BRPI1010307B1 - Polipeptídeos variantes de proteína a (spa), composição imunogênica compreendendo os mesmos, vacina, método de produção da referida vacina, bem como uso dos referidos polipeptídeos - Google Patents

Polipeptídeos variantes de proteína a (spa), composição imunogênica compreendendo os mesmos, vacina, método de produção da referida vacina, bem como uso dos referidos polipeptídeos Download PDF

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Alice Cheng
Dominique M.Missiakas
Hwan Kim
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University Of Chicago
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Abstract

composições e métodos relacionados a variantes de proteína a (spa). a presente invenção refere-se a métodos e composições para o tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana, particularmente infecção por uma bactéria estafilocócica. a invenção proporciona métodos e composições para estimulação de uma resposta imune contra a bactéria. em determinadas modalidades, os métodos e composições envolvem uma variante de proteína a (spa) não toxigênica.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A presente invenção foi feita com suporte do governo sob AI057153, AI75258, AI052474 e GM007281 concedido pelo National Institutes of Health. O Governo tem determinados direitos na invenção.
O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório U.S. No. de Série No. 61/166.432, depositado em 3 de Abril de 2009, Pedido Provisório U.S. No. de Série No. 61/237.956, depositado em 28 de Agosto de 2009 e Pedido Provisório U.S. No. de Série No. 61/287.996, depositado em 18 de Dezembro de 2009.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se, em geral, aos campos de imuno- logia, microbiologia e patologia. Mais particularmente, ela refere-se a métodos e composições envolvendo variantes de Proteína A bacteriana, as quais podem ser usadas para estimular uma resposta imune contra a bactéria. ANTECEDENTES
Uma série de infecções adquiridas no hospital e em comunidade tem aumentado durante anos recentes com o uso crescente de dispositivos intravasculares. Infecções adquiridas em hospital (nosocomiais) são a principal causa de morbidade e mortalidade, mais particularmente nos Estados Unidos, onde ela afeta mais de 2 milhões de pacientes anualmente. As infecções mais frequentes são infecções do trato urinário (33% das infecções), seguido por pneumonia (15,5%), infecções no local cirúrgico (14,8%) e infecções primárias da corrente sanguínea (13%) (Emorl e Gaynes, 1993).
Os principais patógenos nosocomiais incluem Staphylococcus aureus, Estafilococos coagulase-negativos (principalmente Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp., Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Embora esses patógenos causem aproximadamente o mesmo númeroSegue-se folha 1a/171 1a/171de infecções, a gravidade dos distúrbios que eles podem produzir, combina-Segue-se folha 2/171S. aureus e S. epidermidis como sendo os patógenos nosocomiais mais significativos.
Estafilococos podem causar urna ampla variedade de doenças em seres humanos e outros animais através de produção de toxina ou inva- 5 são. Toxinas estafilocócicas são também uma causa comum de contaminação alimentar, uma vez que a bactéria pode crescer em alimentos inapropri- adamente armazenados.
Staphylococcus epidermidis é um comensal o qual também é um patógeno oportunístico importante responsável por infecções de dispositivos 10 médicos danificados e infecções em locais de cirurgia. Dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluem marca-passos cardíacos, shunts de fluido cérebro-espinhal, cateteres de diálise peritonial ambulatorial contínua, dispositivos ortopédicos e válvulas cardíacas proféticas.
Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções no- 15 socomiais com uma morbidade e mortalidade significativas. Ele é a causa de alguns casos de osteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos e síndrome de choque tóxico. S. aureus pode sobreviver sobre su-perfícies secas, aumentando a chance de transmissão. Qualquer infecção por S. aureus pode causar a síndrome da pele escaldada estafilocócica, uma 20 reação cutânea à exotoxina absorvida na corrente sanguínea. Ele também pode causar um tipo de septicemia denominada piemia, que pode ameaçar a vida. Problematicamente, Staphylococcus aureus resistente à Meticilina (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus - MRSA) tem se tornado uma causa principal de infecções adquiridas em hospital.
Infecções por S. aureus e S. epidermidis são, tipicamente, tratadas com antibióticos, com penicilina sendo o fármaco de escolha, enquanto que vancomicina é usada para isolados resistentes à meticilina. O percentual de cepas estafilocócicas que exibem resistência de amplo espectro a antibióticos tem se tornado crescentemente prevalente, impondo uma ameaça àterapia antimicrobiana eficaz. Além disso, a recente emergência de cepas de S. aureus resistente à vancomicina tem estimulado o medo de que cepas MRSA estejam surgindo e se disseminando, para as quais nenhuma terapia está disponível.
Uma alternativa ao tratamento com antibiótico para infecções es- tafilocócicas está sob investigação, a qual usa anticorpos dirigidos contra antígenos estafilocócicos. Essa terapia envolve a administração de antissoro policlonal (WOOO/15238, WOOO/12132) ou tratamento com anticorpos mono- clonais contra o ácido lipoteicóico (WO98/57994).
Uma abordagem alternativa seria o uso de vacinação ativa para gerar uma resposta imune contra os estafilococos. O genoma do S. aureus foi sequenciado e muitas das sequências de codificação foram identificadas (WO02/094868, EP0786519), o que pode levar à identificação de antígenos em potencial. O mesmo é verdadeiro para S. epidermidis (W001/34809). Como um refino dessa abordagem, outros identificaram proteínas que são reconhecidas por soro hiperimune de pacientes que sofreram infecção estafi- locócica (WO01/98499, W002/059148).S. aureus secreta uma pletora de fatores de virulência no milieu extracelular (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Foster, 2005; Shaw et a/., 2004; Sibbald et al., 2006). Assim como a maioria das proteínas secretadas, esses fatores de virulência são translocados pela maquinaria See através da membrana plasmática. Proteínas secretadas pela maquinaria See trazem um peptídeo líder N-terminal que é removido pela peptidase líder uma vez que a pré-proteína está encaixada no translocon See (Dalbey e Wickner, 1985; van Wemente et al., 2001). Análise genômica recente sugere que Actinobacté- rias e membros de Firmicutes codificam um sistema de secreção adicional que reconhece um subconjunto de proteínas de uma maneira Sec- independente (Pallen, 2002). ESAT-6 (Early Secreted Antigen Target 6 kDa) e CFP-10 (Culture Filtrate Antigen 10 kDa) de Mycobacterium tuberculosis representam os primeiros substratos desse novo sistema de secreção denominado ESX-1 ou Snm em M. tuberculosis (Andersen et al., 1995; Hsu et al., 2003; Pym et al., 2003; Stanley et al., 2003). Em S. aureus, dois fatores semelhantes ao ESAT-6, designados EsxA e EsxB, são secretaries pela via Ess (Sistema de Secreção ESAT-6 - ESAT-6 Secretion System) (Burts et al., 2005).
A primeira geração de vacinas objetivadas contra S. aureus ou contra as exoproteínas que ele produz tem obtido sucesso limitado (Lee, 1996). Permanece uma necessidade de desenvolver vacinas eficazes contra infecções estafilocócicas. Composições para tratamento de infecção estafi- 5 locócicas adicionais também são necessárias.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Proteína A (SpA)(SEQ ID NO: 33), uma proteína na superfície ancorada na parede celular de Staphylococcus aureus, confere evasão bac- teriana de respostas imunes inatas e adaptativas. A Proteína A se liga à i- 10 munoglobulinas em sua porção Fc, interage com o domínio VH3 de receptores de células B, estimulando inapropriadamente a proliferação e apoptose de células B, se liga a domínios do fator de von Willebrand A1 para ativar a coagulação intracelular e também se liga ao Receptor-1 de TNF para contribuir para a patogênese de pneumonia estafilocócica. Em virtude do fato de 15 que a Proteína A captura a imunoglobulina e mostra atributos tóxicos, a possibilidade de que essa molécula na superfície possa funcionar como uma vacina em seres humanos não foi rigorosamente buscada. Aqui, os inventores demonstram que variantes de Proteína A não são mais capazes de se 1 ■' . ligar à imunoglobulinas as quais são, desse modo, privadas de seu potencial 20 toxigênico, isto é, são não toxigênicas, estimulam respostas imunes humo- rais que protegem contra doença estafilocócica.
Em determinadas modalidades, uma variante de SpA é uma variante de SpA de comprimento total compreendendo um domínio A, B, C, D e E variante. Em determinados aspectos, uma variante de SpA compreende 25 ou consiste da sequência de aminoácido que é 80, 90, 95, 98, 99 ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34. Em outras modalidades, uma variante de SpA compreende um segmento de SpA. O segmento de SpA pode compreender pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios de ligação á IgG. Os domínios de IgG podem ser pelo menos ou 30 no máximo 1,2, 3, 4, 5 ou mais domínios A, B, C, D ou E variantes. Em determinados aspectos, uma variante de SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios A variantes. Em um outro aspecto, uma variante de SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios B variantes. Em ainda um outro aspecto, uma variante de SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios C variantes. Em ainda um outro aspecto, uma variante de SpA compreende 5 pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios D variantes. Emdeterminados aspectos, uma variante de SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios E variantes. Em um outro aspecto, uma variante de SpA compreende uma combinação de domínios A, B, C, D e E em várias combinações e permutações. As combinações podem incluir 10 todo ou parte de um segmento de peptídeo sinalizador de SpA, um segmento de região SpA e/ou um segmento sinalizador de seleção de SpA. Em outros aspectos, uma variante de SpA não inclui um segmento de peptídeo sinalizador de SpA, um segmento de região SpA e/ou um segmento sinalizador de seleção de SpA. Em determinados aspectos, um domínio A varian- 15 te compreende uma substituição na(s) posição(ões) 7, 8, 34 e/ou 35 de SEQID NO: 4. Em outro aspecto, um domínio B variante compreende uma substituição na(s) posição(ões) 7, 8, 34 e/ou 35 de SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto, um domínio C variante compreende uma substituição na(s) posi- ção(ões) 7, 8, 34 e/ou 35 de SEQ ID NO: 5. Em determinados aspectos, um 20 domínio D variante compreende uma substituição na(s) posição(ões) 9, 10,e/ou 38 de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, um domínio E variante compreende uma substituição na(s) posição(ões) 6, 7, 33 e/ou 34 de SEQ ID NO: 3.
Em determinados aspectos, uma variante de SpA inclui uma 25 substituição de (a) uma ou mais substituições de aminoácido em um subdo- mínio de ligação à Fc de IgG do domínio A, B, C, D e/ou E de SpA que rompem ou diminuem a ligação à Fc de IgG e (b) uma ou mais substituições de aminoácido em um subdomínio de ligação VH3 do domínio A, B, C, D e/ou E de SpA que rompem ou diminuem a ligação ao VH3. Em ainda outros aspec- 30 tos, a sequência de aminoácido de uma variante de SpA compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica, incluindo todos os valores e faixas entre os mesmos, a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2-6.
Em um outro aspecto, uma variante de SpA inclui (a) uma ou mais substituições de aminoácido em um subdomínio de ligação a Fc de IgG do domínio D de SpA ou em uma posição de aminoácido correspondente em 5 outros domínios de IgG que rompem ou diminuem a ligação à Fc de IgG e (b) uma ou mais substituições de aminoácido em um subdomínio de ligação VH3 do domínio D de SpA ou em uma posição de aminoácido correspondente em outros domínios de IgG que rompem ou diminuem a ligação ao VH3. Em determinados aspectos, os resíduos de aminoácido F5, Q9, Q10, S11, 10 F13, Y14, L17, N28, 131 e/ou K35 (SEQ ID NO: 2,
QNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLN ES) do subdomínio de ligação à Fc de IgG do domínio D são modificados ou substituídos. Em determinados aspectos, os resíduos de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43 e/ou E47 (SEQ ID NO: 2) do subdomí- 15 nio de ligação VH3 do domínio D são modificados ou substituídos, de modo que a ligação à Fc ou VH3 seja atenuada. Em outros aspectos, modificações ou substituições correspondentes podem ser manipuladas em posições correspondentes do domínio A, B, C e/ou E. Posições correspondentes são definidas por alinhamento da sequência de aminoácido do domínio D com uma 20 ou mais da sequências de aminoácido de outros domínios de ligação à IgG de SpA, por exemplo, vide figura 1. Em determinados aspectos, a substituição de aminoácido pode ser qualquer um dos outros 20 aminoácidos. Em um outro aspecto, substituições conservatives de aminoácido podem ser especificamente excluídas de possíveis substituições de aminoácido. Em 25 outros aspectos, apenas substituições não conservatives são incluídas. Em qualquer caso, qualquer substituição ou combinação de substituições que reduzem a ligação do domínio, de modo que a toxicidade por SpA seja signi-ficativamente reduzida é considerada. A significância da redução na ligação refere-se a uma variante que produz toxicidade mínima a nenhuma quando 30 introduzida em um indivíduo e pode ser avaliada usando métodos in vitro descritos aqui.
Em determinadas modalidades, uma variante de SpA compre- ende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais peptídeos de domínio D de SpA variante. Em determinados aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 ou mais resíduos de aminoáci- dos de uma variante de SpA são substituídos ou modificados - incluindo, 5 mas não limitado a, aminoácidos F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131e/ou K35 (SEQ ID NO: 2) do subdomínio de ligação à Fc de IgG do domínio D e resíduos de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43 e/ou E47 (SEQ ID NO: 2) do subdomínio de ligação VH3 do domínio D. Em um aspecto da invenção, os resíduos de glutamina na posição 9 e/ou 10 de SEQ 10 ID NO: 2 (ou posições correspondentes em outros domínios) sofreram mutação. Em outro aspecto, os resíduos de ácido aspártico 36 e/ou 37 de SEQ IDNO: 2 (ou posições correspondentes em outros domínios) sofreram mutação. Em um outro aspecto, glutamina 9 e 10 e resíduos de ácido aspártico 36 e 37 sofreram mutação. Mutantes/variantes de SpA ou SpA-D não toxi- 15 gênicas purificadas descritos aqui não são mais capazes de se ligar significativamente (isto é, demonstram afinidade de ligação atenuada ou rompida) ao VH3 de Fcy ou F(ab)2 e também não estimulam apoptose de células B.
Essas variantes de Proteína A não toxigêniças podem ser usadas como vacinas de subunidade e estimular respostas imunes humórais e conferir imu- 20 nidade protetora contra estímulo por S. aureus. Comparado com a Proteína
A de comprimento total do tipo silvestre ou o domínio D de SpA do tipo silvestre, imunização com variantes de SpA-D resultou em um aumento em anticorpos específicos para Proteína A. Usando um modelo com camundongos de desafio estafilocócico e formação de abscesso, foi observado que 25 imunização com as variantes de Proteína A não toxigêniças gerou proteçãosignificativa contra infecção estafilocócica e formação de abscesso. Uma vez que virtualmente todas as cepas de S. aureus expressam Proteína A, imunização de seres humanos com as variantes de Proteína A não toxigêniças pode neutralizar esse fator de virulência e, desse modo, estabelecer imuni- 30 dade protetora. Em determinados aspectos, a imunidade protetora protegeou alivia a infecção por cepas de Staphylococcus resistentes a fármaco, tais como USA300 e outras cepas MRSA.
Modalidades incluem o uso de variantes de Proteína A em métodos e composições para o tratamento de infecção bacteriana e/ou estafilo- cócica. O presente pedido também proporciona uma composição imunogê- nica compreendendo uma variante de Proteína A ou fragmento imunogênico 5 da mesma. Em determinados aspectos, o fragmento imunogênico é um segmento de domínio D de Proteína A, Além disso, a presente invenção proporciona métodos e composições que podem ser usados para tratar (por exemplo, limitar a formação de abscesso e/ou persistência estafilocócica em um indivíduo) ou prevenir infecção bacteriana. Em alguns casos, métodos 10 para estimulação de uma resposta imune envolvem administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma composição incluindo ou que codifica toda ou parte de um polipeptídeo ou antígeno de Proteína A variante e, em determinados aspectos, outras proteínas bacterianas. Outras proteínas bac- terianas incluem, mas não estão limitadas a, (i) um fator de virulência secre- 15 tado e/ou uma proteína na superfície celular ou peptídeo ou (ii) uma molécula de ácido nucleico recombínante que codifica um fator de virulência secre- tado e/ou uma proteína na superfície celular ou peptídeo.
Em outros aspectos, pode ser administrada ao indivíduo toda ou parte de uma variante de Proteína A, tal como um segmento de domínio D 20 variante de Proteína A. Polipeptídeo da invenção pode ser formulado em uma composição farmaceuticamente aceitável. A composição pode ainda compreender um ou mais de pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 antígenos estafilocócicos adicionais ou fragmento imunogênico dos mesmos (por exemplo, Eap, Ebh, Emp, 25 EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrO, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla (por exemplo, mutantes H35), IsdC, SasF, vWbp ou vWh). Antígenos estafí- locócícos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, mas não estão limitados a, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa (GenBank CAC80837), Aap (A- 30 cesso ao GenBank AJ249487), Ant (Acesso ao GenBank NP_372518), glu- cosaminidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imunodominante, IsaA/PisA, receptor de la- minina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II 5 (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA,SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF (WO 00/12689), SdrG I Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxi- nas SEB (WO 00/02523), transportador ABC Site e Ni, proteína de ligação a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de liga- 10 ção à Vitronectina (vide Publicações PCT W02007/113222,W02007/113223, W02006/032472, W02006/032475, W02006/032500, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na íntegra). O antígeno estafilocócíco ou fragmento imunogênico pode ser administrado concorrentemente com a variante de Proteína A. O antígeno estafilocócíco ou frag- 15 mento imunogênico e a variante de Proteína A podem ser administrados na mesma composição. A variante de Proteína A pode também ser uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica uma variante de Proteína A. Uma molécula de ácido nucleico recombinante pode codificar a variante de Proteína A e pelo menos um antígeno estafilocócíco óu fragmento imuno- 20 gênico do mesmo. Conforme usado aqui, o termo "modular" ou "modulação"abrange os significados das palavras "intensificar" ou "inibir". "Modulação" de atividade pode ser um aumento ou uma diminuição na atividade. Conforme usado aqui, o termo "modulador" refere-se a compostos que desempenham a função de uma porção, incluindo super-regulação, indução, estimu- 25 lação, potencialização, inibição, sub-regulação ou supressão de uma proteína, ácido nucleico, gene, organismo ou semelhante.
Em determinadas modalidades, os métodos e composições usam ou incluem ou codificam toda ou parte de uma variante de Proteína A ou antígeno. Em outros aspectos, a variante de Proteína A pode ser usada 30 em combinação com fatores secretados ou antígenos na superfície incluindo, mas não limitado a, uma ou mais de um polipeptídeo isolado de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa. Hla, IsdC, SasF, vWbp ou vWh ou segmento imunogênico do mesmo. Antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, mas não estão limitadas a, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, 5 Aap, Ant, glucosaminidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imunodominante, IsaA/PisA, 10 receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exo- toxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC Site e Ni, proteína de liga- 15 ção a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina. Em determinadas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, glucosami- 20 nidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, 25 Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxi-nas SEB (WO 00/02523), transportador ABC Site e Ni, proteína de ligação a 30 SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina. pode ser especificamente excluídas de uma formulação da invenção.
Em ainda outros aspectos, a variante de Proteína A isolada é multimerizada, por exemplo, dimerizada ou uma fusão linear de dois ou mais polipeptídeos ou segmentos peptídicos. Em determinados aspectos, da invenção, uma composição compreende multímeros ou concatâmeros de 1, 2, 5 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais proteínasda superfície celular isoladas ou segmentos das mesmas. Concatâmeros são polipeptídeos lineares tendo um ou mais unidades peptídicas de repetição. Polipeptídeos ou fragmentos de SpA podem ser consecutivos ou separados por um espaçador ou outras sequências peptídicas, por exemplo, um 10 ou mais peptídeos bacterianos adicionais. Em um outro aspecto, os outros polipeptídeos ou peptídeos contidos no multímero ou concatâmero podem incluir, mas não estão limitados a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh ou fragmento 15 imunogênicos do mesmo. Antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, mas não estão limitadas a, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, glucosaminidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína 20 de iigação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2.+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de25 RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrFI (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC Site e Ni, proteína de ligação a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina.
O termo "variante de Proteína A" ou "variante de SpA" refere-sea polipeptídeos que incluem um domínio IgG de SpA tendo duas ou mais substituições de aminoácido que rompem a ligação à Fc e VH3. Em determi- nados aspectos, uma variante de SpA inclui um peptídeo de domínio D variante, bem como variantes de polipeptídeos de SpA e segmentos dos mesmos que são não toxigênicos e estimulam uma resposta imune contra proteína A bacteriana estafilocócica e/ou bactérias que expressam a mesma.
Modalidades da presente invenção incluem métodos para estimular uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica ou estafiloco- cos em um indivíduo compreendendo fornecimento, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma variante de Proteína A ou um segmento da mesma. Em determinados aspectos, os métodos para estimular uma resposta 10 imune contra uma bactéria estafilocócica ou estafilococos em um indivíduo compreendem fornecimento, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou mais proteínas secretaries e/ou proteínas na superfície celular ou segmentos/fragmentos das mesmas. Uma proteína secretada ou proteína na superfície celular inclui, 15 mas não está limitada a, Proteínas Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp e/ou vWh e fragmento imunogênicos das mesmas. Antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, mas não estão limitadas a, proteína de ligação à vitronecti- 20 na de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, glucosaminidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transpor-tador ABS imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npa- se, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG I Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), 30 transportador ABC Site e Ni, proteína de ligação a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina.
Modalidades da invenção incluem composições que incluem um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à Proteína A ou uma segunda proteína ou peptídeo que é uma proteína bacteriana secretada ou uma proteína na superfície celular bacteriana. Em uma outra modalidade 5 da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a um polipeptídeo de domínio D de Proteína A (SEQ ID NO: 2), domínio E (SEQ ID NO: 3), domínio A (SEQ ID NO: 4), domínio C (SEQ ID NO: 5), domínio B (SEQ ID NO: 6) ou uma sequência de 10 ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de domínio D, domínio E, domínio A, domínio C ou domínio B de Proteína A. Em determinados aspectos, um segmento polipeptídico de proteína A terá uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Similaridade ou identidade, com identidade sendo preferido, é conhecida na técnica e uma série de diferentes programas podem ser 15 usados para identificar se uma proteína (ou ácido nucleico) tem identidade ou similaridade de sequência a uma sequência conhecida. Identidade e/ou similaridade de sequência é determinada usando técnicas padrões conhecidas no campo incluindo, mas não limitado a, o algoritmo de identidade de sequência local de Smith & Waterman (1981), pelo algoritmo de alinhamento 20 de identidade de sequência de Needleman & Wunsch (1970), pela busca por similaridade método de Pearson & Lipman (1988), por meio de implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), o programa de sequência Best Fit 25 descrito por Devereux et al. (1984), De preferência, usando as configurações de default ou através de inspeção. De preferência, a identidade percentual é calculada usando ferramentas de alinhamento conhecidas e prontamente determináveis por aqueles versados no campo. A identidade percentual é essencialmente o número de aminoácidos idênticos dividido pelo número 30 total dos aminoácidos comparados vezes cem.
Ainda outras modalidades incluem métodos para estimulação, em um indivíduo, de uma resposta imune protetora ou terapêutica contra uma bactéria estafilocócica compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma composição incluindo (i) uma variante de SpA, por exemplo, um polipeptídeo ou peptídeo variante de domínio D de SP do mesmo; ou (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica tal polipeptí- 5 deo ou peptídeo variante de SPA do mesmo ou (iii) administração de um polipeptídeo variante de domínio D de SPA com qualquer combinação ou permuta de proteínas bacterianas descritas aqui. Em uma modalidade preferida, a composição não é uma bactéria estafilocócica. Em determinados aspectos, o indivíduo é um ser humano ou uma vaca. Em um outro aspecto, a 10 composição é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável.O estafilococo pode ser Staphylococcus aureus.
Ainda outras modalidades incluem vacinas compreendendo urna composição farmaceuticamente aceitável tendo um polipeptídeo variante de SPA isolado ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou 15 peptídeo(s) descritos aqui, em que a composição é capaz de estimular uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica. A vacina pode compreender um polipeptídeo variante de SPA isolado ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou peptídeo(s) descrito(s). Em determinados aspectos da invenção, o polipeptídeo variante de SPA isolado ou qualquer 20 outra combinação ou permuta de proteína(s) ou peptídeo(s) descrito(s) são multimerizados, por exemplo, dimerizados ou concatamerizados. Em um outro aspecto, a composição de vacina está contaminada por menos de cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,05% (ou qualquer faixa derivável das mesmas) de outras proteínas estafilocócicas. Uma composição pode 25 ainda compreender um polipeptídeo não-SPA isolado. Tipicamente, a vacina compreende um adjuvante. Em determinados aspectos, uma proteína ou peptídeo da invenção é ligado (covalente ou não covalentemente) ao adjuvante, De preferência, o adjuvante é quimicamente conjugado à proteína.
Em ainda outras modalidades, uma composição de vacina é 30 uma composição farmaceuticamente aceitável tendo um ácido nucleico re- combinante que codifica todo ou parte de um polipeptídeo variante de SPA ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou peptídeo(s) descritos aqui, em que a composição é capaz de estimular uma resposta imune contra urna bactéria estafilocócica. A composição de vacina pode compreender um ácido nucleico recombinante que codifica todo ou parte de um polipeptídeo variante de SPA ou qualquer outra combinação ou permuta 5 de proteína(s) ou peptídeo(s) descritos aqui. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico recombinante contém um promotor heterólogo. De preferência, o ácido nucleico recombinante é um vetor. Mais preferivelmente, o vetor é um plasmídeo ou um vetor virai. Em alguns aspectos, a vacina inclui uma bactéria não estafilocócica recombinante contendo o ácido nucleico. A 10 bactéria não estafilocócica recombinante pode ser Salmonella ou outra bactéria gram-positiva. A vacina pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, mais preferivelmente, um adjuvante.
Ainda outras modalidades incluem métodos para estimulação, em um indivíduo, de uma resposta imune protetora ou terapêutica contra 15 uma bactéria estafilocócica compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma composição de um polipeptídeo variante de SPA ou segmento/fragmento do mesmo e ainda compreendendo um ou mais de uma proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, S- drD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp ou vWh ou 20 peptídeo da mesma. Em uma modalidade preferida, a composição compreende uma bactéria não estafilocócica. Em um outro aspecto, a composição é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. O estafilococo para o qual um indivíduo está sendo tratado pode ser Staphylococcus aureus. Métodos da invenção também incluem composições de variantes de 25 SpA que contêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou mais fatores de virulência secretados e/ou proteínas na superfície celular, tais como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp ou vWh em várias combinações. Em determinados aspectos, uma formulação de vacina inclui Eap, Ebh, Emp, 30 EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp e vWh. Em determinados aspectos, uma combinação de antí- geno pode incluir (1) uma variante de SpA e IsdA; (2) variante de SpA e
ClfB; (3) variante de SpA e SdrD; (4) variante de SpA e variante de Hla ou Hla; (5) variante de SpA e ClfB, SdrD e variante de Hla ou Hla; (6) variante de SpA, IsdA, SdrD e variante de Hla ou Hla; (7) variante de SpA, IsdA, ClfB e variante de Hla ou Hla; (8) variante de SpA, IsdA, ClfB e SdrD: (9) variante 5 de SpA, IsdA, ClfB, SdrD e variante de Hla ou Hla; (10) variante de SpA, IsdA, ClfB e SdrD; (11) variante de SpA, IsdA, SdrD e variante de Hla ou Hla; (12) variante de SpA, IsdA e variante de Hla ou Hla; (13) variante de SpA, IsdA, ClfB e variante de Hla ou Hla; (14) variante de SpA, ClfB e SdrD; (15) variante de SpA, ClfB e variante de Hla ou Hla; ou (16) variante de SpA, S- 10 drD e variante de Hla ou Hla.
Em determinados aspectos, uma bactéria que distribui uma composição da invenção será limitada ou atenuada com relação ao crescimento prolongado ou persistente ou formação de abscesso. Em ainda um outro aspecto, variante de SpA(s) pode ser superexpressa em uma bactéria 15 atenuada para intensificar adicionalmente ou suplementar uma resposta imune ou formulação de vacina.
Determinadas modalidades são dirigidas a métodos para estimular uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica em um indivíduo compreendendo fornecimento, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de a 20 peptídeo compreendendo um polipeptídeo de coagulase ou um segmento imunogênico do mesmo tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80, 85, 90, 95, 98, to 100% idêntica à SEQ ID NO: 27 ou um segmento do mesmo ou pelo menos 80, 85, 90, 95, 98, to 100% idêntico aos amino- ácidos 27-508 de SEQ ID NO: 32 ou um segmento do mesmo,
Em determinados aspectos, é fornecida ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de coagulase por meio de administração, ao indivíduo, de uma composição compreendendo: (i) um polipeptídeo de coagulase isolado ou segmento do mesmo tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 27 ou um segmento do 30 mesmo ou é pelo menos 90% idêntico aos aminoácidos 27-508 de SEQ IDNO: 32 ou um segmento do mesmo; ou (ii) pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante isolada que codifica um polipeptídeo de coagu- lase ou um segmento do mesmo tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 27 ou um segmento do mesmo ou é pelo menos 90% idêntico aos aminoácidos 27-508 de SEQ ID NO: 32 ou um segmento do mesmo. Em um outro aspecto, a composição compreende umpolipeptídeo de coagulase isolado tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 ou a sequência de aminoácido dos aminoácidos 27-508 de SEQ ID NO: 32.
Determinadas modalidades são dirigidas a métodos para tratamento da infecção estafilocócica em um indivíduo compreendendo forneci- 10 mento, a um indivíduo tendo ou suspeito de ter ou em risco de desenvolver a infecção estafilocócica, de uma quantidade eficaz de um peptídeo isolado compreendendo um polipeptídeo de coagulase tendo uma sequência de a- minoácido que é pelo menos 80, 85, 90, 95, 98, to 100% idêntica à SEQ ID NO: 27 ou é pelo menos 80, 85, 90, 95, 98, to 100% idêntico aos aminoáci-15 dos 27-508 de SEQ ID NO: 32. Em um aspecto particular, o polipeptídeo de coagulase tem uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 ou tem um aminoácido idêntico aos aminoácidos 27-508 de SEQ ID NO: 32. Em determinados aspectos, o indivíduo é diagnosticado com uma infecção estafilocócica persistente. Em um outro aspecto, o polipeptídeo de coagulase estimula20 a produção de um anticorpo que se liga à Coa ou vWbp/vWh no indivíduo.
Modalidades incluem métodos de prevenção ou tratamento de infecção estafilocócica compreendendo a etapa de administração de uma composição imunogênica compreendendo uma coagulase estafilocócica ou um segmento imunogênico da mesma.
Determinadas modalidades são dirigidas a métodos de composição de uma imunoglobulina para uso em prevenção ou tratamento de infecção estafilocócica compreendendo as etapas de imunização de um recipiente com um polipeptídeo de coagulase e isolamento de imunoglobulina do recipiente.
Uma outra modalidade é dirigida a uma imunoglobulina preparada por meio do método descrito aqui.Uma outra modalidade é dirigida a métodos para tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica compreendendo uma etapa de administração, a um paciente, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de imunoglobulina que se liga à coagulase.
Outras modalidades são dirigidas a um uso da composição farmacêutica de imunoglobulinas de coagulase na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica.
Ainda outras modalidades incluem vacinas compreendendo uma composição farmaceuticamente aceitável tendo um polipeptídeo de coagula- se isolado ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou pep- tídeo(s) descritos aqui, em que a composição é capaz de estimular uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica. A vacina pode compreender um polipeptídeo de coagulase isolado ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou peptídeo(s) descrito. Em determinados aspectos da invenção, o polipeptídeo de coagulase isolado ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou peptídeo(s) descrito(s) são multimeriza- dos, por exemplo, dimerizados ou concatamerizados. Em um outro aspecto, a composição de vacina está contaminada por menos de cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,05% (ou qualquer faixa derivável das mesmas) de outras proteínas estafilocócicas. Uma composição pode ainda compreender um polipeptídeo de não-coagulase isolado. Tipicamente, a vacina compreende um adjuvante. Em determinados aspectos, uma proteína ou peptídeo da invenção é ligado (covalente ou não covalentemente) ao adjuvante, De preferência, o adjuvante é quimicamente conjugado à proteína.
Em ainda outras modalidades, uma composição de vacina é uma composição farmaceuticamente aceitável tendo um ácido nucleico recombinante que codifica todo ou parte de um polipeptídeo de coagulase ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína(s) ou peptídeo(s) descritos aqui, em que a composição é capaz de estimular uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica. A composição de vacina pode compreender um ácido nucleico recombinante que codifica todo ou parte de um polipeptídeo de coagulase ou qualquer outra combinação ou permuta de proteína^) ou peptídeo(s) descritos aqui. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico recombinante contém um promotor heterólogo. De preferência, o ácido nucleico recombinante é um vetor. Mais preferivelmente, o vetor é um plasmídeo ou um vetor virai. Em alguns aspectos, a vacina inclui uma bactéria não estafilocócica recombinante contendo o ácido nucleico. A bactéria 5 não estafilocócica recombinante pode ser Salmonella ou outra bactéria gram-positiva. A vacina pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, mais preferivelmente, um adjuvante.
Ainda outras modalidades incluem métodos para estimulação, em um indivíduo, de uma resposta imune protetora ou terapêutica contra 10 uma bactéria estafilocócica compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma composição de um polipeptídeo de coagulase ou segmento/fragmento do mesmo e ainda compreendendo um ou mais de uma proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, S- drE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp ou vWh ou peptídeo 15 da mesma. Em uma modalidade preferida, a composição compreende uma bactéria não estafilocócica. Em um outro aspecto, a composição é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. O estafilococo para o qual um indivíduo está sendo tratado pode ser Staphylococcus aureus. Métodos da invenção também incluem coagulase composições que contêm um ou 20 mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou mais fatores de virulência secretados e/ou proteínas na superfície celular, tal como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, SpA e variantes do mesmo, vWbp ou vWh em várias combinações. Em determinados aspectos, uma formulação de vacina 25 inclui Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp e vWh. Em determinados aspectos, uma combinação de antígeno podem incluir (1) uma Coa e/ou vWbp e IsdA; (2) uma Coa e/ou vWbp e ClfB; (3) uma Coa e/ou vWbp e SdrD; (4) uma Coa e/ou vWbp e variante de Hla ou Hla; (5) uma Coa e/ou vWbp e ClfB, 30 SdrD e variante de Hla ou Hla; (6) uma Coa e/ou vWbp e IsdA, SdrD e variante de Hla ou Hla; (7) uma Coa e/ou vWbp e IsdA, ClfB e variante de Hla ou Hla; (8) uma Coa e/ou vWbp e IsdA, ClfB e SdrD; (9) uma Coa e/ou vWbp e
IsdA, ClfB, SdrD e variante de Hla ou Hla; (10) uma Coa e/ou vWbp e IsdA, ClfB e SdrD; (11) uma Coa e/ou vWbp e IsdA, SdrD e variante de Hla ou Hla; (12) uma Coa e/ou vWbp e IsdA e variante de Hla ou Hla; (13) uma Coa e/ou vWbp e IsdA, ClfB e variante de Hla ou Hla; (14) uma Coa e/ou vWbp e ClfB e SdrD; (15) uma Coa e/ou vWbp e ClfB e variante de Hla ou Hla; ou (16) uma Coa e/ou vWbp e SdrD e variante de Hla ou Hla.
O termo "proteína EsxA" refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de EsxA do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsxA de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína EsxB" refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de EsxB do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsxB de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína SdrD'1 refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de SdrD do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SdrD de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína SdrE" refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de SdrE do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SdrE de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína IsdA" refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de IsdA do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas IsdA de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína IsdB" refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de IsdB do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas IsdB de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína Eap" refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos de Eap do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Eap de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína Ebh" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de Ebh do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Ebh de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína Emp" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de Emp do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Emp de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína EsaB" refere-se a uma proteína que inclui po- lipeptídeos de EsaB do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsaB de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína EsaC" refere-se a uma proteína que inclui po- lipeptídeos de EsaC do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsaC de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína SdrC" refere-se a uma proteína que inclui po- lipeptídeos de SdrC do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SdrC de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína ClfA" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de ClfA do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas ClfA de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína ClfB" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de ClfB do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas ClfB de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína CoA" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de CoA do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas CoA de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína HIA" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de HIA do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e 5 segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas HIA de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína IsdC" refere-se a uma proteína que inclui poli- peptídeos de IsdC do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta 10 imune contra proteínas IsdC de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína SasF" refere-se a uma proteína que inclui po- lipeptídeos de SasF do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SasF de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína vWbp" refere-se a uma proteína que inclui po-Hpeptídeos de vWbp (proteína de ligação ao fator de von Willebrand) do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas vWbp de bactérias estafilocócicas.
O termo "proteína vWh" refere-se a uma proteína que inclui poli-peptídeos de vWh (homólogo de proteína de ligação ao fator de von Willebrand) do tipo silvestre isolados de bactérias estafilocócicas e segmentos dos mesmos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas vWh de bactérias estafilocócicas.
Uma resposta imune refere-se a uma resposta humoral, umaresposta celular ou uma resposta humoral e celular em um organismo. Uma resposta imune pode ser medida por meio de ensaios que incluem, mas não estão limitados a, ensaios que medem a presença ou quantidade de anticorpos que reconhecem específicamente uma proteína ou proteína na superfí-cie celular, ensaios que medem a ativação ou proliferação de células T e/ou ensaios que medem a modulação em termos de atividade ou expressão de um ou mais citocinas.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína EsxA. Em determinados aspectos, a proteína EsxA terá 5 toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína EsxB. Em determinados aspectos, a proteína EsxB terá 10 toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína SdrD. Em determinados aspectos, a proteína SdrD terá 15 toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13.
Em outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína SdrE. Em determinados aspectos, a proteína SdrE terá toda ou 20 parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína IsdA. Em determinados aspectos, a proteína IsdA terá 25 toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína IsdB. Em determinados aspectos, a proteína IsdB terá 30 toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
Modalidades da invenção incluem composições que incluem um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína E- saB. Em determinados aspectos, a proteína EsaB terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17.
Em uma outra modalidade da invenção uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína ClfB. Em determinados aspectos, a proteína ClfB terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína IsdC. Em determinados aspectos, a proteína IsdC terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína SasF. Em determinados aspectos, a proteína SasF terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20,
Em ainda outras modalidades da invenção', uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína SdrC. Em determinados aspectos, a proteína SdrC terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína ClfA. Em determinados aspectos, a proteína ClfA terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Eap. Em determinados aspectos, a proteína Eap terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Ebh. Em determinados aspectos, a proteína Ebh terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Emp. Em determinados aspectos, a proteína Emp terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína EsaC. Em determinados aspectos, a proteína EsaC terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26. Sequências de polipeptideos de EsaC podem ser encontradas em um banco de dados de proteína e incluem, mas não estão limitadas a, números de acesso ZP 02760162 (Gl:168727885), NP_645081.1 (Gl:21281993) e NP_370813.1 (Gl: 15923279), cada um dos quais é incorporado aqui por referência como a data de prioridade do presente pedido.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína CoA. Em determinados aspectos, a proteína CoA terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27.
Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína HIA. Em determinados aspectos, a proteína HIA terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28.
EJode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar a uma proteína vWh. Em determinados aspectos, a proteína vWh terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29.
EJode incluir um polipeptídeo, peptídeo ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou similar à proteína vWbp. Em determinados aspectos, a proteína vWbp terá toda ou parte da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32.
Em determinados aspectos, um polipeptídeo ou segmen-to/fragmento pode ter uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácido do polipeptídeo de referência. O termo "similaridade" refere-se a um polipeptídeo que tem uma sequência que tem um 15 determinado percentual dos aminoácidos que são idênticos ao polipeptídeo de referência ou substituições conservatives constitutivas com os polipeptídeos de referência.
Os polipeptídeos descritos aqui podem incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos variantes dentro de pelo 20 menos ou no máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,25 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159,160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174,30 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189,190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204,205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 ou mais aminoácidos contíguos ou qualquer faixa derivável das mesmas, de SEQ ID NO: 2-30 ou SEQ ID NO: 32-34.
Um segmento polipeptídico , conforme descrito aqui, pode incluir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179,180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209,210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224,225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239,240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550,1000 ou mais aminoácidos contíguos ou qualquer faixa derivável das mesmas, de SEQ ID NO: 2-30 ou SEQ ID NO: 33-34,
As composições podem ser formuladas em uma composição farmaceuticamente aceitável. Em determinados aspectos da invenção, a bactéria estafilocócica é uma bactéria S. aureus.
Em outros aspectos, uma composição pode ser administrada mais de uma vez ao indivíduo e pode ser administrada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais vezes, A administração das composições inclui, mas não está limitada a, oral, parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa ou várias combinações das mesmas, incluindo inalação ou aspiração.
Em ainda outras modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo descrito aqui ou segmentos/fragmentos do mesmo. Tipicamente, uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo descrito aqui contém um promotor heterólogo. Em determinados aspectos, uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção é um vetor, em aindaoutros aspectos, o vetor é um plasmídeo. Em determinadas modalidades, o vetor é um vetor virai. Em determinados aspectos, uma composição inclui uma bactéria não estafilocócica recombinante contendo ou que expressa um polipeptídeo descrito aqui. Em aspectos particulares, a bactéria não estafilocócica recombinante é Salmonella ou outra bactéria gram-positiva. Umacomposição é, tipicamente, administrada a mamíferos, tais como seres humanos, mas administração a outros animais que são capazes de estimular uma resposta imune é considerada. Em outros aspectos, a bactéria estafilocócica contendo ou que expressa o polipeptídeo é Staphylococcus aureus. Em outras modalidades, a resposta imune é uma resposta imune protetora.
Em outras modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica todo ou parte de um ou mais de uma proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, S- drD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, SpA, vWbp ou vWh ou peptídeo ou variante das mesmas. Antígenos estafilocócicos adicionaisque podem ser usados em combinação com os polipeptídeos descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, glucosaminidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fi-brinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imu- nodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrFb (WO00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinasSEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC SitC e Ni, proteína de ligação a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP- 1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina. Em aspectos particulares, a bactéria é uma bactéria não estafilocócica recombinante , tal como a Salmonella ou outra bactéria gram-positíva.
Composições da invenção são, tipicamente, administradas a se- 5 res humanos, mas administração a outros animais que são capazes de estimular uma resposta imune a uma bactéria estafilocócica é considerada, particularmente gado, cavalos, cabras, ovelha e outros animais domésticos, isto é, mamíferos.
Em determinados aspectos, a bactéria estafilocócica é Staphylo- 10 coccus aureus. Em outras modalidades, a resposta imune é uma resposta imune protetora. Em ainda outros aspectos, os métodos e composições da invenção podem ser usadas para prevenir, aliviar, reduzir ou tratar infecção de tecidos ou glândulas, por exemplo, glândulas de mamíferos, particularmente mastite e outras infecções. Outros métodos incluem, mas não estão 15 limitados a, redução profilática da carga bacteriana em um indivíduo que não exibe sinais de infecção, particularmente aqueles indivíduos que se suspeita ou estão em risco de serem colonizados por uma bactéria alvo, por exemplo, pacientes que estão ou estarão em risco ou são suscetíveis à infecção durante permanência em um hospital, tratamento e/ou recuperação.
Qualquer modalidade discutida com relação a um aspecto da invenção se aplica a outros aspectos da invenção também. Em particular, qualquer modalidade discutida no contexto de um polipeptídeo ou peptídeo variante de SPA ou ácido nucleico pode ser implementada com relação a outros antígenos, tais como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, 25 SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, glucosami- nidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a coíá- geno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à30 fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC Site e Ni, proteína de ligação a 5 SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina (ou ácido nucleicos) e vice versa. Também deve ser entendido que qualquer uma ou mais de Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de ligação à vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, 10 glucosaminidase de autolisina, amidase de autolisina, Cna, proteína de ligação a colágeno (US6288214), EFB (FIB), Proteína de ligação à elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de ligação a fibrinogênio (US6008341), Proteína de ligação à fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABS imunodominante, IsaA/PisA, 15 receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogode MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína de ativação de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK.SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC SitC e Ni, proteína de liga-20 ção a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2 e/ou Proteína de ligação à Vitronectina podem ser especificamente excluídas de uma composição desejada.
Modalidades da invenção incluem composições que contêm ou não contêm uma bactéria. Uma composição pode ou não incluir uma bacté- 25 ria estafilocócica atenuada ou viável ou intacta. Em determinados aspectos, a composição compreende uma bactéria que não é uma bactéria estafilocócica ou não contém uma bactéria estafilocócica. Em determinadas modalidades, uma composição bacteriana compreende uma variante de Proteína A estafilocócica isolada ou recombinantemente expressa ou um nucleotídeo 30 que codifica a mesma. A composição pode ser ou incluir uma bactéria estafilocócica recombinantemente manipulada que tenha sido alterada de uma forma que compreenda especificamente alteração da bactéria com relação a um fator de virulência secretado ou proteína na superfície celular. Por exemplo, a bactéria pode ser recombinantemente modificada para expressar mais fator de virulência ou proteína na superfície celular do que ela expressaria se não modificada.5 O termo "isolado" pode referir-se a um ácido nucleico ou polipeptídeo que é substancialmente livre de material celular, material bacteriano, material virai ou meio de cultura (quando produzido através de técnicas de DNA recombinante) de sua fonte de origem ou precursores químicos ou outros produtos químicos (quando quimicamente sintetizado). Além disso, um 10 composto isolado refere-se a um que pode ser administrado a um indivíduo como um composto isolado; em outras palavras, o composto pode simplesmente não ser considerado "isolado" se ele está aderido a uma coluna ou incrustado em um gel de agarose. Além disso, um "fragmento de ácido nucleico isolado" ou "peptídeo isolado" é um fragmento de ácido nucleico ou 15 proteína que não ocorre naturalmente como um fragmento e/ou não está, tipicamente, em um estado funcional.
Porções da invenção, tais como polipeptídeos, peptídeos, antígenos ou imunogênios, podem ser conjugadas ou ligadas covalente ou não covalentemente à outras porções, tais como adjuvantes, proteínas, peptí- 20 deos, suportes, porções fluorescentes ou rótulos. O termo "conjugado" ou "imunoconjugado" é amplamente usado para definir a associação operativa de uma porção com outro agente e não se destina a referir-se unicamente a qualquer tipo de associação operativa e não está particularmente limitado à "conjugação" química. Proteínas de fusão recombinantes são particularmen- 25 te consideradas. As composições da invenção podem ainda compreender um adjuvante ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Um adjuvante pode ser covalente ou não covalentemente acoplado a um polipeptídeo ou peptídeo da invenção. Em determinados aspectos, o adjuvante é quimica-mente conjugado a uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo.30 O termo "fornecimento de" é usado de acordo com seu significado comum para indicar "suplementar ou reabastecer o uso". Em algumas modalidades, a proteína é fornecida diretamente por meio de administração da proteína enquanto que, em outras modalidades, a proteína é eficazmente fornecida por meio de administração de um ácido nucleico que codifica a proteína. Em determinados aspectos, a invenção considera composições compreendendo várias combinações de ácido nucleico, antígenos, peptídeos e/ou epítopos.
O indivíduo terá (por exemplo, será diagnosticado com uma infecção estafilocócica), será suspeito de ter ou estarem risco de desenvolver uma infecção estafilocócica. Composições da presente invenção incluem composições imunogênicas em que o(s) antígeno(s) ou epitope(s) está(ão) contido(s) em uma quantidade eficaz para obter a finalidade pretendida. Mais especificamente, uma quantidade eficaz significa uma quantidade de ingredientes ativos necessários para estimular ou provocar uma resposta imune ou conferir resistência a, alívio de ou melhora de uma infecção. Em aspectos mais específicos, uma quantidade eficaz previne, alivia ou melhora sintomas de uma doença ou infecção ou prolonga a sobrevida do indivíduo que está sendo tratado. Determinação da quantidade eficaz está dentro da capacidade daqueles versados no campo, especialmente à luz da divulgação detalhada fornecida aqui. Para qualquer composição usada nos métodos da invenção, uma quantidade ou dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de estudos in vitro, cultura de células e/ou ensaios com modelos animais. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para obter uma resposta imune desejada ou concentração ou titulação de anticorpo em circulação. Tal informação pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteis em seres humanos.
As modalidades na seção Exemplos devem ser entendidas como sendo modalidades da invenção que são aplicáveis a todos os aspectos da invenção.
O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para referir-se à alternativas apenas ou alternativas que são mutuamente exclusivas, embora a divulgação sustente a definição de referir-se apenas a alternativas e "e/ou". Considera-se também que qualquer coisa listada usando o termo "ou" pode tam- bém ser especificamente excluída.Por todo o presente pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão do erro para o dispositivo ou método que está sendo empregado para determinar o valor.
Seguindo a lei de patentes há muito em vigor, as palavras "um" e "uma", quando usadas em conjunto com a palavra "compreendendo" nas reivindicações ou relatório descritivo, denota um(a) ou mais, a menos que especificamente mencionado.
Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deverá ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades específicas da invenção, são fornecidos à guisa de ilustração apenas, uma vez que diversas alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados no campo a partir da presente descrição detalhada.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
De modo que o assunto no qual as características, vantagens e objetivos da invenção mencionados acima, bem como outros os quais se tornarão claros, sejam atingidos e possam ser entendidos em detalhes, descrições mais particulares e determinadas modalidades da invenção resumidamente descritas acima são ilustradas nos desenhos em anexo. Esses desenhos formam parte do relatório descritivo. Deve ser notado, contudo, que os desenhos em anexo ilustram determinadas modalidades da invenção e, portanto, não devem ser considerados como limitando seu escopo.
Figuras 1A - 1E, Geração de uma vacina de proteína A não to- xigênica. figura 1A Produto traducional de proteína A (SpA) de S. aureus Newman e USA300 ILAC com um peptídeo sinalizador N-terminal (retângulo em branco), cinco domínios de ligação à imunoglobulina (IgBDs, designados E, D, A, B e C), região X variável e sinal de seleção C-terminal (retângulo preto), figura 1B, Sequência de aminoácido dos cinco IgBDs, bem como SPA-DKKAA não toxigênica, com as posições de feixes a-helicoidais triplos (Hl, H2 e H3), bem como glutamina (Q) 9, 10 e aspartato (D) 36, 37 indica dos. figura 1C, SDS-PAGE manchado com Coomassie Blue de SpA, SpA-D, SPA-DKKAA OU SrtA purificada sobre Ni-NTA Sepharose in na presença ou ausência de imunoglobulina humana (hlgG). figura 1D, ELISA examinando a associação de SpA, SpA-D ou SPA-DKKAA imobilizada com IgG humana, bem 5 como seus fragmentos Fc ou F(ab)2 e fator de von Willebrand (vWF). figura 1E, linfócitos B CD19+ em tecido esplénico de camundongos BALB/c que tinham sido "mock" imunizados ou tratados com SpA-D ou SpA-DKKAA foram quantificados por meio de FACS.
A figura 2. Vacina de proteína A não toxigênica previne a forma- 10 ção de abscesso. Histopatologia de tecido renal isolado durante necropsia de camundongos BALB/c que tinham sido "mock" imunizados (PBS) ou vacinados com SpA, SpA-D, bem como SPA-DKKAA θ estimulados com S. aureus Newman. Tecidos seccionados finos foram manchados com hematoxili- na-eosina. As setas brancas identificam infiltrados de leucócitos polimorfo- 15 nucleares (PMN). As setas escuras identificam colônias de abscessos estafi- locócicos.
A figuras 3A-C. Anticorpos estimulados pela vacina de proteína A não toxigênica bloqueiam a função superantigênica de células B de SpA. FIG 3A, Anticorpos de coelho estimulados contra SPA-DKKAA foram punfica- 20 dos sobre uma matriz com antígeno imobilizado e analisados através de SDS-PAGe manchado com Coomassie Blue. Anticorpos foram clivados com pepsina e fragmentos F(ab)2 foram purificados através de um segundo ciclo de cromatografia por afinidade sobre matriz de SPA-DKKAA- FIG 3B, F(ab)2 específico para SPA-DKKAA interfere com a ligação de SpA ou SpA-D à imu- 25 noglobulina humana (hlgG) ou FIG 3C, ao fator de von Willebrand (vWF).
A figuras 4A-D. Proteína A não toxigênica de comprimento total gera respostas imunes aprimoradas. FIG 4A, SpAKKAA de comprimento total foi purificada sobre Ni-NTA Sepharose e analisada através de SDS-PAGE manchado com Coomassie-Blue. FIG 4B, Linfócitos B CD 19+ em tecido es- 30 plênico de camundongos BALB/c que tinham sido "mock" imunizados ou tratados com SpA ou SPAKKAA foram quantificados por meio de FACS. FIG 4C, ELISA examinando a associação de SpA ou SPAKKAA imobilizada com IgG humana, bem como seus fragmentos Fc ou F(ab)2 ou fator de von Willebrand (vWF). FIG 4D, Titulações de anticorpo no soro humano ou de camundongo ao toxoide de difteria (CRM197) e SPAKKAA OU SPA-DKKAA não toxigênicas. Voluntários humanos com uma história de imunização para 5 DTaP e infecção estafilocócica (n = 16), bem como camundongos (n = 20)que tinham sido infectados com S. aureus Newman ou USA 300 LAC ou imunizados com SpAKKAA ou SÇA-DKKAA foram examinados por meio de dot blot quantitativa.
A figura 5. Proteína A é requerida para a patogênese de infec-ções letais por S. aureus em camundongos. Grupos de camundongos BALB/c (n = 8) foram injetados com suspensões de 2 x 108 CFU de S. aureus Newman ou sua variante com deleção de proteína A isogênica (Δspa) em PBS. Os animais infectados foram monitorados com relação à sobrevida durante um período de 15 dias.
A figuras 6A-B. Anticorpos contra proteína A protegem os camundongos contra infecções letais por S. aureus. FIG 6A. Grupos de camundongos BALB/c (n = 10) foram injetados com 5 mg kg'1 de IgG de coelho purificada por afinidade específica para SPAKKAA (O-SPAKKAA) OU O antígeno de vacina em placa rV10 (DeBord et a/., 2006) ("mock"). Quatro horas de- 20 pois, cada animal foi infectado através de injeção intraperitoneal com uma suspensão de 3 x 108 CFU de S. aureus Newman e monitorado com relação à sobrevida durante um período de 10 dias. Os dados são representativos de três experimentos independentes. FIG 6B. Grupos de camundongos BALB/c (n = 10) foram imunizados com um reforço de SPAKKAA OU controlede PBS/adjuvante ("mock"). Cada animal foi subsequentemente infectado através de injeção intraperitoneal com uma suspensão de 6 x 108 CFU de S. aureus Newman e monitorado com relação à sobrevida durante um período de 10 dias. A significância estatística (P) foi analisada com o teste "log-rank" duplamente configurado não emparelhado. Os dados são representativos detodos os três experimentos independentes.
A figura 7. Imunização com SPAKKAA protege os camundongos contra estímulo com isolados MRSA resistentes à vancomicina Mu50. Gru- pos de camundongos BALB/c (n = 15) foram imunizados com reforço de SRAKKAA OU controle com PBS/adjuvante ("mock"). Cada animal foi subsequentemente infectado, por meio de injeção intravenosa, com uma suspensão de 3 x 107 CFU de S. aureus Mu50. A carga estafilocócica, calculada 5 como log-io CFU g’1, foi determinada em tecidos renais homogeneizados 4 dias após infecção. A significância estatística foi calculada com o t-teste de Student duplamente configurado não emparelhado e o P-valor registrado.
A figuras 8A-B. Falta de respostas imunes protetoras à infecções estafilocócicas. FIG 8A. Infecção estafilocócica não gera imunidade proteto- 10 ra. Camundongos BALB/c (n = 10) foram infectados com S. aureus Newman ou "mock" estimulados (PBS) durante trinta dias e infecção eliminada com tratamento por cloranfenicol. Ambos os grupos de animais foram, então, estimulados com S. aureus Newman e a carga bacteriana (CFU) em homogenate de tecido renal analisada após necropsia no dia 4. Os dados são repre- 15 sentativos de três análises independentes. FIG 8B. Imunização com IsdB não protege os camundongos contra estímulo por S. aureus USA300 (LAC). Camundongos BALB/c (n = 10) foram imunizados com IsdB (100 μg de IsdB emulsificada em CFA, seguido por um reforço de IFA/IsdB no dia 11) e estimulados através de injeção retro-orbital com 5 x 106 CFU de S. aureus U- 20 SA300 (LAC) no dia 21. Quatro dias após estímulo, os rins foram removidosdurante necropsia e a carga estafilocócica por grama de tecido homogeneizado enumerada pela formação de colônias sobre lâminas de ágar. Comparado com animais "mock" imunizados a (PBS/adjuvante) com 6,93 (±0,24) logio CFU g'1, vacinação com IsdB estava associada a 6,25 (±0,46) log10 25 CFU g'1 e não gerou proteção estatisticamente significativa (P = 0,2138, t- teste de Student duplamente configurado) a partir de estímulo com USA300 (LAC). Os dados são representativos de três análises independentes.
A figura 9. Comparação de formação de abscesso em camundongos tratados com PBS, SpA, SpA-D e SpA-DKKAA-
As figuras 10A-10H. Localização de pró-trombina, fibrinogênio,coagulase (Coa) e proteína de ligação ao fator de von Willebrand (vWbp) em abscessos estafilocócicos. Camundongos BALB/c infectados através de ino- culação intravenosa com 1 x 107 CFU de S. aureus Newman foram sacrificados 5 dias pós-infecção. Os rins foram removidos, incrustados em parafina, seccionados finos e manchados através de imunoquímica usando anticorpos de coelho (a) específicos para pró-trombina de camundongo (figura 5 10A, 10C), fibrinogênio / fibrina de camundongo (figura 10B, 10D), Coa de S.aureus (figura 10E, 10G) ou vWbp de S. aureus (figura 10F, 10H). As imagens mostradas são representativas de três rins coletados, Os painéis nas figuras 10C, 10D, 10G e 10H ilustram a coloração de anticorpo dentro de um único abscesso analisado como quatro seções sequenciais, ampliadas a 10 partir de uma área nos painéis nas figuras 10A, 10B, 10E e 10F que é definida pelo retângulo com margens em branco.
As figuras 11A-11C. Mutantes de coa e vWbp de Staphylococcus aureus mostram defeitos na coagulação sanguínea, (figura 11A) Diagrama ilustrando o produto traducional primário de coa e vWbp, incluindo 15 peptídeo sinalizador (S), os domínios D1 e D2 de ligação à pró-trombina, um domínio de função desconhecida, sítio de ligação ao fator de von Willebrand (vWF) sobre vWbp e as repetições de ligação ao fibrinogênio (R) de Coa. Números indicam resíduos de aminoácidos, (figura 11B) Sobrenadantes de cultura de S. aureus Newman (tipo silvestre) ou variantés isogênicas care- 20 cendo de coa (Δcoa), vWbp (ΔvWbp) ou ambos os genes (Δcoa, ΔvWbp) foram examinados através de imunoblotting com anticorpos específicos para Coa (oCoa) ou vWbp (avWbp). Para estudos de complementação, plasmí- deos que expressam os alelos do tipo silvestre de coa (pcoa) ou vWbp (pvWbp) foram eletroporados em cepas estafilocócicas e subsequentemente25 analisados por meio de imunoblotting. (figura 11C) Sangue de camundongo tratado com lepirudina foi "mock" tratado ou infectado com S. aureus Newman ou suas variantes de coagulase isogênicas e incubado durante até 48 horas a 25°C. Os tubos foram inclinados para avaliar a coagulação. Os dados são representativos de quatro determinações independentes.
As figuras 12A-12R. Contribuições de coa e vWbp para a sobrevivência bacteriana no sangue e bacteremia letal induzida por S. aureus em camundongos, (figura 12A) Cepas estafilocócicas Newman, Δcoa, ΔvWbp ou Δcoa, ΔvWbp e as variantes complementadas foram incubadas com sangue de camundongo anti-coagulado com lepirudina durante 30 minutos e a sobrevivência bacteriana avaliada pela formação de colônia sobre lâminas de ágar. Os dados foram gerados a partir de três ensaios distintos, (figura 12B) Grupos de 10 camundongos foram injetados, no plexo retro-orbital, com 1 x 108 CFU de S. aureus Newman (tipo silvestre), bem como Δcoa, ΔvWbp ou Δcoa, ΔvWbp. A sobrevida do animal com o tempo foi registrada durante 10 dias. Similar a B, aos camundongos foram fornecidas 1 x 10z CFU das cepas estafilocócicas Newman (figura 12C e K, M), ΔvWbp (figura 14D, F e M, L), Δcoa (figura 14G, I e O, Q) ou Δcoa, ΔvWbp (figura 12H, J e P, R), coletadas nos dias 5 (figura 12C-J) ou 15 (figura 12K-R) e avaliadas com relação à carga bacteriana em tecido renal (Tabela 7) e formação de abscesso histo- patológica. Todos os dados dos animais são representativos de dois experimentos independentes.
As figuras 13A-13D. Anticorpos contra Coa e vWbp bloqueiam a coagulação sanguínea por coagulases estafilocócicas. (figura 13A) His6-Coa e Hise-vWbp foram purificadas através de cromatografia por afinidade a partir de E. coli e analisadas sobre SDS-PAGE manchado com Coomassie. (figura 13B) Anticorpos de coelho estimulados contra His6:Coa ou His6-vWbp foram purificados por afinidade e analisados através de ELISA quanto à rea- tividade imune com coagulases purificadas. Os dados são a média de três determinações experimentais independentes, (figura 13C) Sangue de camundongo tratado com lepirudina foi tratado com PBS (mock), anticorpos irrelevantes (aV10) ou anticorpos dirigidos contra Coa (αCoa), vWbp (a- vWbp) ou ambas as coagulases (αCoa/ αvWbp) antes de infecção com S. aureus Newman e incubação durante 48 horas a 25°C. (figura 13D) Sangue de camundongo tratado com lepirudina foi tratado com anticorpos conforme acima. As amostras de sangue foram, então, incubadas com Coa ou vWbp funcionalmente ativa e o tempo de coagulação registrado.
As figuras 14A-14F. Efeitos biológicos e anticorpos dirigidos contra coagulases estafilocócicas. Medição por ressonância de plasmônio em superfície de anticorpo que altera a associação entre Coa ou vWbp e pró- trombína ou fibrinogênio. Diferenças de resposta quando de adição de coagulase (Coa) â pró-trombina (figura 14A) ou fibrinogênio (figura 14B) foram comparadas com as diferenças de resposta na presença de quantidades crescentes de anticorpos (aCoa - 1:1, 1:2, 1:4, 1:8). Diferenças de resposta 5 quando da adição de vWbp à pró-trombina (figura 16A) ou fibrinogênio (figura 14B) foram comparadas com as diferenças de resposta na presença de quantidades crescentes de anticorpos (avWbp - 1:1, 1:2, 1:4, 1:8). (figura 14E, F). Coa ou vWbp ativa purificada foi incubada em uma proporção molar de 1:1 com pró-trombina humana. A capacidade enzimática do complexo foi 10 avaliada monitorando a taxa de divagem de S-2238 (substrato cromogênicosubstituto de fibrinogênio, fornecido em excesso). O ensaio foi repetido na presença de anticorpos específicos ou cruzados adicionados em um excesso de 3M e os dados foram normalizados para a atividade média % sem inibição. Os dados são a média de três ensaios independentes.
As figura 15. Contribuição de anticorpos específico à coagulasepara a sobrevida de camundongos com bacteremia estafilocócica. Vinte e quatro horas antes de infecção, camundongos BALB/c (n = 15) foram injetados no peritônio com anticorpos de coelho purificados (5 mg de anticorpo/kg de peso corporal). Os animais foram, então, estimulados com 1 x 108 CFUde S. aureus Newman injetados no plexo retro-orbital e monitorados com relação à sobrevida. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.
As figuras 16A-16H. Transferência passiva de anticorpos à coagulase confere proteção contra formação de abscesso por S. aureus. Um 25 "mock" experimental (PBS, figura 18A e 18C) ou anticorpos de coelho purificados dirigidos contra vWbp (avWbp, figura 18B e 18D), Coa (aCoa, figura 18E e 18G) ou ambas as coagulases (aCoa / avWbp, figura 18F e 18H) foram injetados na cavidade peritonial de camundongos BALB/c (n = 10) e as titulações de anticorpo analisadas por meio de ELISA (Tabela 8). Animais 30 passivamente imunizados foram infectados através de injeção de 1 x 107 CFU de S. aureus Newman no plexo retro-orbital. A carga bacteriana e formação de abscesso foram determinadas após necropsia nos rins de animais que tinham sido sacrificados cinco dias após infecção, tecidos renais foram fixados com paraformaldeído, incrustados em parafina, seccionados finos, manchados com hematoxilína-eosina e imagens histopatológicas adquiridas por meio de microscopia luminosa. Os dados são representativos de dois experimentos distintos.
As figuras 17A-H. Imunização com coagulases protege os camundongos contra formação de abscesso por S. aureus. Camundongos BALB/c (n = 15) foram imunizados com 50 pg de His6-Coa, His6-vWbp, His6- Coa e His6-vWbp ou mock (PBS) emulsificado com adjuvante nos dias 0 e 11 e as titulações de anticorpo analisadas por meio de ELISA no dia 21 (Tabela 8). No dia 21, os animais foram estimulados através de injeção de 1 x 107CFU de S. aureus Newman no plexo retro-orbital. A carga bacteriana e formação de abscesso foram determinados após necropsia nos rins de animais que tinham sido sacrificados cinco dias após infecção. Tecidos renais foram fixados com paraformaldeído, incrustados em parafina, seccionados finos,manchados com hematoxilina-eosina e imagens histopatológicas adquiridas através de microscopia luminosa. Os dados são representativos de dois experimentos distintos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Staphylococcus aureus é um comensal da pele e narinas humanas e a causa de infecções na corrente sanguínea, pele e tecidos moles (Klevens et al., 2007). Aumentos dramáticos recentes na mortalidade por doenças estafilocócicas são atribuídos à disseminação de cepas de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) frequentemente não suscetíveis a antibióticos (Kennedy et al., 2008). Em um grande estudo retrospectivo, a incidência de infecções MRSA foi de 4,6% de todas as admissões hospitalares nos Estados Unidos (Klevens et al., 2007). Os custos anuais para a saúde para 94.300 indivíduos infectados por MRSA nos Estados Unidos excederam a $2,4 bilhões (Klevens et al., 2007). A epidemia atual por MRSA tem precipitado uma crise na saúde publica que precisa ser considerada pelo desenvolvimento de uma vacina preventiva (Boucher e Corey, 2008). Até o momento, uma vacina licenciada pelo FDA que possa prevenir doenças por S. aureus não está disponível.
Os inventores descrevem aqui o uso de Proteína A, uma proteína na superfície ancorada na parede celular de estafilococos, para a geração de variantes que podem servir como vacinas de subunidade. A patogê- 5 nese de infecções estafilocócicas é iniciada à medida que as bactérias invadem a pele ou corrente sanguínea via trauma, ferimentos cirúrgicos ou dispositivos médicos (Lowy, 1998). Embora o patógeno invasor possa sofrer fagocitose e ser morto, estafilococos também podem escapar das defesas imunes inatas e causar infecções em tecidos de órgãos, induzindo à respos- 10 tas inflamatórias que atraem macrófagos, neutrófilos e outros fagócitos (Lowy, 1998). A invasão responsiva de células imunes ao local de infecção é acompanhada por necrose de liquefação à medida que o hospedeiro busca prevenir a disseminação estafilocócica e permite a remoção de resíduos de tecido necrótico (Lam et a!., 1963). Tais lesões podem ser observadas atra- 15 vés de microscopia como áreas hipercelulares contendo tecido necrótico, leucócitos e um ninho central de bactérias (Lam et al., 1963). A menos que os abscessos estafilocócicos sejam cirurgicamente drenados e tratados com antibióticos, infecção disseminada e septicemia produzem uma consequência letal (Sheagren, 1984).
III. Antígenos estafilocócicos A. Proteína A estafilocócica (SpA)
Todas as cepas de Staphylococcus aureus expressam o gene estrutural para Proteína A (spa) (Jensen, 1958 ; Said-Salim et al., 2003), um fator de virulência bem caracterizado cujo produto de proteína na superfície 25 ancorado na parede celular (SpA) abrange cinco domínios de ligação à imunoglobulina altamente homólogos designados E, D, A, B e C (Sjodahl, 1977). Esses domínios mostram ~ 80% de identidade a nível de aminoácido, têm 56 a 61 resíduos de comprimento e são organizados como repetições aleatórias (Uhlen et al., 1984). SpA é sintetizada como uma proteína precursora 30 com um peptídeo sinalizador YSIRK/GS N-terminal e um sinal de seleção com motivo LPXTG C-terminal (DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992). Proteína A ancorada na parede celular é encontrada em grande a- bundancia sobre a superfície estafilocócica (DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972). Cada um de seus domínios de ligação à imunoglobulina é composto de El-hélices anti-paralelas que se assemelham a um feixe com três hélices e se ligam ao domínio Fc de imunoglobulina G (IgG) (Deisenhofer, 5 1981; Deisenhofer et al., 1978), à cadeia pesada VH3 (Fab) de IgM (isto é, oreceptor de células B) (Graille et al., 2000), ao fator de von Willebrand em seu domínio A1 [vWF Al é um ligante para plaquetas] (O'Seaghdha et al., 2006) e ao receptor I de fator α de necrose de tumor (tTNF-α) (TNFRI) (Gomez et al., 2006), o qual se encontra sobre superfícies do epitélio das vias 10 aéreas (Gomez et al., 2004; Gomez et al., 2007).
SpA impede a fagocitose por neutrófilos de estafilococos através de seu atributo de ligação ao componente Fc de IgG (Jensen, 1958; Uhlen et al., 1984). Além disso, a SpA é capaz de ativar a coagulação intravascular via sua ligação aos domínios A1 do fator de von Willebrand (Hartleib et al., 15 2000). Proteínas plasmáticas, tais como fibrinogênio e fibronectina, atuamcomo pontes entre estafilococos (ClfA e ClfB) e a integrina plaquetária GPI- Ib/llla (O'Brien et al., 2002), uma atividade que é suplementada através de associação de Proteína A com vWF Al, a qual permite que os estafilococos capturem plaquetas via o receptor de plaquetas GPIb-α (Foster, 2005; O'Se- 20 aghdha et al., 2006). SpA também se liga ao TNFRI e essa interação contribui para a patogênese de pneumonia estafilocócica (Gomez et al., 2004). SpA ativa sinalização pró-inflamatória através de ativação TNFR1 mediada de TRAF2, da quinase p38/c-Jun, quinase de proteína de ativação de mitógeno (MAPK) e o fator de Rel-transcrição NF-KB. A ligação de SpA induzainda à proteção de TNFR1, uma atividade que parece requerer a enzima de conversão de TNF (TACE) (Gomez et al., 2007). Todas as atividades de SpA antes mencionadas são mediadas através de seus cinco domínios de ligação à IgG e podem ser alteradas pelas mesmas substituições de aminoácido, inicialmente definidas por seu requisito para a interação entre a Proteína
A e lgG1 humana (Cedergren etal., 1993.A SpA também funciona como um superantígeno de células B mediante captura da região Fab de IgM trazendo VH3, o receptor de células B (Gomez et al., 2007; Goodyear et al., 2003; Goodyear e Silverman, 2004; Roben et al., 1995). Após estímulo intravenoso, mutações na proteína A estafilocócica (SpA) mostram uma redução na carga estafilocócica em tecidos de órgãos e capacidade dramaticamente reduzida de formar abscessos 5 (descrita aqui). Durante infecção com S. aureus do tipo silvestre, abscessos são formados dentro de quarenta e oito horas e são detectáveis por meio de microscopia luminosa de tecido renal seccionado fino, manchado com hema- toxilina-eosina, inicialmente marcado por um influxo de leucócitos polimorfo- nucleares (PMNs). No dia 5 de infecção, os abscessos aumentam de tama- 10 nho e envolvem uma população central de estafilococos, envolvida por uma camada de material eosinofílico amorfo e um grande agrupamento de PMNs. Histopatologia revelou necrose massiva de PMNs em proximidade ao ninho estafilocócíco no centro de lesões por abscesso, bem como uma manta de fagócitos saudáveis. Os inventores também observaram uma borda de 15 PMNs necróticos na periferia das lesões por abscesso, limitando a pseudo- cápsula eosinofílica que separava o tecido renal saudável da lesão infecciosa. Variantes estafilocócicas carecendo de proteína A são incapazes de estabelecer as características histopatológicas de abscessos e são eliminadas durante infecção.
Em estudos anteriores, Cedergren et al. (1993) manipularamcinco substituições individuais no subdomínio de ligação ao fragmento Fc do domínio B de SpA, L17D, N28A, 131A e K35A. Esses autores criaram essas proteínas para testar dados obtidos a partir de uma estrutura tridimensional de um complexo entre um domínio de SpA e Fc-i. Cedergren et al. determi- 25 naram os efeitos dessas mutações sobre a estabilidade e ligação, mas não consideraram o uso de tais substituições para a produção de um antígeno de vacina.Brown et al. (1998) descrevem estudos projetados para manipular novas proteínas baseadas em SpA que permitem o uso de condições de 30 eluição mais favoráveis quando usadas como ligantes de afinidade. As mutações estudadas incluíam mutações únicas de Q13A, Q14H, N15A, N15H, F17H, Y18F, L21H, N32H ou K39H. Brown et al. reportam que substituições Q13A, N15A, N15H e N32H fizeram pouca diferença nos valores de constante de dissociação e que a substituição Y18F resultou em uma diminuição de 2 vezes na afinidade de ligação quando comparado à SpA do tipo silvestre. Brown et al. também reportam que substituições L21H e F17H diminuem a afinidade de ligação em cinco vezes e cem vezes, respectivamente. Os autores também estudaram substituições análogas em dois domínios aleatórios. Assim, os estudos de Brown et al. foram dirigidos à geração de uma SpA com um perfil de eluição mais favorável, consequentemente, o uso de substi-tuições de His para proporcionar uma alteração sensível ao pH na afinidade de ligação. Brown et al. não fazem menção ao uso de SpA como um antíge- no de vacina.
Graille et al. (2000) descrevem uma estrutura de cristal do domínio D de SpA e do fragmento Fab de um anticorpo de IgM humano. Graille et al. definem, através de análise da estrutura de cristal, os resíduos de aminoácido do domínio D que interagem com o fragmento Fab como os resíduos Q26, G29, F30, Q32, S33, D36, D37, Q40, N43, E47 ou L51, bem como os resíduos de aminoácido que formam a interface entre os subdomínios do domínio D. Graille et al. definem as interações moleculares dessas duas proteínas, mas não fazem menção a qualquer uso de substituições nos resíduos de interação na produção de um antígeno de vacina.0’Seaghdha et al. (2006) descrevem estudos dirigidos à elucidação de qual subdomínio do domínio D se liga ao vWF. Os autores geraram mutações simples nos subdomínios de ligação à Fc ou VH3, isto é, os resíduos de aminoácidos F5A, Q9A, Q10A, F13A, Y14A, L17A, N28A, 131 A, K35A, G29A, F30A, S33A, D36A, D37A, Q40A, E47A ou Q32A. Os autores descobriram que vWF se liga ao mesmo subdomínio que se liga Fc. O'Sea- ghda et al. definem o subdomínio do domínio D responsável pela ligação ao vWF, mas não fazem menção a qualquer uso de substituições nos resíduos de interação na produção de um antígeno de vacina.
Gomez et al. (2006) descrevem a identificação de resíduos responsáveis pela ativação de TNFR1 usando mutações únicas de F5A, F13A, Y14A, L17A, N21A, 131 A, Q32A e K35A. Gomez et al. não fazem menção a respeito de qualquer uso de substituições nos resíduos de interação na produção de um antígeno de vacina.
Proteína A rotulada por afinidade recombinante, um polipeptídeo abrangendo os cinco domínios de IgG (EDCAB) (Sjodahl, 1977) mas care-cendo da Região X C-terminal (Guss et al., 1984), foi purificada a partir de E. coli recombinante e usada como um antígeno de vacina (Stranger-Jones et al., 2006). Em virtude dos atributos da SpA na ligação à porção Fc de IgG, uma resposta imune humoral específica à proteína A não pôde ser medida (Stranger-Jones et al., 2006). Os inventores superaram esse obstáculo atra-vés da geração de SpA-DQ9,10K;D36,37A. Camundongos BALB/c imunizados com Proteína A recombinante (SpA) mostraram proteção significativa contra estímulo intravenoso com cepas de S. aureus: uma redução de 2,951 log na carga estafilocócica quando comparado com o tipo silvestre (P > 0,005; t-teste de Student) (Stranger-Jones et al., 2006). Anticorpos específi-cos para SpA podem causar eliminação fagocítica antes de formação de abscesso e/ou prejudicar a formação da barreira eosinofílica antes mencionada em abscessos que separam colônias estafilocócicas de células imunes, uma vez que essas não se formam durante infecção com cepas mutan- tes de Proteína A. Cada um dos cinco domínios de SpA (isto é, domíniosformados a partir de feixes de três hélices designados E, D, A, B e C) exerce propriedades de ligação similares (Jansson et al., 1998). A solução e estrutura de cristal do domínio D foram resolvidas com e sem os ligantes de Fc e VH3 (Fab), os quais se ligam à Proteína A de uma maneira não competitiva em sítios distintos (Graille et al., 2000). Mutações em resíduos conhecidospor estarem envolvidos em ligação à IgG (FS, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131 e K35) são também requeridas para ligação ao vWF Al e TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006; O'Seaghdha et al., 2006), enquanto que resíduos importantes para interação com VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) parecem não ter um impacto sobre as outrasatividades de ligação (Graille et al., 2000; Jansson et al., 1998). SpA objetiva especificamente um subconjunto de células B que expressa IgM relacionada à família VH3 sobre sua superfície, isto é, receptores de células B do tipo VH3 (Roben et al., 1995). Quando de interação com SpA, essas células B proliferam e levam à apoptose, levando à deteção preferencial e prolongada de linfócitos B semelhantes aos inatos (isto é, células B da zona marginal e células B2 foliculares) (Goodyear et al., 2003; Goodyear et al., 2004).
Base molecular de visualização na superfície e função de Proteína A.
A Proteína A é sintetizada como um precursor em citoplasma bacteri- ano e secretada via seu peptídeo sinalizador YSIRK na parede em cruz, isto é, no septo de divisão celular de estafilococos (figura 1A). (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Após clivagem do sinal de seleção LPXTG C-terminal, a Proteína A é ancorada em ligações em ponte cruzadas de pepti- doglicanas bacterianas pela sortase A (Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). A Proteína A é a proteína na superfície mais abundante de estafilococos; a molécula é expressa por virtualmente todas as cepas de S. aureus (SaTd-Salim et al., 2003; Cespedes et aL, 2005;
Kennedy et al., 2008). Estafilococos, reconstituem 15-20% de sua parede celular por ciclo de divisão (Navarre e Schneewind 1999). Hidrolases de mu- rino clivam as fitas de glicana e peptídeos na parede de peptidoglicanas, desse modo, liberando a Proteína A com seu tetrapeptídeo dissacarídico na parede celular C-terminal preso no meio extracelular (Toh-Que et al., 1999).
Assim, por design fisiológico, a Proteína A está ancorada à parede celular e é visualizada sobre uma superfície bacteriana, mas também liberada em tecidos circundantes durante infecção do hospedeiro (Marraffini etal., 2006).
Proteína A captura imunoglobulinas sobre uma superfície bacteriana e essa atividade bioquímica permite escape estafilocócíco de respostasimunes inatas do hospedeiro e adquiridas (Jensen 1958; Goodyear e Silver- man 2004). De modo interessante, a região X da Proteína A (Guss et al., 1984), um domínio repetido que une os domínios de ligação à IgG ao sinal de seleção LPXTG/ancora na parede celular, é talvez a porção mais variável do genoma estafilocócíco (Schneewind et al., 1992; Saíd-Salim et al., 2003).
Cada um dos cinco domínios de ligação à imunoglobulina da Proteína A (SpA), formados de feixes de três hélices e designados E, D, A, B e C, exerce propriedades estruturais e funcionais similares (Sjõdahl 1977; Jansson et al., 1998). A solução e estrutura de cristal do domínio D foi resolvida com e sem os ligantes de Fc e VH3 (Fab), os quais se ligam à Proteína A de uma maneira não competitiva em sítios distintos (Graille, 2000).
No complexo da estrutura de cristal, o Fab interage com a héliceII e a hélice III do domínio D via uma superfície composta de quatro β-fitas de região VH (Graille 2000). O principal eixo da hélice II do domínio D está a aproximadamente 50° com relação à orientação das fitas e a porção inter- helicoidal do domínio D é mais proximal à fita C0. O sítio de interação sobre o Fab está remoto à região constante de cadeia leve e cadeia pesada de lg.
A interação envolve os seguintes resíduos de domínio D: Asp-36 da hélice II, bem como Asp-37 e Gln-40 no loop entre a hélice II e a hélice III, além de vários outros resíduos com SpA-D (Graille, 2000). Ambas as superfícies de interação são compostas predominantemente de cadeias laterais polares, com três resíduos negativamente carregados sobre o domínio D e dois resí-duos positivamente carregados sobre o Fab 2A2 oculto pela interação, conferindo uma atração eletrostática global entre as duas moléculas. Das cinco interações polares identificadas entre Fab e o domínio D, três estão entre as cadeias laterais. Uma ligação em ponte salina é formada entre Arg-H19 e Asp-36 e duas ligações de hidrogênio são feitas entre Tyr-H59 e Asp-37 eentre Asn-H82a e Ser-33. Em virtude de conservação de Asp-36 e Asp-37 em todos os cinco domínios de ligação à IgG da Proteína A, os inventores realizaram mutações nesses resíduos.
Os sítios de SpA-D responsáveis pela ligação ao Fab são estruturalmente separados da superfície de domínio que media a ligação à Fcy. A 25 interação de Fcy com o domínio D envolve primariamente resíduos na hélice
I com menos envolvimento da hélice II (Gouda et al., 1992; Deisenhofer, 1981). Com exceção de Gln-32, um menor contato em ambos os complexos, nenhum dos resíduos que mediam a interação com Fcy está envolvido em ligação ao Fab. Para examinar a relação espacial entre esses diferentes sí- 30 tios de ligação à lg, os domínios de SpA nesses complexos foram superim- postos para construir um modelo de um complexo entre Fab. o domínio D de SpA e a molécula Fcy. Nesse modelo ternário, Fab e Fcy formam um sandu- íche em torno de faces opostas da hélice II sem evidência de estéreo- impedimento por qualquer interação. Essas descobertas ilustram como, a despeito de seu pequeno tamanho (isto é, 56-61 aa), um domínio de SpA pode mostrar simultaneamente ambas as atividades, explicando a evidência 5 experimental de que as interações de Fab com um domínio individual são não competitivas. Resíduos para a interação entre SpA-D e Fey são Gln-9 e Gln-10.
Em contraste, a ocupação da porção Fc de IgG sobre o domínio D bloqueia sua interação com vWF A1 e provavelmente também TNFR1 10 (0'Seaghdha et al., 2006). Mutações em resíduos essenciais para ligação de Fc à IgG (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131 e K35) são também requeridas para ligação a vWF A1 e TNFR1 (0'Seaghdha et al., 2006; Ce- dergren et al., 1993; Gomez et al., 2006), enquanto que resíduos críticos para a interação com VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) 15 não têm impacto sobre as atividades de ligação de Fc, vWF A1 ou TNFR1 àIgG (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). A atividade de ligação de Fab à imunoglobulina em proteína A objetiva um subconjunto de células B que expressam IgM relacionada à família VH3 sobre sua superfície, isto é, essas moléculas funcionam como receptores de células B do tipo VH3 (Roben et 20 al., 1995). Quando de interação com SpA, essas células B proliferam rapidamente e, então, levam à apoptose, levando à deleção preferencial e prolongada. de linfócitos B semelhantes aos inatos (isto é, células B da zona marginal e células B2 foliculares) (Goodyear e Silverman, 2004; Goodyear e Silverman, 2003). Mais de 40% das células B em circulação são objetivadas 25 pela interação de proteína A e a família VH3 representa a maior família de receptores de células B humanas que confere respostas humorais protetoras contra patógenos (Goodyear e Silverman, 2004; Goodyear e Silverman, 2003). Assim, a proteína A funciona analogamente aos superantígenos esta- filocócicos (Roben et al., 1995), embora essa última classe de moléculas, 30 por exemplo, SEB, TSST-1, TSST-2, forme complexos com o receptor de células T para estimular inapropriadamente respostas imunes do hospedeiro e, desse modo, precipitar aspectos característicos de infecções estafilocóci- cas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Juntas, essas descobertas documentam as contribuições da proteína A no estabelecimento de infecções estafilocócicas e em modulação de respostas imunes do hospedeiro.
Em resumo, domínios de Proteína A podem ser encarados como 5 mostrando duas interfaces diferentes para ligação com moléculas do hospedeiro e qualquer desenvolvimento de vacinas baseadas em proteína A deve considerar a geração de variantes que não alteram a sinalização à célula hospedeira, agregação plaquetária, captura de imunoglobulinas ou a indução de proliferação e apoptose de células B. Tais variantes de Proteína A tam- 10 bém serão úteis em análise de vacinas com relação à capacidade de estimular anticorpos que bloqueiam as atividades de SpA antes mencionadas e ocupam os cinco domínios repetidos em suas interfaces de ligação dupla. Esse objetivo é articulado e dirigido aqui pela primeira vez e são descritos métodos em detalhes para a geração de variantes de Proteína A que podem 15 ser usadas como uma vacina segura para seres humanos. Para alterar a ligação de FcD, vWF Al e TNFR1 à IgG, glutamina (Q) 9 e 10 [numeração derivada do domínio D de SpA, conforme descrito em Uhlen et al., 1984] sofreram mutação e geraram substituições de lisina para ambas as glutaminas, com exceção daquelas que eliminam os atributos de ligação na primeira in- 20 terface de ligação. Para alteração a ligação de VH3 de Fab à IgM, aspartato (D) 36 e 37 sofreram mutação, cada um dos quais é requerido para a associação com o receptor de células B. D36 e D37 foram ambos substituídos por alanina. As mutações Q9.10K e D36.37A são aqui combinadas na molécula recombinante SpA-DQ9,10K;D36,37A e testadas com relação aos atri-butos de ligação da Proteína A. Ainda, SpA-D e SpA-DQ9,10K;D36,37A são submetidas a estudos de imunização em camundongos e coelhos e analisadas com relação à [1] produção de anticorpos específicos (SpA-D Ab); [2] capacidade do Ab de SpA-D de bloquear a associação entre a Proteína A e seus quatro diferentes ligantes; e [3] os atributos do Ab de SpA-D de gerarimunidade protetora contra infecções estafilocócicas (vide a seção Exemplos abaixo).B. Coagulases estafilocócicas
Coagulases são enzimas produzidas por bactérias Staphylococcus que convertem fibrinogênio em fibrina. Coa e vWh ativam a pró-trombina sem proteólise (Friedrich et al., 2003). O complexo de coagulasepró- trombina reconhece o fibrinogênio como um substrato específico, convertendo o mesmo diretamente em fibrina. A estrutura de cristal do complexo ativo revelou ligação dos domínios D1 e D2 à pró-trombina e inserção de seu N- término de Ile1 -Vai2 na bolsa de lie16, induzindo a um sítio ativo funcional no zimogênio através de alteração conformacional (Friedrich et al., 2003). O exo-sítio I de cr-trombina, o sítio de reconhecimento de fibrinogênio e o pró- exo-sítio I sobre a pró-trombina são bloqueados pelo D2 de Coa (Friedrich et al., 2003). Todavia, associação do complexo tetramérico (Coa pró-trombina)2 se liga ao fibrinogênio em um novo sítio com alta afinidade (Panizzi et al., 2006). Esse modelo explica as propriedades coagulantes e eficiente conversão de fibrinogênio pela coagulase (Panizzi et al., 2006).
Fibrinogênio é uma grande glicoproteína (Mr -340.000), formada por três pares de Acr-, Bβ- e /-cadeias covalentemente ligadas para formar um "dímero de trímeros", onde Ae B designam os fibrinopeptídeos liberados por meio de divagem de trombina (Panizzi et al., 2006). A molécula alongada se duplica em três domínio distintos, um fragmento E central que contém o N-término de todas as seis cadeias e dois fragmentos D de flanqueamento formados principalmente pelos C-términos das Bβ- e /-cadeias. Esses domínios globulares estão conectados por estruturas de três hélices longas. Complexos de coagulase-pró-trombina, os quais convertem fibrinogênio hu-mano à fibrina de auto-polimerização, não são objetivados por inibidores de trombina em circulação (Panizzi et al., 2006). Assim, coagulases estafilocócicas ultrapassam a via de coagulação sanguínea fisiológica.
Todas as cepas de S. aureus secretam coagulase e vWbp (Bjer- ketorp et al., 2004; Field e Smith, 1945). Embora trabalho recente tenha reportado contribuições importantes da coagulase para a patogênese de infecções estafilocócicas (Ekstedt e Yotis, 1960; Smith et al., 1947), investigações mais recentes com ferramentas de genética molecular desafiaram essa hipó-tese ao não observar fenótipos de virulência com modelos de endocardite, abscessos na pele e mastite em camundongos (Moreillon et al., 1995; Pho- nimdaeng et al., 1990). A geração de variantes isogênicas de S. aureus Newman, um isolado clínico completamente virulento (Duthie et al., 1952), é descrita aqui onde mutantes coa mostram, na verdade, defeitos na virulência 5 em um modelo de bacteremia letal e abscesso renal em camundongos. Na experiência dos inventores, S. aureus 8325-4 não é totalmente virulento e presume-se que lesões mutacionais nessa cepa possam não ser capazes de revelar defeitos de virulência in vivo. Além disso, anticorpos estimulados contra Coa ou vWbp alteram a patogênese de infecções por S. aureus 10 Newman em um grau que reflete o impacto de deleções gênicas. Coa e vWbp contribuem para a formação de abscesso estafilocócico e bacteremia letal e podem também funcionar como antígenos protetores em vacinas de subunidade.
Estudos bioquímicos documentam o valor biológico de anticor- 15 pos contra Coa e vWbp. Por meio de ligação a antígeno e bloqueio de sua associação com fatores de coagulação, os anticorpos previnem a formação de complexos de Coapró-trombina e vWbp pró-trombina. Estudos de transferência passiva revelaram proteção de animais experimentais contra formação de abscesso estafilocócico e estímulo letal por anticorpos à Coa e 20 vWbp. Assim, anticorpos de neutralização de Coa e vWbp geram proteção imune contra doença estafilocócica.
Estudos anteriores revelaram um requisito de coagulase para resistência à fagocitose no sangue (Smith et al., 1947) e os inventores observaram um fenótipo similar para mutantes Δcoa em sangue de camundon- 25 gos tratados com lepirudina (vide Exemplo 3 abaixo). Uma vez que vWbp mostra maior afinidade pela pró-trombina humana do que a contra-parte em camundongos, suspeita-se que o mesmo possa ser verdadeiro para variantes ΔvWbp em sangue humano. Ainda, expressão de Coa e vWbp em lesões por abscesso, bem como sua distribuição estrita na pseudocápsula eosinofí- 30 lica que circundante (colônias de abscesso estafilocócico - Staphylococcal Abscess Communities - SACs) ou a parede de fibrina periférica, sugerem que coagulases secretadas contribuem para o estabelecimento dessas le- sões. Essa hipótese foi testada e, na verdade, mutantes Δcoa eram defectives no estabelecimento de abscessos. Um teste correspondentes, que bloqueia a função de Coa com anticorpos específicos, produziu o mesmo efeito. Consequentemente, é proposto que a coagulação de fibrina é um evento 5 crítico no estabelecimento de abscessos estafilocócicos que podem ser objetivada para o desenvolvimento de vacinas protetoras. Em virtude de sua função sobreposta sobre a pró-trombina humana, Coa e vWbp são considerados candidatos excelentes para o desenvolvimento de uma vacina.C, Outros antígenos estafilocócicos
Pesquisa nas últimas décadas identificou exotoxinas, proteínasna superfície e moléculas regulatórias de S. aureus como fatores de virulência importantes (Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003). Muito progresso foi obtido com relação à regulação desses genes. Por exemplo, estafilococos desempenham um censo bacteriano via a secreção de peptí-15 deos de auto-indução que se ligam a um receptor cognato em uma concentração limiar, desse modo, ativando reações de fosfo-retardo e ativação transcricional de muitos do genes de exotoxina (Novick, 2003). A patogêne- se de infecção estafilocócica conta com esses fatores de virulência (exotoxí- nas, exopolissacarídeos e adesinas na superfície secrefados). O desenvol- 20 vimento de vacinas estafilocócicas é impedido pela natureza multifacetada dos mecanismos de invasão estafilocócico. É bem estabelecido que microorganismos vivos atenuados são vacinas altamente eficazes; respostas imunes estimuladas por tais vacinas são, frequentemente, de maior magnitude e de duração mais longa do que aquelas produzidas por imunogênios não re-25 plicativos. Uma explicação para isso pode ser que cepas vivas atenuadas estabelecem infecções limitadas no hospedeiro e imitam os estágios iniciais de infecção natural. Modalidades da invenção são dirigidas a composições e métodos incluindo polipeptídeos e peptídeos variantes de SpA, bem como outras proteínas, peptídeos e polipeptídeos extracelulares imunogênicos (in-30 cluindo proteínas ou peptídeos secrefados ou na superfície) de bactérias gram positivas para uso em alívio ou imunização contra infecção. Em modalidades particulares, a bactéria é uma bactéria estafilocócica. Proteínas, polí- peptídeos ou peptídeos extracelu lares incluem, mas não estão limitados a, proteínas secretadas e na superfície celular das bactérias alvo.
O patógeno humano S. aureus secreta EsxA e EsxB, duas proteínas ESAT-6 like, através de um envoltório bacteriano (Burts et al., 2005, o 5 qual é incorporado aqui por referência). esxA e esxB estafilocócicos estão agrupados com seis outros genes na ordem de transcrição: esxA esaA essA esaB essB essC esaC esxB. Os acrônimos esa, ess e esx significam acessório de secreção, sistema e extracelular de ESAT-6, respectivamente, dependendo se as proteínas secretadas exercem um papel acessório (esa) ou 10 direto (ess) para secreção ou são secretadas (esx) no milieu extracelular. Todo o agrupamento de oito genes é aqui referido como agrupamento Ess. EsxA, EsxB, EssA, EssB e EssC são todos requeridos para síntese ou secreção de EsxA e EsxB. Mutantes que falham em produzir EsxA, EsxB e EssC mostram defeitos na patogênese de abscessos em murino por S. au- 15 reus, sugerindo que esse sistema de secreção especializado pode ser uma estratégia geral de patogênese bacteriana humana. Secreção de substratos não-WXG100 pela via ESX-1 foi reportada para vários antígenos, incluindo EspA, EspB, Rv3483c e Rv3615c (Fortune et al., 2005; MacGurn et al., 2005; McLaughlin et al., 2007; Xu et al., 2007). Também foi mostrado que a - 20 via alternativa ESX-5 secreta proteínas WXG100 e não-WXG100 em mico- bactérias patogênicas (Abdallah etal., 2007; Abdallah et al., 2006).
A via Ess de Staphylococcus aureus Ess pode ser encarada como um módulo de secreção equipado com componentes de transporte especializados (Ess), fatores acessórios (Esa) e substratos de secreção cogna- 25 tos (Esx). EssA, EssB e EssC são requeridos para secreção de EsxA e EsxB. Em virtude do fato de ser previsto que EssA, EssB e EssC sejam proteínas transmembrana, considera-se que essas proteínas formam um aparelho de secreção. Algumas das proteínas no agrupamento gênico ess podem transportar ativamente substratos secretados (atuando como um motor), en- 30 quanto que outras podem regular o transporte (regulador). Regulação pode ser obtida, mas não precisa estar limitada a, por meio de mecanismos trans- cricionais ou pós-traducionais para polipeptídeos secretados, selecionado substratos específicos a locais definidos (por exemplo, meio extracelular ou células hospedeiras) ou sincronizando eventos de secreção durante infecção. Nesse ponto, não está claro se todas as proteínas Esx secretadas funcionam como toxinas ou contribuem indiretamente para a patogênese.
Estafilococos contam com adesão mediada por proteínas na superfície a células hospedeiras ou invasão de tecidos como uma estratégia para escapar de defesas imunes. Além disso, S. aureus utiliza proteínas na superfície para capturar ferro do hospedeiro durante infecção, a maioria das proteínas na superfície envolvidas em patogênese estafilocócica traz sinais10 de seleção C-terminais, isto é, elas são covalentemente ligadas ao envoltório da parede celular pela sortase. Ainda, cepas estafilocócicas carecendo dos genes requeridos para ancoragem à proteína na superfície, isto é, sortase A e B, mostram um defeito dramático na virulência em diversos diferentes modelos com camundongos da doença. Assim, antígenos de proteína na super-15 fície representam um alvo para vacina validado, uma vez que os genes correspondentes são essenciais para o desenvolvimento de doença estafilocócica e podem ser explorados em várias modalidades da invenção. A super- família de enzimas sortase é uma transpeptidase Gram-positiva responsável por ancoragem de fatores de virulência de proteínas na superfície à camada . 20 da parede celular de peptidoglicana. Duas isoformas de sortase foram identificadas em Staphylococcus aureus, SrtA e SrtB. Foi mostrado que essas enzimas reconhecem um motivo LPXTG em proteínas de substrato. A isoforma SrtB parece ser importante em aquisição de heme ferro e homeostase de ferro, enquanto que a isoforma SrtA exerce um papel crítico na patogêne-25 se de bactérias Gram-positivas por meio de modulação da capacidade das bactérias de aderir ao tecido do hospedeiro via a ancoragem covalente de adesinas e outras proteína à peptidoglicana na parede celular. Em determinadas modalidades, uma variante de Sp, conforme descrito aqui, pode ser usada em combinação com outras proteínas estafilocócicas, tais como as30 proteínas Coa, Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsaB, EsxA, EsxB, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC, SasF, vWbp e/ou vWh.
Determinados aspectos da invenção incluem métodos e compo- sições referentes a composições proteináceas incluindo polipeptídeos, peptídeos ou ácidos nucleicos que codificam variante(s) de SpA e outros antígenos estafilocócicos, tais como outras proteínas transportadas pela via Ess ou substratos de sortase. Essas proteínas podem ser modificadas por meio de deleção, inserção e/ou substituição.
Os polipeptídeos de Esx incluem a sequência de aminoácido de proteínas Esx de bactérias no gênero Staphylococcus. A sequência de Esx pode ser de uma espécie estafilocócica em particular, tal como Staphylococcus aureus e pode ser de uma cepa em particular, tal como Newman. Em determinadas modalidades, a sequência de EsxA é SAV0282 da cepa Mu50 (a qual é a mesma sequência de aminoácido para Newman) e pode ser obtida usando Acesso ao GenBank Número Q99WU4 (gi|68565539), o qual é incorporado aqui por referência. Em outras modalidades, a sequência de EsxB é SAV0290 da cepa Mu50 (a qual é a mesma sequência de aminoácido para Newman) e pode ser obtida usando Acesso ao GenBank Número Q99WT7 (gi|68565532), o qual é incorporado aqui por referência. Em outras modalidades, outros polipeptídeos transportados pela via Ess podem ser usados, as sequências dos quais podem ser identificadas por aqueles versados no campo usando bancos de dados e recursos acessíveis pela internet.
Os polipeptídeos de substrato sortase incluem, mas não estão limitados a, uma sequência de aminoácido de proteínas SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC ou SasF de bactérias no gênero Staphylococcus. A sequência polipeptídica de substrato sortase pode ser de uma espécie estafilocócica em particular, tal como Staphylococcus aureus e pode ser de uma cepa em particular, tal como Newman. Em determinadas modalidades, a sequência de SdrD é da cepa N315 e pode ser obtida usando Acesso ao GenBank Número NP_373773.1 (gi| 15926240), o qual é incorporado por referência. Em outras modalidades, a sequência de SdrE é da cepa N315 e pode ser obtida usando Acesso ao GenBank Número NP_373774.1 (gi|15926241), o qual é incorporado por referência. Em outras modalidades, a sequência de IsdA é SAV1130 da cepa Mu50 (a qual é a mesma sequên- cia de aminoácido para Newman) e pode ser obtida usando Acesso ao GenBank Número NP_371654.1 (gi| 15924120), o qual é incorporado por referência. Em outras modalidades, a sequência de IsdB é SAV1129 da cepa Mu50 (a qual é a mesma sequência de aminoácido para Newman) e pode 5 ser obtida usando Acesso ao GenBank Número NP_371653.1(gi| 15924119), o qual é incorporado por referência. Em outras modalidades, outros polipeptídeos transportados pela via Ess ou processados por sortase podem ser usados, as sequências dos quais podem ser identificadas por aqueles versados no campo usando bancos de dados e recursos acessíveis 10 pela internet.
Exemplos de várias proteínas que podem ser usadas no contex- . to da presente invenção podem ser identificados analisando as entradas em bancos de dados de genomas bacterianos incluindo, mas não limitado a, números de acesso NC_002951 (Gl: 57650036 e GenBank CP000046), 15 NC_002758 (Gl: 57634611 e GenBank BA000017), NC_002745 (Gl:29165615 e GenBank BA000018), NC_003923 (Gl: 21281729 e GenBank BA000033), NC-002952 (Gl: 49482253 e GenBank BX571856), NC_002953 (Gl: 49484912 e GenBank BX571857), NC_007793 (Gl: 87125858 e GenBank CP000255), NC_007795 (Gl: 87201381 e GenBank CP000253) cada - 20 um dos quais é incorporado por referência.
Conforme usado aqui, um "proteína" ou "polipeptídeo" refere-se a uma molécula compreendendo pelo menos dez resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, uma versão do tipo silvestre de uma proteína ou polipeptídeo é empregada, contudo, em muitas modalidades da invenção, 25 uma proteína ou polipeptídeo modificado é empregado para gerar uma resposta imune. Os termos descritos acima podem ser usados permutavelmen- te. Uma "proteína modificada" ou "polipeptídeo modificado" ou uma "variante" refere-se a uma proteína ou polipeptídeo cuja estrutura química, partícu- iarmente sua sequência de aminoácido, é alterada com relação a uma prote-30 ína ou polipeptídeo do tipo silvestre. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo modifica d o/va ria nte tem pelo menos uma atividade ou função modificada (admitindo que proteínas ou polipeptídeos podem ter múlti- pias atividades ou funções). Considera-se especificamente que uma considerada que uma proteína ou polipeptídeo modificado/variante pode ser alterado com relação a uma atividade ou função e ainda reter uma atividade ou função do tipo silvestre em outros aspectos, tal como imunogenicidade.
Em determinadas modalidades, o tamanho de uma proteína oupolipeptídeo (tipo silvestre ou modificado) pode compreender, mas não está limitado a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,10 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120,130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 15 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 amino moléculas ou mais equalquer faixa derivável das mesmas ou derivada de uma amino sequência correspondente descrita ou mencionada aqui. Considera-se que polipeptí- deos podem sofrer mutação por meio de truncamento, tornando os mesmos mais curtos do que sua forma do tipo silvestre correspondente, mas também „ 20 poderiam ser alterados fundindo ou conjugando uma sequência de proteína heteróloga com uma função particular (por exemplo, para objetivação ou localização, para imunogenicidade intensificada, para fins de purificação, etc.).
Conforme usado aqui, uma "amino molécula" refere-se a qualquer aminoácido, derivado de aminoácido ou mímico de aminoácido conhe- 25 eido no campo. Em determinadas modalidades, os resíduos de uma molécula proteinácea são sequenciais, sem qualquer molécula não-amino interrompendo a sequência de resíduos da amino molécula. Em outras modalidades, a sequência pode compreender uma ou mais porções de moléculas não- amino. Em modalidades particulares, a sequência de resíduos de uma molé- 30 cuia proteinácea pode ser interrompida por uma ou mais porções de molécula não-amino.Consequentemente, o termo "composição proteinácea" abrange sequências de amino moléculas compreendendo pelo menos um dos 20 a- minoácidos comuns em proteínas naturalmente sintetizadas ou pelo menos um aminoácido modificado ou incomum.
Composições proteináceas podem ser feitas através de qualquer técnica conhecida por aqueles versados no campo, incluindo (i) a expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas padrões de biologia molecular, (ii) o isolamento de compostos proteináceos de fontes naturais ou (iii) a síntese química de materiais proteináceos. As sequências de nucleotídeo, bem como proteína, polipeptídeo e peptídeo para vários genes foram anteriormente divulgadas e podem ser encontradas em bancos de dados computadorizados reconhecidos. Um de tais bancos de dados é o banco de dados National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept (na World Wide Web em ncbi.nlm.nih.gov/). As regiões de codificação para esses genes podem ser amplificadas e/ou expressas usando as técnicas divulgadas aqui ou conforme será conhecido por aqueles versa-dos no campo.
Sequências de aminoácido variantes de SpA, coagulases e outros polipeptídeos da invenção podem ser variantes com substituição, inserção ou deleção. Uma variação em um polipeptídeo da invenção pode afetar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais aminoácidos não contíguos ou contíguos do polipeptídeo quando comparado com o tipo silvestre. Uma variante pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, incluindo todos os valores e faixas entre os mesmos, idêntica a qualquer sequência fornecida ou mencionada aqui, por exemplo, SEQ ID NO: 2-8 ou SEQ ID NO: 11-30. Uma variante pode incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos substitutos. Um polipeptídeo processado ou secretado pela via Ess ou outras proteínas na superfície (vide Tabela 1) ou substratos de sortase de quaisquer espécies e cepas estafilocócicas são considerados para uso em com-posições e métodos descritos aqui.
Variantes com deteção carecem, tipicamente, de um ou mais resíduos da proteína nativa ou do tipo silvestre. Resíduos individuais podem ser detetados ou uma série de aminoácidos contíguos podem ser detetados. Um códon terminal pode ser introduzido (por meio de substituição ou inserção) em uma sequência de codificação de ácido nucleico para gerar uma proteína truncada. Mutantes com inserção envolvem, tipicamente, a adição de material em um ponto não terminal no polipeptídeo. Isso pode incluir a inserção de um ou mais resíduos. Adições terminais, denominadas proteínas de fusão, podem também ser geradas. Essas proteínas de fusão incluem multímeros ou concatâmeros de um ou mais peptídeos ou polipeptídeos descritos ou mencionados aqui.
Variantes com substituição contêm, tipicamente, a troca de um aminoácido por outro em um ou mais sítios dentro da proteína e podem ser projetadas para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, com ou sem a perda de outras funções ou propriedades. Substituições podem ser conservatives, isto é, um aminoácido é substituído por um de formato e carga similares. Substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as alterações de: alapina por serina; arginina por lisina; asparagina por glutamina ou histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparagina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparagina ou glutamina; isoleucina por leucina ou valina; leucina por valina ou isoleucina; lisina por arginina; metionina por leucina ou isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina ou metionina; serina por treo- nina; treonina por serina; triptofano por tirosina; tirosina por triptofano ou fenilalanina; e valina por isoleucina ou leucina. Alternativamente, substituições podem ser não conservativas, de modo que a função ou atividade do polipeptídeo são afetadas. Alterações não conservativas envolvem, tipicamente, substituição de um resíduo por outro que é quimicamente dissimilar, tal como um aminoácido polar ou carregado por um aminoácido não polar ou não carregado e vice versa. Tabela 1. Proteínas na superfície de cepas de S. aureus exemplificativas
Figure img0001
Proteínas da invenção podem ser recombinantes ou sintetizadasin vitro. Aíternativamente, uma proteína não recombinante ou recombinante 5 pode ser isolada de bactérias. Considera-se também que uma bactéria contendo tal variante pode ser implementada em composições e métodos da invenção. Consequentemente, uma proteína não precisa ser isolada.
O termo "códon funcionalmente equivalente" é usado aqui para referir-se a códons que codificam o mesmo aminoácido, tal como os seis 10 códons para arginina ou serina e refere-se também a códons que codificam aminoácidos biologicamente equivalentes (vide Tabela 2, abaixo). Tabela 2. Tabela de Códons
Figure img0002
Deve ser entendido também que sequências de aminoácido eácido nucleico podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N- 5 ou C-terminais ou sequências 5' ou 3' adicionais, respectivamente e ainda ser essencialmente conforme apresentado em uma das sequências divulgadas aqui, contanto que a sequência vá de encontro aos critérios apresentados acima, incluindo a manutenção de atividade de proteína biológica (por exemplo, imunogenicidade), onde expressão de proteína é considerada. A 10 adição de sequências terminais se aplica particularmente à sequências de ácido nucleico que podem, por exemplo, incluir várias sequências de não codificação que flanqueiam as porções 5' ou 3' da região de codificação.
O seguinte é uma discussão baseada em alteração dos aminoácidos de uma proteína para criar um polipeptídeo ou peptídeo variante. Por exemplo, determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos na éstrutura de uma proteína com ou sem perda apreciável de capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação a antígeno de anticorpos ou sítios de ligação sobre moléculas 5 de substrato. Uma vez que é a capacidade interativa e natureza de uma proteína que definem a atividade funcional da proteína, determinadas substituições de aminoácido podem ser feitas em uma sequência de proteína e em sua sequência de codificação de DNA subjacente e, ainda assim, produzir uma proteína com uma propriedade desejável. Assim, é considerado pelos 10 inventores que várias alterações podem ser feitas nas sequências de DNA de genes.
Considera-se que, nas composições da invenção, há entre cerca de 0,001 mg e cerca de 10 mg de polipeptídeo, peptídeo e/ou proteína total por ml. A concentração de proteína em uma composição pode ser cerca de, 15 pelo menos cerca de ou no máximo cerca de 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 mg/ml ou mais (ou qualquer faixa derivável das mesmas). Dessas, cerca de, pelo menos cerca de ou no máximo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,’ 15, 16, 17, 18, 19, 20 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100% podem ser uma variante de SpA ou uma coagulase e podem ser usa- 25 das em combinação com outros peptídeos ou polipeptídeos, tais como outros peptídeos e/ou antígenos bacterianos.
A presente invenção considera a administração de polipeptídeos ou peptídeos variantes de SpA para obter um efeito terapêutico ou de terapia preventiva contra o desenvolvimento de uma doença ou condição associada 30 à infecção por um patógeno estafilocócíco.
Em determinados aspectos, combinações de antígenos estafilo- cócicos são usadas na produção de uma composição imunogênica que é eficaz no tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica. Infecções estafilocócicas progridem através de vários estágios diferentes. Por exemplo, o ciclo de vida estafilocócico envolve colonização comensal, início de infecção por acesso a tecidos adjacentes ou à corrente sanguínea e/ou multiplicação 5 anaeróbica no sangue. A interação entre determinantes de virulência de S.aureus e os mecanismos de defesa do hospedeiro pode induzir à complicações, tais como endocardite, formação de abscesso metastático e síndrome séptica. Diferentes moléculas sobre a superfície de uma bactéria estão envolvidas em diferentes etapas do ciclo de infecção, combinações de deter- 10 minados antígenos pode estimular uma resposta imune a qual protege contra múltiplos estágios de infecção estafilocócica. A eficácia de uma resposta . imune pode ser medida em ensaios modelos com animais e/ou usando um ensaio opsonofagocítico.D. Polipeptídeos e Produção de Polipeptídeo
A presente invenção descreve polipeptídeos, peptídeos e proteínas e fragmentos imunogênicos dos mesmos para uso em várias modalidades da presente invenção, por exemplo, polipeptídeos específicos são ensaiados para ou usados para estimular uma resposta imune. Em modalidades específicas, toda ou parte de uma proteína da invenção pode também - 20 ser sintetizada em solução ou sobre um suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos estão comercialmente disponíveis e podem ser usados de acordo com protocolos conhecidos. Vide, por exemplo, Stewart e Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); e Barany e Merrifield (1979), cada um incorporado aqui por referên- 25 cia.
Alternativamente, a tecnologia de DNA recombinante pode ser empregada, em que a sequência de nucleotídeo a qual codifica um peptídeo da invenção é inserida em um vetor de expressão, transformada ou transfec- tada em uma célula hospedeira apropriada e cultivada sob condições ade- 30 quadas para expressão.
Uma modalidade da invenção incluí o uso de transferência de genes para células, incluindo microorganismos, para a produção e/ou apre- sentação de polipeptídeos ou peptídeos. O gene para o polipeptídeo ou peptídeo de interesse pode ser transferido para células hospedeiras apropriadas, seguido por cultura de células sob as condições apropriadas. A geração de vetores de expressão recombinantes e dos elementos incluídos nos 5 mesmos são bem conhecidos no campo e brevemente discutidos aqui. Al-ternativamente, uma proteína a ser produzida pode ser uma proteína endógena normalmente sintetizada pela célula que é isolada e purificada.
Outra modalidade da presente invenção usa linhagens de células de linfócito B autólogas as quais são transfectadas com um vetor virai 10 que expressa um produto imunogênico e, mais especificamente, uma proteína tendo atividade imunogênica. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitados a, linhagens de células Vero e HeLa, outras linhagens de células B e T, tais como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, bem como linhagens de células de ovário de 15 Hâmster Chinês, células W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN e MDCK. Além disso, pode ser escolhido um tipo de célula hospedeira que modula a expressão das sequências inseridas ou que modifica e processa o produto gênico da maneira desejada. Tais modificações, (por exemplo, glico- silação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína 20 podem ser importantes para a função de uma proteína. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-traducional e modificação de proteínas. Linhagens de células ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento corretos da proteína estranha expressa.
Uma série de sistemas de seleção pode ser usada incluindo,mas não limitado a, quinase de timidina de HSV, genes de fosforibosil transferase de hipoxantina-guanina e fosforibosil transferase de adenina, em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também, resistência anti-metabólito pode ser usada como a base de seleção: para dhfr, o qual confere resistên- 30 cia ao timethoprim e metotrexato; gpt, a qual confere resistência ao ácido micofenólico; neo, o qual confere resistência ao aminoglicosídeo G418; e hygro, o qual confere resistência à higromicina.
Células animais podem ser propagadas in vitro em dois modos: como células não dependentes de ancoragem que crescem em suspensão por todo o grosso da cultura ou como células dependentes de ancoragem que requerem fixação a um substrato sólido para sua propagação (isto é, um 5 tipo em monocamada de crescimento celular).
Culturas em suspensão ou não dependentes de ancoragem de linhagens de células estabelecidas contínuas são o meio mais amplamente usado para produção em larga escala de células e produtos celulares. Contudo, células cultivadas em suspensão têm limitações, tais como potencial 10 tumorigênico e menor produção de proteína do que células aderentes.
Onde uma proteína é especificamente mencionada aqui ela é, de preferência, uma referência a uma proteína nativa ou recombinante ou opcionalmente uma proteína na qual qualquer sequência sinalizadora tenha sido removida. A proteína pode ser isolada diretamente da cepa estafilocóci- 15 ca ou produzida por meio de técnicas de DNA recombinante. Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composição imunogê- nica da invenção. Esses são fragmentos compreendendo pelo menos 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos ou 100 aminoácidos, incluindo todos os valores e fàixas entre os mes- 20 mos, tomados continuamente da sequência de aminoácidos da proteína.
Além disso, tais fragmentos imunogênicos são imunologicamente reativos com anticorpos gerados contra as proteínas estafilocócicas ou com anticorpos gerados por meio de infecção de um hospedeiro mamífero com estafilococos. Fragmentos imunogênicos também incluem fragmentos que, quando 25 administrados em uma dose eficaz (quer isoladamente ou como um hapteno ligado a um veículo), estimulam uma resposta imune protetora ou terapêutica contra infecção estafilocócica. Em determinados aspectos, ela protege contra infecção por S. aureus e/ou S. epidermidis. Tal fragmento imunogênico pode incluir, por exemplo, uma proteína carecendo de uma sequência 30 líder N-terminal e/ou um domínio transmembrana e/ou um domínio âncora C- terminal. Em um aspecto preferido, o fragmento imunogênico de acordo com a invenção compreende substancialmente todo o domínio extracelular de uma proteína a qual tem pelo menos 80% identidade, pelo menos 85% identidade, pelo menos 90% identidade, pelo menos 95% identidade ou pelo menos 97-99% identidade, incluindo todos os valores e faixas entre os mesmos, a uma sequência selecionada de segmentos polipeptídicos descri- 5 tos ou mencionados aqui.
Também incluídas nas composições imunogênicas da invenção estão proteínas de fusão compostas de uma ou mais proteínas estafilocócicas ou fragmentos imunogênicos de proteínas estafilocócicas. Tais proteínas de fusão podem ser feitas recombinantemente e podem compreender uma 10 porção de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínas ou segmentos estafilocócicos. Alternativamente, uma proteína de fusão pode compreender múltiplas porções de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 proteínas estafilocócicas. Essas podem combinar diferentes proteínas estafilocócicas e/ou múltiplos da mesma proteína ou fragmento de proteína ou fragmentos imunogênicos na mesma 15 proteína (formando um multímero ou um concatâmero). Alternativamente, a invenção também inclui proteínas de fusão individuais de proteínas estafilocócicas ou fragmentos imunogênicos das mesmas, como uma proteína de fusão com sequências heterólogas, tal como um fornecedor de epítopos de células T ou tags de purificação, por exemplo: □-galactosidase, glutationa-S- 20 transferase, proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein - GFP), tags de epítopo, tais como FLAG, tag myc, poli histidina ou proteínas na superfície viral, tai como hemaglutinina do virus da influenza ou proteinas bac- terianas, tais como toxoide do tétano, toxoide de difteria ou CRM 197.IV. Ácido nucleicos
Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se apolinucleotídeos recombinantes que codificam proteínas, polipeptídeos, peptídeos da invenção. As sequências de ácido nucleico para SpA, coagulases e outras proteínas bacterianas são incluídas, todas as quais são incorporadas por referência e podem ser usadas para preparar peptídeos ou polipep- 30 tídeos.
Conforme usado no presente pedido, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é recombinante ou foi isola- da do ácido nucleico genômico total. Incluídos dentro do termo "polinucleotí- deo" estão oligonucleotídeos (ácido nucleicos de 100 resíduos ou menos de comprimento), vetores recombinantes incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fago, vírus e semelhantes. Polinucleotídeos incluem, em determinados aspectos, sequências regulatórias isoladas substancialmente de seus genes que ocorrem naturalmente ou sequências de codificação de proteína. Polinucleotídeos podem ser fita simples (codificação ou anti-senso) ou fita dupla e podem ser RNA, DNA (genômico, cDNA ou sintético), análogos dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. Sequências de codificação ou não codificação adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo.
A esse respeito, os termos "gene11, "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico" são usados para referir-se a um ácido nucleico que codifica uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo (incluindo quaisquer sequências requeridas para transcrição apropriada, modificação pós-traducional ou localização). Conforme será entendido por aqueles versados no campo, esse termo abrange sequências genômicas, cassetes de expressão, sequências de cD- NA e segmentos de ácido nucleico menores.manipulados que expressam ou podem ser adaptados para expressar proteínas, polipéptídeos, domínios, peptídeos, proteínas de fusão e mutantes. Um ácido nucleico que codifica todo ou parte de um polipeptídeo pode conter uma sequência de ácido nucleico contígua de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280,290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430,440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570,580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720,730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870,880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 ou mais nucleotídeos, nucleosídeos ou pares de base, incluindo todos os valores e faixas entre os mesmos, de um polinucleotídeo que codi fica uma ou mais sequências de aminoácido descritas ou mencionadas aqui. Considera-se também que um polipeptídeo em particular pode ser codificado por ácidos nucleicos contendo variações tendo sequências de ácido nucleico ligeiramente diferentes mas, todavia, codificam as mesmas ou proteínas substancialmente similares (vide Tabela 2 acima).
Em modalidades particulares, a invenção refere-se a segmentos de ácido nucleico isolados e vetores recombinantes que incorporai sequências de ácido nucleico que codificam uma variante de SpA ou coagulase. O termo "recombinante" pode ser usado em conjunto com um polinucleotídeo ou polipeptídeo e refere-se, em geral, a um polipeptídeo ou polinucleotídeo produzido e/ou manipulado in vitro ou que é um produto de replicação de tal molécula.
Em outras modalidades, a invenção refere-se a segmentos de ácido nucleico isolados e vetores recombinantes que incorporam sequências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo ou peptídeo variante de SpA ou coagulase para gerar uma resposta imune em um indivíduo. Em várias modalidades, os ácido nucleicos da invenção podem ser usados em vacinas genéticas. .
Os segmentos de ácido nucleico usados na' presente invenção podem ser combinados com outras sequências de ácido nucleico, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzima de restrição adicionais, sítios de clonagem múltipla, outros segmentos de codificação e semelhantes, de modo que seu comprimento global pode variar consideravelmente. Portanto, considera-se que um fragmento de ácido nucleico de quase qualquer comprimento pode ser empregado, com o comprimento total estando, de preferência, limitado pela facilidade de composição e uso no protocolo pretendido de ácido nucleico recombinante. Em alguns casos, uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência polipeptídica com sequências de codificação heterólogas adicionais, por exemplo, para permitir purificação do polipeptídeo, transporte, secreção, modificação pós- traducional ou para benefícios terapêuticos, tais como objetivação ou eficácia. Conforme discutido acima, uma tag ou outro polipeptídeo heterólogo pode ser adicionado à sequência de codificação polipeptídica modificada, em que "heterólogo" refere-se a um polipeptídeo que não é o mesmo que o polipeptídeo modificado.
Em algumas outras modalidades, a invenção refere-se a segmentos de ácido nucleico isolados e vetores recombinantes que incluem, dentro de sua sequência, uma sequência de ácido nucleico contígua de SEQ ID NO: 1 (domínio D de SpA) ou SEQ ID NO: 3 (SpA) ou quaisquer outras sequências de ácido nucleico que codificam coagulases ou outros fatores de virulência secrefados e/ou proteínas na superfície, incluindo proteínas transportadas pela via Ess, processadas por sortase ou proteínas incorporadas aqui por referência.
Em determinadas modalidades, a presente invenção proporciona variantes de polinucleotídeo tendo identidade substancial às sequências divulgadas aqui; aquelas compreendendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência, incluindo todos os valores e faixas entre os mesmos, comparado com uma sequência de polinucleotídeo da presente invenção usando os métodos descritos aqui (por exemplo, análise pelo BLAST usando parâmetros padrões).
A invenção também considera o uso de polinucleotídeos os quais são complementares a todos os polinucleotídeos descritos acima.
E. Vetores
Polipeptídeos da invenção podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico compreendida em um vetor. O termo "vetor" é usado para referir-se a uma molécula de ácido nucleico veículo na qual uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser inserida para introdução em uma célula, onde ela pode ser reproduzida e expressa. Uma sequência de ácido nucleico pode ser "heteróloga", o que significa que ela está em um contexto estranho à célula na qual o vetor está sendo introduzido ou ao ácido nucleico no qual ela é incorporada, o qual inclui uma sequência homóloga a uma sequência na célula ou ácido nucleico, mas em uma posição, dentro da célula hospedeira ou ácido nucleico onde ela não é comumente encon-trada. Vetores incluem DNAs, RNAs, plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteri- ófago, vírus de animais e vírus de planta) e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs). Aqueles versados no campo estarão bem equipados para construir um vetor através de técnicas recombinantes padrões (por exemplo, Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996, ambos incorporados aqui por 5 referência), além de codificação do polipeptídeo variante de SPA, o vetor pode codificar outras sequências polipeptídicas, tais como um ou mais de outros peptídeos bacterianos, uma tag ou um peptídeo de intensificação de imunogenicidade. Vetores úteis que codificam tais proteínas de fusão incluem vetores pIN (Inouye et al., 1985), vetores que codificam um trecho de 10 histidinas e vetores pGEX para uso na geração de proteínas de fusão solúveis em glutationa S-transferase (GST) para posterior purificação e separação ou divagem.
O termo "vetor de expressão'' refere-se a um vetor contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos parte de um pro- 15 duto gênico capaz de ser transcrito. Em alguns casos, moléculas de RNA são, então, traduzidas em uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo. Vetores de expressão podem conter uma variedade de "sequências de controle", as quais referem-se à sequências de ácido nucleico necessárias para a transcrição e possivelmente tradução de uma sequência de' codificação opera- 20 velmente ligada em um organismo hospedeiro em particular. Além de sequências de controle que governam a transcrição e tradução, vetores e vetores de expressão podem conter sequências de ácido nucleico que servem à outras funções também e são descritas aqui.
1. Promotores e Intensificadores
Um "promotor" é uma sequência de controle. O promotor é, tipicamente, uma região de uma sequência de ácido nucleico na qual início e taxa de transcrição são controlados. Ele pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas regulatórias podem se ligar, tal como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. As frases "operativamente posi- 30 cionado", "operativamente ligado", "sob controle" e "sob controle transcricio- nal" significam que um promotor está em uma localização e/ou orientação funcional correta com relação a uma sequência de ácido nucleico para con trolar o início de transcrição e expressão dessa sequência. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um "intensificador", o qual refere-se a uma sequência regulatória de cis-atuação envolvida na ativação transcricio- nal de uma sequência de ácido nucleico.
Naturalmente, pode ser importante empregar um promotor e/ouintensificador que dirige relativamente a expressão do segmento de DNA no tipo de célula ou organismo escolhido para expressão. Aqueles versados no campo de biologia molecular conhecem, em geral, o uso de promotores, in- tensificadores e combinações de tipos de células para expressão de proteína10 (vide Sambrook et al., 2001, incorporado aqui por referência). Os promotores empregados podem ser constitutivos, tecido-específicos ou induzíveis e, em determinadas modalidades, podem dirigir expressão em alto nível do segmento de DNA introduzido sob condições especificadas, tal como produção em larga escala de proteínas ou peptídeos recombinantes.15 Vários elementos/promotores podem ser empregados no contexto da presente invenção para regular a expressão de um gene. Exemplos de tais elementos induzíveis, os quais são regiões de uma sequência de ácido nucleico que podem ser ativadas em resposta a um estímulo específico incluem, mas não estão limitados a, Cadeia Pesada de Imunoglobulina (Ba-20 nerjieta/., 1983; Gilles et a/., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et a/., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et a/., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et a/.; 1990), Cadeia Leve de Imunoglobulina (Queen et al., 1983; Picard et al., 1984), Receptor de Células T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990), HLA DQ α e/ou DQ β (Sullivan et al., 1987), β
Interferon (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988), lnterleucina-2 (Greene et al., 1989), Receptor de lnterleucina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990), Classe II do MHC 5 (Koch et al., 1989), Classe II do MHC HLA-DRgSherman et al., 1989), β-Actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989), Quinase de Creatina Muscular (MCK) (Jaynes etal., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson etal., 1989), Pré-albumina (Transtire- tina) (Costa et al., 1988), Elastase I (Ornitz et al., 1987), Metalotioneína (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989), Colagenase (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987), Albumina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990), α-Fetoproteina (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989), y- Globina (Bodine etal., 1987; Perez-Stabela et al., 1990), y-Globina (Trudel et al., 1987), c-fos (Cohen et al., 1987), c-Ha-Ras (Triesman, 1986; Deschamps 5 et al., 1985), Insulina (Edlund et al., 1985), Molécula de Adesão de Célula
Neural (NCAM) (Hirsh etal., 1990), α1-Antitripaina (Latimer et al., 1990), His- tona H2B (TH2B) (Hwang et al., 1990), Colágeno do Tipo I e/ou de camundongo (Ripe et al., 1989), Proteinas Glicose-Reguladas (GRP94 e GRP78) (Chang et al., 1989), Hormônio de Crescimento de Rato (Larsen et al., 10 1986), Amiloide A de Soro Humano (SAA) (Edbrooke et al., 1989), TroponinaI (TN I) (Yutzey et al., 1989), Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta . (PDGF) (Pech et al., 1989), Distrofia Muscular de Duchenne (Klamut et al., 1990), SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986;15 Wang et al., 1986; Wherek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988), Polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell etal., 1988), Retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Khegler et al., 1983, . 20 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al.,1987; Thiesen etal., 1988; Celander et al., 1988; Choi etal., 1988; Reisman et al., 1989), Papiloma Virus (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Span- ded e Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss etal., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens etal., 1987), Virus25 da Hepatite B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988), Vírus da Imunodeficiência Humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989), IE de30 Citomegalovirus (CMV) (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986), Virus da Leucemia de Macaco Gibão (Holbrook et al., 1987; Quinn etal., 1989). Elementos induzíveis incluem, mas não estão limitados a, MT II - Forbol Éster (TFA)ZMetais Pesados (Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (vírus de tumor5 mamário de camundongo) - Glucocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors etal., 1983; Chandler et a/., 1983; Lee et a/., 1984; Ponta etal., 1985; Sakai et al., 1988); β-lnterferon - poli(rl)x/poli(rc) (Tavernier et al., 1983); Adenovirus 5 E2 - EIA (Imperiale et al., 1984); Colagenase - Forbol Éster (TPA) (Angel et al., 1987a); Estromelisina - Forbol Éster (TPA) (Angel10 et al., 1987b); SV40 - Forbol Éster (TPA) (Angel et al., 1987b); Gene MX deMurino - Interferon, Vírus da Doença Newcastle (Hug et al., 1988); Gene . GRP78 - A23187 (Resendez et al., 1988); α-2-Macroglobulina - IL-6 (Kunz etal., 1989); Vimentina - Soro (Riffling et al., 1989); Gene H-2Kb da Classe I doMHC - Interferon (Blanar et al., 1989); HSP70 - EIA/Grande Antígeno T de15 SV40 (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); Proliferina - Forbol Éster/TPA (Mordacq et al., 1989); Fator de Necrose de Tumor - PMA (Hensel et al., 1989); e Gene α de Hormônio de Estimulação de Tiroide - Hormônio da TÍ- roide (Chatterjee et al., 1989).Acredita-se que o promotor que é empregado em particular para - 20 controlar a expressão de polinucleotídeos que codificam o peptídeo ou proteína da invenção não é crítico, contanto que ele seja capaz de expressar o polinucleotídeo em uma célula alvo, de preferência uma célula bacteriana. Onde uma célula humana é objetivada, é preferível posicionar a região de codificação de polinucleotídeo adjacente a e sob o controle de um promotor25 que é capaz de ser expresso em uma célula humana. Falando de modo geral, tal promotor poderia incluir um promotor bacteriano, virai ou humano.
Em modalidades nas quais um vetor é administrado a um indivíduo para expressão de uma proteína, considera-se que qualquer promotor desejável para uso com o vetor é um que não é sub-regulado por citocinas 30 ou um que é forte o bastante para que, mesmo se sub-regulado, produza uma quantidade eficaz de uma variante de SpA para estimular uma resposta imune. Exemplos não limitativos desses são IE de CMV e LTR de RSV.
Promotores tecido-específicos podem ser usados, particularmente se expressão é em células nas quais expressão de um antígeno é desejável, tal como células dendríticas ou macrófagos. Os promotor de MHC I e MHC II de mamífero são exemplos de tais promotores tecido-específicos.
2. Sinais de Início e Sítios de Ligação Ríbossômica Internos (IRES)
Um sinal de início específico pode também ser requerido para tradução eficiente de sequências de codificação. Esses sinais incluem o có- don inicial ATG ou sequências adjacentes. Pode ser necessário proporcionar sinais de controle de tradução exógenos, incluindo o códon inicial ATG. A- 10 queles versados no campo serão prontamente capazes de determinar isso e o fornecimento dos sinais necessários.. Em determinadas modalidades da invenção, o uso de elementosde sítios de entrada ríbossômica internos (Internal Ribosome Entry Sites - IRES) é feito para criar mensagens multigênicas ou policistrônicas. Elemen- 15 tos IRES são capazes de ultrapassar o modelo de varredura ribossômica de tradução Cap-dependente 5* metilada e começar a tradução em sítios internos (Pelletier e Sonenberg, 1988; Macejak e Sarnow, 1991). Elementos IRES podem ser ligados a quadros de leitura aberta heterólogos. Múltiplos quadros de leitura aberta podem ser transcritos juntos, cada um separado . 20 por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressos usando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem (vide Patentes U.S. 5.925.565 e 5.935.819, aqui incorporadas por referência).
3. Marcadores Selecionáveis e Passíveis de Triagem
Em determinadas modalidades da invenção, células contendoum construto de ácido nucleico da presente invenção podem ser identificadas in vitro ou in vivo por meio de codificação de um marcador passível de triagem ou selecionável no vetor de expressão. Quando transcrito e traduzido, um marcador confere uma alteração identificável à célula, permitindo 30 fácil identificação de células contendo o vetor de expressão. Em geral, um marcador selecionável é um que confere uma propriedade que permite seleção. Um marcador selecionável positivo é um no qual a presença do marca- dor permite sua seleção, enquanto que um marcador selecionável negativo é um no qual sua presença impede sua seleção. Um exemplo de um marcador selecionável positivo é um marcador de resistência a fármaco.
F. Células Hospedeiras
Conforme usado aqui, os termos "célula," "linhagem de célula" e"cultura de célula" podem ser usados permutavelmente. Todos esses termos também incluem sua prole, a qual é qualquer e todas as gerações subsequentes. Deve ser entendido que toda a prole pode não ser idêntica em virtude de mutações deliberadas ou inadvertidas. No contexto de expressão de 10 uma sequência de ácido nucleico heteróloga, "célula hospedeira" refere-se a uma célula procariota ou eucariota e inclui qualquer organismo transformável . que é capaz de replicação de um vetor que expressa um gene heterólogo codificado por um vetor. Uma célula hospedeira pode e tem sido usada como um recipiente para vetores ou vírus. Uma célula hospedeira pode ser 15 "transfectada" ou "transformada", a qual refere-se a um processo pelo qual ácido nucleico exógeno, tal como uma sequência de codificação de proteína recombinante, é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula transformada inclui a célula primária em questão e sua prole. ♦ ' 'Células hospedeiras podem ser derivadas dé procariotas ou eu- • 20 cariotas, incluindo bactérias, células de levedura, células de inseto e células de mamífero para replicação do vetor ou expressão de parte ou toda a(s) sequência(s) de ácido nucleico. Numerosas linhagens e culturas de células estão disponíveis para uso como uma célula hospedeira e elas podem ser obtidas através da American Type Culture Collection (ATCC), a qual é uma 25 organização que serve como um arquivo para culturas vivas e materiais genéticos (www.atcc.org).
G. Sistemas de Expressão
Existem numerosos sistemas de expressão que compreendem pelo menos uma parte ou todas as composições discutidas acima. Sistemas 30 baseados em procariota e/ou eucariota podem ser empregados para uso com a presente invenção para produzir sequências de ácido nucleico ou seus polipeptídeos, proteínas e peptídeos cognatos. Muitos de tais sistemas estão comercial e amplamente disponíveis.
O sistema de células de inseto/baculovirus pode produzir um alto nível de expressão de proteína de um segmento de ácido nucleico heteró- logo, tal como descrito nas Patentes U.S. 5.871.986, 4.879.236, ambas in- 5 corporadas aqui por referência e o qual pode ser adquirido, por exemplo, sob o nome MAXBAC® 2.0 da INVITROGEN® e BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM da CLONTECH®.
Além dos sistemas de expressão divulgados da invenção, outros exemplos de sistemas de expressão incluem STRATAGENE®'s COMPLETE 10 CONTROL™ Inducible Mammalian Expression System, o qual envolve urn receptor ecdisoma-induzivel sintético ou seu sistema de expressão pET, um , sistema de expressão de E. coli. Outro exemplo de um sistema de expressão induzível está disponível da INVITROGEN®, o qual traz o sistema T- REX™ (expressão tetracicilina-regulada), um sistema de expressão de ma- 15 mifero induzível que usa o promotor CMV de comprimento total. O INVITROGEN® também proporciona um sistema de expressão de levedura de-nominado o sistema de expressão Pichia methanolica, o qual é projetado para produção em alto nível de proteínas recombinantes na levedura metilo- ♦ .trófica Pichia methanolica. Aqueles versados no campo saberão como ex. 20 pressar um vetor, tal como um construto de expressão, para produzir uma sequência de ácido nucleico ou seu polipeptídeo, proteína ou peptídeo cognato.
V. POLISSACARÍDEOS
As composições imunogênicas da invenção podem ainda com- 25 preender polissacarídeos capsulares, incluindo um ou mais de PIA (também conhecido como PNAG) e/ou polissacarídeos capsular do Tipo V e/ou do Tipo VIII de S. aureus e/ou polissacarídeo capsular do Tipo I e/ou do Tipo II e/ou do Tipo III de S. epidermidis.
H. PIA (PNAG)
Agora, está claro que as várias formas de polissacarídeos nasuperficie estafilocócica identificados como PS/A, PIA e SAA são a mesma entidade química - PNAG (Maira-Litran et al., 2004). Portanto, o termo PIA ou PNAG abrange todos esses polissacarídeos ou oligossacarídeos derivados dos mesmos.PIA é uma adesina intercelular polissacarídica e é composto de um polímero de glucosaminas β-(1—>6)-ligadas substituídas por constituintes 5 de N-acetila e O-succinila. Esse polissacarídeo está presente em S. aureus e S. epídermidis e pode ser isolado de qualquer fonte (Joyce et al., 2003; Maira-Litran et al., 2002). Por exemplo, PNAG pode ser isolado da cepa MN8m de S. aureus (documento W004/43407). PIA isolado de S. epidermi- dis é um constituinte integral do biofilme. Ele é responsável por mediação de 10 adesão célula-célula e provavelmente também funciona para proteger a colônia em crescimento contra a resposta imune do hospedeiro. Recentemen- . te, foi mostrado que o polissacarídeo anteriormente conhecido como poli-N- succinil-β-(1—>-6)-glucosamina (PNSG) não tem a estrutura esperada, uma vez que a identificação de N-succinilação estava incorreta (Maira-Litran et 15 al., 2002). Portanto, o polissacarídeo formalmente conhecido como PNSG e agora conhecido como sendo PNAG é também abrangido pelo termo PIA.PIA (ou PNAG) pode ser de diferentes tamanhos, variando de mais de 400 kDa a entre 75 e 400 kDa a entre 10 e 75 kDa a oligossacarí- deos compostos de até 30 unidades de repetição 30 (de glucosamina β- . 20 (1-»6)-ligada substituída por constituintes de N-acetila e O-succinila). Qualquer tamanho de polissacarídeo ou olígossacarídeo de PIA pode ser usado em uma composição imunogênica da invenção. Em um aspecto, o polissacarídeo tem mais de 40 kDa. Dimensionamento pode ser obtido através de qualquer método conhecido no campo, por exemplo, por meio de microfluidi- 25 zação, irradiação ultrassónica ou através de clivagem química (documentos WO 03/53462, EP497524, EP497525). Em determinados aspectos, PIA (PNAG) tem pelo menos ou no máximo 40-400 kDa, 40-300 kDa, 50-350 kDa, 60-300 kDa, 50-250 kDa e 60-200 kDa.PIA (PNAG) pode ter diferentes graus de acetilação em virtude 30 de substituição sobre os grupos amino por acetato. PIA produzido in vitro é quase totalmente substituído sobre grupos amino (95- 100%). Alternativamente, um PIA desacetilado (PNAG) pode ser usado tendo menos de 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% de acetilação. Uso de um PIA desacetilado (PNAG) é preferido, uma vez que epítopos não acetilados de PNAG são eficientes na mediação de morte opsônica de bactérias Gram positivas, de preferência S. aureus e/ou S. epidermidis. Em determinados aspectos, o PIA 5 (PNAG) tem um tamanho entre 40 kDa e 300 kDa e é desacetilado de modo que menos de 60%, 50%, 40%, 30% ou 20% dos grupos amino sejam acetilados.
O termo PNAG desacetilado (dPNAG) refere-se a um polissaca- rídeo ou oligossacarídeo de PNAG no qual menos de 60%, 50%, 40%, 30%, 10 20% ou 10% dos grupos amino são acetilados. Em determinados aspectos,PNAG é desacetilado para formar dPNAG através de tratamento químico do . polissacarídeo nativo. Por exemplo, o PNAG nativo é tratado com uma solução básica, de modo que o pH se eleve para acima de 10. Por exemplo, o PNAG é tratado com NaOH, KOH ou NH4OH a 0,1-5 M, 0,2-4 M, 0,3-3 M, 15 0,5-2 M, 0,75-1,5 M ou 1 M. Tratamento é durante pelo menos 10 a 30 minutos ou 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20 horas em uma temperatura de 20-100, 2580, 30-60 ou 30-50 ou 35-45 °C. dPNAG pode ser composição conforme descrito no documento WO 04/43405.O(s) polissacarídeo(s) pode(m) ser conjugado(s) ou não conju- • 20 gado(s) a uma proteína veículo.
I. Polissacarídeos do Tipo 5 eTipo 8 de S. aureus
A maioria das cepas de S. aureus que causam infecção no homem contêm polissacarídeos do Tipo 5 ou do Tipo 8. Aproximadamente 60% das cepas humanas são do Tipo 8 e aproximadamente 30% são do Tipo 5.
As estruturas de antígenos de polissacarídeo capsular do Tipo 5 e do Tipo 8 são descritas em Moreau et al. (1990) e Fournier et al., (1984). Ambas têm FucNAcp em sua unidade de repetição, bem como ManNAcA, a qual pode ser usada para introduzir um grupo sulfidrila. As estruturas são: Tipo 5->4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1^4)-α-L-FucNAc(1->3)-β-D-FucNAc-(1^Tipo 8-^3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1—>3)-α-L-FucNAc(1—>3)-β-D-FucNAc-(1—> Recente (Jones, 2005) espectroscopia por NMR revisou as estruturas para: Tipo 5—>4)-β-D-ManNAcA-(1—>4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1—>3)-β-D-FucNAc-(1—> Tipo 85 ->3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1^3)-a-L-FucNAc(1^3)-a-D-FucNAc(1^Polissacarídeos podem ser extraídos da cepa apropriada de S. aureus usando métodos bem conhecidos por aqueles versados no campo, vide Patente U.S. 6.294.177. Por exemplo, ATCC 12902 é uma cepa de S. aureus do Tipo 5 e ATCC 12605 é uma cepa de S. aureus do Tipo 8.10 Polissacarídeos são de tamanho nativo ou podem, alternativamente, ser dimensionados, por exemplo, por meio de microfluidização, irradiação ultrassónica ou através de tratamento químico. A invenção também abrange oligossacarídeos derivados dos polissacarídeos dos tipos 5 e 8 de S. aureus. Os polissacarídeos dos tipos 5 e 8 incluídos na composição imu- 15 nogênica da invenção são, de preferência, conjugados a uma proteína veículo conforme descrito abaixo ou são, alternativamente, não conjugados. As composições imunogênicas da invenção contêm, alternativamente, polissa- carideo do tipo 5 ou do tipo 8. te .
J. Antígeno S. aureus 336
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende o antígeno S. aureus 336 descrito na Patente U.S. 6.294.177. O antígeno 336 compreende hexosamina β-ligada, não contém grupos O- acetila e se liga especificamente a anticorpos ao S. aureus Tipo 336 depositado sob ATCC 55804. Em uma modalidade, o antígeno 336 é um polissaca- 25 rídeo o qual é de tamanho nativo ou pode, alternativamente, ser dimensionado, por exemplo, através de microfluidização, irradiação ultrassónica ou por meio de tratamento químico. A invenção também abrange oligossacarí-deos derivados do antígeno 336. O antígeno 336 pode ser não conjugado ou conjugado a uma proteína veículo.
K. Polissacarídeos do Tipo I, II e III de S, epidermidis
Dentre os problemas associados ao uso de polissacarídeos em vacinação está o fato de que polissacarídeos são, per se, pobres imunogê- nios. É preferido que os polissacarídeos utilizados na invenção sejam ligados a uma proteína veículo a qual confere auxílio de células T espectadoras para aprimorar a imunogenicidade. Exemplos de tais veículos os quais podem ser conjugados a imunogênios de polissacarídeo incluem os toxoides 5 de Difteria e Tétano (DT, DT CRM197 e TT, respectivamente), hemocianina do caramujo Megathura crenulata (Keyhole Limpet Haemocyanin - KLH) e o derivado proteináceo purificado de Tuberculina (PPD), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer um dos acima. Fragmentos ade- 10 quados para uso incluem fragmentos que abrangem epítopos T-auxiliares. Em particular, o fragmento de proteína D de H. influenza estará, de preferência, contido no 1/3 N-terminal da proteína. Proteína D é uma proteína de ligação à IgD de Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1) e é um imuno- gênio potencial. Além disso, proteínas estafilocócicas podem ser usadas 15 como uma proteína veículo nos conjugados de polissacarídeo da invenção.
Uma proteína veículo que seria particularmente vantajosa de usar no contexto de uma vacina estafilocócica é alfa toxoide estafilocócíco. A forma nativa pode ser conjugada a um polissacarídeo, uma vez que o processo de conjugação reduz a toxicidade. De preferência,'alfa toxinas geneti- « 20 camente desintoxicadas, tais como as variantes His35Leu ou His35Arg, são usadas como veículos, uma vez que a toxicidade residual é menor. Alternativamente, a alfa toxina é quimicamente desintoxicada através de tratamento com um reagente de ligação cruzada, formaldeído ou glutaraldeído. Uma alfa toxina geneticamente desintoxicada é opcionalmente desintoxicada qui- 25 micamente, de preferência por meio de tratamento com um reagente de ligação cruzada, formaldeído ou glutaraldeído, para reduzir adicionalmente a toxicidade.
Os polissacarídeos podem ser ligados à(s) proteína(s) veículo através de qualquer método conhecido (por exemplo, aqueles métodos des- 30 critos nas Patentes U.S. 4.372.945, 4.474.757 e 4.356.170). De preferência, química de conjugação por CDAP é realizada (vide documento WO95/08348). Em CDAP, o reagente de cianilação tetrafluoroborato de 1- ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) é, de preferência, usado para a síntese de conjugados de polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode ser realizada sob condições relativamente suaves, as quais evitam a hidrólise dos polissacarídeos sensíveis a álcali. Essa síntese permite acoplamento 5 direto a uma proteína veículo.
Conjugação envolve, de preferência, produção de uma ligação direta entre a proteína veículo e um polissacarídeo. opcionalmente, um es- paçador (tal como dihidreto adípico (ADH)) pode ser introduzido entre a proteína veículo e o polissacarídeo.
IV, Resposta Imune e Ensaios
Conforme discutido acima, a invenção refere-se à estimulação ou indução de uma resposta imune em um indivíduo contra uma variante de SpA ou peptídeo de coagulase. Em uma modalidade, a resposta imune pode proteger contra ou tratar um indivíduo tendo, suspeito de ter ou em risco de 15 desenvolver uma infecção ou doença relacionada, particularmente aquelas relacionadas a estafilococos. Um uso das composições imunogênicas da invenção é prevenir infecções nosocomiais por meio de inoculação de um indivíduo antes que ele sofra procedimentos em um hospital ou outro ambiente tendo um risco aumentado de infecção.
A. Imunoensaíos
A presente invenção inclui a implementação de ensaios soroló- gicos para avaliar se e até que ponto uma resposta imune é induzida ou estimulada pelas composições da invenção. Existem muitos tipos de imunoen- saios que podem ser implementados. Imunoensaíos abrangidos pela presen- 25 te invenção incluem, mas não estão limitadas a, aqueles descritos na Patente U.S. 4.367.110 (ensaio em sanduíche de anticorpo monoclonal duplo) e Patente U.S. 4.452.901 (Western blot). Outros ensaios incluem imunoprecipi- tação de ligantes rotulados e imunocitoquímica, ambos in vitro e in vivo.
Imunoensaíos são, em geral, ensaios de ligação. Determinados 30 imunoensaíos preferidos são os vários tipos de ensaios imunoabsorventes enzima-ligados (ELISAs) e radioimunoensaios (RIA) conhecidos no campo. Detecção imunohistoquímica usando seções teciduais é também particular- mente útil. Em um exemplo, anticorpos ou antígenos são imobilizados sobre uma superfície selecionada, tal como uma cavidade em uma lâmina de microtitulação de poliestireno, tira de teste ou suporte de coluna. Então, uma composição de teste suspeita de conter o anticorpo ou antígeno desejado, 5 tal como uma amostra clínica, é adicionada às cavidades. Após ligação e lavagem para remover complexos imunes não especificamente ligados, o antígeno ou anticorpo ligado pode ser detectado. Detecção é, em geral, obtida mediante a adição de outro anticorpo específico para o antígeno ou anti-corpo desejado, que é ligado a um rótulo detectável. Esse tipo de ELISA é10 conhecido como um "ELISA em sanduíche". Detecção pode também ser obtida mediante a adição de um segundo anticorpo específico para o antígeno desejado, seguido pela adição de um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação pelo segundo anticorpo, com o terceiro anticorpo estando ligado a um rótulo detectável.15 ELISAS de competição são também possíveis implementaçõesnas quais amostras de teste competem pela ligação com quantidades conhecidas de antígenos ou anticorpos rotulados. A quantidade de espécies reativas na amostra desconhecida é determinada misturando-se a amostra com as espécies rotuladas conhecidas antes ou durante'incubação com ca-20 vidades revestidas. A presença de espécies reativas na amostra atua para reduzir a quantidade de espécies rotuladas disponíveis para ligação à cavidade e, assim, reduz o sinal final. A despeito do formato empregado, ELISAs têm determinadas características em comum, tais como revestimento, incubação ou ligação, lavagem para remover espécies não especificamente liga-25 das e detecção dos complexos imunes ligados.
Antígenos ou anticorpos podem também ser ligados a um suporte sólido, tal como na forma de lâminas, glóbulos, tiras de teste, membranas ou matriz de coluna e a amostra a ser analisada é aplicada ao antígeno ou anticorpo imobilizado. No revestimento de uma lâmina com antígeno ou anti- 30 corpo pode-se, em geral, incubar as cavidades da lâmina com uma solução do anticorpo ou antígeno, quer durante a noite ou durante um período especificado. As cavidades da lâmina serão, então, lavadas para remover materi- al incompletamente adsorvído. Quaisquer superfícies disponíveis restantes das cavidades são, então, "revestidas" com uma proteína não específica que é antigenicamente neutra com relação ao antissoro testado. Essas incluem albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin - BSA), caseína e soluções de leite em pó. O revestimento permite bloqueio de sítios de absorção não específicos sobre a superfície de imobilização e, assim, reduz a interferência causada pela ligação não específica de antíssoros sobre a superfície.
B. Diagnóstico de Infecção bacteriana
Além do uso de proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos, bem como anticorpos que se ligam a esses polipeptídeos, proteínas e/ou peptídeos, para tratar ou prevenir infecção conforme descrito acima, a presente invenção considera o uso desses polipeptídeos, proteínas e/ou anticorpos em uma variedade de formas, incluindo a detecção da presença de Estafilococos para diagnosticar uma infecção, seja em um paciente ou sobre equipamento médico, o qual pode também se tornar infectado. De acordo com a invenção, um método preferido de detecção da presença de infecções envolve as etapas de obtenção de uma amostra suspeita de estar infectada por uma ou mais espécies ou cepas de bactérias estafilocócicas, tal como uma amostra tomada de um indivíduo, por exemplo, de sangue, saliva, tecidos, osso, músculo, cartilagem ou pele. Após isolamento da amostra, ensaios diagnósticos utilizando os polipeptídeos, proteínas, peptídeos e/ou anticorpos da presente invenção podem ser realizados para detectar a presença de estafilococos e tais técnicas de ensaio para determinação de tal presença em uma amostra são bem conhecidas por aqueles versados no campo e incluem métodos tais como radioimunoensaio, análise por Western blotting e ensaios ELISA. Em geral, de acordo com a invenção, um método de diagnóstico de uma infecção é considerado, em que uma amostra suspeita de estar infectada por estafilococos tem o polipeptídeo, proteína, peptídeo, anticorpo ou anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção adicionado à mesma e estafilococos são indicados pela ligação de anticorpo aos polipeptídeos, proteínas e/ou peptídeos ou polipeptídeos, ligação de proteínas e/ou peptídeos aos anticorpos na amostra.
Consequentemente, anticorpos de acordo com a invenção podem ser usados para a prevenção de infecção por bactérias estafilocócicas (isto é, imunização passiva), para o tratamento de uma infecção em andamento ou para uso como ferramentas de pesquisa. O termo "anticorpos", conforme usado aqui, inclui anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, com cadeia única, biespecíficos, simianizados e humanizados e anticorpos primatizados, bem como fragmentos Fab, tais como aqueles fragmentos os quais mantêm a especificidade de ligação dos anticorpos, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab. Consequentemente, a invenção considera o uso de cadeias únicas, tais como as cadeias pesada e leve variáveis dos anticorpos. A geração de qualquer um desses tipos de anticorpos ou fragmentos de anticorpo é bem conhecida por aqueles versados no campo. Exemplos específicos da geração de um anticorpo a uma proteína bacteriana pode ser encontrada na Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 20030153022, a qual é incorporada aqui por referência na íntegra.
Qualquer um dos polipeptídeos, proteínas, peptídeos e/ou anticorpos descritos acima pode ser rotulado diretamente com um rótulo detec- tável para identificação e quantificação de bactérias estafilocócicas. Rótulos para uso em imunoensaíos são, em geral, conhecidos por aqueles versados no campo e incluem enzimas, radioisótopos e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas, incluindo partículas coloridas, tais como ouro coloidal ou glóbulos de látex. Imunoensaíos adequados incluem ensaios i- munoabsorventes enzima-ligados (ELISA).
C. Imunidade Protetora
Em algumas modalidades da invenção, composições proteiná- ceas conferem imunidade protetora a um indivíduo. Imunidade protetora refere-se à capacidade do corpo de montar uma resposta imune específica que protege o indivíduo contra o desenvolvimento de uma doença ou condição em particular que envolve o agente contra o qual há uma resposta imune. Uma quantidade imunogenicamente eficaz é capaz de conferir imunidade protetora ao indivíduo.
Conforme usado aqui no relatório descritivo e na seção reivindicações que segue, o termo polipeptídeo ou peptídeo refere-se a um trecho de aminoácidos covalentemente ligados existente via ligações peptídicas. Diferentes polipeptídeos têm diferentes funcionalidades de acordo com a presente invenção. Enquanto, de acordo com um aspecto, um polipeptídeo é derivado de um imunogênio projetado para induzir a uma resposta imune ativa em um recipiente, de acordo com outro aspecto da invenção, um polipeptídeo é derivado de um anticorpo o qual resulta da estimulação de uma resposta imune ativa, por exemplo, em um animal e a qual pode servir para induzir a uma resposta imune passiva no recipiente. Em ambos os casos, contudo, o polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo de acordo com qualquer possível uso de códon.
Conforme usado aqui, a frase "resposta imune" ou seu equivalente "resposta imunológica", refere-se ao desenvolvimento de urna resposta humoral (anticorpo-mediada), celular (mediada por células T antígeno- específicas ou seus produtos de secreção) ou humoral e celular dirigida contra uma proteína, peptídeo, carboidrato ou polipeptídeo da invenção em um paciente recipiente. Tal resposta pode ser uma resposta ativa induzida por administração de imunogênio ou uma resposta passiva induzida pela administração de anticorpo contendo material ou células T produzidas. Uma resposta imune celular é estimulada pela apresentação de epítopos polipeptídi- cos em associação com moléculas do MHC da Classe I ou Classe II para ativar células T auxiliares CD4 (+) e/ou células T citotóxicas CD8 (+) antígé- no-específicas. A resposta pode também envolver a ativação de monócitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrócitos, células microgliais, eosinófilos ou outros componentes de imunidade inata. Conforme usado aqui, "imunidade ativa" refere-se à qualquer imunidade conferida a um indivíduo mediante a administração de um antígeno.
Conforme usado aqui, "imunidade passiva" refere-se à qualquer imunidade conferida a um indivíduo sem administração de um antígeno ao indivíduo. "Imunidade passiva", portanto, inclui, mas não está limitada a, administração de efetuadores imunes ativados, incluindo mediadores célula- res ou mediadores de proteína (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou policlonais) de uma resposta imune. Uma composição de anticorpo monoclonal ou policlonal pode ser usada em imunização passiva para a prevenção ou tratamento de infecção por organismos que trazem o antígeno reconhecido pelo anticorpo. Uma composição de anticorpo pode incluir anticorpos que se ligam a uma variedade de antígenos que podem, por sua vez, estar associados a vários organismos. O componente anticorpo pode ser um antissoro policlonal. Em determinados aspectos, o anticorpo ou anticorpos são purificados por afinidade a partir de um animal ou segundo indivíduo que tenha sido estimulado com (um) antígeno(s). Alternativamente, uma mistura de anticorpos pode ser usada, a qual é uma mistura de anticorpos monoclonais e/ou policlonais aos antígenos presentes nos mesmos, relacionados ou diferentes micróbios ou organismos, tais como bactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas incluindo, mas não limitado a, bactérias estafilocócicas.
Imunidade passiva pode ser conferida a um paciente ou indivíduo por meio de administração, ao paciente, de imunoglobulinas (lg) e/ou outros fatores imunes obtidos de um doador ou outra fonte que não um paciente tendo imuno-reatividade conhecida. Em outros aspectos, uma composição antigênica da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo que, então, atua como uma fonte ou doador de globulina, produzida em resposta ao estímulo com a composição antigênica ("globulina hiperimune"), que contém anticorpos dirigidos contra Estafilococos ou outro organismo. Um indivíduo assim tratado doaria plasma do qual globulina hiperimune seria, então, obtida, via metodologia de fracionamento de plasma convencional e administrada a outro indivíduo de forma a conferir resistência contra ou tratar infecção estafilocócica. Globulinas hiperimunes de acordo com a invenção são particularmente úteis para indivíduos imunocomprometidos, para indivíduos que estão sofrendo procedimentos invasivos ou onde o tempo não permite que o indivíduo produza seus próprios anticorpos em resposta à vacinação. Vide Patentes U.S. 6.936.258, 6.770.278, 6.756.361, 5.548.066, 5.512.282, 4.338.298 e 4.748.018, cada uma das quais é incorporada aqui por referência na íntegra, para métodos exemplificativos e composições relacionadas à imunidade passiva.
Para fins do presente relatório descritivo e das reivindicações em anexo, os termos "epítopo" e "determinante antigênico" são usados permu- 5 tavelmente para referir-se a um local sobre um antígeno ao qual células B e/ou T respondem ou reconhecem. Epítopos de células B podem ser formados de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por duplicação terciária de uma proteína. Epítopos formados de aminoácidos contíguos são, tipicamente, retidos quando de exposição a solventes de 10 desnaturação, enquanto que epítopos formados por duplicação terciária são, tipicamente, perdidos quando de tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo inclui, tipicamente, pelo menos 3 e, mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos para determinação de conformação espacial de epítopos incluem, por exem- 15 pio, cristalografia de raios x e ressonância magnética nuclear bidimensional.
Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols (1996). Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples que mostra a capacidade de um anticorpo de bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. Células T reconhecem epítopos contíguos 20 de cerca de nove aminoácidos para células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para células CD4. Células T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação antígeno- dependente, conforme determinado por meio de incorporação de 3H-timidina por células T produzidas em resposta a um epítopo (Burke et al., 1994), por 25 morte antígeno-dependente (ensaio de linfócito T citotóxico, Tigges et al., 1996) ou através de secreção de citocina.
A presença de uma resposta imunológica célula-mediada pode ser determinada por meio de ensaios de proliferação (células T CD4 (+)) ou ensaios de CTL (Cytotoxic T Lymphocyte - linfócito T citotóxico). As contribu- 30 ições relativas de respostas humorais e celulares ao efeito protetor ou terapêutico de um imunogênio podem ser distinguidas isolando separadamente IgG e células T de um animal singeneico imunizado e medindo-se o efeito protetor ou terapêutico em um segundo indivíduo.
Conforme usado aqui e nas reivindicações, os termos "anticorpo" ou "imunoglobulina" são usados permutavelmente e referem-se à qualquer uma de várias classes de proteínas estruturalmente relacionadas que 5 funcionam como parte da resposta imune de um animal ou recipiente, proteínas as quais incluem IgG, IgD, IgE, IgA, IgM e proteínas relacionadas.
Sob condições fisiológicas normais, anticorpos são encontrados no plasma e outros fluidos corporais e na membrana de determinadas células e são produzidos por linfócitos do tipo denotado células B ou seu equiva- 10 lente funcional. Anticorpos da classe IgG são compostos de quatro cadeias polipeptídicas ligadas juntas por ligações de dissulfeto. As quatro cadeias de moléculas de IgG intactas são duas cadeias pesadas idênticas referidas como cadeias H e duas cadeias leves idênticas referidas como cadeias L.
De forma a produzir anticorpos policlonais, um hospedeiro, tal 15 como um coelho ou cabra, é imunizado com o antígeno ou fragmento anti- gênico, em geral com um adjuvante e, se necessário, acoplado a um veículo. Anticorpos ao antígeno são subsequentemente coletados do soro do hospedeiro. O anticorpo policlonal pode ser purificado por afinidade contra o antígeno, tornando-o monoespecífico.
Anticorpos monoclonais podem ser produzidos por meio de hipe-rimunização de um doador apropriado com o antígeno ou ex-vivo mediante o uso de culturas primárias de células esplénicas ou linhagens de célula derivadas do baço (Anavi, 1998; Huston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mer- naugh et alr, 1995).
Conforme usado aqui e nas reivindicações, a frase "uma porçãoimunológica de um anticorpo" inclui um fragmento Fab de um anticorpo, um fragmento Fv de um anticorpo, uma cadeia pesada de um anticorpo, uma cadeia leve de um anticorpo, um heterodímero consistindo em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo, um fragmento variável de uma 30 cadeia leve de um anticorpo, um fragmento variável de uma cadeia pesada de um anticorpo e uma variante de cadeia única de um anticorpo, a qual é também conhecida como scFv. Além disso, o termo inclui imunoglobulinas quiméricas as quais são os produtos de expressão de genes fundidos derivados de diferentes espécies, uma das espécies pode ser um ser humano, caso no qual uma imunoglobulina quimérica é dita como sendo humanizada. Tipicamente, uma porção imunológica de um anticorpo compete com o anticorpo intacto do qual ela foi derivada pela ligação específica a um antígeno.
Opcionalmente, um anticorpo ou, de preferência, uma porção imunológica de um anticorpo, pode ser quimicamente conjugado a ou expresso como uma proteína de fusão com outras proteínas. Para fins do presente relatório descritivo e as reivindicações em anexo, todas de tais proteínas de fusão são incluídas na definição de anticorpos ou uma porção imunológica de um anticorpo.
Conforme usado aqui, os termos "agente imunogênico" ou "imu- nogênio" ou "antígeno" são usados permutavelmente para descrever uma molécula capaz de indução de uma resposta imunológica contra si mesma quando de administração a um recipiente, quer isoladamente, em conjunto com um adjuvante ou apresentada sobre um veículo de visualização.
D. Métodos de Tratamento
Um método da presente invenção inclui tratamento de uma doença ou condição causada por um patógeno estafilocócico. Um polipeptídeo imunogênico da invenção pode ser fornecido para induzir a uma resposta imune em uma pessoa infectada com estafilococos ou que se suspeita ter sido exposta a estafilococos. Os métodos podem ser empregados com relação a indivíduos que tenham sido testados positivos para exposição a estafilococos ou que são considerados em risco de infecção baseado em possível exposição.
Em particular, a invenção abrange um método para tratamento de infecção estafilocócica. particularmente infecções nosocomiais adquiridas em hospital. As composições imunogênicas e vacinas da invenção são particularmente vantajosas para usar em casos de cirurgia eletiva. Tais pacientes saberão a data de cirurgia antecipadamente e poderiam ser inoculados antecipadamente. As composições imunogênicas e vacinas da invenção são também vantajosas de usar para inocular profissionais de saúde.
Em algumas modalidades, o tratamento é administrado na presença de adjuvantes ou veículos ou outros antígenos estafilocócicos. Além disso, em alguns exemplos, o tratamento compreende administração de outros agentes comumente usados contra infecção bacteriana, tais como um 5 ou mais antibióticos.
O uso de peptídeos para vacinação pode requerer, mas não ne-cessariamente, conjugação do peptídeo a uma proteína veículo imunogêni- ca, tal como antígeno na superfície de hepatite B, hemocianina do caramujo Megathura crenulata ou albumina de soro bovino. Métodos para realização 10 dessa conjugação são bem conhecidos no campo.VI, Vacina e Outras Composições Farmacêuticas e AdministraçãoE, Vacinas
A presente invenção inclui métodos para prevenção ou alívio de infecções estafilocócicas, particularmente infecções nosocomiais adquiridas 15 em hospital. Como tal, a invenção considera vacinas para uso em modalidades de imunização ativa e passiva. Composições imunogênicas, propostas como sendo adequadas para uso como uma vacina, podem ser preparadas a partir de polipeptídeo(s) de SpA imunogênico(s), tais como um domínio D variante de SpA ou coagulases imunogênicas. Em outras modalidades, SpA 20 ou coagulases podem ser usadas em combinação com outras proteínas de virulência secretadas, proteínas na superfície ou fragmentos imunogênicos das mesmas. Em determinados aspectos, o material antigênico é extensivamente submetido à diálise para remover moléculas de pequeno peso molecular indesejadas e/ou liofilizado para formulação mais prontamente em 25 um veículo desejado.
Outras opções para uma vacina baseada em proteína/peptídeo envolvem introdução de ácidos nucleicos que codificam o(s) antígeno(s) como vacinas de DNA. A esse respeito, relatos recentes descrevem a construção de vírus de vacina recombinante que expressam 10 epítopos de CTL 30 mínimos contíguos (Thomson, 1996) ou uma combinação de epítopos de células B, linfócitos T citotóxicos (Cytotoxic T-Lymphocyte - CTL) e T- auxiliares (T-helper - Th) de vários micróbios (An, 1997) e uso com sucesso de tais construtos para imunizar camundongos para produzir respostas imunes protetoras. Assim, há ampla evidência na literatura quanto à utilização com sucesso de peptídeos, células que apresentam antígeno (Antigen Presenting Cells - APCs) pulsadas com peptídeo e construtos que codificam5 peptídeo para produção eficiente in vivo de resposta imune protetora. O uso de sequências de ácido nucleico como vacinas é exemplificado nas Patentes U.S. 5.958.895 e 5.620.896.
A composição de vacinas que contêm sequência(s) polipeptídi- ca(s) ou peptídica(s) como ingredientes ativos é, em geral, bem entendidona técnica, conforme exemplificado pelas Patentes U.S. 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; e 4.578.770, todas as quais são incorporadas aqui por referência. Tipicamente, tais vacinas são preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em líquido antes de injeção tam-bém podem ser preparadas. A composição pode também ser emulsificada. O ingrediente imunogênico ativo é, muitas vezes, misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhante e combinações dos mesmos. Além disso, sedesejado, a vacina pode conter quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes de umedecimento ou emulsificação, agentes de tamponamen- to de pH ou adjuvantes que intensificam a eficácia das vacinas. Em modalidades específicas, vacinas são formuladas com uma combinação de substâncias, conforme descrito nas Patentes U.S. 6.793.923 e 6.733.754, asquais são incorporadas aqui por referência.
Vacinas podem ser convencionalmente administradas parente- ralmente, através de injeção, por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente. Formulações adicionais as quais são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações o-rais. Para supositórios, aglutinantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos: tais supositórios podem ser formados de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10%, de preferência cerca de 1% a cerca de 2%. Formulações orais incluem excipientes normalmente empregados tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Es- 5 sas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações com liberação sustentada ou pós e contêm cerca de 10% a cerca de 95% de ingrediente ativo, de preferência cerca de 25% a cerca de 70%.
Os polipeptídeos e construtos de DNA que codificam polipeptí- 10 deo podem ser formulados em uma vacina como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do peptídeo) e aqueles que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico ou ácidos orgânicos, tais como ácidos acético, oxálico, tartárico, mandéli- 15 co e semelhantes.
Tipicamente, vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal para ser tera- peuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo a capacidade dó sistema imune do 20 indivíduo de sintetizar anticorpos e o grau de proteção desejado, quantidades precisas de ingrediente ativo requeridas para administração dependem do julgamento do médico. Contudo, faixas de dosagem adequadas são da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação. Regimes adequados para administração inicial e reforços são também 25 variáveis, mas são exemplificados por uma administração inicial, seguido por subsequentes inoculações ou outras administrações.
A maneira de aplicação pode ser variada amplamente. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina é aplicável. Acredita-se que esses incluam aplicação oral dentro de uma base sólida 30 fisiologicamente aceitável ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, parenteralmente, através de injeção e semelhantes. A dosagem da vacina dependerá da via de administração e variará de acordo com o tamanho e saúde do indivíduo.
Em determinados casos, será desejável ter múltiplas administrações da vacina, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais administrações. As vacinações podem ser em intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 5 12 semanas, incluindo todas as faixas entre os mesmos. Reforços periódicosem intervalos de 1-5 anos serão desejáveis para manter níveis protetores dos anticorpos. O curso da imunização pode ser acompanhado por ensaios para anticorpos contra os antígenos, conforme descrito nas Patentes U.S. 3.791.932; 4.174.384 e 3.949.064.
1. Veículos
Uma determinada composição pode variar quanto a sua imuno- genicidade. Frequentemente, é necessário, portanto, reforçar o sistema imune do hospedeiro, conforme pode ser obtido acoplando-se um peptídeo ou polipeptídeo a um veículo. Veículos exemplificativos e preferidos são hemo- 15 cianina do caramujo Megathura crenulata (Keyhole Limpet Hemocyanin - KLH) e albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin - BSA). Outras albuminas, tais como ovalbumina, albumina de soro de camundongo ou albumina de soro de coelho, podem ser usadas também como veículos. Meios para conjugação de um polipeptídeo a uma proteína veícúlo são bem conhe- 20 eidos na técnica e incluem glutaraldeído, m-maleimidobenzoil-N-hidróxi- succinimida éster, carbodiimida e benzidina bis-biazotizada.
2. Adjuvantes
A imunogenicidade das composições de polipeptídeo ou peptídeo pode ser intensificada mediante o uso de estimuladores não específicos 25 da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes adequados incluem todos os compostos imunoestimulatórios aceitáveis, tais como cito- cinas, toxinas ou composições sintéticas. Uma série de adjuvantes pode ser usada para intensificar a resposta de um anticorpo contra um polipeptídeo variante de SPA ou coagulase ou qualquer outra proteína bacteriana ou 30 combinação considerada aqui. Adjuvantes podem (1) reter o antígeno no corpo para causar uma liberação lenta; (2) atrair células envolvidas em uma resposta imune para o local de administração; (3) induzir à proliferação ou ativação de células do sistema imune; ou (4) aprimorar a dispersão do antígeno por todo o corpo do indivíduo.
Adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, emulsões óleo- em-água, emulsões água-em-óleo, sais minerais, polinucleotídeos e subs- 5 tâncias naturais. Adjuvantes específicos que podem ser usados incluem IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, y-interferon, GMCSP, BCG, sais de alumínio, tal como hidróxido de alumínio ou outro composto de alumínio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídio A e monofosforil lipídio A (MPL). RIBI, o qual contém três componentes extraídos de bactérias, 10 MPL, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (Cell WallSkeleton - CWS) em uma emulsão a 2% de esqualenoTTween. Antígenos do MHC podem mesmo ser usados. Outros adjuvantes ou métodos são exemplificados nas Patentes U.S. 6.814.971, 5.084.269, 6.656.462, cada uma das quais é incorporada aqui por referência).
Vários métodos para obter efeito adjuvante para uma vacina incluem uso de agentes tais como hidróxido ou fosfato de alumínio (alume), comumente usado como uma solução a cerca de 0,05 a cerca de 0,1% em solução salina tamponada com fosfato, mistura com polímeros sintéticos de açúcares (Carbopol®) usados como uma solução a cercã de 0,25%, agrega- 20 ção da proteína na vacina por meio de tratamento térmico com temperaturas oscilando entre cerca de 70° a cerca de 101 °C durante um período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. Agregação através de reativação com anticorpos (Fab) tratados com pepsina à albumina; mistura com células bacterianas (por exemplo, C. parvurri), endotoxinas ou componentes de lipo-25 polissacarídeo de bactérias Gram-negativas; emulsão em veículos oleosos fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, monooleato de manídeo (Aracel A)); ou emulsão com uma solução a 20% de um perfluorocarboneto (Fluosol- DA®) usado como um substituto em bloco podem também ser empregados para produzir um efeito adjuvante.30 Exemplos de e adjuvantes frequentemente preferidos incluemadjuvante completo de Freund (um estimulador não específico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvante incompleto de Freund e hidróxido de alumínio.
Em alguns aspectos, é preferido que o adjuvante seja selecionado para ser um indutor preferencial de uma resposta do tipo Th1 ou Th2. Altos níveis de citocinas do tipo Th1 tendem a favorecer a indução de respostas imunes célula-mediadas a um antígeno fornecido, enquanto que altos níveis de citocinas do tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.
A distinção de respostas imunes do tipo Th1 e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo sustentará uma resposta imune a qual é descrita como sendo predominantemente Th1 ou predominantemente Th2. Contudo, muitas vezes é conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquilo descrito em clones de células T CD4+ de murinos por Mos- mann e Coffman (Mosmann e Coffman, 1989). Tradicionalmente, respostas do tipo Th1 estão associadas à produção das citocinas INF-y e IL-2 por linfó- citos T. Outras citocinas frequentemente associadas à indução de respostas imunes do tipo Th1 diretamente não são produzidas por células T, tal como IL-12. Em contraste, respostas do tipo Th2 estão associadas à secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10.
Além de adjuvantes, pode ser desejável co-administrar modificadores da resposta biológica (Biologic Response Modifiers - BRM) para intensificar as respostas imunes. Foi mostrado que BRMs super-regulam a imunidade de células T ou sub-regulam a atividade de células supressoras. Tais BRMs incluem, mas não estão limitados a, Cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); ou Ciclofosfamida (CYP; 300 mg/m2) em baixa dose (Johnson/Mead, NJ) e citocinas, tais como y-interferon, IL-2 ou IL-12 ou genes que codificam proteínas envolvidas em funções auxiliares imunes, tal como B-7.
F. Componentes e Porções Lipídicas
Em determinadas modalidades, a presente invenção refere-se a composições compreendendo um ou mais lipídios associados a um ácido nucleico ou um polipeptídeo/peptídeo. Um lipídio é uma substância que é insolúvel em água e extraível com um solvente orgânico. Outros compostos que não aqueles especificamente descritos aqui são entendidos por aqueles versados no campo como lipídios e são abrangidos pelas composições e métodos da presente invenção. Um componente lipídico e um não-lipídico podem ser presos um ao outro, quer covalente ou não covalenternente.
Um lipídio pode ser um lipídio que ocorre naturalmente ou um lipídio sintético. Contudo, um lipídio é, usualmente, uma substância biológica. Lipídios biológicos são bem conhecidos no campo e incluem, por exemplo, gorduras neutras, fosfolipídios, fosfoglicerídeos, esteróis, terpenos, lisolipí- dios, glicoesfingolipídios, glicolipídios, sulfatídeos, lipídios com ácidos graxos 10 éter- e éster-ligados e lipídios polimerizáveis e combinações dos mesmos.
Uma molécula de ácido nucleico ou um polipeptídeo/peptídeo, associado a um lipídio, pode ser disperso em uma solução contendo um lipídio, dissolvido com um lipídio, emulsificado com um lipídio, misturado com um lipídio, combinado com um lipídio, covalenternente ligado a um lipídio, 15 contido como uma suspensão em um lipídio ou de outro modo associado a um lipídio. Um lipídio ou composição associada de lipídio-poxvírus da presente invenção não está limitada a qualquer estrutura em particular. Por e-xemplo, ela pode também simplesmente estar interposta em uma solução, possivelmente formando agregados os quais não são de tamanho ou forma- 20 to uniforme. Em outro exemplo, elas podem estar presentes em uma estrutura com bicamada, como micelas ou com uma estrutura "em colapso". Em outro exemplo não limitativo, um complexo de Lipofectamine (Gibco BRL)- poxvírus ou Superfect (Qiagen)-poxvírus é também considerado.
Em determinadas modalidades, uma composição pode compre- 25 ender cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4% cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cercade 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cercade 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca30 de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cercade 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cercade 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cercade 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cercade 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cercade 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca5 de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cercade 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cercade 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cercade 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cercade 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca10 de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cercade 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cercade 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou qualquer faixa entre as mesmas, de um lipídio, tipo de lipídio ou componente não lipidico em particular, tal como um adjuvante, antígeno, peptídeo, polipeptídeo, açúcar, ácí- 15 do nucleico ou outro material divulgado aqui ou conforme será conhecido por aqueles versados no campo. Em um exemplo não limitativo, uma composição pode compreender cerca de 10% a cerca de 20% de lipídios neutros e cerca de 33% a cerca de 34% de um cerebrosídeo e cerca de 1 % de colesterol. Em outro exemplo não limitativo, um lipossoma pode compreender 20 cerca de 4% a cerca de 12% de terpenos, em que cerca de 1% da rnicela é especificamente licopeno, deixando cerca de 3% a cerca de 11% do lipossoma compreendendo outros terpenos; e cerca de 10% a cerca de 35% de fosfatidil colina e cerca de 1% de um componente não lipidico. Assim, considera-se que as composições da presente invenção podem compreender 25 qualquer um dos lipídios, tipos de lipídios ou outros componentes em qualquer combinação ou faixa percentual.
G. Terapia Combinada
As composições e métodos relacionados da presente invenção, particularmente administração de um fator de virulência secretado ou proteí- 30 na na superfície, incluindo um polipeptídeo ou peptídeo variante de SPA e/ou outros peptídeos ou proteínas bacterianas a um paciente/indivíduo, podem também ser usados em combinação com a administração de terapias tradicionais. Essas incluem, mas não estão limitadas a, administração de antibióticos, tais como estreptomicina, ciprofloxacina, doxiciclina, gentamici- na, cloranfenicol, trimethoprim, sulfametoxazola, ampicilina, tetraciclina ou várias combinações de antibióticos.
Em um aspecto, considera-se que um vacina e/ou terapia compolipeptídeo é usada em conjunto com tratamento antibacteriano. Alternativamente, a terapia pode preceder ou seguir o tratamento com outro agente em intervalos oscilando de minutos a semanas. Em modalidades onde os outros agentes e/ou proteínas ou polinucleotídeos são administrados sepa- 10 radamente, em geral, se deverá assegurar que um período de tempo significativo não tenha expirado entre o momento de cada distribuição, de modo que o agente e composição antigênica ainda sejam capazes de exercer, vantajosamente, um efeito combinado sobre o indivíduo. Em tais casos, considera-se que se pode administrar ambas as modalidades dentro de cerca 15 de 12-24 h uma da outra ou dentro de cerca de 6-12 h uma da outra. Em algumas situações, pode ser desejável prolongar o período de tempo para administração significativamente, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) tenham decorrido entre as respectivas administrações.20 Várias combinações podem ser empregadas, por exemplo, terapia com antibiótico é "A" e a molécula imunogênica fornecida como parte de um regime de terapia imune, tal como um antígeno, é "B":A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A25 B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
Administração das composições imunogênicas da presente invenção a um paciente/indivíduo seguirá protocolos gerais para a administração de tais compostos, levando-se em conta a toxicidade, se houver, da composição de SpA ou outras composições descritas aqui. Espera-se que 30 os ciclos de tratamento sejam repetidos conforme necessário. Considera-se também que várias terapias padrões, tal como hidratação, possam ser aplicadas em combinação com a terapia descrita.
H. Composições Farmacêuticas Gerais
Em algumas modalidades, composições farmacêuticas são ad-ministradas a um indivíduo. Diferentes aspectos da presente invenção envolvem administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo. Em algumas modalidades da presente invenção, antígenos estafilocócicos, membros da via Ess, incluindo polipeptídeos ou peptídeos da classe Esa ou Esx e/ou membros de substratos de sortase podem ser administrados ao paciente para proteger contra infecção por um ou mais patóge- nos estafilocócicos. Alternativamente, um vetor de expressão que codifica um ou mais de tais polipeptídeos ou peptídeos pode ser fornecido a um paciente como um tratamento preventivo. Adicionalmente, tais compostos podem ser administrados em combinação com um antibiótico ou um antibacte- riano. Tais composições serão, em geral, dissolvidas ou dispersas em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável.
Além dos compostos formulados para administração parenteral, tais como aqueles para injeção intravenosa ou intramuscular, outras fonnas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; cápsulas de liberação com o tempo; e qualquer outra forma atualmente utilizada, incluindo cremes, loções, lavagens bucais, inalantes e semelhantes.
Os compostos ativos da presente invenção podem ser formulados para administração parenteral, por exemplo, formulados para injeção através das vias intravenosa, intramuscular, subcutânea ou mesmo intraperitoneal. A composição de uma composição aquosa que contém um composto ou compostos que aumentam a expressão de uma molécula da classe I do MHC será conhecido por aqueles versados no campo à luz da presente divulgação, Tipicamente, tais composições podem ser preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para uso para preparar soluções ou suspensões quando da adição de um líquido antes de injeção podem também ser preparadas; e as composi-ções podem também ser emulsificadas.
Soluções dos compostos ativos como a base livre ou sais farma- cologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, tal como hidróxipropil celulose. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e 5 uso, esses composições contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.
As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propileno glicol aquoso; e pós estéreis para 10 o composição extemporâneo de soluções ou dispersões injetáveis estéreis.
Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida até o ponto em que ela seja facilmente injetável. Também, ela deverá ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos.
As composições proteináceas podem ser formuladas em umaforma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e os quais são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como ácido acético, oxálico, 20 tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por e- xemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico e bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.
O veículo pode também ser um solvente ou meio de dispersãocontendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso de um revestimento, tal como lecitina, mantendo o ta-manho de partícula requerido no caso de dispersões e através do uso de tensoativos. Prevenção da ação de microorganismos pode ser obtida por meio de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabe- nos, clorobutanol, fenol, ácido sórbíco, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida mediante o uso, nas composições, de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis são preparadas mediante incorporação dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Em geral, dispersões são preparadas por meio de incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril o qual contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a composição de soluções injetáveis estéreis, os métodos de composição preferidos são técnicas de secagem a vácuo e liofilização, as quais proporcionam um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente desejado adi-cional a partir de uma solução previamente filtrada estéril dos mesmos.
Administração das composições de acordo com a presente invenção será, tipicamente, através de qualquer via comum. Isso inclui, mas não está limitado a, administração oral, nasal ou bucal. Ãlternativamente, a administração pode ser através de injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal ou intravenosa. Em determinadas modalidades, uma composição de vacina pode ser inalada (por exemplo, Patente U.S. 6.651.655, a qual é especificamente incorporada por referência). Tais composições serão, normalmente, administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis que incluem veículos, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis. Conforme usado aqui, o termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem os quais são, dentro do escopo do julgamento médico, adequados para contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alergia ou outras complicações problemáticas excessivas comensuráveis com uma proporção benefí- cio/risco razoável.O termo "veiculo farmaceuticamente aceitável" significa um material, composição ou carreador farmaceuticamente aceitável, tal como um enchedor líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação, envolvido em transporte de um agente químico.
Para administração parenteral em uma solução aquosa, por e- 5 xemplo, a solução deverá ser adequadamente tamponada, se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A esse respeito, meios aquosos estéreis os quais podem ser empregados 10 serão conhecidos por aqueles versados no campo à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em solução de NaCI isotônica e adicionada a fluido de hipodermólise ou injetada no local de infusão proposto (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente, dependen- 15 do da condição do indivíduo. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o indivíduo em particular.
Uma quantidade eficaz de composição terapêutica ou profilática é determinada baseada no objetivo pretendido. O termo "dose unitária" ou 20 "dosagem" refere-se à unidades fisicamente distintas adequadas para uso em um indivíduo, cada unidade contendo urna quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas desejadas discutidas acima em associação com sua administração, isto é, a via e regime apropriados. A quantidade a ser administrada, de acordo com o número de trata- 25 mentos e dose unitária, depende da proteção desejada.
Quantidades precisas da composição também dependem do julgamento do médico e são peculiares a cada indivíduo. Fatores que afetam a dose incluem o estado físico e clínico do indivíduo, via de administração, objetivo pretendido do tratamento (alívio de sintomas versus cura) e potên- 30 cia, estabilidade e toxicidade da composição em particular.
Quando de formulação, soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal conforme seja profilática ou terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tal como o tipo de soluções injetáveis descrito acima.
I. Administração In Vitro, Ex Vivo ou In Vivo
Conforme usado aqui, o termo administração in vitro refere-se amanipulações realizadas sobre células removidas de ou fora de um indivíduo, incluindo, mas não limitado a, células em cultura. O termo administração ex vivo refere-se à células as quais tenham sido manipuladas in vitro e são subsequentemente administradas a um indivíduo. O termo administra- 10 ção in vivo inclui todas as manipulações realizadas dentro de um indivíduo.
Em determinados aspectos da presente invenção, as composições podem ser administradas in vitro, ex vivo ou in vivo. Em determinadas modalidades in vitro, linhagens de células de linfócitos B são incubadas com um vetor viral da presente invenção durante 24 a 48 horas ou com uma vari- 15 ante de SpA e/ou coagulase e/ou qualquer outra composição descrita aqui durante duas horas. As células transduzidas podem, então, ser usadas para análise in vitro ou, alternativamente, para administração ex vivo. As Patentes U.S. 4.690.915 e 5.199.942, ambas incorporadas aqui por referência, divulgam métodos para manipulação ex vivo de células sanguíneas mononuclea- 20 res e células de medula óssea para uso em aplicações terapêuticas.
J. Anticorpos e Imunização passiva
Outro aspecto da invenção é um método de composição de uma imunoglobulina para uso em prevenção ou tratamento de infecção estafilocócica compreendendo as etapas de imunização de um recipiente ou doador com 25 a vacina da invenção e isolamento de imunoglobulina do recipiente ou doador. Uma imunoglobulina preparada por meio desse método é um outro aspecto da invenção. Uma composição farmacêutica compreendendo a imunoglobulina da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável é um outro aspecto da invenção a qual poderia ser usada na fabricação de um medicamento para o 30 tratamento ou prevenção de doença estafilocócica. Um método para tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica compreendendo uma etapa de administração, a um paciente, de uma quantidade eficaz da composição farma- cêutica da invenção é um outro aspecto da invenção.
Inóculos para a produção de anticorpo policlonal são composições, tipicamente, dispersando a composição antigênica em um diluente fisi- ologicamente tolerável, tal como solução salina ou outros adjuvantes adequados para uso humano para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunoestimulatória de inoculo é administrada a um mamífero e o mamífero inoculado é, então, mantido durante um tempo suficiente para que a composição antigênica induza a anticorpos protetores.
Os anticorpos podem ser isolados até o ponto desejado por meio de técnicas bem conhecidas, tal como cromatografia por afinidade (Harlow e Lane, 1988). Anticorpos podem incluir composições de antissoro de urna variedade de animais comumente usados, por exemplo, cabras, primatas, burros, suínos, cavalos, porcos-da-índia, ratos ou o homem.
Uma imunoglobulina produzida de acordo com a presente invenção pode incluir anticorpos inteiros, fragmentos ou subfragmentos de anticorpo. Anticorpos podem ser imunoglobulinas inteiras de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE), anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade dupla por dois ou mais antígenos da invenção. Eles podem também ser fragmentos (por exemplo,' F(ab')2, Fab', Fab, Fv e semelhantes), incluindo fragmentos híbridos. Uma imunoglobulina também inclui proteínas naturais, sintéticas ou geneticamente manipuladas que atuam como um anticorpo por meio de ligação a antígenos específicos para formar um complexo.
Uma vacina da presente invenção pode ser administrada a um recipiente que, então, atua como uma fonte de imunoglobulina, produzida em resposta ao estímulo pela vacina específica. Um indivíduo assim tratado doaria plasma do qual globulina hiperimune seria obtida via metodologia de fracionamento de plasma convencional. A globulina hiperimune seria administrada a outro indivíduo de forma a conferir resistência contra ou tratar infecção estafilocócica. Globulinas hiperimunes da invenção são particularmente úteis para tratamento ou prevenção de doença estafilocócica em bebês, indivíduos imunocomprometidos ou onde tratamento é requerido e não há tempo para que o indivíduo produza anticorpos em resposta à vacinação.
Um aspecto adicional da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais (ou fragmentos dos mesmos; de preferência, de ser humano ou humanizados) reativos contra pelo menos dois constituintes da composição imunogênica da invenção, a qual poderia ser usada para tratar ou prevenir infecção por bactérias Gram positivas, de preferência estafilococos, mais preferivelmente S. aureus ou S. epidermidis. Tais composições farmacêuticas compreendem anticorpos monoclonais que podem ser imunoglobulinas inteiras de qualquer classe, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade por dois ou mais antígenos da invenção. Eles podem também ser fragmentos (por exemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fve semelhantes), incluindo fragmentos híbridos.
Métodos de produção de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Kohler e Milstein, 1975; Harlow e Lane, 1988). Alternativamente, fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos por meio de triagem de uma biblioteca de phage display adequada (Vaughan et al., 1998). Anticorpos monoclonais podem ser humanizados ou parcialmente humanizados através de métodos conhecidos.
VII. EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são fornecidos para fins de ilustração de várias modalidades da invenção e não se destinam a limitar a presente invenção de qualquer modo. Aqueles versados no campo apreciarão prontamente que a presente invenção é bem adaptada para atingir os objetivos e atingir as finalidades e vantagens mencionadas, bem como aqueles objetivos, finalidades e vantagens inerentes aqui. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos aqui, são atualmente representativos de modalidades preferidas, são exemplificativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Alterações nos mesmos e outros usos os quais são abrangidos dentro do espírito da invenção, conforme definido pelo escopo das reivindicações, ocorrerão para aqueles versados no campo.
EXEMPLO 1
VARIANTES DE PROTEÍNA A NÃO TOXIGÊNICOS COMO VACINAS DE SUBUNIDADE PARA PREVENIR INFECÇÕES POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Um modelo animal para infecção por S, aureus
Camundongos BALB/c foram infectados por meio de injeção in-travenosa com 1 □ 107 CFU do isolado clínico humano S. aureus Newman (Baba et al., 2007). Dentro de 6 horas após infecção, 99,999% dos estafilococos desapareceram da corrente sanguínea e foram distribuídos via a vas- culatura. Disseminação estafilocócica aos tecidos periféricos ocorreu rapidamente, uma vez que a carga bacteriana nos rins e outros tecidos de órgãos periféricos atingiu 1 □ 105 CFU g"1 dentro das primeiras três horas. A carga estafilocócica em tecidos renais aumentou em 1,5 log CFU dentro de vinte e quatro horas. Quarenta e oito horas após infecção, os camundongos desenvolveram abscessos disseminados em múltiplos órgãos, detectáveis por meio de microscopia luminosa de tecido renal seccionado fino, manchado com hematoxilina-eosina. O diâmetro inicial do abscesso era de 524 pM (□ 65 pM); lesões eram inicialmente marcadas por um influxo de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) e não traziam organização discernível de estafilococos, a maioria dos quais parecia residir dentro de PMNs. No dia 5 de infecção, os abscessos aumentaram de tamanho e envolviam uma população central de estafilococos, circundada por uma camada de material eosi- nofílico amorfo e um grande agrupamento de PMNs. Histopatologia revelou necrose massiva de PMNs em proximidade ao ninho estafilocócíco no centro das lesões por abscesso, bem como uma manta de fagócitos saudáveis. Uma borda de PMNs necróticos foi observada na periferia das lesões por abscesso, limitando material eosinofílico que separa o tecido renal saudável das lesões. Os abscessos eventualmente atingiram um diâmetro ,□ 1,524 pM no dia 15 ou 36. Em intervalos de tempo posteriores, a carga estafilocócica foi aumentada para 104-106 CFU g‘1 e lesões por abscesso crescentes migraram em direção à cápsula do órgão. Lesões periféricas estavam propensas à ruptura, desse modo, liberando material necrótico e estafilococos na cavidade peritonial ou no espaço retro-peritoneal. Esses eventos resultaram em bacteremia, bem como uma onda secundária de abscessos, eventualmente precipitando um resultado letal.
Para enumerar a carga estafilocócica em tecido renal, os animais foram sacrificados, seus rins excisados e homogenato tecidual disperso 5 sobre meio de ágar para formação de colônia. No dia 5 de infecção, uma média de 1 □ 106 CFU g-1 de tecido renal para S. aureus Newman foi observada. Para quantificar a formação de abscesso, os rins foram visualmente examinados e cada a órgão individual foi fornecido um escore de um ou zero. A soma final foi dividida pelo número total de rins para calcular o percen- 10 tual de abscessos na superfície (Tabela 3). Além disso, rins aleatoriamente escolhidos foram fixados em formalina, incrustados, seccionados finos e manchados com hematoxilina-eosina. Para cada rim, quatro seções sagitais em intervalos de 200 μM foram visualizados através de microscopia. Os números de lesões foram contados para cada seção e a média calculada para 15 quantificar o número de abscessos dentro dos rins. S. aureus Newman causou 4,364 ± 0,889 abscessos por rim e abscessos na superfície foram observados sobre 14 de 20 rins (70%) (Tabela 3).
Quando examinado através de microscopia por varredura eletrônica, S. aureus Newman estava localizado em trechos hermeticamente as- 20 sociados no centro dos abscessos. Estafilococos estavam contidos por uma pseudocápsula amorfa que separava as bactérias do agrupamento de leucócitos nos abscessos. Nenhuma célula imune foi observada nesses grupos centrais de estafilococos, contudo, células sanguíneas vermelhas ocasionais foram localizadas entre as bactérias. Populações bacterianas no centro do 25 abscesso, designadas colônias de abscesso estafilocócico (Staphylococcal Abscess Communities - SAC), pareciam homogêneas e revestidas por um material granular, elétron-denso. A cinética do aparecimento de lesões infecciosas e os atributos morfológicos de abscessos formados por S. aureus Newman eram similares àqueles observados após infecção de camundongo 30 com S. aureus USA300 (LAC), o clone de S. aureus resistente à meticilina (CA-MRSA) adquirido em comunidades epidêmicas atual nos Estados Unidos (Diep et al., 2006).
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Mutantes de Proteína A (SpA) de S. aureus são avirulentos e não podem formar abscessos.
Sortase A é uma transpeptidase que imobiliza dezenove proteínas na superfície no envoltório da cepa Newman de S. aureus (Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). Trabalho anterior identificou a sortase A como um fator de virulência em múltiplos sistemas de modelo animal, contudo, as contribuições dessa enzima e suas proteínas na superfície ancoradas para a formação ou persistência de abscessos ainda não tinha sido revelada (Jonsson et al., 2002; Weiss et al., 2004). Comparado com o parental do tipo silvestre (Baba et al., 2007), uma variante de srtA isogênica (ΔsrtA) falhou em formar lesões por abscesso quando de exame macroscópico ou histopatológico nos dias 2, 5 ou 15. Em camundongos infectados com o mutante strA, apenas 1 □ 104 CFU g'1 foi recuperado de tecido renal no dia 5 de infecção, a qual é uma redução de 2,046 log10 CFU g‘1 comparado com a cepa parental do tipo silvestre (P - 6,73 x 10'6). Um efeito similar foi observado para o mutante srtA da cepa MRSA USA300 (dados não mostrados). Microscopia por varredura eletrônica mostrou que mutantes srtA estavam altamente dispersos e frequentemente associados com leucócitos em tecido renal de outro modo saudável. No dia quinze após infecção, srtA foram eliminados dos tecidos renais, uma redução > 3,5 log10 CFU g'1 comparado com o tipo silvestre (Tabela 3). Assim, proteínas na superfície ancoradas em sortase A permitem a formação de lesões por abscesso e a persistência de bactérias em tecidos do hospedeiro, em que estafilococos se reproduzem como colônias incrustadas em uma matriz extracelular e protegidas dos leucócitos circundantes por uma pseudocápsula amorfa.
Sortase A ancora um grande espectro de proteínas com sinais de seleção ao motivo LPXTG ao envoltório da parede celular, desse modo, conferindo visualização em superfície de muitos fatores de virulência (Mazmanian et al., 2002). Para identificar proteínas na superfície requeridas para formação de abscesso estafilocócico, inserções na bursa aurealis foram introduzidas em sequências de codificação 5' de genes que codificam polipeptídeos com proteínas de motivo LPXTG (Bae et al., 2004) e essas mutações foram transduzidas em S. aureus Newman. Mutações no gene estrutural para Proteína A (spa) reduziu a carga estafilocócica em tecidos renais de camundongos infectados em 1,004 log10 (P = 0,0144). Quando analisados com relação a sua capacidade de formar abscessos em tecidos renais por meio de histopatologia, nós observamos que os mutantes spa eram incapazes de formar abscessos quando comparado com a cepa parental do tipo silvestre S. aureus Newman (S. aureus Newman do tipo silvestre 4,364 ± 0,889 abscessos por rim vs. o mutante spa isogênico com 0,375 ± 0,374 lesões; P = 0,0356).
Proteína A bloqueia respostas imunes inatas e adaptativas.
Estudos identificaram a Proteína A como um fator de virulência crítico durante a patogênese de infecções por S. aureus. Trabalho recente demonstrou que a Proteína A impede a fagocitose de estafilococos mediante ligação do componente Fc de imunoglobulina (Jensen 1958; Uhlén et al., 1984), ativa a agregação de plaquetas via o fator de von Willebrand (Hartleib et al., 2000), funciona como um superantígeno de células B por meio de captura da região F(ab)2 de IgM trazendo VH3 (Roben et al., 1995) e, através de sua ativação de TNFR1, pode iniciar a pneumonia estafilocócica (Gomez et al., 2004). Em virtude do fato de que a Proteína A captura imunoglobulina e mostra atributos tóxicos, a possibilidade de que essa molécula na superfície possa funcionar como uma vacina em seres humanos não tinha sido rigorosamente investigada. Os inventores demonstram, pela primeira vez, que variantes de Proteína A não são mais capazes de se ligar à imunoglobulinas, vWF e TNFR-1 são removidos de seu potencial toxigênico e são capazes de estimular respostas imunes humorais que protegem contra doença estafilocócica.
Base molecular de visualização na superfície e função de Proteína A.
A Proteína A é sintetizada como um precursor em citoplasma bacteriano e secretada via seu peptídeo sinalizador YSIRK na parede em cruz, isto é, no septo de divisão celular de estafilococos (figura 1A). (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Após clivagem do sinal de seleção LPXTG C-terminal, a Proteína A é ancorada em ligações em ponte cruzadas de pep- tidoglicanas bacterianas pela sortase A (Schneewind et al., 1995; Mazmani- an et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). A Proteína A é a proteína na superfície mais abundante de estafilococos; a molécula é expressa por vírtualmen- te todas as cepas de S. aureus (SaTd-Salim et al., 2003; Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008). Estafilococos, reconstituem 15-20% de sua parede celular por ciclo de divisão (Navarre e Schneewind 1999). Hidrolases de murino clivam as fitas de glicana e peptídeos na parede de peptidoglicanas, desse modo, liberando a Proteína A com seu tetrapeptídeo dissacarídico na parede celular C-terminal preso no meio extracelular (Ton-Que et al., 1999). Assim, por design fisiológico, a Proteína A está ancorada à parede celular e é visualizada sobre uma superfície bacteriana, mas também liberada em tecidos circundantes durante infecção do hospedeiro (Marraffini et al., 2006).
Proteína A captura imunoglobulinas sobre uma superfície bacteriana e essa atividade bioquímica permite escape estafilocócico de respostas imunes inatas do hospedeiro e adquiridas (Jensen 1958; Goodyear e Silverman 2004). De modo interessante, a região X da Proteína A (Guss et al., 1984), um domínio repetido que une os domínios de ligação à IgG ao sinal de seleção LPXTG/ancora na parede celular, é talvez a porção mais variável do genoma estafilocócico (Schneewind et al., 1992; SaTd-Salim et al., 2003). Cada um dos cinco domínios de ligação à imunoglobulina da Proteína A (SpA), formados de feixes de três hélices e designados E, D, A, B e C, exerce propriedades estruturais e funcionais similares (Sjõdahl 1977; Jansson et al., 1998). A solução e estrutura de cristal do domínio D foi resolvida com e sem os ligantes de Fc e VH3 (Fab), os quais se ligam à Proteína A de uma maneira não competitiva em sítios distintos (Graille et al., 2000).
No complexo da estrutura de cristal, o Fab interage com a hélice II e hélice III do domínio D via uma superfície composta de quatro β-fitas de região VH (Graille et al., 2000). O principal eixo da hélice II do domínio D está a aproximadamente 50° com relação à orientação das fitas e a porção inter-helicoidal do domínio D é mais proximal à fita C0. O sítio de interação sobre o Fab está remoto à região constante de cadeia leve e cadeia pesada de lg. A interação envolve os seguintes resíduos de domínio D: Asp-36 da hélice II, bem como Asp-37 e Gln-40 no loop entre a hélice II e a hélice III, além de vários outros resíduos com SpA-D (Graille et af., 2000). Ambas as superfícies de interação são compostas predominantemente de cadeias laterais polares, com três resíduos negativamente carregados sobre o domínio D 5 e dois resíduos positivamente carregados sobre o Fab 2A2 oculto pela interação, conferindo uma atração eletrostática global entre as duas moléculas. Das cinco interações polares identificadas entre Fab e o domínio D, três estão entre as cadeias laterais. Uma ligação em ponte salina é formada entre Arg-H19 e Asp-36 e duas ligações de hidrogênio são feitas entre Tyr-H59 e 10 Asp-37 e entre Asn-H82a e Ser-33. Em virtude de conservação de Asp-36 e Asp-37 em todos os cinco domínios de ligação à IgG da Proteína A, esses resíduos foram selecionados para mutagênese.
Os sítios SpA-D responsáveis pela ligação ao Fab são estruturalmente separados da superfície de domínio que media a ligação ao Fed. A 15 interação de Fcy com o domínio B envolve primariamente resíduos na hélice I com menor envolvimento da hélice II (Deisenhofer 1981; Gouda et al., 1992). Com exceção de Gln-32, um contato mínimo em ambos os complexos, nenhum dos resíduos que mediam a interação com Fcy está envolvido em ligação ao Fab. Para examinar a relação espacial entre esses diferentes 20 sítios de ligação à Ig, os domínios de SpA nesses complexos foram supe- rimpostos para construir um modelo de um complexo entre Fab, o domínio D de SpA e a molécula de Fcy. Nesse modelo ternário, Fab e Fcy formam um sanduíche em torno de faces opostas da hélice II sem evidência de estéreo- impedimento de qualquer interação. Essas descobertas ilustram como, a 25 despeito de seu pequeno tamanho (isto é, 56-61 aa), um domínio de SpA pode mostram simultaneamente ambas as atividades, explicando a evidência experimental de que as interações de Fab com um domínio individual são não competitivas. Resíduos para a interação entre SpA-D e Fcy são Gln-9 e Gln-10.
Em contraste, ocupação da porção Fc de IgG sobre o domínio Dbloqueia sua interação com vWF A1 e provavelmente também TNFR1 (0'Seaghdha et al., 2006). Mutações em resíduos essenciais para ligação à Fc de IgG (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131 e K35) são também requeridas para ligação a vWF A1 e TNFR1 (Cedergren et at., 1993; Gomez et al., 2006; 0'Seaghdha et al. 2006), enquanto que resíduos críticos para a interação com VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) não têm 5 impacto sobre as atividades de ligação de Fc de IgG, vWF A1 ou TNFR1 (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). A atividade de ligação de Fab à imunoglobulina da proteína A objetiva um subconjunto de células B que expressam IgM relacionada à família VH3 sobre sua superfície, isto é, essas moléculas funcionam como receptores de células B do tipo VH3 (Roben et 10 al., 1995). Quando de interação com SpA, essas células B proliferam rapidamente e, então, permitem apoptose, levando à deleção preferencial e prolongada de linfócitos B semelhantes aos inatos (isto é, células B da zona marginal e células B2 foliculares) (Goodyear e Silverman 2003; Goodyear e Silverman 2004). É importante notar que mais de 40% das células B em cir- 15 culação são objetivadas por uma interação de Proteína A e a família VH3 representa a maior família de receptores de células B humanas que confere respostas humorais contra patógenos (Goodyear e Silverman 2003; Goodyear e Silverman 2004). Assim, a Proteína A funciona analogamente aos superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), embora a última classe 20 de moléculas, por exemplo, SEB, TSST-1, TSST-2, forme complexos com o receptor de células T para estimular inapropriadamente respostas imunes do hospedeiro e, desse modo, precipitar aspectos característicos de infecções estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Juntas, essas descobertas documentam as contribuições da Proteína A no estabelecimen- 25 to de infecções estafilocócicas e em modulação de respostas imunes do hospedeiro.
Variante Não toxiqênico de Proteína A.
Os inventores desenvolveram uma variante não toxigênico de Proteína A estafilocócica e, com esse reagente em mãos, objetivaram pela 30 primeira vez medir a resposta imune de animais à imunização com Proteína A. Ainda, os inventores pesquisaram se imunização de animais com uma variante não toxigênica de Proteína A poderia gerar respostas imunes que . estimulam a imunidade protetora contra infecção estafilocócica.
Para alterar as atividades de ligação à Fc de IgG, vWF A1 e TN- FR1 da Proteína A, resíduos de glutamina (Q) 9 e 10 [a numeração aqui é derivada daquela estabelecida para o domínio D de SpA] foram modificados, 5 gerando substituições de lisina ou glicina para ambas as glutaminas, com a expectativa de que essas substituições eliminassem as ligações iônicas formadas entre a Proteína A do tipo silvestre e seus ligantes. O efeito adicionado das duas substituições de lisina pode ser que esses resíduos positivamente carregados instituem uma carga repelente para imunoglobulinas. Para 10 alterar a ligação de VH3 ao Fab de IgG, os inventores selecionaram os resí- . duos de aspartato (D) 36 e 37 de SpA-D, cada um dos quais é requerido para a associação de Proteína A com o receptor de células B. D36 e D37 foram ambos substituídos por alanina. As mutações Q9,10K e D36.37A foram . combinadas na molécula recombinante SpA-DQ9-ioK;D36,37A θ examinadas 15 com relação aos atributos de ligação da Proteína A.* Em resumo, uma sequência genômica de Proteína A (spa) de
Staphylococcus aureus N315 foi PCR amplificada com os iniciadores (GCTGCACATATGGCGCAACACGATGAAGCTCAAC [5‘iniciador] (SEQ ID NO: 35) e AGTGGATCCTTATGCTTTGTTAGCATCTGC [3' iniciador] (SEQ 20 ID NO: 36)), clonada no vetor pET15b (pYSJ1, códons 48-486) (Stranger- Jones, et al., 2006) e plasmídeo recombinante transformado em E. coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990). Um produto de proteína A derivado de pYSJ1 traz resíduos 36-265 de SpA fundidos à His tag N-terminal (MGSSH- HHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO: 37)). Após expressão induzível por 25 IPTG, SpA HiSβ-tagged SpA N-terminal foi purificada através de cromatografia por afinidade sobre resina Ni-NTA (Stranger-Jones et al., 2006). O domínio D de SpA (SpA-D) foi amplificado por PCR com um par de iniciadores específicos (AACATATGTTCAACAAAGATCAA.CAAAGC [5' iniciador] (SEQ ID NO: 38) e AAGGATCCAGATTCGTTTAATTTTTTAGC [31 iniciador] (SEQ 30 ID NO: 39)), subclonado no vetor pET15b (pHAN1, spa códons 212-261) e o plasmídeo recombinante transformado em E. coli BL21(DE3) para expressar e purificar a proteína His6-tagged N-terminal recombinante. Para gerar muta- ções na sequência de codificação de SpA-D, conjuntos de dois pares de iniciadores foram sintetizados (para substituições de D por A: CTTCATTCAA- AGTCTTAAAGCCGCCCCAAGCCAAAGCACTAAC [5' iniciador] (SEQ ID NO: 40) e GTTAGTGCTTTGGCTTGGGGCGGCTTTAAGACTTTGAATGA- 5 AG [3’ iniciador] (SEQ ID NO: 41); para substituições de Q por K CA-TATGTTCAACAAAGATAAAAAAAGCGCCTTCTATGAAATC [5* iniciador] (SEQ ID NO: 42) e GATTTCATAGAAGGCGCTTTTTTTATCTTTGTTGAA- CATATG [31 iniciador] (SEQ ID NO: 43); para substituições de Q por G CA- TATGTTCAACAAAGATGGAGGAAGCGCCTTCTATGAAATC [5* iniciador] 10 (SEQ ID NO: 44) e GATTTCATAGAAGGCGCTTCCTCCATCTTTGTTGAA-CATATG’ [3' iniciador] (SEQ ID NO: 45). Iniciadores foram usados para protocolos de mutagênese Quick-Change. Após mutagênese, as sequências de DNA foram confirmadas para cada uma das proteínas recombinantes: SpA, SpA-D e SpA-DQ9 IOG;D36,37A e SpA-DQ9,ioK;D36,37A. Todas as proteínas foram 15 purificadas a partir de lisatos de E. coli recombinante usando cromatografia em Ni-NTA e subsequentemente submetidas à diálise contra PBS e armazenadas a 4°C.Para medir a ligação de imunoglobulina à Proteína A e suas variantes, 200 μg de proteína purificada foram diluídos em um volume de 1 ml 20 usando tampão de coluna (Tris-HCI a 50 mM, NaCI a 150 mM, pH de 7,5) e, então, carregados sobre uma coluna de Ni-NTA pré-equilibrada (volume de leito de 1 ml). As colunas foram lavadas com 10 ml de tampão de coluna. 200 μg de IgG humana purificada foram diluídos em um volume total de 1 ml de tampão de coluna e, então, aplicados a cada uma das colunas carrega- 25 das com Proteína A e suas variantes. As colunas foram subsequentemente lavadas com 5 ml de tampão de lavagem (imidazol a 10 mM em tampão de coluna) e 5 ml de tampão de coluna. Amostras de proteína foram eluídas com 2 ml de tampão de eluição (imidazol a 500 mM em tampão de coluna), as frações coletadas e alíquotas submetidas à eletroforese em gel de SDS- 30 PAGE, seguido por coloração com Coomassie-Blue. Conforme mostrado na figura 1C, Proteína A do tipo silvestre (SpA) e seu SpA-domínio D retiveram ambos a imunoglobulina durante cromatografia. Em contraste, a variante SpA-Dqg.-ioKiDae.sTA não se liga à imunoglobulina.
Para quantificar a ligação de Proteína A e suas variantes à porção Fc de imunoglobulina e ao domínio VH3 de Fab, imunoglobulina G humana HRP conjugada [hlgG], a porção Fc de IgG humana [hFc] e a porção 5 F(ab)2 de IgG humana [hF(ab)2], bem como ensaios ELISA foram usados para quantificar a quantidade relativa de ligação à Proteína A e suas variantes. Os dados na figura 1D demonstram a ligação de SpA e SpA-D à hlgG e hFc, enquanto que SPA-DQ9IIQG;D36,37A θ SPA-DQ9,WK;D36,37A mostraram apenas atividades de ligação de base. SpA se ligou em quantidades similares à 10 hFc e hF(ab)2, contudo, a ligação de SpA-D à hF(ab)2 foi reduzida comparado com a SpA de comprimento total. Esse resultado sugere que a presença de múltiplos domínios de ligação à IgG podem aumentar cooperativamente a capacidade da Proteína A de se ligar ao receptor de células B. Quando comparado com o poder de ligação reduzido de SpA-D à hF(ab)2, das duas 15 variantes apenas SpA-DQ9,IOK;D36,37A mostrou uma redução significativa na capacidade de se ligar ao domínio VH3 de imunoglobulina. Para examinar os atributos toxigênicos de SpA-D e suas variantes, proteínas purificadas foram injetadas em camundongos, os quais foram sacrificados após 4 horas para remover seus baços. Tecido de órgão foi homogeneizado, material capsular 20 removido e células B manchadas com anticorpos CD 19 fluorescentes. Após análise por FACS para quantificar a abundancia de células B em tecidos esplénicos, foi observado que SpA-D causou uma queda de 5% na contagem de células B comparado com um controle "mock" (PBS) (figura 1E). Em contraste, SpA-Dqg -IOK;D36,37A não causa uma redução nas contagens de células 25 B, indicando que a molécula mutante tinha perdido seus atributos toxigênicos de estimulação de proliferação e morte de células B (figura 1E). Em resumo, substituições de aminoácido nos resíduos Q9, Q10, D36 e D37 de SpA-D eliminou a capacidade dos domínios de Proteína A de se ligar à imu- noglobulinas ou exercer funções toxigêniças em tecidos humanos e animais.
Variantes Não toxigêniças de Proteina A estimulam proteção por vacina.
Para testar se a Proteína A e suas variante spodem ou não funcionar como antígenos de vacina, SpA, SpA-D, SpA-DQ9t10K;D36,37A θ SpA- DQ9,IOK.D36,37A foram emulsificados com adjuvante completo ou incompleto de Freund e camundongos BALB/c de quatro semanas de idade imunizados no dia 1 e dia 11 com 50 μg de proteína purificada. Grupos de animais (n - 5) foram analisados quanto às respostas imunes humorais à imunização medi- 5 ante coleta de sangue dos animais antes (dia 0) e após o esquema de imunização (dia 21). A Tabela 4 indica que os camundongos imunizados geraram apenas uma resposta imune humoral modesta dirigida à Proteína A do tipo silvestre ou seu módulo SpA-D, enquanto que a quantidade de anticorpo estimulado após imunização com SPA-DQ9T10K;D36,37A OU SpA-DQ9,10K;D36,37A foi 10 aumentada quatro a cinco vezes. Após estímulo intravenoso com 1 * 107 CFU de S. aureus Newman, os animais foram sacrificados no dia 4, seus rins removidos e analisados com relação à carga estafilocócica (colocando o homogenato tecidual sobre lâminas de ágar e enumerando as unidades de formação de colônia, CFU) ou histopatologia. Conforme esperado, camun- 15 dongos "mock" (PBS) imunizados (n = 19) traziam 6,46 log10 (± 0,25) CFU em tecido renal e lesões infecciosas estavam organizadas em 3,7 (± 1.2) abscessos por órgão (n = 10)(Tabela 4). Imunização de animais com SpA levou a uma redução de 2,51 log-t0 CFU no dia 5 (P = 0,0003) com 2,1 (±1,2) abscessos por órgão. Os últimos dados indicam que não houve redução sig- 20 nificativa na formação de abscesso (P = 0,35). Imunização com SpA-D gerou resultados similares: uma redução de 2,03 log10 CFU no dia 5 (P = 0,0001) com 1,5 (± 0,8) abscessos por órgão (P = 0,15). Em contraste, imunização com SpA-DQ9,IOK;D36,37A ou SpA-DQ9i10G;D36i37A criou proteção aumentada, com redução de 3,07 Iog10e3,03 log10 CFU no dia 4, respectivamente (significân- 25 cia estatística de P<0,0001 para ambas as observações). Ainda, imunização com SPA-DQ9,1OK;D36,37A θ SPA-DQ9IIOG;D36,37A gerou proteção significativa contra formação de abscesso estafilocócico, com apenas 0,5 (± 0,4) e 0,8 (± 0,5) lesões infecciosas por órgão (P = 0,02 e P = 0,04) sendo identificadas. Assim, imunização com variantes não toxigênicas de Proteína A gera res- 30 postas imunes humorais aumentadas para Proteína A e confere imunidade protetora contra estímulo estafilocócico. Esses dados indicam que Proteína A é um candidato ideal para uma vacina humana que previne doença por S. aureus.
Esses resultados excitantes têm várias implicações para o design de uma vacina humana. Primeiro, a geração de mutações por substituição que afetam a capacidade de domínios de Proteína A de ligação à imu- 5 noglobulina, quer isoladamente ou em combinação de dois ou mais domínios, pode gerar variantes não toxigêniças adequadas para desenvolvimento de vacina. Parece, da mesma forma, que uma combinação de domínios de ligação à IgG mutantes que se assemelham intimamente à estrutura da Proteína A podem gerar respostas imunes humorais ainda melhores, conforme 10 é reportado aqui para o domínio D-SpA apenas. Ainda, um provável atributo de anticorpos específicos à Proteína A pode ser que a interação de sítios de ligação antigênica com a superfície microbiana pode neutralizar a capacidade dos estafilococos de capturar imunoglobulinas via sua porção Fc ou estimular o receptor de células B via atividades de ligação ao VH3.
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Proteção por Vacina em abscessos em murino, infecção letal em murinos e modelos de pneumonia em murinos.
Três modelos animais foram estabelecidos para o estudo de doença infecciosa por S. aureus. Esses modelos são usados aqui para examinar o nível de imunidade protetora conferida via a geração de anticorpos específicos à Proteína A.
MATERIAIS E MÉTODOS
Abscesso em Murino - Camundongos BALB/c (fêmeas de 24 dias de idade, 8-10 camundongos por grupo, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) são imunizados através de injeção intramuscular na perna traseira com proteína purificada (Chang et al., 2003; Schneewind et al., 1992). SpA purificada, SpA-D ou SPA-DQ9I1OK;D36,37A (50 pg de proteína) é administrada nos dias 0 (emulsificada a 1:1 com adjuvante completo de Freund) e 11 (emulsificada a 1:1 com adjuvante incompleto de Freund). Amostras de sangue são coletadas através de coleta de sangue retro-orbital nos dias 0, 11 e 20. O soro é examinado por meio de ELISA quanto às titulações de IgG para atividade específica de SpA-D e SPA-DQ9I1OK;D36,37A- Os animais imunizados são estimulados no dia 21 através de injeção retro-orbital de 100 μl de suspensão de S. aureus Newman ou S. aureus USA300 (1x10' cfu). Para isso, culturas noturnas de S. aureus Newman são diluídas a 1:100 em caldo de soja tríptico fresco e crescidas durante 3 h em 37°C. Estafilococos são centrifugados, lavadas duas vezes e diluídas em PBS para proporcionar uma Aeoo de 0,4 (1 x 108 cfu por ml). As diluições são verificadas experimentalmente colocando em lâminas de ágar e formando colônias. Os camundongos são anestesiados através de injeção intraperitoneal de 80-120 mg de cetamina e 3-6 mg de xilazina por quilograma de peso corporal e através de injeção retro-orbital. No dia 5 ou 15 após estímulo, os camundongos são sacrificados através de inalação de CO2 comprimido. Os rins são removidos e homogeneizados em Triton X-100 a 1%. As alíquotas são diluídas e colocadas em lâminas sobre meio de ágar para determinação em triplicate de CFU. Para histologia, tecido renal é incubado em temperatura ambiente em formalina a 10% durante 24 h. Os tecidos são incrustados em parafina, secciona- dos finos, manchados com hematoxilina/eosina e examinados por um microscópio.
Infecção Letal em Murinos - Camundongos BALB/c (fêmeas de 24 dias de idade, 8-10 camundongos por grupo, Charles River Laboratories, 5 Wilmington, MA) são imunizados através de injeção intramuscular na perna traseira com SpA purificada, SpA-D ou SPA-DQ9Í1OK;D36,37A (50 μg de proteína). A vacina é administrada nos dias 0 (emulsificada a 1:1 com adjuvante completo de Freund) e 11 (emulsificada a 1:1 com adjuvante incompleto de Freund). Amostras de sangue são coletadas por meio de coleta de sangue 10 retro-orbital nos dias 0, 11 e 20. O soro é examinado através de ELISA quanto às titulações de IgG com atividade de ligação específica à SpA-D e SPA-DQ9IIOK;D36,37A- OS animais imunizados são estimulados no dia 21 através de injeção retro-orbital de 100 Dl de suspensão de S. aureus Newman ou S. aureus USA300 (15 x 107 cfu) (34). Para isso, culturas noturnas de S.aureus Newman são diluídas a 1:100 em caldo de soja tríptico fresco e crescidas durante 3 h a 37°C. Estafilococos são centrifugados, lavados duas vezes, diluídos em PBS para proporcionar uma A600 de 0,4 (1 x 108cfu por ml) e concentrados. As diluições são verificadas experimentalmente colocando em lâminas de ágar e formando colônias. Os camundongos são anestesia- 20 dos através de injeção intraperitoneal de 80-120 mg de cetamina e 3-6 mg de xílazina por quilograma de peso corporal. Os animais imunizados são estimulados no dia 21 através de injeção intraperitoneal com 2 x 1010 cfu de S. aureus Newman ou 3-10 x 109 cfu de isolados clínicos de S. aureus. Os animais são monitorados durante 14 dias e a doença letal é registrada.
Modelo de Pneumonia em Murinos - Cepas de S. aureus Newman ou USA300 (LAC) são crescidas a 37°C em caldo de soja tríptico/ágar até uma OD6ΘO 0,5. Alíquotas de cultura de 50 ml são centrifugadas, lavadas em PBS e suspensas em 750 μl de PBS para estudos de mortalidade (3-4 x 108 CFU por volume de 30 μl) ou 1,250 μl de PBS (2 x 108 CFU por volume 30 de 30 μl) para experimentos de carga bacteriana e histopatologia (2, 3). Para infecção pulmonar, camundongos C57BL/6J de 7 semanas de idade (The Jackson Laboratory) são anestesiados antes de inoculação de 30 μl de sus- pensão de S. aureus na narina esquerda. Os animais são colocados na gaiola em uma posição de supino para recuperação e observados durante 14 dias. Para imunização ativa, camundongos de 4 semanas de idade recebem 20 μg de SpA-D ou SPA-DQ9I10K;D36,37A em CFA no dia 0 através da via i.m., 5 seguido por um reforço com 20 μg de SpA-D ou SPA-DQ9,10K;D36,37A em adjuvante incompleto de Freund (IFA) no dia 10. Os animais são estimulados com S. aureus no dia 21. O soro é coletado antes de imunização e no dia 20 para avaliar a produção de anticorpo específico. Para estudos de imunização passiva, camundongos de 7 semanas de idade recebem 100 μl de NRS(Normal Rabbit Serum - Soro Normal de Coelho) ou antissoro de coelho - SpA-D-específico via injeção i.p. 24 h antes de estímulo. Para avaliar a correlação patológica de pneumonia, os animais infectados são sacrificados via inalação forçada de CO2 antes de remoção de ambos os pulmões. O pulmão . direito é homogeneizado para enumeração da carga bacteriana pulmonar. O 15 pulmão esquerdo é colocado em formalina a 1% e incrustado em parafina, seccionado fino, manchado com hematoxilina-eosina e analisado por meio de microscopia.
Anticorpos de Coelho - 200 μg de SpA-D purificada ou SpA- DQ9,IOK;D36,37A são usados como um imunogênio para a produção de antisso- 20 ro de coelho. 200 μg de proteína são emulsificados com CFA para injeção no dia 0, seguido por injeções de reforço com 200 μg de proteína emulsificada com IFA nos dias 21 e 42. As titulações de anticorpo de coelho são determinadas por meio de ELISA. Anticorpos purificados são obtidos através de cromatografia por afinidade de soro de coelho sobre SpA-D ou SpA-DQ9JOK;D36,37A Sepharose. A concentração de anticorpos eluídos é medida pela absorbância a A2so θ titulações de anticorpo específicas são determinadas através de ELISA.
Imunização ativa com variantes de SpA-domínio D - Para determinar a eficácia da vacina, os animais são ativamente imunizados com SpA- 30 D purificada ou SpADQ9i10K; D36,37A- Como um controle, os animais são imunizados com adjuvante apenas. Titulações de anticorpo contra composições de proteína A são determinadas usando SpA-D ou SpA-DQ9iioK;D36,37A como antígenos; note que a variante SpA-DQ9iioK;D36,37A não pode se ligar à porção Fc ou Fab de IgG. Usando modelos de doença infecciosa descritos acima, qualquer redução na carga bacteriana (abscessos e pneumonia em muri- nos), evidência histopatológica de doença estafilocócica (abscessos e pneumonia em murinos) e proteção contra doença letal (estímulo letal e pneumonia em murinos) são medidas.
Imunização passiva com anticorpos policlonais de coelho purificados por afinidade gerados contra variantes de SpA-domínio D - Para determinar a imunidade protetora de anticorpos de coelho específicos para Proteína A, os camundongos são passivamente imunizados com 5 mg/kg de anticorpos de coelho derivados de SpA-D purificada ou SpA-DQ9i-ioK;D36,37A- Ambos esses composições de anticorpo são purificados através de croma- tografia por afinidade usando SpA-D ou SpA-DQ9,IOK;D36,37A imobilizada. Como um controle, os animais são passivamente imunizados com anticorpos rV10 (um antígeno protetor de placa que não tem impacto sobre as consequências sobre infecções estafilocócicas). As titulações de anticorpo contra todos os composições de Proteína A são determinadas usando SpA-DQ9i1oK; D36.37A como um antígeno, uma vez que essa variante não pode se ligar à porção Fc ou Fab de IgG. Usando os modelos de doença infecciosa descritos acima, a redução na carga bacteriana (abscessos e pneumonia em muri-nos), evidência histopatológica de doença estafilocócica (abscesso e pneumonia em murinos) e a proteção contra doença letal (estímulo letal e pneumonia em murinos) são medidas.
EXEMPLO 2
VACINA DE PROTEÍNAS NÃO TOXIGÊNIÇAS PARA INFECÇÃO POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE À METICILINAIsolados clínicos de S. aureus expressando proteína A (Shopsin et al., 1999, cujo produto traducional primário é compreendido de um peptídeo sinalizador N-terminal (DeDent et al., 2008), cinco Ig-BDs (designadas E, D, A, B e C) (Sjodahl, 1977), região X com repetições variáveis de um peptídeo de oito resíduos (Guss et al., 1984) e sinal de seleção C-terminal para a ancoragem na parede celular de SpA (Schneewind et al., 1992; Sch- neewind et al., 1995) (figura 1A-1B). Orientado por homologia de aminoácido (Uhlen et al., 1984), a estrutura de feixe α-helicoidal tripla de IgBDs (Deise- nhofer et al., 1978; Deisenhofer et al., 1981) e suas interações atômicas com VH3 de Fab (Graille et al., 2000) ou Fey (Gouda et al., 1998), glutamina 9 e 5 10 foram selecionados, bem como aspartato 36 e 37 como críticos para aassociação de SpA com anticorpos ou receptores de células B, respectivamente. Substituições Gln9Lys, GlnlOLys, Asp36Ala e Asp37Ala foram introduzidas no D domínio para gerar SPA-DKKAA (figura 1B). A capacidade de SpA-D ou SPA-DKKAA isolada de se ligar à IgG humana foi analisada por10 meio de cromatografia por afinidade (figura 1D). SpA-D rotulada com polihis- tídina, bem como SpA de comprimento total retiveram a IgG humana sobre Ni-NTA, enquanto que SPA-DKKAA θ um controle negativo (SrtA) não (figura 1C). Um resultado similar foi observado com fator de von Willebrand (Har- tleib et al., 2000) o qual, junto com receptor 1 de fator de necrose de tumor15 (TNFR1)(Gomez et al., 2004), pode também se ligar à proteína A via glutamina 9 e 10 (figura 1D). Imunoglobulina humana abrange 60-70% de IgG do tipo VH3. OS inventores distinguem entre domínio Fc e ativação de receptor de células B de Igs e mediram a associação de fragmentos Fcy e F(ab)2 humanos, ambos os quais se ligam à SpA de comprimento total ou SpA-D, mas20 não à SPA-DKKAA (figura 1D). Injeção de SpA-D na cavidade peritonial de camundongos resultou em expansão de células B, seguido por colapso a- poptótico de linfócitos CD19+ em tecido do baço de camundongos BALB/c (Goodyear e Silverman, 2003)(figura 1E). Atividade superantigênica de células B não foi observada após injeção com SÇA-DKKAA θ TUNEL-coloração de25 tecido esplénico falhou em detectar o aumento nas células apoptóticas que segue a injeção de SpA ou SpA-D (figura 1E).
Anticorpos contra SÇA-DKKAA protegem contra infecções MSSA e MRSA. Camundongos BALB/c "nâives" de seis semanas de idade foram injetados com 50pg cada de SpA purificada, SpA-D ou SPA-DKKAA emulsifica- 30 da em CFA e receberam um reforço com o mesmo antígeno emulsificado em IFA. Em concordância com a hipótese de que SpA-D promove o colapso a- poptótico de populações de células B clonais ativadas, os inventores obser- varam uma titulação de anticorpos específicos para SPA-DKKAA dez vezes maior após imunização de camundongos com a variante não toxigênica quando comparado com o superantígeno célula B (Spa-D vs. SPA-DKKAA P <0,0001, Tabela 5). As titulações de anticorpo estimuladas através de imunização com SpA de comprimento total eram maiores do que aquelas estimuladas por SpA-D (P = 0,0022), o qual provavelmente é em virtude do maior tamanho e estrutura de domínio interativa desse antígeno (Tabela 5). Todavia, ainda assim a SpA estimulou menores titulações de anticorpo do que SPA-DKKAA (P = 0,0003), a qual abrange apenas 50 aminoácidos da proteína A (520 resíduos, SEQ ID NO: 33). Camundongos imunizados foram estimulados através de inoculação intravenosa com S. aureus Newman e a capacidade dos estafilococos de causar abscessos em tecidos renais foi examinada por meio de necropsia quatro dias após estímulo. Em tecido renal homo-geneizado de camundongos "mock" imunizados (PBS/adjuvante), uma carga estafilocócica média de 6,46 log10 CFU g’1 foi enumerada (Tabela 5). Imunização de camundongos com SpA ou SpA-D levou a uma redução na carga estafilocócica, contudo, animais vacinados com SPA-DKKAA mostraram uma redução ainda maior de 3,07 log10 CFU g’1 de S. aureus Newman em tecidos renais (P <0,0001, Tabela 5). Formação de abscesso nós rins foi analisada por meio de histopatologia (figura 2). Animais "mock" imunizados traziam uma média de 3,7 (E11,2) abscessos por rim (Tabela 5). Vacinação com SpA- DKKAA reduziu o número médio de abscessos para 0,5 (D0,4) (P = 0,0204), enquanto que imunização com SpA ou SpA-D não causa uma redução significativa no número de lesões por abscesso (Tabela 5). Lesões em animais vacinados com SpA-DKKAA eram de menor tamanho, com menos PMNs infil- trantes e colônias de abscesso estafilocócico caracteristicamente ausentes (Cheng et al., 2009)(figura 2). Abscessos em animais que tinham sido imunizados com SpA ou SpA-D mostraram a mesma estrutura global de lesões em animais "mock" imunizados (figura 2).
Os inventores examinaram se imunização com SPA-DKKAA pode proteger os camundongos contra cepas MRSA e selecionaram o isolado USA300 LAC para estímulo animal (Diep et al., 2006). Essa cepa CA-MRSA altamente virulenta se dissemina rapidamente por todo os Estados Unidos, causando morbidade e mortalidade humanas significativas (Kennedy et al., 2008). Comparado com camundongos de controle com adjuvante, animais imunizados com SPA-DKKAA traziam uma redução de 1,07 log™ CFU g'1 na 5 carga bacteriana de tecidos renais infectados. Exame histopatológico de tecido renal após estímulo com S. aureus USA300 revelou que o número médio de abscessos foi reduzido de 4,04 (DO,8) para 1,6 (00,6) (P = 0,02774). Em contraste, imunização com SpA ou SpA-D não causa uma redução significativa na carga bacteriana ou formação de abscesso (Tabela 5).
Anticorpos SPA-DKKAA impedem interação de imunoglobulina-proteína A. Coelhos foram imunizados com SPA-DKKAA θ anticorpos específicos foram purificados sobre uma coluna de afinidade de SPA-DKKAA, seguido por SDS-PAGE (figura 3). IgG específica para SÇA-DKKAA foi clivada com pepsina para gerar fragmentos Fcy e F(ab)2, os últimos dos quais foram puri-15 ficados por meio de cromatografia sobre uma coluna de SPA-DKKAA (figura3). Ligação de IgG humana ou vWF à SpA ou SpA-D foi alterada por F(ab)2 SPA-DKKAA específicos, indicando que anticorpos derivados de SPA-DKKAA neutralizam a função superantigênica de células B da proteína A, bem como suas interações com lg (figura 3).20 SPAKKAA gera respostas imunes protetoras aprimoradas. Paraaprimorar adicionalmente as propriedades da vacina para proteína A não toxigênica, os inventores geraram SPAKKAA, a qual inclui todos os cinco IgBDs com quatro substituições de aminoácido - substituições correspondendo a GlnOLys, GlnlOLys, Asp36Ala e Asp37Ala do domínio D - em cada25 um de seus cinco domínios (E, D, A, B e C). SPAKKAA rotulada com polihisti- dina foi purificada por meio de cromatografia por afinidade e analisada através de SDS-PAGE manchado com Coomassie Blue (figura 4). Diferente da SpA de comprimento total, SPAKKAA não se liga à IgG, Fc e F(ab)2 humanos ou vWF (figura 4). SPAKKAA falhou em mostrar atividade superantigênica de30 células B, uma vez que injeção da variante em camundongos BALB/c não causa uma depleção de células B CD19+ em tecido esplénico (figura 4). Vacinação com SÇAKKAA gerou maiores de titulações de anticorpos específicos do que imunização com SÇA-DKKAA e conferiu proteção elevada aos camundongos contra estímulo com S. aureus USA300 (Tabela 5). Quatro dias após estímulo, animais vacinados com SPAKKAA traziam 3,54 log10 CFU g’1 menos estafilococos em tecidos renais (P = 0,0001) e também causou uma maior 5 redução no número de lesões por abscesso (P = 0,0109) (Tabela 5). Como um teste se vacinas de proteína A têm um impacto sobre outras cepas MR- SA, os camundongos foram estimulados com o isolado MRSA resistente à vancomicina Mu50 Japonês (Hiramatsu et al., 1997). Similar aos dados observados com o isolado MRSA USA300, animais vacinados com SPAKKAA 10 traziam menos estafilococos Mu50 em tecidos renais do que animais "mock" imunizados (P = 0,0248, figura 7).
Transferência passiva de anticorpos SpA-específicos previne doença estafilocócica. SPAKKAA foi usada para imunizar coelhos. Anticorpos de coelho específicos para SpA-DKKAA ou SPAKKAA foram purificados por afi- 15 nidade sobre matrizes com antígeno cognato imobilizado e injetados em uma concentração de 5 mg kg’1 de peso corporal na cavidade peritonial de camundongos BALB/c (Tabela 6). Vinte e quatro horas depois, titulações de anticorpos específicos foram determinadas no soro e os animais estimulados através de inoculação intravenosa com S. aureus Newman. Transferência 20 passiva reduziu a carga estafilocócica em tecidos renais para anticorpos específicos para SPA-DKKAA (P = 0,0016) ou SPAKKAA (P = 0,0005). Quando de exame histopatológico, ambos os anticorpos reduziram a abundancia de lesões por abscesso nos rins de camundongos estimulados com S. aureus Newman (Tabela 6). Juntos, esses dados revelam que proteção por vacina 25 após imunização com SÇA-DKKAA OU SÇAKKAA é conferida por anticorpos que neutralizam a proteína A.
Os inventores também tentaram determinar se anticorpos específicos à proteína A podem proteger animais contra estímulo letal. Camundongos BALB/c foram ativa ou passivamente imunizados para estimular an- 30 ticorpos contra SPAKKAA e, então, estimulados através de injeção intraperitoneal com doses letais de S. aureus Newman (figura 6). Anticorpos contra SPAKKAA, quer estimulados por imunização ativa (P = 0,0475, SÇAKKAA VS. mock) ou passiva (P = 0,0493, SPAKKAA VS. mock), conferiram proteção contra estímulo letal com S. aureus Newman (figura 6).
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Resposta imune à Proteína A aDós infecção estafilocócica ouimunização com SPAkka,lApós infecção com S. aureus virulento, os camundongos nãodesenvolvem imunidade protetora contra subsequente infecção com a mes-5 ma cepa (Burts et al., 2008) (figura 8). A abundancia média de lgG específica para Spa-dkkaa nesses animais foi determinada por dot blot como 0,20µg ml"' (80,04) e 0,'14 µg ml"' (1?0,01) para cepas Newman e USA300 LAC,respectivamente (figura 4)- A concentração minima de lgG específica paraproteína A requerida para proteção contra doença em animais vacinados10 com SPAkkaa ou SPA-Dkkaa (P " redução de 0,05 |og10 na CFU estafilocócica. g"i de tecido renal) foi calculada como 4,05 µg m|"1 (Zl 0,88). A concentraçãosérica média de lgG SpA-específica em voIuntários humanos adultos saudá-. veis (n = 16) foi de 0,21 µg rnl"' (r] 0,02). Assim, infecções por S. aureus emW camundongos ou seres humanos não estão associadas à respostas imunes15 que estimulam níveis significativos de anticorpos de neutralização dirigidos" contra proteína A, o que provavelmente é em virtude de atributos superantigênicos de células B dessa molécula. Em contraste, a concentração séricamédia de lgG específica para toxina de difteria em voluntários humanos,0,068 µg m|"1 (B 0,20), estava dentro da faixa para imunidade protetora con-20 tra difteria (Behring, 1890; Lagergard et al., 1992).lsolados clínicos de S. aureus expressam proteína A, um fatorde virulência essencial cuja atividade superantigênica de células B e atributos evasivos por eliminação opsonofagocítica são absolutamente requeridospara formação de abscesso estafilocócico (Palmqvist et al., 2005; Cheng et25 al., 2009; Silverman e Goodyear, 2006). Proteína A pode, assim, atuar comourna toxina essencial para patogênese, cujos atributos moleculares devemser neutralizados de forma a obter imunidade protetora. Mediante geraçãode variantes não toxígênicas incapazes de se ligar à lgs via domínios Fcy ouVH3-Fab, os inventores medem aqui, pela primeira vez, as respostas imunes30 de neutralização de proteína A como uma correlação para imunidade protetora contra infecção por S. aureus. Em contraste a muitas cepas sensíveis àmeticilina, o isolado CA-MRSA, USA300 LAC, é significativamente mais viru-lento (Cheng et al., 2009). Por exemplo, imunização de animais experimentais com a proteína na superfície lsd8 (Kuklin et al., 2006; Stranger-jones etal., 2006) estimula anticorpos que conferem proteção contra S. aureusNewman (Stranger-jones et al., 2009) mas não contra estímulo por USA300.
MATERIAL E MÉTODOS
Cepas bacterianas e crescimento. Cepas Newman e USA300 de Staphylococcus aureus foram crescidas em caldo de soja tríptico (Tryptic Soy Broth - TSB) a 37 °C. Cepas DH5α e BL21 (DE3) de Escherichia coli foram crescidas em caldo de Luria-Bertani (LB) com 100 μg ml'1 de ampicili- na a 37°C.
Anticorpos de Coelho. A sequência de codificação para SpA foi amplificada por PCR com dois iniciadores, gctgcacatatggcgcaacacgatga- agctcaac (SEQ ID NO: 35) e agtggatccttatgcttgagctttgttagcatctgc (SEQ ID NO: 36) usando DNA template de S. aureus Newman. SpA-D foi amplificada por PCR com dois iniciadores, aacatatgttcaacaaagatcaacaaagc (SEQ ID NO: 38) e aaggatccagattcgtttaattttttagc (SEQ ID NO: 39). A sequência para SpA- DKKAA sofreu mutação com dois conjuntos de iniciadores catatgttcaacaaaga- taaaaaaagcgccttctatgaaatc (SEQ ID NO: 42) e gatttcatagaaggcgctttttt- tatctttgttgaacatatg (SEQ ID NO: 43) para Q9K,Q10K, bem como cttcattcaa- agtcttaaagccgccccaagccaaagcactaac (SEQ ID NO: 40) e gt- tagtgctttggcttggggcggctttaagactttgaatgaag (SEQ ID NO: 41) para D36A,D37A. A sequência de SÇAKKAA foi sintetizada pela Integrated DNA Technologies, Inc. Produtos de PCR foram clonados no pET-15b, gerando proteína recombinante Hiss tagged N-terminal. Os plasmideos foram transformados em BL21(DE3). Culturas noturnas de transformantes foram diluídas a 1:100 em meio fresco e crescidas a 37°C até uma OD60ode 0,5, ponto no qual as culturas foram induzidas com β-D-1-tiogalatopiranosideo de iso- propila (IPTG) a 1 mM e crescidas durante mais três horas. Células bacterianas foram sedimentadas por meio de centrifugação, suspensas em tampão de coluna (Tris-HCI a 50 mM, pH de 7,5, NaCI a 150 mM) e rompidas em células em uma Prensa Francesa a 14.000 psi. Os lisatos foram limpos dos componentes insolúveis através de ultracentrifugação a 40.000 xg. Proteí- nas no lisato solúvel foram submetidas à cromatografia por afinidade com níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA, Qiagen). As proteínas foram eluídas em tampão de coluna contendo concentrações sucessivamente maiores de imidazol (100-500 mM). As concentrações de proteína foram determinadas 5 por meio de ensaio de ácido bicincônico (BCA) (Thermo Scientific). Para geração de anticorpo, coelhos (6 meses de idade, New-Zealand brancos, fêmeas, Charles River Laboratories) foram imunizados com 500 μg de proteína emulsificada em Adjuvante Completo de Freund (Difco) através de injeção subcapsular. Para imunizações de reforço, proteínas emulsificadas em 10 Adjuvante Incompleto de Freund e injetadas 24 ou 48 dias após a imunização inicial. No dia 60, o sangue dos coelhos foi coletado e o soro recuperado.
Isolamento de Anticorpo. Antígeno purificado (5 mg de proteína) foi covalentemente ligado à colunas HP NHS-ativadas HiTrap (GE Healthca- 15 re). Matriz antigênica foi usada para cromatografia por afinidade de 10-20 ml de soro de coelho a 4°C. A matriz carregada foi lavada com 50 volumes de coluna de PBS, os anticorpos eluídos com tampão de eluição (glicina a 1 M, pH de 2,5, NaCI a 0,5 M) e imediatamente neutralizados com Tris-HCI a 1M, pH de 8,5. Os anticorpos purificados foram submetidos à diálise durante a 20 noite contra PBS a 4°C.
Fragmentos F(ab)?. Anticorpos purificados por afinidade foram misturados com 3 mg de pepsina a 37 °C durante 30 minutos. A reação foi dissipada com Tris-HCI a 1 M, pH de 8,5 e fragmentos F(ab)2 foram purificados por afinidade com colunas HP NHS-ativadas HiTrap conjugadas a antí- 25 genos específicos. Anticorpos purificados foram submetidos à diálise durante a noite contra PBS a 4°C, carregados sobre um gel de SDS-PAGE e visualizados por coloração com Coomassie Blue.
Imunização ativa e passiva. Camundongos BALB/c (3 semanas de idade, fêmeas, Charles River Laboratories) foram imunizados com 50 μg 30 de proteína emulsificada em Adjuvante Completo de Freund (Difco) através de injeção intramuscular. Para imunizações de reforço, as proteínas foram emulsificadas em Adjuvante Incompleto de Freund e injetadas 11 dias após a imunização inicial. No dia 20 após imunização, o sangue de 5 camundongos foi coletado para obter soro para titulações de anticorpo específicos através de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA).
Camundongos BALB/c foram imunizados através de injeção in- 5 tramuscular e receberam um reforço com o mesmo antígeno em Alume após 11 e 25 dias. No dia 34, o sangue dos camundongos foi coletado para obter soro para titulações específicas de anticorpo. Anticorpos purificados por afinidade foram injetados na cavidade peritonial de camundongos BALB/c 24 horas ou 4 horas antes de estímulo subletal ou letal, respectivamente. O 10 sangue dos animais foi coletado via punção da veia peri-orbital e as titulações de anticorpo antígeno-específico no soro medidas por meio de ELISA.
Abscesso renal em camundongos. Culturas noturnas de S. aureus Newman ou USA300 (LAC) foram diluídas a 1:100 em TSB fresco e crescidas durante 2 horas a 37°C. Estafilococos foram sedimentados, lava- 15 dos e suspensos em PBS em uma OD6oo de 0,4 (~1 □ 108 CFU ml'1). Inócu- los foram quantificados dispersando alíquotas de amostra sobre TSA e enumerando as colônias formadas. Camundongos BALB/c (6 semanas de idade, fêmeas, Charles River Laboratories) foram anestesiados via injeção intraperitoneal com 100 mg/mf1 de cetamina e 20 mg/mL1 de xilazina por quilogra- 20 ma de peso corporal. Os camundongos foram infectados por meio de injeção retro-orbital com 1 □ 107 CFU de S. aureus Newman ou 5 □ 106 CFU de S. aureus USA300. No dia 4 após estímulo, os camundongos foram sacrificados por meio de inalação de CO2. Ambos os rins foram removidos e a carga estafilocócica em um órgão foi analisada homogeneizando o tecido renal 25 com PBS, Triton X-100 a 1%. Diluições seriais de homogenato foram dispersas sobre TSA e incubadas para formação de colônia. O órgão restante foi examinado através de histopatologia. Resumidamente, os rins foram fixados em formalina a 10% durante 24 horas em temperatura ambiente. Os tecidos foram incrustados em parafina, seccionados finos, manchados com hemato- 30 xilina-eosina e examinados por meio de microscopia luminosa para enumerar as lesões por abscesso. Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais do após revisão do protocolo experimental e aprovação pelo Institutional Biosafety Committee (IBC) e o Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Chicago.
Infecção de camundongos. Estafilococos foram usados para in- 5 fectar camundongos anestesiados através de injeção retro-orbital (1 x 107 CFU de S. aureus Newman, 5 x 106 CFU de S. aureus USA300 ou 3 x 107 CFU de S. aureus Mu50). Nos dias 4, 15 ou 30, os camundongos foram sacrificados, os rins removidos e tecido homogeneizado disperso sobre ágar para formação de colônia. Tecido de órgãos foi também seccionado fino, 10 manchado com hematoxilina-eosina e visualizado por um microscópio. Experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais após revisão do protocolo experimental e aprovação pelo Institutional Biosafety Committee (IBC) e o Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Chicago.Para experimentos de estímulo letal, camundongos BALB/c(grupos de 8-10 animais por experimento) foram injetados com uma suspensão de 2-6 x 108 CFU de S. aureus Newman ou sua variante de Δspa isogê- nica na cavidade peritonial. A sobrevida do animal foi monitorada durante um período de 15 dias e a significância estatística de dados de sobrevida anali- 20 sada com o teste " log-rank".
Ligação à Proteína A. Para ligação à IgG humana, colunas de afinidade Ni-NTA foram pré-carregadas com 200 μg de proteínas purificadas (SpA, SpA-D, SPA-DKKAA θ SrtA) em tampão de coluna. Após lavagem, 200 μg de IgG humana (Sigma) foram carregados sobre a coluna. Amostras de 25 proteína foram coletadas das lavagens e eluições e submetidas à eletroforese em gel de SDS-PAGE, seguido por coloração com Coomassie Blue. Proteínas purificadas (SpA, SPAKKAA, SpA-D e SPA-DKKAA) foram revestidas sobre lâminas para ELISA MaxiSorp (NUNC) em tampão de carbonato a 0,1 M (pH de 9,5) em uma concentração de 1 μg ml’1 durante a noite a 4°C. As lâ- 30 minas foram, em seguida, bloqueadas com leite integral a 5%, seguido por incubação com diluições seriais de IgG humana peroxidase-conjugada, fragmentos Fc ou F(ab)2 durante uma hora. As lâminas foram lavadas e re veladas usando reagentes para ELISA OptEIA (BD). As reações foram dissipadas com ácido fosfórico a 1 M e leituras de A450 foram usadas para calcular metade da titulação máxima e a ligação percentual.
Ensaios de ligação ao fator de von Willebrand (vWF). Proteínas 5 purificadas (SpA, SPAKKAA, SpA D e SPA-DKKAA) foram revestidas e bloqueadas conforme descrito acima. As lâminas foram incubadas com vWF humana em uma concentração de 1 μg ml'1 durante duas horas, então, lavadas e bloqueadas com IgG humana durante mais uma hora. Após lavagem, as lâminas foram incubadas com uma diluição serial de anticorpo peroxidase- 10 conjugado dirigido contra a vWF humana durante uma hora. As lâminas fo-ram lavadas e reveladas usando reagentes para ELISA OptEIA (BD). As reações foram dissipadas com ácido fosfórico a 1 M e leituras de A450 foram usadas para calcular metade da titulação máxima e a ligação percentual. Para ensaios de inibição, as lâminas foram incubadas com fragmentos 15 F(ab)2 purificados por afinidade específicos para SPA-DKKAA em uma concentração de 10 μg mT1 durante uma hora antes de ensaios de ligação a ligante.
Apoptose de esplenócitos. Proteínas purificadas por afinidade (150 μg de SpA, SpA-D, SPAKKAA e SPA-DKKAA) foram injetadas na cavidade peritonial de camundongos BALB/c (6 semanas de idade, fêmeas, Charles 20 River Laboratories). Quatro horas após injeção, os animais foram sacrificados através de inalação de CO2. Seus baços foram removidos e homogeneizados. Resíduos celulares foram removidos usando um raspador de células e as células suspensas foram transferidas para tampão de lise ACK (NH4CI a 0,15 M, KHCO3 a 10 mM, EDTA a 0,1 mM) para submeter as células san- 25 guineas vermelhas à lise. Células sanguíneas inteiras foram sedimentadas por meio de centrifugação, suspensas em PBS e manchadas com anticorpo monoclonal anti-CD10 conjugado a R-PE diluído a 1:250 (Invitrogen) sobre gelo e no escuro durante uma hora. As células foram lavadas com FBS a 1% e fixadas com formalina a 4% durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as cé- 30 lulas foram diluídas em PBS e analisadas por meio de citometria de fluxo. O órgão restante foi examinado através de hístopatologia. Resumidamente, os baços forma fixados em formalina a 10% durante 24 horas em temperatura ambiente. Os tecidos foram incrustados em parafina, seccionados finos, manchados com o kit de detecção de Apoptose (Millipore) e examinados por meio de microscopia luminosa.
Quantificação de anticorpo. Soro foi coletado de voluntários humanos saudáveis ou camundongos BALB/c que tinham sido infectados com S. aureus Newman ou USA300 durante 30 dias ou que tinham sido imunizados com SPA-DKKAA/ SPAKKAA, conforme descrito acima. IgG humana/de camundongo (Jackson Immunology Laboratory), SPAKKAA θ CRMi97 foram colocadas sobre uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite integral a 5%, seguido por incubação com soro humano ou de camundongo. IgG anti-humana/camundongo purificada por afinidade conjugada a IRDye 700DX (Rockland) foi usada para quantificar as intensidades de sinal usando o sistema de formação de imagem por infravermelho Odyssey™ (Li-cor). Experimentos com sangue de voluntários humanos envolviam protocolos que foram revistos, aprovados e realizados sob supervisão regulatória do The University of Chicago's Institutional Review Board (IRB).
Análise estatística, t testes de Student duplamente configurados foram realizados para analisar a significância estatísticá de abscessos renais, ELISA e dados do superantígeno célula B. Dados de sobrevida animal foram analisados com o teste "log-rank" (Prism).
EXEMPLO 3
COAGULASES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS CONTRIBUEM PARA A FORMAÇÃO DE ABSCESSOS E FUNCIONAM COMO ANTÍGENOS PRO-TETORES
Todos os isolados clínicos de S. aureus mostram atividade de coagulase - a coagulação de sangue ou plasma através de ativação não pro- teolitica de pró-trombina para clivar fibrinogênio. Os inventores identificaram pró-trombina, fibrinogênio, coagulase (Coa) e proteína de ligação ao fator de von Willebrand (vWbp) em lesões por abscesso estafilocócicos de camundongos infectados. Coa e vWbp secretadas contribuem ambos para a atividade de coagulase de S. aureus Newman, desse modo, permitindo a forma- ção de abscesso, bem como doença letal em camundongos. Anticorpos estimulados contra Coa ou vWbp purificada bloqueiam especificamente a associação do polipeptídeo correspondente com pró-trombina e fibrinogênio. Anticorpos específicos para Coa e vWbp, quer estimulados através de imu- 5 nização ativa ou passiva, impediram a formação de abscesso e mortalidade de camundongos infectados com estafilococos.
Resultados
Localização de coagulase e fatores de coagulação em abscessos estafilocócicos. Trabalho anterior estabeleceu o modelo de abscesso 10 renal em camundongos, pelo que 1 □ 107 CFU do isolado clínico humano S.aureus Newman (Baba et al., 2007) são injetados na corrente sanguínea de camundongos BALB/c (Albus et al., 1991). Quarenta e oito horas após infecção, os camundongos desenvolvem abscessos disseminados em múltiplos órgãos, detectáveis por meio de microscopia luminosa de tecido renal sec- 15 cionado fino, manchado com hematoxílina-eosina inicialmente como um acúmulo de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) com poucas bactérias (Cheng et al., 2009). Em torno do dia 5 de infecção, os abscessos aumentam de tamanho e envolvem uma população central de estafilococos (colônia de abscessos estafilocócicos - Staphylococcal Abscess Community - SAC), 20 envolvida por uma camada de material eosinofílico, amorfo (a pseudocápsu-la) e um grande agrupamento de PMNs (Cheng et al., 2009). Histopatologia revela necrose massiva de PMNs em proximidade ao ninho estafilocócico no centro das lesões por abscesso, bem como uma manta de fagócitos saudáveis. Em intervalos de tempo posteriores, os SACs aumentam e os absces- 25 sos rompem, liberando material necrótico e estafilococos na corrente sanguínea. Um novo ciclo de formação de abscesso é iniciado, eventualmente precipitando uma consequência letal de infecções (Cheng et al., 2009).
Para localizar coagulases em lesões por abscesso, os rins dos camundongos que tinham sido infectados durante 5 dias com S. aureus 30 Newman foram seccionados finos e manchados através de imunohistoquí- mica com anticorpos de coelho específicos para Coa ou vWbp purificados por afinidade (figura 10). Os inventores observaram coloração intensa de
Coa na pseudocápsula que envolve os SACs e na periferia de lesões por abscesso, isto é, a cápsula de fibrina que delimita o tecido não infectado. Coloração de vWbp ocorreu por todas as lesões por abscessos, mas também com acúmulo na periferia. Anticorpos específicos para pró-trombina 5 revelaram coloração do zimogênio na pseudocápsula e na periferia, enquanto que coloração específica para fibrinogênio/fibrina ocorreu por todas as lesões por abscesso. Juntos, esses dados indicam que a pseudocápsula eosinofílica de abscessos estafilocócicos traz pró-trombina e fibrinogênio, os quais se co-localizam com Coa. Na periferia de lesões por abscesso, Coa, 10 vWbp, pró-trombina e fibrinogênio/fibrina estão co-localizados. Essas observações levaram à investigação adicional se Coa e vWbp são contribuintes cruciais para o estabelecimento de abscessos ao disparar conversão pró- trombina mediada de fibrinogênio em fibrina.
Coa e vWbp de Staphylococcus aureus contribuem para a coa- 15 gulação sanguínea de camundongos. Os genes coa e/ou vWbp sobre o cromossomo de S. aureus Newman foram deletados por meio de substituição alélica usando a tecnologia pKOR1 (Bae e Schneewind, 2005). Dois plasmídeos de complementação, pcoa e pvl/l/bp, foram gerados através de clonagem dos genes estruturais coa ou vWbp, bem corno suas sequências 20 promotoras a montante no pOS1 (Schneewind et al., 1993). Os plasmídeos foram eletroporados em estafilococos e sua replicação continuou selecionada sobre meio suplementado com cloranfenicol (Schneewind et al., 1992). Quando hibridizados para coagulases com anticorpos específicos, os inventores observaram secreção de Coa pela cepa do tipo silvestre, bem como 25 ΔvWbp, mas não as variantes Δcoa ou Δcoa/ΔvWbp (figura 11). O defeito fenotípico dos mutantes Δcoa e Δcoa/ΔvW0p foi restaurado através de ele- troporação com pcoa, mas não pvWbp (figura 11). Similarmente, secreção de vWbp foi observada em culturas de S. aureus Newman (tipo silvestre), bem como do mutante Δcoa, mas não nas variantes ΔvWbp ou Δcoat ΔvWbp 30 (figura 11). Esse defeito foi restaurado através de eletroporação com pvWõp, mas não pcoa.
Coagulação sanguínea é eficazmente inibida pela hirudina (lepi- rudina) (Harvey et al., 1986), um peptídeo de 65 resíduos de lesma que forma um complexo a 1:1 com a trombina, desse modo, bloqueando a conversão proteolítica de fibrinogênio em fibrina (Markwardt, 1955). Inoculação de sangue fresco de camundongo tratado com lepirudina com S. aureus New- 5 man disparou a coagulação em menos de 12 horas, enquanto que sangue "mock" infectado permaneceu sem coágulos durante mais de 48 horas (figura 11C). Usando esse ensaio, foi observado que variantes estafilocócicas carecendo de atividade de coagulase mostram retardos no tempo de coagulação, 36 horas para Δcoa e 24 horas para ΔvWbp (figura 11C). O mutante 10 duplo, Δcoa/ΔvWbp, foi incapaz de coagular o sangue dos camundongos.
Esses defeitos foram complementados através de eletroporação com plas- mídeos pvWbp, bem como pcoa. Tomados juntos, esses dados indicam que duas coagulases, Coa e vWbp, contribuem para a capacidade do S. aureus Newman de coagular o sangue de camundongo (figura 11C).
Coa e vWbp são requeridas para sobrevivência estafilocócica nosangue, formação de abscesso e bacteremia letal em camundongos. Para analisar as contribuições para a virulência de coagulases, os inventores primeiro examinaram a sobrevivência estafilocócica em sangue tratado com lepirudina. A cepa S. aureus Newman do tipo silvestre não foi eliminada do 20 sangue dos camundongos, contudo, variantes isogênicas carecendo de Coa, isto é, Δcoa e Δcoa/ΔvWbp mostraram, cada uma, uma redução significativa na CFU após incubação de 30 min. Esse defeito na sobrevivência foi restaurado por coa, mas não por pvWbp, sugerindo que apenas Coa é requerida para sobrevivência estafilocócica no sangue de camundongos.
Bacteremia estafilocócica é uma causa frequente de mortalidadehumana em ambientes hospitalares (Klevens et al., 2007). Os inventores acreditam ter determinado se coagulases são requeridas para estímulo letal de camundongos BALB/c após injeção intravenosa de 1 x 108 CFU de S. aureus Newman. Todos os animais infectados com a cepa Newman parental 30 do tipo silvestre sucumbiram à infecção dentro de 24 horas (figura 12B). Animais infectados com mutantes simples, Δcoa ou Δvi/l/bp mostraram, cada um, um breve retardo, mas estatisticamente significativo, no tempo até a morte (figura 12B). A cepa mutante dupla teve um impacto significativamente maior do que mutantes com deleções únicas e animais infectados com a cepa Δcoa/ΔvWbp mostraram a maior redução na virulência comparado com o tipo silvestre (figura 12B).
Os inventores analisaram, em seguida, a formação de abscessoem tecidos renais de camundongos infectados e observaram que variantes de Δcoa tinham sua capacidade prejudicada de formar abscessos nos dias 5 e 15 de infecção (Tabela 7, figura 12G, 121)). O mutante ΔvWbp continuou a formar abscessos, embora a carga bacteriana, o tamanho global de colônias 10 de abscessos estafilocócicos e a quantidade de infiltrados de células imunes fossem reduzidos nessas variantes (Tabela 7, figura 12D, 12F)). Mutantes em coagulase têm a virulência ligeiramente mais atenuadas do que aqueles em vWbp, assim como Δcoa tem menor formação de abscesso e carga bac-teriana em torno do dia 15. Contudo, os mutantes duplos Δcoa / ΔvWbp ti- 15 nham capacidade acentuadamente reduzida de formar abscessos e persistiam em tecidos infectados (Tabela 7, figura 12H, 12K)). Assim, coagulase e proteína de ligação ao fator de von Willebrand são importantes para sobrevivência estafilocócica no hospedeiro, quer na corrente sanguínea ou em tecidos de órgãos terminais.
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Anticorpos contra coagulases e seu efeito sobre a coagulação sanguínea induzidos durante infecção estafilocócica. His6-Coa e His6-vWbp recombinante foram purificadas através de cromatografia por afinidade sobre Ni-NTA (FIG. 13A), emulsificadas em adjuvante e injetadas em coelhos para estimular anticorpos específicos que foram purificados sobre matrizes de afinidade trazendo proteína recombinante. Anticorpos dirigidos contra Coa se ligam preferencialmente à Coa, não vWbp (FIG. 13B). A recíproca era verdadeira para anticorpos dirigidos contra vWbp (FIG. 13B). Quando adicionadas ao sangue de camundongos tratados com lepirudina infectados com S. aureus Newman, os inventores observaram que anticorpos dirigidos contra Coa, vWbp ou Coa e vWbp bloqueiam, cada um, a coagulação san-guínea (FIG. 13C). Como controles, amostras "mock" tratadas ou tratadas com injeção de anticorpo V10 irrelevante (o qual confere proteção contra Yersinia pestis do tipo III (DeBord et al., 2006)) não tiveram efeito (FIG. 13C).
Para examinar o papel de anticorpos sobre Coa ou vWbp isolada, os inventores purificaram proteínas recombinantes, funcíonalmente ativas (Friedrich et al., 2003) que foram, então, adicionadas ao sangue de camundongos tratados com lepirudina. O sangue de camundongos tratados com Coa ou vWbp coagulou em menos de 30 minutos (FIG. 13D). Como um controlem tratamento "mock" (PBS) ou com anticorpo V10 irrelevante não afetou a coagulação. Anticorpos dirigidos contra Coa ou vWbp retardaram a coagulação do sangue de camundongos tratados com proteínas recombinantes e isso ocorreu mesmo para o fator homólogo de reação cruzada (FIG. 13D). Reatividade cruzada mínima dos anticorpos foi observada atra-vés de ELISA e Western blot, ainda que haja inibição cruzada de função.
Anticorpos que bloqueiam a associação entre coagulases e pró- trombina ou fibrinogênio. Ressonância de plasmônio em superfície (Surface Plasmon Resonance - SPR) foi usada para investigar como anticorpos aCoa e avWbp interferem com as funções fisiológicas de coagulases. Pró- trombina foi imobilizada sobre um chip CM5. Deixando fluir Coa purificada sobre a amostra, uma constante de dissociação KD de 28 nM foi calculada, uma medição que é comensurável com outros relatos na literatura (Friedrich et al., 2003). A adição de αCoa levou a uma diminuição concentração- dependente no sinal de resposta para a formação de pró-trombinaDCoa, indicando que esses anticorpos bloqueiam a associação de Coa com pró- 5 trombina (FIG. 14A). SPR confirmou ainda a associação entre coagulase efibrinogênio (KD de 93,1 nM, FIG. 14B). Quando de pré-incubação com aCo- a, os inventores observaram uma diminuição dramática na ligação de Coa ao fibrinogênio (FIG. 14B). Tomados juntos, esses resultados indicam que anticorpos dirigidos contra Coa bloqueiam a associação dessa molécula com 10 fatores de coagulação sanguínea.vWbp purificada mostrou forte afinidade pela pró-trombina (KD de38,4 nM, FIG. 13C) e fibrinogênio (484 nM, FIG. 13D), o último dos quais não tinha, até o momento, sido apreciado (Kroh et al., 2009). Ainda, pré- incubação com anticorpos estimulados contra vWbp bloqueou a associação 15 entre vWbp e pró-trombina ou fibrinogênio de uma maneira dose-dependente (FIG. 13C, 13D). Essas descobertas sustentam os resultados dos ensaios de coagulação sanguínea, demonstrando que anticorpos poli- clonais podem bloquear a interação entre Çoa ou vWbp e componentes específicos da cascata de coagulação (FIG. 12).
Para testar se anticorpos específicos para coagulases bloqueiama conversão de fibrinogênio em fibrina, a capacidade de complexos de pró- trombina*coagulase de clivar S-2238 foi medida, um substituto para a clivagem de fibrinogênio em fibrina (FIG. 14E, 14F). A adição de anticorpos específicos à pro-trombina’Coa ou pró-trombina-vWbp reduziu a capacidade25 desses complexos de converter substrato em produto. Ainda, inibição cruzada de anticorpos coagulase-específicos foi observada, onde a adição de anticorpos de reação cruzada causou uma redução na atividade do complexo de pró-trombinaevWbp. Esses dados sugerem que anticorpos específicos dirigidos contra Coa ou vWbp neutralizam o efeito patofisiológico do produto30 secretado ao qual eles se ligam.
Anticorpos contra coagulases conferem proteção contra doençaestafilocócica. Anticorpos do tipo IgG específicos para Coa ou vWbp foram isolados de soro de coelho através de cromatografia sobre uma coluna de afinidade, gerados através de ligação cruzada covalente do antígeno à CNBr sepharose. Os inventores tentaram alterar a patogênese estafilocócica mediante a administração de anticorpos de neutralização dirigidos contra Coa 5 e/ou vWbp. Aos camundongos foram administrados anticorpos de coelho e estimulados com uma dose letal da cepa Newman de S. aureus. Injeção de anticorpos Coa ou vWbp específicos prolongou significativamente a sobrevida de murinos (FIG. 15).
Para testar reagentes de anticorpo para possível proteção por 10 vacina contra bacteremia letal, IgG purificada por afinidade (5 mg kg'1 de peso corporal) foi injetada na cavidade peritonial de camundongos. Vinte e quatro horas depois, os animais forma injetados com uma suspensão de 1 x 108 CFU de S. aureus Newman em PBS no plexo retro-orbital. Monitorando os animais com o tempo, os inventores observaram que anticorpos dirigidos 15 contra vWbp (avWbp) levaram a um tempo até a morte aumentado e sobrevida de 10% quando comparado a animais que tinham recebido anticorpos aV10 irrelevantes e morreram dentro de 12-48 horas (FIG. 15). Anticorpos contra Coa (aCoa) aumentaram adicionalmente o tempo até a morte de camundongos passivamente imunizados (FIG. 15). Uma mistura de ambos osanticorpos (αCoa/αvWbp) não gerou um aprimoramento estatisticamente significativo na sobrevida ou tempo até a morte com relação aos anticorpos aCoa.
Para examinar a imunização passiva quanto à proteção contra formação de abscesso estafilocócica, anticorpos purificados (5 mg kg'1 de 25 peso corporal) foram injetados na cavidade peritonial dos camundongos e formação de abscesso foi monitorada durante cinco dias após estímulo intravenoso com 1 x 107 CFU de S. aureus Newman. Anticorpos contra vWbp não levam a uma redução significativa na carga estafilocócica ou no número de lesões inflamatórias (Tabela 8), embora as lesões observadas trouxes- 30 sem pequenas colônias de abscessos menores e infiltrados de PMN reduzidos quando comparado com os camundongos "mock" imunizados (FIG. 16). Anticorpos contra coagulase reduziram a carga estafilocócica (P = 0,042), bem como o número de lesões inflamatórias (P = 0,039); lesões por abscesso com colônias estafilocócicas no ninho de grandes infiltrados de PMN não foram detectadas (FIG. 16 e Tabela 8). Animais que receberam ambos os anticorpos, αWbp e aCoa, mostraram uma redução ainda maior na carga 5 estafilocócica (P = 0,013) e uma redução na abundancia de lesões inflamatórias (P = 0,0078) (Tabela 8). Juntos, esses dados indicam que anticorpos contra coagulases, administrados através de imunização passiva, protegem os camundongos contra formação de abscesso e permitem eliminação do patógeno invasor dos tecidos hospedeiros. Anticorpos contra vWbp contri- 10 buem relativamente pouco para proteção da vacina, em concordância com a descoberta de que vWbp não exerce o mesmo papel crítico que a Coa durante a patogênese de infecção por S. aureus em camundongos (Tabela 8).
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Coagulases funcionam como antígenos protetores contra infecção estafilocócicas. Coa e vWbp rotuladas com poli-histidina foram purificadas de E. coli e usadas como antígenos de vacina em subunidade. Proteínas (100 μg emulsificadas em CFA ou IFA) foram injetadas em camundongos 5 BALB/c "naive" no dia (CFA) ou 11 (IFA). Os animais foram estimulados no dia 21 através de inoculação intravenosa de S. aureus Newman. O sangue de cinco animais de controle foi coletado no momento de desafio e titulações de anticorpo no soro contra antígenos de vacina foram determinadas através de ELISA (Tabela 9). Os animais foram sacrificados cinco ou quinze dias 10 após estímulo da carga estafilocócica e histopatologia de lesões por abscesso foram analisadas. Imunização com Coa reduziu a carga bacteriana no dia 5 (P = 0,03, PBS mock vs. Coa) e dia 15 (P = 4,286 x 10'5, PBS mock vs. Coa, vide Tabela 9). Vacinação com Coa também diminuiu o número de lesões infecciosas que se formaram nos tecidos renais, mock vs. Coa, P = 15 0,03 (dia 5) e P = 0,0522 (dia 15) (Tabela 9). De nota, nenhum dos camundongos imunizados com CoA desenvolveu lesões por abscesso típicas (figura 17). Na ocasião, pequenos acúmulos de PMNs que não estavam associados às colônias de abscesso estafilocócico foram observados (figura 17). Imunização com vWbp não reduz significativamente a carga estafilocócica 20 no dia 5 (P = 0,39, PBS mock vs. vWbp) ou no dia 15 (P = 0,09, PBS mock vs. vWbp). O número total de lesões inflamatórias não foi reduzido. Todavia, a arquitetura dos abscessos tinha mudado após imunização com vWbp. As colônias estafilocócicas não foram detectadas no centro dos abscessos e, antes, infiltrações de PMN foram observadas (figura 17). A vacina combina- 25 da, vWbp-Coa, reduziu adicionalmente o número de células inflamatórias em tecidos renais e animais infectados não mostram lesões por abscesso no dia 5 ou 15 (Tabela 9).
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Materiais e Métodos
Cepas Bacterianas e Crescimento de Culturas. Estafilococos foram cultivados sobre ágar ou caldo de soja tríptico a 37°C. Cepas DH5a e BL21(DE3) de E. coli (Studier et al., 1990) foram cultivadas sobre ágar ou caldo de Luria a 37°C. Ampicilina (100 μg/ml) e cloranfenicol (10 μg/ml) foram usados para seleção de plasmídeo pET15b (Studier et al., 1990) e pOSI (Schneewind etal., 1993), respectivamente.
Geração de Mutantes. Sequências de DNA 1 kb a montante e a jusante de coa e vWbp foram amplificadas por PCR usando os iniciadores attB1_Coa, Coa1_BamHI, Coa2_BamHI, attbB2_Coa e attB1_vWF, vWF1_BamHI, vWF2_BamHI, attbB2_vWF (Tabela 10). Os fragmentos foram trocados sobre pKOR1 usando o kit BP Clonase II (Invitrogen) (Bae e Schneewind, 2005). Esses vetores foram eletroporados em S. aureus Newman e submetidos à troca alélica induzida por desvio de temperatura para gerar a deleção correspondente (Bae e Schneewind, 2005). Mutantes foram verificados por meio de amplificação por PCR do locus gênico, sequencia- mento de DNA de análise por imunoblot.
Para gerar plasmídeos de complementação, os iniciadores Co- a_promotor_BamHI_F, Coa_out_Pstl_R, vWbp_promotor_BamHI_F, vWbp_out_Pstl_R (Tabela 10) foram projetados para incluir a região promotora a jusante de vWbp ou coa e as regiões amplificadas foram clonadas no pOS1. Esses plasmídeos foram verificados através de sequenciamento e, então, eletroporados em cepas estafilocócicas. Para análise por imunoblot, culturas noturnas de estafilococos crescidas em caldo de soja tríptico (Difco) foram re-diluídas a 1:100 e crescidas com agitação a 37°C até que elas atingissem uma OD6OO de 0,4. Amostras de 1 ml de cada cultura centrifugadas a 13.000 xg durante 10 min em uma centrífuga para bancada e o sobrenadan- te foi recuperado. Ácido tricloroacético, 75 μl de uma solução a 100% em peso/v, foi adicionado e as amostras foram incubadas sobre gelo durante 10 min, seguido por centrifugação e lavagem com 1 ml de acetona a 100% gelada. As amostras foram secas ao ar durante a noite e solubilizadas em 50 μl de tampão de amostra (SDS a 4%, Tris-HCI a 50 mM, pH de 8, glicerol a 10% e azul de bromofenol).
Ensaio de sobrevivência e Coagulação Sanguínea. Culturas noturnas de cepas estafilocócicas foram diluídas a 1:100 em TSB fresco e crescidas a 37°C até que elas atingissem uma OD6oo de 0,4. Um ml de cultura foi centrifugado e estafilococos lavados e suspensos em 10 ml de PBS estéril para gerar uma suspensão de 1 x 107 CFU/ml. Sangue íntegro de camundongos Balb/c "na'ive" de 6 semanas de idade foi coletado e REFLU- DAN™ (lepirudina, Bayer) foi adicionado até uma concentração final de 50 pg/ml. 450 μL de sangue foram transformados em alíquotas em um tubo de Eppendorf de 1 ml e misturados com 50 μl de amostra bacteriana (1 x 105 CFU/ml). As amostras foram incubadas a 37°C com rotação lenta. Alíquotas de 100 μl foram removidas nos tempos 0 min e 30 min, misturadas a 1: 1 com saponina a 2%/PBS e incubadas sobre gelo durante 30 minutos. Cinco diluições seriais de 1:10 foram preparadas e alíquotas de 10 μl dispersas sobre ágar TSA para formação e enumeração de colônia.
Para avaliar a atividade de coagulação sanguínea bacteriana, 10 μl da cultura bacteriana de estoque acima foram adicionados a 100 μl de sangue de camundongo anticoagulado em um tubo de ensaio plástico estéril (BD Falcon) para obter uma concentração final de 1 x 105 CFU/ml. Para alteração de anticorpo, mais 10 ul de PBS contendo 3 x 10‘5 Mol de anticorpo foram adicionados à mistura. Para avaliar proteínas recombinantes, 10 μl de proteína em tampão de PBS foram adicionados até uma concentração final de 50 μM. Os tubos de ensaio foram incubados em temperatura ambiente e a liquidez, ou coagulação sanguínea foi verificada inclinando os tubos em ângulos de 45° em intervalos sincronizados.
Purificação de Proteína. Para estudos de vacinação, a sequência de codificação de comprimento total de Coa ou vWbp madura foi clonada no vetor pET15b usando os iniciadores Coa_foward_Xhol, Co- a_reverso_BamHI, vWbp_forward_Xhol, vWbp_reverso_BamHI (Tabela 10) para obter His6-Coa e His6-vWbp. E. coli BL21(DE3) trazendo vetores de expressão foi crescida a 37°C e induzida com IPTG a 1 mM após duas horas. Quatro horas após indução, as células foram centrifugadas a 6.000 *g, suspensas em 1 * tampão para coluna (Tris-HCI a 0,1 M, pH de 7,5, NaCI a 0,5 M) e submetidas à lise em uma prensa Francesa a 14.0000 li- bras/polegadaz. Os lisatos foram submetidos à ultracentrifugação a 40.000 xg durante 30 min e o sobrenadante foi submetido à cromatografia Ni-NTA, 5 lavado com tampão de coluna contendo imidazol a 25 μM, seguido por elui- ção com imidazol a 500 μM. O eluato foi submetido à diálise com 1 x PBS. Para removera endotoxina, Triton-X114 a 1:1.000 foi adicionado e a solução foi dissipada durante 5 min, incubada a 37°C durante 10 min e centrifugada a 13.000 xg. O sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de dessalini-10 zação HiTrap para remover qualquer resto de Triton-X114.
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Para estudos enzimáticos, ELISA e SPR, a sequência de codificação de comprimento total de Coa ou vWbp madura de coelho foi clonada em pET15b com iniciadores Coa_Xho_fatorXa_F, Coa_reverso_BamHI, vWbp_Xho_fator Xa_F, vWbp_reverso_BamHI (Tabela 10), o qual contêm 5 um sítio de Fator Xa que precede a Ile-Val-Thr-Lys inicial de coagulase e Val-Val-Ser-Gly de vWbp. Essas proteínas foram expressas usando o protocolo acima, então, clivadas com 10 unidades de Fator Xa/1ml durante 1 hora a 25°C para remover a His6 tag do N-término. As proteínas foram, então, carregadas sobre uma coluna Superdex 75 (GE Healthcare) para purificação 10 final. Todas as proteínas eluídas foram armazenadas em 1 x PBS.
Anticorpos de Coelho. A concentração de proteína foi determinada usando um kit BCA (Thermo Scientific). A pureza foi verificada através de análise em gel de SDS page e coloração com Coomassie Brilliant Blue. Coelhos fêmeas brancos New-Zealand de seis semanas de idade (Charles 15 River Laboratories) foram imunizados com 500 μg de proteína emulsificada em CFA (Difco) para imunização inicial ou IFA para imunizações de reforço nos dias 4 e 48. No dia 60, o sangue dos coelhos foi coletado e soro recuperado para imunoblotting ou experimentos de transferência passiva. Para purificação de anticorpo, His6-Coa recombinante ou His6-vWbp (5 mg) foi cova- lentemente ligada à colunas HP ativadas com NHS HiTrap (GE Healthcare). Essa matriz de antígeno foi, então, usada para cromatografia por afinidade de 10-20 ml de soro de coelho a 4°C. A matriz carregada foi lavada com 50 volumes de coluna de PBS, os anticorpos eluídos com tampão de eluição 5 (gentecina a 1 M, pH de 2,5, NaCI a 0,5) e imediatamente neutralizados comTris-HCI a IM, pH de 8,5. Anticorpos purificados sofreram diálise durante a noite contra PBS a 4°C.
Ressonância de Plasmônio em Superfície. A afinidade e taxas de associação e dissociação foram medidas por um BIAcore 3000. Tampões 10 foram filtrados e desgasseificados. Um chip CM5 foi preparada para ligação de amina através de injeção de pró-trombina humana (500 nM, pH de 4,0) (Innovative Research) e fibrinogênio humano (200 nM, pH de 4,5) (Innovative Research) na presença de EDC a 0,2 M e NHS a 0,05 M. Para medir a interação de coagulase com pró-trombina e fibrinogênio, Coa foi diluída em 15 tampão HBS-P (HEPES a 20 mM [pH de 7,4], NaCI a 150 mM, tensoativoP20 a 0,005% [vol/vol]) em concentrações de 0 - 75 nM com injeções sucessivas de coagulase durante 300 segundos, seguido por 300 segundos para dissociação, seguido por regeneração com NaOH (50 pL, 30 segundos). KD e D2 foram determinadas usando o software BiaEvaluation e a me- 20 lhor adaptação foi determinada com um modelo de ligação a 1:1 com a linha de base de extração e Rmax local. A interação de fator de von Willebrand com pró-trombina e fibrinogênio foi medida da mesma forma. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata. Experimentos de inibição com anticorpos policlonais foram conduzidos através de sucessivas injeções de coagu-25 lase (25 nM) incubada com DCoa a 0 nM - 200 nM sob as mesmas condições de injeção descritas acima. vWF (50 nM) foi similarmente incubado com DvWF a 0 nM - 400 nM. A diferença de resposta foi medida como a alteração nas unidades de resposta de antes de injeção até o final da injeção.
Medições de Atividade de Coagulase. Pró-trombina a 1 x 10‘16 M(Innovative Research) foi pré-incubada durante 20 min com uma quantidade equimolar de coagulase funcional ou vWbp em temperatura ambiente, se- guide pela adição de S-2238 (um substrato cromogênico) até uma concentração final de 1 mM em um tampão de reação total de 100 μl de 1 x PBS. A alteração na absorbância foi medida a 450 nm durante 10 minutos em um espectrofotômetro, plotada como uma função do tempo e adaptada a uma 5 curva linear. O declínio da curva (dA/dt) foi interpretado como sendo a taxade hidrólise de S-2238 e: assim, refletindo a função enzimática (% de atividade de coagulase-pró-trombina ou complexo de vWbp-pró-trombina). O ensaio foi repetido na presença de anticorpos específicos ou cruzados adicionados em um excesso de 3M (3 x 10’1s M) e os dados foram normalizados 10 para a atividade % média sem inibição.
Modelo de Abscesso Renal e Estímulo Letal. Culturas noturnas de cepas estafilocócicas foram diluídas a 1:100 em TSB fresco crescidas até que elas atingissem uma OD60o de 0,4. 10 ml de bactérias foram centrifugados a 7.500 *g, lavados e suspensos em 10 ml de 1 xPBS. Camundongos 15 BALB/c fêmeas de seis de semanas de idade (Charles River) foram injeta-dos retro-orbitalmente com 1 x 107 CFU de suspensão estafilocócíco em 100 μl de PBS. Grupos de 10 camundongos foram usados. No quinto dia pós- injeção, esses camundongos foram sacrificados através de asfixia por CO2 e seus rins foram excisados. Todos os órgãos foram examinados com relação20 a lesões na superfície e 8-10 rins direitos foram enviados para seccionamento por histopatologia e coloração com hematoxilina-eosina. Essas seções foram examinadas através de microscopia luminosa quanto a abscessos internos. Para o modelo de estímulo letal, todas as condições experimentais permanecem as mesmas, exceto que 1 x 108 CFU de estafilococos foram25 administrados e os camundongos foram monitorados durante 10 dias pós- infecção quanto à sobrevivência.
Coloração Imunohistoquímica de seções renais. Rins seccionados foram desparafinizados e reidratados através de xileno e diluições seriais de EtOH em água destilada. Eles foram incubados em tampão de recu- 30 peração de antígeno (DAKO, pH de 6,0) e aquecidos no vapor em um fornoa 96QC durante 20 minutos. Após enxague, as seções foram incubadas em peróxido de hidrogênio a 3% durante 5 minutos e, então, soro normal a 10% em Triton X-100/PBS a 0,025% durante 30 minutos. IgG humana a 10% foi usada como reagente de bloqueio para incubação durante 30 minutos (Sigma-Aldrich). Anticorpo primário foi aplicado sobre as seções para incubação noturna a 4DC em uma câmara umidificada. Os anticorpos primários usados5 foram: Pró-trombina anti-camundongo de rato a 1:500 (Innovative Research), fibrinogênio anti-camundongo de coelho a 1:500 (Innovative Research), anti- estafilocoagulase de coelho a 1:250 ou vWbp anti-estafilococo de coelho a 1:250. Após lavagem com TBS, as seções foram incubadas com anticorpo secundário biotinílado (diluição a 1:50 de IgG anti-rato biotinilada, BA-400110 da Vector Laboratories; ou diluição a 1:200 de IgG anti-coelho biotinilada, BA-1000 da Vector) e, então, reagentes ABC (Vector Laboratories). A ligação antígeno-anticorpo foi detectada através do sistema de cromogênio de substrato DAB. As seções foram rapidamente imersas em hematoxilina para contra-coloração e avaliadas sob um microscópio luminoso.
Imunização Ativa. Camundongos BALB/c de três semanas deidade foram injetados com 50 μg de proteína cada, emulsificada em 100 μl de CFA. Grupos de 15 camundongos foram usados, com 5 camundongos reservados para coleta de sangue e titulações de anticorpo. Onze dias pós- vacinação, esses camundongos receberam um reforço com 50 μg de proteí-20 na cada, emulsificada em 100 μl de IFA. No dia 21, os camundongos foram injetados com 1x10' CFU de estafilococos para o modelo de abscesso renal 1 x 108 CFU para estímulo letal. No momento de infecção, o sangue de 5 camundongos foi coletado para obter titulações de anticorpo.
Transferência Passiva de Anticorpos. Vinte e quatro horas antes25 de infecção, camundongos BALB/c de seis semanas de idade foram injetados com anticorpos purificados contra Coa e/ou vWbp em uma dose de 5 mg/kg de peso corporal. Grupos de 10 camundongos foram usados. Esses camundongos foram estimulados por meio de injeção retro-orbital com 1 x 107 CFU (modelo de abscesso renal) ou 1 x 108 CFU de estafilococos (bac-30 teremia letal).
REFERÊNCIAS
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Claims (8)

1. Polipeptídeo imunogênico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um segmento do domínio D de uma Proteína A variante (SpA) compreendendo as substituições de aminoácidos nas posições 9, 10, 36 e 37 da SEQ ID NO:2, cuja substituição de aminoácidos correspondente às posições 9 e 10, que rompe a ligação Fc, são feitas pelos resíduos de lisina e a substituição correspondente às posições 36 e 37, que rompe a ligação VH3, são feitas pelo resíduo de alanina.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:(i) uma ou mais variantes de um domínio E, domínio A, domínio B ou domínio C de SpA;(ii) dois ou mais segmentos de domínio D; ou(iii) um segmento que não é de Proteína A, preferencialmente um segundo segmento antigênico; em que o segundo segmento antigênico é opcionalmente um segmento antigênico de estafilococo, preferencialmente, um segmento Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Eap, Ebh, EsaB, Coa, vWbp, vWh, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, ClfA, ClfB e/ou SasF.
3. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo com definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 em uma composição farmaceuticamente aceitável.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda (a) pelo menos um segundo antígeno estafilocócico, preferencialmente em que o segundo antígeno é selecionado de um peptídeo EsaB, Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Eap, Ebh, Coa, vWbp, vWh, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, ClfA, ClfB e/ou SasF; ou(b) um adjuvante, preferencialmente em que uma variante de SpA é acoplada a um adjuvante.
5. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o poli- peptídeo com definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 4 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. Método de produção de uma vacina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de mistura de antígenos para produzir a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 4 e adição de um excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição imunogênica ou vacina para elicitar uma resposta imunológica contra uma bactéria estafilocócica em um indivíduo.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que(a) a composição compreende ainda um adjuvante;(b) em que a bactéria estafilocócica é uma bactéria S. aureus;(c) em que a bactéria estafilocócica é resistente a um ou mais tratamentos, preferencialmente em que a bactéria é resistente à meticilina;(d) a composição compreende uma bactéria não estafilocócica recombinante que expressa uma variante de SpA, preferencialmente em que a bactéria não estafilocócica recombinante é uma Salmonella;(e) em que o indivíduo é um mamífero, preferencialmente um ser humano;(f) em que a resposta imune é uma resposta imune protetora; ou(g) em que o indivíduo tem, é suspeito de ter ou está em risco de desenvolver uma infecção estafilocócica, preferencialmente em que o indivíduo é diagnosticado com uma infecção estafilocócica persistente.
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