JP5789250B2 - プロテインA(SpA)変種に関連する組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は広くは、免疫学、微生物学、および病理学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細菌に対する免疫反応を引き出すために使用できる細菌プロテインA変種を伴う方法および組成物に関する。
市中獲得型および病院獲得型の両感染の数は、血管内装置の使用増加とともにここ数年増えている。病院獲得型の(院内)感染は罹病率および死亡率の主な原因であり、より具体的には、米国では、病院獲得型の感染は毎年2百万人超の患者に影響を与えている。最も頻度が高い感染は、尿管感染(感染の33%)であり、次いで肺炎(15.5%)、外科手術部位感染(14.8%)および主要血流感染(13%)が続く(Emorl and Gaynes, 1993)。
が修飾または置換される。ある種の局面において、ドメインDのVH3結合サブドメインのアミノ酸残基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43および/またはE47 (SEQ ID NO:2)は、FcまたはVH3との結合が弱められるように修飾または置換される。さらなる局面において、対応する修飾または置換は、ドメインA、B、Cおよび/またはEの対応する位置において操作されてもよい。対応する位置は、ドメインDアミノ酸配列と、SpAの他のIgG結合ドメイン由来のアミノ酸配列の一つまたは複数とのアライメントによって規定され、例えば、図1を参照されたい。ある種の局面において、アミノ酸置換はその他20種のアミノ酸のいずれかであることができる。さらなる局面において、保存的アミノ酸置換を可能なアミノ酸置換から特に除外することができる。他の局面において、非保存的置換しか含まれない。いずれにしても、SpA毒性が顕著に低減されるようにドメインの結合を低減する任意の置換または置換の組み合わせが企図される。結合の低減の意義は、被験体に導入され、本明細書において記述されるインビトロの方法を用いて評価されうる場合に、最低毒性から無毒性を生じる変種をいう。
より具体的には、有効量とは、免疫反応を刺激するもしくは誘発するのに、または感染に対する耐性、感染の改善もしくは感染の緩和をもたらすのに必要な活性成分の量を意味する。より具体的な局面において、有効量は、疾患もしくは感染の症状を阻止する、軽減するもしくは改善する、または処置される被験体の生存を引き延ばす。有効量の判定は十分に、とりわけ本明細書において提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。本発明の方法において用いられるどの調製物についても、有効な量または用量は、インビトロ研究、細胞培養および/または動物モデルアッセイ法から最初に推定することができる。例えば、所望の免疫反応または循環血中抗体の濃度もしくは力価を達成するため、動物モデルにおいて用量を処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に判定することができる。
(a) Fc結合を破壊する少なくとも一つのアミノ酸置換および(b) VH3結合を破壊する少なくとも第二のアミノ酸置換および(c) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を有する変種プロテインA (SpA)を含む、単離ポリペプチド。
[本発明1002]
変種SpAが、変種ドメインDセグメントを含む、本発明1001の単離ポリペプチド。
[本発明1003]
変種SpAが、SEQ ID NO:2のアミノ酸位置9または10の位置に一つまたは複数のアミノ酸置換を有し、かつSEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、本発明1002の単離ポリペプチド。
[本発明1004]
アミノ酸置換が、グルタミン残基に代えてリジン残基である、本発明1003の単離ポリペプチド。
[本発明1005]
SEQ ID NO:2のアミノ酸位置36および37にアミノ酸置換をさらに含む、本発明1003の単離ポリペプチド。
[本発明1006]
ドメインDのアミノ酸配列がSEQ ID NO:2のアミノ酸位置36および37にアラニン残基置換を含む、本発明1005の単離ポリペプチド。
[本発明1007]
SpA Eドメイン、Aドメイン、BドメインまたはCドメインの一つまたは複数の変種をさらに含む、本発明1002の単離ポリペプチド。
[本発明1008]
二つまたはそれ以上のDドメインセグメントを含む、本発明1002の単離ポリペプチド。
[本発明1009]
非プロテインAセグメントをさらに含む、本発明1001の単離ポリペプチド。
[本発明1010]
非プロテインAセグメントが第二の抗原セグメントである、本発明1009の単離ポリペプチド。
[本発明1011]
第二の抗原セグメントがブドウ球菌抗原セグメントである、本発明1010の単離ポリペプチド。
[本発明1012]
ブドウ球菌抗原セグメントがEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよび/またはSasFセグメントである、本発明1011の単離ポリペプチド。
[本発明1013]
薬学的に許容される組成物の中に、IgG、Fcγ、VH3 F(ab) 2 、フォンウィルブランド因子(vWF)および腫瘍壊死因子α受容体1 (TNFR1)とのプロテインAドメインDの結合を弱力化する一つまたは複数の変異を有する毒素非産生性の変種プロテインA (SpA)ペプチドを含むペプチド組成物であって、それを必要としている被験体において免疫反応を刺激できる、前記組成物。
[本発明1014]
SpA変種がSEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10に一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
SpA変種がSEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にリジンの置換を含む、本発明1014の組成物。
[本発明1016]
SEQ ID NO:2のアミノ酸位置36および37にアミノ酸置換をさらに含む、本発明1014の組成物。
[本発明1017]
SpA変種がSEQ ID NO:2と少なくとも70%同一のアミノ酸配列を含む、本発明1015の組成物。
[本発明1018]
SpA変種がSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む、本発明1013の組成物。
[本発明1019]
少なくとも第二のブドウ球菌抗原をさらに含む、本発明1013の組成物。
[本発明1020]
第二の抗原がEsaB、Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよび/またはSasFペプチドから選択される、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
プロテインAドメインDペプチドを含むペプチド以外のブドウ球菌成分の1重量%未満を含む、本発明1013の組成物。
[本発明1022]
アジュバントをさらに含む、本発明1013の組成物。
[本発明1023]
SpA変種がアジュバントにカップリングされる、本発明1022の組成物。
[本発明1024]
SEQ ID NO:2のアミノ酸位置9、10、36および37にアミノ酸置換を有するプロテインA (SpA)変種を含んだ単離ペプチドを含む免疫原性組成物。
[本発明1025]
Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFからなる群より選択される少なくとも一つの他のブドウ球菌抗原またはその免疫原性断片をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
PIA多糖類またはオリゴ糖をさらに含む、本発明1001〜1025のいずれかの組成物。
[本発明1027]
黄色ブドウ球菌(S. aureus)由来のV型および/またはVIII型莢膜多糖類またはオリゴ糖をさらに含む、本発明1001〜1026のいずれかの組成物。
[本発明1028]
ブドウ球菌莢膜多糖類がタンパク質担体に結合される、本発明1001〜1027のいずれかの免疫原性組成物。
[本発明1029]
タンパク質担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)プロテインD、肺炎球菌溶血素およびαトキソイドからなる群より選択される、本発明1028の免疫原性組成物。
[本発明1030]
本発明1001〜1029のいずれかの組成物および薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
[本発明1031]
抗原を混合して本発明1001〜1029のいずれかの組成物を作出する段階および薬学的に許容される賦形剤を添加する段階を含む、ワクチンを作出する方法。
[本発明1032]
本発明1030のワクチンを、それを必要としている患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。
[本発明1033]
ブドウ球菌感染の処置または予防用のワクチンの製造における、本発明1001〜1029のいずれかの組成物の使用。
[本発明1034]
レシピエントを本発明1030のワクチンで免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。
[本発明1035]
本発明1034の方法によって調製される免疫グロブリン。
[本発明1036]
本発明1035の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
[本発明1037]
本発明1036の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
[本発明1038]
ブドウ球菌感染の処置または予防用の薬物の製造における、本発明1036の薬学的調製物の使用。
[本発明1039]
SEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有するプロテインA (SpA)変種を含む組成物の有効量を被験体に提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発するための方法。
[本発明1040]
i) SEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有する単離されたSpA変種、または
ii) SEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有するSpA変種をコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、SpA変種の有効量を被験体に提供する、本発明1039の方法。
[本発明1041]
組成物が単離されたSpA変種を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
被験体にアジュバントの投与もする、本発明1039の方法。
[本発明1043]
組成物がアジュバントを含む、本発明1041の方法。
[本発明1044]
SpA変種がアジュバントにカップリングされる、本発明1041の方法。
[本発明1045]
SpA変種がSEQ ID NO:2と少なくとも70%同一であり、かつSEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有する、本発明1039の方法。
[本発明1046]
組成物が薬学的に許容される組成物中に処方される、本発明1041の方法。
[本発明1047]
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、本発明1039の方法。
[本発明1048]
ブドウ球菌が一つまたは複数の処置に対して耐性である、本発明1039の方法。
[本発明1049]
前記菌がメチシリン耐性である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、本発明1039の方法。
[本発明1051]
組成物が経口的に、非経口的に、皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、本発明1039の方法。
[本発明1052]
第二のブドウ球菌抗原を含む組成物を被験体に投与する段階をさらに含む、本発明1039の方法。
[本発明1053]
第二のブドウ球菌抗原がEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFの一つまたは複数である、本発明1052の方法。
[本発明1054]
組成物が、SpA変種をコードする組み換え核酸分子を含む、本発明1040の方法。
[本発明1055]
組成物が、SpA変種を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌(Salmonella)である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
被験体が哺乳類である、本発明1039の方法。
[本発明1058]
被験体がヒトである、本発明1039の方法。
[本発明1059]
免疫反応が防御免疫反応である、本発明1039の方法。
[本発明1060]
ブドウ球菌感染を有する、ブドウ球菌感染を有することが疑われる、またはブドウ球菌感染を発症するリスクがある被験体に、SEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有するプロテインA変種を含む単離されたペプチドの有効量を提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌感染を処置するための方法。
[本発明1061]
被験体が持続的ブドウ球菌感染と診断される、本発明1060の方法。
[本発明1062]
SpA変種が、被験体においてプロテインAに結合する抗体の産生を誘発する、本発明1060の方法。
[本発明1063]
SpA変種がSEQ ID NO:2と少なくとも80%同一であり、かつSEQ ID NO:2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有する、本発明1062の方法。
[本発明1064]
SpA変種がSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する、本発明1062の方法。
[本発明1065]
SpA変種がアジュバントとともに投与される、本発明1062の方法。
[本発明1066]
SpA変種がアジュバントにカップリングされる、本発明1065の方法。
[本発明1067]
SpA変種が薬学的に許容される組成物中に処方される、本発明1060の方法。
[本発明1068]
第二のブドウ球菌抗原を投与する段階をさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1069]
第二のブドウ球菌抗原がSpA変種と同時に投与される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
第二のブドウ球菌抗原およびSpA変種を、同一組成物で投与する、本発明1069の方法。
[本発明1071]
第二のブドウ球菌抗原がSpA変種と融合される、本発明1069の方法。
[本発明1072]
第二のブドウ球菌抗原がEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFペプチドの一つまたは複数である、本発明1068の方法。
[本発明1073]
ブドウ球菌感染が黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染である、本発明1060の方法。
[本発明1074]
ペプチドが経口的に、非経口的に、経皮的に、経粘膜的に、皮下に、筋肉内にまたは吸入により投与される、本発明1060の方法。
[本発明1075]
ペプチドを二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1076]
被験体が哺乳類である、本発明1060の方法。
[本発明1077]
被験体がヒトである、本発明1060の方法。
[本発明1078]
SEQ ID NO:27もしくはそのセグメントと少なくとも90%同一である、またはSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27-508もしくはそのセグメントと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するコアグラーゼポリペプチドまたはその免疫原性セグメントを含む組成物の有効量を被験体に提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発するための方法。
[本発明1079]
i) SEQ ID NO:27もしくはそのセグメントと少なくとも90%同一である、またはSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27-508もしくはそのセグメントと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する単離されたコアグラーゼポリペプチドまたはそのセグメント; あるいは
ii) SEQ ID NO:27もしくはそのセグメントと少なくとも90%同一である、またはSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27-508もしくはそのセグメントと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するコアグラーゼポリペプチドまたはそのセグメントをコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子
を含む組成物を被験体に投与することにより、コアグラーゼポリペプチドの有効量を被験体に提供する、本発明1078の方法。
[本発明1080]
組成物が、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27-508のアミノ酸配列を有する単離されたコアグラーゼポリペプチドを含む、本発明1079の方法。
[本発明1081]
被験体にアジュバントの投与もする、本発明1078の方法。
[本発明1082]
コアグラーゼポリペプチドがアジュバントにカップリングされる、本発明1080の方法。
[本発明1083]
組成物が薬学的に許容される組成物中に処方される、本発明1079の方法。
[本発明1084]
ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、本発明1078の方法。
[本発明1085]
ブドウ球菌が一つまたは複数の処置に対して耐性である、本発明1084の方法。
[本発明1086]
前記菌がメチシリン耐性である、本発明1085の方法。
[本発明1087]
組成物を二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、本発明1078の方法。
[本発明1088]
組成物が経口的に、非経口的に、皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、本発明1078の方法。
[本発明1089]
第二のブドウ球菌抗原を含む組成物を被験体に投与する段階をさらに含む、本発明1078の方法。
[本発明1090]
第二のブドウ球菌抗原がEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、SpA、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFの一つまたは複数である、本発明1089の方法。
[本発明1091]
組成物が、コアグラーゼポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を含む、本発明1079の方法。
[本発明1092]
組成物が、コアグラーゼポリペプチドを発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌である、本発明1092の方法。
[本発明1094]
被験体が哺乳類である、本発明1078の方法。
[本発明1095]
被験体がヒトである、本発明1078の方法。
[本発明1096]
免疫反応が防御免疫反応である、本発明1078の方法。
[本発明1097]
ブドウ球菌感染を有する、ブドウ球菌感染を有することが疑われる、またはブドウ球菌感染を発症するリスクがある被験体に、SEQ ID NO:27と少なくとも90%同一である、またはSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27-508と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するコアグラーゼポリペプチドを含む単離されたペプチドの有効量を提供する段階を含む、被験体においてブドウ球菌感染を処置するための方法。
[本発明1098]
被験体が持続的ブドウ球菌感染と診断される、本発明1097の方法。
[本発明1099]
コアグラーゼポリペプチドが、被験体においてCoaまたはvWbpに結合する抗体の産生を誘発する、本発明1097の方法。
[本発明1100]
コアグラーゼポリペプチドがSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有し、またはSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27-508と同一のアミノ酸を有する、本発明1097の方法。
[本発明1101]
第二のブドウ球菌抗原を投与する段階をさらに含む、本発明1097の方法。
[本発明1102]
第二のブドウ球菌抗原がコアグラーゼポリペプチドと同時に投与される、本発明1101の方法。
[本発明1103]
第二のブドウ球菌抗原が、Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、SpA、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBまたはSasFペプチドの一つまたは複数である、本発明1102の方法。
[本発明1104]
ブドウ球菌感染が黄色ブドウ球菌感染である、本発明1097の方法。
[本発明1105]
ペプチドが経口的に、非経口的に、経皮的に、経粘膜的に、皮下に、筋肉内にまたは吸入により投与される、本発明1097の方法。
[本発明1106]
ペプチドを二回以上被験体に投与する段階をさらに含む、本発明1097の方法。
[本発明1107]
被験体が哺乳類である、本発明1097の方法。
[本発明1108]
被験体がヒトである、本発明1097の方法。
[本発明1109]
ブドウ球菌コアグラーゼまたはその免疫原性セグメントを含む免疫原性組成物を投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。
[本発明1110]
ブドウ球菌コアグラーゼがCoaもしくはvWhポリペプチドまたはその免疫原性セグメントである、本発明1109の方法。
[本発明1111]
Coaポリペプチドまたはその免疫原性セグメントが、SEQ ID NO:27またはそのセグメントと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有し、かつvWhポリペプチドまたはその免疫原性セグメントが、SEQ ID NO:32のアミノ酸番号27〜508またはそのセグメントと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、本発明1109の方法。
[本発明1112]
Coaポリペプチドまたはその免疫原性セグメントがSEQ ID NO:27またはそのセグメントのアミノ酸配列を有し、かつvWhポリペプチドまたはその免疫原性セグメントがSEQ ID NO:32のアミノ酸番号27〜508またはそのセグメントのアミノ酸配列を有する、本発明1109の方法。
[本発明1113]
レシピエントをコアグラーゼポリペプチドで免疫する段階およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置に用いるための免疫グロブリンを調製する方法。
[本発明1114]
本発明1113の方法によって調製される免疫グロブリン。
[本発明1115]
本発明1114の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1116]
本発明1115の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。
[本発明1117]
ブドウ球菌感染の処置または予防用の薬物の製造における、本発明1115の薬学的調製物の使用。
本発明の他の目標、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の特定の態様を示しているが、この詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲のなかで種々の変更および修正が明らかになると考えられるので、単なる例示として与えられるものと理解されるべきである。
黄色ブドウ球菌は、ヒト皮膚および鼻孔の片利共生生物であり、血流、皮膚および軟組織感染の主因である(Klevens et al., 2007)。ブドウ球菌疾患の死亡率の最近の劇的な増加は、抗生物質に対して感受性を示さないことが多いメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株の広がりに起因する(Kennedy et al., 2008)。大規模な遡及的研究において、米国ではMRSA感染の発生率が全入院の4.6%であった(Klevens et al., 2007)。米国では94,300人のMRSA感染個体のための年間医療費は24億ドルを超える(Klevens et al., 2007)。現在のMRSA流行病は、予防ワクチンの開発によって取り組む必要がある公衆衛生の危機を引き起こしている(Boucher and Corey, 2008)。これまでに、黄色ブドウ球菌疾患を予防するFDA認可済みワクチンは利用可能ではない。
A. ブドウ球菌プロテインA (SpA)
黄色ブドウ球菌株はどれも、プロテインA、つまり細胞壁固定表面タンパク質産物(SpA)がE、D、A、BおよびCと命名された5つの高度に相同的な免疫グロブリン結合ドメインを包含するよく特徴付けられた病毒性因子に対する構造遺伝子(spa) (Jensen, 1958; Said-Salim et al., 2003)を発現する(Sjodahl, 1977)。これらのドメインはアミノ酸のレベルでおよそ80%の同一性を示し、長さが56〜61残基であり、縦列反復配列として組織化される(Uhlen et al., 1984)。SpAは、N末端YSIRK/GSシグナルペプチドおよびC末端LPXTGモチーフ選別シグナルを有する前駆体タンパク質として合成される(DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992)。細胞壁固定プロテインAは、ブドウ球菌表面に非常に豊富に提示される(DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972)。その免疫グロブリン結合ドメインの各々が、3ヘリックスバンドルへ集合しかつ免疫グロブリンG (IgG)のFcドメインを結合する逆平行α-ヘリックス(Deisenhofer, 1981; Deisenhofer et al., 1978)、IgMのVH3重鎖(Fab) (すなわち、B細胞受容体) (Graille et al., 2000)、そのA1ドメインのフォンウィルブランド因子[vWF AIは血小板に対するリガンドである] (O'Seaghdha et al., 2006)、および気道上皮の表面に提示される(Gomez et al., 2004; Gomez et al., 2007)腫瘍壊死因子α (TNF-α)受容体I (TNFRI) (Gomez et al., 2006)から構成される。
プロテインAは、細菌細胞質中で前駆体として合成され、そのYSIRKシグナルペプチドを介して隔壁、すなわち、ブドウ球菌の細胞分裂隔壁の位置で分泌される(図1) (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008)。C末端LPXTG選別シグナルの切断の後、プロテインAはソルターゼAによって細菌ペプチドグリカン架橋に固定される(Mazmanian et al., 1999; Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 2000)。プロテインAは最も豊富なブドウ球菌表面タンパク質である。この分子はほぼ全ての黄色ブドウ球菌株によって発現される(Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008; Said-Salim et al., 2003)。ブドウ球菌は分裂周期1回につきその細胞壁の15〜20%を代謝する(Navarre and Schneewind 1999)。ネズミヒドロラーゼはペプチドグリカンのグリカン鎖および壁ペプチドを切断し、それにより、付着されたC末端細胞壁二糖類テトラペプチドを有するプロテインAを細胞外培地へ放出する(Ton-That et al., 1999)。このように、生理学的デザインによって、プロテインAは細胞壁に固定もされ、細菌表面に提示もされるが、宿主感染の間に周辺組織中に放出もされる(Marraffini et al., 2006)。
コアグラーゼはブドウ球菌によって産生される酵素であり、フィブリノゲンをフィブリンに変換する。CoaおよびvWhは、タンパク質分解なしでプロトロンビンを活性化する(Friedrich et al., 2003)。コアグラーゼ・プロトロンビン複合体はフィブリノゲンを特異的基質として認識し、フィブリノゲンを直接的にフィブリンへ変換する。活性複合体の結晶構造によって、D1およびD2ドメインのプロトロンビンとの結合ならびにそのIle1-Val2 N末端のIle16ポケットへの挿入、その結果、立体構造変化を通じた酵素前駆体における機能的な活性部位の誘導が明らかとなった(Friedrich et al., 2003)。α-トロンビンのエキソサイトI、フィブリノゲン認識部位、およびプロトロンビン上のプロエキソサイトIはCoaのD2によって遮断される(Friedrich et al., 2003)。それにもかかわらず、四量体(Coa・プロトロンビン)2複合体の会合により、高い親和性で新しい部位にてフィブリノゲンを結合する(Panizzi et al., 2006)。このモデルから、コアグラーゼによる凝固性および効率的なフィブリノゲン変換が説明される(Panizzi et al., 2006)。
過去数十年の間にわたる研究から、重要な病毒性因子として黄色ブドウ球菌外毒素、表面タンパク質および調節分子が特定された(Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003)。これらの遺伝子の調節に関して相当な進歩が達成された。例えば、ブドウ球菌は、同族受容体に閾値濃度で結合し、それによってリン酸リレイ反応の活性化および外毒素遺伝子の多くの転写活性化を行う自己誘導性ペプチドの分泌を介して細菌個体数の調査を行う(Novick, 2003)。ブドウ球菌感染の発病はこれらの病毒性因子(分泌された外毒素、エキソ多糖類および表面付着因子)に依る。ブドウ球菌ワクチンの開発は、ブドウ球菌浸潤機構の多面性によって妨げられる。弱毒化生微生物は極めて効果的なワクチンであることが十分に確立されている。このようなワクチンによって誘発される免疫反応は多くの場合、複製しない免疫原によってもたらされる免疫反応よりも大きなものであり、長い作用時間のものである。これに対する一つの説明は、弱毒化生菌株が宿主において限定的な感染を樹立し、自然感染の初期段階を模倣するということでありうる。本発明の態様では、変種SpAポリペプチドおよびペプチド、ならびに感染に対しての軽減または免疫で用いるグラム陽性細菌の他の免疫原性細胞外タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド(分泌タンパク質またはペプチドも細胞表面タンパク質またはペプチドもともに含む)を含む、組成物および方法に関する。特定の態様において、細菌はブドウ球菌細菌である。細胞外タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドには、標的細菌の分泌タンパク質および細胞表面タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。
本発明は、本発明のさまざまな態様で用いるためのポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片について記述する。例えば、特定のポリペプチドを、免疫反応を誘発するかアッセイし、または免疫反応を誘発するために用いる。特定の態様において、本発明のタンパク質の全部または一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、Stewart and Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
ある種の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドに関する。SpA、コアグラーゼおよび他の細菌タンパク質に対する核酸配列が含まれ、これらの全てが参照により組み入れられ、これらを用いてペプチドまたはポリペプチドを調製することができる。
本発明のポリペプチドは、ベクター中に含まれる核酸分子によってコードされてもよい。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「異種」であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞または核酸中の配列と同種であるが、しかし通常は見られない、宿主細胞または核酸内の位置にある配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、標準的な組み換え技術(例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996)を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っているであろう。変種SpAポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは一つまたは複数の他の細菌ペプチド、タグまたは免疫原性増強ペプチドのような他のポリペプチド配列をコードしてもよい。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、pINベクター(Inouye et al., 1985)、一続きのヒスチジンをコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断に向けたグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質の作出で用いるpGEXベクターが含まれる。
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。これには、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素を含めてもよい。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で、その配列の転写開始および発現を制御するのに正しい機能的位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用調節配列をいう「エンハンサー」とともに用いられても用いられなくてもよい。
特異的開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要がありうる。当業者は容易にこれを決定して、必要なシグナルを提供することができるであろう。
本発明のある種の態様において、本発明の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターの中にスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。転写され翻訳される場合、マーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含んだ細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が可能になるものであるのに対し、陰性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が妨害されるものである。陽性選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代の、その子孫も含む。故意または偶然の変異により全ての子孫が同一ではないことがあると理解されよう。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができ、使用されている。宿主細胞は「形質移入」または「形質転換」されてもよく、それらは組み換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。
先に論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物および/または真核生物に基づく系を本発明で用いるために利用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。そのような多くの系が市販されており、広く利用可能である。
本発明の免疫原性組成物は、PIA (PNAGとしても公知)の一つもしくは複数を含む莢膜多糖類、ならびに/または黄色ブドウ球菌V型および/もしくはVIII型莢膜多糖類、ならびに/または表皮ブドウ球菌I型および/もしくはII型および/もしくはIII型莢膜多糖類をさらに含むことができる。
現在では、PS/A、PIAおよびSAAとして同定されたブドウ球菌表面多糖類の各種形態は同じ化学的実体、つまりPNAGであることが明らかである(Maira-Litran et al., 2004)。それゆえ、PIAまたはPNAGという用語は、これらの全ての多糖類またはそれらに由来するオリゴ糖を包含する。
ヒトでの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌の大部分の菌株が5型または8型多糖類のいずれかを含む。およそ60%のヒト菌株が8型であり、およそ30%が5型である。5型および8型莢膜多糖類抗原の構造はMoreauら(1990)およびFournierら(1984)に記述されている。どちらもその反復単位の中にFucNAcpと、スルフヒドリル基を導入するのに使用できるManNAcAとを有する。それらの構造は:
5型
→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
であり、
最近(Jones, 2005)では、NMR分光法によってそれらの構造は:
5型
→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
に訂正されている。
一つの態様において、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第6,294,177号に記述されている黄色ブドウ球菌336抗原を含む。336抗原は、β結合ヘキソサミンを含み、O-アセチル基を含まず、ATCC 55804の下で寄託された黄色ブドウ球菌336型に対する抗体と特異的に結合する。一つの態様において、336抗原は多糖類であり、これは天然のサイズのものであり、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的処理によってサイジングされてもよい。本発明はまた、336抗原に由来するオリゴ糖を網羅する。336抗原は担体タンパク質に結合されなくてもまたは結合されてもよい。
ワクチン接種に多糖類を用いることに付随する問題の中には、多糖類それ自体が不十分な免疫原であるという事実がある。本発明において利用される多糖類を、傍観T細胞の助けをもたらすタンパク質担体に連結させて、免疫原性を改善することが好ましい。多糖類免疫原と結合されうるそのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれDT、DT CRM 197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ならびにツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)、緑膿菌エキソプロテインA (rEPA)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のプロテインD、肺炎球菌溶血素またはこれらのうちのいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片には、Tヘルパーエピトープを包含する断片が含まれる。特に、インフルエンザ菌由来のプロテインD断片は、そのタンパク質のN末端側の3分の1を含むことが好ましいであろう。プロテインDは、インフルエンザ菌由来のIgD結合タンパク質であり(EP 0 594 610 B1)、潜在的な免疫原である。さらに、ブドウ球菌タンパク質を本発明の多糖類結合体における担体タンパク質として用いることができる。
上記のように、本発明は、被験体において変種SpAまたはコアグラーゼペプチドに対する免疫反応を惹起または誘導することに関係する。一つの態様において、免疫反応は、感染または関連する疾患、とりわけブドウ球菌に関連する疾患を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある被験体を防御または処置することができる。本発明の免疫原性組成物の使い方の一つは、病院または感染のリスク増大を伴う他の環境において医療手当を受ける前に被験体を予防接種することによって院内感染を予防することである。
本発明は、本発明の組成物により免疫反応が誘導または惹起されるかどうか、およびどの程度まで誘導または惹起されるかを評価するための血清学的アッセイ法の実施を含む。実施されうる多くのタイプの免疫アッセイ法が存在する。本発明により包含される免疫アッセイ法には、米国特許第4,367,110号に記述されているもの(二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ法)および米国特許第4,452,901号に記述されているもの(ウエスタンブロット)が含まれるが、これらに限定されることはない。他のアッセイ法には、インビトロおよびインビボの両方での、免疫細胞化学および標識リガンドの免疫沈降が含まれる。
上記の感染を処置または予防するためのタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチド、ならびにこれらのポリペプチド、タンパク質および/またはペプチドに結合する抗体の使用に加え、本発明は、患者内であれ医療機器上であれ、同様に感染しうる感染症を診断するためのブドウ球菌の存在の検出を含む、種々の様式でのこれらのポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび/または抗体の使用を企図する。本発明によれば、感染の存在を検出する好ましい方法は、個体から、例えば、個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から採取されたサンプルのような、一種または複数種のブドウ球菌種または菌株に感染していることが疑われるサンプルを得る段階を含む。サンプルの単離に続き、本発明のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび/または抗体を利用する診断アッセイ法を行ってブドウ球菌の存在を検出することができ、サンプル中でのそのような存在を判定するためのそのようなアッセイ技術は当業者に周知であり、放射免疫アッセイ法、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法などの方法を含む。概して、本発明によれば、ブドウ球菌に感染していることが疑われるサンプルを本発明によるポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗体またはモノクローナル抗体に加え、サンプル中の、ポリペプチド、タンパク質および/もしくはペプチドに結合する抗体、または抗体に結合するポリペプチド、タンパク質および/もしくはペプチドによってブドウ球菌が示される、感染を診断する方法が企図される。
本発明のいくつかの態様において、タンパク質性組成物は被験体に防御免疫を付与する。防御免疫とは、免疫反応が起こる作用因子を伴った特定の疾患または状態を被験体が発症することを防ぐ特異的な免疫反応を開始する身体の能力をいう。免疫原性上有効な量は、被験体に防御免疫を付与することができる。
本発明の方法は、ブドウ球菌病原菌によって引き起こされる疾患または状態の処置を含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、ブドウ球菌に罹患している者またはブドウ球菌に曝されていると疑われる者において免疫反応を誘導するために与えることができる。ブドウ球菌への曝露で陽性と判定された個体、または曝露の可能性に基づいて感染のリスクがあると思われる個体について、それらの方法を利用することができる。
E. ワクチン
本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染を予防または改善するための方法を含む。したがって、本発明は、能動免疫と受動免疫の両方の態様で用いるためのワクチンを企図する。ワクチンとして用いるのに適当であると提唱されている免疫原性組成物は、SpAドメインD変種または免疫原性コアグラーゼのような、免疫原性SpAポリペプチドから調製することができる。他の態様において、SpAまたはコアグラーゼを他の分泌病毒性タンパク質、表面タンパク質またはその免疫原性断片と組み合わせて用いることができる。ある種の局面において、抗原材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために十分に透析され、および/または所望の媒体へのより容易な処方のために凍結乾燥される。
所与の組成物はその免疫原性が異なる場合がある。それゆえ、宿主免疫系を追加免疫することが必要になることが多く、これはペプチドまたはポリペプチドを担体にカップリングさせることにより達成することもできる。例示的なかつ好ましい担体はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを担体として用いることもできる。ポリペプチドを担体タンパク質に抱合させるための手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル(maleimidobencoyl)-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化(bis-biazotized)ベンジジンを含む。
ポリペプチドまたはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫反応の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。適当なアジュバントはサイトカイン、毒素または合成組成物などの、許容される全ての免疫刺激性化合物を含む。変種SpAポリペプチドもしくはコアグラーゼ、または本明細書において企図されるその他任意の細菌タンパク質もしくは組み合わせに対する抗体反応を増強するために、いくつかのアジュバントを用いることができる。アジュバントは、(1) 抗原を体内に捕捉して持続放出を引き起こすこと; (2) 免疫反応に関わる細胞を投与部位に引き付けること; (3) 免疫系細胞の増殖もしくは活性化を誘導すること; または(4) 被験体の体全体に抗原を広げるのを改善することができる。
ある種の態様において、本発明は、核酸またはポリペプチド/ペプチドと結び付いた一つまたは複数の脂質を含む組成物に関する。脂質は水に不溶な、かつ有機溶媒で抽出可能な物質である。本明細書において具体的に記述するもの以外の化合物は、当業者により脂質と理解され、本発明の組成物および方法によって包含される。脂質成分および非脂質は、共有結合的または非共有結合的に、互いに付着されてもよい。
本発明の組成物および関連する方法、特に、変種SpAポリペプチドもしくはペプチドを含む、分泌病毒性因子もしくは表面タンパク質、および/または他の細菌ペプチドもしくはタンパク質の患者/被験体への投与を従来の治療の施行と併せて用いることもできる。これらには、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、または抗生物質の各種組み合わせなどの抗生物質の投与が含まれるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、薬学的組成物が被験体に投与される。本発明の種々の局面では、被験体に組成物の有効量を投与することを伴う。本発明のいくつかの態様において、ブドウ球菌抗原、Ess経路の成員、例えばEsaもしくはEsxクラスのポリペプチドもしくはペプチドなど、および/またはソルターゼ基質の成員を患者に投与して、一種または複数種のブドウ球菌病原菌を防御することができる。あるいは、一つまたは複数のそのようなポリペプチドまたはペプチドをコードする発現ベクターを、予防的処置として患者に与えることもできる。さらに、そのような化合物を抗生物質または抗菌薬と併せて投与することもできる。そのような組成物は一般に、薬学的に許容される担体または水媒体中に溶解または分散される。
本明細書において用いられる場合、インビトロ投与という用語は、培養細胞を含むが、これに限定されない、被験体から取り出されたまたは被験体の体外の細胞に対して行われる操作をいう。エクスビボ投与という用語は、インビトロにおいて操作されており、その後で、被験体に投与される細胞をいう。インビボ投与という用語は、被験体の体内で行われる全ての操作を含む。
本発明の別の局面は、レシピエントまたはドナーを本発明のワクチンで免疫する段階およびレシピエントまたはドナーから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法である。この方法によって調製される免疫グロブリンは、本発明のさらなる局面である。本発明の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、ブドウ球菌疾患の処置または予防のための薬物の製造において使用できる本発明のさらなる局面である。本発明の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含むブドウ球菌感染の処置または予防のための方法は、本発明のさらなる局面である。
以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を例証する目的で与えられており、いかなる形においても本発明を限定することを意図するものではない。本発明は本明細書の中にある目標、目的および利点のほかに、言及されている、目標を実行するために、かつ目的および利点を得るために十分に適していることを当業者は容易に理解するであろう。本実施例は、本明細書において記述される方法とともに、目下、好ましい態様を代表するものであり、例示するものであり、本発明の範囲に対する限定と意図するものではない。その変更および特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨のなかに包含されるその他の用途が、当業者には思い浮かぶであろう。
黄色ブドウ球菌感染の動物モデル
BALB/cマウスに静脈内注射によって1×107 CFUのヒト臨床分離株の黄色ブドウ球菌Newmanを感染させた(Baba et al., 2007)。感染後6時間以内に、99.999%のブドウ球菌が血流から消失し、脈管構造を介して行き渡った。末梢組織へのブドウ球菌の播種は、腎臓および他の末梢器官組織における細菌負荷が最初の3時間以内に1×105 CFU g-1に達したことから、急速に起こった。腎臓組織におけるブドウ球菌の負荷は、24時間以内に1.5 log CFU増加した。感染から48時間後に、マウスはヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓組織の光学顕微鏡検査によって検出可能な、多器官における播種性膿瘍を発現した。初期の膿瘍直径は524 μM (± 65 μM)であった。病変部は病初では多形核白血球(PMN)の流入が目立ち、識別可能なブドウ球菌組織化がなく、その大部分はPMN内に存在するものと思われた。感染5日目に、膿瘍はサイズが増大し、好酸球性の無形性物質の層および大きなPMNカフで囲まれた、中心のブドウ球菌集団を含んでいた。病理組織診断によって、膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌巣のすぐ近くでのPMNの大量壊死および一面の正常食細胞が明らかになった。正常腎組織を病変部と区別する好酸球性の無形性物質に隣接する、膿瘍病変部周辺の壊死PMNの縁が観察された。膿瘍は15または36日目に≧ 1,524 μMの直径に最終的に達した。もっと後の時間間隔で、ブドウ球菌負荷は104〜106 CFU g-1まで増大し、成長中の膿瘍病変部は器官被膜の方へ移動した。末梢病変部は裂けやすく、それによって壊死物質およびブドウ球菌を腹膜腔または後腹膜腔へ放出した。これらの事象は菌血症および膿瘍の第二波を引き起こし、最終的には致死的転帰を招いた。
a攻撃菌株あたりBALB/cマウス15匹のコホートにおいて感染から5日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値<0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
d感染から5日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(陽性%)によって測定した。
e動物8〜10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の病理組織診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
f統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した。P値<0.05を有意と見なした。
ソルターゼAは、黄色ブドウ球菌株Newmanの外膜中に19種の表面タンパク質を固定化するトランスペプチダーゼである(Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000)。以前の研究では、多数の動物モデル系においてソルターゼAを病毒性因子と同定しているが、膿瘍の形成または存続へのこの酵素およびその固定表面タンパク質の寄与はまだ明らかにされていない(Jonsson et al., 2002; Weiss et al., 2004)。野生型の親株と比べて(Baba et al., 2007)、同質遺伝子srtA変種(ΔsrtA)は2、5または15日目に肉眼検査または病理組織学的検査のいずれに関しても膿瘍病変部を形成できなかった。strA変異体に感染したマウスでは、感染5日目に腎臓組織から1×104 CFU g-1しか回収されず、これは野生型の親株と比べて2.046 log10 CFU g-1の低下である(P=6.73×10-6)。類似の欠陥はMRSA株USA300のsrtA変異体にも観察された(データ不掲載)。走査電子顕微鏡法から、srtA変異体が、その他の点では健常な腎組織において高度に分散し、多くの場合、白血球と結び付いていることが示された。感染後15日目に、srtA変異体は、腎組織から除去され、野生型と比べて≧ 3.5 log10 CFU g-1の低下であった(表3)。このように、ソルターゼA固定表面タンパク質は、宿主組織において膿瘍病変部の形成および細菌の存続を可能にし、その場所でブドウ球菌は、細胞外マトリックスに埋め込まれ、かつ無定形の偽被膜により周囲の白血球から保護された群集として複製する。
研究によって、プロテインAは黄色ブドウ球菌感染の発病の間の重要な病毒性因子と特定された。以前の取り組みによって、プロテインAは、免疫グロブリンのFc成分に結合することによりブドウ球菌の食作用を妨害し(Jensen 1958; Uhlen et al., 1984)、フォンウィルブランド因子を介して血小板凝集を活性化し(Hartleib et al., 2000)、VH3を持つIgMのF(ab)2領域を捕捉することによりB細胞超抗原として機能し(Roben et al., 1995)、および、そのTNFR1活性化を通じて、ブドウ球菌性肺炎を引き起こしうる(Gomez et al., 2004)ことが実証された。プロテインAが免疫グロブリンを捕捉し、有毒な特質を呈するという事実によって、この表面分子がヒトでのワクチンとして機能しうる可能性は厳密には追求されてこなかった。本発明者らは初めて、プロテインA変種が免疫グロブリンにもはや結合できず、vWFおよびTNFR-1はその毒素産生能が取り除かれ、ブドウ球菌疾患を防御する体液性免疫反応を刺激しうることを実証する。
プロテインAは、細菌細胞質中で前駆体として合成され、そのYSIRKシグナルペプチドを介して隔壁、すなわち、ブドウ球菌の細胞分裂隔壁の位置で分泌される(図1A) (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008)。C末端LPXTG選別シグナルの切断の後、プロテインAはソルターゼAによって細菌ペプチドグリカン架橋に固定される(Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000)。プロテインAは最も豊富なブドウ球菌表面タンパク質である; この分子はほぼ全ての黄色ブドウ球菌株によって発現される(Said-Salim et al., 2003; Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008)。ブドウ球菌は分裂周期1回につきその細胞壁の15〜20%を代謝する(Navarre and Schneewind 1999)。ネズミヒドロラーゼはペプチドグリカンのグリカン鎖および壁ペプチドを切断し、それにより、付着されたC末端細胞壁二糖類テトラペプチドを有するプロテインAを細胞外培地へ放出する(Ton-That et al., 1999)。このように、生理学的デザインによって、プロテインAは細胞壁に固定もされ、細菌表面に提示もされるが、宿主感染の間に周辺組織中に放出もされる(Marraffini et al., 2006)。
本発明者らは、ブドウ球菌プロテインAの毒素非産生性の変種を開発し、この試薬を手にして、初めて、プロテインA免疫に対する動物の免疫反応を測定することを目標とした。さらに、本発明者らは、毒素非産生性プロテインA変種による動物の免疫が、ブドウ球菌感染に対する防御免疫を高める免疫反応を生じうるかどうかについて取り組む。
でPCR増幅し、pET15bベクター(pYSJ1, コドン番号48-486)にクローニングし(Stranger-Jones, et al., 2006)、組み換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換した(Studier et al., 1990)。pYSJ1由来のプロテインA産物は、N末端Hisタグ(MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:37))に融合されたSpA残基番号36-265を持つ。IPTG誘導発現の後、組み換えN末端His6タグ付きSpAをNi-NTA樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した(Stranger-Jones et al., 2006)。SpAのドメインD (SpA-D)を特異的プライマーの対
でPCR増幅し、pET15bベクター(pHAN1, spaコドン番号212-261)にサブクローニングし、組み換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換して組み換えN末端His6タグ付きタンパク質を発現させ、精製した。SpA-Dコード配列における変異を作出するために、二本のプライマー対のセットを合成した(DからAへの置換の場合には:
; QからKへの置換の場合には
; QからGへの置換の場合には
。
プライマーをquick-change突然変異誘発プロトコルに用いた。突然変異誘発の後、DNA配列を組み換えタンパク質: SpA、SpA-DならびにSpA-DQ9,10G;D36,37AおよびSpA-DQ9,10K;D36,37Aの各々について確認した。タンパク質は全て、Ni-NTAクロマトグラフィーを用いて組み換え大腸菌の溶解物から精製し、その後、PBSに対して透析し、4℃で貯蔵した。
プロテインAおよびその変種がワクチン抗原として機能できるかどうか試験するために、SpA、SpA-D、SpA-DQ9,10K;D36,37AおよびSpA-DQ9,10K;D36,37Aを完全または不完全フロインドアジュバントで乳化し、1日目および11日目に精製タンパク質50 μgで4週齢のBALB/cマウスに免疫した。免疫スケジュールの前(0日目)および後(21日目)に動物から採血することにより免疫に対する体液性免疫反応について動物のコホート(n=5)を分析した。表4は、免疫されたマウスが野生型プロテインAまたはそのSpA-Dモジュールに対する体液性免疫反応をわずかしか生じなかったのに対し、SpA-DQ9,10K;D36,37AまたはSpA-DQ9,10K;D36,37Aによる免疫の後に引き起こされた抗体の量が4〜5倍に増えたことを示す。1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanによる静脈内攻撃の後、動物を4日目に殺処理し、その腎臓を切除し、(組織ホモジネートを寒天プレート上にプレーティングし、コロニー形成単位CFUを数え上げることにより)ブドウ球菌負荷または組織病理診断のいずれかについて分析した。予想通り、モック(PBS)免疫マウス(n=19)は腎臓組織において6.46 log10 (±0.25)のCFUを持ち、感染病変部は器官あたり膿瘍3.7 (±1.2)個(n=10)へと組織化された(表4)。SpAによる動物の免疫は5日目に2.51 log10のCFUの低減(P=0.0003)をもたらし、器官あたりの膿瘍は2.1 (±1.2)個となった。後者のデータは、膿瘍形成に有意な低減がなかった(P=0.35)ことを示している。SpA-Dによる免疫は類似の結果: 5日目に2.03 log10のCFUの低減(P=0.0001)をもたらし、器官あたりの膿瘍は1.5 (±0.8)個(P=0.15)となった。対照的に、SpA-DQ9,10K;D36,37AまたはSpA-DQ9,10G;D36,37Aによる免疫は、防御の増大を生み出し、4日目に、それぞれ、3.07 log10および3.03 log10のCFUの低減を伴った(どちらの観察結果についても統計的有意性P<0.0001)。さらに、SpA-DQ9,10K;D36,37AおよびSpA-DQ9,10G;D36,37Aの両方による免疫は、器官あたり0.5 (±0.4)および0.8 (±0.5)個の感染病変部(P=0.02およびP=0.04)しか特定されなかったので、ブドウ球菌膿瘍形成からの顕著な防御を生じた。このように、毒素非産生性プロテインA変種による免疫は、プロテインAに対する体液性免疫反応の増大を生じ、ブドウ球菌の攻撃に対する防御免疫を与える。これらのデータは、プロテインAが、黄色ブドウ球菌疾患を予防するヒトワクチンの理想的な候補であることを示している。
aBALB/cマウス18〜20匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
c統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
blog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
d感染から4日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(陽性%)によって測定した。
e動物10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断; 腎臓あたりの膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に平均化した。
f統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
SpA-D1およびSpA-D2は、それぞれ、SpA-DQ9,10K;D36,37AおよびSpA-DQ9,10G;D36,37Aを表す。
三つの動物モデルは黄色ブドウ球菌感染性疾患の研究のために樹立された。これらのモデルをここで用いて、プロテインA特異的抗体の作出を介して提供される防御免疫のレベルを調べる。
ネズミ膿瘍
後肢への筋肉内注射により精製タンパク質でBALB/cマウス(24日齢雌性、1群あたりマウス8〜10匹、Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を免疫する(Chang et al., 2003; Schneewind et al., 1992)。精製SpA、SpA-DまたはSpA-DQ9、10K;D36、37A (タンパク質50 μg)を0日目(完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)および11日目(不完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)に投与する。血液サンプルを0、11および20日目に眼窩後部採血によって採血する。特異的なSpA-DおよびSpA-DQ9、10K;D36、37A結合活性に対するIgGの力価についてELISAにより血清を調べる。黄色ブドウ球菌Newmanまたは黄色ブドウ球菌USA300懸濁液(1×107 cfu) 100 μlの眼窩後部注射によって21日目に免疫動物を攻撃する。このため、黄色ブドウ球菌Newmanの終夜培養の培養物を新鮮なトリプトソイブロスに100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させる。ブドウ球菌を遠心分離し、二回洗浄し、PBS中で希釈してA600 0.4 (1×108 cfu/ml)を得る。寒天上でのプレーティングおよびコロニー形成によって希釈を実験的に検証する。マウスを体重1キログラムあたり80〜120 mgのケタミンおよび3〜6 mgのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔し、眼窩後部注射によって感染させる。攻撃後5日目または15日目に、マウスを圧縮CO2の吸入によって安楽死させる。腎臓を切除し、1% Triton X-100中でホモジナイズする。cfuの3回繰り返しの判定のためアリコットを希釈し、寒天培地上にプレーティングする。組織診断のため、腎臓組織を24時間10%ホルマリン中にて室温でインキュベートする。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、顕微鏡検査する。
後肢への筋肉内注射により精製SpA、SpA-DまたはSpA-DQ9、10K;D36、37A (タンパク質50 μg)でBALB/cマウス(24日齢雌性、1群あたりマウス8〜10匹、Charles River Laboratories, Wilmington, MA)を免疫する(Chang et al., 2003; Schneewind et al., 1992)。ワクチンを0日目(完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)および11日目(不完全フロインドアジュバントで1:1に乳化)に投与する。血液サンプルを0、11および20日目に眼窩後部採血によって採血する。特異的なSpA-DおよびSpA-DQ9、10K;D36、37A結合活性を有するIgGの力価についてELISAにより血清を調べる。黄色ブドウ球菌Newmanまたは黄色ブドウ球菌USA300懸濁液(15×107 cfu) 100 μlの眼窩後部注射によって21日目に免疫動物を攻撃する(34)。このため、黄色ブドウ球菌Newmanの終夜培養の培養物を新鮮なトリプトソイブロスに100分の1希釈し、37℃で3時間増殖させる。ブドウ球菌を遠心分離し、二回洗浄し、PBS中で希釈してA600 0.4 (1×108 cfu/ml)を得てから、濃縮する。寒天上でのプレーティングおよびコロニー形成によって希釈を実験的に検証する。マウスを体重1キログラムあたり80〜120 mgのケタミンおよび3〜6 mgのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔する。2×1010 cfuの黄色ブドウ球菌Newmanまたは3〜10×109 cfuの臨床黄色ブドウ球菌分離株での腹腔内注射によって21日目に免疫動物を攻撃する。動物を14日間モニタリングし、致命的疾患を記録する。
黄色ブドウ球菌株NewmanまたはUSA300 (LAC)をOD660 0.5までトリプトソイブロス/寒天中にて37℃で増殖させる。50 mlの培養物アリコットを遠心分離し、PBS中で洗浄し、死亡率研究の場合にはPBS 750 μl (容量30 μlあたり3〜4×108 CFU)に懸濁し、または細菌負荷および組織病理学的実験の場合にはPBS 1,250 μl (容量30 μlあたり2×108 CFU)に懸濁する(2, 3)。肺感染のため、7週齢のC57BL/6Jマウス(The Jackson Laboratory)を左鼻孔への黄色ブドウ球菌懸濁液30 μlの植菌の前に麻酔する。動物を回復のために背臥位で檻の中に入れ、14日間観察する。能動免疫の場合、4週齢のマウスに0日目にCFA中20 μgのSpA-DまたはSpA-DQ9,10K;D36,37Aを筋肉内経路を介して投与し、引き続き10日目に不完全フロインドアジュバント(IFA)中20 μgのSpA-DまたはSPA-DQ9,10K;D36,37Aで追加免疫を行う。21日目に黄色ブドウ球菌で動物を攻撃する。血清を免疫前におよび20日目に回収して、特異的抗体の産生を評価する。受動免疫試験の場合、7週齢のマウスに攻撃24時間前に腹腔内注射を介してNRS (正常ウサギ血清)またはSpA-D特異的なウサギ抗血清のいずれか100 μlを投与する。肺炎の病理的相関を評価するために、両肺の除去前に強制CO2吸入によって感染動物を殺処理する。肺細菌負荷の計数のために右肺をホモジナイズする。左肺を1%ホルマリンに入れ、パラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、顕微鏡検査する。
精製されたSpA-DまたはSpA-DQ9,10K;D36,37A 200 μgをウサギ抗血清の産生用の免疫原として用いる。0日目の時点で注射用にCFAでタンパク質200 μgを乳化し、引き続き21日目および42日目にIFAで乳化されたタンパク質200 μgで追加免疫を行う。ウサギ抗体の力価をELISAによって判定する。精製抗体をSpA-DまたはSpA-DQ9,10K;D36,37Aセファロース上でのウサギ血清のアフィニティークロマトグラフィーによって得る。溶出された抗体の濃度をA280での吸光度によって測定し、特異的抗体の力価をELISAによって測定する。
ワクチン効力を判定するために、動物を精製SpA-DまたはSpADQ9,10K;D36,37Aで能動免疫する。対照として、動物をアジュバントだけで免疫する。抗原としてSpA-DまたはSpA-DQ9,10K;D36,37Aを用いてプロテインA調製物に対する抗体の力価を判定する; SpA-DQ9,10K;D36,37A変種はIgGのFcまたはFab部分を結合できないことに注意する。上記の感染性疾患モデルを用いて、細菌負荷(ネズミ膿瘍および肺炎)のいずれかの低減、ブドウ球菌疾患(ネズミ膿瘍および肺炎)の組織病理学的証拠ならびに致死的疾患(ネズミ致死的攻撃および肺炎)からの防御を測定する。
プロテインA特異的ウサギ抗体の防御免疫を判定するために、マウスを5 mg/kgの精製SpA-DまたはSpA-DQ9,10K;D36,37A由来ウサギ抗体で受動免疫する。これらの抗体調製物のどちらも、固定化されたSpA-DまたはSpA-DQ9,10K;D36,37Aを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。対照として、動物をrV10抗体(ブドウ球菌感染の転帰に影響を与えないペスト防御抗原)で受動免疫する。この変種はIgGのFcまたはFab部分を結合できないので、SpA-DQ9,10K;D36,37Aを抗原として用いて、全てのプロテインA調製物に対する抗体の力価を判定する。上記の感染性疾患モデルを用いて、細菌負荷(ネズミ膿瘍および肺炎)の低減、ブドウ球菌疾患(ネズミ膿瘍および肺炎)の組織病理学的証拠ならびに致死的疾患(ネズミ致死的攻撃および肺炎)からの防御を測定する。
黄色ブドウ球菌の臨床分離株はプロテインA (Shopsin et al., 1999、その一次翻訳産物はN末端シグナルペプチド(DeDent et al., 2008)、5つのIg-BD (E、D、A、BおよびCと命名された)(Sjodahl, 1977)、8残基ペプチドの可変的反復を有する領域X (Guss et al., 1984)およびSpAの細胞壁固定のためのC末端選別シグナル(Schneewind et al., 1992; Schneewind et al., 1995)から構成される)を発現する(図1A〜1B)。アミノ酸相同性(Uhlen et al., 1984)、IgBDの三重α-ヘリックスバンドル構造(Deisenhofer et al., 1978; Deisenhofer et al., 1981)およびFab VH3 (Graille et al., 2000)またはFcγ (Gouda et al., 1998)との原子相互作用による導きで、グルタミン9および10、ならびにアスパラギン酸36および37を、それぞれ、SpAと抗体またはB細胞受容体との結び付きに重要であるとして選択した。置換Gln9Lys、Gln10Lys、Asp36AlaおよびAsp37AlaをDドメインに導入して、SpA-DKKAAを作出した(図1B)。ヒトIgGを結合する単離SpA-DまたはSpA-DKKAAの能力をアフィニティークロマトグラフィーによって分析した(図1D)。ポリヒスチジンタグ付きSpA-Dおよび全長SpAはヒトIgGをNi-NTA上に保持したのに対し、SpA-DKKAAおよび陰性対照(SrtA)は保持しなかった(図1C)。腫瘍壊死因子受容体1 (TNFR1)(Gomez et al., 2004)とともに、グルタミン9および10を介しプロテインAを同様に結合できる、フォンウィルブランド因子(Hartleib et al., 2000)で類似の結果が認められた(図1D)。ヒト免疫グロブリンは60〜70%のVH3型 IgGを包含する。本発明者らは、IgのFcドメインおよびB細胞受容体活性化を区別し、ともに全長SpAまたはSpA-Dに結合したが、SpA-DKKAAに結合しなかった、ヒトFcγおよびF(ab)2断片の結び付きを測定した(図1D)。マウスの腹腔内へのSpA-Dの注射はB細胞増加、その後BALB/cマウスの脾臓組織におけるCD19+リンパ球のアポトーシス崩壊を生じた(Goodyear and Silverman, 2003)(図1E)。B細胞超抗原活性はSpA-DKKAAによる注射後に認められず、脾臓組織のTUNEL染色では、SpAまたはSpA-Dの注射に続くアポトーシス細胞の増加を検出することができなかった(図1E)。
未処置の6週齢BALB/cマウスに、CFA中で乳化された精製SpA、SpA-DまたはSpA-DKKAA各50 μgを注射し、IFA中で乳化された同じ抗原を追加免疫した。SpA-Dが活性化されたクローン性B細胞集団のアポトーシス崩壊を促進するという仮説に一致して、本発明者らは、B細胞超抗原と比べて毒素非産生性の変種によるマウスの免疫後にSpA-DKKAA特異的抗体の10倍高い力価を認めた(Spa-D vs. SpA-DKKAA P <0.0001、表5)。全長SpAによる免疫でもたらされた抗体の力価は、SpA-Dで誘発されたものよりも高く(P=0.0022)、これはこの抗原のいっそう大きなサイズおよび反復ドメイン構造による可能性が高い(表5)。それにもかかわらず、SpAでさえもプロテインA (520残基、SEQ ID NO:33)の50アミノ酸しか含まない、SpA-DKKAAよりも低い抗体力価を誘発した(P=0.0003)。免疫マウスを黄色ブドウ球菌Newmanでの静脈内接種によって攻撃し、腎組織において膿瘍をまき散らすブドウ球菌の能力を攻撃から4日後に剖検によって調べた。モック(PBS/アジュバント)免疫マウスのホモジナイズ腎組織において、6.46 log10 CFU g-1の平均ブドウ球菌負荷が測定された(表5)。SpAまたはSpA-Dによるマウスの免疫は、ブドウ球菌負荷の低下をもたらしたが、SpA-DKKAAワクチン接種動物は腎組織において黄色ブドウ球菌Newmanのさらに高い、3.07 log10 CFU g-1の低下を呈した(P <0.0001、表5)。腎臓における膿瘍形成を組織病理診断によって分析した(図2)。モック免疫動物は腎臓あたり平均3.7 (±1.2)個の膿瘍を有していた(表5)。SpA-DKKAAによるワクチン接種は膿瘍の平均数を0.5 (±0.4)(P=0.0204)にまで減らしたのに対し、SpAまたはSpA-Dによる免疫は膿瘍病変部の数の顕著な低下を引き起こさなかった(表5)。SpA-DKKAAワクチン接種動物由来の病変部はサイズがさらに小さくなり、浸潤PMNがいっそう少なく、ブドウ球菌膿瘍群集を特徴的に欠いていた(Cheng et al., 2009)(図2)。SpAまたはSpA-Dで免疫されていた動物における膿瘍は、モック免疫動物での同じ全体構造の病変部を呈した(図2)。
ウサギをSpA-DKKAAで免疫し、特異的抗体をSpA-DKKAAアフィニティーカラム上で精製し、その後SDS-PAGEを行った(図3)。SpA-DKKAA特異的なIgGをペプシンで切断してFcγおよびF(ab)2断片を作出し、この後者をSpA-DKKAAカラム上でのクロマトグラフィーによって精製した(図3)。ヒトIgGまたはvWFとSpAまたはSpA-Dとの結合は、SpA-DKKAA特異的なF(ab)2によって撹乱され、SpA-DKKAA由来の抗体がプロテインAのB細胞超抗原の機能およびIgとのその相互作用を中和することを示唆するものであった(図3)。
毒素非産生性プロテインAのワクチン特性をさらに改善するため、本発明者らは、IgBDの5つのドメイン(E、D、A、BおよびC)のそれぞれの中に、4つのアミノ酸置換、つまりドメインDのGln9Lys、Gln10Lys、Asp36AlaおよびAsp37Alaに対応する置換を有する全5つのIgBDを含む、SpAKKAAを作出した。ポリヒスチジンタグ付きSpAKKAAをアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、クマシーブルー染色したSDS-PAGEによって分析した(図4)。全長SpAとは異なり、SpAKKAAはヒトIgG、FcおよびF(ab)2またはvWFを結合しなかった(図4)。SpAKKAAは、BALB/cマウスへのこの変種の注射が脾臓組織においてCD19+ B細胞の枯渇を引き起こさなかったので、B細胞超抗原活性を呈することができなかった(図4)。SpAKKAAワクチン接種は、SpA-DKKAA免疫よりも高い特異的抗体の力価を生じ、黄色ブドウ球菌USA300の攻撃からの防御増強をマウスに与えた(表5)。攻撃から4日後、SpAKKAAワクチン接種動物は腎組織において3.54 log10 CFU g-1少ないブドウ球菌を有し(P=0.0001)、膿瘍病変部の数のさらに大幅な低下も引き起こした(P=0.0109) (表5)。プロテインAワクチンが他のMRSA菌株に影響を与えるかどうかの試験として、マウスを日本のバンコマイシン耐性MRSA分離株Mu50 (Hiramatsu et al., 1997)で攻撃した。MRSA分離株USA300で認められたデータと同様に、SpAKKAAワクチン接種動物はモック免疫動物よりも腎組織において少ないMu50ブドウ球菌を有していた(P=0.0248、図7)。
SpAKKAAを用いてウサギを免疫した。SpA-DKKAAまたはSpAKKAAに特異的なウサギ抗体を、固定化された同種抗原を有する基材上でアフィニティー精製し、BALB/cマウスの腹腔へ5 mg kg-1体重の濃度で注射した(表6)。24時間後に、特異的抗体の力価を血清中で判定し、動物を黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内接種によって攻撃した。受動移入はSpA-DKKAA (P=0.0016)またはSpAKKAA (P=0.0005)特異的抗体に対する腎臓組織でのブドウ球菌負荷を低減した。組織病理検査に関し、どちらの抗体も黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃されたマウスの腎臓における膿瘍病変部の存在量を低減した(表6)。総合して、これらのデータは、SpA-DKKAAまたはSpAKKAAによる免疫後のワクチン防御が、プロテインAを中和する抗体によって与えられることを明らかにしている。
a免疫1回あたりBALB/cマウス15〜20匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。3回の独立したかつ再現可能な動物実験の代表を示す。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
d無作為に選択した5つの血清IgGの力価の平均をELISAによってブドウ球菌感染の前に測定した。
e動物10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
aアフィニティー精製された抗体を1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanによる静脈内攻撃の24時間前にBALB/cマウスの腹腔へ5 mg・kg-1の濃度で注射した。
b免疫1回あたりBALB/cマウス15匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。2回の独立したかつ再現可能な動物実験の代表を示す。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
c統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
dlog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
e無作為に選択した5つの血清IgGの力価の平均をELISAによってブドウ球菌感染の前に測定した。
f動物10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
病毒性の黄色ブドウ球菌による感染の後、マウスは同じ菌株によるその後の感染に対する防御免疫を発現しない(Burts et al., 2008)(図8)。これらの動物におけるSpA-DKKAA特異的なIgGの平均存在量はドットブロットにより、菌株NewmanおよびUSA300 LACに対して、それぞれ、0.20 μg ml-1 (±0.04)および0.14 μg ml-1 (±0.01)と判定された(図4)。SpAKKAAまたはSpA-DKKAAワクチン接種動物での疾患防御に必要なプロテインA特異的IgGの最小濃度(P .0.05 ブドウ球菌CFU g-1腎組織のlog10の低下)は、4.05 μg ml-1 (±0.88)と計算された。成人健常ヒト志願者(n=16)におけるSpA特異的IgGの平均血清濃度は、0.21 μg ml-1 (±0.02)であった。このように、マウスまたはヒトにおける黄色ブドウ球菌感染は、プロテインAに対して作製される中和抗体の有意なレベルのものを産生させる免疫反応と関係がなく、これはこの分子のB細胞超抗原特性によるものである可能性が高い。対照的に、ヒト志願者におけるジフテリア毒素に特異的なIgGの平均血清濃度0.068 μg ml-1 (±0.20)は、ジフテリアに対する防御免疫の範囲内であった(Behring, 1890; Lagergard et al., 1992)。
細菌株および増殖
黄色ブドウ球菌株NewmanおよびUSA300はトリプトソイブロス(TSB)にて37℃で増殖させた。大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)は、100 μg ml-1のアンピシリンを有するルリア・ベルターニ(LB)ブロスにて37℃で増殖させた。
黄色ブドウ球菌Newmanの鋳型DNAを用いて二つのプライマー
でSpAのコード配列をPCR増幅した。二つのプライマー
でSpA-DをPCR増幅した。Q9K,Q10Kの場合には
ならびにD36A,D37Aの場合には
の二セットのプライマーでSpA-DKKAAの配列を突然変異誘発させた。SpAKKAAの配列はIntegrated DNA Technologies, Incによって合成された。PCR産物をpET-15bにクローニングし、N末端His6タグ付き組み換えタンパク質を作出した。プラスミドをBL21(DE3)に形質転換した。形質転換体の終夜培養の培養物を新鮮な培地中で100分の1倍に希釈し、37℃でOD600 0.5まで増殖させ、この時点で培養物を1 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導し、さらに3時間増殖させた。細菌細胞を遠心分離により沈降させ、カラム用緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機により14,000 psiで破壊した。溶解物から40,000×gでの超遠心分離によって膜および不溶性成分を除去した。可溶性溶解物中のタンパク質をニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA, Qiagen)アフィニティークロマトグラフィーに供した。連続的に高濃度のイミダゾール(100〜500 mM)を含有するカラム用緩衝液中にタンパク質を溶出させた。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ法(Thermo Scientific)によってタンパク質濃度を判定した。抗体産生のため、ウサギ(6ヶ月齢New-Zealandホワイト、雌性、Charles River Laboratories)に、完全フロインドアジュバント(Difco)中で乳化されたタンパク質500 μgを被膜下(subscapular)注射によって免疫した。追加免疫のため、タンパク質を不完全フロインドアジュバント中で乳化し、初回免疫から24日または48日後に注射した。60日目に、ウサギから採血し、血清を回収した。
精製抗原(タンパク質5 mg)をHiTrap NHS-活性化HPカラム(GE Healthcare)に共有結合的に連結させた。4℃でのウサギ血清10〜20 mlのアフィニティークロマトグラフィーのために抗原-基材を用いた。充填された基材を50カラム容量のPBSで洗浄し、抗体を溶出用緩衝液(1 Mグリシン, pH 2.5, 0.5 M NaCl)で溶出し、1 M Tris-HCl, pH 8.5ですぐに中和した。精製抗体を4℃でPBSに対して終夜透析した。
アフィニティー精製された抗体をペプシン3 mgと37℃で30分間混合した。反応液を1 M Tris-HCl, pH 8.5でクエンチし、F(ab)2断片を、特異的抗原を結合させたHiTrap NHS活性化HPカラムでアフィニティー精製した。精製抗体を4℃でPBSに対して終夜透析し、SDS-PAGEゲルに負荷し、クマシーブルー染色で可視化した。
BALB/cマウス(3週齢、雌性、Charles River Laboratories)に、完全フロインドアジュバント(Difco)中で乳化されたタンパク質50 μgを筋肉内注射によって免疫した。追加免疫のため、タンパク質を不完全フロインドアジュバント中で乳化し、初回免疫から11日後に注射した。免疫後20日目に、マウス5匹から採血して酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)による特異的抗体の力価を目的に血清を得た。
黄色ブドウ球菌NewmanまたはUSA300 (LAC)の終夜培養の培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37℃で2時間増殖させた。ブドウ球菌を沈降させ、洗浄し、OD600 0.4 (およそ1×108 CFU ml-1)でPBSに懸濁した。サンプルアリコットをTSA上に広げ、形成されたコロニーを数え上げることによって接種材料を定量化した。BALB/cマウス(6週齢、雌性、Charles River Laboratories)を体重1キログラムあたり100 mg ml-1のケタミンおよび20 mg ml-1のキシラジンの腹腔内注射によって麻酔した。眼窩後部注射によって1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newmanまたは5×106 CFUの黄色ブドウ球菌USA300をマウスに感染させた。攻撃後4日目に、マウスをCO2の吸入によって殺処理した。両方の腎臓を切除し、一方の器官におけるブドウ球菌負荷を、PBS, 1% Triton X-100で腎組織をホモジナイズすることによって分析した。ホモジネートの連続希釈液をTSA上に広げ、コロニー形成のためにインキュベートした。残りの器官は組織病理診断によって調べた。手短に言えば、腎臓を室温にて24時間10%ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、光学顕微鏡検査により検査して膿瘍病変部を数え上げた。全てのマウス実験は、シカゴ大学の施設内生物安全委員会(IBC)および動物実験委員会(IACUC)による実験プロトコルの審査および承認に従う施設内ガイドラインによって実施された。
ブドウ球菌を用いて眼窩後部注射(1×107 CFUの黄色ブドウ球菌Newman、5×106 CFUの黄色ブドウ球菌USA300または3×107 CFUの黄色ブドウ球菌Mu50)により麻酔マウスに感染させた。4、15または30日目に、マウスを殺処理し、腎臓を切除し、ホモジナイズ組織をコロニー形成のために寒天上に広げた。器官組織をまた、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシンで染色し、顕微鏡検査した。動物実験は、シカゴ大学の施設内生物安全委員会(IBC)および動物実験委員会(IACUC)による実験プロトコルの審査および承認に従う施設内ガイドラインによって実施された。
ヒトIgGの結合のため、Ni-NTAアフィニティーカラムにカラム用緩衝液中200 μgの精製タンパク質(SpA、SpA-D、SpA-DKKAAおよびSrtA)を予め充填した。洗浄後、ヒトIgG (Sigma) 200 μgをカラムに負荷した。タンパク質サンプルを洗浄液および溶出液から回収し、SDS-PAGEゲル電気泳動に供し、引き続いてクマシーブルー染色を行った。精製タンパク質(SpA、SpAKKAA、SpA-DおよびSpA-DKKAA)を0.1 M炭酸緩衝液(pH 9.5)中1 μg ml-1の濃度で終夜4℃にてMaxiSorp ELISAプレート(NUNC)上にコーティングした。プレートを次に、5%全乳でブロッキングし、ペルオキシダーゼ結合ヒトIgG、FcまたはF(ab)2断片の連続希釈液とのインキュベーションを1時間行った。プレートを洗浄し、OptEIA ELISA試薬(BD)を用いて発色させた。反応を1 Mリン酸でクエンチし、A450の読み出しを用いて最大半量の力価および結合割合を計算した。
精製タンパク質(SpA、SpAKKAA、SpA DおよびSpA-DKKAA)を上記のようにコーティングし、ブロッキングした。プレートを2時間1 μg ml-1の濃度のヒトvWFとともにインキュベートし、次いで洗浄し、さらに1時間ヒトIgGでブロッキングした。洗浄後、プレートを、ヒトvWFに対して作製されたペルオキシダーゼ結合抗体の連続希釈液とともに1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、OptEIA ELISA試薬(BD)を用いて発色させた。反応を1 Mリン酸でクエンチし、A450の読み出しを用いて最大半量の力価および結合割合を計算した。阻害アッセイ法のため、プレートをリガンド結合アッセイ法の前に1時間10 μg ml-1の濃度のSpA-DKKAA特異的アフィニティー精製F(ab)2断片とともにインキュベートした。
アフィニティー精製されたタンパク質(SpA、SpA-D、SpAKKAAおよびSpA-DKKAA 150 μg)をBALB/cマウス(6週齢、雌性、Charles River Laboratories)の腹腔へ注射した。注射から4時間後に、動物をCO2の吸入によって殺処理した。それらの脾臓を切除し、ホモジナイズした。細胞ろ過器を用いて細胞残屑を除去し、懸濁細胞をACK溶解用緩衝液(0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA)に移入して、赤血球を溶解した。白血球を遠心分離により沈降させ、PBSに懸濁し、250分の1希釈されたR-PE結合抗CD19モノクローナル抗体(Invitrogen)で氷上および暗所中にて1時間染色した。細胞を1% FBSで洗浄し、4℃にて終夜4%ホルマリンで固定した。翌日、細胞をPBS中で希釈し、フローサイトメトリーによって分析した。組織病理診断を目的に、残りの器官を調べた。手短に言えば、脾臓を室温にて24時間10%ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、Apoptosis検出キット(Millipore)で染色し、光学顕微鏡検査により検査した。
血清を、30日間黄色ブドウ球菌NewmanもしくはUSA300で感染されていたか、または上記のようにSpA-DKKAA/SpAKKAAで免疫されていた健常ヒト志願者またはBALB/cマウスから回収した。ヒト/マウスIgG (Jackson Immunology Laboratory)、SpAKKAAおよびCRM197をニトロセルロース膜上にブロットした。膜を5%全乳でブロッキングし、引き続きヒトまたはマウス血清のいずれかとのインキュベーションを行った。IRDye 700DX結合アフィニティー精製抗ヒト/マウスIgG (Rockland)を用いてOdyssey(商標)赤外画像システム(Li-cor)によりシグナル強度を定量化した。ヒト志願者由来の血液を用いた実験では、シカゴ大学の施設内治験審査委員会(IRB)の規制監督下で審査され、承認され、実施されたプロトコルを伴った。
両側スチューデントt検定を実施して、腎膿瘍、ELISAおよびB細胞超抗原のデータの統計的有意性を解析した。動物生存のデータはlog-rank試験(Prism)で解析した。
全ての黄色ブドウ球菌臨床分離株はコアグラーゼ活性、つまりフィブリノゲンを切断するためのプロトロンビンの非タンパク質分解活性化による血液または血漿の凝固を示す。本発明者らは、感染マウスのブドウ球菌膿瘍病変部においてプロトロンビン、フィブリノゲン、コアグラーゼ(Coa)およびフォンウィルブランド因子結合タンパク質(vWbp)を特定した。分泌CoaおよびvWbpはともに、黄色ブドウ球菌Newmanコアグラーゼ活性に寄与し、それによってマウスにおいて膿瘍形成および致死的疾患を可能にした。精製CoaまたはvWbpに対して作製された抗体は、対応するポリペプチドとプロトロンビンおよびフィブリノゲンとの結合を特異的に遮断する。Coa-およびvWbp-特異的抗体は、能動免疫または受動免疫により作製されたかにかかわらず、ブドウ球菌に感染したマウスの膿瘍形成および死亡数を抑制した。
ブドウ球菌膿瘍におけるコアグラーゼおよび凝固因子の局在
以前の研究により、1×107 CFUのヒト臨床分離株・黄色ブドウ球菌Newman (Baba et al., 2007)がBALB/cマウス(Albus et al., 1991)の血流中に注射されるマウス腎膿瘍モデルが樹立された。感染から48時間後に、マウスはヘマトキシリン・エオシン染色され、薄切片にされた腎臓組織の光学顕微鏡検査により検出可能な、多器官における播種性膿瘍を、病初では細菌をほとんど含まない多形核白血球(PMN)の蓄積として発現する(Cheng et al., 2009)。感染から5日目までに、膿瘍はサイズが増大し、好酸球性の無形性物質の層(偽被膜)および大きなPMNカフで囲まれた、中心のブドウ球菌集団(ブドウ球菌膿瘍群集-SAC)を含む(Cheng et al., 2009)。組織病理診断から、膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌巣のすぐ近くでのPMNの大量壊死および一面の正常食細胞が明らかである。もっと後の時間間隔で、SACは増大し、膿瘍が破裂して、血流中に壊死物質およびブドウ球菌を放出する。新たなラウンドの膿瘍形成が始まり、最終的には感染の致死的転帰を招く(Cheng et al., 2009)。
黄色ブドウ球菌Newmanの染色体上のcoaおよび/またはvWbp遺伝子を、pKOR1技術を用いて対立遺伝子置換により欠失させた(Bae and Schneewind, 2005)。coaまたはvWbp構造遺伝子およびその上流プロモーター配列をpOS1 (Schneewind et al., 1993)にクローニングすることによって、二つの補完性プラスミドpcoaおよびpvWbpを作出した。プラスミドをブドウ球菌に電気穿孔し、その継続的複製を、クロラムフェニコールを補充した培地にて選択した(Schneewind et al., 1992)。コアグラーゼを特異的抗体でプローブした場合、本発明者らはCoa分泌を、野生型およびΔvWbp菌株によって認めたが、ΔcoaまたはΔcoa/ΔvWbp変種によっては認めなかった(図11)。ΔcoaおよびΔcoa/ΔvWbp変異体の表現型欠損は、pcoaでの電気穿孔によって回復されたが、pvWbpによっては回復されなかった(図11)。同様に、vWbpの分泌は黄色ブドウ球菌Newman (野生型)およびΔcoa変異体培養物において認められたが、ΔvWbpまたはΔcoa/ΔvWbp変種においては認められなかった(図11)。この欠損はpvWbpでの電気穿孔によって回復したが、pcoaによっては回復しなかった。
コアグラーゼの病毒性寄与について分析するため、本発明者らは初めに、レピルジン処理血液でのブドウ球菌の生存について調べた。野生型菌株の黄色ブドウ球菌Newmanはマウス血液中で殺処理されなかったが、しかしCoaを欠く同質遺伝子変種、すなわちΔcoaおよびΔcoa/ΔvWbpは、各々がインキュベーションから30分後にCFUの顕著な低減を示した。この生存の欠損はpcoaによって回復されたが、pvWbpによっては回復されなかったことから、マウス血液中でのブドウ球菌の生存にはCoaだけが必要であることを示唆している。
*BALB/cマウス(n=18〜20)の腹膜へ0日目に、アフィニティー精製されたvWbpに対するウサギ抗体(α-vWbp)、Coaに対するウサギ抗体(α-Coa)またはvWbpおよびCoaに対するウサギ抗体(α-vWbp/Coa)の各100 μlを注射した。24時間後、動物を血清中IgG抗体の力価について調べ、1×107コロニー形成単位(CFU)の黄色ブドウ球菌Newmanまたはその変異体の静脈内接種により攻撃した。5または15日後、動物を殺処理し、両方の腎臓を切除した。一方の腎臓をホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシン染色し、腎臓あたり4枚の矢状切片を膿瘍形成について分析した。もう一方の腎臓をPBS緩衝液中でホモジナイズし、ホモジネートをコロニー形成のため寒天培地上に広げ、ブドウ球菌負荷をCFUとして数え上げた。
a免疫1回あたりBALB/cマウス18〜20匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
e感染から4日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(陽性%)によって測定した。
f動物10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
g統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
組み換えHis6-CoaおよびHis6-vWbpをNi-NTA上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し(図13A)、アジュバント中で乳化し、ウサギを注射して特異的抗体を産生させ、これを、組み換えタンパク質を有するアフィニティー基材上で精製した。Coaに対して作製された抗体はCoaに選択的に結合し、vWbpには結合しなかった(図13B)。この相反性はvWbpに対して作製された抗体にも当てはまった(図13B)。本発明者らは、黄色ブドウ球菌Newmanに感染したレピルジン処理マウス血液への添加時に、Coa、vWbpまたはCoaおよびvWbpに対して作製された抗体がそれぞれ、血液の凝固を遮断することを認めた(図13C)。対照として、モック処理サンプルまたは無関係のV10抗体(ペスト菌(Yersinia pestis) III型注射に対する防御を与える(DeBord et al., 2006))では効果がなかった(図13C)。
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、αCoaおよびαvWbp抗体が、コアグラーゼの生理学的機能をいかにして妨げるかについて調べた。プロトロンビンをCM5チップ上に固定化した。サンプルに対して精製Coaを流し、文献(Friedrich et al., 2003)での他の報告に見合った測定値である、解離定数KD 28 nMが計算された。αCoaの添加はプロトロンビン-Coaの形成に対する反応シグナルの濃度依存的な減少をもたらし、これらの抗体がCoaとプロトロンビンとの結合を遮断することを示していた(図14A)。SPRによってさらに、コアグラーゼとフィブリノゲンとの間の結合(KD 93.1 nM、図14B)が確認された。本発明者らは、αCoaとのプレインキュベーションによって、Coaとフィブリノゲンとの結合の劇的な減少を認めた(図14B)。総合すれば、これらの結果は、Coaに対して作製された抗体がこの分子と血液凝固因子との結合を遮断することを示している。
CoaまたはvWbpに特異的なIgG型抗体を、CNBrセファロースへの抗原の共有結合性架橋によって作出された、アフィニティーカラムに対するクロマトグラフィーによってウサギ血清から単離した。本発明者らは、Coaおよび/またはvWbpに対して作製された中和抗体の投与によってブドウ球菌の発病を撹乱しようと試みた。マウスにウサギ抗体を投与し、これを致死的用量の黄色ブドウ球菌株Newmanで攻撃した。CoaまたはvWbp特異的抗体の注射によって、ネズミの生存時間が顕著に延ばされた(図15)。
*BALB/cマウス(n=18〜20)の腹膜へ0日目に、アフィニティー精製されたvWbpに対するウサギ抗体(α-vWbp)、Coaに対するウサギ抗体(α-Coa)またはvWbpおよびCoaに対するウサギ抗体(α-vWbp/Coa)の各100 μlを注射した。24時間後、動物を血清中IgG抗体の力価について調べ、1×107コロニー形成単位(CFU)の黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内接種により攻撃した。5日後、動物を殺処理し、両方の腎臓を切除した。一方の腎臓をホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシン染色し、腎臓あたり4枚の矢状切片を膿瘍形成について分析した。もう一方の腎臓をPBS緩衝液中でホモジナイズし、ホモジネートをコロニー形成のため寒天培地上に広げ、ブドウ球菌負荷をCFUとして数え上げた。
a免疫1回あたりBALB/cマウス18〜20匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
e感染から4日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(陽性%)によって測定した。
f動物10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
g統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
ポリヒスチジンタグ付きCoAおよびvWbpを大腸菌から精製し、サブユニットワクチン抗原として用いた。タンパク質(100 μg; CFAまたはIFA中に乳化)を0日目(CFA)または11日目(IFA)に未処置のBALB/cマウスへ注射した。黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内接種によって21日目に動物を攻撃した。攻撃の時点で対照動物5匹から採血し、ワクチン抗原に対する血清抗体の力価をELISAによって判定した(表9)。攻撃から5または15日後に動物を殺処理し、ブドウ球菌負荷および膿瘍病変部の組織病理診断の分析を行った。Coaによる免疫は細菌負荷を5日目(P=0.03、PBSモック vs. Coa)および15日目(P=4.286×10-5、PBSモック vs. Coa、表9参照)までに低減した。Coaワクチン接種も、腎臓組織において形成された感染病変部の数を減らした; モック vs. Coa、P=0.03 (5日目)およびP=0.0522 (15日目) (表9)。注目すべきは、Coa免疫マウスのどれも典型的な膿瘍病変部を発現しなかった(図17)。時折、ブドウ球菌膿瘍群集と関連のないPMNの小さな蓄積を認めた(図17)。vWbpによる免疫はブドウ球菌負荷を5日目に(P=0.39、PBSモック vs. vWbp)または15日目に(P=0.09、PBSモック vs. vWbp)あまり低減しなかった。炎症性病変部の総数は減らなかった。それにもかかわらず、膿瘍の構造はvWbpによる免疫後に変化していた。ブドウ球菌群集は膿瘍の中心に検出されず、その代わりに、PMNの浸潤を認めた(図17)。組み合わせワクチンvWbp-Coaは、腎臓組織における炎症細胞の数をさらに低減し、感染動物は膿瘍病変部を5または15日目に呈さなかった(表9)。
*BALB/cマウス(n=18〜20)に0日目に、CFA中で乳化された精製vWbp、CoaまたはvWbpおよびCoaの各100 μgを注射し、11日目にIFA中で乳化された同じ抗原を追加免疫した。20日目にIgG抗体の力価について動物を調べ、21日目に1×107コロニー形成単位(CFU)の黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内接種によって動物を攻撃した。25日目に、動物を殺処理し、両方の腎臓を切除した。一方の腎臓をホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン・エオシン染色し、腎臓あたり4枚の矢状切片を膿瘍形成について分析した。もう一方の腎臓をPBS緩衝液中でホモジナイズし、ホモジネートをコロニー形成のため寒天培地上に広げ、ブドウ球菌負荷をCFUとして数え上げた。
a免疫1回あたりBALB/cマウス18〜20匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10 CFU g-1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差(±SEM)が示してある。
b統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した。P値 <0.05を有意と見なした。
clog10 CFU g-1として計算された細菌負荷の低下。
d無作為に選択した5つの血清IgGの力価の平均をSpA-DKKAA抗原でのELISAによってブドウ球菌感染の前に測定した。
e感染から4日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査(陽性%)によって測定した。
f動物10匹からヘマトキシリン・エオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断; 腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均(±SEM)を目的に再び平均化した。
g統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録した; P値 <0.05を有意と見なした。
h黄色ブドウ球菌Newmanによる感染から5日後のマウスの分析。
i黄色ブドウ球菌Newmanによる感染から15日後のマウスの分析。
細菌株および培養物の増殖
ブドウ球菌はトリプトソイ寒天またはブロスにて37℃で培養された。大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3) (Studier et al., 1990)は、ルリア寒天またはブロスにて37℃で培養された。アンピシリン(100 μg/ml)およびクロラムフェニコール(10 μg/ml)を、それぞれ、pET15b (Studier et al., 1990)およびpOS1 (Schneewind et al., 1993)プラスミド選択に用いた。
プライマーattB1_Coa、Coa1_BamHI、Coa2_BamHI、attbB2_CoaおよびattB1_vWF、vWF1_BamHI、vWF2_BamHI、attbB2_vWF (表10)を用いて、coaおよびvWbpの1 kb上流および下流のDNA配列をPCR増幅した。この断片を、BPクロナーゼIIキット(Invitrogen)を用いてpKOR1上に入れ替えた(Bae and Schneewind, 2005)。これらのベクターを黄色ブドウ球菌Newmanへ電気穿孔し、温度変化誘導性の対立遺伝子交換に供して対応する欠失を作出した(Bae and Schneewind, 2005)。変異体を、遺伝子座のPCR増幅、DNA配列決定および免疫ブロット分析によって確認した。
ブドウ球菌株の終夜培養の培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、OD600 0.4に達するまで37℃で増殖させた。培養物1 mlを遠心分離し、ブドウ球菌を洗浄し、無菌PBS 10 mlに懸濁して1×107 CFU/mlの懸濁液を作出した。未処置6週齢Balb/cマウス由来の全血を回収し、REFLUDAN(商標) (lepirudin, Bayer)を終濃度50 μg/mlまで加えた。血液450 μLを1 mlのエッペンドルフ管へ分注し、50 μlの細菌サンプル(1×105 CFU/ml)と混合した。サンプルをゆっくり回転させながら37℃でインキュベートした。アリコット100 μlを0分および30分の時点で除去し、2%サポニン/PBSと1:1混合し、30分間氷上でインキュベートした。5つの10分の1連続希釈液を調製し、コロニーの形成および数え上げのためにアリコット10 μlをTSA寒天上に広げた。
ワクチン接種研究のため、プライマーのCoa_foward_XhoI、Coa_reverse_BamHI、vWbp_forward_XhoI、vWbp_reverse_BamHI (表10)を用いpET15bベクターに成熟CoaまたはvWbpの全長コード配列をクローニングしてHis6-CoaおよびHis6-vWbpを得た。発現ベクターを持つ大腸菌BL21(DE3)を37℃で増殖させ、2時間後1 mM IPTGで誘導した。誘導から4時間後に、細胞を6,000×gで遠心分離し、1×カラム用緩衝液(0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M NaCl)に懸濁し、フレンチプレス中にて14,0000 lb/in2で溶解した。溶解物を30分間40,000×gでの超遠心分離に供し、上清をNi-NTAクロマトグラフィーに供し、25 μMイミダゾールを含有するカラム用緩衝液で洗浄し、引き続き500 μMイミダゾールでの溶出を行った。溶出液を1×PBSで透析した。内毒素を除去するため、1,000分の1のTriton-X114を添加し、溶液を5分間冷却し、37℃で10分間インキュベートし、13,000×gで遠心分離した。上清をHiTrap脱塩カラムに負荷して、Triton-X114のいずれの残存物も除去した。
タンパク質濃度はBCAキット(Thermo Scientific)を用いて決定した。純度はSDS pageゲル分析およびクマシーブリリアントブルー染色によって確認した。6ヶ月齢New-Zealandホワイトの雌性ウサギ(Charles River Laboratories)に初回免疫の場合にはCFA (Difco)または24および48日目の追加免疫の場合にはIFA中で乳化されたタンパク質500 μgを免疫した。60日目に、ウサギから採血し、免疫ブロッティングまたは受動移入実験のために血清を回収した。抗体精製のため、組み換えHis6-CoaまたはHis6-vWbp (5 mg)をHiTrap NHS-活性化HPカラム(GE Healthcare)に共有結合的に連結させた。この抗原-基材を次に、4℃でのウサギ血清10〜20 mlのアフィニティークロマトグラフィーに用いた。充填された基材を50カラム容量のPBSで洗浄し、抗体を溶出用緩衝液(1 Mグリシン, pH 2.5、0.5 M NaCl)で溶出させ、1 M Tris-HCl, pH 8.5ですぐに中和した。精製抗体を4℃でPBSに対して終夜透析した。
親和性ならびに結合速度および解離速度をBIAcore 3000にて測定した。緩衝液をろ過滅菌し、脱気した。アミン結合を目的に0.2 M EDCおよび0.05 M NHSの存在下でのヒトプロトロンビン(500 nM, pH 4.0) (Innovative Research)およびヒトフィブリノゲン(200 nM, pH 4.5) (Innovative Research)の注入によってCM5チップを調製した。コアグラーゼとプロトロンビンおよびフィブリノゲンとの相互作用を測定するため、CoaをHBS-P緩衝液(20 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、0.005% [体積/体積]界面活性剤P20)の中に濃度0〜75 nMで希釈し、連続してコアグラーゼの注入300秒間、引き続き解離を300秒、引き続きNaOHによる再生(50 μL、30秒)を行った。BiaEvaluationソフトウェアを用いてKDおよびχ2を決定し、ドリフティングベースラインおよび局所Rmaxありの1:1結合モデルで最良の適合を決定した。フォンウィルブランド因子とプロトロンビンおよびフィブリノゲンとの相互作用を同じように測定した。全ての実験は三つ組で繰り返した。ポリクローナル抗体による阻害実験は上記と同じ注入条件の下、0 nM〜200 nMのαCoaとともにインキュベートされたコアグラーゼ(25 nM)の連続注入によって行った。vWF (50 nM)を0 nM〜400 nMのαvWFとともに同様にインキュベートした。注入の前から注入の終わりまでの反応単位の変化として反応の差異を測定した。
1×10-16 Mのプロトロンビン(Innovative Research)を等量の機能的コアグラーゼまたはvWbpとともに室温で20分間プレインキュベートした後、1×PBS 100 μlの全反応緩衝液中1 mMの終濃度までS-2238 (発色基質)の添加を行った。吸光度の変化を分光光度計にて10分間450 nmで測定し、時間の関数としてプロットし、線形曲線に適合させた。曲線の傾き(dA/dt)はS-2238加水分解の速度であると解釈され、したがって、酵素機能(コアグラーゼ-プロトロンビンまたはvWbp-プロトロンビン複合体活性 %)を反映していると解釈された。このアッセイを、3 M過剰(3×10-16 M)で添加された特異性または交差性抗体の存在下で繰り返し、データを、阻害なしでの平均活性%に対して規準化した。
ブドウ球菌株の終夜培養の培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、OD600 0.4に達するまで増殖させた。細菌10 mlを7,500×gで遠心分離し、洗浄し、1×PBS 10 mlに懸濁した。6週齢雌性BALB/cマウス(Charles River)の眼窩後部にPBS 100 μl中1×107 CFUのブドウ球菌懸濁液を注射した。マウス10匹のコホートを用いた。感染後5日目に、これらのマウスをCO2窒息によって殺処理し、その腎臓を切除した。全ての器官を表面病変部について調べ、右腎8〜10個を組織病理切片作製およびヘマトキシリン・エオシン染色のために発送した。これらのスライドを内部膿瘍を目的に光学顕微鏡検査によって調べた。致死的攻撃モデルの場合、全ての実験条件は、1×108 CFUのブドウ球菌を投与したこと、およびマウスを感染後10日間、生存についてモニタリングしたことを除いて何ら変わりない。
切片化された腎臓を脱パラフィン化し、キシレンおよびEtOHの連続希釈を通じて蒸留水に再水和された。それらを抗原回復用緩衝液(DAKO, pH 6.0)中でインキュベートし、蒸し器にて20分間96℃超で加熱した。洗浄後、スライドを5分間3%の過酸化水素、次いで30分間0.025%のTritonx-100-PBS中10%の正常血清中にてインキュベートした。30分のインキュベーションの間のブロッキング試薬として10%ヒトIgGを用いた(Sigma-Aldrich)。湿度室中4℃での終夜インキュベーションの間、スライド上に一次抗体を適用した。使用した一次抗体は、500分の1のラット抗マウスプロトロンビン(Innovative Research)、500分の1のウサギ抗マウスフィブリノゲン(Innovative Research)、250分の1のウサギ抗スタフィロコアグラーゼまたは250分の1のウサギ抗ブドウ球菌vwbpであった。TBS洗浄の後、スライドをビオチン化二次抗体(Vector Laboratoriesの50分の1希釈のビオチン化抗ラットIgG, BA-4001; またはVectorの200分の1希釈のビオチン化抗ウサギIgG, BA-1000)、次いでABC試薬(Vector Laboratories)とともにインキュベートした。抗原-抗体結合をDAB基質色素原の系によって検出した。スライドを対比染色のためにヘマトキシリン中に手短に浸漬し、光学顕微鏡下で評価した。
3週齢BALB/cマウスにCFA 100 μl中で乳化された各タンパク質50 μgを注射した。マウス15匹のコホートを用い、マウス5匹は採血および抗体力価のために取っておいた。ワクチン接種から11日後に、これらのマウスにIFA 100 μl中で乳化された各タンパク質50 μgを追加免疫した。21日目に、マウスに腎膿瘍モデルの場合には1×107 CFU、または致死的攻撃の場合には1×108 CFUのブドウ球菌を注射した。感染の時点でマウス5匹から採血して抗体の力価を得た。
感染の24時間前に、6週齢BALB/cマウスにCoaおよび/またはvWbpに対する精製抗体を5 mg/kg体重の用量で注射した。マウス10匹のコホートを用いた。これらのマウスを1×107 CFUのブドウ球菌(腎膿瘍モデル)または1×108 CFUのブドウ球菌(致死的菌血症)の眼窩後部注射によって攻撃した。
Claims (43)
- (a) Fc結合を破壊する少なくとも一つのアミノ酸置換および(b) VH3結合を破壊する少なくとも第二のアミノ酸置換および(c) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する変種プロテインA (SpA)を含み、変種SpAがSEQ ID NO:2のアミノ酸9、10、36または37に対応するアミノ酸位置に2つ以上のアミノ酸置換を有し、変種プロテインAが毒素非産生性であり、かつブドウ球菌プロテインAおよび/またはこれを発現する細菌に対する免疫反応を刺激する、単離ポリペプチド。
- 変種SpAが、変種ドメインDセグメントを含む、請求項1記載の単離ポリペプチド。
- 変種SpAが、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項2記載の単離ポリペプチド。
- SEQ ID NO:2の位置9または10におけるアミノ酸置換が、グルタミン残基に代えてリジン残基である、請求項2記載の単離ポリペプチド。
- ドメインDのアミノ酸配列がSEQ ID NO:2のアミノ酸位置36および37にアラニン残基置換を含む、請求項4記載の単離ポリペプチド。
- SpA Eドメイン、Aドメイン、BドメインまたはCドメインの一つまたは複数の変種をさらに含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の単離ポリペプチド。
- 二つまたはそれ以上のDドメインセグメントを含む、請求項2〜5のいずれか一項記載の単離ポリペプチド。
- 非プロテインAセグメントをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離ポリペプチド。
- 非プロテインAセグメントが第二の抗原セグメントである、請求項8記載の単離ポリペプチド。
- 第二の抗原セグメントがブドウ球菌抗原セグメントである、請求項9記載の単離ポリペプチド。
- ブドウ球菌抗原セグメントがEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよび/またはSasFセグメントである、請求項10記載の単離ポリペプチド。
- 薬学的に許容される組成物の中に、IgG、Fcγ、VH3 F(ab)2、フォンウィルブランド因子(vWF)および腫瘍壊死因子α受容体1 (TNFR1)とのプロテインAドメインDの結合を弱力化する2つ以上の変異を有する毒素非産生性の変種プロテインA (SpA)ペプチドを含み、SpA変種がSEQ ID NO:2のアミノ酸9、10、36または37に対応するアミノ酸位置に2つ以上のアミノ酸置換を有する、免疫原性組成物。
- 変種プロテインA (SpA)ペプチドが、請求項1〜11のいずれか一項記載の単離ポリペプチドである、請求項12記載の免疫原性組成物。
- 少なくとも第二のブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項12または13記載の免疫原性組成物。
- 第二のブドウ球菌抗原がEsaB、Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよび/またはSasFペプチドから選択される、請求項14記載の免疫原性組成物。
- プロテインAドメインDペプチドを含むペプチド以外のブドウ球菌成分の1重量%未満を含む、請求項12または13記載の免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項12または13記載の免疫原性組成物。
- SpA変種がアジュバントにカップリングされる、請求項17記載の免疫原性組成物。
- Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFからなる群より選択される少なくとも一つの他のブドウ球菌抗原またはその免疫原性断片をさらに含む、請求項12〜18のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- PIA多糖類またはオリゴ糖をさらに含む、請求項12〜19のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 黄色ブドウ球菌(S. aureus)由来のV型および/またはVIII型莢膜多糖類またはオリゴ糖をさらに含む、請求項12〜20のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- ブドウ球菌莢膜多糖類がタンパク質担体に結合される、請求項12〜21のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- タンパク質担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)プロテインD、肺炎球菌溶血素およびαトキソイドからなる群より選択される、請求項22記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の単離ポリペプチドまたは請求項12〜23のいずれか一項記載の免疫原性組成物、および薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
- 抗原を混合して請求項12〜23のいずれか一項記載の免疫原性組成物を作出する段階および薬学的に許容される賦形剤を添加する段階を含む、ワクチンを作出する方法。
- レシピエントを請求項24記載のワクチンで免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む方法によって調製されるブドウ球菌感染の予防または処置で用いるための免疫グロブリン。
- 請求項26記載の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- ブドウ球菌感染の処置または予防のための、請求項24記載のワクチンまたは請求項27記載の薬学的組成物。
- ブドウ球菌感染の処置または予防用の薬物の製造における、請求項1〜11のいずれか一項記載の単離ポリペプチド、請求項12〜23のいずれか一項記載の免疫原性組成物または請求項27記載の薬学的組成物の使用。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の単離ポリペプチド、請求項1〜11のいずれか一項記載の単離ポリペプチドをコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子、または請求項12〜23のいずれか一項記載の免疫原性組成物を含む、対象においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発するための薬学的組成物
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の単離ポリペプチドまたは請求項12〜23のいずれか一項記載の免疫原性組成物を含む、ブドウ球菌感染を有する、ブドウ球菌感染を有することが疑われる、またはブドウ球菌感染を発症するリスクがある対象においてブドウ球菌感染を処置するための薬学的組成物。
- 対象がアジュバントも投与される、請求項30記載の薬学的組成物。
- ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項30または31記載の薬学的組成物。
- ブドウ球菌が一つまたは複数の処置に対して耐性である、請求項30記載の薬学的組成物。
- 前記菌がメチシリン耐性である、請求項34記載の薬学的組成物。
- 対象に二回以上投与するための、請求項30または31記載の薬学的組成物。
- 経口的に、非経口的に、皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与するための、請求項30または31記載の薬学的組成物。
- SpA変種を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、請求項30記載の薬学的組成物。
- 組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌(Salmonella)である、請求項38記載の薬学的組成物。
- 対象が哺乳類である、請求項30または31記載の薬学的組成物。
- 対象がヒトである、請求項30または31記載の薬学的組成物。
- 免疫反応が防御免疫反応である、請求項30記載の薬学的組成物。
- 対象が持続的ブドウ球菌感染と診断される、請求項31記載の薬学的組成物。
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