ES2784957T3

ES2784957T3 - Composiciones y métodos relacionados con variantes de la proteína A (SPA)

Info

Publication number: ES2784957T3
Application number: ES17193256T
Authority: ES
Inventors: Olaf Schneewind; Alice Cheng; Dominique Missiakas; Hwan Kim
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2010-04-05
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2030-04-05
Also published as: HUE026855T2; EP3002293A1; ES2563646T3; HRP20200727T1; KR20170102039A; KR101773368B1; EP2414387A4; PT3281947T; BRPI1010307B1; WO2011005341A3; LT3281947T; SMT201600033B; SI3281947T1; WO2011005341A2; EP2414387B1; US9567379B2; EP2414387A2; PT2414387E; CA2757543C; ZA201107702B

Abstract

Una variante inmunogénica de la proteína A (SpA) que comprende: (a) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a VH3 del dominio E, D, A, B o C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a VH3, en donde la variante de SpA comprende un dominio E que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 33 y 34 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 36 y 37 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 6; y/o un dominio C que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 5; y (b) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio E, D, A, B o C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, en donde la variante de SpA comprende un dominio E que comprede una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 6 y 7 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 6; y/o un dominio C que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 5.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos relacionados con variantes de la proteína A (SPA)

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

I. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia en general a las áreas de inmunología, microbiología, y patología. Más en particular, hace referencia a composiciones que implican variantes de la proteína A bacteriana, que pueden utilizarse para provocar una respuesta inmune contra las bacterias.

II. ANTECEDENTES

El número de infecciones tanto extrahospitalarias como intrahospitalarias ha aumentado en los últimos años con el aumento del uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones intrahospitalarias (nosocomiales) causan una gran morbilidad y mortalidad, más concretamente en los Estados Unidos, donde afecta a más de 2 millones de pacientes anualmente. Las infecciones más frecuentes son infecciones del tracto urinario (un 33% de las infecciones), seguido de neumonía (un 15,5%), infecciones de sitio quirúrgico (un 14,8%) e infecciones primarias del torrente sanguíneo (un 13%) (Emorl and Gaynes, 1993).

Entre los patógenos nosocomiales más importantes se incluyen el Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos (principalmente Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp., Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque estos patógenos causan aproximadamente el mismo número de infecciones, la gravedad de los trastornos que producen en combinación con la frecuencia de aislados resistentes a antibióticos, nivelan esta clasificación hacia el S. aureus y el S. epidermidis como los patógenos nosocomiales más significativos.

Los estafilococos pueden causar una amplia variedad de enfermedades en humanos y otros animales ya sea a través de la producción o bien la invasión de toxinas. Las toxinas estafilocócicas son también una causa común de intoxicación por alimentos, ya que las bacterias pueden crecer en alimentos almacenados de forma no apropiada.

El Staphylococcus epidermidis es un comensal habitual de la piel que es además un importante patógeno oportunista responsable de infecciones de dispositivos médicos defectuosos e infecciones en los sitios quirúrgicos. Los dispositivos médicos infectados por el S. epidermidis incluyen estimuladores cardiacos, shunt o derivación del líquido cefalorraquídeo, catéteres para diálisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y válvulas cardíacas protésicas.

El Staphylococcus aureus es la causa más común de las infecciones nosocomiales con una morbilidad y mortalidad significativas. Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abscesos, y síndrome de shock tóxico. El S. aureus puede sobrevivir en superficies secas, lo que aumenta la posibilidad de transmisión. Cualquier infección por S. aureus puede causar el síndrome estafilocócico de la piel escaldada, una reacción cutánea a la exotoxina absorbida en el torrente sanguíneo. También puede causar un tipo de septicemia llamada piemia que puede suponer un peligro para la vida. Problemáticamente, el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) se ha convertido en la principal causa de infecciones intrahospitalarias.

Las infecciones por S. aureus y S. epidermidis se tratan habitualmente con antibióticos, siendo la penicilina el fármaco por excelencia, mientras que la vancomicina se utiliza para los aislados resistentes a meticilina. El porcentaje de cepas estafilocócicas que muestran una resistencia de amplio espectro a los antibióticos, se ha vuelto cada vez más frecuente, lo que representa una amenaza para una terapia antimicrobiana efectiva. Además, la reciente aparición de una cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha suscitado el temor de que están surgiendo y extendiéndose cepas de SARM para las que no existe disponibilidad de ninguna terapia efectiva.

Se encuentra en investigación una alternativa al tratamiento con antibióticos para las infecciones estafilocócicas que utiliza anticuerpos dirigidos contra antígenos estafilocócicos. Esta terapia implica la administración de antisuero policlonal (WO00/15238, WO00/12132) o tratamiento con anticuerpos monoclonales contra el ácido lipoteicoico (WO98/57994).

Una aproximación alternativa sería el uso de una vacuna activa para generar una respuesta inmune contra los estafilococos. El genoma del S. aureus se ha secuenciado y muchas de las secuencias de codificación se han identificado (WO02/094868, EP0786519), lo que puede conducir a la identificación de antígenos potenciales. Lo mismo ocurre para el S. epidermidis (WO01/34809). Como refinamiento de esta aproximación, otros investigadores han identificado proteínas que son reconocidas por suero hiperinmune procedente de pacientes que han sufrido una infección por estafilococos (WO01/98499, WO02/059148).

El S. aureus secreta una plétora de factores de virulencia en medio extracelular (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Foster, 2005; Shaw et al., 2004; Sibbald et al., 2006). Como la mayoría de las proteínas secretadas, estos factores de virulencia son trasladados por la maquinaria Sec a través de la membrana plasmática. Las proteínas secretadas por la maquinaria Sec portan un péptido líder N-terminal que es eliminado por una peptidasa líder una vez que la preproteína se acopla en el translocón Sec (Dalbey and Wickner, 1985; van Wely et al., 2001). Un análisis reciente del genoma sugiere que las Actinobacterias y miembros de los Firmicutes codifican un sistema de secreción adicional que reconoce un subconjunto de proteínas de manera independiente de Sec (Pallen, 2002). El ESAT-6 (antígeno diana de secreción temprana de 6 kDa, del inglés “early secreted antigen target 6 kDa”) y el CFP-10 (antígeno de 10 kDa de filtrado de cultivos) de la Mycobacterium tuberculosis, representan los primeros sustratos de este nuevo sistema de secreción denominado ESX-1 o Snm en M. tuberculosis (Andersen et al., 1995; Hsu et al., 2003; Pym et al., 2003; Stanley et al., 2003). En el S. aureus, dos factores similares a ESAT-6 denominados EsxA y EsxB son secretados por la vía Ess (sistemas de secreción de ESAT-6) (Burts et al., 2005).

La primera generación de vacunas dirigidas contra el S. aureus o contra las exoproteínas que produce, han alcanzado un éxito limitado (Lee, 1996). Persiste la necesidad de desarrollar vacunas efectivas contra infecciones estafilocócicas. También son necesarias composiciones adicionales para tratar las infecciones estafilocócicas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La proteína A (SpA)(SEQ ID NO:33), una proteína de superficie anclada a la pared celular del Staphylococcus aureus, permite la evasión bacteriana de las respuestas inmunes innatas y adaptativa. La proteína A se une a las inmunoglobulinas en su porción Fc, interactúa con el dominio VH3 de los receptores de células B estimulando de forma inapropiada la proliferación de células B y la apoptosis, se une a los dominios A1 del factor de von Willebrand para activar la coagulación intracelular, y además se une al receptor 1 del TNF para contribuir a la patogénesis de la neumonía estafilocócica. Debido al hecho de que la proteína A captura la inmunoglobulina y muestra atributos tóxicos, no se ha seguido de manera rigurosa la posibilidad de que esta molécula de superficie pueda funcionar como una vacuna en humanos. Aquí los inventores demuestran que las variantes de la proteína A que ya no son capaces de unirse a las inmunoglobulinas, a las que se elimina así su potencial toxigénico, es decir, son no toxigénicas, estimulan las respuestas inmunes humorales que protegen contra enfermedades estafilocócicas.

La presente invención proporciona una variante inmunogénica de la proteína A (SpA) que comprende:

(a) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a V^h3 del dominio E, D, A, B o C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a V^h3, en donde la variante de SpA comprende un dominio E que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 33 y 34 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 36 y 37 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 6; y/o un dominio C que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 5; y

(b) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio E, D, A, B o C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, en donde la variante de SpA comprende un dominio E que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 6 y 7 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 6; y/o un dominio C que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 5.

En determinados modos de realización la variante de SpA es una variante de SpA de longitud completa que comprende un dominio variante A, B, C, D, y E. En determinados aspectos, la variante de SpA comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos que es un 80, 90, 95, 98, 99, o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:34. En otras realizaciones, la variante de SpA comprende un segmento de la SpA. El segmento de la SpA puede comprender al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o más dominios de unión de IgG. Los dominios de IgG pueden ser al menos o como máximo 1,2, 3, 4, 5 o más dominios A, B, C, D, o E variantes. En determinados aspectos la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, o más dominios de la variante A. En un aspecto adicional la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, o más dominios de la variante B. En aún un aspecto adicional, la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1,2, 3, 4, 5, o más dominios de la variante C. En aún otro aspecto adicional la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, o más dominios de la variante D. En determinados aspectos la variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, o más dominios de la variante E. En un aspecto adicional, la variante de SpA comprende una combinación de los dominios A, B, C, D, y E en diversas combinaciones y permutaciones. Las combinaciones pueden incluir la totalidad o parte de un segmento del péptido señal de SpA, un segmento de la región X de SpA, y/o un segmento de la señal de clasificación de SpA. En otros aspectos, la variante de SpA no incluye un segmento del péptido señal de SpA, un segmento de la región X de SpA, y/o un segmento de la señal de clasificación de SpA. En ciertos aspectos un dominio A variante comprende una sustitución en la posición o posiciones 7, 8, 34, y/o 35 de la SEQ ID NO:4. En otro aspecto un domino B variante comprende una sustitución en la posición o posiciones 7, 8, 34, y/o 35 de la SEQ ID NO:6. En aún otro aspecto un dominio C variante comprende una sustitución en la posición o posiciones 7, 8, 34, y/o 35 de la SEQ ID NO:5. En ciertos aspectos, un dominio D variante comprende una sustitución en la posición o posiciones 9, 10, 37, y/o 38 de la SEQ ID NO:2. En un aspecto adicional un dominio E variante comprende una sustitución en la posición o posiciones 6, 7, 33, y/o 34 de la s Eq ID NO:3.

La variante de SpA incluye (a) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio A, B, C, D y7o E de la SpA que interrumpe o disminuye la unión a la Fc de IgG, y (b) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a V^h3 del dominio A, B, C, D y/o E de SpA que interrumpe o disminuye la unión a V^h3. En aún otros aspectos, la secuencia de aminoácidos de una variante de SpA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50%, un 60%, un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, o un 100% idéntica, incluyendo todos los valores y rangos entre los mismos, a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs:2-6.

En un aspecto la variante de SpA incluye (a) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio D de la SpA, o en correspondientes posiciones de aminoácidos en otros dominios de IgG, que interrumpen o disminuyen la unión a Fc de la IgG, y (b) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a V^h3 del dominio D de la SpA, o en correspondientes posiciones de aminoácidos en otros dominios de IgG, que interrumpen o disminuyen la unión a V^h3. En ciertos aspectos el residuo de aminoácido F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131, y/o K35 (SEQ ID NO:2, QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLN ES) del subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio D se modifican o sustituyen. En ciertos aspectos el residuo de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, and/or E47 (SEQ ID NO:2) del subdominio de unión a V^h3 del dominio D se modifican o sustituyen, de tal manera que la unión a Fc o a V^h3 es atenuada. En aspectos adicionales, pueden realizarse mediante ingeniería genética correspondientes modificaciones o sustituciones en posiciones correspondientes del dominio A, B, C, y/o E. Las posiciones correspondientes se definen mediante alineamiento de la secuencia de aminoácidos del dominio D con una o más secuencias de aminoácidos de otros dominios de unión a IgG de la SpA, por ejemplo ver la Figura 1. En ciertos aspectos la sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de los diferentes 20 aminoácidos. En un aspecto adicional, las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser excluidas específicamente de las posibles sustituciones de aminoácidos. En otros aspectos únicamente se incluyen sustituciones no conservadoras. En cualquier caso, se encuentra contemplada cualquier sustitución o combinación de sustituciones que reduzca la unión del dominio de tal manera que se reduzca de manera significativa la toxicidad de la SpA. La implicación de la reducción en la unión hace referencia a una variante que produce mínima o ninguna toxicidad cuando se introduce en un sujeto y puede ser evaluado utilizando métodos in vitro descritos en la presente patente.

En determinados modos de realización, una variante de SpA comprende al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, o más péptidos del dominio D de la variante de SpA. En ciertos aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19 o más residuos de aminoácidos de la variante de SpA se sustituyen o modifican - incluyendo pero sin limitarse a los aminoácidos F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131, y/o K35 (SEQ ID NO:2) del subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio D y el residuo de aminoácido Q26, G29, f 30, S33, D36, D37, Q40, N43, y/o E47 (SEQ ID NO:2) del subdominio de unión a V^h3 del dominio D. En un aspecto de la invención los residuos de glutamina en la posición 9 y 10 de SEQ ID NO:2 (o posiciones correspondientes en otros dominios) son mutadas. En otro aspecto, los residuos de ácido aspártico 36 y 37 de SEQ ID n O:2 (o posiciones correspondientes en otros dominios) son mutados. En un aspecto adicional, los residuos de glutamina 9 y 10, y ácido aspártico 36 y 37 son mutados. Los mutantes/las variantes de la SpA-D o SpA no toxigénica purificadas descritas en la presente patente, ya no son capaces de unirse de forma significativa (es decir, demuestran una afinidad de unión atenuada o interrumpida) a Fcy o a F(ab)²V^h3, y además no estimulan la apoptosis de la las células B. Estas variantes no toxigénicas de la proteína A pueden utilizarse como vacunas subunitarias y elevar las respuestas inmunes humorales, y conferir inmunidad protectora contra la prueba de provocación del S. aureus. En comparación con la proteína A de longitud completa de tipo silvestre o la SpA-dominio D de tipo silvestre, la inmunización con las variantes de SpA-D dieron como resultado un incremento en el anticuerpo específico de la proteína A. Utilizando un modelo con ratón de la prueba de provocación estafilocócica y la formación de abscesos, se observó que la inmunización con las variantes de la proteína A no toxigénicas generaron una protección significativa contra la infección estafilocócica y la formación abscesos. Como prácticamente todas las cepas de S. aureus expresan la proteína A, la inmunización de humanos con las variantes no toxigénicas de la proteína A pueden neutralizar este factor de virulencia y, de esta manera, establecer inmunidad protectora. En determinados aspectos, la inmunidad protectora protege de, o mejora, la infección por cepas de estafilococos resistentes a fármacos, tales como la USA300 y otras cepas SARM.

Los modos de realización incluyen el uso de las variantes de la proteína A en composiciones para el tratamiento de infecciones bacterianas y/o estafilocócicas. Esta aplicación también proporciona una composición inmunogénica que comprende una variante inmunogénica de la proteína A de la invención. Además, la presente invención proporciona composiciones que pueden ser utilizadas para tratar (por ejemplo, limitar la formación y/o persistencia de abscesos estafilocócicos en un sujeto) o prevenir una infección bacteriana. En algunos casos, los métodos para estimular una respuesta inmune implican administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que incluye o codifica la totalidad o parte de un polipéptido o antígeno de la variante de la proteína A, y en ciertos aspectos otras proteínas bacterianas. Otras proteínas bacterianas incluyen, pero no se limitan a (i) un factor de virulencia secretado, y/o una proteína o péptido de la superficie celular, o (ii) una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un factor de virulencia secretado, y/o una proteína o péptido de la superficie celular.

En otros aspectos, se puede administrar al sujeto la totalidad o parte de una variante de la proteína A, tal como un segmento del dominio D de la variante de la proteína A. El polipéptido de la invención puede formularse en una composición farmacéuticamente aceptable. La composición puede además comprender uno o más de, al menos o como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19 antígenos estafilocócicos adicionales o un fragmento inmunogénico del mismo (por ejemplo, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla (por ejemplo, mutantes H35), IsdC, SasF, vWbp, o vWh). Entre los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden utilizarse en combinación con una variante de la proteína A se incluyen, sin limitarse a, la proteína de unión a vitronectina de 52kDa (WO 01/60852), Aaa (GenBank CAC80837), Aap (n° de accesión del GenBank AJ249487), Ant (número de accesión del GenBank NP_372518), autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (US6008341), proteína de unión a fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del a Rn III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, y/o proteína de unión a Vitronectina (ver las publicaciones PCT WO2007/113222, WO2007/113223, WO2006/032472, WO2006/032475, WO2006/032500). El antígeno estafilocócico o fragmento inmunogénico puede ser administrado de forma concurrente con la variante de la proteína A. El antígeno estafilocócico o fragmento inmunogénico y la variante de la proteína A puede ser administrado en la misma composición. La variante de la proteína A puede además ser una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una variante de la proteína A. Una molécula de ácido nucleico recombinante puede codificar la variante de la proteína A y al menos un antígeno estafilocócico o un fragmento inmunogénico del mismo. Tal como se utiliza en la presente patente, el término “modular” o “modulación” abarca los significados de las palabras “aumentar” o “ inhibir”. La “modulación” de la actividad puede ser tanto un incremento como una disminución de la actividad. Tal como se utiliza en la presente patente, el término “modulador” hace referencia a compuestos que efectúan la función de una fracción, incluyendo la regulación por incremento, inducción, estimulación, potenciación, inhibición, regulación por disminución, o supresión de una proteína, ácido nucleico, gen, organismo o similar.

En determinados modos de realización las composiciones incluyen o codifican la totalidad o parte del antígeno o variante de la proteína A. En otros aspectos, la variante de la proteína A puede ser utilizada en combinación con factores secretados o antígenos de superficie incluyendo, pero sin limitarse a uno o más de un polipéptido Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, o vWh aislado o un segmento inmunogénico del mismo. Los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden ser utilizados en combinación con una variante de la proteína A incluyen, pero no se limitan a proteína de unión a vitronectina de 52kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (US6008341), proteína de unión a Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, y/o proteína de unión a Vitronectina. En ciertas realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (US6008341), proteína de unión a Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del a Rn III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF (WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (Wo 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, Ss P-2, y/o proteína de unión a Vitronectina.

En aún otros aspectos, la variante de la proteína A aislada se multimeriza, por ejemplo, dimeriza en una fusión lineal de dos o más polipéptidos o segmentos peptídicos. En ciertos aspectos de la invención, una composición comprende multímeros o concatámeros de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más proteínas de la superficie celular aisladas o segmentos de las mismas. Los concatámeros son polipéptidos lineales que tienen una o más unidades peptídicas de repetición. Los polipéptidos o fragmentos de SpA pueden ser consecutivos o estar separados mediante un espaciador u otras secuencias peptídicas, por ejemplo, uno o más péptidos bacterianos adicionales. En un aspecto adicional, los demás polipéptidos o péptidos contenidos en el multímero o concatámero pueden incluir, pero no están limitados a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 de Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Los antígenos estafilocócicos que pueden utilizarse en combinación con una variante de la proteína A se encuentran descritos anteriormente.

El término “variante de la proteína A” o “variante de la SpA” hace referencia a polipéptidos que incluyen un dominio de la IgG de SpA con dos o más sustituciones de aminoácidos que interrumpen la unión a Fc y a V^h3. En un aspecto determinado, la variante de SpA incluye un péptido de dominio D de la variante, además de variantes de polipéptidos de SpA y segmentos de los mismos que son no toxigénicos y estimulan una respuesta inmune contra la proteína A de las bacterias estafilococos y/o bacterias que los expresan.

Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos para provocar una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo o estafilococos en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de la proteína A o un segmento de la misma. En determinados aspectos, los métodos para provocar una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo o estafilococos en un sujeto comprenden proporcionar al sujeto una cantidad efectiva de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más proteínas secretadas y/o proteínas de la superficie celular o segmentos/fragmentos de las mismas. Una proteína secretada o una proteína de superficie celular incluye, pero no se limita a las proteínas Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, y/o vWh y fragmentos inmunogénicos de las mismas. Los antígenos estafilocócicos adicionales que pueden utilizarse en combinación con una variante de la proteína A se encuentran descritos anteriormente.

Los modos de realización de la invención incluyen composiciones que incluyen una variante de la SpA que es al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica o similar a la proteína A, o una segunda proteína o péptido que es una proteína bacteriana secretada o una proteína de la superficie celular bacteriana. En un modo de realización de la invención una composición puede incluir una variante de la SpA que sea al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica o similar a un polipéptido del dominio D (SEQ ID NO:2), dominio E (SEQ ID NO:3), dominio A (SEQ ID NO:4), dominio C (SEQ ID NO:5), dominio B (SEQ ID NO:6) de la proteína A, o a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido del dominio D, dominio E, dominio A, dominio C, o dominio B de la proteína A. En ciertos aspectos la variante de la proteína A tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Se conoce en el arte la similitud o la identidad de secuencias, siendo preferida la identidad, y pueden utilizarse una cantidad de diferentes programas para identificar si una proteína (o ácido nucleico) tiene identidad o similitud de secuencia con respecto a una secuencia conocida. La identidad y/o similitud de una secuencia se determina utilizando técnicas estándar conocidas en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a, el algoritmo de identidad de secuencias de Smith & Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de la secuencia de Needleman & Wunsch (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, de Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al. (1984), preferiblemente utilizando los ajustes por defecto, o mediante inspección. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula utilizando herramientas de alineamiento conocidas, y fácilmente verificables, para los expertos en el arte. El porcentaje de identidad es esencialmente el número de aminoácidos idénticos dividido por el número total de aminoácidos multiplicado por cien.

Aún otros aspectos de la divulgación incluyen métodos para estimular en un sujeto una respuesta inmune protectora o terapéutica contra una bacteria estafilococo que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que incluye (i) una variante de SpA, por ejemplo, un polipéptido del dominio D de la variante de SpA o un péptido del mismo; o, (ii) una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de la variante de SpA o péptido de la misma, o (iii) administrar un polipéptido del dominio D de la variante de SpA con cualquier combinación o permutación de proteínas bacterianas descritas en el presente documento. En un aspecto preferido, la composición no es una bacteria de estafilococo. En ciertos aspectos el sujeto es un humano o una vaca. En un aspecto adicional la composición está formulada en forma de una formulación farmacéuticamente aceptable. Los estafilococos pueden ser Staphylococcus aureus.

Aún incluso otros modos de realización incluyen vacunas que comprenden una composición farmacéuticamente aceptable que tiene un polipéptido de la variante inmunogénica de SpA aislado de la invención, en donde la composición es capaz de estimular una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo. En determinados aspectos de la invención el polipéptido de la variante de SpA aislado, o cualquier otra combinación o permutación de la proteína o proteínas o péptido o péptidos descritos se multimerizan, por ejemplo, dimerizan o concatamerizan. En otro aspecto, la composición de la vacuna está contaminada por menos de aproximadamente un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,05% (o cualquier rango que pueda obtenerse entre los mismos) de otras proteínas estafilocócicas. Una composición puede además comprender un polipéptido no SpA aislado. Habitualmente, la vacuna comprende un adyuvante. En ciertos aspectos una proteína o péptido de la invención está enlazada (de forma covalente o no covalente) al adyuvante, preferiblemente el adyuvante se conjuga químicamente con la proteína.

En incluso aún aspectos adicionales de la divulgación, una composición de vacuna es una composición farmacéuticamente aceptable que tiene un ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de un polipéptido de la variante de SpA, o cualquier otra combinación o permutación de una proteína o proteínas o de un péptido o péptidos descritos en el presente documento, en donde la composición es capaz de estimular una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo. La composición de vacuna puede comprende un ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de un polipéptido de una variante de SpA, o cualquier otra combinación o permutación de una proteína o proteínas o de un péptido o péptidos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones el ácido nucleico recombinante contiene un promotor heterólogo. Preferiblemente, el ácido nucleico es un vector. Más preferiblemente el vector es un plásmido o un vector vírico. En algunos aspectos la vacuna incluye una bacteria no estafilococo recombinante que contiene el ácido nucleico. Las bacterias no estafilococos recombinantes peuden ser Salmonela u otra bacteria gram-positiva. La vacuna puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, más preferiblemente un adyuvante.

Aún otros modos de realización incluyen composiciones para su uso en métodos para estimular en un sujeto una respuesta inmune terapéutica o protectora contra la bacteria estafilococo que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición del polipéptido de una variante inmunogénica de SpA o un segmento/fragmento del mismo, y que además comprende una o más proteínas o péptidos Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, o vWh de los mismos. En un modo de realización preferido la composición comprende una bacteria no estafilococo. En un aspecto adicional la composición está formulada en forma de una formulación farmacéuticamente aceptable. Los estafilococos para los que el sujeto está siendo tratado pueden ser Staphylococcus aureus. Los métodos de la divulgación incluyen además composiciones de la variante de SpA que contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o más factores de virulencia secretados y/o proteínas de la superficie celular, tales como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, o vWh en diversas combinaciones. En ciertos aspectos una formulación para vacuna incluye Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, y vWh. En ciertos aspectos una combinación de antígenos puede incluir (1) una variante de SpA y IsdA; (2) una variante de SpA y ClfB; (3) una variante de SpA y SdrD; (4) una variante de SpA y Hla o una variante de Hla; (5) una variante de SpA y ClfB, SdrD, y Hla o una variante de Hla; (6) una variante de SpA, IsdA, SdrD, y Hla o una variante de Hla; (7) una variante de SpA, IsdA, ClfB, y Hla o una variante de Hla; (8) una variante de SpA, IsdA, ClfB, y SdrD; (9) una variante de SpA, IsdA, ClfB, SdrD y Hla o una variante de Hla; (10) una variante de SpA, IsdA, ClfB, y SdrD; (11) una variante de SpA, IsdA, SdrD, y Hla o una variante de Hla; (12) una variante de SpA, IsdA, y Hla o una variante de Hla; (13) una variante de SpA, IsdA, ClfB, y Hla o una variante de Hla; (14) una variante de SpA, ClfB, y SdrD; (15) una variante de SpA, ClfB, y Hla o una variante de Hla; o (16) una variante de SpA, SdrD, y Hla o una variante de Hla.

En determinados aspectos, una bacteria que administra una composición de la invención será limitada o atenuada con respecto al crecimiento o formación de abscesos prolongada o persistente. En aún otro aspecto, la variante o variantes de SpA pueden ser sobre-expresadas en una bacteria atenuada para aumentar o complementar más aún una respuesta inmune o la formulación de una vacuna.

Ciertos modos de realización están dirigidos a composiciones para su uso en métodos para provocar una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo en un sujeto, que comprenden proporcionar al sujeto una cantidad efectiva del polipéptido o composición de la invención.

El término “proteína EsxA” hace referencia a una proteína que incluye polipéptidos EsxA de tipo silvestre aislados de bacterias estafilococos y segmentos de los mismos, además de variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas EsxA de bacterias estafilococos. De forma similar, los términos “proteína EsxB ", "proteína SdrD", "proteína SdrE", "proteína IsdA", "proteína IsdB", "proteína Eap", "proteína Ebh", "proteína Emp", "proteína EsaB", "proteína EsaC", "proteína SdrC", "proteína ClfA", "proteína ClfB", "proteína Coa", "proteína Hla", "proteína IsdC" y "proteína SasF" hacen referencia a proteínas que incluyen polipéptidos aislados de tipo silvestre EsxA, EsxB, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, SdrC, ClfA, ClfB, CoA, Hla, IsdC o SasF de bacterias estafilocócicas y segmentos de los mismos, además de variantes que estimulan una respuesta inmune contra proteínas EsxA, EsxB, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, SdrC, ClfA, ClfB, CoA, Hla, IsdC o SasF de bacterias estafilococos.

El término “proteína vWbp" hace referencia a una proteína que incluye polipéptidos de vWbp (proteína de unión al factor de von Willebrand) de tipo silvestre aislados de bacterias estafilococos y segmentos de los mismos, además de variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas vWbp de bacterias estafilococos.

El término “proteína vWbp" hace referencia a una proteína que incluye polipéptidos de vWbp (homólogo de la proteína de unión al factor de von Willebrand) de tipo silvestre aislados de bacterias estafilococos y segmentos de los mismos, además de variantes que estimulan una respuesta inmune contra las proteínas vWbp de bacterias estafilococos.

Una respuesta inmune hace referencia a una respuesta humoral, a una respuesta celular, o a ambas respuestas, la humoral y la celular, en un organismo. Una respuesta inmune puede medirse mediante ensayos que incluyen, pero no se limitan a, ensayos que miden la presencia o la cantidad de anticuerpos que reconocen de forma específica una proteína o una proteína de la superficie celular, ensayos que miden la activación o proliferación de linfocitos T, y/o ensayos que miden la modulación en términos de la actividad o expresión de una o más citoquinas.

En aún otros modos de realización de la invención, una composición puede incluir un polipéptido, péptido, o proteína que sea o sea al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica o similar a una proteína EsxA, EsxB, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, EsaB, ClfB, IsdC, SasF, SdrC, ClfA, Eap, Ebh, Emp, EsaC, Coa, Hla, vWa o vWbp. En ciertos aspectos la proteína EsxA tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11.

En ciertos aspectos la proteína EsxB tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12.

En ciertos aspectos la proteína SdrD tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13.

En ciertos aspectos la proteína SdrE tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20. En ciertos aspectos la proteína

tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21. En ciertos aspectos la proteína tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22. En ciertos aspectos la proteína

Eap tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:23. En ciertos aspectos la proteína Ebh tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24. En ciertos aspectos la proteína Emp tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:25. En ciertos aspectos la proteína EsaC tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26. La secuencia de los polipéptidos EsaC pueden encontrarse en las bases de datos de proteínas e incluyen, pero no se limitan a, los números de accesión ZP_02760162 (GI:168727885), NP_645081.1 (GI:21281993), y NP_370813.1 (GI:15923279). En ciertos aspectos la proteína Coa tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la

SEQ ID NO:27. En ciertos aspectos la proteína Hla tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ

ID NO:28. En ciertos aspectos la proteína vWa tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29. En ciertos aspectos la proteína vWbp tendrá toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:32.

En ciertos aspectos, un polipéptido o segmento/fragmento puede tener una secuencia que sea al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98%, o al menos un 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. El término “similitud” hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia que tiene un determinado porcentaje de aminoácidos que o bien son idénticos con el polipéptido de referencia o constituyen sustituciones conservadoras con los polipéptidos de referencia.

Los polipéptidos revelados en la presente patente pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12, 13,14, 15, o más aminoácidos de la variante dentro de al menos, o como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,

51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,

110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132,

133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,

156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178,

179, 180, 181, 182, 183,184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,

202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224,

225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247,

248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier rango que se pueda obtener entre los mismos, de la SEQ ID NO:2-30, o SEQ ID NO:32-34.

Un segmento de polipéptido tal como se revela en la presente patente puede incluir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,

14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,

45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,

105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,

128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150,

151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181,182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier rango que se pueda obtener entre los mismos, de la SEQ ID N0:2-30, o SEQ ID NO:33-34.

Las composiciones pueden ser formuladas en una composición farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos de la invención, la bacteria estafilococo es una bacteria S. aureus.

En aspectos adicionales, una composición puede ser administrada más de una vez a un sujeto, y puede ser administrada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más veces. La administración de las composiciones incluye, pero no se limita a, la vía oral, parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, o diversas combinaciones de las mismas, incluyendo inhalación o aspiración.

En aún modos de realización adicionales, una composición comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de la variante inmunogénica de SpA de acuerdo a la invención. Habitualmente, una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido descrito en la presente patente contiene un promotor heterólogo. En ciertos aspectos, una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención es un vector, en aún otros aspectos el vector es un plásmido. En ciertos modos de realización el vector es un vector vírico. En ciertos aspectos una composición incluye una bacteria no estafilococo recombinante que contiene o expresa una variante de SpA de la invención. En aspectos en particular, la bacteria no estafilococo recombinante es Salmonella u otra bacteria gram-positiva. Una composición se administra habitualmente a mamíferos, tales como sujetos humanos, pero se contempla la administración a otros animales que sean capaces de provocar una respuesta inmune. En otros aspectos, la bacteria estafilococo que contiene o expresa la variante de SpA es Staphylococcus aureus. En modos de realización adicionales la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora.

En modos de realización adicionales, la composición comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica todo o parte de una o más proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, SpA, vWbp, o vWh o péptido o variante de la misma. Se describen anteriormente antígenos estafilocócicos que pueden ser utilizados en combinación con los polipéptidos descritos en la presente patente. En aspectos en particular, una bacteria es una bacteria no estafilococo recombinante, tal como la Salmonella u otra bacteria gram-positiva.

Las composiciones de la invención se administran habitualmente a sujetos humanos, pero se contempla la administración a otros animales que son capaces de provocar una respuesta inmune a una bacteria estafilococo, en particular ganado, caballos, cabras, ovejas y otros animales domésticos, es decir, mamíferos.

En ciertos aspectos, la bacteria estafilococo es un Staphylococcus aureus. En modos de realización adicionales la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora. En aún otros aspectos, las composiciones de la invención son para su uso en la prevención, mejora, reducción o tratamiento de la infección de tejidos o glándulas, por ejemplo, glándulas mamarias, en particular mastitis y otras infecciones. Otros métodos incluyen, pero no se limitan a reducir de forma profiláctica la carga bacteriana en un sujeto que no muestra signos de infección, en particular aquellos sujetos que se sospecha están o se encuentran en riesgo de ser colonizados por una bacteria diana, por ejemplo, pacientes que están o estarán en riesgo o serán susceptibles de infección durante una estancia, tratamiento, y/o recuperación en el hospital.

Cualquier modo de realización tratada con respecto a un aspecto de la invención también se aplica a otros aspectos de la invención. En particular, cualquier modo de realización tratado en el contexto de un polipéptido o péptido o ácido nucleico de la variante de SpA puede ser implementado con respecto a otros antígenos, tales como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (US6008341), proteína de unión a Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora del a Rn III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, y/o proteína de unión a Vitronectina (o ácidos nucleicos), y vice versa. Se entiende también que una cualquiera o más de Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína de unión a vitronectina de 52kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glucosaminidasa, autolisina amidasa, Cna, proteína de unión a colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína de unión a Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína de unión a fibrinógeno (US6008341), proteína de unión a Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador a Bc inmunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipasa GehD, Ma P, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npasa, proteína activadora de ARN III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), transportador ABC de SitC y Ni, proteína de unión a SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, y/o proteína de unión a Vitronectina, puede ser excluido específicamente de una composición reivindicada.

Los modos de realización de la invención incluyen composiciones que contienen o no contienen una bacteria. Una composición puede incluir o puede no incluir una bacteria estafilocócica atenuada o viable o intacta. En ciertos aspectos, la composición comprende una bacteria que no es una bacteria estafilocócica o no contiene una bacteria estafilocócica. En ciertos modos de realización, una composición bacteriana comprende una variante de la proteína A estafilocócica aislada o expresada de forma recombinante, de la invención. La composición puede ser o incluir una bacteria estafilococo modificada por ingeniería genética de forma recombinante, que haya sido modificada de forma que comprenda modificar específicamente la bacteria con respecto a un factor de virulencia secretado o a una proteína de la superficie celular. Por ejemplo, la bacteria puede ser modificada de forma recombinante para expresar más de un factor de virulencia o una proteína de la superficie celular de lo que expresaría si no estuviera modificada.

El término “aislado” puede hacer referencia a un ácido nucleico o polipéptido que se encuentra sustancialmente libre de material celular, material bacteriano, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante) de su fuente de origen, o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetizan químicamente). Más aún, un compuesto aislado hace referencia a uno que puede ser administrado a un sujeto como un compuesto aislado; en otras palabras, el compuesto simplemente no puede ser considerado “aislado” si está adherido a una columna o incluido en gel de agarosa. Más aún, un “fragmento de ácido nucleico aislado” o “péptido aislado” es un fragmento de ácido nucleico o proteína que no es de origen natural como fragmento y/o no se encuentra habitualmente en estado funcional.

Las fracciones de la invención, tales como polipéptidos, péptidos, antígenos, o inmunógenos, pueden conjugarse o enlazarse de forma covalente o no covalente con otras fracciones tales como adyuvantes, proteínas, péptidos, soportes, fracciones de fluorescencia, o marcadores. El término “conjugado” o “inmunoconjugado” se utiliza ampliamente para definir la asociación operativa de una fracción con otro agente y no pretende hacer referencia exclusivamente a cualquier tipo de asociación operativa, y no está particularmente limitada a la “conjugación” química. Se contemplan en particular las proteínas de fusión recombinantes. Las composiciones de la invención pueden además comprender un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un adyuvante puede acoplarse de forma covalente o no covalente a un polipéptido o péptido de la invención. En ciertos aspectos, el adyuvante se conjuga químicamente con una proteína, polipéptido o péptido.

El término “proporcionar” se utiliza de acuerdo a su significado corriente para indicar “suministrar o facilitar para su uso”. En algunas realizaciones, la proteína se proporciona directamente administrando la proteína, mientras que en otras realizaciones la proteína se proporciona de manera efectiva administrando un ácido nucleico que codifica la proteína. En ciertos aspectos, la invención contempla composiciones que comprenden diversas combinaciones de ácido nucleico, antígenos, péptidos, y/o epítopos.

El sujeto tendrá (por ejemplo, está diagnosticado con una infección estafilocócica), se sospecha que tiene, o estará en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica. Las composiciones de la presente invención incluyen composiciones inmunogénicas en las que el antígeno o antígenos o el epítopo o epítopos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito deseado. Más específicamente, una cantidad efectiva significa una cantidad de ingredientes activos necesarios para estimular o provocar una respuesta inmune, o proporcionar resistencia a, mejora de, o mitigación de una infección. En aspectos más específicos, una cantidad efectiva evita, alivia o mejora los síntomas de una enfermedad o infección, o prolonga la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. La determinación de la cantidad efectiva se encuentra dentro de la capacidad de los expertos en el arte, en especial en vista de la revelación detallada que se proporciona en la presente patente. Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, una cantidad o dosis efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de estudios in vitro, cultivos celulares, y/o ensayos con modelos animales. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos animales para lograr una respuesta inmune deseada o concentración o título de anticuerpo circulante. Tal información puede ser utilizada para determinar de forma más precisa las dosis útiles en humanos.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para que la materia en la que las características, ventajas y objetos de la invención citados anteriormente, además de otros que serán aclarados, se logre y pueda ser comprendida en detalle, se ilustran en los dibujos adjuntos descripciones más concretas y ciertos modos de realización de la invención resumidos brevemente anteriormente. Estos dibujos forman parte de la especificación. Ha de señalarse, sin embargo, que los dibujos adjuntos ilustran ciertos modos de realización de la invención y por lo tanto no han de considerarse limitativos en su alcance.

FIGs. 1A - 1E Generación de una vacuna de proteína A no toxigénica. FIG 1A producto de la traducción de la proteína A de S. aureus de la cepa Newman y USA300 LAC con un péptido señal N-terminal (recuadro blanco), cinco dominios de unión a inmunoglobulina (IgBDs designados E, D, A, B y C), región variable X y señal de clasificación C-terminal (recuadro en negro). FIG. 1B, secuencia de aminoácidos de los cinco IgBDs además de SpA-D^kkaano toxigénica, con las posiciones de haces de triple hélice a (H1, H2 y H3), además de glutamina (Q) 9, 10 y aspartato (D) 36, 37 indicadas. FIG. 1C, SDS-PAGE con tinción de azul Coomassie de SpA, SpA-D, SpA-D^kkaao SrtA purificada sobre Ni-NTA-sefarosa en presencia o ausencia de inmunoglobulina humana (hIgG). FIG. 1D, ensayo ELISA que examina la asociación de SpA, SpA-D o SpA-D^kkaainmovilizada con IgG humana, además de sus fragmentos Fc o F(ab)²y el factor de von Willebrand (vWF). FIG. 1E, se cuantificaron linfocitos CD19+ B en tejido esplénico de ratones BALB/c que habían sido inmunizados con células mock (inactivas) o tratados con SpA-D o SpA-D^kkaamediante el método FACS.

FIG. 2 La vacuna de proteína A no toxigénica evita la formación de abscesos. Histopatología de tejido renal aislado durante la necropsia de ratones BALB/c que habían sido inmunizados de forma ficticia (PBS) o vacunados con SpA, SpA-D además de SpAD^kkaay con los que se realizó una prueba de provocación con S. aureus Newman. Los tejidos en secciones finas se colorearon con hematoxilina-eosina. Las flechas de color blanco identifican infiltrados de leucocitos polimorfonucleares (PMN). Las flechas oscuras identifican comunidades de abscesos estafilocócicos.

FIGs. 3A-C Los anticuerpos generados por la vacuna de proteína A no toxigénica bloquean la función superantigénica de los linfocitos B de la SpA. FIG 3A, los anticuerpos de conejo generados contra la SpA-D^kkaafueron purificados sobre una matriz con antígenos inmovilizados y se analizaron mediante SDS-PAGE con tinción de azul Coomassie. Los anticuerpos se escindieron con pepsina y se purificaron los fragmentos de F(ab)²mediante una segunda vuelta de cromatografía por afinidad sobre una matriz de SpA-D^kkaa. FIG 3B, la F(ab)²específica de SpA-D^kkaainterfiere con la unión de la SpA o SpA-D a la inmunoglobulina humana (hIgG) o, FIG 3C, al factor de von Willebrand (vWF).

FIGs.4A-D La proteína A no toxigénica de longitud completa genera respuestas inmunes mejoradas. FIG 4A, la SpA^kkaade longitud completa se purificó sobre Ni-NTA-sefarosa y se analilzó mediante SDS-PAGE con tinción de azul Coomassie. FIG 4B, se cuantificaron los linfocitos - CD19+ B en tejido esplénico de ratones BALB/c que habían sido inmunizados de forma ficticia o tratados con SpA o SpA^kkaa, mediante FACS. FIG 4C, ensayo ELISA que examina la asociación de SpA o SpA^kkaainmovilizada con IgG humana, además de sus fragmentos Fc o F(ab)2 o factor de von Willebrand (vWF). FIG 4D, títulos de suero de anticuerpos de ratón o humanos para toxoide diftérico (CRM197) y SpA ^kkaao SpA-D^kkaano toxigénica. Se examinaron mediante dot blot cuantitativo los voluntarios humanos con historia de inmunización contra DTaP e infección estafilocócica (n=16), además de ratones (n=20) que habían sido infectados con S. aureus Newman o USA 300 LAC o inmunizados con SpA^kkaao SpA-D^kkaa.

FIG. 5 La proteína A se requiere para la patogénesis de las infecciones letales por S. aureus en ratones. Se inyectó a cohortes de ratones BALB/c (n=8) suspensiones de 2 X 108 UFC de S. aureus Newman o su variante de deleción de la proteína A isogénica (Aspa) en PBS. Los animales infectados se monitorizaron para determinar su supervivencia durante un periodo de 15 días.

FIGs.6A-B Los anticuerpos contra la proteína A protegen los ratones contra infecciones letales por S. aureus. FIG 6A Se inyectó a cohortes de ratones BALB/c (n=10) 5 mg kg_1 IgG de conejo purificado por afinidad específico para SpA^kkaa(a-SpAKKAA), o antígeno de la vacuna contra la peste rV10 (DeBord et al., 2006) (molde). Cuatro horas más tarde, se infectó cada animal mediante inyección intraperitoneal con una suspensión de 3 X 108 UFC de S. aureus Newman y se monitorizaron para determinar su supervivencia durante un periodo de 10 días. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. FIG 6B Cohortes de ratones BALB/c (n=10) se inmunizaron con la estrategia inducción-refuerzo (prime-boost) con SpA^kkaao control con PBS/adyuvante (molde). Cada animal se infectó posteriormente mediante inyección intraperitoneal con una suspensión de 6 X 108 UFC de S. aureus Newman y se monitorizaron para determinar su supervivencia durante un periodo de 10 días. Se analizó la significación estadística (P) con el test de rango logarítmico bilateral desapareado. Los datos son representativos de los tres experimentos independientes.

FIG. 7 La inmunización de SpA^kkaaprotege los ratones contra la prueba de provocación con el aislado Mu50 de SARM resistente a la vancomicina. Se inmunizaron cohortes de ratones BALB/c con la estrategia inducción-refuerzo (prime boost) con SpA ^kkaao control con PBS/adyuvante (modelo). Cada animal fue infectado posteriormente mediante inyección intravenosa con una suspensión de 3 X 107 UFC de Mu50 de S. aureus. La carga estafilocócica, calculada como el log 10 UFC g-1, se determinó en tejidos renales homogeneizados 4 días a continuación de la infección. La significación estadística se calculó con la prueba T de Student bilateral desapareada y el valor P registrado.

FIGs. 8A-B Carencia de respuestas inmunes protectoras a infecciones estafilocócicas. FIG 8A La infección estafilocócica no genera inmunidad protectora. Se infectaron ratones BALB/c (n=10) con S. aureus Newman, o se sometieron a prueba de provocación con células sin infectar o mock (PBS) durante treinta días y la infección se eliminó con tratamiento con cloranfenicol. Ambas cohortes de animales se sometieron a una prueba de provocación con S. aureus Newman y la carga bacteriana (UFC) en el homogeneizado de tejido de riñón se analizó tras la necropsia en el día 4. Los datos son representativos de tres análisis independientes. En la Figura 8B la inmunización con IsdB no protege los ratones contra la prueba de provocación con S. aureus USA300 (LAC). Se inmunizaron ratones BALB/c (n=10) con IsdB (l0o |jg de IsdB emulsionado en CFA seguido de refuerzo con IFA/IsdB en el día 11), y se sometieron a prueba de provocación mediante inyección retroorbital con 5X106 UFC de S. aureus USA300 (LAC) en el día 21. Cuatro días después de la prueba de provocación, los riñones fueron extraídos durante la necropsia y se procedió al conteo de la carga estafilocócica por gramo de tejido homogeneizado mediante formación de colonias sobre placas de agar. En comparación con los animales inmunizados con células sin infectar o mock (PBS/adyuvante) con un valor 6,93 (±0,24) log10 UFC g-1, la vacuna con IsdB estuvo asociada con un valor 6,25 (±0,46) logl0 UFC g-1 y no generó una protección estadísticamente significativa (P=0,2138, prueba T de Student bilateral) de la prueba de provocación con USA300 (LAC). Los datos son representativos de tres análisis independientes.

FIG. 9 Comparación de formación de abscesos en ratones tratados con PBS, SpA, SpA-D y SpA-D^kkaa.

FIGs. 10A-10H Localización de protrombina, fibrinógeno, coagulasa (Coa), y proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) en abscesos estafilocócicos. Los ratones BALB/c infectados mediante inoculación intravenosa con 1 X 107 UFC de S. aureus Newman fueron sacrificados 5 días después de la infección. Se extrajeron los riñones, se incluyeron en parafina, se prepararon en secciones finas y se colorearon mediante inmunoquímica, utilizando anticuerpos (a) de conejo específicos para la protrombina de ratón (FIG. 10A, 10C), fibrinógeno/ fibrina de ratón (FIG. 10B, 10D), S. aureus Coa (FIG. 10E, 10G) o S. aureus vWbp (FIG. 10F, 10H). Las imágenes que se muestran son representativas de tres muestras de riñones. Los paneles FIG.

10C, 10D, 10G, y 10H ilustran la tinción de anticuerpos dentro de un único absceso analizado en forma de cuatro secciones secuenciales, aumentadas a partir de un área en los paneles FIG. 10A, 10B, 10E, y 10F que se define mediante el recuadro con márgenes blancos.

FIGs. 11A-11C Los mutantes de Staphylococcus aureus coa y vWbp muestran defectos en la coagulación sanguínea. (FIG. 11A) Diagrama que ilustra el producto de la traducción primaria de coa y vWbp que incluye el péptido señal (S), el dominio D1 y D2 de la unión a protrombina, un dominio de función desconocida, sitio de unión al factor de von Willebrand (vWF) en vWbp, y las repeticiones (R) de unión a fibrinógeno de Coa. Los números indican los residuos de aminoácidos. (FIG. 11B) Se examinaron sobrenadantes de cultivos de S. aureus Newman (tipo silvestre) o variantes isogénicas que carecen de coa (Acoa), vWbp (AvWbp) o ambos genes (Acoa, AvWbp) mediante inmunoblotting con anticuerpos específicos para Coa (aCoa) or vWbp (avWbp). Para estudios de complementación, los plásmidos que expresan los alelos de tipo silvestre de coa (pcoa) o vWbp (pvWbp) fueron electroporados en cepas estafilocócicas y posteriormente se analizaron mediante inmunoblotting. (FIG. 11C) La sangre de ratón tratada con lepirudina fue tratada con células mock o infectadas con S. aureus Newman o sus variantes de coagulasa isogénica, y se incubaron durante un periodo de hasta 48 horas a 25 °C. Los tubos se inclinaron para evaluar la coagulación. Los datos son representativos de cuatro determinaciones independientes.

FIGs. 12A-12R Las contribuciones de coa y vWbp a la supervivencia bacteriana en sangre y el S. aureus indujeron una bacteriemia letal de los ratones. (FIG. 12A) las cepas estafilocócicas Newman, Acoa, AvWbp o Acoa, AvWbp y las variantes complementadas se incubaron con sangre de ratón anticoagulada con lepirudina durante 30 minutos y se evaluó la supervivencia bacteriana mediante formación de colonias sobre placas de agar. Se generaron datos a partir de tres ensayos individuales. (FIG. 12B) Se inyectó en el plexo retroorbital de cohortes de 10 ratones 1X108 UFC de S. aureus Newman (tipo silvestre) además de Acoa, AvWbp o Acoa, AvWbp. Se registró la supervivencia animal en el tiempo durante 10 días. Al igual que en B, se dio a los ratones 1x107 UFC de cepas estafilocócicas Newman (FIG. 12C, E y K, M), AvWbp (FiG. 14D, F y M, L), Acoa (FIG. 14G, I y O, Q) o Acoa, AvWbp (FIG. 12H, J y P, R), cosechadas en los días 5 (FIG. 12C-J) o 15 (FIG. 12K-R) y evaluadas para determinar la carga bacteriana en el tejido renal (Tabla 7) y la formación de abscesos. Todos los datos de animales son representativos de dos experimentos independientes.

FIGs. 13A-13D Los anticuerpos contra Coa y vWbp bloquean la coagulación de la sangre mediante coagulasas estafilocócicas. (FIG. 13A) His6-Coa y His6-vWbp se purificaron por cromatografía de afinidad a partir de E. coli y se analizaron sobre SDS-PAGE con tinción de Coomassie. (FIG. 13B) Los anticuerpos de conejo generados contra His6-Coa o His6-vWbp se purificaron por afinidad y se analizaron mediante ensayo ELISA para determinar la reactividad inmune con coagulasas purificadas. Se realizó la media de los datos a partir de tres determinaciones experimentales independientes. (FIG. 13C) Se trató sangre de ratón tratada con lepirudina con PBS (mock), anticuerpos (aV10) irrelevantes o anticuerpos dirigidos contra Coa (aCoa), vWbp (avWbp) o ambas coagulasas both coagulases (aCoa/ avWbp) previamente a la infección con S. aureus Newman y la incubación durante 48 horas a 25°C. (FIG. 13D) Se trató sangre de ratón tratada con lepirudina con anticuerpos como anteriormente. Las muestras de sangre se incubaron a continuación con Coa o vWbp funcionalmente activos y se registró el tiempo de coagulación.

FIGs. 14A-14F Efectos biológicos de anticuerpos dirigidos contra coagulasas estafilocócicas. Medición por resonancia de plasmones de superficie de anticuerpos que altera la asociación entre Coa o vWbp y la protrombina o fibrinógeno. Se compararon las diferencias en la respuesta ante la adición de coagulasa (Coa) bien a la protrombina (FIG. 14A) o al fibrinógeno (FIG. 14B) con las diferencias en la respuesta en presencia de cantidades en aumento de anticuerpos (aCoa - 1:1, 1:2, 1:4, 1:8). Se compararon las diferencias en la respuesta ante la adición de vWbp bien a la protrombina (FIG. 16A) o al fibrinógeno (FIG. 14B) con las diferencias en la respuesta en presencia de cantidades en aumento de anticuerpos (avWbp - 1:1, 1:2, 1:4, 1:8). (FIG. 14E, F) Se incubó Coa o vWbp activo purificado en una relación molar de 1:1 con protrombina humana. Se evaluó la capacidad enzimática del complejo monitorizando la tasa de escisión de S-2238 (sustrato cromogénico sustituto de fibrinógeno, dado en exceso). El ensayo se repitió en presencia de anticuerpos específicos o cruzados añadidos en exceso de 3M y los datos se normalizaron al % de la actividad media sin inhibición. Los datos son una media de tres ensayos independientes.

FIG. 15 Contribución de los anticuerpos específicos de coagulasa a la supervivencia de ratones con bacteriemia estafilocócica. Veinticuatro horas antes de la infección, se inyectó en el peritoneo de ratones BALB/c (n=15) anticuerpos de conejo purificados (5 mg de anticuerpo/kg peso corporal). Los animales se sometieron a continuación a una prueba de provocación con 1 X 108 UFC de S. aureus Newman inyectadas en el plexo retroorbital y se monitorizaron para determinar su supervivencia. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

FIGs. 16A-16H La transferencia pasiva de anticuerpos de coagulasa confiere protección contra la formación de abscesos por S. aureus. Se inyectó una muestra mock experimental (PBS, FIG. 18A y 18C) o anticuerpos de conejo purificados dirigidos contra vWbp (avWbp, FIG. 18B y 18D), Coa (aCoa, FIG. 18E y 18G) o ambas coagulasas (aCoa / avWbp, FIG. 18F and 18H) en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c (n=10) y se analizaron títulos de anticuerpos mediante ensayo ELISA (Tabla 8). Los animales con inmunización pasiva fueron infectados inyectándoles 1 x 107 UFC de S. aureus Newman en el plexo retroorbital. Se determinó la carga bacteriana y la formación de abscesos tras necropsia en los riñones de animales que habían sido sacrificados cinco días después de la infección. Los tejidos renales se fijaron con paraformaldehído, se incluyeron en parafina, se prepararon en secciones finas, se colorearon con hematoxilina-eosina y se adquirieron imágenes de la histopatología mediante microscopía óptica. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

FIG. 17s A-H La inmunización con coagulasas protege a los ratones contra la formación de abscesos por S. aureus. Se inmunizaron ratones BALB/c (n=15) con 50 |jg de His6-Coa, His6-vWbp, His6-Coa y His6-vWbp o mock (PBS) emulsionado con adyuvante en el día 0 y 11 y se analizaron títulos de anticuerpos mediante ensayo ELISA en el día 21 (Tabla 8). En el día 21, se sometió a los animales a una prueba de provocación inyectando 1 x 107 UFC de S. aureus Newman en el plexo retroorbital. Se determinó la carga bacteriana y la formación de abscesos a continuación de la necropsia en los riñones de los animales que habían sido sacrificados cinco días después de la infección. Los tejidos renales se fijaron con paraformaldehído, se incluyeton en parafina, se prepararon en secciones finas, se colorearon con hematoxilina-eosina y se adquirieron imágenes de la histopatología mediante microscopía óptica. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

El Staphylococcus aureus es un comensal dela piel y los orificios nasales, y la causa principal de infecciones en la corriente sanguínea, la piel y tejidos blandos (Klevens et al., 2007). El reciente y drástico incremento en la mortalidad de las enfermedades estafilocócicas se atribuye a la propagación de las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (SARM) a menudo no susceptibles a los antibióticos (Kennedy et al., 2008). En un gran estudio retrospectivo, la incidencia de infecciones por SARM fue del 4,6% de todas las admisiones hospitalarias en los Estados Unidos (Klevens et al., 2007). Los costes del cuidado sanitario anual para 94.300 individuos infectados con una SARM en los Estados Unidos sobrepasan los 2,4 miles de millones de dólares (Klevens et al., 2007). El actual SARm epidémica ha precipitado una crisis en la salud pública que necesita ser afrontada mediante el desarrollo de una vacuna preventiva (Boucher and Corey, 2008). Hasta la fecha, no se encuentra disponible una vacuna licenciada por la FDA que prevenga enfermedades por S. aureus.

Los inventores describen en la presente patente el uso de la proteína A, una proteína de superficie anclada la pared celular de estafilococos, para la generación de variantes que puedan servir como vacunas subunitarias. La patogénesis de las infecciones estafilocócicas se inicia a medida que las bacterias invaden la piel o el torrente sanguíneo a través de un trauma, heridas quirúrgicas, o dispositivos médicos (Lowy, 1998). Aunque el patógeno invasor puede ser fagocitado y destruido, los estafilococos puede también escapar a las defensas inmunes naturales y sembrar infecciones en tejidos de los órganos, lo que induce a respuestas inflamatorias que atraen macrófagos, neutrófilos, y otros fagocitos (Lowy, 1998). La respuesta de invasión de las células inmunes en el sitio de la infección está acompañada por necrosis por licuefacción, ya que el huésped busca evitar la propagación estafilocócica y permite la eliminación de los restos de tejido necrótico (Lam et al., 1963). Tales lesiones pueden ser observadas mediante microscopía como áreas hipercelulares que contienen tejido necrótico, leucocitos, y un nido central de bacterias (Lam et al., 1963). A menos que los abscesos estafilocócicos se drenen quirúrgicamente y se traten con antibióticos, la infección diseminada y la septicemia producen un resultado letal (Sheagren, 1984).

III. Antígenos estafilocócicos

A. Proteína A estafilocócica (SpA)

Todas las cepas de Staphylococcus aureus expresan el gen estructural para la proteína A (spa) (Jensen, 1958; Said-Salim et al., 2003), un factor de virulencia bien caracterizado cuyo producto proteico (SpA) de superficie anclado a la pared celular abarca cinco dominios de unión a la inmunoglobulina sumamente homólogos denominados E, D, A, B, y C (Sjodahl, 1977). Estos dominios muestran ~ 80% de identidad a nivel de los aminoácidos, son de 56 a 61 residuos de longitud, y están organizados como repeticiones en tándem (Uhlen et al., 1984). La SpA se sintetiza como una proteína precursora con un péptido señal YSIRK/GS N-terminal y una señal de clasificación del motivo LPXTG C-terminal (DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992). La proteína A anclada a la pared celular se muestra en gran abundancia en la superficie estafilocócica (DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972). Cada uno de sus dominios de unión a inmunoglobulina está compuesto de hélices a anti-paralelas que se unen en un haz de tres hélices y se unen al dominio Fc de la inmunoglobulina G (IgG) (Deisenhofer, 1981; Deisenhofer et al., 1978), la cadena pesada de VH3 (Fab) de la IgM (es decir, el receptor de linfocitos B) (Graille et al., 2000), el factor de von Willebrand en su dominio A1 [vWF AI es un ligando para plaquetas] (O'Seaghdha et al., 2006) y el receptor I (TNFRI) del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) (Gomez et al., 2006), que se muestra sobre las superficies del epitelio de las vías respiratorias (Gomez et al, 2004; Gomez et al., 2007).

La SpA impide la fagocitosis de neutrófilos de estafilococos mediante su característica de unirse al componente Fc de la IgG (Jensen, 1958; Uhlen et al., 1984). Más aún, la SpA es capaz de activar la coagulación intravascular mediante su unión a los dominios AI del factor de von Willebrand (Hartleib et al., 2000). Las proteínas plasmáticas tales como el fibrinógeno y la fibronectina, actúan como puentes entre los estafilococos (CIfA y CIfB) y la integrina de plaquetas GPIIb/IIIa (O'Brien et al., 2002), una actividad que se complementa a través de la asociación de la proteína A con vWF AI, lo que permite a los estafilococos capturar las plaquetas a través del receptor de plaquetas GpIb-a (Foster, 2005; O'Seaghdha et al., 2006). La SpA también se une al TNFRI y esta interacción contribuye a la patogénesis de neumonía estafilocócica (Gomez et al., 2004). La SpA activa la señalización proinflamatoria a través de la activación de TRAF2 mediada por TNFR1, la quinasa p38/c-Jun, proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y el factor de transcripción Rel NF-KB. La unión a SpA además induce el shedding (del inglés despojarse o deshacerse) del TNFR1, una actividad que parece requerir la enzima de conversión del TNF (TACE) (Gomez et al., 2007). Todas las actividades de la SpA antes mencionadas están mediadas a través de sus cinco dominios de unión a la IgG y pueden ser alteradas por las mismas sustituciones de aminoácidos, inicialmente definidas por su requerimiento para la interacción entre la proteína A y la IgG1 humana (Cedergren et al., 1993).

La SpA además funciona como un superantígeno de linfocitos B capturando la región Fab de la IgM que porta VH3, el receptor de linfocitos B (Gomez et al., 2007; Goodyear et al., 2003; Goodyear y Silverman, 2004; Roben et al., 1995). A continuación de la prueba de provocación por vía intravenosa, las mutaciones de la proteína A estafilocócica (SpA) muestran una reducción en la carga estafilocócica en los tejidos de los órganos y reduce de forma drástica la capacidad de formar abscesos (descrita en la presente patente). Durante la infección con S. aureus de tipo silvestre, los abscesos se forman dentro de un periodo de 48 horas y se pueden detectar mediante microscopía óptica de tejido renal seccionado en secciones finas y coloreado con hematoxilina-eosina, inicialmente marcado por un influjo de leucocitos polimorfonucleares (PMNs). En el día 5 de la infección, los abscesos aumentan de tamaño y encierran una población central de estafilococos, rodeada por una capa de material amorfo eosinofílico y una gran masa de PMNs. La histopatología reveló una necrosis masiva de PMNs en la proximidad del nido estafilocócico en el centro de las lesiones de abscesos además de una capa de fagocitos saludables. Los inventores además observaron un borde de PMNs necróticos en la periferia de lesiones de abscesos, bordeando la pseudocápsula eosinofílica que separaba el tejido renal saludable de la lesión infecciosa. Las variantes estafilocócicas que carecen de la proteína A no son capaces de establecer las características de la histopatología de los abscesos y se eliminan durante la infección.

En estudios previos, Cedergren et al. (1993) realizaron por ingeniería genética cinco sustituciones individuales en el subdominio de unión al fragmento Fc del dominio B de SpA, L17D, N28A, 131A y K35A. Estos autores crearon estas proteínas para someter a ensayo los datos recopilados de una estructura tridimensional de un complejo entre un dominioi de SpA y Fc1. Cedergren et al. determinaron los efectos de estas mutaciones sobre la estabilidad y la unión, pero no contemplaron el uso de dichas sustituciones para la producción de un antígeno para vacuna.

Brown et al. (1998) describe estudios diseñados para realizar por ingeniería genética proteínas basadas en SpA que permitan el uso de condiciones de elución más favorables cuando se utilizan como ligandos de afinidad. Las mutaciones estudiadas incluían mutaciones únicas de Q13A, Q14H, N15A, N15H, F17H, Y18F, L21H, N32H, o K39H. Brown et al. describen que las sustituciones de Q13A, N15A, N15H, y N32H supusieron una pequeña diferencia con los valores constantes de disociación y que la sustitución de Y18F dio como resultado un aumento de 2 veces en la afinidad de unión en comparación con la SpA de tipo silvestre. Brown et al. también describen que las sustituciones de L21H y F17H reducen la afinidad de unión en cinco veces y cien veces respectivamente. Los autores también estudiaron sustituciones análogas en dos dominios en tándem. Por tanto, los estudios de Brown et al. estaban dirigidos a generar una SpA con un perfil de elución más favorable, por tanto el uso de las sustituciones de His para proporcionar una modificación sensible al pH en la afinidad de unión. Brown et al. no se pronuncia sobre el uso de SpA como un antígeno para vacuna.

Graille et al. (2000) describen una estructura cristalina del dominio D de la SpA y el fragmento Fab de un anticuerpo de IgM humano. Graille et al. definen mediante análisis de una estructura cristalina los residuos de aminoácidos del dominio D que interactúan con el fragmento Fab como los residuos Q26, G29, F30, Q32, S33, D36, D37, Q40, N43, E47, o L51, además de los residuos de aminoácidos que forman la interfaz entre los subdominios del dominio D. Graille et al. definen las interacciones moleculares de estas dos proteínas, pero no se pronuncian en referencia a cualquier uso de sustituciones en los residuos que interactúan en la producción de un antígeno de vacuna.

O'Seaghdha et al. (2006) describe estudios dirigidos a dilucidar qué subdominio del dominio D se une a vWF. Los autores generaron únicas mutaciones bien en los subdominios de unión a Fc o a VH3, es decir, los residuos de aminoácidos F5A, Q9A, Q10A, F13A, Y14A, L17A, N28A, I31A, K35A, G29A, F30A, S33A, D36A, D37A, Q40A, E47A, o Q32A. Los autores descubrieron que el vWF se une al mismo subdominio que se une a Fc. O'Seaghda et al. define el subdominio del dominio D como responsable de la unión a vWF, pero no se pronuncia con respecto a cualquier uso de sustituciones en los residuos que interactúan en la producción de un antígeno de vacuna.

Gomez et al. (2006) describen la identificación de residuos responsable de la activación del TNFR1 utilizando únicas mutaciones de F5A, F13A, Y14A, L17A, N21A, 131A, Q32A, y K35A. Gomez et al. no se pronuncia con respect a cualquier uso de sustituciones en los residuos que interactúan en la producción de un antígeno de vacuna.

La proteína A recombinante con etiquetas de afinidad, un polipéptido que abarca los cinco dominios de la IgG (EDCAB) (Sjodahl, 1977) pero que carece de la región X C-terminal (Guss et al., 1984), se purificó de E. coli recombinante y se utilizó como un antígeno para vacuna (Stranger-Jones et al., 2006). Debido a la propiedad de la SpA de unirse a la porción Fc de la IgG, no puedo medirse una respuesta inmune humoral específica a la proteína A (Stranger-Jones et al., 2006). Los inventores han sobrepasado este obstáculo a través de la generación de SpA-DQ9,10K;D36,37A. Los ratones BALB/c inmunizados con la proteína A recombinante (SpA) mostraron una protección significativa contra la prueba de provocación por vía intravenosa con cepas de S. aureus: una reducción logarítmica de 2,951 en la carga estafilocócica en comparación con el tipo silvestre (P > 0,005; prueba T de Student) (Stranger-Jones et al., 2006). Los anticuerpos específicos de SpA pueden causar un aclaramiento fagocítico previo a la formación de abscesos de la barrera eosinofílica mencionada anteriormente en los abscesos que separan las comunidades estafilocócicas de las células inmunes, ya que estas no se forman durante la infección con las cepas de mutantes de la proteína A. Cada uno de los cinco dominios de la SpA (es decir, dominios formados a partir de haces de tres hélices denominados E, D, A, B, y C) ejerce propiedades de unión similares (Jansson et al., 1998). La estructura cristalina y en solución del dominio D se ha solucionado con y sin los ligandos Fc y VH3 (Fab), los cuales se unen a la proteína A de forma no competitiva en sitios distintos (Graille et al., 2000). Las mutaciones en los residuos que se sabe están implicados en la unión a IgG (FS, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 131 y K35), también se requieren para la unión de vWF AI y TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006; O'Seaghdha et al., 2006), mientras que los residuos importantes para la interacción de VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) parecen no tener impacto sobre las otras actividades de unión (Graille et al., 2000; Jansson et al., 1998). La SpA establece como diana específicamente un subconjunto de linfocitos B que expresa IgM relacionada con la familia VH3 en su superficie, es decir, receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Ante la interacción con SpA, estos linfocitos B proliferan y se destinan a la apoptosis, lo que conduce a una deleción preferencial y prolongada de los linfocitos B de tipo innatos (es decir, los linfocitos B de la zona marginal y los linfocitos B2 foliculares) (Goodyear et al., 2003; Goodyear et al., 2004).

Base molecular de la función y presentación de la superficie de la proteína A . La proteína A se sintetiza como precursor en el citoplasma bacteriano y secretada a través de su péptido señal YSIRK en su pared transversal, es decir, el septo de división celular de los estafilococos (FIG. 1) (DeDent et al., 2007; De Dent et al., 2008). Después de la escisión de la señal de clasificación LPXTG C-terminal, la proteína A se encuentra anclada a puentes transversales del péptidoglicano bacteriano mediante sortasa A (Mazmanian et al., 1999; Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 2000). La proteína A es la proteína de superficie más abundante de los estafilococos; la molécula es expresada por prácticamente todas las cepas de S. aureus (Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008; Said-Salim et al., 2003). Los estafilococos giran alrededor de un 15-20% de su pared celular por ciclo de división (Navarre and Schneewind, 1999). Las hidrolasas murinas cortan las cadenas de glicano y los péptidos de pared del péptidoglicano, liberando de este modo la proteína A con su tetrapéptido disacárido de la pared celular C-terminal hacia el medio extracelular (Ton-That et al., 1999). Por tanto, mediante su diseño fisiológico, la proteína A es anclada a la pared celular y mostrada sobre la superficie bacteriana, pero también se libera hacia los tejidos circundantes durante la infección del huésped (Marraffini et al., 2006).

La proteína A captura inmunoglobulinas en la superficie bacteriana y esta actividad bioquímica permite el escape estafilocócico de las respuestas inmunes innatas y adquiridas del huésped (Jensen, 1958; Goodyear et al., 2004). De manera interesante, la región X de la proteína A (Guss et al., 1984), un dominio de repetición que une los dominios de unión a IgG a la señal de clasificación LPXTG / anclaje a la pared celular, es quizás la porción más variable del genoma estafilocócico (Said-Salim, 2003; Schneewind et al., 1992). Cada uno de los cinco dominios de unión a la inmunoglobulina de la proteína A (SpA), formados a partir de haces de tres hélices y denominados E, D, A, B, y C, ejerce propiedades funcionales y estructurales similares (Sjodahl, 1977; Jansson et al., 1998). La estructura cristalina y en solución del dominio D se ha resuelto con y sin los ligandos Fc y V^h3 (Fab), los cuales se unen a la proteína A de una forma no competitiva en distintos sitios (Graille 2000).

En el complejo de estructura cristalina, la región Fab interactúa con la hélice II y la hélice III del dominio D a través de una superficie compuesta de cuatro cadenas p de la región VH (Graille 2000). El eje mayor de la hélice II del dominio D es de aproximadamente 50° con respecto a la orientación de las cadenas, y la porción interhelicoidal del dominio D es la más proximal con respecto a la cadena C0. El sitio de interacción en Fab se encuentra apartado de la región constante de la cadena pesada y la cadena ligera de la Ig. La interacción implica los siguientes residuos del dominio D: Asp-36 de la hélice II, Asp-37 y Gln-40 en el bucle entre la hélice II y la hélice II y otros residuos diversos (Graille 2000). Ambas superficies interactuantes están compuestas predominantemente de cadenas laterales polares, con tres residuos de carga negativa en el dominio D y dos residuos de carga positiva en la Fab 2A2 sumergida por la interacción, lo que proporciona una atracción electroestática global entre las dos moléculas. De las cinco interacciones polares identificadas entre Fab y el dominio D, tres son entre cadenas laterales. Se forma un puente de sal entre Arg-H19 y Asp-36 y se realizan dos enlaces de hidrógeno entre Tyr-H59 y Asp-37 y entre Asn-H82a y Ser-33. Debido a la conservación de Asp-36 y Asp-37 en todos los cinco dominios de unión a IgG de la proteína A, los inventores mutaron estos residuos.

Los sitios SpA-D responsables de la unión a Fab se encuentran estructuralmente separados de la superficie del dominio que hace de mediador en la unión a Fcy. La interacción de Fcy con el dominio D implica principalmente a los residuos en la hélice I, con una menor implicación de la hélice II (Gouda et al., 1992; Deisenhofer, 1981). Con la excepción de la Gln-32, un contacto de poca importancia en ambos complejos, ninguno de los residuos que hacen de mediadores en la interacción de Fcy, están implicados en la unión a Fab. Para examinar la relación espacial entre estos diferentes sitios de unión a Ig, los dominios de SpA en estos complejos han sido superpuestos para construir el modelo de un complejo entre Fab, el dominio D de SpA, y la molécula Fcy. En este modelo ternario, Fab y Fcy forman una estructura tipo sándwich alrededor de caras opuestas de la hélice II sin evidencia de impedimento estérico de ninguna de las interacciones. Estas observaciones ilustran cómo, a pesar de su pequeño tamaño (es decir, 56-61 aa), un dominio de la SpA puede mostrar simultáneamente ambas actividades, lo que explica la evidencia experimental de que las interacciones de Fab con un dominio individual son no-competitivas. Los residuos para la interacción entre SpA-D y Fcy son Gln-9 y Gln-10.

En contraste, la ocupación de la porción Fc de la IgG en el dominio D bloquea su interacción con el vWF A1 y probablemente también el TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006). Las mutaciones en los residuos esenciales para la unión a Fc de la IgG (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 y K35) también se requieren para la unión al vWF A1 y al TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006; Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006), mientras que los residuos de vital importancia para la interacción con VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, n 43, E47) no tienen impacto alguno en las actividades de unión de la Fc, el vW f A1 o el TNFR1 de la IgG (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). La actividad de unión a Fab de la inmunoglobulina de la proteína A establece como diana un subconjunto de linfocitos B que expresan IgM relacionado con la familia V^h3 en su superficie, es decir, estas moléculas funcionan como receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Ante la interacción con la SpA, estos linfocitos B proliferan rápidamente y a continuación se destinan a la apoptosis, lo que conduce a una deleción preferencial y prolongada de los linfocitos B de tipo innato (es decir, linfocitos B de la zona marginal y linfocitos B2 foliculares) (Goodyear y Silverman, 2004; Goodyear y Silverman, 2003). Más del 40% de los linfocitos B circulantes son la diana de la interacción de la proteína A, y la familia V^h3 representa la familia más grande de receptores de linfocitos B humanos que imparten respuestas humorales protectoras contra patógenos (Goodyear y Silverman, 2004; Goodyear y Silverman, 2003). Por tanto, la proteína A funciona de forma análoga a los superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), a pesar de que esta última clase de moléculas, por ejemplo, SEB, TSST-1, TSST-2, forman complejos con el receptor de linfocitos T para estimular inadecuadamente las respuestas inmunes del huésped y provocando de ese modo características de enfermedad típicas de las infecciones estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Estas observaciones en conjunto documentan las contribuciones de la proteína A en cuanto a establecer infecciones estafilocócicas y modular las respuestas inmunes del huésped.

En resumen, puede verse que los dominios de la proteína A muestran dos interfaces diferentes para la unión con moléculas hospedadoras, y cualquier desarrollo de vacunas a base de proteína A debe considerar la generación de variantes que no perturben la señalización de la célula hospedadora, la agregación de plaquetas, secuestro de inmunoglobulinas o la inducción de la proliferación y apoptosis de linfocitos B. Tales variantes de la proteína A deberían además ser de utilidad a la hora de analizar las vacunas para determinar la capacidad de generar anticuerpos que bloqueen las actividades de la SpA mencionadas anteriormente y ocupar los cinco dominios de repetición en sus interfaces de unión doble. Este objeto se expresa y se aplica en la presente por primera vez y se describen en detalle métodos para la generación de variantes de la proteína A que pueden ser utilizados como una vacuna segura para humanos. Para alterar la unión de Fcy, vWF AI y TNFR1 a la IgG, se mutaron la glutamina (Q) 9 y la 10 [numeración obtenida a partir del dominio D de la SpA tal como se describe en Uhlen et al., 1984], y se generaron sustituciones de lisina para ambas glutaminas esperando que éstas supriman las propiedades del ligando en la primera interfaz de unión. Para alterar la unión de Fab VH3 a la IgM, se mutaron el aspartato (D) 36 y el 37, cada uno de los cuales se requiere para la asociación con el receptor del linfocito B. El D36 y el D37 fueron ambos sustituidos con alanina. Las mutaciones Q9,10K y D36,37A se combinan aquí en la molécula recombinante SpA-DQ9,10K-;D36,37A y se prueban para determinar las propiedades de unión de la proteína A. Además, las SpA-D y SpA-DQ9,10K;D36,37A están sujetas a estudios de inmunización en ratones y conejos y se analizan para determinar [1] la producción de anticuerpos específicos (SpA-D Ab); [2] la capacidad de la SpA-D Ab de bloquear la asociación entre la proteína A y sus cuatro ligandos diferentes; y, [3] als propiedades de la SpA-D Ab para generar inmunidad protectora contra infecciones estafilocócicas. (Ver la sección de Ejemplos más adelante).

B. Coagulasas estafilocócicas

Las coagulasas son enzimas producidas por bacterias Staphylococcus que convierten el fibrinógeno en fibrina. La Coa y vWh activan la protrombina si proteólisis (Friedrich et al., 2003). El complejo coagulasa-protrombina reconoce el fibrinógeno como un sustrato específico, convirtiéndolo directamente en fibrina. La estructura cristalina del complejo activo reveló las uniones de los dominios D1 y D2 a la protrombina y la inserción de su Ile1-Val2 N-terminal en la cavidad lle16, lo que induce un sitio activo funcional en el zimógeno a través de un cambio conformacional (Friedrich et al., 2003). El exositio I de la a-trombina, el sitio de reconocimiento del fibrinógeno, y el proexositio I en la protrombina son bloqueados por el D2 de la Coa (Friedrich et al., 2003). No obstante, la asociación del complejo tetramérico (Coaprotrombina)²se une al fibrinógeno en un nuevo sitio con una elevada afinidad (Panizzi et al., 2006). Este modelo explica las propiedades coagulantes y la eficaz conversión del fibrinógeno por parte de la coagulasa (Panizzi et al., 2006).

El fibrinógeno es una glicoproteína grande (Mr -340.000), formada por tres pares de cadenas Aa-, Bp-, y y-enlazadas de forma covalente para formar un “dímero de trímeros”, donde A y B designan los fibrinopéptidos liberados por el corte de trombina (Panizzi et al., 2006). La molécula alargada se pliega en tres dominios separados, un fragmento E central que contiene los extremos N-terminal de todas las seis cadenas y dos fragmentos D flanqueadores formados principalmente por los extremos C-terminal de las cadenas Bp- y y-. Estos dominios globulares están conectados por estructuras helicoidales triples grandes. Los complejos de coagulasa-protrombina, que convierten el fibrinógeno humano en la fibrina autopolimerizante, no son la diana de los inhibidores de trombina circulante (Panizzi et al., 2006). Por tanto, las coagulasas estafilocócicas se desvían de la vía fisiológica de coagulación de la sangre.

Todas las cepas de S. aureus secretan coagulasa y vWbp (Bjerketorp et al., 2004; Field y Smith, 1945). Aunque en trabajos previos se describían importantes contribuciones de la coagulasa a la patogénesis de las infecciones estafilocócicas (Ekstedt y Yotis, 1960; Smith et al., 1947), investigaciones más recientes con herramientas de genética molecular retaron este punto de vista observando fenotipos sin virulencia con modelos de endocarditis, abscesos de la piel y mastitis en ratones (Moreillon et al., 1995; Phonimdaeng et al., 1990). Generando variantes isogénicas de S. aureus Newman, un aislado clínico completamente virulento (Duthie et al., 1952), se describe en la presente patente que los mutantes de coa de hecho muestran defectos de virulencia en un modelo de bacteriemia letal y absceso renal en ratones. Bajo la experiencia de los inventores, el S. aureus 8325-4 no es completamente virulento, y se presupone que las lesiones mutágenas en esta cepa pueden no ser capaces de revelar defectos de virulencia in vivo. Más aún, los anticuerpos generados contra la Coa o el vWbp alteran la patogénesis de las infecciones por S. aureus Newman hasta el grado de ser un reflejo del impacto de las deleciones de genes. Coa y vWbp contribuyen a la formación de abscesos estafilocócicos y bacteriemia letal y pueden funcionar como antígenos protectores en vacunas subunitarias.

Estudios bioquímicos documentan el valor biológico de los anticuerpos contra Coa y vWbp. Uniéndose al antígeno y bloqueando su asociación con factores de coagulación, los anticuerpos evitan la formación de complejos Coaprotrombina y vWbp-protrombina. Estudios de transferencia pasiva revelaron la protección de animales experimentales contra la formación de abscesos estafilocócicos y la prueba de provocación letal mediante anticuerpos de Coa y vWbp. Por tanto, los anticuerpos que neutralizan Coa y vWbp generan protección inmune contra la enfermedad estafilocócica.

Estudios anteriores revelaron la necesidad de coagulasa para resistir la fagocitosis en sangre (Smith et al., 1947) y los inventores observaron un fenotipo similar para los mutantes de Acoa en sangre de ratón tratada con lepirudina (ver Ejemplo 3 más adelante). Debido a que el vWbp presenta una mayor afinidad con la protrombina humana que su equivalente en ratones, se sospecha que puede ocurrir lo mismo para las variantes de AvWbp en la sangre humana. Además, la expresión de Coa y vWbp en lesiones de abscesos, además de su sorprendente distribución en la pseudocápsula eosinofílica que le rodea (las comunidades de abscesos estafilocócicos (SACs) o la pared de fibrina periférica, sugieren que las coagulasas secretadas contribuyen al establecimiento de estas lesiones. Esta hipótesis se sometió a prueba y, de hecho, los mutantes de Acoa resultaron defectuosos en el establecimiento de abscesos. Una prueba correspondiente, bloqueando la función de la Coa con anticuerpos específicos, produjo el mismo efecto. En consecuencia, se propone que la coagulación de la fibrina es un hecho de vital importancia en el establecimiento de abscesos estafilocócicos que puede establecerse como diana para el desarrollo de vacunas protectoras. Debido a su función de superposición en la protrombina humana, tanto la Coa como el vWbp se consideran candidatos excelentes para el desarrollo de vacunas.

C. Otros antígenos estafilocócicos

Las investigaciones a lo largo de diversas décadas pasadas han identificado las exotoxinas de S. aureus, las proteínas de superficie y las moléculas reguladoras como importantes factores de virulencia (Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003). Se ha logrado un gran avance en cuanto a la regulación de estos genes. Por ejemplo, los estafilococos llevan a cabo un censo bacteriano a través de la secreción de péptidos autoinductores que se unen a un receptor afín en una concentración umbral, activando de ese modo una reacción phosphorelay (reacciones múltiples de fosfotransferencia) y la activación de la transcripción de muchos de los genes de la exotoxina (Novick, 2003). La patogénesis de las infecciones estafilocócicas se basa en estos factores de virulencia (exotoxinas secretadas, exopolisacáridos y adhesinas de superficie). El desarrollo de vacunas estafilocócicas se ve dificultado por la naturaleza multifacética de los mecanismos de invasión estafilocócica. Está bien establecido que los micro-organismos vivos atenuados son vacunas sumamente efectivas; las respuestas inmunes provocadas por tales vacunas son a menudo de mayor magnitud y de mayor duración que las producidas por inmunógenos no replicantes. Una explicación para este hecho puede ser que las cepas vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el huésped e imitan los estados tempranos de la infección natural. Las realizaciones de la invención están dirigidas a composiciones y métodos que incluyen polipéptidos y péptidos de la variante de SpA, además de otras proteínas, polipéptidos y péptidos extracelulares inmunogénicos (incluyendo tanto péptidos o proteínas secretadas como de la superficie celular), de bacterias gram positivas para su uso en la mitigación o inmunización contra la infección. En modos de realización en particular la bacteria es una bacteria estafilococo. Las proteínas, polipéptidos o péptidos extracelulares, incluyen, pero no se limitan a, proteínas secretadas y de la superficie celular de las bacterias establecidas como diana.

El patógeno humano S. aureus secreta EsxA y EsxB, dos proteínas similares a ESAT-6, a través de la envoltura bacteriana (Burts et al., 2005, que se incorpora en la presente patente a modo de referencia). Las esxA y esxB estafilocócicas se agrupan con otros seis genes en el orden de transcripción: esxA esaA essA esaB essB essC esaC esxB. Los acrónimos esa, ess, y esx representan accesorios de secreción, sistema de secreción o secreción extracelular de ESAT-6, respectivamente, dependiendo de si las proteínas codificadas juegan un papel accesorio (esa) o directo (ess) para la secreción, o si son segregadas en un el medio extracelular (esx). En la presente patente se hace referencia al grupo entero de ocho genes como el grupo Ess. EsxA, esxB, essA, essB, y essC son todos necesarios para la síntesis o secreción de EsxA y EsxB. Los mutantes que no producen EsxA, EsxB, y EssC presentan defectos en al patogénesis de abscesos murinos de S. aureus, lo que sugiere que este sistema de secreción especializado puede ser una estrategia general de la patogénesis bacteriana humana. Se ha descrito la secreción de sustratos no-WXG100 por parte de la vía de ESX-1 para diversos antígenos incluyendo EspA, EspB, Rv3483c, y Rv3615c (Fortune et al., 2005; MacGurn et al., 2005; McLaughlin et al., 2007; Xu et al., 2007). También se ha mostrado que la vía alternativa de ESX-5 secreta tanto proteínas WXG100 como no-WXG100 en micobacterias patogénicas (Abdallah et al., 2007; Abdallah et al., 2006).

La vía Ess del Staphylococcus aureus puede verse como un módulo de secreción equipado con componentes de transporte especializados (Ess), factores accesorios (Esa) y sustratos de secreción afines (Esx). EssA, EssB y EssC se requieren para la secreción de EsxA y EsxB. De bido a que se prevé que son proteínas transmembrana, se contempla que estas proteínas forman un aparato de secreción. Algunas de las proteínas en este grupo de genes ess pueden transportar de forma activa sustratos segregados (actuando como un motor) mientras que otras pueden regular el transporte (regulador). La regulación puede lograrse, pero sin necesidad de estar limitado a ello, mediante mecanismos de transcripción o post-traducción para polipéptidos secretados, clasificación de sustratos específicos para localizaciones definidas (por ejemplo, medio extracelular o células hospedadoras), o seguimiento del tiempo de los eventos de secreción durante la infección. En este punto, no está claro si todas las proteínas Esx secretadas funcionan como toxinas o contribuyen indirectamente a la patogénesis.

Los estafilococos dependen de la adhesión mediada por las proteínas de superficie a las células hospedadoras o de la invasión de tejidos como una estrategia para escapar de las defensas inmunes. Además, el S. aureus utiliza las proteínas de superficie para secuestrar hierro del huésped durante la infección. La mayoría de las proteínas de superficie implicadas en la patogénesis estafilocócica portan señales de clasificación C-terminales, es decir, están enlazadas de forma covalente a la envoltura de la pared celular mediante la sortasa. Además, las cepas estafilocócicas que carecen de los genes requeridos para el anclaje de las proteínas de superficie, es decir, sortasa A y B, presentan una espectacular deficiencia de virulencia en diversos modelos diferentes de enfermedad en ratón. Por tanto, los antígenos de las proteínas de superficie representan una diana para vacuna validada, ya que los genes correspondientes son esenciales para el desarrollo de la enfermedad estafilocócica y pueden ser explotados en diversos modos de realización de la invención. La superfamilia sortasa de enzimas son transpeptidasas gram-positivas responsables del anclaje de los factores de virulencia de las proteínas de superficie a la capa del peptidoglicano de la pared celular. Se han identificado dos isoformas de la sortasa en el Staphylococcus aureus, la SrtA y SrtB. Se ha mostrado que estas enzimas reconocen el motivo LPXTG en las proteínas sustrato. La isoforma SrtB parece ser importante en la adquisición del hierro hémico y la homeostasis del hierro, mientras que la isoforma SrtA juega un papel de vital importancia en la patogénesis de las bacterias gram-positivas modulando la capacidad de la bacteria para adherirse al tejido del huésped a través del anclaje covalente de adhesinas y otras proteínas a al peptidoglicano de la pared celular. En determinados modos de realización las variantes de SpA descritas en la presente patente pueden ser utilizadas en combinación con otras proteínas estafilocócicas tales como las proteínas Coa, Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsaB, EsxA, EsxB, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC, SasF, vWbp, y/o vWh.

Determinados aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones en referencia a composiciones proteicas que incluyen polipéptidos, péptidos o ácidos nucleicos que codifican una variante o variantes de SpA y otros antígenos estafilocócicos tales como otras proteínas transportadas por la vía Ess, o sustratos de sortasa. Estas proteínas pueden ser modificadas por deleción, inserción, y/o sustitución.

Los polipéptidos Esx incluyen la secuencia de aminoácidos de las proteínas Esx de las bacterias en el género Staphylococcus genus. La secuencia Esx puede ser de una especie de estafilococo en particular, tal como el Staphylococcus aureus, y puede proceder de una cepa en particular, tal como por ejemplo la Newman. En determinadas realizaciones, la secuencia de EsxA es SAV0282 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma utilizando el Número de Accesión del Genbank Q99WU4 (gi|68565539). En otras realizaciones, la secuencia de EsxB es SAV0290 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma utilizando Número de Accesión del Genbank Q99WT7 (gi|68565532). En realizaciones adicionales, pueden utilizarse otros polipéptidos transportados por la vía Ess, las secuencias de las cuales pueden ser identificadas por un experto en el arte utilizando bases de datos y recursos accesibles a través de Internet.

Los polipéptidos sustrato de la sortasa incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de aminoácidos de las proteínas SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC o SasF delas bacterias en el género Staphylococcus. La secuencia del polipéptido sustrato de la sortasa puede ser de una especie de staphylococcus en particuar, tal como el Staphylococcus aureus, y puede proceder de una cepa en particular, tal como por ejemplo la Newman. En determinadas realizaciones, la secuencia de SdrD procede de la cepa N315 y se puede acceder a la misma utilizando el Número de Accesión del Genbank NP_373773.1 (gi|15926240). En determinadas realizaciones, la secuencia de SdrE procede de la cepa N315 y se puede acceder a la misma utilizando el Número de Accesión del Genbank NP_373774.1 (gi|15926241). En determinadas realizaciones, la secuencia de IsdA es SAV1130 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma utilizando el Número de Accesión del Genbank NP_371654.1 (gi|15924120). En otras realizaciones, la secuencia de IsdB es SAV1129 de la cepa Mu50 (que es la misma secuencia de aminoácidos para Newman) y se puede acceder a la misma utilizando el Número de Accesión del Genbank NP_371653.1 (gi|15924119). En realizaciones adicionales, pueden utilizarse otros polipéptidos transportados por la vía Ess o procesados por la sortasa, cuyas secuencias pueden ser identificadas por un experto en el arte utilizando bases de datos y recursos accesibles a través de internet.

Pueden identificarse ejemplos de diversas proteínas que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención mediante el análisis de los registros de bases de datos de genomas bacterianos, incluyendo pero sin limitarse a, los números de accesión NC_002951 (GI:57650036, y CP000046 de GenBank), NC_002758 (GI:57634611, y BA000017 de GenBank), NC_002745 (GI:29165615, y BA000018 de GenBank), NC_003923 (GI:21281729, y BA000033 de GenBank), NC_002952 (GI:49482253, y BX571856 de GenBank), NC_002953 (GI:49484912, y BX571857 de GenBank), NC_007793 (GI:87125858, y CP000255 de GenBank), NC_007795 (GI:87201381, y CP000253 de GenBank).

Tal como se utiliza en la presente patente, una “proteína” o “polipéptido” hace referencia a una molécula que comprende al menos diez residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, se emplea una versión de tipo silvestre de una proteína o polipéptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la invención se emplea una proteína o polipéptido modificados para generar una respuesta inmune. Los términos descritos anteriormente pueden ser utilizados indistintamente. Una “proteína modificada” o “un polipéptido modificado” o una “variante” hacen referencia a una proteína o polipéptido cuya estructura química, en particular su secuencia de aminoácidos, se encuentra alterada con respecto a la proteína o polipéptido de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una proteína o polipéptido modificado/variante tiene al menos una actividad o función modificada (reconociendo que las proteínas o los polipéptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). Se contempla específicamente que una proteína o polipéptido modificado/variante puede estar alterado con respecto a una actividad o función y aun así mantener una actividad o función de tipo silvestre en otros aspectos, tal como la inmunogenicidad.

En determinadas realizaciones el tamaño de una proteína o polipéptido (de tipo silvestre o modificado) puede comprender, pero no está limitado a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,-69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000,1100, 1200,1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 moléculas amino o más, y cualquier rango que pueda obtenerse en las mismas, o derivado de una secuencia de aminoácidos correspondiente descrita o referenciada en la presente patente. Se contempla que los polipéptidos pueden ser mutados por truncamiento, haciéndolas más pequeñas que su forma de tipo silvestre correspondiente, pero además podrían ser alteradas fusionando o conjugando una secuencia de proteínas heteróloga con una función en particular (por ejemplo, para su fijación como diana o localización, para el aumento de inmunogenicidad, para propósitos de purificación, etc.).

Tal como se utiliza en la presente patente, una “amino molécula”, hace referencia a cualquier aminoácido, derivado de aminoácidos, o imitador de aminoácidos conocido en el arte. En determinadas realizaciones, los residuos de la molécula proteica son secuenciales, sin que ninguna molécula interrumpa la secuencia de los residuos de la amino molécula. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender una o más fracciones de moléculas no amino. En realizaciones en particular, la secuencia de residuos de la molécula proteica puede ser interrumpida por una o más fracciones de moléculas no amino.

Por consiguiente, el término “composición proteica” abarca secuencias de amino moléculas que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes en las proteínas sintetizas naturalmente, o al menos un aminoácido modificado o no habitual.

Las composiciones proteicas pueden realizarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en el arte, incluyendo (i) la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas biológicas moleculares estándar, (ii) el aislamiento de compuestos proteicos a partir de fuentes naturales, o (iii) la síntesis química de materiales proteicos. Se han revelado las secuencias de nucleótidos además de las de proteínas, polipéptidos y péptidos para varios genes, y pueden encontrarse en bases de datos informatizadas reconocidas. Una base de datos de este tipo es la base datos Genbank y la GenPept del “National Center for Biotechnology Information” (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) (en la World Wide Web en la dirección ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones de codificación para estos genes puede ser amplificadas y/o expresadas utilizando las técnicas reveladas en la presente patente o como será conocido para los expertos de práctica habitual en el arte.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de SpA, coagulasas y otros polipéptidos de la invención pueden ser variantes sustitutivas, insercionales, o de deleción. Una variación en un polipéptido de la invención puede afectar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, o más aminoácidos contiguos o no contiguos del polipéptido, en comparación con el tipo silvestre. Una variante puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, o 90%, incluyendo todos los valores y rango entre los mismos, idéntica a cualquier secuencia proporcionada o referenciada en la presente patente, por ejemplo, SEQ ID NO:2-8 o SEQ ID NO:11-30. Una variante puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más aminoácidos sustitutos. Se contemplan para su uso en las composiciones y métodos descritos en la presente patente, un polipéptido procesado o secretado por la vía Ess o por otras proteínas de superficie (ver Tabla 1) o sustratos de sortasa de cualquier especie y cepa de estafilococo.

Las variantes de deleción carecen habitualmente de uno o más residuos de la proteína nativa o de tipo silvestre. Pueden eliminarse los residuos individuales, o pueden eliminarse un número de aminoácidos contiguos. Puede introducirse un codón de terminación (mediante sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico de codificación para generar una proteína truncada. Los mutantes insercionales implican habitualmente la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido. Esto puede incluir la inserción de uno o más residuos. Pueden también generarse adiciones terminales, denominadas proteínas de fusión. Estas proteínas de fusión incluyen multímeros o concatámeros de uno o más péptidos o polipéptidos descritos o referenciados en la presente patente.

Las variantes sustitutivas habitualmente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se reemplaza con otro de forma y carga similar. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina por serina; arginina por lisina; asparagina por glutamina o histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparagina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparagina o glutamina; isoleucina por leucina o valina; leucina por valina o isoleucina; lisina por arginina; metionina por leucina o isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina o metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptófano to tirosina; tirosina por triptófano o fenilalanina; y valina por isoleucina o leucina. De manera alternativa, las sustituciones pueden no ser conservadoras de tal manera que se ve afectada una función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservadores implican habitualmente la sustitución de un residuo con uno que sea químicamente no similar, tal como un aminoácido polar o con carga por un aminoácido no polar o sin carga, y vice versa.

Tabla 1. Ejemplos de proteínas de superficie de cepas de S. aureus

Las proteínas de la invención pueden ser recombinantes, o sintetizarse in vitro. De manera alternativa, una proteína no recombinante o recombinante puede ser aislada de una bacteria. También se contempla que una bacteria que contiene una variante de este tipo pueda ser implementada en composiciones y métodos de la invención. Consecuentemente, una proteína no necesita ser aislada.

El término “codón funcionalmente equivalente” se utiliza en la presente patente para hacer referencia a codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina, y también hace referencia a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (ver la Tabla 2, a continuación).

Tabla 2 Tabla de codones

Se debe entender que las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales, o secuencias del extremo 5' o 3', respectivamente, y aun así seguir siendo esencialmente tal como se muestra en una de las secuencias reveladas en la presente patente, siempre que la secuencia cumpla con los criterios establecidos anteriormente, incluyendo mantener la actividad biológica de la proteína (por ejemplo, la inmunogenicidad) en lo que a la expresión de proteínas se refiere. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a las secuencias de ácidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir diversas secuencias no codificantes que flanquean la porción 5' o la 3' de la región de codificación.

Lo siguiente es una discusión basada en el cambio de aminoácidos de una proteína para crear un polipéptido o péptido variante. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica con o sin apreciar pérdida de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión al antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas sustrato. Ya que es la capacidad y naturaleza interactiva de una proteína lo que define esa actividad funcional de la proteína, pueden realizarse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteínas, y en su secuencia de codificación de ADN subyacente, y no obstante producir una proteína con una propiedad deseable. Se contempla, por tanto, por parte de los inventores que pueden realizarse diversos cambios en las secuencias de ADN de los genes.

Se contempla que en las composiciones de la invención, haya entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 10 mg de polipéptido, péptido y/o proteína total por ml. La concentración de la proteína en una composición puede ser de aproximadamente, al menos, aproximadamente o como máximo aproximadamente 0,001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10,0 mg/ml o más (o cualquier rango que pueda obtenerse entre los mismos). De esto, aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% puede ser una variante de SpA o una coagulasa, y puede ser utilizada en combinación con otros péptidos o polipéptidos, tales como otros péptidos bacterianos y/o antígenos.

La presente invención contempla la administración de los péptidos o polipéptidos de la Variante de SpA para efectuar una terapia preventiva o efecto terapéutico contra el desarrollo de una enfermedad o condición asociada con una infección por un patógeno estafilococo.

En ciertos aspectos, las combinaciones de antígenos estafilocócicos se utilizan en la producción de una composición inmunogénico que sea efectiva en el tratamiento o prevención de infecciones estafilocócicas. Las infecciones estafilocócicas se desarrollan a través de diversas etapas diferentes. Por ejemplo, el ciclo de vida estafilocócico implica la colonización de comensales, la iniciación de la infección accediendo a tejidos anexos o al torrente sanguíneo, y/o la multiplicación anaeróbica en la sangre. La interacción entre los determinantes de virulencia del S. aureus y los mecanismos de defensa del huésped puede inducir complicaciones tales como endocarditis, formación de abscesos metastásica y síndrome de sepsis. Las diferentes moléculas en la superficie de la bacteria están implicadas en diferentes etapas del ciclo de infección. Las combinaciones de ciertos antígenos pueden provocar una respuesta inmune que protege contra múltiples etapas de la infección estafilocócica. La efectividad de la respuesta inmune puede medirse en ensayos en animales y/o utilizando un ensayo opsonofagocítico.

D. Polipéptidos y producción de polipéptidos

La presente invención describe polipéptidos, péptidos, y proteínas y fragmentos inmunogénicos de los mismos para su uso en diversas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, los polipéptidos específicos se someten a ensayo para determinar o se utilizan para provocar una respuesta inmune. En realizaciones específicas, todas o parte de las proteínas de la invención pueden también ser sintetizadas en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Se encuentran comercialmente disponibles diversos sintetizadores automáticos y pueden ser utilizados de acuerdo con protocolos conocidos. Ver, por ejemplo, Stewart y Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); y Barany y Merrifield (1979).

De manera alternativa, la tecnología de ADN recombinante puede ser empleada en donde una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, se transforma o transfecta en una célula hospedadora apropiada y se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión.

Un modo de realización de la invención incluye el uso de la transferencia de genes a las células, incluyendo microorganismos, para la producción y/o presentación de polipéptidos péptidos. El gen para el polipéptido o péptido de interés puede ser transferido a células hospedadoras apropiadas seguido de cultivo de células bajo condiciones apropiadas. La generación de vectores de expresión recombinantes, y los elementos incluidos en los mismos, son bien conocidos en el arte y se discuten brevemente en la presente patente. De forma alternativa, la proteína a ser producida puede ser una proteína endógena sintetizada habitualmente por la célula que es aislada y purificada.

Otro modo de realización de la presente invención utiliza líneas celulares de linfocitos B autólogas, que son transfectadas con un vector vírico que expresa un producto inmunogénico, y más específicamente, una proteína que tiene actividad inmunogénica. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos incluyen, pero sin limitarse a, células Vero y HeLa, otras líneas celulares B- y T-, tales como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, además de líneas celulares de ovario de hámster chino, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN y células MDCK. Además, puede elegirse una cepa de la célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la manera deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, la glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión/corte) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento post-traducción y la modificación de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares apropiadas o los sistemas hospedadores para asegurar la correcta modificación y el procesamiento de la proteína extraña expresada.

Puede utilizarse un número de sistemas de selección incluyendo, pero sin limitarse a, la timidina quinasa del HSV, hipoxantineguanina fosforibosiltransferasa, y genes de adenina foforibosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, puede utilizarse la resistencia anti-metabolitos como la base de la selección: para dhfr, que confiere resistencia a la trimetoprima y metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; e hygro, que confiere la resistencia a higromicina.

Las células animales pueden propagarse in vitro de dos maneras: como células no dependientes del anclaje que se cultivan en suspensión a través del volumen del cultivo, o como células dependientes del anclaje que requieren la fijación a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un crecimiento celular de tipo monocapa).

Los cultivos en suspensión o no dependientes del anclaje a partir de líneas celulares continuas establecidas son el medio más ampliamente utilizado de producción a gran escala de células y productos celulares. Sin embargo, las células cultivadas en suspensión tienen limitaciones, tales como el potencial tumorigénico y una producción de proteínas menor que las células adherentes.

En los casos en que una proteína es específicamente mencionada en la presente patente, es preferiblemente una referencia a una proteína recombinante o nativa, o de manera opcional una proteína en la que cualquier secuencia señal ha sido eliminada. La proteína puede ser aislada directamente de la cepa estafilocócica o producida mediante técnicas de ADN recombinante. Pueden incorporarse fragmentos inmunogénicos en la composición inmunogénica de la invención. Estos son fragmentos que comprenden al menos 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, o 100 aminoácidos, incluyendo todos los valores y rangos entre los mismos, tomados de forma continua a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, tales fragmentos inmunogénicos son inmunológicamente reactivos con anticuerpos generados contra las proteínas estafilocócicas o con anticuerpos generados por la infección de un huésped mamífero con estafilococos. Los fragmentos inmunogénicos también incluyen fragmentos que cuando se administran en una dosis efectiva, (ya sean solos o como un hapteno enlazado a un soporte), provocan una respuesta inmune protectora o terapéutica contra una infección estafilocócica, en ciertos aspectos es protectora contra una infección con S. aureus y/o S. epidermidis. Un fragmento inmunogénico de este tipo puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico según la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene al menos un 80% de identidad, al menos un 85% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad, o al menos un 97-99% de identidad, incluyendo todos los valores y rangos entre los mismos, con el segmento de la secuencia de un polipéptido descrito o referenciado en la presente patente.

También incluidas en las composiciones inmunogénicas de la invención, se encuentran las proteínas de fusión compuestas de una o más proteínas estafilocócicas, o fragmentos inmunogénicos de proteínas estafilocócicas. Tales proteínas de fusión pueden ser realizadas de manera recombinante y pueden comprender una porción de al menos

1, 2, 3, 4, 5, o 6 proteínas o segmentos estafilocócicos. De manera alternativa, una proteína de fusión puede comprender múltiples porciones de al menos 1,2, 3, 4 o 5 proteínas estafilocócicas. Estas pueden combinar diferentes proteínas estafilocócicas y/o múltiples de la misma proteína o fragmento de proteína, o fragmentos inmunogénicos en la misma proteína (formando un multímero o concatámero). De manera alternativa, la invención además incluye proteínas de fusión individuales de proteínas estafilocócicas o fragmentos inmunogénicos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas tales como un proveedor de epítopos de linfocitos T o etiquetas de purificación, por ejemplo: p-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, proteínas verdes fluorescentes (GFP), etiquetas de epítopos tales como Fl a G, etiqueta myc, poli histidina, o proteínas de superficie víricas tales como el hemaglutinina del virus de la influenza, o proteínas bacteriana tales como el toxoide tetánico, toxoide diftérico, o el CRM197.

IV. Ácidos nucleicos

En ciertos modos de realización, la presente invención hace referencia a polinucleótidos recombinantes que codifican las proteínas, polipéptidos, péptidos de la invención. Se incluyen las secuencias de ácido nucleico para la SpA, coagulasas y otras proteínas bacterianas, y pueden utilizarse para preparar péptidos o polipéptidos.

Tal como se utiliza en esta solicitud, el término “polinucleótido” hace referencia a una molécula de ácido nucleico que es recombinante o que ha sido aislada libre de ácido nucleico genómico total. El término “polinucleótido” incluye oligonucleótidos (ácidos nucleicos de 100 residuos o menos de longitud), vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares. Los polinucleótidos incluyen, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente de sus genes de origen natural o secuencias de codificación de proteínas. Los polinucleótidos pueden ser de cadena única (de codificación o antisentido) o de doble cadena, y puede ser ARN, ADN (genómico, ADNc o sintético), análogos de los mismos, o una combinación de los mismos. Las secuencias de codificación o no codificación pueden, pero no necesitan, estar presentes dentro de un polinucleótido.

A este respecto, el término “gen”, “polinucleótido” o “ácido nucleico” se utiliza para hacer referencia a un ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, o péptido (incluyendo cualquier secuencia requerida para una transcripción apropiada, una modificación post-traducción, o localización). Tal como se entenderá por los expertos en el arte, este término abarca secuencias genómicas, casetes de expresión, secuencias de ADNc, y segmentos de ácido nucleico modificados por ingeniería genética más pequeños que expresan, o pueden ser adaptados para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión, y mutantes. Un ácido nucleico que codifica parte o la totalidad de un polipéptido puede contener una secuencia de ácido nucleico contigua de: 10, 20, 30, 4

110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 280, 290, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 500, 510, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 730, 740, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 9 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500,

6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, o más nucleótidos, nucleósidos, o pares de bases, incluyendo todos los valores y rangos entre los mismos, de un polinucleótido que codifica uno o más secuencias de aminoácidos descritas o referenciadas en la presente patente. Se contempla que un polipéptido en particular puede ser codificado por ácidos nucleicos que contienen variaciones que presentan secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes pero, aun así, codificar la misma proteína o una sustancialmente similar (ver la Tabla 2 anterior).

En realizaciones en particular, la invención hace referencia a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican la Variante de SpA. El término “recombinante” puede ser utilizado en conjunto con un polinucleótido o polipéptido y generalmente hace referencia a un polipéptido o polinucleótido producido y/o manipulado in vitro o que es un producto de replicación de una molécula de ese tipo.

En otros modos de realización, la invención hace referencia a segmentos de ácido nucleico aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos o péptidos de Variante de SpA para generar una respuesta inmune en un sujeto. En diversas realizaciones los ácidos nucleicos de la invención pueden ser utilizados en vacunas genéticas.

Los segmentos de ácido nucleico utilizados en la presente invención pueden combinarse con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, otros segmentos de codificación, y similares, de tal manera que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla, por lo tanto, que un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud puede ser empleado, estando limitada su longitud total preferiblemente por la facilidad de preparación y utilización en el protocolo de ácidos nucleicos recombinantes. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia de polipéptidos con secuencias de codificación heterólogas adicionales, por ejemplo para permitir la purificación del polipéptido, transporte, secreción, modificación post-traducción, o para beneficios terapéuticos tales

como el establecimiento de dianas o la eficacia. Tal como se ha discutido anteriormente, puede añadirse una etiqueta u otros polipéptidos heterólogos a la secuencia de codificación del polipéptido modificada, en donde “heteróloga” hace referencia a un polipéptido que no es el mismo que el polipéptido modificado.

En ciertas realizaciones diferentes, la invención hace referencia a segmentos de ácido nucleico aislados y a vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia una secuencia de ácido nucleico contigua de la s Eq ID NO:1 (dominio D de SpA) o SEQ ID NO:3 (SpA) o cualquier otras secuencias de ácido nucleico que codifica coagulasas u otros factores de virulencia secretados y/o proteínas de superficie, incluyendo proteínas transportadas por la vía Ess, procesada por la sortasa, o proteínas.

En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona variantes de polinucleótidos que tienen una identidad sustancial con las secuencias reveladas en la presente patente; donde las mismas comprenden al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o una identidad de secuencia mayor, incluyendo todos los valores y rangos entre los mismos, en comparación con una secuencia de polinucleótidos de esta invención, utilizando los métodos descritos en la presente (por ejemplo, análisis BLAST utilizando parámetros estándar).

La presente invención además contempla el uso de polinucleótidos que son complementarios a todos los polinucleótidos descritos anteriormente.

E. Vectores

Los polipéptidos de la invención pueden ser codificados por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término “vector” se utiliza para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico portadora en la que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico para su introducción en una célula donde pueda ser reproducida y expresada. Una secuencia de ácido nucleico puede ser “heteróloga”, lo que significa que se encuentra en un contexto ajeno a la célula en la que el vector está siendo introducida o al ácido nucleico en el que se incorpora, que incluye una secuencia homóloga a una secuencia en la célula o ácido nucleico pero en una posición dentro de la célula hospedadora o ácido nucleico donde no se encuentra normalmente. Los vectores incluyen ADN, ARN, plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales, y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosoma artificial de levadura o YAC) Un experto en el arte estaría bien preparado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar (por ejemplo, Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996, ambos incorporados en la presente patente a modo de referencia). Además de codificar un polipéptido de Variante de SpA, el vector puede codificar otras secuencias de polipéptidos tales como uno o más péptidos bacterianos, una etiqueta, o un péptido de aumento de la inmunogenicidad. Entre los vectores de utilidad que codifican tales proteínas de fusión se incluyen vectores pIN (Inouye et al., 1985), vectores que codifican un tramo de histidinas, y vectores pGEX, para su uso en generar proteínas de fusión solubles de glutatión-S-transferasa (GST) para su purificación y separación o escisión más tarde.

El término “vector de expresión” hace referencia a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. En alguno casos, se traducen las moléculas de ARN a una proteína, polipéptido o péptido. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de “secuencias de control”, lo que hace referencia a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y la posible traducción de una secuencia de codificación ligada operativamente en un organismo hospedador en particular. Además de controlar las secuencias que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen otras también funciones y se describen en la presente patente.

1. Promotores y potenciadores

Un “promotor” es una secuencia de control. El promotor es habitualmente una región de una secuencia de ácido nucleico en la cual se controlan la iniciación y la tasa de transcripción. Puede contener elementos genéticos en los que pueden unirse proteínas reguladoras y moléculas tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las frases “posicionado operativamente”, “ ligado operativamente”, “bajo control”, y “bajo control transcripcional” significan que un promotor se encuentra en una localización y/u orientación funcional correcta en relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar la iniciación de la transcripción y la expresión de esa secuencia. Un promotor puede ser o no utilizado en conjunción con un “potenciador”, que hace referencia a una secuencia reguladora que actúa en cis- implicada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido nucleico.

Naturalmente, puede ser importante emplear un promotor y/o potenciador que diría de forma efectiva la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula u organismo elegido para la expresión. Los expertos en el arte de la biología molecular conocen generalmente el uso de promotores, potenciadores, y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas (ver Sambrook et al., 2001). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos del tejido, o inducibles y en ciertos modos de realización pueden dirigir una expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido bajo condiciones específicas, tal como la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes.

Pueden emplearse diversos elementos/promotores en el contexto de la presente invención para regular la expresión de un gen.

No se cree que el promotor en particular que se emplee para controlar la expresión del péptido o proteína que codifica el polinucleótido de la invención sea de mucha importancia, siempre que sea capaz de expresar el polinucleótido en una célula diana, preferiblemente una célula bacteriana. Cuando se fije como diana una célula humana, es preferible situar la región de codificación del polinucleótido adyacente a y bajo el control de un promotor que sea capaz de ser expresado en una célula humana. En términos generales, un promotor de ese tipo podría incluir un promotor bien bacteriano, como humano o vírico.

En realizaciones en las que se administra un vector a un sujeto para la expresión de una proteína, se contempla que un promotor que se desea para su uso con el vector es uno que no se encuentra regulado por disminución por parte de las citoquinas, o uno que es lo suficientemente fuerte de manera que incluso si está regulado por disminución, produce una cantidad efectiva de una Variante de SpA para provocar una respuesta inmune. Ejemplos no limitativos de estos son CMV IE y RSV LTR. Pueden utilizarse promotores específicos de tejidos, particularmente si la expresión es en células en las que la expresión de un antígeno es deseable, tal como por ejemplo células dendríticas o macrófagos. Los promotores MHC I y MHC II de mamíferos son ejemplos de dichos promotores específicos de tejidos.

2. Señales de iniciación y sitios internos de unión al ribosoma (IRES)

Una señal de iniciación específica también puede ser requerida para una traducción eficiente de secuencias de codificación. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG. Un experto de práctica habitual en el arte sería capaz de determinar esta circunstancia fácilmente y proporcionar las señales necesarias.

En determinadas realizaciones de la invención, el uso de elementos de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) se utilizan para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de escaneo ribosómico de la traducción dependiente del Cap metilado del extremo 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988; Macejak and Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden estar ligados a marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden transcribirse juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Pueden expresarse múltiples genes de manera eficaz utilizando un único promotor/potenciador para transcribir un único mensaje (ver las patentes estadounidenses 5,925,565 y 5,935,819).

3. Marcadores que pueden seleccionarse o detectarse

En determinadas realizaciones de la invención, las células que contienen un constructo de ácido nucleico de la presente invención pueden ser identificadas in vitro o in vivo codificando un marcador que puede seleccionarse o detectarse en el vector de expresión. Cuando se transcribe y se traduce, un marcador confiere un cambio identificable a la célula, lo que permite una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión.

F. Células hospedadoras

Tal como se utiliza en la presente patente, los términos “célula”, “línea celular”, y “cultivo celular” pueden utilizarse indistintamente. Todos estos términos además incluyen su progenie, que es todas y cada una de las generaciones posteriores. Se debe entender que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, “célula hospedadora” hace referencia a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de reproducir un vector o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede utilizarse, y ha sido utilizada como receptor para vectores o virus. Una célula hospedadora puede ser “transfectada” o “transformada”, lo que hace referencia a un proceso por el cual un ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia de codificación de proteínas recombinantes, se transfiere a o se introduce en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye al sujeto primario y a su progenie.

Las células hospedadoras pueden obtenerse a partir de células procariotas o eucariotas, incluyendo bacterias, células de levaduras, células de insectos, y células de mamíferos para la replicación del vector de expresión de parte o la totalidad de la secuencia o secuencias de ácido nucleico. Se encuentran disponibles numerosas líneas y cultivos celulares para su uso como una célula hospedadora, y pueden ser obtenidas a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, del inglés “American Type Culture Collection”), que es una organización que funciona como un archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org).

G. Sistemas de expresión

Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte o la totalidad de las composiciones tratadas anteriormente. Los sistemas basados en procariotas y/o eucariotas pueden emplearse para su uso con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico, o sus polipéptidos, proteínas y péptidos afines. Muchos sistemas de este tipo se encuentran amplia y comercialmente disponibles.

El sistema de células/baculovirus de insectos puede producir un elevado nivel de expresión de proteínas de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes estadounidenses 5,871,986, 4,879,236, y que pueden adquirirse, por ejemplo, con el nombre MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM FROM CLONTECH®.

Además de los sistemas de expresión revelados de la invención, otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el sistema de expresión de mamíferos inducible STRATAGENE®'s COMPLETE CONTROL™, que implica un receptor inducible por ecdisoma, o su sistema de expresión de pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible se encuentra disponible de INVITROGEN®, el cual lleva el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamíferos inducible que utiliza el promotor CMV de longitud completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión en levaduras denominado sistema de expresión en Pichia methanolica, que está diseñado para una producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. Un experto en el arte sabría cómo expresar un vector, tal como un constructo de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptido afín.

V. Polisacáridos

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden además comprender polisacáridos capsulares que incluyen uno o más del polisacárido capsular PIA (también conocido como PNAG) y/o el S. aureus de Tipo V y/o tipo VIII y/o el polisacárido capsular S. epidermidis de Tipo I, y/o Tipo II y/o Tipo III.

H. PIA (PNAG)

Está claro actualmente que las diversas formas de polisacáridos de superficie estafilocócicos identificados como PS/A, PIA y SAA son la misma entidad química - PNa G (Maira-Litran et al., 2004). Por lo tanto, el término PIA o PNAG abarca todos los polisacáridos u oligosacáridos obtenidos de los mismos.

PIA es una adhesina polisacárida intercelular y está compuesta de un polímero de glucosamina unida por enlace p-(1—6) sustituida con constituyentes N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en el S. aureus como en el S. epidermidis y puede ser aislado de cualquier fuente (Joyce et al., 2003; Maira-Litran et al., 2002). Por ejemplo, el PNGA puede aislarse de la cepa MN8m (WO04/43407) del S. aureus. La PIA aislada de S. epidermidis es un constituyente integral de la biopelícula. Es responsable de mediar en la adhesión célula-célula y probablemente también funciona para proteger la colonia en crecimiento de la respuesta inmune del huésped. Recientemente, se mostró que el polisacárido conocido previamente como N-succinil-p-(1—6)-glucosamina (PNSG) no tiene la estructura esperada ya que la identificación de la N- succinilación era incorrecta (Maira-Litran et al., 2002). Por lo tanto, el polisacárido conocido formalmente como PNSG y que se ha encontrado ahora que es PNAG, también se encuentra abarcado por el término PIA.

PIA (o PNAG) pueden ser de diferentes tamaños que varían desde aproximadamente 400kDa hasta entre 75 y 400kDa hasta entre 10 y 75kDa, hasta oligosacáridos compuestos de hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina unida por un enlace p-(1 —^ 6) sustituida con constituyentes N-acetilo y O-succinilo. Cualquier tamaño del polisacárido u oligosacárido de PIA puede ser utilizado en una composición inmunogénica de la invención, en un aspecto el polisacárido es de aproximadamente 40kDa. El dimensionamiento puede lograrse mediante cualquier método conocido en el arte, por ejemplo mediante microfluidización, irradiación ultrasónica o mediante escisión química (WO 03/53462, EP497524, EP497525). En determinados aspectos PIA (PNGA) es al menos o como máximo de 40-400kDa, 40-300kDa, 50-350kDa, 60-300kDa, 50-250kDa y 60-200kDa.

PIA (PNAG) puede tener un diferente grado de acetilación debido a la sustitución por acetato en los grupos amino. PIA producida in vitro es casi totalmente sustituida en los grupos amino (95- 100%). De forma alternativa, puede utilizarse una PIA (PNAG) desacetilada con menos del 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% de acetilación. Se prefiere el uso de una PIA (PNGA) desacetilada ya que los epítopos no acetilados de la PNAG son eficaces en la mediación de la muerte opsónica de bacterias Gram-positivas, preferiblemente S. aureus y/o S. epidermidis. En determinados aspectos, PIA (PNAG) tiene un tamaño de entre 40kDa y 300kDa y está desacetilado de manera que un 60%, 50%, 40%, 30% o 20% de los grupos de aminoácidos están acetilados.

El término PNAG (dPNAG) desacetilado hace referencia a un polisacárido u ologosacárido PNGA en el que menos de un 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% de los grupos amino están acetilados. En ciertos aspectos, PNGA es desacetilado para formar dPNGA tratando químicamente el polisacárido nativo. Por ejemplo, el PNGA nativo es tratado con una solución básica de tal forma que el pH se eleva hasta aproximadamente 10. Por ejemplo, el PNGA se trata con 0,1-5 M, 0,2-4 M, 0,3-3 M, 0,5-2 M, 0,75-1,5 M o 1 M NaOH, KOH o NH4OH. El tratamiento es durante al menos 10 a 30 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 horas a una temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 o 30-50 o 35-45 °C. Se puede preparar dPNGA tal como se describe en la WO 04/43405.

El polisacárido o polisacáridos pueden conjugarse o no conjugarse a una proteína transportadora.

I. Polisacáridos del Tipo 5 y Tipo 8 del S. aureus

La mayoría de las cepas de S. aureus que causan infección pueden contener polisacáridos del Tipo 5 o del Tipo 8. Aproximadamente un 60% de las cepas humanas son del Tipo 8 y aproximadamente un 30% son del Tipo 5. Las estructuras de los antígenos del polisacárido capsular del Tipo 5 y Tipo 8 se describen en Moreau et al., (1990) y en Fournier et al., (1984). Ambos tienen un FucNAcp en su unidad de repetición además de ManNAcA que puede ser utilizado para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras son:

Tipo 5

■4)-p-D-ManNAcA(3OAc)-(1^4)-a-L-FucNAc(1^3)-p-D-FucNAc-(1

Tipo 8

^3)-p-D-ManNAcA(40Ac)-(1^3)-a-L-FucNAc(1^3)-p-D-FucNAc-(1

0139 Recientemente (Jones, 2005) la espectroscopia de RMN revisó las estructuras a:

Tipo 5

■4)-p-D-ManNAcA-(1^4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1^3)-p-D-FucNAc-(1

Tipo 8

^3)-p-D-ManNAcA(40Ac)-(1^3)-a-L-FucNAc(1^3)-a-D-FucNAc(1^

Los polisacáridos pueden extraerse de la cepa adecuada de S. aureus utilizando un método bien conocido para los expertos en el arte, Ver la Patente estadounidense 6,294,177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus de Tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus de Tipo 8.

Los polisacáridos son de tamaño nativo o pueden dimensionarse de forma alternativa, por ejemplo mediante microfluidización, irradiación ultrasónica, o mediante tratamiento químico. La invención además incluye oligosacáridos derivados de los polisacáridos del Tipo 5 y 8 del S. aureus. Los polisacáridos del tipo 5 y 8 incluidos en la composición inmunogénica de la invención, se conjugan preferiblemente con una proteína transportadora tal como se describe más adelante, o alternativamente no se conjugan. Las composiciones inmunogénicas de la invención contienen de forma alternativa un polisacárido del tipo 5 o bien del tipo 8.

J. Antígeno 336 del S. aureus

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende el antígeno 336 del S. aureus descrito en la patente estadounidense 6,294,177. El antígeno 336 comprende una hexosamina con enlace p, no contiene ningún grupo O-acetilo, y específicamente se une a los anticuerpos del S. aureus de tipo 336 depositados bajo la referencia ATCC 55804. En una realización, el antígeno 336 es un polisacárido que es del tamaño nativo o que puede ser dimensionado de manera alternativa, por ejemplo, mediante microfluidización, y radiación ultrasónica, o por tratamiento químico. La invención también incluye oligosacáridos obtenidos a partir del antígeno 336. El antígeno 336 puede estar no conjugado o conjugado a una proteína transportadora.

K. Polísacáridosde tipo I, II y III del S. epidermidis

Entre los problemas asociados con el uso de los polisacáridos en la vacunación se encuentra el hecho de que los polisacáridos per se son inmunógenos débiles. Se prefiere que los polisacáridos utilizados en la invención se enlacen a una proteína transportadora que proporcione la colaboración de un linfocito T “bystander” (activación inespecífica) para mejorar la inmunogenicidad. Ejemplos de tales transportadoras que pueden conjugarse a inmunógenos polisacáridos incluyen los toxoides de la Difteria y el Tétanos (DT, DT CRM197 y TT, respectivamente), hemocianina extraída de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés), y el derivado proteico purificado (PPD) de la Tuberculina, exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), proteína D de la Haemophilus influenzae, pneumolisina o fragmentos de cualquiera de las anteriores. Entre los fragmentos adecuados para su uso se incluyen fragmentos que abarcan epítopos T-auxiliares. En particular, el fragmento de la proteína D de la H. influenza contiene preferiblemente el 1/3 en el extremo N-terminal de la proteína. La proteína D es una proteína de unión a IgD de la Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1) y es un potencial inmunógeno. Además, las proteínas estafilocócicas pueden ser utilizadas como proteína transportadora en los conjugados de polisacáridos de la invención.

Una proteína transportadora que sería particularmente ventajosa para su uso en el contexto de vacunas estafilocócicas es el toxoide alfa estafilocócico. La forma nativa puede conjugarse a un polisacárido ya que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferiblemente, las toxinas alfa detoxificadas tales como las variantes His35Leu o His35Arg se utilizan como transportadoras ya que la toxicidad residual es menor. De manera alternativa, la toxina alfa se detoxifica químicamente mediante tratamiento con un reactivo de entrecruzamiento, formaldehído o glutaraldehído. Una toxina alfa genéticamente detoxificada es detoxificada químicamente de forma opcional, preferiblemente mediante tratamiento con un reactivo de entrecruzamiento, formaldehído o glutaraldehído para reducir adicionalmente la toxicidad.

Los polisacáridos pueden enlazarse a la proteína o proteínas transportadoras mediante cualquier método conocido (por ejemplo, los métodos descritos en las patentes estadounidenses 4,372,945, 4,474,757, y 4,356.170). Preferiblemente, se lleva a cabo la química de conjugación con CDAP (ver WO95/08348). En CDAP, el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) se utiliza preferiblemente para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse según condiciones relativamente suaves, que evitan la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a la alcalinidad. Esta síntesis permite un acoplamiento directo con una proteína transportadora.

La conjugación implica preferiblemente producir un enlace directo entre la proteína transportadora y el polisacárido. Opcionalmente, se puede introducir un espaciador (tal como dihidruro adípico (ADH)) entre la proteína transportadora y el polisacárido.

IV. Respuesta inmune y Ensayos

Tal como se ha tratado anteriormente, la invención hace referencia a provocar o inducir una respuesta inmune en un sujeto contra una Variante de SpA o péptido de coagulasa. En una realización, la respuesta inmune puede proteger contra o tratar a un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar una infección o enfermedad relacionada con la misma, en particular las asociadas a estafilococos. Un uso de las composiciones inmunogénicas de la invención es prevenir las infecciones nosocomiales mediante la inoculación a un sujeto antes de someterse a un tratamiento en un hospital o en otro entorno con un elevado riesgo de infección.

A. Inmunoensayos

La presente revelación incluye la implementación de ensayos serológicos para evaluar si y hasta qué punto una respuesta inmune es inducida o provocada por las composiciones de la invención. Existen muchos tipos de inmunoensayos que pueden ser implementados. Los inmunoensayos que abarca la presente revelación incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la patente estadounidense 4,367,110 (ensayo tipo sándwich de doble anticuerpo monoclonal) y en la patente estadounidense 4,452,901 (ensayo western blot). Otros ensayos incluyen la inmunoprecipitación de ligandos marcados e inmunocitoquímica, tanto in vitro como in vivo.

Los inmunoensayos generalmente son ensayos de unión. Determinados inmunoensayos preferidos son los diversos tipos de ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA) conocidos en el arte. La detección inmunohistoquímica utilizando secciones de tejidos es también particularmente útil. En un ejemplo, se inmovilizan anticuerpos o antígenos en una superficie seleccionada, tal como un pocillo en una placa de microtitulación de poliestireno, varilla graduada, o soporte en columna. A continuación, una composición de prueba que se sospecha contiene al antígeno o anticuerpo deseado, tal como una muestra clínica, se añade a los pocillos. Después de la unión y del lavado para eliminar complejos inmunes enlazados de manera no específica, puede detectarse el antígeno o el anticuerpo. La detección se logra generalmente mediante la adición de otro anticuerpo, específico para el antígeno o anticuerpo deseado, que está unido a un marcador detectable. Este tipo de ELISA se conoce como “ELISA tipo sándwich”. La detección puede también lograrse mediante la adición de un segundo anticuerpo específico para el antígeno deseado, seguido de la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión para el segundo anticuerpo, estando el tercer anticuerpo unido a un marcador detectable.

Los ensayos ELISA de competición son también posibles implementaciones en las que las muestras de ensayo compiten para unirse con cantidades conocidas de antígenos o anticuerpos marcados. La cantidad de especies reactivas en la muestra desconocida se determina mezclando la muestra con las especies marcadas conocidas antes o durante la incubación con pocillos revestidos. La presencia de especies reactivas en la muestra actúa para reducir la cantidad de especies marcadas disponibles para unirse al pocillo y por tanto reduce la señal final. Independientemente del formato empleado, los ensayos ELISA tienen determinadas características en común, tales como recubrimiento, incubación o unión, lavado para eliminar las especies enlazadas de forma no específica, y detección de los complejos inmunes enlazados.

Los antígenos o anticuerpos pueden además enlazarse a un soporte sólido, como por ejemplo a una en forma de placa, perlas, varilla graduada, membrana o matriz en columna, y la muestra a ser analizada se aplica al antígeno o anticuerpo inmovilizado. A la hora de recubrir una placa bien con un antígeno o bien con un anticuerpo, generalmente se incubarán los pocillos de la placa con una solución del antígeno o el anticuerpo, bien durante la noche o durante un periodo de tiempo específico. Los pocillos de la placa se lavarán entonces para eliminar el material adsorbido de forma incompleta. Cualquier superficie disponible restante de los pocillos se “recubren” a continuación con una proteína no específica que es antigénicamente neutral con respecto al antisuero del ensayo. Estas incluyen albúmina de suero bovino (BSA), caseína, y soluciones de leche en polvo. El recubrimiento permite el bloqueo de sitios de adsorción no específicos en la superficie de inmovilización y por tanto reduce el fondo causado por la unión no específica del antisuero sobre la superficie.

El término “anticuerpos” tal como se utiliza en la presente patente incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena única, biespecíficos, simianizados, y humanizados o primatizados además de fragmentos Fab, tales como aquellos fragmentos que mantienen la especificidad de la unión de los anticuerpos, incluyendo los productos de una genoteca de expresión de inmunoglobulina Fab. Por consiguiente, la invención contempla el uso de cadenas únicas tales como la cadena pesada y ligera variable de los anticuerpos. La generación de cualquiera de estos tipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo es bien conocida por los expertos en el arte. Pueden encontrarse ejemplos específicos de la generación de un anticuerpo para una proteína bacteriana en la Solicitud de patente estadounidense con número de publicación N° 20030153022.

Cualquiera de los polipéptidos, proteínas, péptidos, y/o anticuerpos descritos anteriormente pueden ser marcados directamente con un marcador detectable para la identificación y cuantificación de bacterias estafilocócicas. Los marcadores para su uso en inmunoensayos son conocidos en general para los expertos en el arte e incluye enzimas, radioisótopos, y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas, incluyendo particular tales como oro coloidal o perlas de látex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

B. Inmunidad protectora

En algunos modos de realización de la invención, las composiciones proteicas confieren inmunidad protectora a un sujeto. La inmunidad protectora hace referencia a la habilidad del cuerpo de elaborar una respuesta inmune que proteja al sujeto de desarrollar una enfermedad o condición en particular que implica el agente contra el cual hay una respuesta inmune. Una cantidad inmunogénicamente efectivo es capaz de conferir inmunidad protectora al sujeto.

Tal como se utiliza en la presente patente en la especificación y en la sección de las reivindicaciones que sigue a continuación, los términos polipéptido o péptido hacen referencia a un tramo de aminoácidos enlazados de forma covalente entre los mismos mediante enlaces peptídicos. Los diferentes polipéptidos tienen diferentes funcionalidades de acuerdo con la presente invención. Mientras que según un aspecto un polipéptido se obtiene de un inmunógeno diseñado para inducir una respuesta inmune activa en un receptor, según otro aspecto de la invención, un polipéptido se obtiene a partir de un anticuerpo que se obtiene como resultado a continuación de la provocación de una respuesta inmune activa en, por ejemplo, un animal, y que puede utilizarse para inducir una respuesta inmune pasiva en un receptor. En ambos casos, sin embargo, el polipéptido es codificado por un polinucleótido de acuerdo con cualquier uso posible del codón.

Tal como se utiliza en la presente patente la frase “respuesta inmune” o su equivalente “respuesta inmunológica” hace referencia al desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos), celular (mediada por linfocitos T específicos del antígeno o sus productos de secreción), o ambas humoral y celular dirigida contra una proteína, péptido, carbohidrato, o polipéptido de la invención en un paciente receptor. Una respuesta de este tipo puede ser una respuesta activa inducida por la administración de un inmunógeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de un anticuerpo, material que comprende anticuerpos, o linfocitos T activados (primed). Una respuesta inmune celular es provocada por la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas de MHC de Clase I o de Clase II, para activar los linfocitos T auxiliares CD4 (+) específicos al antígeno y/o linfocitos T citotóxicos CD8 (+). La respuesta puede además implicar la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células microgliales, eosinófilos u otros componentes de inmunidad innata. Tal como se utiliza en la presente patente “ inmunidad activa” hace referencia a cualquier inmunidad conferida a un sujeto mediante la administración de un antígeno.

Tal como se utiliza en la presente patente “ inmunidad pasiva” hace referencia a cualquier inmunidad conferida a un sujeto sin la administración de un antígeno al sujeto. “ Inmunidad pasiva” por tanto incluye, pero no se limita a, la administración de efectores activados inmunes que incluyen mediadores celulares o mediadores proteicos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o policlonales) de una respuesta inmune. Una composición monoclonal o policlonal puede ser utilizada en la inmunización pasiva para la prevención o tratamiento de la infección por organismos que portan el antígeno reconocido por el anticuerpo. Una composición de anticuerpos puede incluir anticuerpos que se unen a una variedad de antígenos que pueden a su vez estar asociados con diversos organismos. El componente anticuerpo puede ser un antisuero policlonal. En ciertos aspectos el anticuerpo o anticuerpos se purifican por afinidad a partir de un animal o un segundo sujeto al que se ha sometido a una prueba de provocación con un antígeno o antígenos. De manera alternativa, puede utilizarse una mezcla de anticuerpos, que es una mezcla de anticuerpos monoclonales o policlonales para antígenos presentes en los mismos, relacionados o diferentes microbios u organismos, tales como bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas, incluyendo pero sin limitarse a bacterias estafilococos.

Se puede impartir inmunidad pasiva a un paciente o sujeto administrando al paciente inmunoglobulinas (Ig) y/u otros factores inmunes obtenidos de un donante, o de otra fuente que no sea un paciente que presente inmunorreactividad conocida. En otros aspectos, una composición antigénica de la presente invención puede ser administrada a un sujeto que entonces actúa como una fuente o donante de globulina, producida en respuesta a la prueba de provocación con la composición antigénica (“globulina hiperinmune”), que contiene anticuerpos dirigidos contra Staphylococcus u otro organismo. Un sujeto tratado de este modo donaría plasma a partir de la cual se obtendría la globulina hiperinmune, mediante metodología de fraccionamiento en plasma convencional, y se administraría a otro sujeto para conferir resistencia contra una infección por estafilococos o tratar la misma. Las globulinas hiperinmunes de acuerdo con la invención son particularmente útiles para individuos inmunocomprometidos, para individuos sometidos a procedimientos invasivos o en los casos en los que el tiempo no permite al individuo producir sus propios anticuerpos en respuesta a la vacunación. Ver las patentes estadounidenses 6,936,258, 6,770,278, 6,756,361, 5,548,066, 5,512,282, 4,338,298, and 4,748,018 para ejemplos de métodos y composiciones relacionadas con la inmunidad pasiva.

Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones anexas los términos “epítopo” y “determinante antigénico” se utilizan indistintamente para referirse a un sitio en un antígeno al que responden o reconocen los linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden estar formados a partir de tanto aminoácidos contiguos como aminoácidos no continuos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos son habitualmente conservados en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario se pierden habitualmente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye habitualmente al menos 3, y más usualmente al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía por rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden ser identificados en un inmunoensayo simple que muestra la habilidad de un anticuerpo de bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Los linfocitos T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para células CD8 o aproximadamente 13;15 aminoácidos para células CD4. Los linfocitos T que reconocen el epítopo pueden ser identificados mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente del antígeno, según se determina mediante la incorporación de 3H-timidina por parte de linfocitos T activados en respuesta a un epítopo (Burke et al., 1994), por muerte celular dependiente del antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., 1996) o por secreción de citoquinas.

La presencia de una respuesta inmunológica mediada por la célula puede ser determinada por ensayos de proliferación (Linfocitos T CD4 (+)) o ensayos CTL (Linfocitos T citotóxicos). Las contribuciones relativas de las respuestas celulares y humorales al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno pueden distinguirse aislando por separado la IgG y los linfocitos T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.

Tal como se utiliza en la presente patente y en las reivindicaciones, los términos “anticuerpo” o “ inmunoglobulina” se utilizan de manera intercambiable y hacen referencia a cualquiera de diversas clases de proteínas relacionadas estructuralmente que funcionan como parte de la respuesta inmune de un animal o receptor, proteínas que incluyen IgG, IgD, IgE, IgA, IgM y proteínas asociadas.

En condiciones fisiológicas normales, se observan anticuerpos en plasma y en otros fluidos corporales y en la membrana de ciertas células y se producen mediante linfocitos del tipo denominado linfocitos B o su equivalente funcional. Los anticuerpos de la clase IgG están compuestos por cadenas de polipéptidos unidas entre sí mediante enlaces disulfuro. Las cuatro cadenas de moléculas de IgG intactas son dos cadenas pesadas idénticas denominadas las cadenas H, y dos cadenas ligeras denominadas cadenas L.

Para producir anticuerpos policlonales, un huésped, tal como un conejo o una cabra, se inmuniza con el antígeno o fragmento de antígeno, generalmente con un adyuvante y, si fuera necesario, se acopla a un transportador. Los anticuerpos para el antígeno se recogen posteriormente del suero del huésped. El anticuerpo policlonal puede ser purificado por afinidad contra el antígeno, volviéndolo mono-específico.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante hiperinmunización de un donante apropiado con el antígeno, o exvivo mediante el uso de cultivos primarios de células esplénicas o líneas celulares obtenidas del bazo (Anavi, 1998; Huston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mernaugh et al., 1995).

Tal como se utiliza en la presente patente y en las reivindicaciones, la frase “parte inmunológica de un anticuerpo” incluye un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fv de un anticuerpo, una cadena pesada de un anticuerpo, un heterodímero que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena ligera de un anticuerpo, un fragmento variable de una cadena pesada de un anticuerpo, y una variante de cadena única de un anticuerpo, que también se conoce como scFv. Además, el término incluye inmunoglobulinas quiméricas que son los productos de expresión de genes fusionados obtenidos a partir de diferentes especies, una de las especies puede ser un humano, en cuyo caso se dice que la inmunoglobulina quimérica está humanizada. Habitualmente, una parte inmunológica de un anticuerpo compite con el anticuerpo intacto a partir del cual fue obtenida para su unión específica a un antígeno.

Opcionalmente, un anticuerpo o preferiblemente una parte inmunológica de un anticuerpo, puede conjugarse químicamente a, o expresarse como, una proteína de fusión con otras proteínas. Para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, todas las proteínas fusionadas de este tipo se incluyen en la definición de anticuerpos o de una parte inmunológica de un anticuerpo.

Tal como se utilizan en la presente patente, los términos “agente inmunogénico” o “inmunógeno” o “antígeno” se utilizan de forma intercambiable para describir una molécula capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma ante la administración a un receptor, ya sea solo, en conjunción con un adyuvante o en un vehículo de presentación.

C. Métodos de tratamiento

Puede proporcionarse un polipéptido inmunogénico de la invención para inducir una respuesta inmune en una persona infectada con estafilococos o que se sospecha ha estado expuesta a estafilococos. Pueden emplearse métodos con respecto a individuos que han dado positivo en un test de exposición a estafilococos, o que se considera están en riesgo de infección en base a una posible exposición.

En particular, la invención abarca composiciones para su uso en un método de tratamiento para infecciones estafilocócicas, en particular infecciones nosocomiales intrahospitalarias. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas de la invención son particularmente ventajosas para su uso en casos de cirugía electiva. Tales pacientes conocerán la fecha de su cirugía por adelantado y podrían ser inoculados con antelación. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas de la invención resultan también ventajosas para su uso para inocular a trabajadores sanitarios.

En algunos modos de realización, el tratamiento se administra en presencia de adyuvantes o transportadores u otros antígenos estafilocócicos. Además, en algunos ejemplos, el tratamiento comprende la administración de otros agentes utilizados normalmente contra una infección bacteriana, como por ejemplo uno o más antibióticos.

El uso de péptidos para la vacunación puede requerir, pero no necesariamente, la conjugación del péptido con una proteína transportadora inmunogénica, tal como el antígeno de superficie, hemocianina extraída de la lapa californiana, o la albúmina de suero bovino. Los métodos para llevar esta conjugación se conocen bien en el arte.

VI. Vacunas y otras composiciones farmacéuticas y administración

D. Vacunas

La presente invención incluye composiciones para su uso en métodos para prevenir o mejorar infecciones estafilocócicas, en particular infecciones nosocomiales intrahospitalarias. Como tal, la invención contempla vacunas para su uso en realizaciones de inmunización tanto pasiva como activa. Las composiciones inmunogénicas, que se proponen como adecuadas para su uso como vacunas, pueden prepararse a partir de un polipéptido o polipéptidos de SpA inmunogénicos, tal como una variante del dominio D de la SpA. En otros modos de realización puede utilizarse la variante de SpA en combinación con otras proteínas de virulencia secretadas, proteínas de superficie o fragmentos inmunogénicos de las mismas. En ciertos aspectos, el material antigénico es ampliamente dializado para eliminar moléculas de reducido peso molecular no deseadas y/o se liofilizan para una formulación más sencilla en un vehículo deseado.

Otras opciones para una vacuna basada en una proteína/péptido implican la introducción de ácidos nucleicos que codifican el antígeno o los antígenos como vacunas de a Dn . A este respecto, informes recientes describen la construcción de virus vaccinia recombinantes que expresan o bien 10 epítopos CTL mínimos (Thomson, 1996) o una combinación de linfocitos B, linfocitos T citotóxicos (CTL), y epítopos de linfocitos T auxiliares (Th) de diversos microbios (An, 1997), y el uso exitoso de tales constructos para inmunizar ratones para respuestas inmunes protectoras de cebado. Por tanto, existe amplia evidencia en la literatura para la utilización con éxito de péptidos, células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) pulsadas con péptidos, y constructos de codificación de péptidos para un cebado in vivo eficaz de respuestas inmune protectoras. El uso de secuencias de ácido nucleico como vacunas se ejemplifica en las Patentes estadounidenses 5,958,895 y 5,620,896.

La preparación de vacunas que contienen secuencias de polipéptidos o péptidos como ingredientes activos se comprende bien en general en el arte, tal como se ejemplifica por las patentes estadounidenses 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; y 4,578,770. Habitualmente, tales vacunas se preparan como inyectables ya sea como soluciones líquidas o suspensiones: también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en un líquido antes de la inyección. La preparación puede además ser emulsionada. El ingrediente inmunogénico activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, suero fisiológico, dextreosa, glicerol, etanol, o similar y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón de pH, o adyuvantes que aumentan la efectividad de las vacunas. En modos de realización específicos, las vacunas se formulan con una combinación de sustancias, según se describe en las patentes estadounidenses 6,793,923 y 6,733,754.

Las vacunas pueden administrarse convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, ya sea subcutánea o intramuscularmente. Entre las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración se incluyen los supositorios y, en algunos casos, las formulaciones orales. Para los supositorios, entre los aglutinantes y soportes tradicionales se incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos: tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el rango de aproximadamente un 0,5% hasta aproximadamente un 10%, preferiblemente aproximadamente un 1% hasta aproximadamente un 2%. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes utilizados habitualmente como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación controlada o polvos y contienen aproximadamente de un 10% hasta aproximadamente un 95% de ingrediente activo, preferiblemente aproximadamente de un 25% a aproximadamente un 70%.

Los constructos de polipéptidos y de ADN que codifica polipéptidos pueden formularse en forma de vacunas en formas neutras o de sales. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales de adición de ácido tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares.

Habitualmente, las vacunas se administran de una forma compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva e inmunogénica. La cantidad a ser administrada depende del sujeto a ser tratado, incluyendo la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo requerido a ser administrado dependen del juicio del profesional médico. Sin embargo, los rangos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacuna. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de posteriores inoculaciones u otras administraciones.

La manera de aplicación puede variar ampliamente. Se puede aplicar cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que entre estos se puede incluir la aplicación por vía oral en una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, mediante inyección o similar. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo al tamaño y la salud del sujeto.

En ciertos casos, será deseable realizar múltiples administraciones de la vacuna, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más administraciones. Las vacunas pueden ser en intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, a 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12 semanas, incluyendo todos los rangos entre las mismas. Será deseable realizar refuerzos periódicos en intervalos de 1-5 años para mantener los niveles protectores de los anticuerpos. Se puede realizar un seguimiento del transcurso de la inmunización mediante ensayos para anticuerpos contra los antígenos, tal como se describe en las patentes estadounidenses 3,791,932; 4,174,384 y 3,949,064.

1. Transportadores

Una composición determinada puede variar en su inmunogenicidad. Por lo tanto, es necesario a menudo reforzar el sistema inmune del huésped, tal como puede lograrse acoplando un péptido o polipéptido a un transportador. Soportes preferidos y ejemplos de los mismos son la hemocianina de lapa californiana (KLH) y la albúmina de suero bovino (BSA). Otras albúminas tales como la ovoalbúmina, albúmina sérica de ratón, o albúmina sérica de conejo pueden también utilizarse como transportadores. Se conocen bien en el arte medios para conjugar un polipéptido a una proteína transportadora e incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobencoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida, y bencidina bis-biazotizada.

2. Adyuvantes

La inmunogenicidad de las composiciones de péptidos o polipéptidos puede aumentarse mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen todos los compuestos inmunoestimuladores aceptables, tales como las citoquinas, toxinas, o composiciones sintéticas. Puede utilizarse una cantidad de adyuvantes para aumentar la respuesta de un anticuerpo contra un polipéptido de SpA o coagulasa variante, o cualquier otra proteína bacteriana o combinación contemplada en la presente patente. Los adyuvantes pueden (1) atrapar el antígeno en el organismo para causar una liberación lenta; (2) atraer a las células implicadas en la respuesta inmune al sitio de administración; (3) inducir la proliferación o activación de las células del sistema inmune; o (4) mejorar la propagación del antígeno a través del organismo del sujeto.

Entre los adyuvantes se incluyen, pero sin limitarse a, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, sales minerales, polinucleótidos, y sustancias naturales. Los adyuvantes específicos que pueden utilizarse incluyen IL-1, IL-2, IL-4, lL-7, IL-12, interferón-Y, GMCSP, BCG, sales de aluminio, tales como hidróxido de aluminio u otros compuestos de aluminio, compuestos MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A, y monofosforil lípido A (MPL). El sistema coadyuvante RIBI, que contienen tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS) en una emulsión al 2% de escualeno/Tween 80. Pueden incluso utilizarse antígenos de MHC. Otros adyuvantes o métodos se ejemplifican en las patentes estadounidenses 6,814,971, 5,084,269, 6,656,462.

Diversos métodos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna incluye el uso de agentes tales como hidróxido de aluminio o fosfato (alum), utilizado comúnmente como una solución aproximadamente al 0,05 a aproximadamente 0,1% en un tampón de fosfatos, la mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol®) utilizada como una solución de aproximadamente un 0,25%, la agregación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento con calor con temperaturas que oscilan entre aproximadamente 70° a aproximadamente 101°C durante un periodo de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. También puede utilizarse para producir un efecto adyuvante, la agregación mediante la reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) a la albúmina; mezcla con células bacterianas (por ejemplo, C. parvum), componentes endotoxinas o lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas; emulsión en vehículos oleaginosos fisiológicamente aceptables (por ejemplo, monooleato de manida (Aracel A)); o una emulsión con solución al 20% de un perfluorocarbono (Fluosol-DA®) que se utiliza como sustituto de bloque.

Ejemplos de adyuvantes y con frecuencia adyuvantes preferidos, incluyen el adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivo), adyuvantes de Freund incompleto, e hidróxido de aluminio.

En algunos aspectos, se prefiere que el adyuvante se seleccione para ser un inductor preferente de una respuesta de tipo Th1 o Th2. Los niveles elevados de citoquinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de la respuesta inmune de tipo Th1 o Th2 no es absoluta. En la realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describa como predominantemente Th1 o Th2. Sin embargo, a menudo resulta conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de las descritas en clones de linfocitos T CD4+ por Mosmann y Coffman (Mosmann, y Coffman, 1989). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de citoquinas del INF-y y IL-2 por parte de los linfocitos T. Otras citoquinas, asociadas con frecuencia con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1, no son producidas por los linfocitos T, tales como la IL-12. En contraste, las respuestas de tipo Th2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10.

Además de adyuvantes, puede ser deseable co-administrar modificadores de la respuesta biológica (BRM) para aumentar las respuestas inmunes. Se ha mostrado que los BRM regular por incremento la inmunidad de los linfocitos T o regulan por disminución la actividad de las células supresoras. Tales BRM incluyen, pero no se limitan a, Cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); o Ciclofosfamida de dosis baja (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/ Mead, NJ) y citoquinas tales como interferón-y, IL-2, o IL-12 o genes que codifican proteínas implicadas en funciones auxiliares inmunes, tales como B-7.

E. Componentes y fracciones lipídicas

En determinados modos de realización, la presente invención hace referencia a composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico o un polipéptido/péptido. Un lípido es una sustancia que es insoluble en agua y extraíble con un disolvente orgánico. Los compuestos distintos a los descritos específicamente en la presente patente se entienden como lípidos por parte de un experto en el arte, y son abarcados por las composiciones y métodos de la presente invención. Un componente lipídico y no lipídico pueden unirse entre sí, ya sea de forma covalente como de forma no covalente.

Un lípido puede ser un lípido de origen natural o un lípido sintético. Sin embargo, un lípido es habitualmente una sustancia biológica. Los lípidos biológicos se conocen bien en el arte, e incluyen por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfinolípidos, glucolípidos, sulfatidas, lípidos con ácidos grasos unidos por éter y éster y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico o un polipéptido/péptido, asociado con un lípido puede dispersarse en una solución que contiene un lípido, disuelta con un lípido, emulsionada con un lípido, mezclada con un lípido, combinada con un lípido, enlazada covalentemente con un lípido, contenida como una suspensión en un lípido o asociada de otro modo a un lípido. Una composición lipídica o poxyvirus asociado a lípido de la presente invención no está limitada a ninguna estructura en particular. Por ejemplo, pueden además sencillamente ser entremezclada en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes ni en tamaño ni en forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelos, o con una estructura “caída”. En otro ejemplo no limitativo, se contempla también un complejo de lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-poxvirus.

En ciertas realizaciones, una composición puede comprender aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 2%, aproximadamente un 3%, aproximadamente un 4% aproximadamente un 5%, aproximadamente un 6% aproximadamente un 7%, aproximadamente un 8%, aproximadamente un 9%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 11%, aproximadamente un 12%, aproximadamente un 13%, aproximadamente un 14%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 16%, aproximadamente un 17%, aproximadamente un 18%, aproximadamente un 19%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 21%, aproximadamente un 22% aproximadamente un 23%, aproximadamente un 24%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 26% aproximadamente un 27%, aproximadamente un 28%, aproximadamente un 29%, aproximadamente un 30% aproximadamente un 31%, aproximadamente un 32%, aproximadamente un 33%, aproximadamente un 34% aproximadamente un 35%, aproximadamente un 36%, aproximadamente un 37%, aproximadamente un 38% aproximadamente un 39%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 41%, aproximadamente un 42% aproximadamente un 43%, aproximadamente un 44%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 46% aproximadamente un 47%, aproximadamente un 48%, aproximadamente un 49%, aproximadamente un 50% aproximadamente un 51%, aproximadamente un 52%, aproximadamente un 53%, aproximadamente un 54% aproximadamente un 55%, aproximadamente un 56%, aproximadamente un 57%, aproximadamente un 58% aproximadamente un 59%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 61%, aproximadamente un 62% aproximadamente un 63%, aproximadamente un 64%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 66% aproximadamente un 67%, aproximadamente un 68%, aproximadamente un 69%, aproximadamente un 70% aproximadamente un 71%, aproximadamente un 72%, aproximadamente un 73%, aproximadamente un 74% aproximadamente un 75%, aproximadamente un 76%, aproximadamente un 77%, aproximadamente un 78% aproximadamente un 79%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 81%, aproximadamente un 82% aproximadamente un 83%, aproximadamente un 84%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 86% aproximadamente un 87%, aproximadamente un 88%, aproximadamente un 89%, aproximadamente un 90% aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94% aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% aproximadamente un 99%, o cualquier rango entre los mismos, de un componente lípido, tipo de lípido, o no lípido en particular, tal como un adyuvante, antígeno, péptido, polipéptido, azúcar, ácido nucleico u otros materiales revelados en la presente patente, tal como conocería un experto en el arte, En un ejemplo no limitativo, una composición puede comprender aproximadamente un 10% hasta aproximadamente un 20% de lípidos neutrales, y aproximadamente un 33% a aproximadamente un 34% de una cerebrosida, y aproximadamente un 1% de colesterol. En otro ejemplo no limitativo, un liposoma puede comprender aproximadamente un 4% a aproximadamente un 12% de terpenos, en donde aproximadamente un 1% de la micela es específicamente licopeno, dejando en aproximadamente un 3% a aproximadamente un 11% de liposoma comprendiendo otros terpenos; y aproximadamente un 10% a aproximadamente un 35% de fosfatidil colina, y aproximadamente un 1% de un componente no lipídico. Por tanto, se contempla que las composiciones de la presente invención pueden comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos u otros componentes en cualquier combinación o rango de porcentaje.

F. Terapia de combinación

Las composiciones de la invención y los métodos relacionados de la presente divulgación, en particular la administración de un factor de virulencia secretado o una proteína de superficie, incluyendo un péptido o polipéptido de variante de SpA, y/o otros péptidos o proteínas bacterianas a un paciente/sujeto, pueden también ser utilizadas en combinación con la administración de terapias tradicionales. Estas incluyen, pero no se limitan a, la administración de antibióticos tales como estreptomicina, ciprofloxacino, doxiciclina, gentamicina, cloranfenicol, trimetoprima, sulfametoxazol, ampicilina, tetraciclina o diversas combinaciones de antibióticos.

En un aspecto, se contempla que una vacuna y/o terapia de polipéptidos se utilice en conjunto con tratamiento antibacteriano. De forma alternativa, la terapia puede preceder o ir después del tratamiento con el otro agente en intervalos que oscilan desde minutos a semanas. En realizaciones en las que los otros agentes y/o proteínas o polinucleótidos se administran por separado, debería asegurarse en general que transcurra un periodo de tiempo significativo entre el tiempo de cada administración, de tal manera que el agente y la composición antigénica serían capaces aún de ejercer un efecto combinado de forma ventajosa en el sujeto. En tales casos, se contempla que se pueden administrar ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 h entre sí o dentro de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para la administración de forma significativa, donde existe un lapso de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a diversas semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.

Pueden emplearse diversas combinaciones, por ejemplo la terapia con antibióticos es “A” y la molécula inmunogénica proporcionada como parte de un régimen de terapia inmune, tal como un antígeno, es “B”:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de composiciones inmunogénicas de la presente invención a un paciente/sujeto seguirá protocolos generales para la administración de tales compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si hubiera alguna, de la composición de SpA, u otras composiciones descritas en la presente patente. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. Se contempla también que diversas terapias estándar, tal como la hidratación, pueden ser aplicadas en combinación con la terapia descrita.

G. Composiciones farmacéuticas en general

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto. Diferentes aspectos de la presente invención implican administrar una cantidad efectiva de una composición a un sujeto. En algunos modos de realización de la presente revelación, los antígenos estafilocócicos, miembros de la vía Ess, incluyendo péptidos y polipéptidos de la clase Esa o Esx, y/o miembros de sustratos de sortasa pueden ser administrados al paciente para protegerle contra la infección por uno o más patógenos de estafilococos. De manera alternativa, un vector de expresión que codifica uno o más polipéptidos o péptidos de este tipo, pueden ser proporcionados a un paciente como un tratamiento preventivo. De manera adicional, tales compuestos pueden ser administrados en combinación con un antibiótico o un antibacteriano. Tales composiciones generalmente serán disueltas o dispersadas en un soporte farmacéuticamente aceptable o un medio acuoso.

Además de los compuestos formulados para la administración parenteral, tales como con inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para la administración por vía oral; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma utilizada actualmente, incluyendo cremas, lociones, enjuagues bucales, inhaladores y similares.

Los compuestos activos de la presente invención pueden ser formulados para su administración por vía parenteral, por ejemplo, formulados para la inyección por vía intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, o incluso intraperitoneal. La preparación de una composición acuosa que contiene un compuesto o compuestos que aumenten la expresión de una molécula MHC de clase I, resultará conocido para los expertos en el arte a la vista de la presente revelación. Habitualmente, tales composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su uso para preparar soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido previamente a la inyección; y, las preparaciones pueden también emulsionarse.

Pueden prepararse en agua soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables, mezcladas de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso como inyectables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete, o propilenglicol; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta un grado en el que pueda ser inyectada fácilmente. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Las composiciones proteicas pueden formularse en una forma neutra o de sal. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína), y que están formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico y fosfórico, o aceites orgánicos tales como el ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Pueden también obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El soporte también puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Puede mantenerse una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula adecuado en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con diversos de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización por filtrado. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de entre los que se han enumerado anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, lo que produce un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución del mismo previamente esterilizada por filtrado.

La administración de los componentes de acuerdo a la presente invención será en general a través de cualquier vía habitual. Esto incluye, pero no se limita a la administración oral, nasal o bucal. De manera alternativa, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, o intravenosa. En determinados modos de realización, una composición para vacuna puede ser inhalada (por ejemplo, Patente estadounidense 6,651,655). Tales composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen soportes fisiológicamente aceptables, tampones u otros excipientes. Tal como se utiliza en la presente patente, el término “farmacéuticamente aceptable” hace referencia a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance de un juicio médico fiable, adecuados para entrar en contacto con tejidos humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problemáticas en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable. El término “soporte farmacéuticamente aceptable”, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una sustancia d relleno líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en portar o transportar un agente químico.

Para la administración por vía parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe estar tamponada de forma adecuada, si fuera necesario, y el diluyente líquido debe volverse isotónico en primer lugar con suficiente suero fisiológico o glucosa. Estas soluciones acuosas en particular son especialmente adecuadas para su administración por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraperitoneal. En conexión con ello, los medios acuosos estériles que pueden ser empleados resultarán conocidos para los expertos en el arte, a la luz de la presente revelación. Por ejemplo, una dosificación podría ser disuelta en una solución de NaCl isotónica, y o bien añadirse a un fluido de hipodermoclisis o bien inyectarse en el sitio propuesto de la infusión, (ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990). Algunas variaciones en la dosificación serán necesarias dependiendo de la condición del sujeto. La persona responsable de la administración determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individualmente.

Se determina una cantidad efectiva de la composición terapéutica o profiláctica en base al objetivo deseado. El término “dosis unitaria” o “dosificación” hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas tratadas anteriormente en asociación con la administración, es decir, la vía y el régimen adecuados. La cantidad a ser administrada, tanto de acuerdo con una cantidad de tratamientos como con una dosis unitaria, depende de la protección deseada.

Las cantidades precisas de la composición también dependen del juicio del profesional sanitario y son específicas para cada individuo. Los factores que afectan a la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la vía de administración, el objetivo deseado del tratamiento (alivio de los síntomas versus cura), y la potencia, estabilidad, y toxicidad de la composición en particular.

Tras la formulación, se administrarán las soluciones de forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéutica o profilácticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente.

H. Administración In vitro, Ex vivo o In vivo

Tal como se utiliza en la presente patente, el término administración in vitro hace referencia a manipulaciones realizadas en células extraídas de o fura de un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a células en cultivo. El término administración ex vivo hace referencia a células que han sido manipuladas in vitro, y que se administran posteriormente a un sujeto. El término administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas dentro de un sujeto.

En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones pueden ser administradas ya sea in vitro, ex vivo, o in vivo. En ciertos modos de realización in vitro, las líneas celulares de linfocitos B autólogos se incuban con un vector vírico de la presente invención durante 24 a 48 horas, o con una SpA y/o coagulasa variante y/o cualquier otra composición descrita en la presente patente durante dos horas. Las células transducidas pueden entonces ser utilizadas para su análisis in vitro, o de manera alternativa para su administración ex vivo. Las patentes estadounidenses 4,690,915 y 5,199,942, revelan métodos para la manipulación ex vivo de células mononucleares sanguíneas y células de la médula ósea para su uso en aplicaciones terapéuticas.

VII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar diversos modos de realización de la invención y no pretenden limitar la presente invención en modo alguno. Un experto en el arte apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionadas, además de aquellos objetos, fines y ventajas inherentes en la presente patente. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente patente son actualmente representativos de modos de realización preferidos, son ejemplos y han de entenderse como limitaciones del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Variantes de la proteína A no toxigénicas como vacunas subunitarias para prevenir infecciones por Staphylococcus aureus

Un modelo animal para una infección p o r S. aureus se infectaron ratones BALB/c mediante inyección intravenosa con 1X107 UFC del aislado clínico humano S. aureus Newman (Baba et al., 2007). Dentro de un periodo de 6 horas a continuación de la infección, 99,999% de los estafilococos desaparecieron de la corriente sanguínea y se distribuyeron a la vasculatura. La diseminación estafilocócica a los tejidos periféricos tuvo lugar rápidamente, a medida que la carga bacteriana en el riñón y otros tejidos de órganos periféricos alcanzaron un valor 1X105 UFC g-1 dentro de las tres primeras horas. La carga estafilocócica en los tejidos del riñón aumentó en 1,5 log de UFC en veinticuatro horas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, los ratones desarrollaron abscesos diseminados en múltiples órganos, detectables mediante microscopía óptica de tejido renal en secciones finas, y coloreado con hematoxilina-eosina. El diámetro inicial de los abscesos fue de 524 j M (± 65 j M); se marcaron inicialmente las lesiones mediante un influjo de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y no albergaban ninguna organización de estafilococos discernible, la mayoría de los cuales parecían residir dentro de las PMN. En el día 5 de la infección, los abscesos aumentaron en tamaño e incluyeron una población central de estafilococos, rodeados de una capa de material amorfo eosinófilo y una gran masa de PMNs. La histopatología reveló una necrosis masiva de los PMN en proximidad a los nidos estafilocócicos en el centro de las lesiones de abscesos, además de un manto de fagocitos saludables. Se observó además un borde de PMNs necróticos en la periferia de las lesiones de abscesos, bordeando material eosinofílico, amorfo que separa el tejido renal saludable de las lesiones. Finalmente, los abscesos alcanzaron un diámetro de > 1.524 j M en el día 15 o 36. En intervalos de tiempo posteriores, la carga estafilocócica fue aumentada a 104-106 UFC g-1 y el crecimiento de lesiones de abscesos migró hacia la cápsula del órgano. Las lesiones periféricas estaban predispuestas a la ruptura, liberando de este modo material necrótico y estafilococos en la cavidad peritoneal o el espacio retroperitoneal. Estos eventos dieron como resultado una bacteriemia además de una onda secundaria de abscesos, lo que precipitó finalmente un desenlace letal.

Para enumerar la carga estafilocócica en el tejido renal, se sacrificaron los animales, se extirparon sus riñones y el homogeneizado de tejido se extendió sobre medio de agar para la formación de colonias. En el día 5 de la infección, se observó una media de 1X3106 de UFC g-1 de tejido renal para S. aureus Newman. Para cuantificar la formación de abscesos, se inspeccionaron visualmente los riñones, y se otorgó a cada órgano individual una puntuación de uno o cero. La suma final se dividió por el número total de riñones para calcular el porcentaje de abscesos en la superficie (Tabla 3). Además, unos riñones elegidos aleatoriamente se fijaron en formalina, se incluyeron, se prepararon en secciones finas, y se colorearon con hematoxilina-eosina. Para cada riñón, se observaron por microscopía cuatro secciones sagitales en intervalos de 200 j M. Se contaron los números de lesiones para cada sección y se calculó la media para cuantificar el número de abscesos dentro de los riñones. El S. aureus Newman causó 4,364 ± 0,889 de abscesos por riñón, y se observaron abscesos en la superficie en 14 de 20 riñones (70%) (Tabla 3).

Cuando se examinó mediante microscopio de barrido electrónico, el S. aureus Newman se situó en césped estrechamente asociado en el centro de los abscesos. Los estafilococos estaban contenidos por pseudocápsulas amorfas que separaban las bacterias de la masa de leucocitos de los abscesos. No se observaron células inmunes en estos nidos centrales de estafilococos, sin embargo se situaron glóbulos rojos ocasionales entre las bacterias. Las poblaciones bacterianas en el centro del absceso, designadas como comunidades de abscesos estafilocócicas (SAC), se mostraron homogéneas y recubiertas por un material granular denso en electrones. La cinética de la apariencia de las lesiones infecciosas y los atributos morfológicos de los abscesos formados por el S. aureus Newman fueron similares a lo observado tras la infección del ratón con S. aureus USA300 (LAC), el actual clon de S.aureus epidémico resistente a meticilina adquirido en la comunidad (CA-SARM) en los Estados Unidos (Diep et al., 2006).

Tabla 3. Requerimientos genéticos para la formación de abscesos por S. aureus Newman en ratones

Carga estafilocócica en el tejido renal_______________Formación de Abscesos en tejido renal Genotipo alog10 Significancia cReducción dAbscesos eNúmero de Significancia UFC g-1 (Valor-P) (log ¹⁰ UFC g- de la Abscesos (valor P) tejido 1) Superficie Por riñón

(%)

Tipo 6,141±

silvestre 70 4,364±0,889

0,192

AsrtA 4,095±

_0,3476,7X10-6 2,046 0 0,000±0,000 0,0216 Spa 5,137

_0,3740,0144 1,004 13 0,375 ± 0,374 0,0356 aMedias de la carga estafilocócica calculada como log10 UFC g-1 en tejidos renales homogeneizados 5 días a continuación de la infección en cohortes de quince ratones BALB/c por cepa de prueba de provocación. Se indica el error estándar de la media (±SEM).

bSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student y los valores P registrados; los valores P <0,05 se consideraron significativos.

cSe calculó la reducción en la carga bacteriana como el valor log10 UFC g-1.

dSe midió la formación de abscesos en los tejidos del riñón cinco días después de la infección mediante inspección macroscópica (% positivo)

eHistopatología de riñones de ocho a diez animales en secciones finas y con tinción de hematoxilina-eosina; se registró la cantidad media de abscesos por riñón y se calculó la media nuevamente para la media final (±SEM). fSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student y los valores P registrados; los valores P <0,05 se consideraron significativos.

Mutantes de la proteína A (spa) del S. aureus son avirulentos y no pueden formar abscesos La Sortasa A es una transpeptidasa que inmoviliza diecinueve proteínas de superficie en la envoltura de la cepa Newman del S aureus (Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). Trabajos anteriores identificaron la sortasa A como un factor de virulencia en múltiples sistemas de modelos de animales, sin embargo las contribuciones de esta enzima y sus proteínas de superficie ancladas para la formación o persistencia de abscesos no han sido aún reveladas (Jonsson et al., 2002; Weiss et al., 2004). En comparación con la cepa parental de origen silvestre (Baba et al., 2007), una variante isogénica (AsrtA) no formó lesiones de abscesos ni en el examen macroscópico ni en la histopatología en los días 2, 5, o 15. En los ratones infectados con el mutante de strA, únicamente se recuperó 1X104 UFC g-1 del tejido renal en el día 5 de la infección que es una reducción de 2,046 log10 UFC g-1 en comparación con la cepa parental de tipo silvestre (P=6,73X10-6). Se observó un defecto similar para el mutante de srtA de la cepa USA300 de SARM (datos no mostrados). El microscopio de barrido electrónico mostró que los mutantes de srtA se encontraban sumamente dispersados y a menudo asociados con leucocitos en tejido renal saludable por lo demás. En el día quince a continuación de la infección, los mutantes de srtA se eliminaron de los tejidos renales, una reducción > 3,5 log10 UFCg-1 en comparación con el tipo silvestre (Tabla 3). Por tanto, las proteínas de superficie ancladas por la sortasa A permiten la formación de lesiones de abscesos y la persistencia de bacterias en los tejidos del huésped, en donde los estafilococos se reproducen como comunidades incluidas en una matriz extracelular y protegido de los leucocitos por una pseudocápsula amorfa.

La sortasa A ancla un gran espectro de proteínas con señales de clasificación del motivo LPXTG a la envoltura de la pared celular, proporcionando de ese modo a la superficie de presentación de muchos factores de virulencia (Mazmanian et al., 2002). Para identificar las proteínas de superficie requeridas para la formación de abscesos estafilocócicos, se introdujeron inserciones de bursa aurealis en secuencias de codificación 5' de genes que codifican polipéptidos con proteínas del motivo LPXTG (Bae et al., 2004) y estas mutaciones fueron transducidas en S. aureus Newman. Las mutaciones en el gen estructural para la proteína A (spa) redujo la carga estafilocócica en tejidos de riñón de ratón infectados en un valor 1,004 log10 (P=0,0144). Cuando se analizaron para determinar su capacidad para formar abscesos en tejidos renales mediante histopatología, se observó que los mutantes de spa no fueron capaces de formar abscesos en comparación con la cepa parental de tipo silvestre de S. aureus Newman (4,364 ± 0,889 abscesos de S. aureus Newman por riñón vs. la mutante de spa isogénica con 0,375 ± 0,374 lesiones; P = 0,0356).

La proteína A bloquea las respuestas inmunes innata y adaptativa. Algunos estudios han identificado la proteína A como un factor de virulencia de vital importancia durante la patogénesis de las infecciones por S. auneus. Trabajos anteriores demostraron que la proteína A impide la fagocitosis de los estafilococos uniendo el componente Fc de la inmunoglobulina (Jensen 1958; Uhlén et al., 1984), activa la agregación de plaquetas a través del factor de Von WIllebrand (Hartleib et al., 2000), funciona como un superantígeno de linfocitos B capturando la región F(ab)2 del IgM que lleva VH3 (Roben et al., 1995), y, a través de su activación del TNFR1, puede iniciar la neumonía estafilocócica (Gomez et al., 2004). Debido al hecho de que la proteína A captura la inmunoglobulina y muestra atributos tóxicos, la posibilidad de que esta molécula de superficie puede funcionar como una vacuna en humanos no se ha perseguido rigurosamente. Los inventores demuestran por primera vez que las variantes de proteína A ya no son capaces de unirse a las inmunoglobulinas, vWF y TNFR-1 se eliminan de su potencial toxigénico y son capaces de estimular respuestas inmunes humorales que protegen contra la enfermedad estafilocócica.

Base m olecular de la función y presentación de superficie de la proteína A. La proteína A se sintetiza como un precursor en el citoplasma bacteriano y se segrega a través de su péptido de señal YSIRK en la pared transversal, es decir, el septo de división celular de los estafilococos (FIG. 1A). (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Después de la escisión de la señal de clasificación LPXTG C-terminal, la proteína A se encuentra anclada a puentes transversales del péptidoglicano bacteriano mediante la sortasa A (Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). La proteína A es la proteína de superficie más abundante de los estafilococos; la molécula es expresada por prácticamente todas las cepas de S. aureus (Said-Salim et al., 2003; Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008). Los estafilococos giran alrededor de un 15-20% de su pared celular por ciclo de división (Navarre y Schneewind, 1999). Las hidrolasas murinas cortan las cadenas de glicano y los péptidos de pared del péptidoglicano, liberando de este modo la proteína A con su tetrapéptido disacárido unido de la pared celular C-terminal hacia el medio extracelular (Ton-That et al., 1999). Por tanto, mediante su diseño fisiológico, la proteína A es anclada a la pared celular y mostrada sobre la superficie bacteriana, pero también se libera hacia los tejidos circundantes durante la infección del huésped (Marraffini et al., 2006).

La proteína A captura inmunoglobulinas en la superficie bacteriana y esta actividad bioquímica permite el escape estafilocócico de las respuestas inmunes innatas y adquiridas del huésped (Jensen, 1958; Goodyear y Silverman, 2004). De manera interesante, la región X de la proteína A (Guss et al., 1984), un dominio de repetición que une los dominios de unión a IgG a la señal de clasificación LPXTG / anclaje a la pared celular, es quizás la porción más variable del genoma estafilocócico (Schneewind et al., 1992; Said-Salim, 2003). Cada uno de los cinco dominios de unión a la inmunoglobulina de la proteína A (SpA), formados a partir de haces de tres hélices y denominados E, D, A, B, y C, ejerce propiedades funcionales y estructurales similares (Sjodahl, 1977; Jansson et al., 1998). La estructura cristalina y en solución del dominio D se ha resuelto con y sin los ligandos Fc y V^h3 (Fab), los cuales se unen a la proteína A de una forma no competitiva en distintos sitios (Graille et al., 2000).

En el complejo de estructura cristalina, la región Fab interactúa con la hélice II y la hélice III del dominio D a través de una superficie compuesta de cuatro cadenas p de la región VH (Graille et al., 2000). El eje mayor de la hélice II del dominio D es de aproximadamente 50° con respecto a la orientación de las cadenas, y la porción interhelicoidal del dominio D es la más proximal a la cadena C0. El sitio de interacción en Fab se encuentra apartado de la región constante de la cadena pesada y la cadena ligera de la Ig. La interacción implica los siguientes residuos del dominio D: Asp-36 de la hélice II, además de Asp-37 y Gln-40 en el bucle entre la hélice II y la hélice HI, además de otros residuos diversos con SpA-D (Graille et al., 2000). Ambas superficies interactuantes están compuestas predominantemente de cadenas laterales polares, con tres residuos de carga negativa en el dominio D y dos residuos de carga positiva en la Fab 2A2 sumergida por la interacción, lo que proporciona una atracción electroestática global entre las dos moléculas. De las cinco interacciones polares identificadas entre Fab y el dominio D, tres son entre cadenas laterales. Se forma un puente de sal entre Arg-H19 y Asp-36 y se realizan dos enlaces de hidrógeno entre Tyr-H59 y Asp-37 y entre Asn-H82a y Ser-33. Debido a la conservación de Asp-36 y Asp-37 en todos los cinco dominios de unión a IgG de la proteína A, estos residuos fueron seleccionados para la mutagénesis.

Los sitios SpA-D responsables de la unión a Fab se encuentran estructuralmente separados de la superficie del dominio que hace de mediador en la unión a Fcy. La interacción de Fcy con el dominio B implica principalmente a los residuos en la hélice I, con una menor implicación de la hélice II (Deisenhofer, 1981; Gouda et al., 1992). Con la excepción de la Gln-32, un contacto de poca importancia en ambos complejos, ninguno de los residuos que hacen de mediadores en la interacción de Fcy, están implicados en la unión a Fab. Para examinar la relación espacial entre estos diferentes sitios de unión a Ig, los dominios de SpA en estos complejos han sido superpuestos para construir un modelo de un complejo entre Fab, el dominio D de SpA, y la molécula Fcy. En este modelo ternario, Fab y Fcy forman una estructura tipo sándwich alrededor de caras opuestas de la hélice II sin evidencia de impedimento estérico de ninguna de las interacciones. Estas observaciones ilustran cómo, a pesar de su pequeño tamaño (es decir, 56-61 aa), un dominio de la SpA puede mostrar simultáneamente ambas actividades, lo que explica la evidencia experimental de que las interacciones de Fab con un dominio individual son no-competitivas. Los residuos para la interacción entre SpA-D y Fcy son Gln-9 y Gln-10.

En contraste, la ocupación de la porción Fc de la IgG en el dominio D bloquea su interacción con el vWF A1 y probablemente también el TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006). Las mutaciones en los residuos esenciales para la unión a Fc de la IgG (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, 31 y K35) también se requieren para la unión al vWF A1 y al TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gómez et al., 2006; O'Seaghdha et al., 2006), mientras que los residuos de vital importancia para la interacción con V^h3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, n 43, E47) no tienen impacto alguno en las actividades de unión de la Fc, el vW f A1 o el TNFR1 de la IgG (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). La actividad de unión a Fab de la inmunoglobulina de la proteína A establece como diana un subconjunto de linfocitos B que expresan IgM relacionado con la familia VH3 en su superficie, es decir, estas moléculas funcionan como receptores de linfocitos B de tipo VH3 (Roben et al., 1995). Ante la interacción con la SpA, estos linfocitos B proliferan rápidamente y a continuación se destinan a la apoptosis, lo que conduce a una deleción preferencial y prolongada de los linfocitos B de tipo innato (es decir, linfocitos B de la zona marginal y linfocitos B2 foliculares) (Goodyear y Silverman, 2003; Goodyear y Silverman, 2004). Es importante señalar que más del 40% de los linfocitos B circulantes son la diana de la interacción de la proteína A, y la familia VH3 representa la familia más grande de receptores de linfocitos B humanos que imparten respuestas humorales protectoras contra patógenos (Goodyear y Silverman, 2003; Goodyear y Silverman, 2004). Por tanto, la proteína A funciona de forma análoga a los superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), a pesar de que esta última clase de moléculas, por ejemplo, SEB, TSST-1, TSST-2, forman complejos con el receptor de linfocitos T para estimular inadecuadamente las respuestas inmunes del huésped y provocando de ese modo características de enfermedad típicas de las infecciones estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Estas observaciones en conjunto documentan las contribuciones de la proteína A en cuanto a establecer infecciones estafilocócicas y modular las respuestas inmunes del huésped.

Variante no toxigénica de la proteína A. Los inventores han desarrollado una variante no toxigénica de la proteína A estafilocócica y, con este reactivo en mano, se pusieron como objetivo por primera vez a medir la respuesta inmune de animales a la inmunización de la proteína A. Además, los inventores abordaron la cuestión de si la inmunización de animales con una variante de la proteína A podría generar respuestas inmunes que elevaran la inmunidad protectora contra la infección estafilocócica.

Para alterar las actividades de unión de Fcy, vWF AI y TNFR1 a la IgG de la proteína A, se modificaron los residuos 9 y 10 de la glutamina (Q) [la numeración aquí es obtenida a partir de la establecida para el dominio D de la SpA] generando sustituciones de lisina o glicina para ambas glutaminas esperando que estas sustituciones supriman los enlaces de iones formados entre la proteína A de tipo silvestre y sus ligandos. El efecto añadido de las dobles sustituciones de lisina puede ser que estos residuos con carga positiva instituyen una carga repelente para las inmunoglobulinas. Para alterar la unión de Fab VH3 a la IgM, los inventores seleccionaros los residuos de aspartato (D) 36 y 37 de la SpA-D, cada uno de los cuales se requiere para la asociación de la proteína A con el receptor del linfocito B. Los D36 y el D37 fueron ambos sustituidos con alanina. Las mutaciones Q9, 10K y D36, 37A se combinaron en la molécula recombinante SpA-DQ9,10K-;D36,37A y se examinaron para determinar las propiedades de unión de la proteína A.

En breve, la secuencia genómica de la proteína A (spa) de Staphylococcus aureus N315 se amplificó mediante PCR con los cebadores (GCT GCACAT AT GGCGCAACACGAT GAAGCTCAAC [cebador5'](SEQ ID NO:35) y AGTGGATCCTTATGCTTTGTTAGCATCTGC [cebador 3'] (SEQ ID NO:36)), clonados en el vector pET15b (pYSJ1, codones 48-486) (Stranger-Jones, et al., 2006), y el plásmido recombinante se transformó en E. coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990). El producto de la proteína A obtenido de pYSJ1 alberga los residuos 36-265 de la SpA fusionados al marcador His N-terminal (MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ LID N0:37)). Después de la expresión inducible por IPTG, la SpA marcada con His6 N-terminal recombinante fue purificada por cromatografía de afinidad sobre resina de Ni-NTA (Stranger-Jones et al., 2006). El dominio D de SpA (SpA-D) fue amplificado por PCR con un par de cebadores específicos (AACATATGTTCAACAAAGATCAACAAAGC [cebador 5'](SEQ ID NO:38) y AAGGATCCAGATTCGTTTAATTTTTTAGC [cebador 3'] (SEQ ID NO:39)), subclonados en el vector pET15b (pHAN1, codones 212-261 de spa), y el plásmido recombinante se transformó en E. coli BL21(DE3) para expresar y purificar la proteína marcada con His6 N-terminal recombinante. Para generar mutaciones en la secuencia de codificación de SpA-D, se sintetizaron conjuntos de dos pares de cebadores (para las sustituciones de D a A: CTTCATTCAAAGTCTTAAAGCCGCCCCAAGCCAAAGCACTAAC [cebador 5'] (SEQ ID NO:40) y GTTAGTGCTTTGGCTTGGGGCGGCTTTAAGACTTTGAATGAAG [cebador 3'] (SEQ ID NO:41); para sustituciones de Q a K, CATATGTTCAACAAAGATAAAAAAAGCGCCTTCTATGAAATC [cebador 5'] (SEQ ID NO:42) y GATTTCATAGAAGGCGCTTTTTTTATCTTTGTTGAACATATG [cebador 3'] (SEQ ID NO:43); para sustituciones de Q a G, CATAT GTTCAACAAAGATGGAGGAAGCGCCTTCTATGAAATC [cebador 5'] (SEQ ID NO:44) y GATTTCATAGAAGGCGCTTCCTCCATCTTTGTTGAACATATG' [cebador 3'] (SEQ ID NO:45). Los cebadores sew utilizaron para protocolos de mutagénesis de cambios rápidos. A continuación de la mutagénesis, las secuencias de ADN se confirmaron para cada una de las proteínas recombinantes: SpA, SpA-D y SpA-DQ9,10G;D36,37A y SpA-D^q9,10K;D36,37^a. Todas las proteínas fueron purificadas a partir de lisados de E. coli recombinante utilizando cromatografía con Ni-NTA, y posteriormente se dializaron contra PBS y se almacenaron a 4°C.

Para medir la unión de la inmunoglobulina a la proteína A y a sus variantes, se diluyeron 200 |jg de proteína purificada en un volumen de 1 ml utilizando un tampón de columna (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH7,5), y a continuación se cargó en una columna de Ni-NTA pre-equilibrada (1 ml de volumen del lecho). Las columnas se lavaron con 10 ml de tampón de columna. Se diluyeron 200 jg de IgG humano en un volumen total de tampón de columna de 1 ml y a continuación se aplicó a cada una de las columnas cargadas con proteína A y sus variantes. Las columnas se lavaron posteriormente con 5 ml de tampón de lavado (10 mM de imidazol en tampón de columna) y 5 ml de tampón de columna. Las muestras de proteínas se eluyeron con 2 ml de tampón de elución (500 mM de imidazol en tampón de columna), se recogieron las fracciones y los alícuotas se sometieron a electroforesis en gel SDS-PAGE, seguido de tinción con azul Coomassie. Tal como se muestra en la Figura 1C, la proteína A de tipo silvestre (SpA) y su dominio D de SpA ambos mantuvieron la inmunoglobulina durante la cromatografía. En contraste, la variante de SpA-Dq9,10K;D36,37a no se unió a la inmunoglobulina.

Para cuantificar la unión de la proteína A y sus variantes a la porción Fc de la inmunoglobulina y el dominio VH3 de Fab, se utilizó inmunoglobulina G humana conjugada con HRP [hIgG], la porción Fc de la IgG humana [hFc] y la porción F(ab)2 de la IgG humana [hF(ab)2] además de ensayos ELISA para cuantificar la cantidad relativa de unión a la proteína A y sus variantes. Los datos en la Figura ID demuestran la unión de SpA y SpA-D a hIgG y hFc, mientras que SpA-Dq9,iog;D36,37a y SpA-Dq9,iok;D36,37a mostraron únicamente actividades de unión secundarias. La SpA enlazó cantidades similares de hFc y hF(ab)2, sin embargo la unión de SpA-D a hF(ab)2 fue reducida en comparación con la SpA de longitud completa. Este resultado sugiere que la presencia de múltiples dominios de unión a IgG puede aumentar de forma cooperativa la capacidad de la proteína A para unirse al receptor de linfocitos B. Cuando se compara con el reducido poder de unión de SpA-D para hF(ab)2, de las dos variantes únicamente SpA-Dq9,iok;D36,37a mostró una reducción significativa en la capacidad para unirse al dominio VH3 de la inmunoglobulina. Para examinar los atributos toxigénicos de SpA-D y sus variantes, se inyectaron proteínas purificadas en ratones, que fueron sacrificados después de 4 horas para extraer sus bazos. El tejido de los órganos fue homogeneizado, se eliminó material capsular y se colorearon linfocitos B con anticuerpos CD19 fluorescentes. A continuación del análisis FACS para cuantificar la abundancia de linfocitos B en tejido esplénico, se observó que la SpA causa una caída del 5% en el conteo de linfocitos B en comparación con un control con mock (PBS) (Figura 1E). En contraste, SpA-Dq9,iok;D36,37a no causó ninguna reducción en los conteos de linfocitos B, lo que indica que la molécula mutante había perdido sus atributos toxigénicos de estimular la proliferación y muerte de linfocitos B (Figura 1E). En resumen, las sustituciones de aminoácidos en los residuos Q9, Q10, D36, y D37 de la SpA-d suprimieron la capacidad de los dominios de la proteína A para unirse a las inmunoglobulinas o ejercer funciones toxigénicas en tejidos humanos o animales.

Las variantes de la proteína A no toxigénica provocan la protección de la vacuna. Para probar si la proteína A y sus variantes pueden funcionar como antígenos de vacuna o no, se emulsionaron SpA, SpA-D, SPA-Dq9,iok;D36,37a, y SpA-Dq9,iog;D36,37a con adyuvante de Freund completo o incompleto y se inmunizaron ratones BALB/c de 4 semanas en el día 1 y en el día 11 con 50 |jg de proteína purificada. Se analizaron cohortes de animales (n=5) para determinar las respuestas inmunes a la inmunización mediante sangrado de los animales antes (día 0) y después del esquema de inmunización (día 21). La tabla 4 indica que los ratones inmunizados generaron una modesta respuesta inmune humoral dirigida a la proteína A o a su módulo SpA-D, mientras que la cantidad de anticuerpo generado después de la inmunización con SpA-Dq9,iok;D36,37a o SpA-Dq9,iog;D36,37a aumentó de cuatro a cinco veces. Después de la prueba de provocación intravenosa con 1 X 107 UFC de S. aureus Newman, los animales se sacrificaron en el día 4, se extrajeron sus riñones y o bien se analizaron para determinar la carga estafilocócica (colocando en placas homgeneizado tisular sobre placas de agar y enumerando las unidades formadoras de colonia, UFC) o realizando histopatología. Tal como se esperaba, los ratones inmunizados con mock (PBS) (n=19) albergaron 6,46 logio (± 0,25) UFC en el tejido renal y las lesiones infecciosas se organizaron en 3,7 (± 1,2) abscesos por órgano (n=10) (Tabla 4). La inmunización de los animales con SpA condujo a una reducción de 2,51 logio UFC en el día 5 (P=0,0003) con 2,1 (± 1,2) abscesos por órgano. Los últimos datos indican que no hubo una reducción significativa en la formación de abscesos (P=0,35). La inmunización con SpA-D generó resultados similares: una reducción de 2,03 logio UFC en el día 5 (P=0,0001) con 1,5 (± 0,8) abscesos por órgano (P=0,15). En contraste, la inmunización con SpA-Dq9,iok;D36,37a o SpA-Dq9,iog;D36,37a creó un aumento de la protección, con una reducción de 3,07 logio y 3,03 logio UFC en el día 4, respectivamente (significancia estadística P<0,0001 para ambas observaciones). Además, la inmunización tanto con SpA-Dq9,iok;D36,37a como con SpA-Dq9,iog;D36,37a generó una protección significativa de la formación de abscesos estafilocócicos, ya que solamente se identificaron 0,5 (± 0,4) y 0,8 (± 0,5) lesiones infecciosas por órgano (P=0,02 y P=0,04). La inmunización con variantes de proteína A no toxigénicas genera un aunmento de las respuestas inmunes humorales para la proteína A y proporciona inmunidad contra la prueba de provocación estafilocócica. Estos datos indican que la proteína A es un candidato ideal para una vacuna humana que prevenga una enfermedad por S. aureus.

Estos emocionantes resultados tienen diversas implicaciones para el diseño de una vacuna humana. En primer lugar, la generación de mutaciones por sustitución que afectan a la capacidad de los dominios de unión a inmunoglobulina de la proteína A, ya sea sola o en combinación con dos o más dominios, puede generar variantes no toxigénicas adecuadas para el desarrollo de una vacuna. Parece probable que una combinación de dominios de unión a IgG mutantes que se asemeje mucho a la estructura de la proteína A, pueda generar incluso mejores respuestas humorales, tal como se describe aquí para la SpA-dominio D por sí sola. Además, una propiedad probable de los anticuerpos específicos de la proteína A puede ser que la interacción de los sitios de unión del antígeno con la superficie microbiana puede neutralizar la capacidad de los estafilococos de capturar inmunoglobulinas a través de la porción Fc, o de estimular el receptor de linfocitos B a través de las actividades de unión de VH3.

Tabla 4. Variantes de la proteína A no toxigénicos como antígenos de vacunas que previenen la enfermedad por S.

aureus

Carga bacteriana en el riñón (n=número de Título de IgG Formación de abscesos en ratones (n=número de ratones ratones) Antígeno alog10 bReducción cValor P dabscesos Reducción eHistopatología Reducción fValor UFC g-1 de P superficie

Mock 6,46±0,25 - - <100 14/19 - 3,7 ± 1,2 - -(n=19) (70%) (n=10)

SpA 3,95±0,56 2,51 0,0003 1706±370 10/20 32% 2,1 ± 1,2 2,2 0,35

(n=20) (50%) (n=10)

SpA-D 4,43±0,41 2,03 0,0001 381±27 10/18 25% 1,5±0,8 (n=10) 2,2 0,15

(n=18) (55%)

SpA-D1 3,39±0,50 3,07 <0,0001 5600±801 6/20 59% 0,5±0,4 (n=10) 3,2 0,02

(n=19) (30%)

SpA-D2 3,43±0,46 3,03 <0,0001 3980±676 6/19 57% 0,8±0,5 (n=10) 2,9 0,04

(n=19) (32%)

aMedias de la carga estafilocócica calculada como log10 UFC g-1 en tejidos renales homogeneizados 4 días a continuación de la infección en cohortes de 18 a 20 ratones BALB/c. Se indica el error estándar de la media (±SEM).

cReducción en la carga bacteriana calculada como log10 UFC g-1.

dSe midió la formación de abscesos en los tejidos del riñón cuatro días después de la infección mediante inspección macroscópica (% positivo)

eHistopatología de riñones de diez animales en secciones finas y con tinción de hematoxilina-eosina; se registró la cantidad de abscesos por riñón y se calculó la media para la media final (±SEM).

fSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student y los valores P registrados; los valores P <0,05 se consideraron significativos.

SpA-D1 y SpA-D2 representan SpA-Dq9,1qk;d36,37a y SpA-Dq9,1qg;d36,37a, respectivamente.________________________________

Protección de la vacuna en abscesos murinos, infección letal murina, y modelos de neumonía murinos. Se han establecido tres modelos de animales para el estudio de la enfermedad infecciosa por S. aureus. Estos modelos se utilizan aquí para examinar el nivel de inmunidad protectora proporcionada a través de la generación de los anticuerpos específicos de la proteína A.

Materiales y métodos

Abscesos murinos - se inmunizan ratones BALB/c (hembras de 24 días de edad, 8-10 ratones por grupo, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) mediante inyección intramuscular en la pata trasera con proteína purificada (Chang et al., 2003; Schneewind et al., 1992). Se administra SpA, SpA-D o SpA-DQ9,10K;D36,37A purificada (50 ug de proteína) en los días 0 (emulsionada en una relación 1:1 con adyuvante completo de Freund) y 11 (emulsionada en una relación 1:1 con adyuvante incompleto de Freund). Se extraen muestras de sangre mediante sangrado retroorbital en los días 0, 11, y 20. Se examinan los sueros mediante ELISA para determinar los títulos de IgG para las actividades de unión específica de SpA-D y SpA-DQ9,10K;D36,37A. Los animales inmunizados se someten a una prueba de provocación en el día 21 mediante inyección retroorbital de 100 pl de una suspensión de S. aureus Newman o S. aureus USA300 (1 x 107 ufc). Para ello, se diluyen cultivos de toda la noche de S. aureus Newman en una relación 1:100 en caldos de soya tríptica frescos y se cultivaron durante 3 h a 37°C. Los estafilococos se centrifugan, se lavan dos veces y se diluyen en PBS para producir un A600 de 0,4 (1 x 108 ufc por ml). Se verifican las diluciones de forma experimental mediante colocación en placas de agar y formación de colonias. Los ratones se anestesian por inyección intraperitoneal de 80-120 mg of ketamina y 3-6 mg de xilacina por kilogramo de peso corporal y se infectaron mediante inyección retroorbital. En el día 5 o 15 a continuación de la prueba de provocación, se practica la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2 comprimido. Los riñones son extraídos y homogeneizados en 1% Triton X-100. Los alícuotas se diluyen y se colocan en placas sobre medio de agar para la determinación por triplicado de las ufc. Para la histología, el tejido renal se incuba a temperatura ambiente en in 10% de formalina durante 24 h. Los tejidos se incluyen en parafina, se preparan en secciones finas, y se colorean con tinción de hematoxilina-eosina, y se examinaron mediante microscopía.

Infección letal murina - se inmunizan ratones BALB/c (hembras de 24 días de edad, 8-10 ratones por grupo, Charles River Laboratories, Wilinington, MA) mediante inyección intramuscular en la pata trasera con proteína SpA, SpA-D o SpA-Dq9,1ok;D36,37a purificada (50 pg de proteína).La vacuna se administra en los días 0 (emulsionada en una relación 1:1 con adyuvante completo de Freund) y 11 (emulsionada en una relación 1:1 con adyuvante incompleto de Freund). Se extraen muestras de sangre mediante sangrado retroorbital en los días 0, 11, y 20. Se examinan los sueros mediante ELISA para determinar los títulos de IgG para la actividad de unión específica de SpA-D y SpA-DQ9,i0K;D36,37A. Los animales inmunizados se someten a una prueba de provocación en el día 21 mediante inyección retroorbital de 100 |jl de una suspensión de S. aureus Newman o S. aureus USA300 (15 x 107 ufc) (34). Para ello, se diluyen cultivos de toda la noche de S. aureus Newman en una relación 1:100 en caldo de soya tríptica fresco y se cultivaron durante 3 h a 37°C. Los estafilococos se centrifugan, se lavan dos veces y se diluyen en PBS para producir un A600 de 0,4 (1 x 108 ufc por ml) y se concentraron. Se verifican las diluciones de forma experimental mediante colocación en placas de agar y formación de colonias. Los ratones se anestesian por inyección intraperitoneal de 80-120 mg of ketamina y 3-6 mg de xilacina por kilogramo de peso corporal. Los animales inmunizados se someten a prueba de provocación en el día 21 mediante inyección intraperitoneal con 2 X 1010 ufc de S. aureus Newman de 3- 10 x 109 ufc de aislados de S. aureus clínico. Los animales son monitorizados durante 14 días, y se registra la enfermedad letal.

Modelo de neumonía murino - Se cultivan cepas de S. aureus Newman o USA300 (LAC) a 37°C en caldo de soja tríptica/agar para OD6600,5. Se centrifugan 50-ml alícuotas del cultivo, se lavan en PBS, y se suspenden en 750 j l de p Bs para realizar estudios de mortalidad (3-4 x 108 UFC por un volumen de 30-jl), o 1.250 j l de PBS (2 x 108 UFC por volumen de 30-jl) para experimentos de carga bacteriana e histopatología (2, 3). Para la infección del pulmón, se anestesian ratones C57BL/6J de 7 semanas de vida (The Jackson Laboratory) antes de la inoculación de 30 j l de suspensión de S. aureus en la fosa nasal izquierda. Los animales se introducen en la jaula en posición supina para su recuperación y se obervaron durante 14 días. Para la inmunización activa, ratones de 14 semanas de vida reciben 20 jg de SpA-D o SPA-Dq9,10K;D36,37a en CFA (adyuvante comleto de Freund) en el día 0 porvía i.m., seguido de un refuerzo con 20 jg de SpA-D o SpA-DQ9,10K;D36,37A en adyuvante incompleto de Freund (IFA) en el día 10. Los animales se someten a prueba de provocación con S. aureus en el día 21. Se recogen los sueros antes de la inmunización en el día 20 para evaluar la producción de anticuerpos específicos. Para estudios de inmunización pasiva, ratones de 7 semanas de vida reciben 100 j l de NRS (suero normal de conejo) o bien antisuero de conejo específico de SpA-D por inyección i.p. 24 h antes de la prueba de provocación. Para evaluar las correlaciones patológicas de la neumonía, los animales infectados se sacrifican mediante inhalación de CO2 forzada antes de la extracción de ambos pulmones. El pulmón derecho es homogeneizado para la enumeración de la carga bacteriana. El pulmón izquierdo se coloca en formalina al 1% y se incluye en parafina, se prepara en secciones finas, se colorea con hematoxilina-eosina, y se analiza mediante microscopía.

Anticuerpos de conejo. - Se utiliza 200 SpA-D o SpA-DQ9,10K;D36,37A purificada como inmunógeno para la producción de antisuero de conejo. Se emulsiona 200 jg de proteína con c Fa para su inyección en el día 0, seguido de inyecciones de refuerzo con 200 jg de proteína emulsionada con IFA los días 21 y 42. Los títulos de anticuerpos de conejo se determinan mediante ELISA. Se obtienen anticuerpos purificados mediante cromatografía por afinidad de suero de conejo en SpA-D o SpA-DQ9,10K;D36,37A sefarosa. La concentración de anticuerpos eluídos se mide mediante absorbancia en A280 y los títulos de anticuerpos específicos se determinan mediante ELISA.

Inmunización activa con variantes de SpA-dominio D. - Para determinar la eficacia de la vacuna, los animales se inmunizan de forma activa con SPA-D o SpADQ9,10K; d36,37a purificada. Como control, los animales se inmunizan solo con adyuvante. Se determinan los títulos de anticuerpos contra las preparaciones de proteína A utilizando SPA-D o SpA-DQ9,10K;D36,37A como antígenos; ha de señalarse que la variante de SpADQ9,10K;D36,37A no puede unirse a la porción Fc o Fab de la IgG. Utilizando los modelos de enfermedades infecciosas descritos anteriormente, se mide cualquier reducción en la carga bacteriana (abscesos murinos y neumonía), evidencia de histopatología de la enfermedad estafilocócica (abscesos murinos y neumonía) y protección de la enfermedad letal (prueba de provocación letal murina y neumonía).

Inmunización pasiva con anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad generados contra las variantes de SpA-dominio D. - Para determinar la inmunidad protectora de los anticuerpos de conejo específicos de la proteína A, los ratones se inmunizan de forma pasica con 5 mg/kg SPA-D o SpADQ9,10K; d36,37a purificada obtenida de anticuerpos de conejo. Ambas preparaciones de anticuerpos se purifican mediante cromatografía de afinidad utilizando SPA-D o SpA-DQ9,10K;D36,37A. Como control, los animales se inmunizan de forma pasiva con anticuerpos rV10 (un antígeno de protección contra plagas que no tiene impacto alguno en el resultado de las infecciones estafilocócicas). Se determinan los títulos de anticuerpos contra todas las preparaciones de proteína A utilizando SpA-Dq9,10K;D36,37a como antígeno, y esta variante no puede unirse a la porción Fc o Fab de la IgG. Utilizando los modelos de enfermedades infecciosas descritos anteriormente, se mide la reducción en la carga bacteriana (abscesos murinos y neumonía), evidencia de histopatología de la enfermedad estafilocócica (abscesos murinos y neumonía) y la protección de la enfermedad letal (prueba de provocación letal murina y neumonía).

Ejemplo 2

Vacuna de proteína A no toxigénica para una infección por Staphylococcus aureus resitente a meticilina

Los aislados clínicos de S. aureus expresan la proteína A (Shopsin et al., 1999, cuyo producto de traducción primario está compuesto por un péptido señal N-terminal (DeDent et al., 2008), cinco dominios de unión a Ig (Ig-BD) (denominados E, D, A, B y C) (Sjodahl, 1977), una región X con repeticiones variables de un péptido de ocho residuos (Guss et al., 1984), y una señal de clasificación C-terminal para el anclaje de la pared celular de SpA (Schneewind et al., 1992; Schneewind et al., 1995) (FIG. 1A-1B). Guiada por la homología de aminoácidos (Uhlen et al., 1984), la estructura de haz de triple hélice a de los IgBDs (Deisenhofer et al., 1978; Deisenhofer et al., 1981) y sus interacciones atómicas con Fab V^h3 (Graille et al., 2000) o Fcy (Gouda et al., 1998), se seleccionó la glutamina 9 y la 10, además de aspartato 36 y 37 como de vital importancia para la asociación de SpA con anticuerpos o receptor de linfocitos B respectivamente. Las sustituciones Gln9Lys, G1n10Lys, Asp36Ala y Asp37Ala fueron introducidas en el dominio D para generar SPA-D^kkaa(FIG. 1B). La capacidad de la SpA-D o SpA-D^kkaapara unirse a la IgG humana fue analizada mediante cromatografía de afinidad (FlG. 1D). La SpA-D marcada con Polihistidina además de la SpA de longitud completa mantuvo el IgG humano en Ni-NTA, mientras que SPA-D^kkaay un control negativo (SrtA) no (FIG. 1C). Un resultado similar se observó con el factor de von Willebrand (Hartleib et al., 2000), el cual, junto con el receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1)(Gomez et al., 2004), puede también unirse a la proteína A a través de la glutamina 9 y 10 (FIG. 1D). La inmunoglobulina humana abarca un 60-70% de IgG de tipo v H3 humana. Los inventores distinguen entre el dominio Fc y la activación del receptor de linfocitos B de las Igs, y midieron la asociación de los fragmentos de Fcy y F(ab)2 humano, ambos de los cuales se unieron a la SpA o SpA-D de longitud completa, pero no a la SPA-D^kkaa(FiG. 1D). La inyección de SpA-D en la cavidad peritoneal de los ratones dio como resultado la expansión de linfocitos B seguida del colapso apoptótico de linfocitos CD19+ en tejido del bazo de ratones BALB/c (Goodyear y Silverman, 2003)(FIG. 1E). No se observó actividad de superantígenos de linfocitos B a continuación de la inyección con SpA-D^kkaa, y la tinción de TUNEL de tejido esplénico no detectó elaumento en células apoptóticas que siguen a la inyección de SpA o SpA-D (FIG. IE).

Anticuerpos contra SpA-D^kkaaprotegen contra infecciones por SASM y SARM. Se inyectaron en cada uno de los ratones BALB/c naive de seis semanas de vida 50|jg de SpA, SpA-D o SpA-D^kkaaemulsionado en CFA y reforzado con el mismo antígeno emulsionado en IFA. En concordancia con la hipótesis de que la SpA-D promueve el colapso apoptótico de las poblaciones de linfocitos B clonales activados, los inventores observaron un título diez veces mayor de anticuerpos específicos de SpA-D^kkaadespués de la inmunización de ratones con la variante no toxigénica en comparación con el superantígeno de linfocitos B (Spa-D vs. SpA-D^kkaaP <0,0001, Tabla 5). Los títulos de anticuerpos generados por la inmunización con la SpA de longitud completa fueron más elevados que los generados por la SpA-D (P=0,0022), lo cual probablemente se debe al mayor tamaño y estructura del dominio reiterativa de este antígeno (Table 5). No obstante, incluso la SpA provocó títulos de anticuerpos inferiores a la SpA-D^kkaa(P=0,0003), que abarca únicametne 50 aminoácidos de la proteína A (520 residuos, SEQ ID NO:33). Los ratones inmunizados se sometieron a una prueba de provocación por inoculación intravenosa con S. aureus Newman y se examinó la capacidad de los estafilococos para diseminar abscesos en tejidos renales mediante necropsia cuatro días después de la prueba de provocación. En tejido renal homogeneizado de ratones inmunizados con mock (PBS/adyuvante), se enumeró una carga estafilocócica media de 6,46 log10 UFC g_1 (Tabla 5). La inmunización de ratones con SpA o SpA-D condujo a la reducción de la carga estafilocócica, sin embargo los animales vacunados con SpA-D^kkaamostraron una reducción incluso mayor, de 3,07 log10 UFC g_1 de S. aureus Newman en tejidos renales (P <0,0001, Tabla 5). La formación de abscesos en riñones se analizó mediatne histopatología (FIG. 2). Los animales inmunizados con mock albergaron una media de 3,7 (±1,2) abscesos por riñón (Tabla 5). La vacunación con SpA-D^kkaaredujo la cantidad media de abscesos a 0,5 (±0,4)(P= 0,0204), mientras que la inmunización con SpA o SpA-D no causó una reducción significativa en la cantidad de lesiones de abscesos (Tabla 5). Las lesiones de los animales vacunados con SpA-D^kkaafueron menores en tamaño, con menos PMNs infiltrantes y carecían, de forma característica, de comunidades de abscesos estafilocócicos (Cheng et al., 2009) (FIG. 2). Los abscesos en los animales que habían sido inmunizados con SpA o SpA-D mostraron la misma estructura general de las lesiones en animales inmunizados con mock (FIG. 2).

Los inventores examinaron si la inmunización con SpA-D^kkaapuede proteger los ratones contra las cepas SARM y seleccionaron el aislado USA300 LAC para realizar la prueba de provocación a los animales (Diep et al., 2006). Esta cepa CA-SARM sumamente virulenta se extendió rápidamente a través de los Estados Unidos, causando una morbilidad y mortalidad (Kennedy et al., 2008). En comparación con los ratones de control con adyuvante, los animales inmunizados con SpA-D^kkaaalbergaron una reducción en la carga bacteriana de los tejidos renales infectados de 1,07 log10 UFC g-1. El examen de la histopatología del tejido renal a continuación de la prueba de provocación con S. aureus USA300 reveló que la cantidad media de abscesos fue reducida de 4,04 (±0,8) a 1,6 (±0,6) (P=0,02774). En contraste, la inmunización con SpA o SpA-D no causó una reducción significativa en la carga bacteriana o en la formación de abscesos (Tabla 5).

Los anticuerpos de SpA-D^kkaaprevienen la interacción inmunoglobulina-proteína A . Se inmunizaron conejos con SpAD^kkaay los anticuerpos específicos se purificaron en columna de afinidad con SpA-D^kkaaseguido de SDS-PAGE (FIG. 3). La IgG específica de SpA-D^kkaase cortó con pepsina para generar fragmentos Fcy y F(ab)2, la última de las cuales se purificó mediante cromatografía en columna de SpA-D^kkaa(FIG. 3). La unión de la IgG humana o el vWF a la SpA o SpA-D se vio alterada por F(ab)2 específico de SpAD^kkaa, lo que indica que los anticuerpos obtenidos de SpA-D^kkaaneutralizan la función de superantígeno de los linfocitos B de la proteína A, además de sus interacciones con Ig (FIG. 3).

SpA^kkaagenera respuestas inmunes protectoras mejoradas. Para mejorar adicionalmente las propiedades de la vacuna para la proteína A no toxigénica, los inventores generaron SpA^kkaa, que incluye todos los cinco IgBDs con cuatro sustituciones de aminoácidos - sustituciones que corresponden a Gln9Lys, Gln10Lys, Asp36Ala y Asp37Ala del dominio D - en cada uno de sus cinco dominios (E, D, A, B y C). Se purificó la SpA^kkaamarcada con polihistidina mediante cromatografía de afinidad y se analizó mediante SDS-PAGE con tinción con azul Coomassie (FIG. 4). Al contrario que la SpA de longitud completa, la SpAkkaa no se une a la IgG humana, Fc y F(ab)2 o al vWF (FIG. 4). La SpAkkaa no mostró actividad superantigénica de los linfocitos B, ya que la inyección de la variante en los ratones BALB/c no causó una depleción de los linfocitos B CD19+ en tejido esplénico (FIG. 4). La vacuna de SpA kkaa generaron títulos de anticuerpos específicos más elevados que la inmunizació con SpA-Dkkaa y proporcionó ratones con una elevada protección contra la prueba de provocación con S. aureus USA300 (Tabla 5). Cuatro días después de la prueba de provocación, los animales vacunados con SpAkkaa albergaron 3,54 log10 UFC g-1 menos estafilococos en tejidos renales (P =0,0001) y también causó una reducción mayor en la cantidad de lesiones de abscesos (P=0,0109) (Tabla 5). Como prueba de si las vacunas de proteína A tienen un impacto en otras cepas de SARM, se sometió a prueba de provocación a ratones con el aislado Japonés de SARM resistente a vancomicina Mu50 (Hiramatsu et al., 1997). De forma similar a los datos observados con el aislado de SARM USA300, los animales vacunados con SpAkkaa albergaron menos estafilococos de Mu50 en los tejidos renales que los animales inmunizados con mock (P=0,0248, FIG. 7).

La transferencia pasiva de anticuerpos específicos de SpA previene la enfermedad estafilocócica. Se utilizó SpAkkaa par inmunizar conejos. Los anticuerpos de conejo específicos para SpA-Dkkaa o SpAkkaa se purificaron por afinidad en matrices con un antígeno afín inmovilizado e inyectado a una concentración de 5 mg por kg-1 de peso corporal en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c (Tabla 6). Veinticuatro horas después, se determinaron títulos de anticuerpos específicos en suero y se sometió a los animales a una prueba de provocación por inoculación intravenosa con S. aureus Newman. La transferencia pasiva redujo la carga estafilocócica en tejidos de riñón para anticuerpos específicos de SpA-Dkkaa (P=0,0016) o SpAkkaa (P=0,0005). Al realizar el examen de histopatología, ambos anticuerpos redujeron la abundancia de lesiones de abscesos en los riñones de ratones sometidos a prueba de provocación con S. aureus Newman (Tabla 6). Estos datos en conjunto revelan que la protección de la vacuna a continuación de la inmunización con SpA-Dkkaa o SpAkkaa es conferida por parte de anticuerpos que neutralizan la proteína A.

Los inventores además buscaban determinar si los anticuerpos específicos de la proteína A pueden proteger a los animales contra una prueba de provocación letal. Se inmunizaron ratones BALB/c de forma activa o psiva para generar anticuerpos contra SpAkkaa y a continuación se sometieron a prueba de provocación mediante inyección intraperitoneal con dosis letales de S. aureus Newman (FIG. 6). Los anticuerpos contra la SpAkkaa, ya se hayan generado mediante inmunización activa (P=0,0475, SpAkkaa vs. mock) o pasiva (P=0,0493, SpAkkaa vs. mock), confirieron protección contra la prueba de provocación letal con S. aureus Newman (FIG. 6)

Tabla 5. Inmunización activa de ratones con vacunas de proteína A

Carga estafilocócica y formación de abscesos en tejido renal

Antígeno alog10 bValor P cReducción (log ¹⁰ UFC g-1) dTítulo de eNúmero de bValor P UFC g-1 IgG abscesos Prueba de provocación S. aureus Newman

Mock 6,46 ± 0,25 - - <100 3,7 ± 1,2 -SpA 3,95 ± 0,56 0,0003 2,51 1706± 370 2,1 ± 1,2 0,3581 SpA-D 4,43 ± 0,41 0,0001 2,03 381 ± 27 1,5 ± 0,8 0,1480 Spa-DKKAA 3,39 ± 0,50 <0,0001 3,07 5600 ± 801 0,5 ± 0,4 0,0204 Prueba de provocación con S. aureus USA300 (LAC)

Mock 7,20 ± 0,24 - - <100 4,0 ± 0,8 -SpA 6,81 ± 0,26 0,2819 0,39 476 ± 60 3,3 ± 1,0 0,5969 SpA-D 6,34 ± 0,52 0,1249 0,86 358 ± 19 2,2 ± 0,6 0,0912 SpA-Dkkaa 6,00 ± 0,42 0,0189 1,20 3710± 1147 1,6 ± 0,6 0,0277 SpA-KKAA 3,66 ± 0,76 0,0001 3,54 10200± 2476 1,2 ± 0,5 0,0109 aMedias de la carga estafilocócica calculada como log10 UFC g-1 en tejidos renales homogeneizados 4 días a continuación de la infección en cohortes de quince a veinte ratones BALB/c por inmunización. Se muestra una representación de tres experimentos en animales independientes y reproducibles. Se indica el error estándar de la media (±SEM).

bSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student bilateral desapareada y los valores P registrados; los valores P <0,05 se consideraron significativos.

cReducción en la carga bacteriana calculada como log10 UFC g-1.

dLas medias de cinco títulos de IgG en suero elegidos aleatoriamente se midieron previamente a la infección estafilocócica mediante ELISA.

eHistopatología de riñones de diez animales en secciones finas y con tinción de hematoxilina-eosina; se registró la cantidad media de abscesos por riñón y se registró y se calculó la media nuevamente para la media final (±SEM).______ Tabla 6. Inmunización pasiva de ratones con anticuerpos contra la proteína A

Carga estafilocócica y formación de abscesos en tejido renal aAntígeno blog10 cValor P dReducción (log ¹⁰ eTítulo de fNúmero de cValor P UFC g-1 UFC g-1) IgG abscesos

Mock ^{7,10 ±}- - <100 4,5 ± 0,8 -_0,14

^{5,53 ±}0,0016 1,57 466± 114 1,9 ± 0,7 0,0235 a-SpA-DKKAA _0,43

^{5,69 ±}0,0005 1,41 1575± 152 1,6 ± 0,5 0,0062 a-SpA-KKAA _0,34

aSe inyectaron anticuerpos purificados por afinidad en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c en una concentración de 5 mg kg-1 veinticuatro horas antes de la prueba de provocación con 1 X 107 UFC de S. aureus Newman.

bMedias de la carga estafilocócica calculada como log10 UFC g-1 en tejidos renales homogeneizados 4 días a continuación de la infección en cohortes de quince ratones BALB/c por inmunización. Se muestra una representación de tres experimentos en animales independientes y reproducibles.Se indica el error estándar de la media (±SEM).

cSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student bilateral y desapareada y los valores P se registraron; los valores P <0,05 se consideraron significativos.

dReducción en la carga bacteriana calculada como log10 UFC g-1.

eLas medias de cinco títulos de IgG en suero elegidos aleatoriamente se midieron previamente a la infección estafilocócica mediante ELISA.

fHistopatología de riñones de diez animales en secciones finas y con tinción de hematoxilina-eosina; se registró la cantidad de abscesos media por riñón y se calculó la media nuevamente para la media final (±SEM).____________

La respuesta inmune a la proteína A a continuación de la infección estafilocócica o la inmunización con SpA^kkaa . A continuación de la infección con S. aureus virulento, los ratones no desarrollan inmunidad protectora contra la posterior infección con la misma cepa (Burts et al., 2008) (FIG. 8). La abundancia media de IgG específico de SpA-Dkkaa en estos animales se determinó por dot blot como 0,20 |jg ml-1 (±0,04) y 0,14 |jg ml-1 (±0,01) para cepas Newman y USA300 LAC, respectivamente (FIG. 4). Se calculó la concentración mínima de IgG específico de proteína A requerido para la protección contra la enfermedad en animales vacunados con SpAkkaa o SpA-Dkkaa (reducción de P .0,05 log10 en las UFC g-1 de tejido renal estafilocócico) como 4,05 jg ml-1 (± 0,88). La concentración media en suero de IgG específico de SpA en voluntarios humanos saludables adultos (n=16) fue de 0,21 jg ml-1 (± 0,02). Por tanto, las infecciones por S. aureus en ratones o humanos no sestán asociadas con las respuestas inmunes que generan niveles significativos de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la proteína A, que es probable que se deba a las propiedades superantigénicas de los linfocitos B de esta molécula. En contraste, la concentración media en suero de la IgG específica para la toxina de la difteria en voluntarios humanos, 0,068 jg ml-1 (± 0,20), se situó dentro del rango para la inmunidad protectora contra la difteria (Behring, 1890; Lagergard et al., 1992).

Los aislados clínicos de S. aureus expresan la proeína A, un factor de virulencia esencial cuya actividad del superantígeno de linfocitos B y propiedades evasivas hacia el aclaramiento opsono-fagocítico son absolutamente necesarias para la formación de abscesos estafilocócicos (Palmqvist et al., 2005; Cheng et al., 2009; Silverman y Goodyear, 2006). Por tanto la proteína A puede considerarse como una toxina, esencial para la patogénesis, cuyas propiedades moleculares deben ser neutralizadas para lograr inmunidad protectora. Generando variantes no toxigénicas no capaces de unirse a las Ig a través de los dominios Fcy o VH3-Fab, los inventores miden aquí por primera vez las respuestas inmunes neutralizantes de la proteína A como una correlación para la inmunidad protectora contra la infección por S. aureus. En contraste con muchas cepas sensibles a la meticilina, el aislado USA300 LAC de CA-SARM es significativamente más virulento (Cheng et al., 2009). Por ejemplo, la inmunización de los animales de los experimentos con la proteína de superficie IsdB (Kuklin et al., 2006; Stranger-Jones et al., 2006) genera anticuerpos que confieren protección contra S. aureus Newman (Stranger-Jones et al., 2009) pero no contra la prueba de provocación con USA300.

Materiales y métodos

Cepas y crecimiento bacteriano. Las cepas de Staphylococcus aureus Newman y USA300 se cultivaron en caldo de soja tríptica (TSB) a 37°C. Las cepas de Escherichia coli DH5a y BL21 (DE3) se cultivaron en caldo Luria-Bertani (LB) con 100 jg ml'1 de ampicilina a 37°C.

Anticuerpos de conejo. La secuencia de codificación para SpA se amplificó por PCR con dos cebadores, gctgcacatatggcgcaacacgatgaagctcaac (SEQ ID NO:35) y agtggatccttatgcttgagctttgttagcatctgc (SEQ ID NO:36) utilizando ADN modelo de S. aureus Newman. La SpA-D fue amplificada por PCR con dos cebadores, aacatatgttcaa.caaagatcaacaaagc (SEQ ID NO:38) y aaggatccagattcgtttaattttttagc (SEQ ID NO:39). La secuencia para SpA-D^kkaase sometió a mutagénesis con dos conjuntos de cebadores catatgttcaacaaagataaaaaaagcgccttctatgaaatc (Se Q ID NO:42) y gatttcatagaaggcgctttttttatctttgttgaacatatg (SEQ ID NO:43) para Q9K, Q10K además de cttcattcaaagtcttaaagccgccccaagccaaagcactaac (SEQ ID NO:40) y gttagtgctttggcttggggcggctttaagactttgaatgaag (SEQ ID NO:41) para D36A,D37A. La secuencia de SpA ^kkaafue sintetizada por Integrated DNA Technologies, Inc. Los productos de la PCR se clonaron en pET-15b genrando una proteína recombinante marcada con His6 N-terminal. Los plásmidos se transformaron en BL21(DE3). Los cultivos de toda la noche de los transformantes se diluyeron en una relación 1:100 en medio fresco y se cultivaron a 37°C hasta un OD6000,5, punto en el que los cultivos fueron inducidos con 1 mM isopropil p-D-1-tiogalatopiranósido (IPTG) y cultivados durante tres horas más. Las células bacterianas se sedimentaron mediante centrifugación, se suspendieron en un tampón de columna (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) y se rompieron con una prensa French a 14.000 psi. Se eliminó de los lisados la membrana y los componentes insolubles mediante ultracentrifugación a 40.000 Xg. Las proteínas en el lisado soluble estaban sometidas a cromatografía de afinidad con ácido níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA, Qiagen). Las proteínas se eluyeron en tampón de columna que contiene concentraciones sucesivamente más elevadas de imidazol (100-500 mM). Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante ensayo del ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific). Para la generación de nticuerpos, se inmunizaron conejos (6 meses de vida, Nueva Zelanda blancos, hembras, Charles River Laboratories) con 500 |jg de proteína emulsionada en adyuvante completo de Freund (Difco) mediante inyección subcapsular. Para inmunizaciones de refuerzo, las proteínas se emulsionaron en Adyuvante incompleto de Freund y se inyectaron 24 o 48 días después de la inmunización inicial. En el día 60, los conejos se desangraron y se recuperó el suero.

Aislamiento de anticuerpos. El antígeno purificado (5 mg de proteína) se enlazó covalentemente a columnas HP de HiTrap activada por NHS (GE Healthcare). Se utilizó antígeno-matriz para la cromatografía de afinidad de 10-20 ml de suero de conejo a 4°C. La matriz cargada se lavó con 50 volúmenes de columna de PBS, se eluyeron los anticuerpos con un tampón de elución (1 M glicina, pH 2,5, 0,5 M NaCl) y se neutralizó inmediatamente con 1M Tris-HCl, pH 8,5. Los anticuerpos purificados se dializaron durante toda la noche contra PBS a 4°C.

Fragmentos F(ab ^{) 2}. Se mezclaron anticuerpos purificados por afinidad con 3 mg de pepsina a 37°C durante 30 minutos. La reacción se extinguió con 1 M Tris-HCl, pH 8,5 y se purificaron por afinidad fragmentos F(ab)2 con columnas HP de HiTrap activadas por NHS conjugadas con antígenos específicos. Se dializaron anticuerpos purificados contra PBS a 4°C, se cargaron en gel SDS-PAGE y se visualizaron con tinción de azul Coomassie.

Inmunización activa y pasiva. Se inmunizaron ratones BALB/c (de 3 semanas de vida, hembras, Charles River Laboratories) con 50 jg de proteína emulsionada en adyuvante de Freund completo (Difco) por inyección intramuscular. Para inmunizaciones de refuerzo, se emulsionaron proteínas en adyuvante de Freund incompleto y se inyectaron 11 días después de la inmunización inicial. En el día 20 a continuación de la inmunización, se desangraron 5 ratones para determinar los títulos mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Se inmunizaron ratones BALB/c mediante inyección intramuscular y se reforzaron con el mismo antígeno en Alum después de 11 y 25 días. En el día 34, los ratones se desangraron para obtener suero para títulos de anticuerpos específicos. Los anticuerpos purificados por afinidad se inyectaron en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c bien 24 horas o 4 horas antes de la prueba de provocación subletal o letal, respectivamente. La sangre del animal se recogió por punción en la vena periorbital y los títulos de anticuerpos de suero específicos se midieron mediante ELISA.

Abscesos renales de ratón. Cultivos de toda la noche de S. aureus Newman o USA300 (LAC) se diluyeron en una relación 1:100 en TSB fresco y se cultivaron durante 2 horas a 37°C. Los estafilococos se sedimentaron, se alvaron y se suspendieron en PBS a 0D600 de 0,4 (~1 X 108 UFC ml'1). Los inóculos fueron cuantificados extendiendo muestras de alícuotas en TSA y enumerando las colonias formadas. Se anestesiaron ratones BALB/c (de 6 semanas de vida, hembras, Charles River Laboratories) mediante inyección intraperitoneal con 100 mg ml- ketamina y 20 mg ml-1 xilacina por kilogramo de peso corporal. Los ratones fueron infectados mediante inyección retroorbital con 1 X 107 UFC de S. aureus Newman o 5 X 106 UFC de S. aureus USA300. En el día 4 después de la prueba de provocación, los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2. Ambos riñones fueron extraídos, y se analizó la carga estafilocócica en un órgano homogeneizando el tejido renal con PBS, 1% Triton X-100. Diluciones en serie del homogeneizado se extendieron en TSA y se incubaron para formación de colonias. El órgano restante se examinó mediante histopatología. Brevemente, los riñones se fijaron en formalina al 10% durante 24 horas a temperatura ambiente. Los tejidos se incluyeron en parafina, se prepararon en secciones finas, y se colorearon con hematoxilina-eosina, y se inspeccionaron por microscopía óptica para enumerar las lesiones de abscesos. Todos los experimentos con ratón se realizaron de acuerdo a las directrices institucionales, siguiendo el informe de protocolo experimental y la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (CIB) y el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Chicago.

Infección de ratones. Se utilizaron estafilococos para infectar ratones anestesiados mediante inyección retroorbital (1 x 107 UFC de S. aureus Newman, 5 x 106 UFC de S. aureus USA300 o 3 x 107 UFC de S. aureus Mu50). En el día 4, 15 o 30, los ratones fueron sacrificados, los riñones fueron extraídos, y el tejido homogeneizado se extendió sobre agar para formación de colonias. El tejido del órgano se preparó en secciones finas, se coloreó con hematoxilinaeosina, y se inspeccionó mediante microscopía. Los experimentos con animales fueron realizados de acuerdo con las directrices institucionales, siguiendo el informe de protocolo experimental y la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (CIB) y el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Chicago.

Para los experimentos con prueba de provocación letal, se inyectó a ratones BALB/c (cohortes de 8-10 animales por experimento) una suspensión de 2-6 x 108 UFC de S. aureus Newman o su variante Aspa isogénica en la cavidad peritoneal. La supervivencia animal fue monitorizada durante un periodo de 15 días y la significancia estadística de los datos de supervivencia fue analizada con el test log-rango.

Unión de la proteína A . Para la unión a la IgG humana, se precargaron columnas de afinidad con Ni-NTA con 200 |jg de proteínas purificadas (SpA, SpA-D, SpA-Dkkaa, y SrtA) en tampón de columa. Después del lavado, se cargaron en la columna 20o jg de IgG huano (Sigma). Las muestras de proteínas se recogieron de los lavados y eluciones y se sometieron a electroforesis en gel SDS-PAGE, seguido de tinción con azul Coomassie. Las proteínas purificadas (SpA, SpAkkaa, SpA-D y SpA-Dkkaa) fueron recubiertas en placas de ELISA MaxiSorp (NUNC) en 0,1M de tampón de carbonato (pH 9,5) a una concentració de 1 jg ml-1 durante toda la noche a 4°C. Las placas se bloquearon a continuación con 5% de leche entera mediante incubación con diluciones en serie de fragmentos de IgG conjugada con peroxidasa, Fc o F(ab)2 durante una hora. Las placas se lavaron y se desarrollaron utilizando reactivos de ELISA OptEIA (BD). Las reacciones se extinguieron con 1 M de ácido fosfórico y se utilizaron lecturas de A450 para calcular el título máximo medio y el porcentaje de unión.

Ensayos de unión al factor de von Willebrand (vWF). Las proteínas purificadas (SpA, SpAkkaa, SpA D y SpA-Dkkaa) fueron recubiertas y bloqueadas tal como se describe anteriormente. Las placas se incubaron con vWF humano a una concentración de 1 jg ml-1 durante dos horas, a continuación se lavaron y se bloquearon con IgG humano durante otra hora. Después del lavado, las placas se incubaron con dilución en serie de anticuerpos conjugados con peroxidasa dirigida contra el vWF durante una hora. Las placas se lavaron y se desarrollarlo utilizando reactivos de ELISA OptEIA (BD). Las reacciones se extinguieron con 1 M de ácido fosfórico y se utilizaron lecturas de A450 para calcular el porcentaje de unión y de título máximo medio. Para los ensayos de inhibición, las placas se incubaron con fragmentos de F(ab)2 purificados, específicos para SpA-Dkkaa a una concentración de 10 mg mM durante una hora antes de los ensayos de unión al ligando.

Apoptosis de esplenocitos. Se inyectaron proteínas purificadas por afinidad (150 jg de SpA, SpA-D, SpAkkaa, y SpA-Dkkaa) en la cavidad peritoneal de ratones BALB/c (de 6 semanas de vida, hembras, Charles River Laboratories). Durante cuatro después de la inyección, se sacrificaron los animales mediante inhalación de CO2. Sus bazos se extrajeron y se homogeneizaron. Se eliminaron detritus de células utilizando un tamiz celular y las células suspendidas se transfirieron a un tampón de lisis de ACK (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) par lisar glóbulos rojos. Se sedimentaron glóbulos blancos mediante centrifugación, se suspendieron en PBS y se colorearon con anticuerpo monoclonal anti-CD19 conjugado con R-PE diluido en una relación 1:250 (Invitrogen), y se dejó en hielo y en la oscuridad durante una hora. Las células se lavaron con FBS al 1% y se fijaron con formalina al 4% durante la noche a 4°C. Al día siguiente, las células se diluyeron en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo. El órgano restante se examinó para su histopatología. Brevemente, se fijaron los bazos en formalina al 10% durante 24 horas a temperatura ambiente. Los tejidos fueron incluidos en parafina, preparados en secciones finas, y coloreados con el kit de detección de apoptosis (Millipore), y se inspeccionaron mediante microscopía óptica.

Cuantificación de anticuerpos. Se recogieron los sueros de voluntarios humanos o de ratones BALB/c que habían sido infectados con el S. aureus Newman o USA300 durante 30 días, o que habían sido inmunizados con SpA-Dkkaa/ SpAkkaa tal como se ha descrito anteriormente. Se transfirió la IgG humana/de ratón (Jackson Immunology Laboratory), SpAkkaa, y CRM197 en membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 5% de leche entera, seguido de la incubación bien con sueros humanos o de ratón. Se utilizó IgG anti-humana/de ratón purificada por afinidad conjugada con IRDye 700DX (Rockland) para cuantificar las intensidades de la señal utilizando el sistema de toma de imágenes de infrarrojos Odyssey™ (Li-cor). Los experimentos con sangre de voluntarios humanos implicaron protocolos que fueron revisados, aprobados y realizados bajo supervisión reguladora del Consejo de evaluación institucional de la Universidad de Chicago (IRB).

Análisis estadístico. Se realizó una prueba t de Student bilateral para analizar la significancia estadística de los abscesos renales, ELISA, y datos de superantígeno de linfocitos B. Los datos de supervivencia animal con el test logrango (Prism).

Ejemplo 3

Las coagulasas de Staphylococcus aureus contribuyen a la formación de abscesos y funcionan como antígenos protectores

Todos los aislados clínicos de S. aureus muestran actividad de coagulasa - la coagulación de la sangre o plasma a través de la activación no proteolítica de la protrombina para cortar el fibrinógeno. Los inventores identificaron la protrombina, fibrinógeno, coagulasa (Coa) y la proteína de unión al factor de von Willebrand (vWbp) en lesiones de abscesos estafilocócicos de ratones infectados. Tanto la Coa como el vWbp secretados contribuyeron a la actividad de la coagulasa de S. aureus Newman, permitiendo de ese modo la formación de abscesos, además de enfermedad mortal en ratones. Los anticuerpos generados contra la Coa y vWbp purificados bloquean específicamente la asociación del polipéptido correspondiente con protrombina y fibrinógeno. Los anticuerpos específicos Coa- y vWbpspecific, ya sean generados por inmunización activa o pasiva, previnieron la formación de abscesos y la mortalidad de ratones infectados con estafilococos.

VIII. Resultados

Localización de coagulasa y factores de coagulación en abscesos estafilocócicos. Los trabajos previos establecieron el modelo de abscesos renales en ratón, por lo que 1X107 CPU del aislado clínico humano S. aureus Newman (Baba et al., 2007) se inyectan en el torrente sanguíneo de ratones BALB/c (Albus et al., 1991). Cuarenta y ocho horas después de la infección, los ratones desarrollaron abscesos diseminados en múltiples órganos, detectables mediante microscopía óptica de tejido renal coloreado con hematoxilina-eosina, preparado en secciones finas inicialmente como una acumulación de leucocitos polimorfonucleares (PMNs) con pocas bacterias (Cheng et al., 2009). En el día 5 de la infección, los abscesos aumentan en tamaño y encierran una población central de estafilococos (comunidad de abscesos estafilocócicos - SAC), rodeados por una capa eosinofílica, de material amorfo (la pseudocápsula) y una gran masa de PMNs (Cheng et al., 2009). La histopatología revela una necrosis masiva de PMNs en la proximidad del nido estafilocócico en el centro de las lesiones de abscesos además de un manto de fagocitos saludables. En intervalos de tiempo posteriores, las SACs aumentas y los abscesos se rompen, liberando material necrótico y estafilococos en el torrente sanguíneo. Una nueva ronda de formación de abscesos se inicia, precipitando finalmente un resultado letal de las infecciones (Cheng et al., 2009).

Para localizar coagulasas en lesiones de abscesos, los riñones de ratones que habían sido infectados durante 5 días con S. aureus Newman se prepararon en secciones finas y se colorearon mediante inmuno-histoquímica con anticuerpos de conejo específicos de Coa- o vWbp- purificados por afinidad (FIG. 10). Los inventores observaron una tinción de Coa intensa en la pseudocápsula que rodea las SACs y en la periferia de las lesiones de abscesos, es decir, la cápsula de fibrina que bordea el tejido no infectado. La tinción de vWbp tuvo lugar a través de las lesiones de abscesos, pero también con acumulación en la periferia. Los anticuerpos específicos de protrombina revelaron tinción del zimógeno en la pseudocápsula y en la periferia, mientras que la tinción espcífica de fibrinógeno/fibrina tuvo lugar por todas las lesiones de abscesos. Estos datos en conjunto indican que la pseudocápsula eosinofílica de los abscesos estafilocócicos alberga protrombina y fibrinógeno, que se localizan junto con Coa. En la periferia de las lesiones de abscesos, Coa, vWbp, protrombina y fibrinógeno/fibrina están co-localizadas. Estas observaciones dieron lugar a una investigación en cuanto a si Coa y vWbp son contribuidores cruciales para el establecimiento de abscesos desencadenando la conversión mediada por protombina de fibrinógeno a fibrina.

La coa y vWbp del Staphylococcus aureus contribuyen a la coagulación de la sangre de ratón. Los genes de coa y/o vWbp en el cromosoma de S. aureus Newman fueron eliminados mediante reemplazo alélico utilizando la tecnología pKOR1 (Bae y Schneewind, 2005). Dos plásmidos complementarios, pcoa y pvWbp, se generaron por clonación de los genes estructurales de coa o vWbp además de sus secuencias promotoras aguas arriba en pOS1 (Schneewind et al., 1993). Los plásmidos fueon electroporados en estafilococos y se seleccionó su replicación continuada se seleccionó en medios complementado con cloramfenicol (Schneewind et al., 1992). Cuando se hibridaron para determinar coagulasas con anticuerpos específicos, los inventores observaron la secreción de Coa por parte del tipo silvestre además de la cepa AvWbp, pero no por variantes de Acoa o Acoa/AvWbp (FIG. 11). El defecto fenotípico de los mutantes de Acoa y Acoa/AvWbp fue restaurado por electroporación con pcoa pero no por pvWbp (FIG. 11). De forma similar, se observó la secreción de vWbp en S. aureus Newman (tipo silvestre) además de clutivos de mutantes Aoa, pero no en variantes de AvWbp o Acoa/AvWbp variants (FIG. 11). Este defecto se restauró mediante electroporación con pvWbp, pero no por pcoa.

La coagulación de la sangre es inhibida de forma efectiva por hirudina (lepirudina) (Harvey et al., 1986), un péptido de 65 residuos de sanguijuela que forma un complejo en una relación 1:1 con la trombina, bloqueando de ese modo la conversión proteolítica de fibrinógeno a fibrina (Markwardt, 1955). La inoculación de sangre de ratón tratada con lepirudina con S. aureus Newman desencadenó la coagulación en menos de 12 horas, mientras que la sangre infectada con células mock permaneció sin coágulos durante más de 48 horas (FIG. 11C). Utilizando este ensayo se observó que las variantes estafilocócicas que carecen de coagulasa mostraron retrasos en el tiempo de coagulación, Acoa 36 horas y AvWbp 24 horas (FIG. 11C). El mutante doble, Acoa/AvWbp, no fue capaz de coagular la sangre de ratón. Estos defectos se complementaron mediante electroporación con plásmidos pvWbp además de pcoa. Tomados en conjunto, estos datos indican que las dos coagulasas, Coa y vWbp, contribuyen a la capacidad del S. aureus Newman para coagular la sangre de ratón (FIG. 11C).

Coa y vWbp son necesarias para la supervivencia estafilocócica en sangre, la formación de abscesos y la bacteriemia letal en ratones. Para analizar las contribuciones de virulencia de las coagulasas, los inventores examinaron en primer lugar la supervivencia estafilocócica en sangre tratada con lepirudina. La cepa de tipo silvestre de S. aureus Newman no fue eliminada en la sangre de ratón, sin embargo cada una de las variantes isogénicas que carecían de Coa, es decir, Acoa y Acoa/AvWbp, mostró una reducción significativa en las UFC después de 30 min de incubación. Este defecto en la supervivencia fue restituido por pcoa, pero no por pvWbp, lo que sugiere que únicamente se requiere Coa para la supervivencia estafilocócica en sangre de ratón.

La bacteriemia estafilocócica es una causa frecuentge de mortalidad en humanos en entornos hospitalarios (Klevens et al., 2007). Los inventores buscaban determinar si las coagulasas se requieren para una prueba de provocación letal de ratones BALB/c a continuación de inyección intravenosa de 1 X 108 UFC de S. aureus Newman. Todos los animales infectados con la cepa Newman parental de tipo silvestre sucumbió a la infección en 24 horas (FIG. 12B). Cada uno de los animales infectados con mutantes únicos, Acoa o AvWbp, mostró un retraso corto peron estadísticamente significativo en el tiempo hasta la muerte (FIG. 12B). La cepa doble mutante resultó significativamente más afectada que los mutantes con deleciones únicas, y los animales infectados con la cepa Acoa/AvWbp mostraron la mayor reducción en la virulencia en comparación con el tipo silvestre (FIG. 12B).

Los inventores analizaron a continuación la formación de abscesos en los tejidos renales de ratones infectados y observaron que las variantes de Acoa resultaron dañadas en su capacidad para formar abscesos en el día 5 y 15 de la infección (Tabla 7, FIG. 12G, 12I)). El mutante AvWbp continuó formando abscesos, aunque la carga bacteriana, el tamaño general de las comunidades de abscesos estafilocócicos y la cantidad de inflitrados inmunes se redujeron en estas variantes (Tabla 7, FIG. 12D, 12F)). Los mutantes en coagulasa están ligeramente más atenuados en virulencia que los de vWbp, ya que Acoa presenta menor formación de abscesos y carga bacteriana en el día 15. Sin embargo, los mutantes dobles Acoa / AvWbp se vieropn notablemente mermados en su capacidad para formar abscesos y persistieron wn tejidos infectados (Tabla 7, FIG. 12H, 12K)). Por tanto, la proteína de unión tanto a coagulasa como al factor de von Willebrand es importante para la supervivencia estafilocócica en el huésped, ya sea en el torrente sanguíneo o en tejidos de órganos extremos.

Tabla 7. Virulencia de mutantes de S. aureus Newman coa, vWbp, y coa/vWbp

Carga estafilocócica en tejido renal* Formación de abscesos en tejido renal* Cepa alog10 Significancia cReducción eAbscesos eNúmero Significancia UFC g-1 de valor P (log10 UFC g-1) de de Valor P tejido superficie abscesos renal (%) por riñón

Análisis en el día 5 de la carga estafilocócica y formación de abscesos

PBS ^{6,034 ±}- - 75 2,333 ± -

_0,8990,623

Coa ^{5,538 ±}0,3750 0,492 38 1,111 ± 0,1635

_0,5600,389

vWbp ^{5,247 ±}0,0859 0,783 56 1,750 ± 0,6085

_0,3110,650

Coal/vWbp ^{4,908 ±}0,0044 1,395 25 0,750 ± 0,0786

_0,2510,342

Análisis en el día 15 de la carga estafilocócica y formación de abscesos

PBS ^{5,380 ±}- - 81 3,000 ± -

_0,2941,234

^{4,023 ±}0,0077 1,357 44 1,400 ± 0,1862 Coa _0,3240,452

^{5,140 ±}0,0688 0,240 50 1,625 ± 0,2974 vWbp _0,6890,298

Coal/vWbp ^{3,300 ±}0,0056 2,080 20 0,556 ± 0,0341

_0,5520,154

*Se inyectó a cada uno de unos ratones BALB/c (n=18-20) en el peritoneo 100 pl de anticuerpos de conejo purificados por afinidad contra vWbp (a-vWbp), Coa (a-Coa) o vWbp y Coa (a-vWbp/Coa) en el día 0. Veinticuatro horas después, los animales fueron examinados para determinar los títulos de anticuerpos de IgG en suero y se sometieron a una prueba de provocación mediante inoculación intravenosa con 1X107 unidades formadoras de colonia (UFC) de S. aureus Newman o mutantes del mismo. Cinco o quince días después, los animales fueron sacrificados y ambos riñones extraídos. Un riñón se fijó en formaldehído, se incluyó en parafina, se preparó en secciones finas, se coloreó con hemaotoxilina-eosina y se analizaron cuatro secciones sagitales por riñón para formación de abscesos. El otro riñón fue homogeneizado en tampón de PBS, el homogeneizado se extendió sobre medio con agar para formación de colonias, y se enumeró la carga estafilocócica como UFC.

Carga estafilocócica en tejido renal* Formación de abscesos en tejido renal* Cepa alog10 Significancia cReducción eAbscesos eNúmero Significancia UFC g-1 de valor P (log ¹⁰ UFC g-1) de de Valor P tejido superficie abscesos renal (%) por riñón aMedias de la carga estafilocócica calculada como logio UFC g-1 en tejidos renales homogeneizados 4 días a continuación de la infección en cohortes de dieciocho a veinte ratones BALB/c por inmunización. Se indica el error estándar de la media (±SEM).

bSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student bilateral y desapareada y los valores P se registraron; los valores P <0,05 se consideraron significativos.

cReducción en la carga bacteriana calculada como log10 UFC g-1.

eLa formación de abscesos en los tejidos renales cuatro días después de la infección se midió mediante inspección macroscópica (% positivo).

fHistopatología de riñones de diez animales en secciones finas y con tinción de hematoxileno-eosina; se registró la cantidad de abscesos media por riñón y se calculó la media nuevamente para la media final (±SEM).

gSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student bilateral y desapareada y los valores P se registraron; los valores P <0,05 se consideraron significativos._______________________________________________

Anticuerpos contra las coagulasas y su efecto en la coagulación sanguínea inducida durante la infección estafilocócica. His6-Coa y His6-vWbp recombinantes fueron purificadas por cromatografía de afinidad sobre Ni-NTA (FIG. 13A), se emulsionaron en adyuvante y se inyectaron en conejos para generar anticuerpos específicos que se purificaron en matrices de afinidad que albergaban la proteína recombinante. Los anticuerpos dirigidos contra Coa se unieron preferentemente a Coa, no a vWbp (FIG. 13B). También ocurría lo recíproco para los anticuerpos dirigidos contra vWbp (FIG. 13B). Cuando se añadió a la sangre de ratón tratada con lepirudina infectada con S. aureus Newman, los inventores observaron que cada uno de los anticuerpos dirigidos contra Coa, vWbp o Coa y vWbp bloqueaba la coagulación de la sangre (FIG. 13C). Como controles, las muestra tratadas con mock o el anticuerpo V10 irrelevante (que proporciona protección contra la inyección de Yersiniapestistipo III (DeBord et al., 2006)) no tuvo ningún efecto (FIG. 13C).

Para examinar el papel de los anticuerpos en Coa o vWbp aislados, los inventores purificaron proteínas recombinantes funcionalmente activas (Friedrich et al., 2003) que fueron añadidas a sangre de ratón tratada con lepirudina. La sangre de ratón tratada con Coa o vWbp coaguló en menos de 30 minutos (FIG. 13D). Como control, las células mock (PBS) o el tratamiento con anticuerpo V10 irrelevante no afectó a la coagulación. Los anticuerpos dirigidos contra Coa o vWbp retrasaron la coagulación de la sangre de ratón tratada con proteínas recombinantes y esto ocurrió incluso para el factor homólogo de reacción cruzada (FIG. 13D). La reactividad mínima de los anticuerpos se observó mediante ELISA y western blot, aunque hay inhibición cruzada de la función.

Anticuerpos que bloquean la asociación entre las coagulasas y la protrombina o fibrinógeno. Se utilizó resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) para investigar cómo los anticuerpos aCoa y avWbp interfieren con las funciones de las coagulasas. La protrombina se inmovilizó en un chip CM5. Haciendo fluir Coa purificada sobre la muestra, se calculó una constante de disociación de KD 28 nM, una medición que corresponde con otros informes en la literatura (Friedrich et al., 2003). La adición de aCoa condujo a una disminución dependiente de la concentración en señal de respuesta para la formació de protrombina-Coa, indicando que estos anticuerpos bloquean la asociación de Coa con la protrombina (FIG. 14A). La SPR confirmó además la asociación entre la coagulasa y fibrinógeno (KD 93,1 nM, FIG. 14B). Tras la pre-incubación con aCoa, los inventores observaron una disminución drástica en la unión de Coa a fibrinógeno (FIG. 14B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que los anticuerpos dirigidos contra Coa bloquean la asociación de esta molécula con los factores de coagulación de la sangre.

vWbp purificada mostró una fuerte afinidad por la protrombina (KD 38,4 nM, FIG. 13C) y el fibrinógeno (484 nM, FIG.

13D), la última de las cuales no había sido apreciada hasta ahora (Kroh et al., 2009). Además, la pre-incubación con anticuerpos generados contra vWbp bloqueó la asociación entre vWbp y protrombina o fibrinógeno de forma dependiente a la dosis (FIG. 13C, 13D). Estas observaciones confirman los resultados de los ensayos de coagulación, que demuestran que los anticuerpos policlonales específicos pueden bloquear la interacción entre Coa o vWbp y los componentes específicos de la cascada de coagulación (FIG. 12).

Para analizar si los anticuerpos específicos para coagulasas bloquean la conversión de fibrinógeno a fibrina, se midió la capacidad de los complejos protrombina-coagulasa para cortar el S-2238, un análogo para el corte de fibrinógeno a fibrina (FIG. 14E, 14F). La adición de anticuerpos específicos a protrombina-Coa o protrombina-vWbp redujo la capacidad de estos complejos para convertir el sustrato a producto. Además, se observó inhibición cruzada de los anticuerpos específicos de coagulasa, donde la adición de anticuerpos de reacción cruzada causó una reducción en la actividad del copmplejo protrombina-vWbp. Estos datos sugieren que los anticuerpos específicos dirigidos contra Coa o vWbp neutralizan el efecto patofisiológico del producto secretado al que se unen.

Los anticuerpos contra coagulasas proporcionan protección contra la enfermedad estafilocócica. Anticuerpos de tipo IgG específicos para Coa o vWbp se aislaron a partir de suero de conejo mediante cromatografía sobre columna de afinidad, generada por el entrecruzamiento covalente del antígeno a sefarosa CNBr. Los inventores intentaron alterar la patogénesis mediante la administración de anticuerpos neutralizantes, dirigidos contra Coa y/o vWbp. Se administró a los ratones anticuerpos de conejo y se sometieron a prueba de provocaci'ñon con una dosis letal de la cepa Newman de S. aureus. La inyección de anticuerpos específicos de Coa o vWbp prolongó la supervivencia murina (FIG. 15).

Para analizar los reactivos de anticuerpos para posible protección con vacuna contra la bacteriemia letal, se inyectó IgG purificado por afinidad (5 mg kg-1 de peso corporal) en la cavidad peritoneal de los ratones. Veinticuatro horas después, se inyectó a los animales una suspensión de 1 X 108 UFC de S. aureus Newman en PBS en el plexo retroorbital. Al monitorizar a los animales en el tiempo, los inventores observaron que los anticuerpos dirigidos contra vWbp (avWbp) conducían a un aumento del tiempo hasta la muerte y a un 10% de supervivencia, en comoparación con animales que habían recibido los anticuerpos aV10 irrelevantes y murieron dentro de un periodo de 12-48 horas (FIG. 15). Los anticuerpos contra Coa (aCoa) además aumentaron el tiempo hasta la muerte de los ratones con inmunización pasiva (FlG. 15). Una mezcla de ambos anticuerpos (aCoa/avWbp) no generaron una mejora estadísticamente significativa en la supervivencia o tiempo hasta la muerte sobre los anticuerpos de aCoa.

Para examinar la inmunización pasiva para la protección contra la formación de abscesos estafilocócicos, se inyectaron anticuerpos purificados (5 mg kg-1 de peso corporal) en la cavidad peritoneal de los ratones y se monitorizó la formación de abscesos durante cinco días después de la prueba de provocación intravenosa con 1 X 107 UFC de S. aureus Newman. Los anticuerpos contra vWbp no condujeron a una reducción significativa en la carga estafilocócica o en el número de lesiones inflamatorias (Tabla 8), aunque las lesiones observadas albergaban comunidades de abscesos más pequeñas e infiltrados PMN reducidos en comparación con ratones inmunizados con mock (FIG. 16). Los anticuerpos contra la coagulasa redujeron la carga estafilocócica (P=0,042) además del número de lesiones inflamatorias (P=0,039); no se detectaron lesiones de abscesos con comuniddes estafilocócicas en el nido de grandes infiltrados de PMN (FIG. 16 y Tabla 8). Los animales que recibieron ambos anticuerpos, aWbp y aCoa, mostraron una resduccuión incluso mayor en la carga estafilocócica (P=0,013) y una reducción en la abundancia de lesiones inflamatorias (P=0,0078) (Tabla 8). En conjunto, estos datos indican que los anticuerpos contra las coagulasas, administrados mediante inmunización pasiva, protegen a los ratones contra la formación de abscesos y permiten el aclaramiento del patógeno invasor de los tejidos del huésped. Los anticuerpos contra vWbp contribuyen relativamente poco a la protección de la vacuna, en concordancia con el descubrimiento de que vWbp nmo juega el mismo papel de vital importancia que Coa durante la patogénesis de las infecciones por S. aureus en ratones (Tabla 8).

Tabla 8. Inmunización pasiva de ratones con anticuerpos de conejo contra Coa y/o vWbp

Carga estafilocócica en tejido renal* Formación de abscesos en ______________________________________________________ tejido renal*_______

Anticuerpo alog10 Significancia cReducción n dTítulo eAbscesos fNúmero Significancia de conejo UFC g- (Valor P) en log ¹⁰ UFC de de de Valor P purificado 1 de g-1 IgG superficie abscesos

tejido (%)

de

riñón

Mock ^{5,86 ±}- - <100 75 4,6 ± 1,4 -_0,29

a- vWbp ^{5,25 ±}0,3554 1,60 1,100 39 1,4 ± 0,5 0,0592 _0,36± 200

a-Coa 4,68 ± 0,0420 1,18 1,300 20 1,2 ± 0,7 0,0396 0,47 ± 250

avWbp/Coa 0,52 0,0130 1,53

25 0,3 ± 0,2 0,0078 4,29 ±

*Se inyectó a cada uno de los ratones BALB/c (n=18-20) en el peritoneo 100 pl de anticuerpos de conejo purificados por afinidad contra vWbp (a-vWbp), Coa (a-Coa) o vWbp y Coa (a-vWbp/Coa) en el día 0. Veinticuatro horas después, los animales fueron examinados para determinar los títulos de anticuerpos de IgG en suero y se sometieron a una prueba de provocación mediante inoculación intravenosa con 1X107 unidades formadoras de colonia (UFC) de S. aureus Newman. Cinco días después, los animales fueron sacrificados y ambos riñones extraídos. Un riñón se fijó en formaldehído, se incluyó en parafina, se preparó en secciones finas, se coloreó con hemaotoxilina-eosina y se analizaron cuatro secciones sagitales por riñón para formación de abscesos.

El otro riñón fue homogeneizado en tampón de PBS, el homogeneizado se extendió sobre medio con agar para formación de colonias, y se enumeró la carga estafilocócica como UFC._______________________________________ aMedias de la carga estafilocócica calculada como logio UFC g-1 en tejidos renales homogeneizados 4 días a continuación de la infección en cohortes de dieciocho a veinte ratones BALB/c por inmunización. Se indica el error estándar de la media (±SEM).

cReducción en la carga bacteriana calculada como log10 UFC g-1.

gSe calculó la significancia estadística con la prueba t de Student bilateral y desapareada y los valores P se registraron; los valores P <0,05 se consideraron significativos._________________________________________________________

Las coagulasas funcionan como antígenos protectores para las infecciones estafilocócicas. CoA y vWbp marcadas con poli-histidina se purificaron a partir de E. coli y se utilizaron como antígeno de vacunas subunitarias. Las proteínas (100 |jg emulsionadas en CFA o IFA) fueron inyectadas en ratones naive BALB/cen el día 0 (CFA) or 11 (IFA). Los animales se sometieron a prueba de provocación en el día 21 mediante inoculación intravenosa del S. aureus Newman. Se desangraron cinco animales a la hora de la prueba de provocación, y se determinaron los títulos de anticuerpos contra antígenos de vacuna mediante ELISA (Tabla 9). Los animales se sacrificaron cinco o quince días a continuación de la prueba de provocación estafilocócica y se analizó la histopatología de las lesiones de abscesos. La inmunización con Coa redujo la carga bacteriana en el día (P=0,03, PBS mock vs. Coa) y día 15 (P=4,286 X 10-5, PBS mock vs. Coa, ver Tabla 9). La vacunación con Coa también disminuyó el número de lesiones infecciosas que se formó en los tejidos renales, mock vs. Coa, P=0,03 (día 5) y P=0,0522 (día 15) (Tabla 9). Ha de destacarse que ninguno de los ratones inmunizados con Coa desarrolló lesiones de abscesos típicas (FIG. 17). En ocasiones se observaron pequeñas acumulaciones de PMNs que no estaban asociados con comunidades de abscesos estafilocócicas (FIG. 17). La inmunización con vWbp no redujo de forma significativa la carga estafilocócica en el día 5 (P=0,39, PBS mock vs. vWbp) o en el día 15 (P=0,09, PBS mock vs. vWbp). El número total de lesiones inflamatorias no se redujo. Sin embargo, la arquitectura de los abscesos había cambiado después de la inmunización con vWbp. No se detectaron comunidades en el centro de los abscesos y en su lugar se observaron infiltraciones de PMN (FIG.

17). La vacuna de combinación, vWbp-Coa, además redujo el número de células inflamatorias en los tejidos renales y los animales infectados no mostraron lesiones de abscesos en el día 5 o 15 (Tabla 9).

IX Materiales y Métodos

Cepas bacterianas y cultivos de crecimiento.Se cultivaron estafilococos en agar con soja tríptica o caldo a 37°C. Las cepas de E. coli DH5a y BL21(DE3) (Studier et al., 1990) en agar o caldo a 37°C. Se utilizó ampicilina (100 |jg/ml) y cloramfenicol (10 mg/ml) se utilizaron para la selección de plásmido, respectivamente pET15b (Studier et al., 1990) y pOS1 (Schneewind et al., 1993).

Generación de mutantes. Se amplificaron secuencias de ADN sequences de 1 kb aguas arriba y aguas abajo de coa y vWbp por PCR utilizando los cebadores attB1_Coa, Coa1_BamHI, Coa2_BamHI, attbB2_Coa y attB1_vWF, vWF1_BamHI, vWF2_BamHI, attbB2_vWF (Tabla 10). Los fragmentos se intercambiaron en pKOR1 utilizando el kit BP clonasa II (Invitrogen) (Bae y Schneewind, 2005). Estos vectores fueron electroporados en S. aureus Newman y sometidos a desplazamiento de temperatura inducida por el intercambio alélico para generar la correspondiente deleción (Bae y Schneewind, 2005). Los mutantes fueron verificados mediante amplificación por PCR del locu génico, secuenciamiento de ADN, y análisis por inmunoblot.

Para generar plásmidos de complementación, los cebadores Coa_promotor_BamHI_F, Coa_out_PstI_R, vWbp_promotor_BamHI_F, vWbp_out_PstI_R (Tabla 10) se diseñaron para incluir la región promotora aguas arriba de vWbp o coa y las regiones amplificadas se clonaron en pOS1. Estos plásmidos se verificaron mediante secuenciación y a continuación fueron electroporados en cepas estafilocócicas. Para análisis de inmunoblot, se refrescaron los cultivos de toda la noche de estafilococos cultivados en caldo de soja tríptica (Difco), en una relación 1:100 y se cultivaron con agitación a 37°C hasta que alcanzaron OD600 de 0,4. Muestras de un ml de cada cultivo se centrifugón a 13.000 xg durante 10 min en una centrifugadora de sobremesa y el sobrenadante se recuperó. Se añadió ácido tricloroacético, 75 pl de una solución al 100% peso/volumen, y las muestras fueron incubadas en hielo durante 10 min, seguido de centrifugación y lavado con 1 ml de acetona helada al 100%. Las muestras se secaron con aire durante la noche y se solubilizaron en 50 pl de tampón de muestra (4% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH8, 10% glicerol, y azul bromofenol).

Ensayo de supervivencia en sangre y coagulación de la sangre. Los cultivos de toda la noche se cepas estafilocócicas se diluyeron en una relación 1:100 en TSB fresco y se cultivaron a 37°C hasta que lograron un 0D600 0,4. Un ml de cultivo se centerifugó, y los estafilococos se lavaron y suspendieron en 10 ml de PBS estéril para generar una suspensión de 1X107 UFC/ml. Se recogió sangre entera de ratones Balb/c naive de 6 semanas y se añadió REFLUDAN™ (lepirudina, Bayer) a una concentración final de 50 pg/ml. 450 pL de sangre se alícuota en un tubo de eppendorf de 1 ml y se mezcló con una muestra bacteriana de 50 pl (1x105 UFC/ml). Las muestras se incubaron a 37°C con rotación lenta. Se extrajeron 100 pl de alícuotas en tiempos de 0 min y 30 min, mezclados en una relación de 1:1 with 2% saponina/PBS y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se prepararon cinco diluciones en serie en una relación 1:10 y se extendieron 10 pl de alícuotas sobre agar TSA para la formación y enumeración de colonias.

Para evaluar la actividad de coagulación de la sangre bacteriana, se añadió 10 pl del cultivo madre bacteriano anterior a 100 pl de sangre de ratón anti-coagulada en un tubo de ensayo de plástico estéril (BD falcon) para lograr una concentración final de 1x105 UFC/ml. Para la alteración de los anticuerpos, se añade a la mezcla una cantidad adicional de 10 ul de PBS que contiene 3x10-5 Mol de anticuerpo. Para evaluar las proteínas recombinantes, se añadió 10 pl de proteína en tampón de PBS a una concentración final de 50 pM. Los tubos de ensayo se incubaron a temperatura ambiente y se verificó la liquidez o coagulación inclinando los tubos a ángulos de 45° en intervalos de tiempo regulares.

Purificación de proteínas. Para estudios de vacunación, se clonó una secuencia de longitud completa de Coa o vWbp madura en un vector pET15b utilizando los cebadores Coa_directo_XhoI, Coa_inverso_BamHI, vWbp_directo_XhoI, vWbp_inverso_BamHI (Tabla 10) para obtener His6-Coa y His6-vWbp. Se cultivó E. coli BL21(DE3) conteniendo vectores de expresión a 37°C y fue inducido con 1 mM IPTg después de dos horas. Cuatro horas después de la inducción, las células se centrifugaron a 6.000 X g, se suspendieron en 1 X tampón de columna (0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl) y se lisaron en una prensa French a 14.0000 lb/in2. Los lisados se sometieron a ultracentrifugación a 40.000 X g durante 30 min y el sobrenadante se sometió a cromatografía Ni-NTA, se alvó con tampón que contenía 25 pM de imidazol, seguido por la elución con 500 pM imidazol. El eluato se dializó con 1 X PBS. Para retirar la endotoxina, se añadió Triton-X114 en una relación 1:1.000 y la solución se enfrió durante 5 min, se incubó a 37°C durante 10 min, y se centrifugó a 13.000 X g. El sobrenadante se cargó en la columna de desalación de HiTrap para eliminar cualquier remanente de Triton-X114.

Tabla 10. Cebadores utilizados en este estudio

Nombre del Cebador Secuencia

attB1_Coa GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTgatgactaagttgaaaaaagaag (SEQ ID NO:46)

Coa1_BamHI aaGGATCCcctccaaaatgtaattgccc (SEQ ID NO:47)

Coa2_BamHI aaGGATCCgtttgtaactctatccaaagac (SEQ ID NO:48)

attbB2_Coa GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTgacacctattgcacgattcg (SEQ ID NO:49) attB1_vWF GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTcagatagcgattcagattcag (SEQ ID NO:50) vWF1_BamHI aaGGATCCctgtattttctccttaattttcc (SEQ ID NO:51)

vWF2_BamHI aaGGATCCcatggctgcaaagcaaataatg (SEQ ID NO:52)

attbB2_vWF GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTgccctggtgtaacaaatttatg (SEQ ID NO:53)

Coa_promoter_BamHI_F gaaGGATCCgtttattctagttaatatatagttaatg (SEQ ID NO:54)

Coa_out_PstI_R gaaCTGCAGctgtatgtctttggatagagttac (SEQ ID NO:55) vWbp_promoter_BamHI_F gaaGGATCCggtggcttttttacttggattttc (SEQ ID NO:56)

vWbp_out_PstI_R gaaCTGCAGcgacaaactcattatttgctttgc (SEQ ID NO:57)

Coa_foward_XhoI GAACTCGAGTCTAGCTTATTTACATGG (SEQ ID NO:58) Coa_Xho_factorXa_F GAACTCGAGatagaaggcagaatagtaacaaaggattatagtggg (SEQ ID NO:59) Coa_reverse_BamHI GTAGGATCCTGGGATAGAGTTACAAAC (SEQ ID NO:60) vWbp_forward_XhoI GAACTCGAGgcattatgtgtatcacaaatttggg (SEQ ID NO:61)

Tabla 10. Cebadores utilizados en este estudio

Nombre del Cebador Secuencia

vWbp_Xho_factorXa_F GAACTCGAGatagaaggcagagtggtttctggggagaagaatc (SEQ ID NO:62) vWbp_reverse_BamHI GAACTCGAGgcagccatgcattaattatttgcc (SEQ ID NO:63)

Para estudios enzimáticos, ELISA y SPR, la secuencia de codificación de longitud completa de Coa o vWbp se clonaron en forma de pET15b con los cebadores Coa_Xho_factorXa_F, Coa_inverso_BamHI, vWbp_Xho_factorXa_F, vWbp_inverso_BamHI (Tabla 10) que contiene un sitio de Factor Xa anterior al inicial Ile-Val-Thr-Lys de coagulasa y Val-Val-Ser-Gly de vWbp. Estas proteínas se expresaron y purificaron utilizando el protocolo anterior, a continuación se cortó con 10 unidades de Factor Xa/1ml durante 1 hora a 25°C para eliminar la etiqueta His6 del extremo N-terminal. Las proteínas se cargaron a continuación en una columna Superdex 75 (GE Healthcare) para la purificación final. Todas las proteínas eludidas se almacenaron en 1X PBS.

Anticuerpos de conejo. La concentración de proteínas se determinó utilizando un kit BCA (Thermo Scientific). La pureza se verificó mediante análisis en SDS PAGE en gel y tinción con azul Coomassie Brillante. Se inmunizaron conejos Nueva Zelanda blancos hembras de seis meses (Charles River Laboratories) con 500 |jg de proteína emulsionada en CFA (Difco) para la inmunización inicial o IFA para inmunizaciones de refuerzo en el día 24 y 48. En el día 60, se desangraron los conejos y el suero se recuperó para inmunoblot o experimentos de transferencia pasiva. Para la purificación de anticuerpos, se enlazó de forma covalente la His6-Coa o His6-vWbp recombinante (5 mg) a columnas HP de HiT rap activada por NHS (GE Healthcare). Esta matriz antigénica se utilizó a continuación para relizar cromatografía de afinidad de 10-20 ml de suero de conejo a 4°C. La matriz cargada se lavó con 50 volúmenes de columna de PBS, se eluyeron los anticuerpos con un tampón de elución (1 M glicina pH 2,5, 0,5 M NaCl) y se neutralizaron inmediatamente con 1M Tris-HCl, pH 8,5. Los anticuerpos purificados se dializaron durante la noche contra PBS a 4°C.

Resonancia de plasmones superficiales. La afinidad y las tasas de asociación y disociación se midieron en un aparato BIAcore 3000. Los tampones se filtraron estériles y se desgasificaron. Se preparó un chip CM5 para ligamiento de amina mediante inyección de protrombina humana (500 nM, pH 4,0) (Innovative Research) y fibrinógeno (200 nM, pH 4,5) (Innovative Research) en presencia de 0,2 M EDC y 0,05 M NHS. Para medir al interacció de la coagulasa con la protrombina y fibrinógeno, se diluyó Coa en tampón Hb S-P (20 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 0,005% [vol/vol] de tensioactivo P20) en concentraciones de 0 - 75 nM con inyecciones sucesivas de coagulasa durante 300 segundos seguido por 300 segundos para la disociación seguidoi por la regenaración con NaOH (50 jL , 30 segundos). Kd y x2 se determinaron utilizando el software de BiaEvaluation y se determinó el mejor resultado con un modelo de unión en una relación 1:1 con una línea de referencia de acumulación y Rmax local. La interacción del factor de von willebrand con la protrombina y el fibrinógeno fue medido de la misma manera. Todos los experimentos se repitieron por triplicado. Los experimentos de inhibición con anticuerpos policlonales se realizaron mediante inyecciones consecutivas de coagulasa (25 nM) incubada con aCoa a 0 nM - 200 nM bajo las mismas condiciones de inyección descritas anteriormente. vWF (50 nM) se incubó de manera similar con avWF a 0 nM - 400 nM. Se midió la diferencia de respuesta como el cambio en las unidades de respuesta desde antes de la inyección hasta el final de la inyección.

Mediciones de la actividad de la coagulasa. Se pre-incubó 1x10'16 M de protrombina (Innovative Research) durante 20 min con una cantidad equimolar de coagulasa funcional o vWbp a temperatura ambiente, seguido de la adición de S-2238 (un sustrato cromogénico) hasta una concentración final de 1 mM en un tampón de reacción totalde 100 j l 1 X PBS. El cambio en la absorbancia se midió a 450 nm durante 10 minutos en un espectrofotómetro, representado como una función del tiempo y ajustado a una línea curva. La pendiente de la curva (dA/dt) se interpretó como la tasa de la hidrólisis de S-2238, y por tanto un refelejo de la función enzimática (% actividad coagulasa-protrombina o vWbpprotrombina del complejo). El ensayo se repitió en presencia de anticuerpos específicos o transcersales añadidos en exceso de 3M excess (3x10'16M) y los datos se normalizaron al % de la actividad media sin inhibición.

Modelo de abscesos renales y prueba de provocación letal. Los cultivos de toda la noche de cepas estafilocócicas se diluyeron en una relación 1:100 en t Sb fresco y se cultivaron hasta que alcanzaron un OD600 de 0,4. Se centrifugaron 10 ml de bacterias a 7.500 xg, se lavaron, y se suspendieron en 10 ml de 1XPBS. Se inyectó por vía retroorbital a ratones BALB/c hembra de seis semanas de vida (Charles River) 1X107 de una suspensión estafilocócica de UFC en 100 j l de PBS. Se utilizaron cohortes de 10 ratones. En el quinto día posterior a la infección estos ratones se sacrificaron mediante asfixia por CO2 y se extirparon sus riñones. Todos los órganos fueron examinados para determinar lesiones de superficie y 8-10 riñones derechos se enviaron para seccionado para histopatología y tinción con hematoxilina-eosina. Estos portaobjetos se examinaron mediante microscopía óptica para determinar abscesos internos. Para el modelo de prueba de provocación letal, todas las condiciones experimentales permanecen igual excepto que 1 x 108 UFC de estafilococos se administraron y que los ratones se monitorizaron durante 10 días después de la infección para la supervivencia.

Tinción InmunoquínmicaI de secciones renales. Se eliminó la parafina de los riñones seccionados y se rehidrataron mediante xileno y diluciones en serie de EtOH en agua destilada. Se incubaron en el tampón de recuperación del antígeno (DAKO, pH 6,0) y se calentó en un vaporizador a aproximadamante 96°C durante 20 minutos. Después de enjuagar, los portaobjetos se incubaron en 3% de hidrógeno de peróxido durante 5 minutos y a continuación 10% de suero normal en 0,025%Tritonx-100 -PBS durante 30 minutes. Se utilizó 10% de IgG humana como reactivo bloqueante durante 30 minutos de incubación (Sigma-Aldrich). Se aplicó anticuerpo primario en los portaobjetos para una incubación de toda la noche a 4°C grados en una cámara de humedad. Los anticuerpos primarios utilizados fueron 1:500 prtrombina anti-ratón de rata (Innovative Research), 1:500 fibrinógeno de conejo anti-ratón (Innovative Research), 1:250 anti-estafilocoagulasa de conejo, o 1:250 anti-estafilococos de conejo vwbp. Después de lavado con TBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado (1:50 dilución de IgG de anti-rata biotinilada, BA-4001 de Vector Laboratories; o 1:200 dilución de IgG anti-conejo biotinilado, BA-1000 del Vector), y a continuación los reactivos ABC (Vector Laboratories). La unión antígeno-anticuerpo se detectó mediante sistema cromógeno del sutrato DAB. Los portaobjetos se sumergieron brevemente en hematoxilina para contra-tinción y evaluación bajo microscopía óptica.

Inmunización activa. Se inyectó a cada uno de los ratones BALB/c de tres semanas 50 |jg de proteína, se emulsionó en 100 j l de CFA. Se utilizaron cohortes de 15 ratones, con 5 ratones reservados para sangrado y títulos de anticuerpos. Once días después de la vacunación, estos ratones se reforzaron con 50 jg de proteína cada uno, se emulsionó en 100 j l de IFA. En el día 21, se inyectó a los ratones con 1x107 de UFC de estafilococos para el modelo de abscesos renales o 1x108 UFC para la prueba de provocación letal. En el momento de la infección 5 ratones se desangraron para obtener títulos de anticuerpos.

Transferencia pasiva de anticuerpos. Veinticuatro horas antes de la infección, se inyectó a ratones BALB/c de seis semanas de vida anticuerpos purificados contra Coa y/o vWbp en una dosis de 5 mg/kg de peso corporal. Se utilizaron cohortes de 10 ratones. Estos ratones se sometieron a prueba de provocación mediante inyección retroorbital con 1x107 de UFC (modelo de abscesos renales) o 1x108 de UFC de estafilococos (bacteriemia letal).

Referencias

Las siguientes referencias proporcionan ejemplos de procedimientos u otros detalles complementarios para los expuestos en la presente patente.

Patente estadounidense 3,791,932

Patente estadounidense 3,949,064

Patente estadounidense 4,174,384

Patente estadounidense 4,338,298

Patente estadounidense 4,356,170

Patente estadounidense 4,367,110

Patente estadounidense 4,372,945

Patente estadounidense 4,452,901

Patente estadounidense 4,474,757

Patente estadounidense 4,554,101

Patente estadounidense 4,578,770

Patente estadounidense 4,596,792

Patente estadounidense 4,599,230

Patente estadounidense 4,599,231

Patente estadounidense 4,601,903

Patente estadounidense 4,608,251

Patente estadounidense 4,683,195 Patente estadounidense 4,683,202 Patente estadounidense 4,684,611 Patente estadounidense 4,690,915 Patente estadounidense 4,690,915 Patente estadounidense 4,748,018 Patente estadounidense 4,800,159 Patente estadounidense 4,879,236 Patente estadounidense 4,952,500 Patente estadounidense 5,084,269 Patente estadounidense 5,199,942 Patente estadounidense 5,221,605 Patente estadounidense 5,238,808 Patente estadounidense 5,302,523 Patente estadounidense 5,310,687 Patente estadounidense 5,322,783 Patente estadounidense 5,384,253 Patente estadounidense 5,464,765 Patente estadounidense 5,512,282 Patente estadounidense 5,512,282 Patente estadounidense 5,538,877 Patente estadounidense 5,538,880 Patente estadounidense 5,548,066 Patente estadounidense 5,550,318 Patente estadounidense 5,563,055 Patente estadounidense 5,580,859 Patente estadounidense 5,589,466 Patente estadounidense 5,591,616 Patente estadounidense 5,610,042 Patente estadounidense 5,620,896 Patente estadounidense 5,648,240 Patente estadounidense 5,656,610 Patente estadounidense 5,702,932 Patente estadounidense 5,736,524 Patente estadounidense 5,780,448 Patente estadounidense 5,789,215 Patente estadounidense 5,801,234 Patente estadounidense 5,840,846 Patente estadounidense 5,843,650 Patente estadounidense 5,846,709 Patente estadounidense 5,846,783 Patente estadounidense 5,849,497 Patente estadounidense 5,849,546 Patente estadounidense 5,849,547 Patente estadounidense 5,858,652 Patente estadounidense 5,866,366 Patente estadounidense 5,871,986 Patente estadounidense 5,916,776 Patente estadounidense 5,922,574 Patente estadounidense 5,925,565 Patente estadounidense 5,925,565 Patente estadounidense 5,928,905 Patente estadounidense 5,928,906 Patente estadounidense 5,932,451 Patente estadounidense 5,935,819 Patente estadounidense 5,935,825 Patente estadounidense 5,939,291 Patente estadounidense 5,942,391 Patente estadounidense 5,945,100 Patente estadounidense 5,958,895 Patente estadounidense 5,981,274 Patente estadounidense 5,994,624 Patente estadounidense 6,00,8341

Patente estadounidense 6,288,214

Patente estadounidense 6,294,177

Patente estadounidense 6,651,655

Patente estadounidense 6,656,462

Patente estadounidense 6,733,754

Patente estadounidense 6,756,361

Patente estadounidense 6,770,278

Patente estadounidense 6,793,923

Patente estadounidense 6,814,971

Patente estadounidense 6,936,258

Patente estadounidense Appln. 2002/0169288

Patente estadounidense Appln. 2003/0153022

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante inmunogénica de la proteína A (SpA) que comprende:

(a) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio E, D, A, B o C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a Vh3, en donde la variante de SpA comprende un dominio E que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 33 y 34 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 36 y 37 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 6; y/o un dominio C que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 5; y

(b) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio E, D, A, B o C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, en donde la variante de SpA comprende un dominio E que comprede una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 6 y 7 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 6; y/o un dominio C que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 5.

2. La variante inmunogénica de la proteína A (SpA) según la reivindicación 1, que comprende:

a)

(i) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio E de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a Vh3, que comprenden una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 33 y 34 de la SEQ ID NO: 3; y

(ii) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio E que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 6 y 7 de la SEQ ID NO: 3; y/o

b)

(i) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio D de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a Vh3, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 36 y 37 de la SEQ ID NO: 2; y

(ii) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio D que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 9 y 10 de la SEQ ID NO: 2; y/o

c)

(i) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio A de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a Vh3, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 4; y

(ii) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio A que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 4; y/o

d)

(i) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio B de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a Vh3, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 6; y

(ii) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio B que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 6; y/o

e)

(i) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio C de la SpA que interrumpen o disminuyen la unión a Vh3, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 34 y 35 de la SEQ ID NO: 5; y

(ii) sustituciones de aminoácidos en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio C que interrumpen o disminuyen la unión a la Fc de IgG, que comprende una sustitución de aminoácidos en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos 7 y 8 de la SEQ ID NO: 5.

3. La variante inmunogénica de SpA según la reivindicación 1 o 2, en donde dicha sustitución de aminoácido en un subdominio de unión a Fc de la IgG del dominio E, D, A, B o C de la SpA es la sustitución de lisina por glutamina.

4. La variante inmunogénica de SpA según la reivindicación 3, que comprende un dominio E que comprende una sustitución del residuo de lisina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 6 y 7 de SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución del residuo de lisina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 9 y 10 de SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución del residuo de lisina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 7 y 8 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución del residuo de lisina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 7 y 8 de SEQ ID NO: 6, y/o un dominio C que comprende una sustitución del residuo de lisina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 7 y 8 de la SEQ ID NO: 5.

5. La variante inmunogénica de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sustitución de aminoácidos en un subdominio de unión a Vh3 del dominio E, D, A, B o C de la SpA es una sustitución de alanina por ácido aspártico.

6. La variante inmunogénica de SpA según la reivindicación 5, que comprende un dominio E que comprende un a sustitución del residuo de alanina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 33 y 34 de la SEQ ID NO: 3; un dominio D que comprende una sustitución del residuo de alanina en posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 36 y 37 de la SEQ ID NO: 2; un dominio A que comprende una sustitución del residuo de alanina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 34 y 35 de la SEQ ID NO: 4; un dominio B que comprende una sustitución del residuo de alanina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 34 y 35 de la SEQ ID NO: 6, y/o un dominio C que comprende una sustitución del residuo de alanina en cada una de las posiciones de aminoácidos correspondiente a las posiciones 34 y 35 de la SEQ ID NO: 5.

7. La variante inmunogénica de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34.

8. La variante inmunogénica de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la variante de SpA comrpende un segmento de SpA que comprende 5 o más dominios de unión a IgG.

9. Una composición inmunogénica que comprende la variante inmunogéncia de SpA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende opcionalmente al menos un segundo antígeno estafilocócico, en donde el segundo antígeno estafilocócico se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en un péptido ClfA, EsaB, Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Eap, Ebh, Coa, vWh, Hla, SdrC, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, ClfB, SasF peptide, un polisacárido capsular de tipo V y/o tipo VIII o un oligosacárido de S. aureus.

10. Una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una variante inmunogénica de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 10.

12. Una vacuna que comprende una composición farmacéuticamente aceptable que tiene un polipéptido de la variante inmunogénica de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la composición es capaz de estimular una respuesta inmune contra una bacteria estafilococo.

13. Una composición que comprende una bacteria no estafilococo recombinante que contiene o expresa una variante inmunogéncia de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. La variante inmunogénica de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección estafilocócica.

15. Uso de la variante inmunogéncia de SpA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección estafilocócica.