BR112013000097B1 - Polipeptídeo imunogênico isolado, composição imunogênica e seu uso - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO COMPREENDENDO UM SEGMENTO DO DOMÍNIO D DE UMA VARIANTE DE PROTEÍNA A (S PA), BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEUS USOS PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA UMA BACTÉRIA ESTAFILOCOCOS. A presente invenção refere-se a composições e seus usos para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana, particularmente infecção por uma bactéria Staphylococcus , ou para induzir uma resposta imune contra as bactérias. A invenção refere-se ainda a um polipeptíde o compreendendo um segmento do domínio D de uma variante de proteína A (SpA).

Description

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade dos pedidos de patente provisórios números de série US 61/361.218, depositado em 2 de julho de 2010, e 61/370.725, depositado em 4 de agosto de 2010, que são aqui incorporados como referência em sua totalidade.

[0002] Esta invenção foi elaborada com o patrocínio governamental, conforme AI057153, AI052474, e GM007281, concedido por National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

I. CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se genericamente aos campos científicos de imunologia, microbiologia, e patologia. Mais particularmente, ela se refere a métodos e composições que envolvem variantes de Proteína A bacterianass, que podem ser usadas para invocar uma resposta imune contra as bactérias.

II. ANTECEDENTES

[0004] O número de infecção adquiridas na comunidade e também contraídas em hospitais tem aumentado durante os últimos anos com o uso crescente de dispositivos intravasculares. As infecções contraídas em hospitais (nosocomiais) são uma causa importante de morbidez e mortalitdade mais particularmente nos Estados Unidos, onde elas afetam mais do que 2 milhões de pacientes anualmente. As infecções mais frequentes são infecções do trato urinário (33% das infecções), e em seguida, pneumonia (15,5%), infecções em locais cirúrgicos (14,8%) e infecções primárias da corrente sanguínea (13%) (Emorl e Gaynes, 1993).

[0005] Os patógenos nosocomiais principais incluem Staphylococcus aureus, coagulase-negative estafilococos coagulase negativa (principalmente Staphylococcus epidermidis), Enterococcus spp., Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Embora estes patógenos causem aproximadamente o mesmo número de infecções, a gravidade dos distúrbios que eles podem produzir combinada com frequência isolados resistentes a antibióticos pendem este ranking na direção de S. aureus e S. epidermidis como sendo os patógenos nosocomiais mais significativos.

[0006] Os estafilococos podem causar uma ampla série de doenças em seres humanos e outros animais através da produção ou invasão de toxinas. As toxinas estafilocócicas são também uma causa comum de envenamento alimentar, pois as bactérias podem crescer em alimentos estocafos inadequadamente.

[0007] Staphylococcus epidermidis é um comensal normal da pele,e é também um patógeno oportunístico importante responsável por infecções de dispositivos médicos prejudicados e infecções em locais de cirurgia. Os dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluem marca-passos caardíacos, derivações de líquido cerebrospinal, catéteres de diálise peritoneal ambulatorial contínua, dispositivos ortopédicos e válvulas cardíacas protéticas.

[0008] Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções nosocomiais com uma morbidade e mortalidade significativa. Ela é a causa de alguns casos de osteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos, e síndrome do choque tóxico. S. aureus pode sobreviver sobre superficies secas, aumentando a possibilidade de transmissão. Qualquer infecção por S. aureus pode causar a síndrome da pele escaldada estafilocócica, uma reação cutânea à exotoxina absorvida na corrente sanguínea. Ela pode causar também um tipo de septicemia piemia que pode ser letal. Problematicamente, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) se tornou uma causa importante de infecções contraídas em hospitais.

[0009] As infecções por S. aureus e S. epidermidis são tratadas tipicamente com antibióticos, sendo a penicilina o fármaco de escolha, enquanto que a vancomicina é usada para isolados resistentes à meticilina. A porcentagem de cepas estafilocócicas que apresentam resistência de amplo espectro a antibióticos se tornou crescentemente prevalente, representando uma ameça para uma terapia antimicrobiana eficaz. Além disso, a recente emergência de uma cepa resistente à vancomicina de S. aureus causou temor que as cepas MRSA são emergentes e disseminam e para as quais não há terapia eficaz disponível.

[00010] Uma alternativa ao tratamento com antibióticos para infecções estafilocócicas está em investigação e ela usa anticorpos direcionados contra antígenos estafilocócicos. Esta terapia emvolve a administração de antissoros policlonais (documentos nos WO00/15238, WO00/12132) ou tratamento com anticorpos monoclonais contra ácido lipoteicoico (documento no WO98/57994).

[00011] Uma abordagem alternativa seria o uso de vacinação ativa para gerar uma resposta imune contra estafilococos. O genoma de S. aureus foi sequenciado e muitas sequências codificadoras foram identificadas (documentos nos WO02/094868, EP0786519), que podem levar à identificação de antígenos potenciais. O mesmo é verdadeiro para S. epidermidis (documento no WO01/34809). Como um refinamento desta abordagem, outros pesquisadores identificaram proteínas que são reconhecidas por soros hiperimunes de pacientes que sofreram infecção estafilocócica (documentos nos WO 01/98499, WO 02/059148).

[00012] S. aureus secreta a pletora de faotres de virulência dentro do meio extracelular (Archer, 1998; Dinges et al., 2000; Foster, 2005; Shaw et al., 2004; Sibbald et al., 2006). Similiarmente à maioria das proteínas secretadas, estes fatores de virulência são deslocados pelo mecanismo Sec através da membrana plasmática. As proteínas secretadas pelo mecanismo Sec portam um peptídeo líder no terminal N, que é removido pela peptidase líder depois que a pré-proteína está engatada no translócon Sec (Dalbey e Wickner, 1985; van Wely et al., 2001). A recente análise do genoma sugere que actinobactérias e membros da Firmicutes codificam um sistema de secreção adicional que reconhece um subconjunto de proteínas de uma maneira independente de Sec (Pallen, 2002). ESAT-6 (alvo antigênico precocemente secretado 6 kDa) e CFP-10 (antígeno de filtrado de cultura 10 kDa) de Mycobacterium tuberculosis representam os primeiros substratos deste sistema de secreção inusitado denominado ESX-1 ou Snm em M. tuberculosis (Andersen et al., 1995; Hsu et al., 2003; Pym et al., 2003; Stanley et al., 2003). Em S. aureus, dois fatores semelhantes a ESAT-6, designados EsxA e EsxB, são secretados pela via Ess (sistema de secreção de ESAT-6) (Burts et al., 2005).

[00013] A primeira geração de vacinas assestadas contra S. aureus ou contra exoproteínas que ela produz atenderam com sucesso limitado (Lee, 1996). Permanece existindo um,a necessidade de se desenvolver vacinas eficazes contra infecções estafilocócicas. Composições adicionais para tratar infecções estafilocócicas também são necessárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00014] A proteína A (SpA) (SEQ ID NO:33), uma proteína superficial ancorada na parede cellular de Staphylococcus aureus, proporiona evasão bacteriana a partir de respostas imunes inatas e adaptadas. A Proteína A se liga a imunoglobulinas na sua parte Fc, interage com o domínio VH3 de receptores de células B, que estimulam inadequadamente a proliferação e apoptose de células B, se liga aos domínios do fator de von Willebrand A1 para ativar a coagulação intracelular, e também se liga ao Receptor-1 de TNF para contribuir para a patogênese de pneumonia estafilocócica. Devido ao fato de que a Proteína A captura imunoglobulina e apresenta atributos tóxicos, a possibilidade que esta molécula superficial pode funcionar como uma vacina em seres humanos não foi perseguida rigorosamente. Nesta invenção demonstrou-se que as variantes da Proteína A não são mais capazes de se ligar a imunoglobulinas, que desta forma são privadas de seu potencial toxigênico, isto é, são não toxigênicas, estimulam respostas imunes humorais que protegem contra doença estafilocócica.

[00015] Em certas modalidades, a variante SpA é uma variante SpA de comprimento inteiro que compreende o domínio A, B, C, D, e/ou E. Em certos aspectos, a variante SpA compreende ou consiste na sequência de aminoácidos que é 80, 90, 95, 98, 99, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:34. Em outras modalidades, a variante SpA compreende um segmento de SpA. O segmento de SpA pode compreender pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios de ligação de IgG. Os domínios de IgG podem ser pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais domínios variantes A, B, C, D, ou E. Em certos aspectos, a variante SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, ou mais domínios variantes A. Em outro aspecto, a variante SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, ou mais domínios variantes B. Em ainda outro aspecto a variante SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, ou mais domínios variantes C. Em ainda outro aspecto a variante SpA comprieende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, ou mais domínios variantes D. Em certos aspectos, a vairante SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, ou mais domínios variantes E. Em outro aspecto a variante SpA compreende uma combinação de domínios A, B, C, D, e E em várias combinações e permutações. As combinações podem incluir a totalidade ou parte de um segmento de peptídeo sinalizador de SpA, um segmento da região X de SpA e/ou um segmento sinalizador de escolha de SpA. Em outros aspectos, a variante SpA não inclui um segmento de peptídeo sinalizador de SpA, um segmento da região X de SpA e/ou um ssegmento sinalizador de escolha de SpA. Em certos aspectos um domínio variante A compreende uma substituição nas posições 7, 8, 34, e/ou 35 de SEQ ID NO:4. Em outro aspecto um domínio variante B compreende uma substituição nas pósições 7, 8, 34, e/ou 35 de SEQ ID NO:6. Em ainda outro aspecto um domínio variante C compreende uma substituição nas posições 7, 8, 34, e/ou 35 de SEQ ID NO:5. Em certos aspectos um domínio variante D compreende uma substituião nas posições 9, 10, 36, e/ou 37 de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto um domínio variante E compreende uma substituição nas posições 6, 7, 33, e/ou 34 de SEQ ID NO:3.

[00016] Em certos aspectos, uma variante do domínio D de SpA ou seu equivalente pode compreender uma mutação nas posições 9 e 36; 9 e 37; 9 e 10; 36 e 37; 10 e 36; 10 e 37; 9, 36, e 37; 10, 36, e 37, 9, 10 e 36; ou 9,10 e 37 de SEQ ID NO:2. Em outro aspecto, mutações análogas podem ser incluídas em um ou mais domínios A, B, C, ou E.

[00017] Em outros aspectos, o aminoácido glutamina (Q) na posição 9 de SEQ ID NO:2 (ou seu aminoácido análogo em outros domínios de SpA) pode ser substituído por uma alanina (A), uma asparagina (N), um ácido aspártico (D), uma cisteína (C), um ácido glutânico (E), uma fenilalanina (F), uma glicina (G), uma histidina (H), uma isoleucina (I), uma lisina (K), uma leucina (L), uma metionina (M), uma prolina (P), uma serina (S), uma treonina (T), uma valina (V), um triptofano (W), oum uma tirosina (Y). Em alguns aspectos a glutamina na posição 9 pode ser substituída por uma arginina (R). Em outro aspecto, a glutamina na posição 9 de SEQ ID NO:2, ou seu equivalente, pode ser substituída por uma lisina ou uma glicina. Quaisquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais das substituições podem ser explicitamente excluídas.

[00018] Em outro aspecto, o aminoácido glutamina (Q) na posição 10 de SEQ ID NO:2 (ou seu aminoácido análogo em outros domínios de SpA) pode ser substituído por uma alanina (A), uma asparagina (N), um ácido aspártico (D), uma cisteína (C), um ácido glutâmico (E), uma fenilalanina (F), uma glicina (G), uma histidina (H), uma isoleucina (I), uma lisina (K), uma leucina (L), uma metionina (M), uma prolina (P), uma serina (S), uma treonina (T), uma valina (V), um triptofano (W), ou uma tirosina (Y). Em alguns aspectos a glutamina na posição 10 pode ser substituída por uma arginina (R). Em outro aspecto, a glutamina na posição 10 de SEQ ID NO:2, ou seu equivalente, pode ser substituída por uma lisina ou glicina. Quaisquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais das substituições podem ser explicitamente excluídas.

[00019] Em certos aspectos, o ácido aspártico (D) na posição 36 de SEQ ID NO:2 (ou seu aminoácido análogo em outros domínios de SpA) pode ser substituído por uma alanina (A), uma asparagina (N), uma arginina (R), uma cisteína (C), uma fenilalanina (F), uma glicina (G), uma histidina (H), uma isoleucina (I), uma lisina (K), uma leucina (L), uma metionina (M), uma prolina (P), uma glutamina (Q), uma serina (S), uma treonina (T), uma valina (V), um triptofano (W), ou uma tirosina (Y). Em alguns aspectos, o ácido aspártico na posição 36 pode ser substituído por um ácido glutâmico (E). Em certos aspectos, um ácido aspártico na posição 36 de SEQ ID NO:2, ou seu equivalente, podsubstituído por uma alanina ou uma serina. Quaisquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais das substituições podem ser explicitamente excluídas.

[00020] Em outro aspecto, o ácido aspártico (D) na posição 37 de SEQ ID NO:2 (ou seu aminoácido análogo em outros domínios de SpA) pode ser substituído por uma alanina (A), uma asparagina (N), uma arginina (R), uma cisteína (C), uma fenilalanina (F), uma glicina (G), uma histidina (H), uma isoleucina (I), uma lisina (K), uma leucina (L), uma metionina (M), uma prolina (P), uma glutamina (Q), uma serina (S), uma treonina (T), uma valina (V), um triptofano (W), ou uma tirosina (Y). Em alguns aspectos, o ácido aspártico na posição 37 pode ser substituído por um ácido glutâmico (E). Em certos aspectos, um ácido aspártico na posição 37 de SEQ ID NO:2, ou seu equivalente, pode ser substituído por uma alanina ou uma serina. Quaisquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais das substituições podem ser explicitamente excluídas.

[00021] Em uma modalidade específica, o aminoácido na posição 9 de SEQ ID NO:2 (ou um aminoácido análogo em outro domínio de SpA) é substituído por uma alanina (A), uma glicina (G), uma isoleucina (I), uma leucina (L), uma prolina (P), uma serina (S), ou uma valina (V). Em certos aspectos, o aminoácido na posição 9 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma glicina. Em outro aspecto o aminoácido na posição 9 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma lisina.

[00022] Em uma modalidade específica, o aminoácido na posição 10 de SEQ ID NO:2 (ou um aminoácido análogo em outro domínio de SpA) é substituído por uma alanina (A), uma glicina (G), uma isoleucina (I), uma leucina (L), uma prolina (P), uma serina (S), ou uma valina (V), Em certos aspectos, o aminoácido na posição 10 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma glicina. Em outro aspecto o aminoácido na posição 10 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma lisina.

[00023] Em uma modalidade específica, o amino na posição 36 de SEQ ID NO:2 (oum um aminoácido análogo em outro domínio de SpA) é substituído por uma alanina (A), uma glicina (G), uma isoleucina (I), uma leucina (L), uma prolina (P), uma serina (S), ou uma valina (V). Em certos aspectos, o aminoácido na posição 36 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma serina. Em outro aspecto o aminoácido na posição 36 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma alanina.

[00024] Em uma modalidade específica, o amino na posição 37 de SEQ ID NO:2 (ou um aminoácido análogo de outro domínio de SpA) é substituído por uma alanina (A), uma glicina (G), uma isoleucina (I), uma leucina (L), uma prolina (P), uma serina (S), ou uma valina (V). Em certos aspectos, o aminoácido na posição 37 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma serina. Em outro aspecto o aminoácido na posição 37 de SEQ ID NO:2 é substituído por uma alanina.

[00025] Em certos aspectos, a variante SpA inclui uma substituição de (a) uma ou mais substituições de aminoácidos em um subdomínio de ligação a IgG Fc do domínio de SpA, A, B, C, D, e/ou E que rompe ou diminui a ligação a IgG Fc, e (b) uma ou mais substituições de aminoácidos em um subdomínio de ligação a VH3 do domínio de SpA, A, B, C, D, e/ou E que rompe ou diminui a ligação a VH3. Em ainda outros aspectos a sequência de aminoácidos de uma variante de SpA compreende uma sequência de aminoácidosque é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% idêntica, incluindo todos valores e faixas entre eles, à sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs:2-6.

[00026] Em outro aspecto a variante SpA inclui (a) uma ou mais substituições de aminoácidos em um subdomínio de ligaçõ a IgG Fc do domínio D de SpA, ou em uma posição de aminoácido correspondente em putros domínios de IgG, que rompe ou diminui a ligação a IgG Fc, e (b) uma ou mais substituições de aminoácidos em um subdomínio de ligação a VH3 do domínio D de SpA, ou em uma posição de aminoácido correspondente em outros domínios de IgG, tque rompe ou diminui a ligação a VH3. Em certos aspectos o resíduo de aminoácidoF5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31, e/ou K35 (SEQ ID NO:2,QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLG EAKKLNES) do subdomínio de ligação a IgG Fc do domínio D são modificados ou substituídos. Em certos aspectos, o resíduo de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, e/ou E47 (SEQ ID NO:2) do subdomínio de ligação a VH3 do domínio D são modificados ou substituídos, tal modo que a ligação a Fc ou VH3 seja atenuada. Em outros aspectos, as modificações ou substituições correspondentes podem ser manipuladas em posições correspondentes do domínio A, B, C, e/ou E. As posições correspondentes são definidas por alinhamento da sequência de aminoácidos do domínio D com uma ou mais sequências de aminoácidos de outros domínios de ligação a IgG de SpA; vide, por exemplo, Figura 2A. Em certos aspectos, a substituição de aminoácido pode ser qualquer um dos outros 20 aminoácidos. Em outro aspecto, substituições de aminoácidos conservativas podem ser especificamente excluídas de possíveis substituições de aminoácidos. Em outros aspectos, apenas substituições não conservativas são incluídas. Em qualquer caso, qualquer substituição ou combinações de substituições que reduz a ligação do domínio, de tal modo que a toxicidade de SpA seja significativamente reduzida, é contemplada. A significância da redução na ligação refere-se a uma variante que produz mínnima ou nenhuma toxidez quando introduzida em um indivíduo e pode ser avaliada usando métodos in vitro aqui descritos.

[00027] Em certas modalidades, uma variant SpA compreende pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais peptídeos do domínio D de SpA. Em certos aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 ou mais resíduos de aminoácidos da variante SpA são substituídos ou modificados, incluindo, porém sem limitações, aminoácidos F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31, e/ou K35 (SEQ ID NO:2) do subdomínio de ligação a IgG Fc do domínio D, e o resíduo de aminoácido Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, e/ou E47 (SEQ ID NO:2) do subdomínio de ligação a VH3 do domínio D. Em um aspecto da invenção, os resíduos de glutamina na posição 9 e/ou 10 de SEQ ID NO:2 (ou posições correspondentes em outros domínios) são mutados. Em outro aspecto, os resíduos de ácido aspártico 36 e/ou 37 de SEQ ID NO:2 (ou posições correspondentes em outros domínios) são mutados. Em outro aspecto, os resíduos de glutamina 9 e 10, e ácido aspartico 36 e 37 são mutados. SpA purificada não toxicogênica ou mutantes/variantes SpA-D aqui descritas não são mais capazes de se ligar significativamente (isto é, demonstram afinidade de ligação atenuada ou rompida) a FCY ou F(ab)2 VH3 e tembém não estimulam apoptose de células B. Estas non-toxigenic Proteína A variantes não toxicogênicas de Proteína A podem ser usadas como vacinas subunitárias e geram respostas imunes humorais e conferem imunidade protetora contra desafio de S. aureus. Em comparação com a Proteína A de comprimento inteiro do tipo selgagem ou o Domínio D de SpA do tipo selvagem, a imunização com variantes SpA-D resultou em um aumento no anticorpo específico de Proteína A. Usando um modelo da desafio estafilocócico com camundongos e formação de abscesso, Observou-se que a imunização com as variantes de Proteína A não toxicogênicas gerou proteção significativa contra infecção estafilocócica e formação de abscesso. Como virtualmente todas cepas de S. aureus expressam Proteína A, a imunização de seres humanos com as variantes de Proteína A não toxigênicas pode neutralizar esta virulência e desta forma estabelecer imunidade protetora. Em certos aspectos, a imunidade protetora protege ou melhora infecção por cepas resistentes a fármacos de estafilococo, tais como as cepas USA300 outras MRSA.

[00028] As modalidades incluem o uso de variantes de Proteína A em métodos e composições para o tratamento de infecção bacteriana e/ou estafilocócica. Esta invenção fornece também uma composição imunogênica que compreende uma variante de Proteína A ou seu fragmento imunogênico. Em certos aspectos, o fragmento imunogênico é um segmento do domínio D da Proteína A. Além disso, a presente invenção fornece métodos e composições que podem ser usadas para tratar (por exemplo, limitar a formação de abscessos estafilocócicos e/ou a persistência em um indivíduo) ou prevenir infecção bacteriana. Em alguns casos, os métodos para estimular uma resposta imune envolvem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que inclui ou codifica a totalidade ou parte de um polipeptídeo variante de Proteína A ou antígeno, e em certos aspectos, outras proteínas bacterianas. Outras proteínas bacterianas incluem, porém sem limitações, (i) um fator de virulência secretado, e/ou um peptídeo ou proteína da superfície celular, ou (ii) uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um fator de viruência secretado, e/ou uma proteína ou peptídeo da superfície celular.

[00029] Em outros aspectos, o indivíduo pode receber a administração da totalidade ou parte de uma variante de Proteína A, tal como um segmento do domínio D da Proteína A variante. O polipeptídeo da invenção pode ser formulado em uma composição farmaceuticamente aceitável. A composição pode compreender ainda um ou mais entre pelo menos ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 antígenos estafilocócicos adicionais ou seu fragmento imunogênico (por exemplo, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla (por exemplo, mutantes H35), IsdC, SasF, vWbp, or vWh). Os antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, porém sem limitações, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (documento no WO 01/60852), Aaa (GenBank CAC80837), Aap (acesso do GenBank AJ249487), Ant (ancesso do GenBank NP_372518), autolisina glucosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC Imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e trnasportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP- 2, e/ou proteína ligante de Vitronectina (vide publicações PCT nos WO2007/113222, WO2007/113223, WO2006/032472,WO2006/032475, WO2006/032500, sendo cada uma delas aqui incorporado como referência em sua totalidade). O antígeno estafilocócico ou fragmento imunogênico pode ser administrado concomitantemente com a variante de Proteína A. O antígeno estafilocócico ou fragmento imunogênico e a variante de Proteína A podem ser administrados na mesma composição. A variante de Proteína A pode ser também uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica uma variante de Proteína A. Uma molécula de ácido nucleico recombinante pode codificar a variante de Proteína A e pelo um antígeno estafilocócico ou seu fragmento imunogênico. Como aqui utilizado, o termo "modular" ou "modulação" engloba os significados das palavaras "intensificar" ou "inibir". "Modulação" da atividade pode ser um aumento ou diminuição na atividade. Como aqui utilizado, o termo “modulador” refere-se a compostos que efetuam a função de um grupamento, incluindo regulação ascendente, indução, estimulação, potencialização, inibição, regulação descendente, ou supressão de uma proteína, ácido nucleico, gene, organismo ou similares.

[00030] Em certas modalidades, os métodos e composições usam ou incluem ou codificam a totalidade ou parte da variante de Proteína A ou antígeno. Em outros aspectos, a variante de Proteína A pode ser usada em combinação com fatores secretados ou antígenos superficiais incluindo, porém sem limitações, um ou mais entre um polipeptídeo Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, ou vWh isolado ou seu segmento imunogênico. Os antígenos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, porém sem limitações, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glicosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, e/ou proteína ligante de Vitronectina. Em certas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais entre Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glicosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteín ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, e/ou proteína ligante de Vitronectina podem ser especificamente excluídas de uma formulação da invenção.

[00031] A tabela que se segue lista as várias combinações de variantes SpA e vários outros antígenos estafilocócicos. Tabela 1. Combinações de SpA e antígeno estafilocócico.

[00032] Em aina outros aspectos, a variante de Proteína A isolada é multimerizada, por exemplo, dimerizada ou uma fusão linear de dois ou mais polipeptídeos ou segmentos de peptídeos. Em certos aspectos da invenção, uma composição compreende multímeros ou concatâmeros de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais proteínas da superfície celular isoladas ou segmentos delas. Os concatâmeros são polipeptídeos lineares que têm uma ou mais unidades peptídicas repetidas. Os polipeptídeos SpA ou fragmentos podem ser consecutivos ou separados por um espaçador ou outras sequências peptídicas, por exemplo, um ou mais peptídeos bacterianos adicionais. Em outro aspecto, os outros polipeptídeos ou peptídeos contidos no multímero ou concatâmero podem incluir, porém sem limitações, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 entre Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh ou seus fragmentos imunogênicos. Os antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, porém sem limitações, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glicosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP- 2, e/ou proteína ligante de Vitronectina.

[00033] O termo “variante de Proteína A” ou “variante SpA” refere-se a polipeptídeos que incluem um domínio IgG de SpA, tendo uma ou mais substituições de aminoácidos que rompem a ligação a Fc e VH3. Em certos aspectos, uma variante SpA inclui um peptídeo do domínio D variante, bem como variantes de polipeptídeos SpA e seus segmentos que não são toxicogênicos e estimulam uma resposta imune contra Proteína A de bactérias estafilocócicas e/ou bactérias que a expressam.

[00034] As modalidades da presente invenção incluem métodos para eliciar uma resposta imune contra uma bactéria esfafilocócias ou estafilococos em um indivíduo, compreendendo fornecer ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma variante de Proteína A ou um seu segmento. Em certos aspectos, os métodos para eliciar uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica ou estafilocococos em um indivíduo compreendem fornecer ao indivíduo uma quantidade eficaz de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou mais proteínas secretadas e/ou proteínas da superfície celular ou seus segmentos/fragmentos. Uma proteína secretada ou proteína da superfície celular inclui, porém sem limitações, proteínas Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, e/ou vWh e seus fragmentos imunogênicos. Os antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com uma variante de Proteína A incluem, porém sem limitações, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolysin glucosaminidase, autolysin amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP- 2, e/ou proteína ligante de Vitronectina.

[00035] As modalidades da invenção incluem composições que incluem um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% idêntica ou similar à Proteína A, ou uma segunda proteína ou peptídeo que é proteína bacteriana secretada ou uma proteína da superfície celular. Em outra modalidade da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a um polipeptídeo do domínio D da Proteína A (SEQ ID NO:2), domínio E (SEQ ID NO:3), domínio A (SEQ ID NO:4), domínio C (SEQ ID NO:5), domínio B (SEQ ID NO:6), ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do domínio domínio D, domínio E, domínio A, domínio C, ou domínio B da Proteína A. Em certos aspectos, um segmento de polipeptídeo da Proteína A deve ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. A similaridade ou identidade, sendo a identidade preferida, é conhecida nessas técnicas e inúeros programas diferentes podem ser usados para identificar se uma proteína (ou ácido nucleico) tem identidade ou similaridade de sequências com uma sequência conhecida. A identidade e/ou similaridade de squências é determinada usando técnicas usuais conhecidas nessa área, incluindo, porém sem limitações, o algoritmo de identidade de sequências de Smith & Waterman (1981), pelo algoritmo de identidade de sequências de Needleman & Wunsch (1970), pelo método de busca de similaridade de Pearson & Lipman (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Softwares Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), o programa de sequências Best Fit descrito por Devereux et al. (1984), de preferência usando parâmetros deomissão, ou por inspeção. De preferência, a identidade percentual é calculada usando ferramentas de alinhamento conhecidas e facilmente disponíveis para os versados nessas técnicas. A identidade percentual ié essencialmente o número de aminoácidos idênticos, dividido pelo número total de aminoácidos comparados multiplicado por cem.

[00036] Ainda outras modalidades incluem métodos para estimular em um indivíduo uma resposta imune protetora ou terapêutica contra uma bactéria estafilocócica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que inclui(i) uma variante SpA, por exemplo, um polipeptídeo do domínio D de SpA variante ou seu peptídeo; ou (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo SpA variante ou seu peptídeo, ou (iii) administrar um polipeptídeo do domínio D variante de SpA com qualquer combinação ou permitação de proteínas bacterianas aqui descritas. Em uma modalidade preferida, a composição não é uma bactéria estafilocócica. Em certos aspectos, o indivíduo é um ser humano ou uma vaca. Em outro aspecto a composição é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Os estafilococos podem ser Staphylococcus aureus.

[00037] Ainda outras modalidades incluem vacinas que compreendem uma composição farmaceuticamente aceitável que tem um polipeptídeo variante de SpA, ou qualquer combinação ou permutação de proteína(s) ou peptídeo(s) aqui descritos, onde a composição é capaz de estimular uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica. A vacina pode compreender um polipeptídeo variante de SpA isolado, ou qualquer combinação ou permutação da proteína(s) ou peptídeo(s) descritos. Em certos aspectos da invenção, o polipeptídeo variante de SpA isolado, ou qualquer combinação ou permutação de proteína(s) ou peptídeo(s) descritos são multimerizados, por exemplo, dimerizados ou concatamerizados. Em outro aspecto, a composição de vacina é é contaminada em menos do que cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,05% (ou qualquer faixa entre esses valores) de outras proteínas estafilocócicas. Uma composição pode compreender ainda uma polipeptídeo não SpA isolado. Tipicamente, a vacina compreende um adjuvante. Em certos aspectos, uma proteína ou peptídeo da invenção é ligado (de forma covalente ou não covalente) ao adjuvante, de preferência o adjuvante quimicamente conjugado à proteína.

[00038] Em ainda outras modalidades, uma composição de vacina é uma composição farmaceuticamente aceitável que tem um ácido nucleico recombinante que codifica a totalidade ou parte de um polipeptídeo SpA variante, ou qualquer combinação ou permitação de proteína(s) ou peptídeo(s) aqui descritos, onde a composição é capaz de estimular uma resposta imune contra bactérias estafilocócicas. A composição de vacina pode compreender uma ácido nucleico recombinante que codifica a totalidade ou parte de um polipeptídeo SpA variante polipeptídeo, ou qualquer combinação ou permutação de proteína(s) ou peptídeo(s) aqui descritos. Em certas modalidades, o ácido nucleico recombinante contém um promotor heterólogo. De preferência, o ácido nucleico recombinante é um vetor. Mais preferivelmente, o vetor é um plasmídeo ou um vetor viral. Em alguns aspectos, a vacina inclui uma bacteria não estafilocócica recombinante que contém o ácido nucleico. Os não estafilococos recombinantes podem ser salmonela ou outras bactérias gram-positivas. A vacina pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, mais preferivelmente um adjuvante.

[00039] Ainda outras modalidades incluem métodos para estimular em um indivíduo uma resposta imune protetora ou terapêutica contra uma bactéria estafilocócica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição de um polipeptídeo variante SpA ou seu segmento/fragmento, e compreendendo ainda uma ou mais entre uma proteína Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, ou vWh ou seu peptídeo. Em uma modalidade preferida, a composição compreende uma bactéria não estafilocócica. Em outro aspecto a composição é formulada em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Os estafilocococos contra os quais um indivíduo é tratado pode ser Staphylococcus aureus. Os métodos da invenção incluem também composições da variante SpA, que contêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou mais fatores de virulência secretados e/ou proteínas da superfície celular, tais como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, ou vWh em várias combinações. Em certos aspectos uma formulação de vacina inclui Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, e vWh. Em certos aspectos, uma combinação de antígenos pode incluir (1) uma variante SpA e IsdA; (2) variante SpA e ClfB; (3) variante SpA e SdrD; (4) variante SpA e Hla ou variante de Hla; (5) variante SpA e ClfB, SdrD, e Hla ou variante de Hla; (6) variante SpA, IsdA, SdrD, e Hla ou variante de Hla; (7) variante SpA, IsdA, ClfB, e Hla ou variante de Hla; (8) variante SpA, IsdA, ClfB, e SdrD; (9) variante SpA, IsdA, ClfB, SdrD e Hla ou variante de Hla; (10) variante SpA, IsdA, ClfB, e SdrD; (11) variante SpA, IsdA, SdrD, e Hla ou variante de Hla; (12) variante SpA, IsdA, e Hla ou variante de Hla; (13) variante SpA, IsdA, ClfB, e Hla ou variante de Hla; (14) variante SpA, ClfB, e SdrD; (15) variante SpA, ClfB, e Hla ou variante de Hla; ou (16) variante SpA, SdrD, e Hla ou variante de Hla.

[00040] Em certos aspectos, uma bacteria que destribui uma composição da invenção deve ser limitada ou atenuada com relção ao crescimento prolongado ou persistente ou formação de abscessos. Em ainda outro aspecto, variante(s) SpA podem ser superexpressadas na bactéria atenuada para intensificar ou suplementar ainda mais uma resposta imune ou formulação de vacina.

[00041] O termo “proteína EsxA” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos EsxA do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsxA de bactérias estafilocócicas.

[00042] O termo “proteína EsxB” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos EsxB do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsxB de bactérias estafilocócicas.

[00043] O termo “proteína SdrD” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos SdrD do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SdrD de bactérias estafilocócicas.

[00044] O termo “proteína SdrE” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos SdrE do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SdrED de bactérias estafilocócicas.

[00045] O termo “proteína IsdA” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos IsdA do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas IsdA de bactérias estafilocócicas.

[00046] O termo “proteína IsdB” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos IsdB do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas IsdB de bactérias estafilocócias.

[00047] O termo “proteína Eap” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos Eap do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Eap de bactérias estafilocócias.

[00048] O termo “proteína Ebh” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos Ebh do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Ebh de bactérias estafilocócias.

[00049] O termo “proteína Emp” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos Emp do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Emp de bactérias estafilocócias.

[00050] O termo “proteína EsaB” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos Esab do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsaB de bactérias estafilocócias.

[00051] O termo “proteína EsaC” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos EsaC do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas EsaC de bactérias estafilocócias.

[00052] O termo “proteína SdrC” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos SdrC do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SdrC de bactérias estafilocócias.

[00053] O termo “proteína ClfA” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos ClfA do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas ClfA de bactérias estafilocócias.

[00054] O termo “proteína ClfB” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos ClfB do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas ClfB de bactérias estafilocócias.

[00055] O termo “proteína Coa” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos Coa do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Coa de bactérias estafilocócias.

[00056] O termo “proteína Hla” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos Hla do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas Hla de bactérias estafilocócias.

[00057] O termo “proteína IsdC” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos IsdC do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas IsdC de bactérias estafilocócias

[00058] O termo “proteína SasF” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos SasF do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas SasF de bactérias estafilocócias.

[00059] O termo “proteína vWbp” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos vWbp do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas vWbp de bactérias estafilocócias.

[00060] O termo “proteína vWh” refere-se a uma proteína que inclui polipeptídeos vWh do tipo selvagem isolados de bactérias estafilocócicas e seus segmentos, bem como variantes que estimulam uma resposta imune contra proteínas vWh de bactérias estafilocócias.

[00061] Uma resposta imune refere-se a uma resposta humoral, uma resposta celular, ou uma resposta humoral e também uma resposta celular em um organismo. Uma resposta imune pode ser medida por ensaios que incluem, porém sem limitações, ensaios que medem a presença ou quantidade de anticorpos que reconhecem especificamente uma proteína ou proteína da superfície celular, ensaios que medem a ativação ou proliferação de células T, e/ou ensaios que medem a modulação em termos da atividade ou expressão de uma ou mais citocinas.

[00062] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína EsxA. Em certos aspectos, a proteína EsxA deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11.

[00063] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% idêntica ou similar a uma proteína EsxB. Em certos aspectos, a proteína EsxB deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.

[00064] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína SdrD. Em certos aspectos, a proteína SdrD deve ter a totalidade ou deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13.

[00065] Em outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína SdrE. Em certos aspectos, a proteína SdrE pode ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

[00066] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína IsdA. Em certos aspectos, a proteína IsdA deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15.

[00067] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína IsdB. Em certos aspectos, a proteína IsdB fdeve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

[00068] As modalidades da invenção incluem composições que incluem um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína EsaB. Em certos aspectos, a proteína EsaB deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17.

[00069] Em outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína ClfB. Em certos aspectos, a proteína ClfB deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18.

[00070] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína IsdC. Em certos aspectos, a proteína IsdC deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19.

[00071] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína SasF. Em certos aspectos, a proteína SasF deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20.

[00072] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína eu é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína SdrC. Em certos aspectos, a proteína SdrC deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:21.

[00073] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a um proteína ClfA. Em certos aspectos, a proteína ClfA deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

[00074] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Eap. Em certos aspectos, a proteína Eap deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:23.

[00075] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Ebh. Em certos aspectos, a proteína Ebh deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24.

[00076] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Emp. Em certos aspectos, a proteína Emp deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25.

[00077] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína EsaC. Em certos aspectos, a proteína EsaC deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26. A sequência de polipeptídeos EsaC pode ser encontrada nas bases de dados de proteínas e incluem, porém sem limitações, os números de acesso ZP_02760162 (GI:168727885),NP_645081.1 (GI:21281993), e NP_370813.1 (GI:15923279), sendo cada uma delas aqui incorporado como referência a partir da data de prioridade deste pedido de patente.

[00078] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína tque é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Coa. Em certos aspectos, a proteína Coa deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

[00079] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína Hla. Em certos aspectos, a proteína Hla deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28.

[00080] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína vWa. Em certos aspectos, a proteína vWa deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:29.

[00081] Em ainda outras modalidades da invenção, uma composição pode incluir um polipeptídeo, peptídeo, ou proteína que é ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ou similar a uma proteína vWbp. Em certos aspectos, a proteína vWbp deve ter a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:32.

[00082] Em certos aspectos, um polipeptídeo ou segmento/fragmento pode ter uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% ou mais, idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo referencial. O termo “similaridade” refere-se a um polipeptídeo que tem uma sequência que tem uma cerca porcentagem de aminoácidos que são idênticos ao polipeptídeo referencial ou constituem substituições conservativas nos polipeptídeos referenciais.

[00083] Os polipeptídeos aqui descritos podem incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais aminoácidos variantes dentro de pelo menos, ou no máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1.000 ou mais aminoácidos contíguos, ou qualquer faixa entre esses valores, def SEQ ID NO:2-30, ou SEQ ID NO:32-34.

[00084] Um segmento de polipeptídeo como aqui descrito pode incluir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1.000 ou mais aminoácidos contíguos, ou qualquer faixa entre estes valores, de SEQ ID NO:2-30, ou SEQ ID NO:33-34.

[00085] As composições podem ser formuladas em uma composição farmaceuticamente aceitável. Em certos aspectos da invenção, a batéria estafilocócica é uma bactéria S. aureus.

[00086] Em outros aspectos, uma composição pode ser administrada mais do que uma vez ao indivíduo, e pode ser administrada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais vezes. A administração das composições inclui, porém sem limitações, administração oral, parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, ou várias combinações dessas administrações, incluindo inalação ou aspiração.

[00087] Em ainda outras modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo aqui descrito ou seus segmentos/fragmentos. Tipicamente, uma molécula de ácido nucleico recombinante, que codifica um polipeptídeo aqui descrito, contém um promotor heterólogo. Em certos aspectos, uma molécula de ácido nucleico recombinant da invenção é um vetor, em ainda outros aspectos, o vetor é um plasmídeo. Em certas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em certos aspectos, uma composição inclui uma bactéria não estafilocócica recombinante que contém ou expressa um polipeptídeo aqui descrito. Em aspectos específicos, a bacteria não esfilocócica recombinante é Salmonella ou outra bactéria gram-positiva. Uma composição é tipicamente administrada a mamíferos, tais como indivíduos humanos, mas a administração a outros animais que são capazes de eliciar uma resposta imune está contemplada. Em outros aspectos, bacteria estafilocócica que contém ou expressa o polipeptídeo é Staphylococcus aureus. Em outras modalidades, a resposta imune é uma resposta imune protetora.

[00088] Em outras modalidades, uma composição compreende uma molecula de ácido nucleico recombinante que codifica a totalidade ou parte de uma ou mais proteínas Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, SpA, vWbp, ou vWh ou peptídeo ou sua variante. Os antígenos estafilocócicos adicionais que podem ser usados em combinação com os polipeptídeos aqui descritos incluem, porém sem limitações, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glicosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), SEA exotoxins (WO 00/02523), SEB exotoxins (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP-2, e/ou proteína ligante de Vitronectina. Em espectos específicos, uma bactéria é uma bactéria não estafilocócica recombinante tal como uma salmonela ou outra bactéria gram-positiva.

[00089] As composições da invenção são tipicamente administradas a indivíduos humanos, mas a administração a outros animais que são capazes de eliciar uma resposta imune contra uma bactéria estafilocócica está contemplada, particularmente gado bovino, cavalos, cabras, ovelhas e outros animais domésticos, isto é, mamíferos.

[00090] Em certos aspectos, a bactéria estafilocócica é Staphylococcus aureus. Em outras modalidades, a resposta imune é uma resposta imune protetora. Em ainda outros aspectos, os métodos e composições da invenção podem ser usados para prevenir, melhorar, reduzir, ou tratar infecção de tecidos ou glândulas, por exemplo, glândulas mamárias, particularmente mastite e outras infecções. Outros métodos incluem, porém sem limitações, reduzir profilaticamente a carga bacteriana em um indivíduo que não apresenta sinais de infecção, particularmente aqueles indivíduos suspeitos ou em risco de ser colonizado por uma bactéria-alvo, por exemplo, pacientes que está ou estarão em risco ou suscetíveis à infecção durante duma hospitalização, tratamento, e/ou recuperação.

[00091] Qualquer modalidade discutida com relação a um aspecto da invenção também se aplica a outros aspectos da invenção. Em qualquer modalidade específica discutida no contexto de um polipeptídeo ou peptídeo ou ácido nicleico variante de SpA pode ser implementada com relação a outros antígenos tais como Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glicosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, transportador de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5.801.234), SsaA, SSP-1, SSP-2, e/ou proteína ligante de Vitronectina (ou ácidos nucleicos), e vice-versa. Deve-se entender também que qualquer uma ou mais entre Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsxA, EsxB, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, Coa, Hla, IsdC, SasF, vWbp, vWh, proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852), Aaa, Aap, Ant, autolisina glicosaminidase, autolisina amidase, Cna, proteína ligante de colágeno (US6288214), EFB (FIB), proteína ligante de Elastina (EbpS), EPB, FbpA, proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), proteína ligante de Fibronectina (US5840846), FnbA, FnbB, GehD (US 2002/0169288), HarA, HBP, transportador ABC imunodominante, IsaA/PisA, receptor de laminina, Lipase GehD, MAP, ytansportaor de Mg2+, análogo de MHC II (US5648240), MRPII, Npase, proteína ativadora de RNA III (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK,SBI, SdrF(WO 00/12689), SdrG / Fig (WO 00/12689), SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA (WO 00/02523), exotoxinas SEB (WO 00/02523), SitC e transportador ABC de Ni, proteína ligante de SitC/MntC/saliva (US5,801,234), SsaA, SSP-1, SSP- 2, e/ou proteína ligante de Vitronectina podem ser especificamente excluídas de uma composiçãoreivindicada.

[00092] As modalidades da invenção incluem composições que contêm ou não contêm uma bactéria. Uma composição pode ou não incluir uma bactéria estafilocócica atenuada ou viável ou intacta. Em certos aspectos, a composição compreende uma bactéria que não é uma bactéria estafilocócica ou não contém bactperias estafilocócicas. Em certas modalidades, uma composição bacteriana compreende uma variante de Proteína A estafilocócica isolada ou expressada de forma recombinante ou um nucleotídeo que codifica a mesma. A composição pode ser ou incluir uma bactéria estafilocócica manipulada de forma recombinante que foi alterada de uma maneira tal que compreende alterar a bactéria em relação a um fator de virulência ou proteína a da superfície celular secretada. Por exemplo, a bactéria pode ser modificada de forma recombinante para expressar mais fator de virulência ou proteína da superfície celular do que ela expressaria caso não modificada.

[00093] O termo “isolado” pode se referir a um ácido nucleico ou polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular, material bacteriano, material viral, ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante) ou usa fonte de origem, ou precursores químicos ou outros produtos químicos (quando quimicamente sintetizado). Além disso, um composto isolado refere-se a um que pode ser administrado a um indivíduo como um composto isolado; em outras palavras, o composto pode não ser simlesmente considerado “isolado” caso ele esteja aderido a uma coluna ou embitodo em um gel de agarose. Além disso, um “fragmento de ácido nucleico isolado” ou “peptídeo isolado” é um fragmento de ácido nucleico ou proteína que não é de ocorrência natural e/ou não está tipicamente no estado funcional.

[00094] As porções da invenção, tais como polipeptídeos, peptídeos, antígenos, ou imunógenos, podem ser conjugados de gorma covalente ou não covalente a outros grupamentos tais como adjuvantes, proteínas, peptídeos, suportes, grupamentos fluorescentes, ou marcadores. O termo “conjugado” ou “imunoconjugado” é amplamente utilizado para definir a associação operacional de um grupamento com outro agente e não pretende se referir unicamente a qualquer tipo de associação operacional, e não está particularmente limitado à “conjugação” química. As proteínas de fusão recombinantes estão particularmente contempladas. As composições da invenção podem compreender ainda um adjuvante ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Um adjuvante pode estar acoplado de forma covalente ou não covalente a um polipeptídeo ou peptídeo da invenção. Em certos aspectos, o adjuvante está quimicamente conjugado com uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo.

[00095] O termo “fornecer” é utilizado de acordo com significado normal para indicar “suprir ou prover o uso”. Em algumas modalidades, a proteína é fornecida diretamente administrando a proteína, enquanto que em outras modalidades, a proteína é fornecida eficazmente administrando um ácido nucleico que codifica a proteína. Em certos aspectos, a invenção contempla composições que compreendem várias combinações de ácidos nucleicoa, antígenos, peptídeos, e/ou epítopos.

[00096] O indivíduo deve ter (por exemplo, ser diagnosticado com uma infecção estafilocócica), deve ser suspeito de ter, ou deve estar em risco de desenvolver uma infecção estafilocócica. As composições da presente invenção incluem composições imunogênicas nas o(s) antígeno(s) ou epítopo(s) estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o propósito intencionado. Mais especificamente, uma quantidade eficaz significa uma quantidade de ingredientes ativos, necessária para estimular ou eliciar uma resposta imune, ou conferem resistência, melhora ou mitigação da infecção. Em aspectos mais específicos, uma quantidade eficaz previne, alivia ou melhora os sintomas dda doença ou infecção, ou prolonga a sobrevida do indivíduo que está sendo tratado. A determinação da quantidade eficaz é de pleno conhecimento dos versados nessas técnicas, especialmente à luz da descrição detalhada aqui fornecida. Para qualquer preparação usada nos métodos da invenção, uma quantidade ou dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de estudos in vitro, cultura de células, e/ou testes com modelos animais. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para conseguir uma resposta imune desejada ou concentração ou titulação de anticorpo criculante. Tais informações podem ser usadas para determinar mais precisamente as doses úteis em seres humanos.

[00097] As modalidades na seção de exemplos são modalidades da invenção aplicáveis a todos os aspectos da invenção.

[00098] O uso do termo “ou” nas reivindicações é para significar “e/ou” a menos que explicitamente indicado para se referir a apenas alternativas ou as alternativas são mutuamente excludentes, embora a descrição fundamente uma definição que se refere a apenas alternativas e “e/ou.” Contempla-se também que qualquer coisa listada usando o termo “ou” pode ser especificamente excluída.

[00099] Neste pedido de patente inteiro, o termo “cerca de” é utilizado para indicar que um valor que inclui o desvio-padrão do erro para o dispositivo ou método que está sendo empregado para determinar o valor.

[000100] Acompanhando a lei de patentes existente há muito tempo, as palavras “o”, “a”, “um” e “uma”, quando usadas em conjunto com a palavra “compreende” nas reivindicações ou no relatório descritivo, denota um ou mais, a menos que especificamente assinalado.

[000101] Outros objetos, características e vantagens da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue. Deve-se entender, entretanto, que descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades específicas da invenção, são fornecidos meramente a título ilustrativo, pois várias mudanças e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção ficarão evidentes para aqueles versados nessas técnicas a partir desta descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[000102] Para que o tema das características, vantagens e objetos da invenção enunciados acima, bem como outros fiquem evidentes e possam ser entendidos detalhadamente, descrições mais específicas e certas modalidades da invenção sumarizadas acima estão ilustradas nos desenhos apensados. Estes desenhos fazem parte do relatório descritivo. Deve-se assinalar, entretanto, que os desenhos apensadops ilustram certas modalidades da invenção e, portanto, não devem ser consideradas limitativas em seu âmbito.

[000103] Figuras 1A-1B. (Figura 1A) estrutura primária do precursor de Proteína A com um peptídeo sinalizador do modelo YSIRK no terminal N, cinco domínios de ligação de imunoglobulina como repetições tandem designados E, D, A, B, C, região X, e o sinal de seleção LPXTG. (FIigura 1B) Depois da síntese do precursor de Proteína A, os estafilocócicos secretam este produto por intermédio da via Sec, e sortase A cliva o sinal de seleção LPXTG entre os resíduos T e G. O ataque nucleofílico dos grupos amina dentro do lipídeo II no no intermediário ligado a sortase-tioéster de Proteína A forma a ligação amida que liga a Proteína A ao envelope da parede celular e permite sua apresentação sobre a superfície bacteriana.

[000104] A Figura 2 é um modelo tridimensional das interações moleculares entre o domínio D de SpA da Proteína A, o domínio VH3 Fab do receptor de células B, e do domínio FCY de imunoglobulina. O modelo é obtido a partir de duas estruturas cristalinas (Graille et al., 2000 and Gouda et al., 1992) que revelou resíduos da cadeia lateral envolvidos na formação de ligações iônicas que habilitam estes complexos. Gln-9 e Gln-10 de SpA-D promovem a ligação a FCY, enquanto que Asp-36 e Asp-37 possibilitam a formação de complexo com VH3 Fab.

[000105] Figura 3. Quadro à esquerda - SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie revela a posição migratória de SpA marcada com His purificada, SpA-D, SpA-DQ9,10K;D36,37A, IgG humana, e sortase A (SrtA), uma proteína de controle. Quadro à direita - SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie para reveler a eluição de complexos Proteína A imunoglobulina eluídos depois de cromatografia de afinidade de IgG humana em colunas Ni-NTA pré-carregadas com SpA marcada com His, SpA-D, SpA-DQ9,10K;D36,37A ou SrtA.

[000106] Figura 4. Análises ELISA para quantificar imunoglobulina humana (hIgG), fragmentos F(ab)2 de IgG humanos e fragmentos Fc humanos de imunoglobulina (hFc). As placas foram revestidas com quantidades iguais de SpA marcada com His, SpA-D, SpA-DQ9,10K;D36,37A or SrtA. hIgG-HRP, F(ab)2-HRP e hFc-HRP foram adicionados sobre as placas e incubadas por uma hora. A absorvância a 450nm foi registrada e plotada para determinar as titulações meio-máximas.

[000107] Figura 5. SpA-D purificada, SpA-DQ9,10K;D36,37A ou um controle simulado com PBS foram injetados no peritônio de camundongos e analisados quanto à sua capacidade para reduzir a populção de células B no baço de Camundongos BALB/c experimentais. Os animais foram exterminados 4 horas depois da injeção, seu baço foi removido, o tecido foi homogeneizador e corado com anticorpos CD19 direcionados contra células B. O número de células B foi quantificado por seleção com FACS.

[000108] Figura 6. Geração de uma vacina de proteína A não toxicogênica, um produto da tradução de proteína A (SpA) de S. aureus a. Newman e USA300 LAC com um peptídeo sinalizador no terminal N (barra vazada), cinco domínios ligantes de imunoglobulina (IgBDs designados E, D, A, B e C), região variável X e sinal de seleção do terminal C (barra preenchida). B. Sequência de aminoácidos dos cinco IgBDs bem como SpA-DKKAA não toxicogênico, com as posições de feixes de tripla hélice α (H1, H2 e H3) bem como glutamina (Q) 9, 10 e aspartato (D) 36, 37 indicadas. c. SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie de SpA, SpA-D, SpA-DKKAA ou SrtA purificadas em Sefarose Ni-NTA na presença ou ausência de imunoglobulina humana (hIgG). d. ELISA que examina a associação de SpA, SpA-D or SpA-DKKAA imobilizados com IgG humana, bem como seus fragmentos Fc ou F(ab)2 fator de von Willebrand (vWF). e, linfócitos CD19+ B em tecido esplênico de camundongos BALB/c que tinham sido imunizados simuladamente ou tratados com SpA-D ou SpA-DKKAA foram quantificados por FACS.

[000109] Figura 7. Vacina de Proteína A não toxicogênica previne a formação de abscessos. A histopatologia do tecido renal isolado durante a autópsia de camundongos BALB/c que tinham sido imunizados simuladamente (PBS) ou vacinados com SpA, SpA-D bem como SpA- DKKAA e desafiados com S. aureus Newman. Os tecidos secionados finos foram corados com hematoxilina-eosina. As setas vazadas identificam infiltrados de leucócitos polimorfonucleares (PMN). As setas preenchidas identificam comunidades de abscessos stafilocócicos.

[000110] Figura 8. Anticorpos criados pela vacina de Proteína A não toxigênica bloqueiam a função superantigênica de células B de SpA. a. Anticorpos do coelho criados contra SpA-DKKAA foram purificados em uma matriz com antígeno imobilizado e analisados por SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie. Os anticorpos foram clivados com pepsina e fragmentos F(ab)2 foram purificados por uma segunda rodada de cromatografia de afinidade na matriz de SpA-DKKAA. b. F(ab)2 específicos de SpA-DKKAA c F(ab)2 interferem com a ligação de SpA ou SpA-D à imunoglobulina humana (hIgG), ou, c. ao Fator de von Willebrand (vWF).

[000111] Figura 9. A proteína A não toxicogênica de comprimento inteiro gera melhoras respostas imunes. a. SpAKKAA de comprimento inteiro foi purificada em Ni-NTA Sefarose se analisada por SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie. b. linfócitos B CD19+ em tecido esplênico de camundongos de camundongos BALB/c que tinham sido imunizados simuladamente ou tratados com SpA ou SpAKKAA foram quantificados por FACS. c. ELISA que examina a associação de SpA ou SpAKKAA imobilizada com IgG humana bem como seuis fragmentos Fc ou F(ab)2 ou fator de von Willebrand (vWF). d. Titulações de anticorpo no soro humano ou do camundongo para toxoide de difteria (CRM197) e SpAKKAA ou SpA-DKKAA não toxicogênicas. Voluntários humanos com um histórico de imunização DTaP e infecção estafilocócica (n=16) bem como camundongos (n=20) que tinham sido infectados com S. aureus Newman ou USA 300 LAC ou imunizados com SpAKKAA ou SpA-DKKAA foram examinados por dot blot quantitativa.

[000112] Figura 10. A infecção estafilocócica naõ gera imunidade protetora. Camundongos BALB/c (n=20) foram infectados com S. aureus Newman ou desafiados simuladamente (PBS) por trinta dias e a infecção foi deparada com tratamento com cloranfenico. Ambas coortes de animais foram então desafiadas com S. aureus Newman e carga bacteriana (CFU) no homogeneizador do tecido renal foi analisado depois da autópsia no Dia 4.

[000113] Figura 11. Comparação da formação de abscessos em camundongos tratados com PBS, SpA, SpA-D, e SpA-DKKAA.

[000114] Figuras 12A-12C (A) ELISA que examina a associação de SpA, SpA-D, SpA-DKKAA ou SpA-DGGSS imobilizadas com IgG humana bem como seus fragmentos Fc ou F(ab)2 e IgM. A significância estatística da ligação de SpA-DKKAA e SpA-DGGSS a cada ligante foi comparada com a ligação de SpA-D; a ligação de SpA-D foi comparada com SpA (n=3); * significa P<0,05; ** significa P<0,01. (B) ELISA que examina o nível de anticorpos de reação cruzada de amostras de soros hiperimunes coletados de camundongos ativamente imunizados (n=5) com SpA-D, SpA-DKKAA e SpA-DGGSS. (C) Formação de abscessos em camundongos tratados com PBS, SpA-D, SpA-DKKAA e SpA-DGGSS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[000115] Staphylococcus aureus é uma comensal de pele e narinas humanas, e é a principal causa infecções da corrente sanguínea, pele e tecidos moles (Klevens et al., 2007). Os recentes aumentos dramáticos na mortalidade de doenças estafilocócias são atribuídos à disseminação de cepas resistentes à meticilina de S. aureus (MRSA) frquentemente não suscetíveis a antibióticos (Kennedy et al., 2008). Em um grande estudo retrospectivo, a incidência de infecções MRSA foi de 4,6% de de todas hospitalizações nos Estados Unidos (Klevens et al., 2007). Os custos anuais com o serviço de saúde para 94.300 indivíduos infectados com MRSA nos Estados Unidos excedeu US$2,4 bilhões (Klevens et al., 2007). A atual epidemia de MRSA precipitou uma crise dos serviços de saúde, que precisa ser enfrentada pelo desenvolvimento de uma vacina preventiva (Boucher e Corey, 2008). Até hoje, uma vacina licenciada pela FDA que previne doenças causadas por S. aureus não está disponível.

[000116] Os inventores descrevem aqui o uso de Proteína A, uma proteína da superfície ancorada na parede celular de estafilococos, para a geração de variantes que podem servir como vacinas subunitárias. A patogênese de indecções estafilocócicas é iniciada à medida que as bactérias invadem a pele ou corrente sanguínea por intermédio de traumatismos, feridas cirúrgicas, ou dispositivos médicos (Lowy, 1998). Embora o patógeno invasor possa sofer fagocitose e exterminado, os estafilicocos podem também escapar das defesas imunológicas e infecções latentes em tecidos de órgãos, induzindo respostas inflamatórias que atraem mcrófagos, neutrófilos, e outros fagócitos (Lowy, 1998). A invasão responsiva de células imunes para o local da infecção é acompanhada por necrose de liquefação à medida que o hospedeiro procura prevenir a disseminação estafilocócica e permitir a remoção de resíduos teciduais necróticos (Lam et al., 1963). Tais lesões podem ser observadas por microscopia, pois as áreas hipercelulares contêm tecido necrótico, leucócitos, e um ninho central de bactérias (Lam et al., 1963). A menos que os acessos estafilocócicos sejam cirurgicamente drenados e tratados com antibióticos, a infecção disseminada e septicemia produzem um resultado letal (Sheagren, 1984).

1. Antígenos estafilocócicos A. Proteína A Estafilocócica (SpA)

[000117] Todas as cepas de Staphylococcus aureus expressam o gene estrutural para Proteína A (SpA) (Jensen, 1958 ; Said-Salim et al., 2003), um fator de virulência bem caracterizado cujo produto da superfície ancorado na parede celular (SpA) engloba cinco domínios ligantes de imunoglobulina altamente homólogos designados E, D, A, B, e C (Sjodahl, 1977). Estes domínios apresentam ~ 80% de identidade no nível de aminoácidos, têm um comprimento de 56 a 61 resíduos, e são organizados como repetições tandem (Uhlen et al., 1984). SpA é sintetizada como uma proteína precursora com um peptídeo sinalizador YSIRK/GS no terminal N e um sinal de seleção com o modelo LPXTG no terminal C (DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992). A Proteína A ancorada na parede celular é apresentada em grande abundância sobre a superfície estafilocócica (DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972). Cada um dos seus domínios ligantes de imunoglobulina é constituiído de hélices α antiparalelas que se assemelham ao feixe de três hélices e se ligam ao domínio Fc de imunoglobulina G (IgG) (Deisenhofer, 1981; Deisenhofer et al., 1978), a cadeia pesada VH3 (Fab) de IgM (isto é, o receptor de células B) (Graille et al., 2000), o fator de von Willebrand e seu domínio A1 [vWF AI é um ligante para plaquetas] (O’Seaghdha et al., 2006) e o receptor I do fator de necrose tumoral α (TNF-α) (TNFRI) (Gomez et al., 2006), que é apresentado sobre superfícies de epitélios das vias aéreas (Gomez et al., 2004; Gomez et al., 2007).

[000118] SpA impede a fagocitose de neutrófilos de estafilococos através do seu atributo de se ligar ao componente Fc de IgG (Jensen, 1958; Uhlen et al., 1984). Além disso, SpA é capaz de ativar a coagulação intravascular por intermédio da sua ligação aos domínios do fator de Willebrand AI (Hartleib et al., 2000). As proteínas plasmáticas tais como fibrinogênio e fibronectina atuam como pontes entre estafilococos (CIfA e CIfB) e a integrina plaquetária GPIIb/IIIa (O’Brien et al., 2002), uma atividade que é suplementada através da associação de Proteína A com vWF AI, o que permite que os estafilococos capturem plaquetas por intermédio do receptor de plaquetas GPIb-α (Foster, 2005; O’Seaghdha et al., 2006). SpA também se liga a TNFRI e sua interação contribui para a patogênese de pneumonia estafilocócica (Gomez et al., 2004). SpA activa a sinalização pró-inflamatória através da ativação mediada por TNFR1 de TRAF2, a quinase p38/c-Jun, mitógenos ativam a proteína quinase (MAPK) e o fator de transcrição Rel, NF-KB. A ligação de SpA induz ainda o desprendimento de TNFR1, ujma atividade que parece necessitar da enzima conversora de TNF (TACE)(Gomez et al., 2007). Todas as atividades de SpA supramencionadas são mediadas através dos seus cinco domínios ligantes de IgG e podem ser perturbadas pelas mesmas substituições de aminoácidos, inicialmente definidas por sua necessidade de interação entre Proteína A e IgG1 humana (Cedergren et al., 1993.

[000119] SpA funciona também como um superantígeno de células B capturando a região Fab de VH3 portador de IgM, o receptor de células B (Gomez et al., 2007; Goodyear et al., 2003; Goodyear e Silverman, 2004; Roben et al., 1995). Depois do desafio intravenoso, as mutações estafilocócicas de Proteína A (SpA) apresentam uma redução na carga estafilocócica em tecidos de órgãos e diminuiu dramaticamente a capacidade de formar abscessos (aqui descritos). Durante a infecção com S. aureus do tipo selvagem, os abscessos são formados dentro de quarente e oito horas e são detectáveis por microscopia óptica de tecido renal seccionado fino corado com hematoxilina-eosina, inicialmente marcado por um influxo de leucócitos polimorfonucleares (PMNs). No quinto dia de infecção, os abscessos aumwntam de tamanho e ficam encerrados em uma população central de estafilococos, circundados por uma camada de material eosinofílico amorfo e uma grande fração de PMNs. A histopatologia revelou uma necrose incontável de PMNs na proximidade do ninho estafilocócico no centro de lesões de abscessos bem como um manto de fagócitos sadios. Os inventores observaram também um aro de PMNs necróticos na periferia das lesões de abscessos, delimitando a pseudocápsula eosinofílica que separou o tecido renal sadio da lesão infecciosa. As variantes estafilocócicas sem Proteína A são incapazes de estabelecer as características histopatológicas de abscessos e são depuradas durante a infecção.

[000120] Em estudos anteriores, Cedergren et al. (1993) manipularam conco substituições individuais no fragmento Fc que liga o subdomínio do domínio B de SpA, L17D, N28A, I31A e K35A. Aqueles autores criaram estas proteínas para testar os dados coletados a partir da estrutura tridimensional de um complexo entre um domínio de SpA e Fc1. Cedergren et al. determinaram os efeitos destas mutações sobre a estabilidade e ligação, mas não contemplaram o suo dessas substituções para a produção de um antígeno para vacina.

[000121] Brown et al. (1998) descrevem estudos para manipular novas proteínas proteínas baseadas em SpA que permitem o uso de coindições mais favoráveis de eluição quando usadas como ligantes de afinidade. As mutações estudadas incluíram mutações individuais de Q13A, Q14H, N15A, N15H, F17H, Y18F, L21H, N32H, ou K39H. Brown et al. relatam que substituições Q13A, N15A, N15H, e N32H fizeram pouca diferença para os valores da constante de dissociação e que a substituição Y18F resultou em um decréscimo de 2 vezes na afinidade de ligação em comparação com SpA do tipo selvagem. Brown et al. relatam também que as substituições L21H e F17H diminuem a afinilidade de ligação em cinco vezes e cem vezes, respectivamente. Aqueles autores estudaram também substituições análogas em dois domínios tandem. Assim sendo, os estudos de Brown et al. foram direcionados para gerar uma SpA com perfil de eluição mais favorável, e assim sendo, o uso de substituições His para produzir uma alteração sensível ao pH na afinidade de ligação. Brown et al. silencia sobre o uso de SpA como um antigen para vacina.

[000122] Graille et al. (2000) descrevem uma estrutura cristalina do domínio D de SpA e o fragmento Fab do anticorpo IgM humano. Graille et al. definem por análise de uma estrutura cristalina os resíduos de aminoácidos do domínio D que interagem com o fragmento Fab como os resíduos Q26, G29, F30, Q32, S33, D36, D37, Q40, N43, E47, ou L51, bem como os resíduos de aminoácidos que formam a interface entre os subdomínios do domínio D. Graille et al. definem as interações moleculares destas duas proteínas, mas silencia quanto a qualquer uso de substituções nos resíduos interagentes ao produzir um antígeno para vacina.

[000123] O’Seaghdha et al. (2006) descrevem estudos direcionados em elucidar qual subdomínio do domínio D se liga a vWF. Os autores geraram mutações individuais nos subdomínios ligantes de Fc ou VH3, isto é, resíduos de aminoácidos F5A, Q9A, Q10A, F13A, Y14A, L17A, N28A, I31A, K35A, G29A, F30A, S33A, D36A, D37A, Q40A, E47A, ou Q32A.. Os autores descobritam que vWF se liga ao mesmo subdomínio que liga Fc. O’Seaghda et al. definem o subdomínio do domínio D responsável pela ligação de vWF, mas silencia quanto a qualquer uso de substituições nos resíduos interagentes para produzir antígeno para vacina.

[000124] Gomez et al. (2006) descrevem a identificação de resíduos responsáveis pela ativação do TNFR1 usando mutações individuais de F5A, F13A, Y14A, L17A, N21A, I31A, Q32A, e K35A. Gomez et al. silenciam quanto a qualquer uso de substituições nos resíduos interagentes para produzir um antígeno para vacina.

[000125] A Proteína A recombinante marcada por afinidade, um polipeptídeo que engloba os cinco domínios de IgG (EDCAB) (Sjodahl, 1977), mas sem a Região X do terminal C (Guss et al., 1984), foi purificada a partir de E. coli recombinante e usada como um antígeno de vacina (Stranger-Jones et al., 2006). Por causa dos atributos de SpA em se ligar à parte Fc de IgG, uma resposta humoral específica à Proteína A não pôde ser medida (Stranger-Jones et al., 2006). Os inventores superaram este obstáculo através da geração de SpA- DQ9,10K;D36,37A. Camundongos BALB/c imunizados com Proteína A recombinante (SpA) apresetaram proteção significativa contra desafio intravenoso com as cepas de S. aureus: uma redução 2,951 log na carga estafilocócica em comparação com o tipo selvagem (P > 0,005; teste t de Student) (Stranger-Jones et al., 2006). Anticorpos específicos de SpA podem causar depuração fagocítica antes da formação de abscessos e/ou impactar a formação da barreira esosinofílica supramencionada em abscessos que separam as populações estafilocócicas de células imunes, pois eles não se formam durante infecção com cepas mutantes de Proteína. Cada um dos cinco domínios de SpA (isto é, domínios formados a partir de feixes de tripla hélice designados E, D, A, B, e C) exerce propriedades de ligação similares (Jansson et al., 1998). A solução e a estrutura cristalina do domínio D foi resolvida com e sem os ligantes Fc e VH3 (Fab), que ligam a Proteína A de uma maneira não competitiva em sítios distantes (Graille et al., 2000). As mutações em resíduos que reconhecimente estão envolvidas na ligação de IgG (FS, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 e K35) também são necessárias para a ligação de vWF AI e TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006; O’Seaghdha et al., 2006), enquanto que os resíduos importantes para a interação de VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) parecem não ter qualquer impacto sobre as outras atividades de ligação (Graille et al., 2000; Jansson et al., 1998). SpA assesta especificamente um subconjunto de células B que expressam a IgM relacionada à família VH3 sobre sua superfície, isto é, receptores de células B do tipo VH3 (Roben et al., 1995). Depois da interação com SpA, estas células B proliferam e cometem apoptose, levando à deleção preferencial e prolongada de linfócitos B semelhante a inatos (isto é, células B da zona marginal e células B2 foliculares) (Goodyear et al., 2003; Goodyear et al., 2004).

Base molecular da apresenção e da função superficial de Proteína A.

[000126] A Proteína A é sintetizada como um precursor no citoplasma bacteriano e secretada por intermédio do seu peptídeo sinalizador YSIRK na parede cruzada, isto o septo divisor de estafilococos (Figura 1) (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Depois da clivagem do sinal de seleção LPXTG do terminal C, a Proteína A é ancorada nas pontes cruzadas de peptidoglicanos bacterianos por sortase A (Mazmanian et al., 1999; Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 2000). A Proteína A é a proteína superficial mais abundante de estafilococos; a molécula é expressada por virtualmente todas as cepas de S. aureus (Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008; Said-Salim et al., 2003). Os estafilococos giram mais de 15-20% da sua parede celular por ciclo de divisão (Navarre e Schneewind, 1999). As hidrolases murinas clivam os filmentos de glicanos e peptídeos da parede de poliglicano, liberando desta forma a Proteína A com seu tetrapeptídeo dissacarídeo anexado da parede celular do terminal C para dentro do meio extracelular (Ton-That et al., 1999). Assim sendo, por desenho fisiológico, a Proteína A é ancorada na parede celular e apresentada sobre a superfície bacteriana, mas também liberada para dentro de tecidos circundantes duriante a infecção do hospedeiro (Marraffini et al., 2006).

[000127] A Proteína A captura imunoglobulinas sobre a superfície bacteriana e esta atividade bioquímica permite que os os estafilococos escapem de respostas imunes inatas e adquiridas do hospedeiro (Jensen, 1958; Goodyear et al., 2004). O interessante é que a regiãoI X da Proteína A (Guss et al., 1984), um domínio de repetição de amarra os domínios ligantes de IgG ao sinal de seleção LPXTG / âncora da parede celular, é talvez a parte mais variável do genoma estafilocócico (Said-Salim, 2003; Schneewind et al., 1992). Cada um dos cinco domínios ligantes de imunoglobulina da Proteína A (SpA), formados a partir de feixes de três hélices são designados E, D, A, B, and C, exerce propropriedades estruturais e funcionais similares (Sjodahl, 1977; Jansson et al., 1998). A solução e a estrutura cristalina do domínio D foi resolvida com e sem os ligantes de Fc e VH3 (Fab), que ligam a Proteína A de uma maneira não competitiva em sítios distintos (Graille 2000).

[000128] No complexo de estrutura cristalina, o Fab interage com a hélice II e hélice III do domínio D por intermédio de uma superfície constituída de quatro filamentos β da região VH (Graille 2000). O eixo principal da hélice II do domínio D está aproximadamente a 50° em relação à orientação dos filamentos, e a parte entre hélices do domínio D é mais está mais próxima do filamento C0. O sítio de interação em Fab é distante da cadeia leve de Ig e da região constante da cadeia pesada. A interação envolve os seguintes resíduos do domínio D: Asp- 36 da hélice II, Asp-37 e Gln-40 na alça entre a hélice II e a hélice III e vários outros resíduos (Graille 2000). Ambas superfícies interagentes são constituídas predominantemente de cadeias laterais polares, com três resíduos negativamente carregados no domínio D e dois resíduos positivamente carregados no Fab 2A2 escondidos pela interação, produzindo uma atração eletrostática global entre as duas moléculas. Das cinco interações polares identificadas entre Fab e o domínio D, três são entre cadeias laterais. Uma ponte de sal é formada entre Arg-H19 e Asp-36 e duas ligações hidrogênio são feitas entre Tyr-H59 e Asp-37 e entre Asn-H82a e Ser-33. Or causa da conservação de Asp-36 e Asp- 37 em todos os domínios ligantes de IgG da Proteína A, os inventores mutaram estes resíduos.

[000129] Os sítios SpA-D responsáveis pela ligação de Fab são estruturalmente separados da superfície do domínio que medeia a ligação de Fcy. A interação de FCY com o domínio D envolve principalmente os resíduos na hélice I com menor envolvimento da hélice II (Gouda et al., 1992; Deisenhofer, 1981). Com a exceção do Gln-32, um menor contato em ambos complexos, nenhum dos resíduos que mediam a interação de FCY ETA envolvido na ligação de Fab. Para examinar a relação espacial entre estes diferentes sítios de ligação de Ig, os domínios de SpA nestes complexos foram sobrepostos para construir um modelo de um complexo entre Fab, o domínio D de SpA, e a molécula de Fcy. Neste modelo ternário, Fab e Fcy formam um sanduíche ao redor da faces opostas da hélice II sem evidência de impedimento estérico de qualquer interação. Estas descobertas ilustram como, apesar do seu tamanho pequeno (usto é, 56-61 aa), um domínio de SpA pode apresentar simultaneamente ambas atividades, explicando a evidência experimental que as interações de Fab com um domínio individual são não competitivas. Os resíduos para as interações entre SpA-D e FCY são Gln-9 e Gln-10.

[000130] Em contraste, a ocupação da parte Fc de IgG no domínio D bloqueia sua interação com vWF A1 e provavelmente também TNFR1 (O’Seaghdha et al., 2006). As mutações em resíduos essenciais para a pigação de IgG Fc (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 e K35) são também necessárias para a ligação de vWF A1 e TNFR1 (O’Seaghdha et al., 2006; Cedergren et al., 1993; Gomez et al., 2006), enquanto que os resíduos críticos para a interação de VH3 interaction (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) não têm qualquer impacto sobre as atividades de ligação de IgG Fc, vWF A1 ou TNFR1 (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). A atividade de ligação de Fab de imunoglobulina da Proteína A assesta um subconjunto de células B que expressam IgM relacionada à família VH3 sobre sua superfície, isto é, estas moléculas funcionam como receptores de células B do tipo VH3 (Roben et al., 1995). Depois da interação com SpA, estas células B proliferam rapidamente e depos cometem apoptose, levando à deleção preferencial e prolongada de linfócitos B semelhantes a inatos (isto é, células B marginais e células B2 foliculares) (Goodyear e Silverman, 2004; Goodyear e Silverman, 2003). Mais do que 40% de células B circulantes são assestadas pela interação de Proteína A e a interação da família VH3 representa a maior família de receptores de células B humanas para conferir respostas imunes humorais protetoras contra patógenos (Goodyear e Silverman, 2004; Goodyear e Silverman, 2003). Assim sendo, a Proteína A funciona de forma análoga a superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), embora esta última classe de moléculas, por exemplo SEB, TSST-1, TSST-2, formem complexos com o receptor de células T para estimular inadequadamente respostas imunes do hospedeiro, e desta forma, precipitando aspectos característicos de doença de infecções estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Em conjunto estas descobertas documentam as contribuições da Proteína A em estabelecer infecções estafilocócicas eem modular respostas imunes do hospedeiro.

[000131] Em suma, os domínios da Proteína A podem ser consideradas como apresentando duas interfaces diferentes para ligação com moléculas do hospedeiro e qualquer desenvolvimento de vacinas baseadas em Proteína A devem considerar a geração de variantes que não perturbam a sinalização de células hospedeiras, agregação de plaquelas, sequestrode imunoglobulinas ou a indução da proliferação de células B e apoptose. Essas variantes de Proteína A devem ser úteis também para analisar vacinas quanto à capacidade de gerar anticorpos que bloqueiam as atividades supramencionadas de SpA e ocupam os cinco domínios de repetição nas suas interfaces duplas de ligação. Esta meta é articulada e perseguida nesta invenção pela primeira vez e os métodos são descritos detalhadamente para a geração de variantes da Proteína A que podem ser usadas como vacinas seguras para seres humanos. Para perturbar IgG Fcy, a ligação de vWF AI e TNFR1, glutamina (Q) 9 e 10 [numeração derivada a partir do domínio D de SpA como descrito em Uhlen et al., 1984] foram mutadas, e geradas substituições de lisina por ambas glutaminas com a expectativa que elas abolem os atributos do ligante na primeira interface de ligação. Para perturbar a ligação de IgM Fab VH3, aspartato (D) 36 e 37 foram mutados, cada um deles sendo necessários para a associação com o recepor de células B. D36 e D37 foram ambos substituídos por alanina. As mutações Q9,10K e D36,37A são neste caso combinadas na molécula recombinante SpA-DQ9,10K;D36,37A e testadas quanto aos atributos de ligação de Proteína A. Além disso, SpA-D e SpA-DQ9,10K;D36,37A são submetidas a estudos de imunização em camundongos e coelhos e analisadas quanto a [1] produção de anticorpos específicos (SpA-D Ab); [2] capacidade de SpA- D Ab para bloquear a associação da Proteína A e seus quatro ligantes diferentes; e [3] atributos de SpA-D Ab para gerar imunidade protetora contra infecções estafilocócicas (vide seção de exemplos abaixo).

B. Coagulases Estafilocócicas

[000132] Coagulases são enzimas produzidas por bactérias Staphylococcus que convertem fibrinogênio em fibrina. Coa e vWh ativam protrombina sem proteólise (Friedrich et al., 2003). O complexo coagulase^protrombina reconhece fibrinogênio como um substrato específico, convertendo-o diretamente em fibrina. A estrutura cristalina do complexo ativo revelou ligação dos domínios D1 e D2 à protrombina e inserção do seu terminal Ile1-Val2 N na bolsa de Ile16, induzindo um sítio ativo funcional no zimogênio através da mudança de conformação (Friedrich et al., 2003). Exosítio I de α-trombina, o sítio de reconhecimento de fibrinogênio, e o pró-exosítio I na protrombina são bloqueados pelo D2 de Coa (Friedrich et al., 2003). Contudo, a associação do complexo tetramérico (Coa^protrombina)2 liga fibrinogênio em um novo sítio com alta afinidade (Panizzi et al., 2006). Este modelo explica as propriedades coagulantes e a conversão eficiente de fibrinogênio por coagulase (Panizzi et al., 2006).

[000133] Fibrinogênio é uma glicoproteína grande (Mr ~340.000), formada por três pares de cadeias A a, B β, e Y ligadas de forma covalente para formar um “dímero de trímeros”, onde A e B designam os fibrinopeptídeos liberados pela clivagem de trombina (Panizzi et al., 2006). A molécula alongada dobra em três domínios separados, um fragmento central E que contém os terminais N de todas as seis cadeias e dois fragmentos D flanqueadores formados principalmente pelos terminais C das cadeias Bβ e y. Estes domínios globulares são conectados por três estruturas de tripla hélice longas. Os complexos coagulase-protrombina, que convertem brinogênio humano em fibrina em autopolimerização, não são assestados por inibidores de trombina circulante (Panizzi et al., 2006). Assim sendo, as coagulases estafilocócicas se desviam da via de coagulação sanguínea fisiológica.

[000134] Todas as cepas de S. aureus secretam coagulase e vWbp (Bjerketorp et al., 2004; Field and Smith, 1945). Embora um trabalho antigo tenha relatado contribuições importantes de coagulase para a patogênese de infecções estafilocócicas (Ekstedt e Yotis, 1960; Smith et al., 1947), investigações mais recentes com ferramentas de genética molecular desafiaram esta visão observando que não há quaisquer fenótipos de virulência com endocardite, abscesso cutâneo e modelos de mastite em camundongos (Moreillon et al., 1995; Phonimdaeng et al., 1990). Gerando variantes isogênicas de S. aureus Newman, um isolado clínico plenamente virulento (Duthie et al., 1952), descreve-se aqui que mutantes coa realmente apresentam defeitos de virulência em uma bacteremia letal e modelo de abscesso renal em camundongos. Na experiência dos inventores, S. aureus 8325-4 não é plenamente virulenta e presume-se que lesões mutacionais nesta cepa podem não ser capazes de revelar defeitos de viruência in vivo. Além disso, anticorpos gerados contra Coa ou vWbp perturbam a patogênese de infecções por S. aureus Newman até um grau que espelha o impacto de de deleções gênicas. Coa e vWbp contribuempara a formação de abscessos estafilocócicos e bacteremia letal, e podem também funcionar como antígenos protetores em vacinas subunitárias.

[000135] Estudos bioquímicos documentam o valor biológico de anticorpos contra Coa e vWbp. Se ligando ao antígeno e bloqueando sua associação com fatores coagulantes, os anticorpos previnem a formação de complexos Coa^protrombina e vWbp^protrombina. Estudos de transferência passiva revelaram proteção de cobaias contra a formação de ascessos estafilocócicos e desafio letal por anticorpos de Coa e vWbp. Assim sendo, anticorpos netralizadores de Coa e vWbp geram proteção imunológica contra doença estafilocócica.

[000136] Estudos antigos revelaram uma necessidade de coagulase para resistir fagocitose no sangue (Smith et al., 1947) e os inventores observaram um fenótipo similar para mutantes Δcoa no sangue de camundongos tratados com lepirudina (vide Exemplo 3 abaixo). Como vWbp apresenta afinidade mais alta pela protrombina humana do que equivalente do camundongo, suspeita-se que a mesma coisa possa ser verdadeira para variantes ΔvWbp no sangue humano. Além disso, a expressão de Coa e vWbp em lesões de abscessos, bem como sua distribuição atacante na pseudocápsula eosinofílica circundante (populações de abscessos estafilocócicos (SACs) ou a parede de fibrina periférica, sugerem que as coagulases secretadas contribuem para o estabelecimento destas lesões. Esta hipótese fiu testada e, na realidade, as mutantes Δcoa eram defeituosas no estabelecimento de abscessos. Um teste correspondente, bloqueando a função de Coa com anticorpos específicos, produziu o mesmo efeito. Consequentemente, propõe-se que a coagulação de fibrina é um evento crítico no estabelecimento de abscessos estafilocócicos que podem ser assestados para o desenvolvimento de vacinas protetoras. Devido à sua função de sobreposição sobre a protrombina humana, Coa e vWbp são consideradas excelentes candidatos para desenvolvimento de vacinas.

C. Outros Antígenos Estafilocócicos

[000137] As pesquisas durante as últlmas décadas identificaram exotoxinas de S. aureus, proteínas da superfície e moléculas reguladoras como fatores de virulência importantes (Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003). Muito progresso foi conseguido quanto à regulação desses genes. Por exemplo, os estafilococos realizam um censo bacteriano por intermédio da secreção de peptídeos autoindutores que se ligam a um receptor cognato na concentração limite, ativando desta forma reações de fosfotransferência e ativação da transcrição de muitos genes de exotoxinas (Novick, 2003). A patogênese de infecções estafilocócicas se baseia nesses fatores de virulência (exotoxinas secretadas, exopolissacarídeos, e adesinas de superfície). O desenvolvimento de vacinas estafilocócicas é atrapalhado pela natureza multifacetada de mecanismos de invasão estafilocócica. Está bem estabelecido que microorganismos vivos atenuados são vacinas altamente eficazes; as respostas imunes eliciadas por essas vacinas são frequentemente de maior magnitude e de duração mais longa do que aquelas produzidas por imunógenos não replicantes. Uma explicação para isto pode ser que as cepas vivas atenuadas estabelecem infecções limitadas no hospedeiro e mimetizam os estágios precoces da infecção natural. As modalidades da invenção são direcionadas para composições e métodos que incluem polipeptídeos e peptídeos variantes de SpA, bem como outras proteínas extracelulares imunogênicas, polipeptídeos, e peptídeos (incluindo secretados e proteínas ou peptídeos da superfície célular) de bactérias gram- positivas para o uso em mitigar ou imunizar contra infecção. Em modalidades específicas, a bactéria é uma bactéria estafilocócica. As proteínas, polipeptídeos, ou peptídeos extracelulares incluem, porém sem limitações, proteínas secretadas e da superfície celular da bactéria assestada.

[000138] O patógeno humano S. aureus secreta EsxA e EsxB, duas proteínas semelhantes a ESAT-6, através do envelope bacteriano (Burts et al., 2005, que é aqui incorporado como referência). esxA e esxB estafilocócicos são agrupados com outros seis genes na ordem de transcrição: esxA esaA essA esaB essB essC esaC esxB. Os acrônimos esa, ess, e esx representam respectivamente acessório, sistema e extracelular de secreção de ESAT-6, dependendo de se as proteínas codificadas desempenham um papel acessório (esa) ou direto (ess) para a secreção, ou são secretadas (esx) no meio extracelular. O agrupamento inteiro de oito genes é aqui referido como o agrupamento Ess. EsxA, esxB, essA, essB, e essC são todas necessárias para a síntese ou secreção de EsxA e EsxB. As mutantes que deixam de produzir EsxA, EsxB, e EssC apresentam defeitos na patogênese de abscessos murinos de S. aureus, sugerindo que este sistema de secreção especializado pode ser uma estratégia genérica da patogênese bacteriana humana. A secreção de não substratos de WXG100 pela via de ESX-1 foi relatada para vários antígenos, incluindo EspA, EspB, Rv3483c, e Rv3615c (Fortune et al., 2005; MacGurn et al., 2005; McLaughlin et al., 2007; Xu et al., 2007). A via alternativa de ESX- 5 também demonstrou secretar WXG100 e também não proteínas WXG100 em micobactérias patogênicas (Abdallah et al., 2007; Abdallah et al., 2006).

[000139] A via Ess de Staphylococcus aureus pode ser considerada como um módulo de secreção equipado com componentes de transporte especializados (Ess), fatores acessórios (Esa) e substratos de secreção cognatos (Esx). EssA, EssB e EssC são necessárias para a secreção de EsxA e EsxB. Devido ao fato de que há previsão que EssA, EssB e EssC são proteínas transmembrana, contempla-se que estas proteínas formam um mecanismo de secreção. Algumas das proteínas no agrupamento do gene ess podem transportar ativamente substratos secretados (atuando como motoras) enquanto que outras podem regular o transporte (reguladoras). A regulação pode ser conseguida, mas não precisa ser limitada a mecanismos de transcrição ou pós-tradução para polipeptídeos secretados, seleção de substratos específicos para locais definidos (por exemplo, meio extracelular ou células hospedeiras), ou timing de eventos de secreção durante a infecção. Neste ponto, é incerto se todas proteínas Esx secretadas funcionam como toxinas ou contribuem indiretamente para a patogênese.

[000140] Os estafilococos se baseiam na adesão mediada por proteínas da superfície a células hospedeiras ou invasão de tecidos como estratégia para escapar das defesas imunológicas. Além disso, S. aureus utiliza proteínas de superfície para sequestrar ferro do hospedeiro durante a infecção. A maioria das proteínas de superfície envolvidas na patogênese estafilocócica portam sinais de seleção do terminal C, isto é, elas são ligadas de forma covalente ao envelope da parede celular por sortase. Além disso, as cepas estafilocócicas sem os genes necessários para a ancoragem de proteínas superficiais, isto é, sortase A e B, apresentam um defeito dramático na virulência em vários modelos diferentes da doença em camundongos. Assim sendo, os antígenos de proteínas superficiais representam um alvo de vacina validada, pois os genes correspondentes são essenciais para o desenvolvimento de doença estafilocócica e podem ser explorados em várias modalidades da invenção. A superfamília de enzinas sortase são transpeptidades gram-positivas responsáveis por fatores de virulência de proteínas superficiais para ancoragem na camada da parede celular de peptidoglicanos. Duas isoformas de sortase foram identificadas em Staphylococcus aureus, SrtA e SrtB. Estas enzimas demonstraram reconhecer um modelo de LPXTG em proteínas do substrato. A isoforma SrtB parece ser importante na aquisição de ferro heme e homeostasia de ferro, enquanto que a isoforma SrtA desempenha um papel crítico na patogênese de bactérias gram-positivas modulando a capacidade de a bactéria aderir ao tecido do hospedeiro por intermédio de ancoragem covalente de adesinas e outras proteínas ao peptidoglicano da parade celular. Em certas modalidades, as variantes SpA aqui descritas podem ser usadas em combinação com outras proteínas estafilocócicas tais como as proteínas Coa, Eap, Ebh, Emp, EsaC, EsaB, EsxA, EsxB, Hla, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC, SasF, vWbp, e/ou vWh.

[000141] Certos aspectos da invenção incluem métodos e composições concernentes a composições proteináceas incluindo polipeptídeos, peptídeos, ou variantes SpA que codificam ácidos nucleicos e outros antígenos estafilocócicos tais como outras proteínas transportadas pela via Ess, ou substratos de sortases. Estas proteínas podem ser modificadas por deleção, inserção, e/ou substituição.

[000142] Os polipeptídeos Esx incluem a sequência de aminoácidos de proteínas Esx de bactérias no gênero Staphylococcus. A sequêmncia de Esx pode ser de uma espécie estafilococo específica, tal como Staphylococcus aureus, e pode ser de uma cepa específica, tal como Newman. Em certas modalidades, a sequência de EsxA sequence é SAV0282 da cepa Mu50 (que é a mesma sequência de aminoácidos para Newman) e pode ser acessada usando o Número de Acesso do Genbank Q99WU4 (gi|68565539), que é aqui incorporado como referência. Em outras modalidades, a sequência de EsxB é SAV0290 da cepa Mu50 (que é a mesma sequência de aminoácidos para Newman) e pode ser acessada usando o Número de Acesso do Genbank Q99WT7 (gi|68565532), que é aqui incorporado como referência. Em outras modalidades, outros polipeptídeos transportadas pela via Ess podem ser usados, cujas sequências podem ser identificadas pelos versados nessas técnicas usando bases de dados e recursos acessíveis na internet.

[000143] Os polipeptídeos do substrato sortase incluem, porém sem limitações, as sequências de aminoácidos das proteínas SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, ClfA, ClfB, IsdC ou SasF de bactérias no gênero Staphylococcus. A sequência dos polipeptídeos do substrato sortase pode ser de uma espécie específica de estafilococo, tal como Staphylococcus aureus, e pode ser de uma cepa específica, tal como Newman. Em certas modalidades, a sequência SdrD é da cepa N315 e pode ser acessada usando o Número de Acesso do Genbank NP_373773.1 (gi|15926240), que é aqui incorporado como referência. Em outras modalidades, a sequência SdrE é da cepa N315 e pode ser acessada usando o Número de Acesso do Genbank NP_373774.1 (gi|15926241), que é incorporado como referência. Em outras modalidades, a sequência de IsdA é SAV1130 da cepa Mu50 (que é mesma sequência de aminoácidos para Newman) e pode ser acessada usando o Número de Acesso do Genbank NP_371654.1 (gi|15924120), que é incorporado como referência. Em outras modalidades, a sequência de IsdB é SAV1129 da cepa Mu50 (que é a mesma sequência de aminoácidos para Newman) e pode ser acessada usando o Número de Acesso do Genbank NP_371653.1 (gi|15924119), que é incorporado como referência. Em outras modalidades, outros polipeptídeos transportados pela via de Ess ou processados por sortase podem ser usados, cujas sequências podem ser identificadas pelos versados nessas técnicas usando bases de dados e recursos acessíveis na internet.

[000144] Os exemplos das várias proteínas que podem ser usadas no contexto da presente invenção podem ser identificados por análise de submissões de bases de dados de genomas bacterianos, incluindo, porém sem limitações, os números de acesso NC_002951 (GI:57650036 e GenBank CP000046), NC_002758 (GI:57634611 e GenBank BA000017), NC_002745 (GI:29165615 e GenBank BA000018), NC_003923 (GI:21281729 and GenBank BA000033),NC_002952 (GI:49482253 e GenBank BX571856), NC_002953 (GI:49484912 and GenBank BX571857), NC_007793 (GI:87125858 e GenBank CP000255), NC_007795 (GI:87201381 e GenBank CP000253) sendo cada um deles inçorporado como referência.

[000145] Como aqui utilizado, o termo “proteína” ou “polipeptídeo” refere-se a uma molécula que compreende pelo menos dez resíduois de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma versão do tipo selvagem de uma proteína ou polipeptídeo é empregada; entretanto, em muitas modalidades da invenção, uma proteína ou polipeptídeo modificado é empregado para gerar uma resposta imune. Os termos descritos acima podem ser utilizados de forma intercambiável. Uma “proteína modificada” ou “polipeptídeo modificado” ou uma “variante” refere-se a uma proteína ou polipeptídeo cuja estrutura química, particularmente sua sequência de aminoácidos, é alterada em relação à proteína do tipo selvagem ou polipeptídeo. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo modificado/variante tem pelo menos uma atividade ou função modificada (reconhecendo que proteínas ou polipeptídeos podem ter múltiplas atividades ou funções). Contempla- se especificamente que uma proteína ou polipeptídeo modificado/variante pode ser alterado com relação a uma atividade ou função, mas ainda assim reter uma atividade ou função do tipo selvagem em outros aspectos, tal como imunogenicidade.

[000146] Em certas modalidades, o tamanho de uma proteína ou o polipeptídeo (do tipo selvagem ou modificado) pode compreender, porém sem limitações, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.750, 2.000, 2.250, 2.500 ou mais moléculas amina, e qualquer faixa entre estes valores, ou derivada de uma sequência de aminoácidos correspondente aqui descrita ou referenciada. Contempla- se que os polipeptídeos podem ser mutados por ser truncado, tornando- os mais curtos do que sua forma do tipo selvagem correspondente, mas eles poderiam ser também alterados fundindo ou conjugando uma sequência de proteína heteróloga com uma função específica (por exemplo, para assesto ou localização, para maior imunogenicidade, para propósitos de purificação, etc.).

[000147] Como aqui utilizado, o termo “molécula amina” refere-se a qualquer aminoácido, derivado de aminoácido, ou mimético de aminoácido conhecido nessas técnicas. Em certas modalidades, os resíduos da molécula proteinácea são sequenciais, sem qualquer molécula diferente de amina interrompendo a sequência de resíduos da molécula amina. Em outras modalidades, a sequência pode compreender um ou mais grupamentos de moléculas diferentes de amina. Em modalidades específicas,a sequência de resíduos da molécula proteinácea pode ser interrompida por um ou mais grupamentos de moléculas diferentes de amina.

[000148] Consequentemente, o termo “composição proteinácea” engloba sequências de moléculas amina que compreende pelo menos um dos 20 aminoácidos comuns em proteínas sintetizadas naturalmente, ou pelo um aminoácido modificado ou incomum.

[000149] As composições proteináceas podem ser preparadas por qualquer técnica conhecida pelos versados nessas técnicas, incluindo (i) a expressão de proteínas, polipeptídeos, or peptídeos através de técnicas usuais de biologia molecular, (ii) o isolamento de compostos proteináceosa partir de fontes naturais, ou (iii) a síntese química de materiais proteináceos. O nucleotídeo, bem como a proteína, polipeptídeo, e sequências de peptídeos para vários genes foram descritas anteriormente, e podem ser encontradas nas bases de dados computadorizados reconhecidas. Uma dessa base de dados é o National Center for Biotechnology Information's Genbank e bases de dados GenPept (na rede mundial em ncbi.nlm.nih.gov/). As regiões codificadoras para estes genes podem ser amplificadas e/ou expressadas usando as técnicas aquidescritas ou como é do conhecimento dos versados nessas técnicas.

[000150] Variantes da sequência de aminoácidos de SpA, coagulases e outros polipeptídeos da invenção podem ser variantes por substituição, inserção ou deleção. Uma variação em um polipeptídeo da invenção pode afetar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, ou mais aminoácidos não contíguos ou contíguos do polipeptídeo, em comparação com o tipo selvagem. Uma variante pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90%, incluindo todos valores entre eles, idêntica a qualquer sequência aqui fornecida ou referenciada, por exemplo, SEQ ID NO:2- 8 ou SEQ ID NO:11-30. Uma variante pode incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais aminoácidos substitutos. Um polipeptídeo processado ou secretado pela via de Ess ou outras proteínas superficiais (vide Tabela 1) ou substratos de sortase de qualquer espécie e cepa estafilocócica estão contempladas para uso em composições e métodos aqui descritos.

[000151] As variantes por deleção tipicamente carecem de um ou mais resíduos da proteína nativa ou do tipo selvagem. Os resíduos individuais podem ser deletados ou um número de aminoácidos contíguos pode ser deletado. Um códon de parada pode ser introduzido (por substituição ou inserção) em uma sequência de ácido nucleico codificadora para gerar uma proteína truncada. Os mutantes por inserção tipicamente envolvem a adição de material em um ponto não terminal no polipeptídeo. Isto pode incluir a inserção de um ou mais resíduos. As adições aos terminais, denominadas proteínas de fusão, também podem ser geradas. Estas proteínas de fusão incluem multímeros ou concatâmeros de um ou mais peptídeos ou polipeptídeos aqui descritos ou referenciados.

[000152] As variantes por substituição tipicamente contêm a troca de um aminoácido por outro em um ou mais sítios dentro da proteína, e podem ser desenhadas para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, com ou sem a perda de outras funções ou propriedades. As substituições podem ser conservativas, isto é, um aminoácido é substituído por um de formato e carga similar. As substituições conservativas são bem conhecidas nessas técnicas e incluem, por exemplo, as mudanças de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisine para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e valina para isoleucina ou leucina. Alternativamente, as substituições podem ser não conservativas de tal modo que uma função ou atividade do polipeptídeo seja afetada. As mudanças não conservativas tipicamente envolvem substituir um resíduo por um que é quimicamente dissimilar, tal como um aminoácido polar ou eletricamente carregado por um apolar ou aminoácido inalterado, e vice-versa.Tabela 2. Proteínas superficiais exemplificativas de cepas de S. aureus

[000153] As proteínas da invenção podem ser recombinantes, ou sintetizadas in vitro. Alternativamente, uma proteína não recombinante ou recombinante pode ser isolada a partir das bactérias. Contempla-se também que uma bactéria que contém uma variante pode ser implementada em composições e métodos da invenção. Consequentemente, uma proteína não precisa ser isolada.

[000154] O termo “códon funcionalmente equivalente” é aqui utilizado para se referir a códons que codificam o mesmo aminoácido, tais como os seis códons para arginina ou serina,e refere-se também a códons que codificam aminoácidos biologicamente equivalentes (vide Tabela 2 abaixo). Tabela 3 Tabela de Códons

[000155] Deve-se entender também que sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminácidos adicionais do terminal N ou C, ou sequências 5' ou 3', respectivamente, e ainda assim sejam essencialmente como enunciadas em uma das sequências aqui descritas, desde que a sequência atenda aos critérios enunciados acima, incluindo a manutenção da atividade biológica da proteína (por exemplo, imunogenicidade), onde a expressão da proteína for concernente. A adição de sequências terminais particularmente se aplica a sequências de ácidos nucléicos que podem, por exemplo, incluir várias sequências não codificadoras flanqueando as partes 5' ou 3' da região codificadora.

[000156] O texto que se segue é uma discussão baseada na mudança dos aminoácidos de uma proteína para criar um polipeptídeo or peptídeo variante. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína com ou sem perda acentuada de capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões ligantes de antígeno de anticorpos ou sítios de ligação em moléculas de substrato. Como é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que definem a atividade funcional da proteína, certas substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteína, e na sua sequência codificadora do DNA subjacente, e contudo produzem uma proteína com uma propriedade desejável. Contempla-se assim que várias mudanças podem ser feitas nas sequências de DNA de genes.

[000157] Contempla-se que em composições da invenção, há entre cerca de 0,001 mg e cerca de 10 mg do polipeptídeo, peptídeo, e/ou proteína total por ml. A concentração de proteína em uma composição pode ser de, pelo menos cerca de ou no máximo cerca de 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 mg/mL ou mais (ou qualquer faixa entre estes valores). Destes valores, cerca de, pelo menos cerca de, ou no máximo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% podem ser uma variante SpA ou uma coagulase, e pode ser usada em combinação com outros peptídeos ou polipeptídeos, tais como outros peptídeos e/ou antígenos bacterianos.

[000158] A presente invenção contempla a administração de polipeptídeos ou peptídeos SpA variantes para efetuar uma terapia preventive ou efeito terapêutico contra o desenvolvimento de uma doença ou condição associada a um patógeno estafilocócico.

[000159] Em certos aspectos, combinações de antígenos estafilocócicos são usados na produção de uma composição imunogênica que é eficaz para tratar ou prevenir infecção estafilocócica. As infecções estafilocócicas progridem através de vários estágios diferentes. Por exemplo, o ciclo de vida estafilocócico envolve colonização comensal, iniciação de infecção acessando tecidos adjacentes ou a corrente sanguínea, e/ou multiplicação anaeróbica no sangue. A interação entre determinantes da virulência de S. aureus e os mecanismos de defesa do hospedeiro pode induzir complicações tais como endocardite, formação de abscessos metastáticos, e síndrome séptica. Diferentes moléculas sobre a superfície da bactéria estão envolvidas em diferentes etapas do ciclo da infecção. Combinações de certos antígenos podem eliciar uma resposta imune que protege contra múltiplos estágios da infecção estafilocócica. A eficácia da resposta imune pode ser medida em ensaios de modelos animais e/ou usando um ensaio opsonofagocítico.

D. Polipeptídeos e Produção de Polipeptídeos

[000160] A presente invenção descreve polipeptídeos, peptídeos, e proteínas e seus fragmentos imunogênicos para uso em várias modalidades da presente invenção. Por exemplo, polipeptídeos específicos são testados ou usados para eliciar uma resposta imune. Em modalidades específicas, a totalidade ou parte das proteínas da invenção podem ser sintetizadas em solução ou sobre um suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos estão disponíveis no mercado e podem ser usados de acordo com protocolos conhecidos. Vide, por exemplo, Stewart e Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); e Barany e Merrifield (1979), sendo cada um deles aqui incorporado como referência.

[000161] Alternativamente, tecnologia de DNA recombinante pode ser empregada, onde uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo da invenção é inserida em um vetor de expressão, transformado ou transfectado para dentro de uma célula hospedeira apropriada e cultivado sob condições apropriadas para expressão.

[000162] Uma modalidade da invenção inclui o uso de transferência de gene para células, incluindo microorganismos, para a produção e/ou apresentação de polipeptídeos ou peptídeos. O gene para o polipeptídeo ou peptídeo de interesse pode ser transferido para dentro de células hospedeiras apropriadas, e em seguida, cultura de células sob as condições apropriadas. A geração de vetores de expressão recombinante, e os elementos lá incluídos, são bem conhecidos nessas técnicas e aqui brevemente discutidos. Alternativamente, a proteína a ser produzida pode ser uma proteína endógena normalmente sintetizada pela célula que é isolada e purificada.

[000163] Outra modalidade da presente invenção usa linhagens de células linfocitárias B autólogas, que são transfectadas com um vetor viral que expressa um produto imunogênico, e mais especificamente, uma proteína que tem atividade imunogênica. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos incluem, porém sem limitações, células Vero e HeLa, outras linhagens de células B e T, tais como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, bem como linhagens de células do ovário do hamster chinês, células W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN e MDCK. Além disso, pode ser escolhida uma cepa de célula hospedeira que modula a expresão das sequências inseridas, ou que modifica e processa o produto gênico da maneira desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteínas podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas. Linhagens de células apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhido para assegurar a modificação de processamento correto da proteína estranha expressada.

[000164] Inúmeros sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, porém sem limitações, genes de timidina quinase de HSV, hipoxantina- guanina fosforribosiltransferase, e and adenina fosforribosiltransferase, em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, resistência a antimetabólitos pode ser usada como a base de seleção: no caso de dhfr, que confere resistência a trimetoprim e metotrexato; gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico; neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G418; e hygro, que confere resistência à higromicina.

[000165] Células animais podem ser propagandas in vitro de dois modos: como células não dependentes de ancoragem que crescem em suspensão no volume inteiro da cultura ou como células dependentes de ancoragem que requerem anexação a um subastrato sólido para sua propagação (isto é, um tipo monocamada de crescimento de células).

[000166] As culturas em suspensão não dependentes de encoragem a partir de linhagens de células contínuas estabelecidas são os meios mais amplamente usados de produção em larga escala de células e produtos celulares. Entretanto, as células cultivadas em suspensão têm limitações, tais como potencial tumorogênico e produção mais baixa de proteína do que células aderentes.

[000167] Quando uma proteína é aqui especificamente mencionada, ela é, de preferência, uma referência a uma proteína nativa ou recombinante ou opcionalmente uma proteína na qual qualquer sequência sinalizadora foi removida. A proteína pode ser isolada diretamente a partir da cepa estafilocócica ou produzida por técnicas de DNA recombinante. Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composição imunogênica da invenção. Eles são fragmentos que compreendem pelo menos 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, ou 100 aminoácidos, incluindo todos valores e faixas entre eles, tomados de forma contígua a partir da sequência de aminoácidos da proteína. Além disso, tais fragmentos imunogênicos são imunologicamente reativos com anticorpos gerados contra proteínas estafilocócicas ou com anticorpos gerados por infecção de um hospedeiro mamífero com estafilicocos. Os fragmentos imunogênicos incluem também fragmentos que, quando administrados em uma dose eficaz (seja isoladamente ou como um hapteno ligado a um carreador), eliciam uma resposta imune protetora ou terapêutica contra infecção estafilocócica, em certos aspectos ela é protetora contra infecção por S. aureus e/ou S. epidermidis. Tal fragmento imunogênico pode incluir, por exemplo, a proteína carecedora de uma sequência líder do terminal N, e/ou um domínio transmembrana e/ou um domínio âncora do terminal C. Em um aspecto preferido, o fragmento imunogênico de acordo com the invenção compreende substancialmente a totalidade do domínio extracelular de uma proteína que tem pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 97-99% de identidade,incluindo todos valores e faixas entre estes valores, com um segmento selecionado da sequência de um polipeptídeo aqui descrito ou referenciado.

[000168] Estão incluídas também em composições imunogênicas da invenção proteínas de fusão constituídas de uma ou mais proteínas estafilocócicas, ou fragmentos imunogênicos de proteínas estafilocócicas. Tais proteínas de fusão podem ser preparadas de forma recombinante e podem compreender uma parte de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 sproteínas ou segmentos estafilocócicos. Alternativamente, uma proteína de fusão pode compreender múltiplas partes de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 proteínas estafilocócicas. Elas podem combinar diferentes proteínas estafilocócicas e/ou múltiplos da mesma proteína ou fragmento de proteína, ou fragmentos imunogênicos na mesma proteína (formando um multímero ou um concatâmero). Alternativamente, a invenção inclui também proteínas de fusão individuais de proteínas estafilocócicas ou seus fragmentos imunogênicos, como uma proteína de fusão com sequências heterólogas tais como um fornecedor de epítios de células T ou marcadores de purificação, por exemplo: β-galactosidase, glutationa-S- transferase, proteínas fluorescentes verdes (GFP), marcadores epítopos tais como FLAG, myc tag, poli-histidina, ou proteínas superficiais virais tais como hemaglutinina do vírus influenza, ou proteínas bacterianas tais como toxoide do tétano, toxoide de difteria, ou CRM197.

II. ÁCIDOS NUCLEICOS

[000169] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos recombinantes que codificam as proteínas, polipeptídeos, peptídeos da invenção. As sequências de ácidos nucleicos para SpA, coagulases e outras proteínas bacterianas estão incluídas, sendo que todas elas são incorporadas como referência, e podem ser usadas para preparar peptídeos ou polipeptídeos.

[000170] Como utilizado neste pedido de patente, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é recombinante ou então foi isolada isenta de ácido nucleico genômico total. Estão incluídos no termo “polinucleotídeo” os oligonucleotídeos (ácidos nucleicos com 100 resíduos ou menos de comprimento), vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, e similares. Os polinucleotídeos incluem, em certos aspectos, sequências reguladoras, isoladas substancialmente longe dos seus genes de ocorrência natural ou sequências codificadoras de proteínas. Os polinucleotídeos podem ser de filamento único (codificador ou antisense) ou de filamento duplo, e podem ser RNA, DNA (genômico, cDNA ou sintético), seus análogos, ou uma combinação deles. Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, porém não necessariamente, estar presentes em um polinucleotídeo.

[000171] A este respeito, o termo “gene,” “polinucleotídeo,” or “ácido nucleico” é utilizado para se referir a um ácido nucleico que codifica uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo (incluindo quaisquer sequências necessárias para transcrição, modificação pós-tradução, ou localização apropriada). Como deve ser entendido pelos versados nessas técnicas, este termo engloba sequências genômicas, cassetes de expressão, sequências de cDNA, e segmentos de ácidos nucleicos menores manipulados que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipeptídeos, domínios, peptídeos, proteínas de fusão, e mutantes. Um ácido nucleico que codifica a totalidade ou parte de um polipeptídeo pode conter uma sequência de ácidos nucleicos contíguos de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1.000, 1.010, 1.020, 1.030, 1.040, 1.050, 1.060, 1.070, 1.080, 1.090, 1.095, 1.100, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 9.000, 10.000, ou mais nucleotídeos, nucleosídeos, ou pares de bases, incluindo todos valores e faixas entre estes valores, de um polinucleotídeo que codifica uma ou mais sequências de aminoácidos aqui descritas ou referenciadas. Contempla-se também que um polipeptídeo específico pode ser codificado por ácidos nucleicos que contêm variações que têm sequências de ácidos nucleicos ligeiramente diferentes, mas contudo codificam a proteína igual ou substancialmente similar (vide Tabela 3 acima).

[000172] Em modalidades específicas, a invenção refere-se a segmentos de ácidos nucleicos isolados e vetores recombinantes que incorporam sequências de ácidos nucleicos que codificam uma variant SpA ou coagulase. O term “recombinante” pode ser utilizado em conjunto com um polinucleotídeo ou polipeptídeo e refere-se genericamente a um polipeptídeo ou polinucleotídeo produzido e/ou manipulado in vitro ou é um produto de replicação dessa molécula.

[000173] Em outras modalidades, a invenção refere-se a segmentos de ácidos nucleicos isolados e vetores recombinantes que incorporam sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo ou peptídeo de variant SpA ou coagulase para gerar uma resposta imune em um indivíduo. Em várias modalidades, os ácidos nucleicos da invenção podem ser usados em vacinas genéticas.

[000174] Os segmentos de ácidos nucleicos usados na presente invenção podem ser combinados com outras sequências de ácidos nucleicos, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzimas de restrição adicionais, múltiplos sítios de clonagem, outros segmentos codificadores, e similares, de tal modo que seu comprimento global possa variar consideravelmente. Contempla-se, portanto, que um fragmento de ácido nucleico com quase qualquer comprimento possa ser empregado, sendo o comprimento total, de preferência, limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo intencionado de ácido nucleico recombinante. Em alguns casos, uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de polipeptídeo com sequências codificadoras heterólogas adicionais, por exemplo, para permitir a purificação, transporte, secreção modificação pós-tradução, ou benfício terapêutico do polipeptídeo, tal como assesto ou eficácia. Como discutido acima, um marcador ou outro polipeptídeo heterólogo pode ser adicionado à sequência codificadora do polipeptídeo modificado, onde “heterólogo” refere-se a um polipeptídeo que não é o mesmo que o polipeptídeo modificado.

[000175] Em certas outras modalidades, a invenção refere-se a segmentos de ácidos nucleicos isolados e vetores recombinantes que incluem na sua sequência uma sequência de ácido nucleico contíguo de SEQ ID NO:1 (domínio D de SpA) ou SEQ ID NO:3 (SpA) ou quaisquer outras sequências de ácidos nucleicos que codificam coagulases ou outros fatores de virulência secretados e/ou proteínas superficiais incluindo proteínas transportadas pela via Ess, processadas por sortase, ou proteínas aqui incorporadas como referência.

[000176] Em certas modalidades, a presente invenção fornece variantes de polinucleotídeos que têm substancial identidade às sequências aqui descritas; aquelas que compreendem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% ou identidade de sequências mais alta, incluindo todos valores e faixas entre eles, em comparação com uma sequência de polinucleotídeo desta invenção, ussando os métodos aqui descritos (por exemplo, análise BLAST usando parâmetros padrão). A invenção contempla também o uso de polinucleotídeos que são complementares a todos os polinucleotídeos descritos acima.

A. Vetores

[000177] Os polipeptídeos da invenção podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico compreendida em um vetor. O termo “vetor” é utilizedo para se referir a uma molécula de ácido nucleico carreadora dentro da qual uma sequência de nucleico heteróloga pode ser inserida para introdução em uma célula, onde ela pode ser replicada e expressada. Uma sequência de ácido nucleico pode ser “heteróloga”, o que significa que ela está em um contexto estranho à célula na qual o vetor está sendo introduzido ou ao ácido nucleico no qual é incorporada, que inclui uma sequência homóloga a uma sequência na célula ou ácido nucleico, mas em uma posição dentro da célula hospedeira ou ácido nucleico onde não é normalmente encontrada. Os vetores incluem DNAs, RNAs, plasmídeos, cosmídeos, virus (bacteriófagos, vírus animais, e vírus vegetais), e cromossomas artificiais (por exemplo, YACs). Os versados nessas técnicas devem estar bem informados para construir um vetor através de técnicas recombinantes usuais (por exemplo Sambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996, ambos aqui incorporados como referência). Além de codificar um polipeptídeo SpA variante, o vetor pode codificar outras sequências de polipeptídeos tais como uma ou mais outros peptídeos bacterianos, um marcador, ou um peptídeo intensificador da imunogenicidade. Os vetores úteis que codifycam tais proteínas de fusão incluem vetores pIN (Inouye et al., 1985), vetores que codificam um prologamento de histidinas, e vetores pGEX, para uso em gerar proteínas de fusão solúveis glutationa S- transferase (GST) para purificação purificação e separação ou clivagem posterior.

[000178] O termo “vetor de expressão” refere-se a um vetor que contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos parte de um produto gênico capaz de ser transcrito. Em alguns casos, as moléculas de RNA são então traduzidas em uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo. Vetores de expressão podem conter uma série de “sequências de controle” que se referem a sequências de ácidos nucleicos necessárias para a transcrição e possivelmente tradução de uma sequência codificadora ligada operacionalmente em um organismo hospedeiro específico. Além de sequências de controle que dirigem a transcrição e a tradução, vetores e vetores de expressão podem conter sequências de ácidos nucleicos que servem também para outras funções e são aqui descritas.

1. Promotores e Intensificadores

[000179] Um “promotor” é uma sequência de controle. O promotor é tipicamente uma região de uma sequência de ácido nucleico na qual a iniciação e a velocidade da transcrição são controladas. Ele pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, tal como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. As termos “posicionado operacionalmente”, “ligado operacionalmente”, “sob controle” e “sob controle transcricional” significam que um promotor está em uma localização e/ou orientação funcional correta em relação a uma sequência de ácido nucleico para controlar a iniciação e expressão transcricional daquela sequência. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um “intensificador” que se refere a uma sequência reguladora atuante em “cis” envolvida na ativação transcricional de uma sequência de ácidos nucleicos.

[000180] Naturalmente, pode ser importante empregar um promotor e/ou intensificador que direciona eficazmente a expressão do segmento de DNA no tipo de célula ou organismo escolhido para expressão. Os versados nas técnicas de biologia molecular conhecem os promotores, intensificadores, e combinações de tipos de células para a expressão de proteínas (vide Sambrook et al., 2001, aqui incorporado como referência). Os promotores empregados podem ser constitutivos, específicos do tecido, ou induzível e em certas modalidades podem dirigir a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido sob condições especificadas, tais como a proução em larga escala de proteínas ou peptídeos recombinantes.

[000181] Vários elementos/promotores podem ser empregados no contexto da presente invenção para regular a expressão de um gene. Os exemplos desses elementos induzíveis, que são regiões de uma sequência de ácido nucleico que pode ser ativada em resposta a um estímulo específico, incluem, porém sem limitações, Cadeia Pesada de Imunoglobulina (Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990), Cadeia Leve de Imunoglobulina (Queen et al., 1983; Picard et al., 1984), Receptor de Células T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990), HLA DQ α e/ou DQ β □ QSullivan et al., 1987), Interferon β (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988), Interleucina-2 (Greene et al., 1989), Receptor de Interleucina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990), MHC Class II 5 (Koch et al., 1989), MHC Class II HLA- DRα (απSherman et al., 1989), β-Actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989), Creatina Quinase Muscular (MCK) (Jaynes et al., 1988;Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989), Pré-albumina (Transtiretina) (Costa et al., 1988), Elastase I (Ornitz et al., 1987), Metalotioneína (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989), Colagenase (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987), Albumina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990), α-Fetoproteina (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989), y- Globina (Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990), β-Globina (Trudel et al., 1987), c-fos (Cohen et al., 1987), c-Ha-Ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985), Insulina (Edlund et al., 1985), Molécula de Adesão de Células Neurais (NCAM) (Hirsh et al., 1990), α1- Antitripaína (Latimer et al., 1990), H2B (TH2B) Histona (Hwang et al., 1990), Colágeno do Camundongo e/ou Tipo I (Ripe et al., 1989),Proteínas Reguladas por Glicose (GRP94 e GRP78) (Chang et al., 1989), Hormônio de Crescimento do Rato (Larsen et al., 1986), Amiloide do Soro Humano A (SAA) (Edbrooke et al., 1989), Troponina I (TN I) (Yutzey et al., 1989), Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) (Pech et al., 1989), Distrofia Muscular de Duchenne (Klamut et al., 1990), SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988), Polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988), Retrovírus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989), Vírus do Papiloma (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos e Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987), Vírus da Hepatite B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988), Vírus da Imunodeficiência Humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988;Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989), Citomegalovírus (CMV) IE (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986), Gibbon Vírus da Leucemia Simiana (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).

[000182] Os elementos induzíveis incluem, porém sem limitações, MT II - Éster de Forbol (TFA)/Metais pesados (Palmiter et al., 1982;Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (vírus de tumor mamário do camundongo) - Glicocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); Interferon- β - poli(rI)x/poli(rc) (Tavernier et al., 1983); Adenovírus 5 E2 - ElA (Imperiale et al., 1984); Colagenase - Éster de Forbol (TPA) (Angel et al., 1987a); Estromelisina - Éster de Forbol Ester (TPA) (Angel et al., 1987b); SV40 - Éster de Forbol Ester (TPA) (Angel et al., 1987b); Gene MX Murino - Interferon, Vírus da Doença de Newcastle (Hug et al., 1988); GRP78 Gene - A23187 (Resendez et al., 1988); α-2- Macroglobulina - IL-6 (Kunz et al., 1989); Vimentina - Soro (Rittling et al., 1989); Gene MHC Classe I H-2i<b - Interferon (Blanar et al., 1989); HSP70 - ElA/SV40 Antígeno T Grande (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); Proliferina - Éster de Forbol/TPA (Mordacq et al., 1989); Fator de Necrose T umoral - PMA (Hensel et al., 1989); e Gene α do Hormônio Estimulante da Tireoide - Hormônio Tireóideo (Chatterjee et al., 1989).

[000183] Não se acredita que o promotor específico empregado para controlar a expressão do peptídeo ou proteína que codifica um polinucleotídeo da invenção seja crítico, desde que ele seja capaz de expressar o polinucleotídeo em uma célula assestada, de preferência, uma célula bacteriana. Quando uma célula humana é assestada, é preferível posicionar a região codificadora do polinucleotídeo adjacente e sob o controle de um promotor que é capaz de ser expressado em uma célula humana. Dito genericamente, esse promotor poderia incluir um promotor bacteriano, humano ou viral.

[000184] Em modalidades nas quais um vetor é administrado a um indivíduo para expressão da proteína, contempla-se que um promotor desejável para uso com o vetor seja um qu não é regulado de forma descendente por citocinas ou um que é forte o suficiente mesmo se for regulado de forma descendente, ele produz uma quantidade eficaz de uma variante SpA para eliciar uma resposta imune. Os exemplos não limitativos deles são CMV IE e RSV LTR. Promotores específicos de tecidos podem ser usados, particularmente se a expressão é em células nas quais a expressão de um antígeno é desejável, tais como células dendríticas ou macrófagos. Os promotores MHC I e MHC II de mamíferos são exemplos desses promotores específicos de tecido.

2. Sinais de Iniciação de Sítios Internos de Ligação de Ribossomos (IRES)

[000185] Um sinal de iniciação específico também pode ser necessário para tradução eficiente de sequências codificadoras. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Os sinais de controle exógenos da tradução, incluindo o códon de iniciação ATG, pode precisar ser fornecido. Os versados nessas técnicas devem ser capazes de determinar isto facilmente e providenciar os sinais necessários.

[000186] Em certas modalidades da invenção, o uso elementos sítios internos de ligação de ribossomos (IRES) é para criar mensagens multigênicas ou policistrônicas. Os elementos IRES são capazes de desviar o modelo de varredura de robossomos de Tradução dependente de Cap 5’π metilado e começam a tradução em sítios internos (Pelletier e Sonenberg, 1988; Macejak e Sarnow, 1991). Os elementos IRES podem ser ligados a quadros de leitura aberta heterólogos. Múltiplos quadros de leitura aberta podem ser transcritos juntos, cada um separado por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressados usando um único promotor/intensificador para transcrever uma ínica mensagem (vide patentes nos US 5.925.565 e 5.935.819, aqui incorporadas como referência).

3. Marcadores Selecionáveis e Triáveis

[000187] Em certas modalidades da invenção, as células que contêm uma construção de ácido nucleico da presente invenção podem ser identificadas in vitro ou in vivo codificando um marcador triável ou selecionável no vetor de expressão. Quando transcrito e traduzido, um marcador confere uma mudança identificável à célula permitindo fácil identificação de células que contêm o vetor de expressão. Genericamente, um marcador selecionável é um que confere uma propriedade que permite a seleção. Um marcador selecionável positivo é um no qual a presença do marcador permite sua seleção, enquanto que um marcador selecionável negativo é um no qual a presença impede sua seleção. Um exemplo de um marcador selecionável positivo é um marcador de resistência a fármacos.

B. Células Hospedeiras

[000188] Como aqui utilizados, os termes “célula”, “linhagem de célula” e “cultura de células” podem ser utilizados de forma intercambiável. Todos estes termos incluem também sua progênie, que é qualquer uma e todas gerações subsequentes. Deve-se entender que toda progênie pode não ser idêntica devido a mutações deliberadas ou inadvertida. No contexto de expressar uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, “célula hospedeira” refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica, e inclui qualquer organismo transformável que é capaz de replicar um vetor ou expressar um gene heterólogo codificado por um vetor. Uma célula hospedeira pode e tem sido usada como um receptor para vetores ou vírus. Uma célula hospedeira pode ser “transfectada” ou “transformada”, o que se refere a um processo pelo qual um ácido nucleico exógeno, tal como uma sequência codificadora de proteína recombinante, é transferida ou introduzida na célula hospedeira. Uma célula transformada inclui a célula primária em questão e sua progênie.

[000189] As células hospedeiras podem ser derivadas a partir de procariotos e eucariotos, incluindo bactérias, células de levedura, células de insetos, e células de mamíferos para replicação do vetor ou expressão de parte ou totalidade da(s) sequências(s) de ácido(s) nucleicos(s). Inúmeras linhagens e culturas de células estão disponíveis para uso como uma célula hospedeira, e elas podem ser obtidas na American Tipo Culture Collection (ATCC), que é uma organização que serve como um arquivo para culturas vivas e materiais genéticos (www.atcc.org).

C. Sistemas de Expressão

[000190] Existem inúmeros sistemas de expressão que compreendem pelo menos uma parte ou a totalidade das composições discutidas acima. Sistemas baseados em procariotos e/ou eucariotos podem ser empregados para uso com a presente invenção para produzir sequências de ácidos nucleicos, ou seus polipeptídeos, proteínas e peptídeos cognatos. Muitos desses sistemas estão comercialmente a aplamente disponíveis.

[000191] O sistema de células de insetos/baculovírus pode produzir um alto nível de expressão de proteína de um segmento de ácido nucleico heterológo, tal como descrito nas patentes nos US 5.871.986 e 4.879.236, ambas aqui incorporadas como referência, e que pode ser adquido, por exemplo, sob o nome MAXBAC® 2.0 da INVITROGEN® e BACPACK™ BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM da CLONTECH®.

[000192] Além dos sistemas de expressão descritos da invenção, outros exemplos de sistemas de expressão incluem STRATAGENE®’s COMPLETE CONTROL® Inducible Mammalian Expression System, que envolve um receptor induzível sintético ecdisona, ou seu Sistema de Expressão pET, um sistema de expressão em E. coli. Outro exemplo de um sistema de expressão induzível está disponível na INVITROGEN®, que transporta o Sistema T-REX™ (expressão regulada por tetraciclina), um sistema de expressão induzível em mamíferos, que usa o promotor de CMV de comprimento inteiro. INVITROGEN® fornece também um sistema de expressão em levedura, denominado Sistema de Expressão em Pichia methanolica, que é desenhado para produção de altos níveis de proteínas recombinantes na levedura metilotrófica Pichia methanolica. Os versados nessas técnicas devem saber como expressar um vetor, tal como uma construção de expressão, para produzir uma sequência de ácido nucleico ou seu polipeptídeo, proteína, or peptídeo cognato.

III. POLISSACARÍDEOS

[000193] As composições imunogênicas da invenção podem compreender ainda polissacarídeos capsulares incluindo um ou mais PIA (conhecido também como PNAG) e/ou polissacarídeo capsular do Tipo V e/ou Tipo VIII de S. aureus e/ou polissacarídeo capsular do Tipo I e/ou Tipo II e/ou Tipo III de S. epidermidis.

A. PIA (PNAG)

[000194] Está claro agora que várias formas de polissacarídeos superficiais estafilocócicos identificados como PS/A, PIA e SAA são a mesma entidade química - PNAG (Maira-Litran et al., 2004). Portanto, o termo PIA ou PNAG englobam todos estes polissacarídeos ou oligossacarídeos derivados a partir deles.

[000195] PIA é um polissacarídeo intercelular adesina e é constituído de um polímero de glicosamina ligada em β-(1^6) substituída com constituintes N-acetila e O-succinila. Este polissacarídeo está presente em S. aureus e também em S. epidermidis e pode ser isolado a partir de qualquer fonte (Joyce et al., 2003; Maira-Litran et al., 2002). Por exemplo, PNAG pode ser isolado a partir de S. aureus cepa MN8m (documento no WO 04/43407). PIA isolado a partir de S. epidermidis é um constituinte integral de biofilme. Ele é responsável por mediar a adesão célula/célula e provavelmente também funções para blindar a colônia em crescimento a partir da resposta imune do hospedeiro. O polissacarídeo conhecido anteriormente como poli-N-succinil-β-(1^6)- glicosamina (PNSG) demonstrou recentemente não ter a estrutura esperada, pois a identificação da N- succinilação foi incorreta (Maira- Litran et al., 2002). Portanto, o polissacarídeo formalmente conhecido como PNSG e agora reconhecido como PNAG também está englobado pelo termo PIA.

[000196] PIA (ou PNAG) pode ter diferentes tamanhos variando de mais do que 400 kDa para entre 75 e 400 kDa até entre 10 e 75 kDa para oligossacarídeos constituídos de até 30 unidades de repetição (de glicosamina ligada β-(1^6) substituída com constituintes N-acetila e O- succinila). Qualquer tamanho do polissacarídeo ou oligossacarídeo PIA pode ser usado em uma composição imunogênica da invenção; em um aspecto, o polissacarídeo tem mais de 40 kDa. O dimensionamento pode ser conseguido por qualquer método conhecido nessas técnicas, por exemplo, por microfluidização, irradiação ultrassônica ou por clivagem química (documentos nos WO 03/53462, EP497524,EP497525). Em certos aspectos, PIA (PNAG) tem pelo menos ou no máximo 40-400 kDa, 40-300 kDa, 50-350 kDa, 60-300 kDa, 50-250 kDa e 60-200 kDa.

[000197] PIA (PNAG) pode ter diferentes graus de acetilação devido à substituição nos grupos amina por acetato. PIA produzido in vitro é quase que completamente substituído nos grupos amina (95- 100%). Alternativamente, um PIA (PNAG) desacetilado pode ser usado tendo menos do que 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% de acetilação. O uso de um PIA (PNAG) desacetilado é preferido, pois os epítopos não acetilados de PNAG são eficientes em mediar a exterminação opsônica de bactérias gram-positivas, de preferência S. aureus e/ou S. epidermidis. Em certos aspectos, o PIA (PNAG) tem um tamanho entre 40 kDa e 300 kDa e é desacetilado, de tal modo que menos do que 60%, 50%, 40%, 30% ou 20% de grupos amina sejam acetilados.

[000198] O termo PNAG desacetilado (dPNAG) refere-se a um polissacarídeo ou oligossacarídeo PNAG no qual menos do que 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% dos grupos amina são acetilados. Em certos aspectos, PNAG é desacetilado para formar dPNAG tratando quimicamente o polissacarídeo nativo. Por exemplo, o PNAG nativo é tratado com uma solução básica de tal modo que o pH sub para acima de 10. Por exemplo, o PNAG é tratado com NaOH, KOH ou NH4OH 0,15 M, 0,2-4 M, 0,3-3 M, 0,5-2 M, 0,75-1,5 M ou 1 M. O tratamento é por pelo menos 10 a 30 minutos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20 horas em uma temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 ou 30-50 ou 35-45°C. dPNAG pode ser preparado como descrito no documento no WO 04/43405.

[000199] O(s) polissacarídeo(s) pode(m) ser conjugado(s) ou não conjugado(s) com uma proteína carreadora.

B. Polissacarídeos Tipo 5 e Tipo 8 de S. aureus

[000200] A maioria das cepas de S. aureus que causam infecção no homem contêm polissacarídeos do Tipo 5 ou Tipo 8. Aproximadamente 60% das cepas humanas são Tipo 8 e aproximadamente 30% são Tipo 5. As estruturas Os antígenos polissacarídeos capsulares Tipo 5 e Tipo 8 são descritos em Moreau et al., (1990) e Fournier et al., (1984). Ambos têm FucNAcp em sua unidade de repetição bem como ManNAcA que pode ser usado para introduzir um grupo sulfidrila. As estruturas são: Tipo 5 >4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1>4)-α-L-FucNAc(1>3)-β-D-FucNAc-(1> Tipo 8 >3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1>3)-α-L-FucNAc(1>3)-β-D-FucNAc-(1> Recentemente (Jones, 2005) a espectroscopia de RMN revisou as estruturas para: Tipo 5 >4)-β-D-ManNAcA-(1>4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1>3)-β-D-FucNAc- (1^ Tipo 8 >3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1>3)-α-L-FucNAc(1>3)-α-D-FucNAc(1>

[000201] Os polissacarídeos podem ser extraídos a partir da cepa apropriada de S. aureus usando um método bem conhecido pelos versados nessas técnicas; vide patente no US 6.294.177. Por exemplo, ATCC 12902 é uma cepa Tipo 5 de S. aureus e ATCC 12605 é uma cepa Tipo 8 de S. aureus.

[000202] Os polissacarídeos têm tamanho nativo ou alternativamente podem ser dimensionados, por exemplo, por microfluidização, irradiação ultrassônica, ou por tratamento químico. A invenção cobre também oligossacarídeos derivados de polissacarídeos tipo 5 e 8 de S. aureus. Os polissacarídeos tipo 5 e 8 incluídos na composição imunogênica da invenção são, de preferência, conjugados a uma proteína carreadora como descrito abaixo ou são alternativamente não conjugados. As composições imunogênicas da invenção contêm alternativamente polissacarídeo tipo 5 ou tipo 8.

C. Antígeno de S. aureus 336

[000203] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende o antígeno de S. aureus 336 descrito na patente no US 6.294.177. O antígeno 336 compreende hexosamina ligada em β, contém grupos O-acetila, e especificamente se liga a anticorpos para S. aureus Tipo 336 depositado sob ATCC 55804. Em uma modalidade, o antígeno 336 é um polissacarídeo que tem tamanho nativo ou alternativamente pode ser dimensionado, por exemplo, por microfluidização, irradiação ultrassônica, ou por tratamento químico. A invenção cobre também oligossacarídeos derivados do antígeno 336. O antígeno 336 pode ser não conjugado ou conjugado a uma proteína carreadora.

D. Polissacarídeos Tipo I, II e III de S. epidermidis

[000204] Entre os problemas associados ao uso de polissacarídeos em vacinação, está o fato de que os polissacarídeos por si só são imunógenos deficientes. Prefere-se que os polissacarídeos utilizados na invenção sejam ligados a carreador proteico que proporciona auxílio de células T espectadoras para melhorar a imunogenicidade. Os exemplos desses carreadores que podem ser conjugados a imunógenos polissacarídeos incluem os toxoides de difteria e tétano (DT, DT CRM197 e TT respectivamente), Hemocianina de Lapa Californiana (KLH), e o derivado de proteína purificado de Tuberculina (PPD), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer um dos carreadores acima. Os fragmentos apropriados para uso incluem fragmentos que englobam epítopos de auxiliares T. Particularmente, o fragmento de proteína D de H. influenza deve conter, de preferência, 1/3 da proteína do terminal N. A proteína D é uma proteína ligante de IgD de Haemophilus influenzae (documento no EP 0 594 610 B1) e é um imunógeno potencial. Além disso, as proteínas estafilocócicas podem ser usadas como uma proteína carreadora nos conjugados de polissacarídeos da invenção.

[000205] Uma proteína carreadora seria particularmente vantajosa para uso no contexto de uma vacina estafilocócica e seria toxoide alfa estafilocócico. A forma nativa pode ser conjugada a um polissacarídeo, pois o processo de conjugação reduz a toxicidade. De preferência, toxinas alfa geneticamente detoxificadas tais como as variantes His35Leu ou His35Arg são usadas como carreadores, pois a toxicidade residual é mais baixa. Alternativamente, a toxina alfa é quimicamente detoxificada por tratamento com um reagente reticulante, formaldeído ou glutaraldeído. Uma alfa toxina geneticamente detoxificada é opcionalmente quimicamente detoxificada, de preferência por tratamento com um reagente reticulante, formaldeído ou glutaraldeído para reduzir ainda mais a toxicidade.

[000206] Os polissacarídeos podem ser ligados a uma ou mais proteínas carreadoras por qualquer método conhecido (por exemplo, os métodos descritos nas patentes nos US 4.372.945, 4.474.757, e 4.356.170). De preferência, a química de conjugação com CDAP é conduzida (vide documento no WO 95/08348). Em CDAP, o reagente para introdução cianila, tetraflúor-borato de 1-ciano-dimetil- aminopiridínio (CDAP), é de preferência usado para a síntese de conjugados polissacarídeo/proteína. A reação de cianilação pode ser realizada sob condições relativamente brandas, o que evita a hidrólise dos polissacarídeos sensíveis a álcalis. Esta síntese permite o acoplamento direto a uma protein carreadora.

[000207] A conjugação envolve, de preferência. Produzir uma ligação direta entre a proteína carreadora e o polissacarídeo. Opcionalmente, um espaçador (tal como di-hidreto adípico (ADH)) pode ser introduzido entre a proteína Carreadora e o polissacarídeo.

IV. RESPOSTA IMUNE E ENSAIOS

[000208] Como discutido acima, a invenção refere-se concerns provocar ou induzir uma resposta imune em um indivíduo contra uma variant SpA ou peptídeo de coagulase. Em uma modalidade, a resposta imune pode proteger contra ou tratar um indivíduo que tem, é suspeito de ter, ou está em risco de desenvolver uma infecção ou doença relacionada, particularmente aquelas relacionadas a estafilococos. Um das composições imunogênicas da invenção é para prevenir infecções nosocomiais inoculando um indivíduo antes de submeter a procedimentos em um hospital ou outro ambiente que tem maior risco de infecção.

A. Imunoensaios

[000209] A presente invenção inclui a implementação de ensaios sorológicos para avaliar se e até qual grau uma resposta imune é induzida ou provocada pelas composições da invenção. Há muitos tipos de imunoensaios que podem ser implementados. Os imunoensaios englobados pela presente invenção incluem, porém sem limitações, aqueles descritos na patente no US 4.367.110 (ensaio de sanduíche duplo de anticorpos monoclonais), e patente no US 4.452.901 (Western blot). Otutros ensaios incluem imunoprecipitação de ligantes marcados e imunocitoquímica, ambos in vitro e in vivo.

[000210] Os imunoensaios são genericamente ensaios de ligação. Certos imunoensaios preferidos são os vários tipos de ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs) e radioimunoensaios (RIA) conhecidos nessas técnicas. A detecção imunoistoquímica usando seções de tecidos também é particularmente útil. Em um exemplo, os anticorpos ou antígenos são imobilizados sobre uma superfície selecionada, tal como um poço em uma placa de microtitulação de poliestireno, fita de imersão, ou suporte de coluna. Depois, uma composição em teste suspeita de conter o antígeno ou anticorpo desejado, tal como uma amostra clínica, é adicionada aos poços. Depois da ligação e lavagem para remover complexos imunes ligados inespecificamente, o antígeno ou anticorpo ligado pode ser detectado. A detecção é realizada genericamente pela adição de outro anticorpo, específico para o antígeno or anticorpo desejado, que é ligado a um marcador detectável. Este tipo de ELISA é conhecido como um “sanduíche ELISA.” A detecção pode ser realizada também pela adição de um segundo anticorpo específico para o antigen desejado, e em seguida, pela adição de um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação pelo segundo anticorpo, sendo o terceiro anticorpo ligado a um marcador detectável.ELISAs de competição também são implementações possíveis nas quais as amostras em teste competem pela ligação com quantidades conhecidas de antígenos ou anticorpos marcados. A quantidade de espécies reativas na amostra desconhecida é determinada misturando a amostra com as espécies marcadas conhecidas antes ou durante a incubação com poços revestidos. A presença de espécies reativas na amostra atua para reduzir a quantidade de espécies marcadas para ligação ao poço, e assim sendo, reduz o sinal final. Independentemente do formato empregado, ELISAs têm certas características em comum, tais como revestimento, incubação ou ligação, lavagem para remover espécies ligadas inespecificamente e detectar complexos imunes ligados.

[000211] Antígenos ou anticorpos podem ser também ligados a um suporte sólido, tal como na forma de placa, pérolas, fita de imersão, membrana, ou matriz de coluna, e a amostra a ser analisada é aplicada ao antígeno ou anticorpo imobilizado. Ao revestir uma placa com antígeno ou anticorpo, deve-se genericamente incubar os poços da placa com uma solução do antígeno ou anticorpo, durante a noite inteira ou por um período especificado. Os poços da placa serão então lavados para remover o material adsorvido incompletamente. Quaisquer superfícies remanescentes dos poços são então “revestidas” com uma proteína inespecífica que é neutra em termos antigênicos quanto aos antissoros do teste. Eles incluem albumina do soro bovino (BSA), caseína, e soluções de leito em pó. O revestimento permite o bloqueio de sítios de adsorção inespecíficos sobre a superfície imobilizadora, e assim sendo, reduz o fundo causado pela ligação inespecífica de antissoros sobre a superfície.

B. Diagnóstico de Infecção Bacteriana

[000212] Além do uso de proteínas, polipeptídeos, e/ou peptídeos, bem como anticorpos que se ligam a estes polipeptídeos, proteínas, e/ou peptídeos, para tratar ou prevenir infecção como descrito acima, a presente invenção contempla o uso destes polipeptídeos, proteínas, peptídeos, e/ou anticorpos de uma série de maneiras, incluindo a detecção da presença de estafilococos PAra diagnosticar uma infecção, seja em um paciente ou em equipamento medico que também pode ficar infectado. De acordo com a invenção, um método preferido para detectar a presença de infecções envolve as etapas de ober uma amostra suspeita de estar infectada por uma ou mais espécies ou cepas de bactérias estafilocócicas, tal como uma amostra coletada de um indivíduo, por exemplo, da saliva, tecidos, osso, músculo, cartilagem ou pele do indivíduo. Depois do isolamento da amostra, análises diagnósticas que utilizam os polipeptídeos, proteínas, peptídeos, e/ou anticorpos da presente invenção podem ser conduzidas para detectar a presença de estafilococos, e essas técnicas de análise para determinar essa presença em uma amostra são bem conhecidas pelos versados nessas técnicas e incluem métodos tais como análises por radioimunoensaio, análise Western blot e ELISA. Em geral, de acordo com a invenção, contempla-se um método para diagnosticar uma infecção, no qual uma amostra suspeita de estar infectada com estafilococos recebe a adição do polipeptídeo, proteína, peptídeo, anticorpo, ou anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção, e os estafilococos são indicados pela ligação do anticorpo aos polipeptídeos, proteínas, e/ou peptídeos, or polipeptídeos, proteínas, e/ou peptídeos se ligando aos anticorpos na amostra.

[000213] Consequentemente, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser usados para a prevenção de infecção por bactérias estafilocócicas (isto é, imunização passiva), para o tratamento de uma infecção em andamento, ou para uso como ferramentas de pesquisa. O termo "anticorpos", como aqui utilizado, inclui anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia única, bispecíficos, “simianizados”, e humanizados ou “primatizado”, bem como fragmentos Fab, tais como aqueles fragmentos que mantêm a especificidade de ligação dos anticorpos, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab. Consequentemente, a invenção contempla o uso de cadeias únicas tais como as cadeias variáveis pesadas e leves dos anticorpos. A geração de qualquer um destes tipos de anticorpos ou fragmentos de anticorpos é bem conhecida pelos versados nessas técnicas. Os exemplos específicos da geração de um anticorpo para uma proteína bacteriana podem ser encontrados na publicação do pedido de patente no US 20030153022, que é aqui incorporada como referência em sua totalidade.

[000214] Qualquer um dos polipeptídeos, proteínas, peptídeos e/ou anticorpos descritos acima pode ser marcado diretamente com um marcador detectável para identificação e quantificação de bactérias estafilocócicas. Os marcadores para uso em radioimunoensaios são genericamente conhecidos pelos versados nessas técnicas e incluem enzimas, radioisótopos, e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas, incluindo partículas coloridas tais como pérolas de ouro coloidal ou látex. Os imunoensaios apropriados incluem análises imunoabsorventes ligadas a enzima (ELISA).

C. Imunidade Protetora

[000215] Em algumas modalidades da invenção, composições proteináceas conferem imunidade protetora a um indivíduo. A imunidade protetora refere-se à capacidade de um corpo para montar uma resposta imune específica que protege o indivíduo contra o desenvolvimento de uma doença ou condição específica, que envolve o agente contra o qual há uma resposta imune. Uma quantidade eficaz em termos imunogênicos é capaz de conferir imunidade protetora ao indivíduo.

[000216] Como aqui utiilizado no relatórios descritivo e no quadro reivindicatório que se segue, o termo polipeptídeo ou peptídeo refere-se a um prolongamento de aminoácidos ligado de forma covalente entre eles por intermédio de ligações peptídicas. Diferentes polipeptídeos têm diferentes funcionalidades de acordo com a presente invenção. Embora de acordo com um aspecto, um polipeptídeo seja derivado de um imunógeno desenhado para induzir uma resposta ativa em um recebedor, de acordo com outro aspecto da invenção, um polipeptídeo é derivado de um anticorpo, o que resulta depois da indução de uma resposta imune ativa em, por exemplo, um animal, e que serve para induzir uma resposta imune passiva no recebedor. Em ambos os casos, entretanto, o polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo de acordo com qualquer uso possível de códons.

[000217] Como aqui utilizado, o termo “resposta imune” ou seu equivalente “resposta imunológica” refere-se ao desenvolvimento de uma resposta humoral (mediada por anticorpo), celular (mediada por células T específicas do antígeno ou seus produtos de secreção) ou uma resposta humoral e também and celular direcionada contra uma proteína, peptídeo, carboidrato, ou polipeptídeo da invenção em um paciente recebedor. Essa resposta por ser uma resposta ativa induzida pela administração de imunógeno ou uma resposta passiva induzida pela administração de anticorpo, material que contém anticorpo, ou células T revestidas (primed). Uma resposta imune celular é eliciada pela apresentação de epítopos de polipeptídeos em associação com moléculas MHC Classe I ou Classe II, para ativar células auxiliares T CD4(+) específicas do antígeno e/ou células T CD8 (+) citotóxicas. A resposta pode envolver também a ativação de monócitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas astrócitos, células microgliais, eosinófilos ou outros componentes de imunidade inata. Como aqui utilizado, o termo “imunidade ativa” refere-se a qualquer imunidade conferida a um indivíduo pela administração de um antígeno.

[000218] Como aqui utilizado, o termo “imunidade passiva” refere-se a qualquer imunidade conferida a um indivíduo sem a administração de um antígeno ao indivíduo. “Imunidade passiva”, portanto, inclui, porém sem limitações, administração de efetores imunes ativados incluindo mediadores celulares ou mediadores proteicos (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou policlonais) de uma resposta imune. Uma composição de anticorpo monoclonal ou policlonal pode ser usada em imunização passiva para a prevenção ou tratamento de infecção por organismos portadores do antígeno reconhecido pelo anticorpo. Uma composição de anticorpo pode incluir anticorpos que se ligam a uma série de antígenos que podem, por sua vez, estar associados com vários organismos. O componente anticorpo pode ser um antissoro policlonal. Em certos aspectos, o anticorpo ou anticorpos são purificados por afinidade a partir de um animal ou segundo indivíduo que foi desafiado com um ou mais antígenos. Alternativamente, uma mistura de anticorpos pode ser usada, a qual é uma mistura de anticorpos monoclonais e/ou policlonais para antígenos presentes em micróbios ou organismos iguais, relacionados ou diferentes, tais como bactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas, incluindo, porém sem limitações, bactérias estafilocócicas.

[000219] A imunidade passiva pode ser conferida a um paciente ou indivíduo administrando ao paciente imunoglobulinas (Ig) e/ou outros fatores imunes obtidos de um doador ou outra fonte que não um paciente, tendo imunorreatividade conhecida. Em outros aspectos, uma composição antigênica da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo que então atua como um fonte ou doador para globulina, produzida em resposta a um desafio com a composição antigênica ("globulina hiperimune"), que contém anticorpos direcionados contra estafilococo ou outro organismo. Um indivíduo assim tratado doaria plasma a partitr do qual a globulina hiperimune seria então obtida por intermédio de metodologia convencional de fracionamento de plasma, e administrado a outro indivíduo para conferir resistência contra ou para tratar infecção estafilocócica. As blobulinas hiperimunes de acordo com a invenção são particularmente úteis para indivíduos imunodeficientes, para indivíduos que passam por procedimentos invasivos ou quando o tempo não permite que o indivíduo produza seus próprios anticorpos em resposta à vacinação. Vide patentes nos US 6.936.258, 6.770.278, 6.756.361, 5.548.066, 5.512.282, 4.338.298, e 4.748.018, sendo cada uma delas aqui incorporada como referência em sua totalidade, para obter métodos e composições eemplificativas relacionadas à imunidade passiva.

[000220] Para os propósitos deste relatório descritivo e das reivindicações apensadas, os termos "epítopo” e "determinante antigênico” são utilizados de forma intercambiável para se referir a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem ou reconhecem. Os epítopos de células B podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobragem terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contiguous são tipicamente retidos sob exposição a solventes desnaturantes, enquanto que os epítopos formados por dobragem terciária não tipicamente perdidos sob tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial singular. Os métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Vide, por exemplo, “Epitope Mapping Protocols” (1996). Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples que indica a capacidade de um anticorpo bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno-alvo. As células T reconhecem epítopos contínuos de cerca de nove aminoácidos para células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para células CD4. As células T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação dependente do antígeno, como determinada por incorporação de 3H-timidina por células T revestidas (primed) em resposta a um epítopo (Burke et al., 1994), por exterminação dependente do antígeno (ensaio de linfócitos T citotóxicos, Tigges et al., 1996) ou por secreção de citocina.

[000221] A presença de uma resposta imunológica mediada por célula pode ser determinada por ensaios de proliferação (células T CD4 (+)) ou CTL (linfócito T citotóxico). As contribuições relativas de respostas humorais e celulares para o efeito protetor ou terapêutico de um imunógeno podem ser distinguidas isolando separadamente IgG e células T de um animal isogênico imunizado e medindo o efeito protetor ou terapêutico em um segundo indivíduo.

[000222] Como utilizados neste relatório descritivo e nas reivindicações, os termos "anticorpo” ou "imunoglobulina” são utilizados de forma intercambiável e se referem a qualquer uma das várias classes de proteínas estruturalmente relacionadas que funcionam como parte da resposta imune de um animal ou recebedor, proteínas estas que incluem IgG, IgD, IgE, IgA, IgM e proteínas relacionadas.

[000223] Sob condições fisiológicas normais, os anticorpos são encontrados no plasma e outros fluidos corporais e na membrana de certas células, e são produzidos por linfócitos do tipo denotado células B ou seu equivalente funcional. Os anticorpos da classe IgG são constituídos de até quatro cadeias de polipeptídeo ligadas entre si por ligações dissulfeto. As quatro cadeias de moléculas de IgG intactas são duas cadeias pesadas idênticas referidas como cadeias H e duas cadeias leves idênticas referidas como cadeias L.

[000224] Para produzir anticorpos policlonais, um hospedeiro, tal como um coelho ou cabra, é imunizado com o antígeno ou fragmento de antígeno, genericamente com um adjuvante e, caso necessário, acoplado a um carreador. Os anticorpos para o antígeno são subsequentemente coletados a partirt dos soros do hospedeiro. O anticorpo polyclonal pode ser purificado por afinidade contra o antígeno tornando-o monoespecífico.

[000225] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por hiperimunização de um doador apropriado com o antígeno ou ex-vivo pelo uso de culturas primárias de células esplênicas ou linhagens de células derivadas do baço (Anavi, 1998; Huston et al., 1991; Johnson et al., 1991; Mernaugh et al., 1995).

[000226] Como utilizada neste relatório descritivo e nas reivindicações, a frase "uma parte imunológica de um anticorpo” inclui um fragmento Fab de um anticorpo, um fragmento Fv de um anticorpo, uma cadeia pesada de um anticorpo, uma cadeia leve de um anticorpo, um heterodímero que consiste em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo, um fragmento variável de uma cadeia leve de um anticorpo, um fragmento variável de uma cadeia pesada de um anticorpo, e uma cadeia única variante de um anticorpo, que é conhecida também como scFv. Além disso, o term inclui imunoglobulinas quiméricas que são os produtos da expressão de genes fundidos derivados de espécies diferentes, uma das epécies podendo ser um ser humano, em cujo caso a imunoglobulina quimérica é dita como sendo humanizada. Tipicamente, uma parte imunológica de um anticorpo compete com o anticorpo intact a partir do qual ela foi derivada para ligação específica a um antígeno.

[000227] Opcionalmente, um anticorpo ou de preferência uma parte imunológica de um anticorpo, pode ser quimicamente conjugada, expressada como uma proteína de fusão com outras proteínas. Para os propósitos deste relatório descritivo e das reivindicações apensadas, todas essas proteínas fundidas estão incluídas na definição de anticorpos ou uma parte imonológica de um anticorpo.

[000228] Como aqui utilizados, os termos “agente imunogênico” ou “imunógeno” ou “antígeno” são utilizados de forma intercambiável para descrever uma molécula capaz de induzir uma resposta imunológica contra ele mesmo após a administração a um recebedor, seja isoladamente, em conjunto com um adjuvante, ou apresentado em um veículo de exposição.

D. Métodos de Tratamento

[000229] Um método da presente invenção inclui o tratamento para uma doença ou condição causada por um patógeno estafilocócico. Um polipeptídeo imunogênico da invenção pode ser dado para induzir uma resposta em uma pessoa infectada com estafilococo ou suspeita de ter sido exposta ao estafilococo. Os métodos podem ser empregados para indivíduos que testaram positivamente para exposição ao estafiloco ou que são considerados como estando em risco de infecção baseado em exposição possível.

[000230] Particularmente, a invenção engloba um método de tratamento para infecção estafilocócica, particularmente infecções nocosomiais adquiridas em hospital. As composições imunogênicas e as vacinas da invenção são particularmente vantajosas para uso em casos de cirurgia eletiva. Tais pacientes devem saber a data da cirurgia antecipadamente e poderiam ser inoculados antecipadamente. As composições imunogênicas e vacinas da invenção são vantajosas também para uso na inoculação de profissionais da saúde pública.

[000231] Em algumas modalidades, o tratamento é administrado na presença de adjuvantes ou carreadores ou outros antígenos estafilocócicos. Além disso, em alguns exemplos, o tratamento compreende a administração de outros agentes comumente usados contra infecção bacteriana, tais como um ou mais antibióticos.O uso de peptídeos para vacinação pode requerer, prém não necessariamente, a conjugação do peptídeo com uma proteína carreadora imunogênica, tal como antígeno superficial de hepatite B, hemocianina de lapa caloforniana, ou albumina de soro bovino. Os métodos para realizar esta conjugação são bem conhecidos nessas técnicas.

V. VACINA E OUTRAS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO A. Vacinas

[000232] A presente invenção inclui métodos para prevenir ou melhorar infecções estafilocócicas, particularmente infecções nosocomiais adquiridos em hospital. Assim sendo, a invenção contempla vacinas para uso em modalidades de imunização ativa e passiva. As composições imunogênicas, propostas para serem apropriadas para uso como uma vacina, podem ser preparadas a partir de polipeptídeos SpA imunogênicos, tal como uma variante do domínio D de SpA, ou coagulases imunogênicas. Em outras modalidades, SpA ou coagulases podem ser usadas em combinação com outras proteínas virulentas secretadas, proteínas superficiais ou seus fragmentos imunogênicos. Em certos aspectos, o material antigênico é dialisado extensivamente para remover moleculas de baixo peso molecular indesejadas e/ou liofilizado para formulação mais fácil em um veículo desejado.

[000233] Outras opções para uma vacina baseada em proteína/peptídeo enveolvem introduzir ácidos nucleicos que codificam o(s) antígeno(s) como vacinas de DNA. A este respeito, relatórios recentes descreveram a construção de virus da vacínia recombinantes que expressam 10 epítopos contíiguos de CTL mínimos (Thomson, 1996) ou uma combinação de epítopos de células B, linfócitos de células T citotóxicos (CTL), e auxiliares T (Th) de vários micróbios (An, 1997), e o uso exitoso dessas construções para imunizar camundongos para priming de respostas imunes protetoras. Assim sendo,há ampla evidência na literatura para a utilização exitosa de peptídeos, células apresentadoras de antígenos (APCs) pulsadas por peptídeo, e construções que codificam peptídeos para priming eficiente in vivo de respostas imunes protetoras. O uso de sequências de ácidos nucleicos como vacinas está exemplificado nas patentes nos US 5.958.895 e 5.620.896.

[000234] A preparação de vacinas que contêm sequência(s) de polipeptídeos ou peptídeos como ingredientes ativos é genericamente bem conhecida nessas técnicas, como exemplificado nas patentes nos US 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; e 4.578.770, sendo todas elas aqui incorporadas como referência. Tipicamente, tais vacinas são preparadas como produtos injetáveis como soluções ou suspensões líquidas: formas sólidas para solução ou suspensão em um líquido antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação pode ser também emulsificada. O ingrediente imunogênico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Os excipientes apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerina, etanol, ou similares e combinações deles. Além disso, caso desejado, a vacina pode conter quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, tampões de pH, ou adjuvantes que intensificam a eficácia das vacinas. Em modalidades específicas, as vacinas são formuladas com uma combinação de substâncias, como descrito nas patentes nos US 6.793.923 e 6.733.754, que são aqui icorporadas como referência.

[000235] As vacinas podem ser administradas convencionalmente por via parenteral, por injeção, por exemplo, injeção subcutânea ou intramuscular. Formulações adicionais que são apropriadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. Para supositórios, aglutinantes e carreadores tradicionais pode incluir, por exemplo, polialqulenoglicóis ou triglicerídeos: tais supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm um ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10%, de preferência cerca de 1% a cerca de 2%. As formulações orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e similares. Estas composições tomama forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações com liberação prolongada ou pós e contêm cerca de 10% a cerca de 95% de ingrediente ativo, de preferência cerca de 25% a cerca de 70%.

[000236] Os polipeptídeos e construções de DNA que codificam polipeptídeos podem ser formulados em uma vacina na forma neutra ou de or sal. Os sais farmceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácidos (formados com o grupos amina livres do peptídeo) e aqueles que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e similares.

[000237] Tipicamente, as vacinas são administradas de uma maneira compatível co ma formulação de dosagem, e em uma quantidade que deve ser terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo a capacidade de o sistema imunológico do indivíduo sintetizar anticorpos e o grau de proteção desejado. As quantidades precisas de ingrediente ativo necessárias a serem administradas dependem do julgamento de profisional. Entretanto, as faixas de dosagem apropriadas são da ordem de de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação. Os esquemas apropriados para administração inicial e injeções de reforço também são variados, mas são tipificados por uma administração inicial seguida de inoculações subsequentes de outras administrações.

[000238] A maneira de aplicação pode ser variada amplamente. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina é aplicável. Acredita-se que eles incluem aplicação oral em uma base sólida estável fisiologicamewnte aceitável ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, por via parenteral, por injeção e similares. A dosagem da vacina dependerá da via de administração e variará de acordo com o porte e a saúde do indivíduo.

[000239] Em certos casos, será desejável ter múltiplas administrações da vacina, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais administrações. As vacinações podem ser em intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, a 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12 de doze semanas, incluindo todas as faixas entre eles. Reforços periódicos em intervalos de 1-5 devem ser desejáveis para manter níveis protetores dos anticorpos. O curso da imunização pode ser seguido de análises quanto a anticorpos contra os antígenos, como descrito nas patentes nos US 3.791.932; 4.174.384 e 3.949.064.

1. Carreadores

[000240] Uma dada composição pode variar sua imunogenicidade. Frequentemente é ncessário, portanto, reforçar o sistema imunológico do hospedeiro, como pode ser conseguido acoplando um peptídeo ou polipeptídeo a um carreador. Os carreadores exemplificativos e preferidos são hemocianina de lapa californiana (KLH) e albumina de soro bovino (BSA). Outras albuminas tais como albumina do ovo, albumina de soro do camundongo, ou albumina de soro do coelho também podem ser usadas como carreadores. Os meios para conjugar um polipeptídeo com uma proteína carreadora são bem conhecidos nessas técnicas e incluem glutaraldeído,éster de m-maleimidobencoil- N-hidróxi-sucinimida, carbodiimida, e bis-benzidina biazotada.

2. Adjuvantes

[000241] A imunogenicidade de composições de polipeptídeos ou peptídeos pode ser intensificada plo uso de estimulantes inespecíficos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Os adjuvantes apropriados incluem todos compostos imunoestimulantes, tais como citocinas, toxinas, ou composições sintéticas. Inúmeros adjuvantes podem ser usados para intensificar uma resposta de anticorpo contra um polipeptídeo ou coagulase de SpA variante, ou qualquer outra proteína bacteriana ou combinação aqui contemplada. Os adjuvantes podem (1) aprisionar o antígeno no corpo para causar uma liberação lenta; (2) atrair células envolvidas na resposta imune para o local da administração; (3) induzir a proliferação ou ativação de células do sistema imunlógico; ou (4) melhorar a disseminação do antígeno pelo corpo inteiro do indivíduo.

[000242] Os adjuvantes incluem, porém sem limitações, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, sais minerais, polinucleotídeos, e substâncias naturais. Os adjuvantes específicos que podem ser usados incluem IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, interferon y, GMCSP, BCG, sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio ou outro composto de alumínio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídeo A, e monofosforil-lipídeo A (MPL). RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS) em uma emulsão de 2% esqualeno/Tween 80. Antígenos MHC podem ser ainda usados. Outros adjuvantes ou métodos estão exemplificados nas patentes nos US 6.814.971, 5.084.269, 6.656.462, que são aqui incorporadas como referência.

[000243] Vários métodos para atingir efeito adjuvante para a vacina incluem o uso de agentes tais como hidróxido de alumínio ou fosfato (alume), usados comumente como solução a cerca de 0,05 a cerca de 0,1% em solução salina tamponada com fosfato, mistura com polímeros sintéticos de açúcares (Carbopol®) usados como solução a cerca de 0,25%, agregação da proteína na vacina por tratamento térmico em temperaturasna faixa entre cerca de 70°C e cerca de 101°C por um período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. A agregação reativando com anticorpos (Fab) tratados com pepsina para albumina; mistura com células bacterianas (por exemplo, C. parvum), endotoxinas ou componentes lipopolissacarídeos de baterias gram-negativas; emulsão em veículos oleosos fisiologicamente aceitáveis (por exemplo, monooletato de manida (Aracel A)); ou emulsão com uma solução a 20% de perfluorocarbono (Fluosol-DA®) usado como um bloco substituto também podem ser empregados para produzir um efeito adjuvante.

[000244] Os exemplos de adjuvantes frequentemente preferidos incluen adjuvante de Freund completo (um estimulante inespecífico da resposta imune, que contém Mycobacterium tuberculosis morta), adjuvante de Freunda incompleto, e hidróxido de alumínio.

[000245] Em alguns aspectos, prefere-se que o adjuvante seja selecionado para ser um inductor preferencial de um tipo de resposta Th1 ou Th2. Altos níveis de citocinas do tipo Th1 tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por células contra um dado antígeno, enquanto que altos níveis de citocinas do tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais contra o antígeno.

[000246] A distinção de resposta immune do tipo Th1 e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo suportará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Th1 ou predominantemente Th2. Entretanto, é frequentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquilo descrito em clones de células T CD4+ murinas por Mosmann e Coffman (Mosmann, e Coffman, 1989). Tradicionalmente, respostas do tipo Th1 são associadas à produção de citocinas INF-Y e IL-2 por linfócitos T. Outras citocinas frequentemente associadas diretamente à indução de respostas imunes do tipo Th1 não são produzidas por células T, tal como IL-12. Em contraste, respostas do tipo Th2 são associadas à secreção de IL- 4, IL-5, IL-6, IL-10.

[000247] Além de adjuvantes, pode ser desejável coadministrar modificadores de respostas biológicas (BRM) para intensificar respostas imunes. BRMs demonstraram regular de forma ascendente a imunidade de células T ou regular de forma descendente a atividade de células supresoras. Tais BRMs incluem, porém sem limitações, Cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); ou ciclofosfamidade de dose baixa (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/ Mead, NJ) e citocinas tais como interferon Y, IL-2, ou IL-12 ou genes que codificam proteínas envolvidas funções auxiliares imunes, tal como B-7.

B. Componentes e Porções Lipídicos

[000248] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a composições que compreendem um ou mais lipídeos associados com um ácido nucleico ou um polipeptídeo/peptídeo. Um lipídeo é uma substância que é insolúvel em água e extraível com um solvente orgânico. Compostos que não aqueles aqui especificamente descritos são entendidos pelos versados nessas técnicas como lipídeos, e estão englobados pelas composições e métodos da presente invenção. Um componente lipídico e um não lipídico podem ser anexados um ao outro, seja de forma covalente ou não covalente.

[000249] Um lipídeo pode ser um lipídeo de ocorrência natural ou um lipídeo sintético. Entretanto, um lipídeo é usualmente uma substância biológica. Os lipídeos biológicos são bem conhecidos nessas técnicas, e incluem, por exemplo, gorduras neutras, fosfolipídeos, fosfoglicerídeos, esteroides, terpenos, lisolipídeos, glicoesfingolipídeos, glicolipídeos, sulfatídeos, lipídeos com ácidos graxos ligados com éter e éster e lipídeos polimerizáveis, e combinações deles.

[000250] Uma molécula de ácido nucleico ou um polipeptídeo/peptídeo, associado com um lipídeo pode ser dispersado em uma solução que contém um lipídeo, dissolvido com um lipídeo, emulsificado com um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, ligado de forma covalente a um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo ou associado de outra forma com um lipídeo. Uma composição associada com lipídeo/poxvírus da presente invenção não está limitada a qualquer estrutura específica. Por exemplo, elas podem ser simplesmente entremeadas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou formato. Em outro exemplo, elas podem estar presentes em uma estrutura bicamada, como micelas, oum com uma estrutura “colapsada”. Em outro exemplo não limitativo, um complexo de lipofectamina (Gibco BRL)/poxvírus ou Superfect (Qiagen)/poxvírus também está contemplado.

[000251] Em certas modalidades, uma composição pode compreender cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4% cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou qualquer faixa entre estes valores, de um lipídeo específico, tipo de lipídeo, ou componente não lipídico tal como um adjuvante, antígeno, peptídeo, polipeptídeo, açúcar, ácido nucleico ou outro material aqui descrito ou como seria do conhecimento dos versados nessas técnicas. Em um exemplo não limitativo, uma composição oide compreender cerca de 10% a cerca de 20% lipídeos neutros, e cerca de 33% a cerca de 34% de um cerebrosídeo, e cerca de 1% de colesterol. Em outro exemplo não limitativo, um lipossoma pode compreender cerca de 4% a cerca de 12% de terpenos, onde cerca de 1% da micela é especificamente licopeno, deixando cerca de 3% a cerca de 11% do lipossoma como compreendendo outros terpenos; e cerca de 10% a cerca de 35% fosfatidilcolina, e cerca de 1% de um componente não lipídico. Assim sendo, contempla-se que as composições da presente invenção podem compreender qualquer um dos lipídeos, tipos de lipídeos ou outros componentes em qualquer combinação ou faixa de porcentagem.

C. Terapia Combinada

[000252] As composições e os métodos relacionados da presente invenção, particularmente a administração de um fator de virulência secretado ou proteína superficial, incluindo um polipeptídeo or peptídeo de SpA variante, e/ou outros peptídeos ou proteínas bacterianas, a um paciente/indivíduo, também pode ser usada em combinação com a administração de terapias tradicionais. Elas incluem, porém sem limitações, a administração de antibióticos tais como estreptomicina, ciprofloxacina, doxiciclina, gentamicina, cloranfenicol, trimetoprim, sulfametoxazol, ampicilina, tetraciclina ou várias outras combinações de antibióticos.

[000253] Em um aspecto, contempla-se que uma vacina de polipeptídeo e/ou terapia é usada em conjunto com tratamento antibacteriano. Alternativamente, a terapia pode preceder ou suceder o tratamento com outro agente em intervalos na faixa de entre minutos e semanas. Em certas modalidades nas quais os outros agentes e/ou proteínas ou polinucleotídeos são administrados separadamente, deve- se genericamente assegurar que um período de tempo significativo não expire entre a hora de cada distribuição, de tal modo que o agente e a composição antigênica seja capaz de exercer um efeito vantajosamente combinado sobre o indivíduo. Nesses casos, contempla-se que se possa administrar ambas modalidades dentro de cerca de 12-24 h entre si ou dentro de cerca de 6-12 h entre uma e outra. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tempo para administração significativamente, onde um intervalo de vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respectivas administrações.

[000254] Vairas combinações podem ser empregadas, por exemplo, terapia com antibiótico é “A” e a molécula imunogênica dadas como parte de um esquema de terapia imunológica, tal como um antígeno, é “B”: A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[000255] A administração das composições imunogênicas da presente invenção a um paciente/indivíduo seguirá protocolos genéricos para a administração desses compostos, levando em considração a toxicidade, caso haja alguma, da composição de SpA, ou outras composições aqui descritas. Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos conforme necessário. Contempla-se também que várias terapias usuais, tais como hidratação, possam ser aplicadas em combinação com a terapia descrita.

D. Composições Farmacêuticas Gerais

[000256] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são administradas a um indivíduo. Diferentes aspectos da presente invenção envolvem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição a um indivíduo. Em algumas modalidades da presente invenção, antígenos estafilocócicos, membros da via Ess, incluindo polipeptídeos ou peptídeos da classe Esa ou Esx, e/ou membros de substratos sortase podem ser administrados ao paciente para proteger infecção por um ou mais patógenos estafilocócicos. Alternativamente, um vetor de expressão que codifica um ou mais desses polipeptídeos ou peptídeos pode ser dado a um paciente como um tratamento preventivo. Adicionalmente, tais compostos podem ser administrados em combinação com um antibiótico ou um antibacteriano. Tais composições devem ser genericamente dissolvidas ou dispersadas em um carreador farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso.

[000257] Além dos compostos formulados para administração parenteral, tais como aqueles para injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos, ou outros sólidos para administração oral; cápsulas com liberação controlada; e qualquer outra forma usada atualmente, incluindo cremes, loções, colutórios, inalantes e similares.

[000258] Os compostos ativos da presente invenção podem ser formulados para administração parenteral, por exemplo, formulados para injeção por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, ou mesmo intraperitoneal. A preparação de uma composição aquosa que contém um composto ou compostos que aumentam a expressão de uma molécula MHC classe I deve ser conhecida pelos versados nessas técnicas à luz da presente descrição. Tipicamente, tais composições podem ser preparadas como produtos injetáveis, seja como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas para uso na preparação de soluções ou suspensões depois da adição de um líquido antes da injeção também podem ser podem ser preparadas e as preparações podem ser também emulsificadas.

[000259] As soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água misturada adequadamente com um surfactante, tal como hidróxi-propil- celulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerina, polietilenoglicóis líquidos, e misturas deles, e em óleos. Sob condições normais de estocagem e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.

[000260] As formas farmacêuticas apropriadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas; formulações que incluem óleo de gergelim, óleo de amendoim, ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve fluida até o grau em que ela possa ser injetada facilmente. Ela deve ser também estável sob as condições de fabricação e estocagem, e deve ser conservada contra a ação contaminadora de microorganismos, tais como bactérias e fungos.

[000261] As composições proteináceas podem ser formuladas em uma forma neutral ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácidos (formados com os grupos amina livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser obtidos a partir bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidsos de sódio, potásio, amônio, cálcio, ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares.

[000262] O carreador pode ser também um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerina, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), misturas apropriadas deles, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula apropriado no caso de dispersão, e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser gerada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, Parabens, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares e cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser gerada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[000263] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, e em seguida, filtrando sob condições estéreis. Genericamente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio básico de dispersão e os outros ingredientes necessários entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéries para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução deles previamente filtrados sob condições estéreis.

[000264] A administração das composições de acordo com a presente invenção deve ser tipicamente por intermédio de qualquer via convencional. Isto inclui, porém sem limitações, administração oral, nasal, ou bucal. Alternativamente, a administração pode ser injeção ortópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, ou intravenosa. Em certas modalidades, uma composição de vacina pode ser inalada (por exemplo, patente no US 6.651.655, que é aqui especificamente incorporada como referência). Tais composições seriam normalmente administradas como composiçõesfarmaceuticamente aceitáveis que incluem carreadores, tampões ou outros excipientes fisiologicamente aceitáveis. Como aqui utilizado, o termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se aos compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito do jultamento médico criterioso, apropriadas para contactar os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérfica excessiva ou outras complicações problemáticas proporcionais à relação de risco/benefício. O termo "carreador farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação líquido ou sólido, envolvido em carrear ou transportar um agente químico.

[000265] Para administração parenteral em solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, caso necessário, e o diluente líquido é primeiramente tornado isotênico com solução salina ou glicose suficiente. Estas soluções aquosas específicas são espacialmente apropriadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, e intraperitoneal. A este respeito, o meio aquosos estéril que pode ser empregado deve ser conhecido pelos versados nessas técnicas à luz da presente descrição. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em solução de NaCl isotônica e adicionada ao líquido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto, (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1990). Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá dependendo da condição do indivíduo. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o indivíduo em questão.

[000266] Uma quantidade eficaz da composição terapêutica ou profilática é determinada baseado na meta pretendida. O termo “dose unitária” ou “dosagem” refere-se a unidades fisicamente distintas apropriadas para uso em um indivíduo, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas desejadas discutidas acima em associação com sua administração, isto é, a via e o esquema apropriado. A quantidade a ser administrada, de acordo com o número de tratamentos e também a dose unitária, depende da proteção desejada.

[000267] As quantidades precisas da composição dependem também do julgamento do profisional médico e são peculiares a cada indivíduo. Os fatores que afetam a dose incluem estado físico e clínico do indivíduo, via de administração, meta pretendida do tratamento (alicio de sintomas versus cura), e potência, estabilidade e toxicidade da composição específica.

[000268] Depois da formulação, as soluções devem ser administradas de uma maneira compatível com a frmulação de dosages e em uma quantidade quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. As formulações são administradas facilmente em uma série de formas de dosagem forms, tal como o tipo de soluções injetáveis descritas acima.

E. Administração in vitro, ex vivo ou in vivo

[000269] Como aqui utilizado, o termo administração in vitro refere-se a manipulações realizadas em células removidas ou fora de um indivíduo, incluindo, porém sem limitações, células em cultura. O termo administração ex vivo refere-se a células que foram manipuladas in vitro, e são subsequentemente administradas a um indivíduo. O termo administração in vivo inclui todas as manipulações realizadas dentro de um indivíduo.

[000270] Em certos aspectos da presente invenção, as composições podem ser administadas in vitro, ex vivo, ou in vivo. Em certas modalidades in vitro, linhagens de células linfocitárias B autólogas são incubadas com um vetor viral da presente invenção por 24 a 48 horas ou com variante SpA e/ou coagulase e/ou qualquer outra composição aqui descrita por duas horas. As células transduzidas podem ser então usadas para análise in vitro, ou alternativamente para administração ex vivo. As patentes nos US 4.690.915 e 5.199.942, ambas qui incorporadas como referência, descrevem métodos para manipulação ex vivo de células mononucleares sanguíneas e células da medula óssea par uso em aplicações terapêiticas.

F. Anticorpos e Imunização Passiva

[000271] Outro aspecto da invenção é um método para preparar uma imunoglobulina para uso na prevenção ou tratamento de infecção estafilocócica, compreendendo as etapas de imunizar um recebedor ou doador com a vacina da invenção e isolar a imunoglobulina do recebedor ou doador. Uma imunoglobulina preparada por este método é outro aspecto da invenção. Uma composição farmacêutica que compreende a imunoglobulina da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável é outro aspecto da invenção, que poderia ser usada na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença estafilocócica. Um método para tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica que compreende a etapa de administrar a um paciente uma quantidade eficaz da preparação farmacêutica da invenção é outro aspecto da invenção.

[000272] Os inóculos para a produção de anticorpos policlonais são tipicamente preparados dispersando a composição antigênica em um diluente fisiologicamente tolerável tal como solução salina ou outros adjuvantes apropriados para uso humano para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunestimulante do inóculo é administrada a um mamífero e o mamífero inoculado é então mantido por um tempo suficiente para que a composição antigênica induza anticorpos protetores.

[000273] Os anticorpos podem ser isolados até o grau desejado por técnicas bem conhecidas tais como cromatografia de afinidade (Harlow e Lane, 1988). Os anticorpos podem incluir preparações de antissoro a partir de uma série animais comumente usados tais como, por exemplo, cabras, primatas, jumentos, porcos, cavalos, porquinhos-da-índia, ratos ou homens.

[000274] Uma imunoglobulina produzida de acordo com a presente invenção pode incluir anticorpos integrais, fragmentos ou subfragmentos de anticorpos. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas integrais de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD or IgE), anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade dupla para dois ou mais antígenos da invenção. Eles podem ser também fragmentos (por exemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv e similares) incluindo fragmentos híbridos. Uma imunoglobulina inclui também proteínas naturais, sintéticas, ou geneticamente manipuladas que atuam como um anticorpo ligando-se a antígenos específicos para formar um complexo.

[000275] Uma vacina da presente invenção pode ser administrada a um recebedor que então atua como uma fonte de imunoglobulina, produzida em resposta ao desafio a partir da vacina específica. Um indivíduo assim tratado doaria plasma a partir do qual a globulina hiperimune seria obtida por intermédio de metodologia convencional de fracionamento do plasma. A globulina hiperimune seria administrada a outro indivíduo para conferir resistência contra ou tratar infecção estafilocócica. As globulinas hiperimunes da invenção são particularmente úteis para o tratamento ou prevenção de doença estafilocócica em recé-nascidos, indivíduos imunocomprometidos, ou quando o tratamento é necessário e não há tempo para que o indivíduo produza anticorpos em resposta à vacinação.

[000276] Um aspecto adicional da invenção é uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais anticorpos monoclonais (ou seus fragmento; de preferência, humanos ou humanizados) reativos contra pelo menos dois constituintes da composição imunogênica da invenção, que poderia ser usada para tratar ou prevenir infecção por bactérias gram-positivas, de preferência estafilococos, mais preferivelmente S. aureus ou S. epidermidis. Tais composições farmacêuticas compreendem anticorpos monoclonais que podem ser imunoglobulinas integrais de qualquer classe, anticorpos quiméricos, ou anticorpos híbridos com especificidade para dois ou mais antígenos da invenção. Eles podem ser também fragmentos (por exemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv e similares) incluindo fragmentos híbridos.

[000277] Os métodos para produzir anticorpos monoclonais são bem conhecidos nessas técnicas e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma cells (Kohler e Milstein, 1975; Harlow e Lane, 1988). Alternativamente, fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos triando uma biblioteca apropriada de fagos (Vaughan et al., 1998). Os anticorpos monoclonais podem ser humanizados ou em parte humanizados por métodos conhecidos.

VI. EXEMPLOS

[000278] Os exemplos que se seguem são fornecidos com o propósito de ilustrar várias modalidades da invenção e não pretendem de forma alguma limitar a presente invenção. Os versados nessas técnicas devem avaliar que a presente invenção é bem adaptada para conduzir os objetivos e obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem como os objetivos, finalidades e vantagens inerentes nela. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos são presentemente representativos de modalidades preferidas, e exemplificativas, e não pretendem limitar o âmbito da invenção. Mudanças nelas e outros usos que está englobados no espírito da invenção como definidos no âmbito das reivindicações devem ocorrer para os versados nessas técnicas.

EXEMPLO 1 VARIANTES DE PROTEÍNA A NÃO TOXIGÊNICAS COMO VACINAS SUBUNITÁRIAS PARA PREVENIR INFECÇÕES POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS A. RESULTADOS Modelo animal para infecção por S. aureus

[000279] Camundongos BALB/c foram infectados por injeção intravenosa com 1x107 UFC do isolado clínico humano S. aureus Newman (Baba et al., 2007). Dentro de 6 horas depois da infecção, 99,999% dos estafilococos desapareceram da corrente sanguínea e foram distribuídos por intermédio da vasculatura. A disseminação estafilocócica para tecidos periféricos ocorreu rapidamente, pois a carga bacteriana no rime outros tecidos de órgãos atingiu 1 x105 UFC g-1 dentro das primeiras três horas. A carga estafilocócica em recidos renais aumentou em 1.5 log UFC dentro de vinte e quatro horaas. Quarenta e oito horas depois da infecção, os camundongos desenvolveram abscessos disseminados em múltiplos órgãos, detectáveis por microscopia luminosa de tecido renal fino secionado corado com hematoxilina-eosina. O diâmetro inicial dos abscessos foi 524 μM (± 65 μM); as lesões foram inicialmente marcadas por um influxo de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) e não abrigam organização discernível de estafilococos, cuja maioria pareceu residir em PMNs. No quinto dia de infecção, os abscessos aumentaram de tamanho e encerravam uma população central de estafilococos, circundados por uma camada de material amorfo eosinofílico e uma grande bainha de PMNs. A histopatologia revelou uma necrose pesada de PMNs na proximidade de um foco estafilocócico no centro das lesões de abscessos, bem como uma manta de fagócitos sadios. Um aro de PMNs necróticos foi observado na periferia de lesões de abscessos, margeando material amorfo eosinofílico que separa tecido renal sadio de Lesões. Os abscessos eventualmente atingiram um diâmetro de > 1.524 μM no Dia 15 ou 36. Em intervalos de tempo posteriores, a carga estafilocócica aumentou para 104-106 UFC g-1 e lesões de abscessos em crescimento migraram na direção da cápsula de órgãos. As lesões periféricas eram suscetíveis à ruptura, liberando desta forma material necrótico e estafilococos para dentro da cavidade peritoneal ou espaço retroperitoneal. Estes eventos resultaram em bacteremia bem como uma onda secundária de abscessos, eventualmente precipitando um resultado letal.

[000280] Para contar a carga estafilocócica no tecido renal, os animais foram exterminados, seus rins foram excisados e o homogeneizado tecidual foi espalhado sobre meio de ágar para formação de colônias. No quinto dia de infecção, uma media de 1x106 UFC g-1 no tecido renal para S. aureus Newman foi observado. Para quantificar a formação de abscessos, os rins foram inspecionados visualmente, e cada órgão individual tecebeu uma pontuação de um ou zero. A soma final foi dividida pelo número total de rins para calcular a porcentagem de abscessos superficiais (Tabela 4). Além disso, rins escolhidos aleatoriamente foi fixadols em formol, embutidos, secionados finos, e corados com hematoxilina-eosina. Para cada rim, quatro seções sagitais em intervalos de 200 μM intervals foram visualizadas por microscopia. Os numerous de lesões foram contados para cada seção e foi tirada a média para quantificar o número de abscessos dentro dos rins. S. aureus Newman causou 4,364 ± 0,889 abscessos por rim, e os abscessos superficiais foram observados em 14 de 20 rins (70%) (Tabela 4).

[000281] Quando examinada por micriscopia eletrônica de varredura, S. aureus Newman foi localizada em coberturas firmemente associadas no centro de abscessos. Os estafilococos foram contidos por uma pseudocápsla amorfa que separou as bactérias da bainha de leucócitos de abscessos. Nenhuma célula imune foi observada nestes focos centrais de estafilococos; entretanto, eritrócitos ocasionais foram localizados entre as bactérias. As populações bacterianasno centro de abscessos, designados “populações de abscessos estafilocócicos” (SAC), pareceram homogêneas e revestidas por material granular denso de elétrons. A cinética do aparecimento de lesões infecciosas e os atributos morfológicos dos abscessos formados por S. aureus Newman foram similares àqueles observados depois da infecção de camundongos com S. aureus USA300 (LAC), o clone de S. aureus (CA- MRSA) resistente à meticilina aquirido pela comunidade epidêmica corrente nos Estados Unidos (Diep et al., 2006).Tabela 4. Requisitos genéticos para a formação de abscessos de S. aureus Newman em camundongos#

Mutantes de Proteína A (SpA) de S. aureus são avirulentas e não conseguem formar abscessos

[000282] Sortase A é uma transpeptidase que imobiliza dezenove proteínas superficiais no envelope da cepa de S. aureus Newman (Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). Um trabalho anterior identificou sortase A como um fator de cirulência em múltiplos sistemas de modelos animais; entretanto as contribuições desta enzima e suas proteínas superficiais ancoradas para a formação ou persistência de abscessos não foram ainda reveladas (Jonsson et al., 2002; Weiss et al., 2004). Em comparação com o antecessor do tipo selvagem (Baba et al., 2007), uma variante isogênica srtA (ΔsrtA) falhou em formar lesões de abscessos no exame macroscópico ou histopatológico nos Dias 2, 5, ou 15. Em camundongos infectados com o mutante strA, apenas 1x104 CFU g-1 foi recuperado a partir do tecido renal no Dia 5 da infecção, o que é uma redução de 2,046 log10 UFC g-1 em comparação com a cepa parental do tipo selvagem (P=6,73x10-6). Um defeito similar foi observado para o mutante srtA da cepa MRSA USA300 (dados não ilustrados). Uma microscopia eletrônica de varredura indicou que mutantes srtA eram altamente dispersados e frequentemente associados com leucócitos em tecido renal sadio. No Dia quinze depois da infecção, mutantes srtA foram depurados dos tecidos renais, uma redução > 3,5 logic de UFC g-1 em comparação com o tipo selvagem (Tabela 3). Assim sendo, proteínas superficiais ancoradas em sortase A permitem a formação de lesões de abscessos e a presistência de bactérias em tecidos do hospedeiro, onde os estafilococos replicam como populações embutidas em uma matriz extracelular e blindados contra leucócitos circundantes por uma pseudocápsula amorfa.

[000283] Sortase A ancora um grande espectro de proteínas com sinais de seleção do modelo LPXTG no envelope da parede celular, proporcionando desta forma a apresentação superficial de muitos fatores de virulência (Mazmanian et al., 2002). Para identificar proteínas superficiais necessárias para a formação de abscessos estafilocócicos, inserções de bursa aurealis foram introduzidas em sequências codificadoras 5’ de genes que codificam polipeptídeos com proteínas do modelo LPXTG (Bae et al., 2004) e estas mutações foram transduzidas em S. aureus Newman. Mutações no gene estrutural para Proteína A (spa) reduziram a carga estafilocócica em tecidos renais de camundongos infectados em 1,004 log10 (P=0,0144). Quando analisados quanto à sua capacidade para formar abscessos em tecidos renais por histopatologia, observou-se que os mutantes spa eram incapazes de formar abscessos em comparação com a cepa parental do tipo selvagem S. aureus Newman (S. aureus Newman do tipo selvagem 4,364 ± 0,889 abscessos por rim versus o mutante spa isogênico com 0,375 ± 0,374 lesões; P = 0,0356).

Proteína A bloqueia respostas imunes inatas e adaptativas.

[000284] Estudos identificaram a Proteína A como um fator de virulência crítico durante a patogênese de infecções por S. aureus. Um trabalho anterior demonstrou que a Proteína A impede a fagocitose de estafilococos ligando o componente Fc de imunoglobulina (Jensen 1958; Uhlén et al., 1984), ativa a agregação de plaquetas por intermédio do fator de von Willebrand (Hartleib et al., 2000), funciona como um superantígeno de células B capturando a região F(ab)2 de IgM portadora de VH3 (Roben et al., 1995), e através da sua ativação de TNFR1, pode iniciar pneumonia estafilocócica (Gomez et al., 2004). Devido ao fato de que a Proteína A captura imunoglobulina e apresenta atributos tóxicos, a possibilidade que esta molécula superficial pode funcionar como uma vacina em seres humanos não foi rigorosamente perseguida. Os inventores demonstram pela primeira vez que variantes de Proteína A incpazes de se ligar a imunoglobulinas, vWF e TNFR-1 perdem seu potencial toxigênico e são capazes de estimular respostas imunes humorais que protegem contra doença estafilocócica.

Base molecular da apresentação superficial e função da Proteína A

[000285] A Proteína A é sintetizada como um precursor no citoplasma bacteriano e é secretada por intermédio do seu peptídeo sinalizador YSIRK na parede transversal, isto é, o septo de divisão da célula de estafilococos (Figura 1). (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008). Depois da clivagem do sinal de seleção LPXTG do terminal C, a Proteína A é ancorada em pontes cruzadas de peptidoglicanos bacterianos por sortase A (Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 1999; Mazmanian et al., 2000). A Proteína A é a proteína superficial mais abundante de estafilococos; a molécula é expressada por virtualmente todas as cepas de S. aureus (Said-Salim et al., 2003; Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008). Os estafilococos viram mais de 15-20% da sua parede celular por ciclo de divisão (Navarre and Schneewind 1999). S hidrolases murinas clivam os filamentos de glicanos e peptídeos da parede de peptidoglicano, liberando desta forma Proteína A com seu tetrapeptídeo dissacarídeo da parede celular do terminal C dentro do meio extracelular (Ton-That et al., 1999). Assim sendo, por desenho fisiológico, Proteína A é ancorada na parede celular e apresentada sobre a superfície bacteriana, mas liberada para dentro de tecidos circundantes durante a infecção do hospedeiros (Marraffini et al., 2006).

[000286] A Proteína A captura imunoglobulinas sobre a superfície bacteriana e esta atividade bioquímica permite o escape de estafilococos de respostas imunes inatas e adquiridas do hospdeiro (Jensen 1958; Goodyear and Silverman 2004). O interessante é que a região X da Proteína A (Guss et al., 1984), um domínio de repetição que amarra os domínios ligantes de IgG na âncora do sinal de seleção LPXTG/parede celular, é talvez a parte mais variável do Genoma estafilocócico (Schneewind et al., 1992; Said-Salim et al., 2003). Cada um dos cinco domínios ligantes de imunoglobulina da Proteína A (SpA), formados a partir de feixes de tripla hélice e designados E, D, A, B, and C, exerce propriedades estruturais e funcionais similares (Sjodahl 1977; Jansson et al., 1998). A solução e e a estrutura cristalina do domínio D foram resolvidas com e sem os ligantes Fc e VH3 (Fab) ligands, que se ligam à Proteína A de uma maneira não competitiva em sítios distintos (Graille et al., 2000).

[000287] No complexo com estrutura cristalina, o Fab interage com a hélice II e hélice III do domínio D por intermédo de uma superfície constituída de quatro filamentos β da região VH (Graille et al., 2000). O eixo principal da hélice II do domínio D tem aproximadamente 50° em relação à orientação dos filamentos, e a parte entre hélices do domínio D é mais próxima do filamento C0. O sítio de interação em Fab é distante da cadeia leve de Ig e da região constante da cadeia pesada. A interação envolve os seguintes resíduos do domínio D: Asp-36 da hélice II bem como Asp-37 e Gln-40 na alça entre a hélice II e a hélice III, além de outros resíduos com SpA-D (Graille et al., 2000). Ambas superfícies interagentes são constituídas predominantemente de cadeias laterais polares, com três resíduos negativamente carregados no domínio D e dois resíduos positivamente carregados em Fab 2A2 escondidos pela interação, produzindo uma atração eletrostática global entre as duas moléculas. Das cinco interações polares identificadas entre Fab e o domínio D, três estão entre cadeias laterais. Uma ponte de sal é formada entre Arg-H19 e Asp-36 e duas ligações hidrogênio são feitas entre Tyr- H59 e Asp-37 e entre Asn-H82a e Ser-33. Por causa da conservação de Asp-36 e Asp-37 em todos os cinco domínios ligantes de IgG de Proteína A, estes resíduos foram selecionados para mutagênese.

[000288] Os sítios de SpA-D responsáveis pela ligação de Fab são estruturalmente separados da superfície do domínio que medeia a ligação de Fcy. A interação de Fcy com o domínio B envolve principalmente resíduos na hélice I com menor envolvimento da hélice II (Deisenhofer 1981; Gouda et al., 1992). Com a exceção de Gln-32, um contato menor em ambos complexos, nenhum dos resíduos que medeiam a interação de Fcy está envolvido na ligação de Fab. Para examinar a relação espacial entre estes diferentes sítios de ligação de Ig, os domínios de SpA nestes complexos foram superpostos para construir um modelo de um complexo entre Fab, o domínio D de SpA, e a molécula de Fcy. Neste modelo ternário, Fab e Fcy formam um sanduíche ao redor das faces opostas da hélice helix II sem evidência de impedimento estérico de qualquer interação. Estas descobertas ilustram como, apesar do seu tamanho pequeno (isto é, 56-61 aa), um domínio de SpA pode exibir simultaneamente ambas atividades, explicando a evidência experimental que as interações de Fab com um domínio individual são não competitivas. Os resíduos para interação entre SpA-D e Fcy são Gln-9 e Gln-10.

[000289] Em contraste, a ocupação da parte Fc de IgG no domínio D bloqueia sua interação com vWF A1 e provavelmente também TNFR1 (O'Seaghdha et al., 2006). As mutações em resíduos essenciais para a ligação de IgG Fc (F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31 and K35) também são necessárias para a ligação de vWF A1 e TNFR1 (Cedergren et al., 1993; Gómez et al., 2006; O'Seaghdha et al. 2006), enquanto que os resíduos críticos para a interação de VH3 (Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, E47) não têm qualquer impacto sobre as atividades de ligação deIgG Fc, vWF A1 ou TNFR1 (Jansson et al., 1998; Graille et al., 2000). A atividade da ligação de da imunoglobulina da Proteína A assesta um subconjunto de células B que expressam IgM relacionada à família de VH3 sobre sua superfície, isto é, estas moléculas funcionam como receptores de células B do tipo VH3 (Roben et al., 1995). Depois da interação com SpA, estas células B proliferam rapidamente e depois cometem apoptose, levando à deleção preferencial e prolongada de linfócitos B semelhantes e inatas (isto é, células B da zona marginal e células B2 foliculares) (Goodyear e Silverman 2003; Goodyear e Silverman 2004). É importante assinalar que mais do que 40% das células B circulantes são assestados pela interação da Proteína A e a família VH3 representa a maior família de receptores de células B humanas para conferir respostas humorais protetoras contra patógenos (Goodyear e Silverman 2003; Goodyear e Silverman 2004). Assim sendo, a Proteína A funciona de forma análoga aos superantígenos estafilocócicos (Roben et al., 1995), embora essa última classe de moléculas, por exemplo SEB, TSST-1, TSST-2, formem complexos com o receptor de células T para estimular inadequadamente respostas imunes do hospedeiro e desta forma precipitar apectos característicos da doença de infecções estafilocócicas (Roben et al., 1995; Tiedemann et al., 1995). Em conjunto estas descobertas documentam as contribuições da Proteína A em estabelecer infecções estafilocócicas e modular respostas imunes do hospedeiro.

Variante de Proteína A Não toxigênica

[000290] Os inventores desenvolveram uma variante não toxigênica de Proteína A estafilocócica e, com este reagente à disposição, almejaram pela primeira vez medir a resposta imune de animais à imunização de Proteína A. Além disso, os inventores se dedicaram a descobrir se a imunização de animais com uma variante não toxigênica de Proteína A poderia gerar respostas imunes que criam munidade protetora contra infecção estafilocócica.

[000291] Para perturbar as atividades da ligação de IgG Fc, vWF A1 e TNFR1 de Proteína A, os resíduos de glutamina (Q) 9 e 10 [a numeração neste caso é derivada daquela estabelecida para o domínio D de SpA] foram modificados gerando substituições de lisina ou glicina no lugar de ambas glutaminas com a expectativa que estas substituições abolem as ligações iônicas formadas entre a Proteína A do tipo selvagem e seus ligantes. O efeito somado das substituições duplas por lisina pode ser que esses resíduos positivamente carregados instituem uma carga repelente para imunoglobulinas. Para perturbar a ligação de IgM Fab VH3, os inventores selecionaram os resíduos de aspartato (D) 36 e 37 de SpA-D, cada um dos quais é necessário para a associação de Proteína A com o receptor de células B. D36 e D37 foram ambos substituídos por alanina. As mutações Q9,10K e D36,37A foram combinadas na molécula recombinante SpA-DQ9,10K;D36,37A e examinadas quanto aos atributos de ligação de Proteína A.

[000292] Resumidamente, a sequência genômica de Proteína A (spa) de Staphylococcus aureus N315 foi amplificada por PCR com os iniciadores (GCTGCACATATGGCGCAACACGATGAAGCTCAAC [5’iniciador](SEQ ID NO:35) e AGTGGATCCTTATGCTTTGTTAGCATCTGC [3’ iniciador] (SEQ ID NO:36)), clonada no vetor pET15b (pYSJ1, códons 48-486) (Stranger- Jones, et al., 2006) e plasmídeo recombinante transformado em E. coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990). O produto de Proteína A derivado a partir de pYSJ1 abriga os resíduos 36-265 de SpA fundidos ao marcador His do terminal N (MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:37)). Deppis da expressão induzível de IPTG, SpA recombinante marcada com His6 no terminal N foi purificada por cromatografia de afinidadena resina Ni-NTA (Stranger-Jones et al., 2006). O domínio D de SpA (SpA- D) foi amplificado por PCR com um par de iniciadores específicos (AACATATGTTCAACAAAGATCAACAAAGC [5’ iniciador](SEQ ID NO:38) e AAGGATCCAGATTCGTTTAATTTTTTAGC [3’ iniciador] (SEQ ID NO:39)), sub-clonado no vetor pET15b (pHAN1, spa códons 212-261) e plasmídeo recombinante transformado em E. coli BL21(DE3) para expressar e purificar proteína recombinante marcada com His6 no terminal N. Para gerar mutações na sequência codificadora de SpA-D, conjuntos de pares de iniciadores foram sintetizados (para substituições de D para A: CTTCATTCAAAGTCTTAAAGCCGCCCCAAGCCAAAGCACTAAC [5’ iniciador] (SEQ ID NO:40) e GTTAGTGCTTTGGCTTGGGGCGGCTTTAAGACTTTGAATGAAG [3’ iniciador] (SEQ ID NO:41); para substituições de Q para K CATATGTTCAACAAAGATAAAAAAAGCGCCTTCTATGAAATC [5’ iniciador] (SEQ ID NO:42) e GATTTCATAGAAGGCGCTTTTTTTATCTTTGTTGAACATATG [3’ iniciador] (SEQ ID NO:43); para substituições de Q para G CATATGTTCAACAAAGATGGAGGAAGCGCCTTCTATGAAATC [5’ iniciador] (SEQ ID NO:44) e GATTTCATAGAAGGCGCTTCCTCCATCTTTGTTGAACATATG' [3’ iniciador] (SEQ ID NO:45). Os iniciadores foram usados para protocolos de mutagênese de mudança rápida. Depois da mutagênese, as sequências de DNA foram confirmadas para cada uma das proteínas recombinantes: SpA, SpA-D e SpA-DQ9,10G;D36,37A e SpA-DQ9,10K;D36,37A. Todas as proteínas foram purificadas a partir de lisados de E. coli recombinante, usando cromatografia de Ni-NTA e subsequentemente dialisadas contra PBS e estocadas a 4°C.

[000293] Para medir a ligação de imunoglobulina à Proteína A e suas variantes, 200 μg de proteína purificada foram diluídos em um volume de 1 mL usando tampão de coluna (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e depois carrégados em uma coluna de Ni-NTA pré-equilibrada (volume do leito de 1 mL). As colunas foram lavadas com 10 mL de tampão de coluna. 200 μg de IgG humana purificada foram diluídos em um volume total de 1 mL de tampãode coluna e depois aplicados a cada uma das colunas carregada com Proteína A e suas variantes. As colunas foram subsequentemente lavadas com 5 mL de tampão de lavagem (imidazol 10 mM em tampão de coluna) e 5 mL de tampão de coluna. Amostras da proteína foram eluídas com 2 mL de tampão de eluição (imidazol 500 mM em tampão de coluna), as frações foram coletadas e alíquotas foram submetidas a eletroforese em gel de SDS- PAGE, e em seguida, coloração com Azul de Coomassie. Como ilustrado na Figura 3, a Proteína A do tipo selvagem (SpA) e seu domínio D de SpA retiveram imunogobulina durante a cromatografia. Em contraste, a variante SpA-DQ9,10K;D36,37A não se ligou à imunoglobulina.

[000294] Para quantificar a ligação de Proteína A e suas variantes à parte Fc de imunoglobulina e o domínio VH3 de Fab, a imunoglobulina G humana conjugada com HRP [hIgG], a parte Fc de IgG humana [hFc] e a parte F(ab)2 de IgG humana [hF(ab)2] bemj como análises ELISA foram usadas para quantificar a quantidade relativa da ligação à Proteína A e suas variantes. Os dados na Figura 4 demonstram a ligação de SpA e SpA-D à hIgG e hFc, enquanto que SpA-DQ9,10G;D36,37A e SpA- DQ9,10K;D36,37A apresentaram apenas atividades de ligação de fundo. Quantidades similares se ligaram a SpA de hFc e hF(ab)2; entretanto, a ligação de SpA-D a hF(ab)2 foi reduzida em comparação com SpA de comprimento inteiro. Este resultado sugere que a presença de múltiplos domínios ligantes de IgG pode aumentar de forma cooperante a capacidade de a Proteína A se ligar ao receptor de células B. Quando comparada com a potência de ligação reduzida de SpA-D a hF(ab)2, das duas variantes apenas SpA-DQ9,10K;D36,37A apresentou uma redução significativa na capacidade de se ligar ao domínio VH3 de imunoglobulina. Para examinar os atributos toxigênicos de SpA-D e suas variantes, as proteínas purificadas foram injetadas em camundongos, que foram sacrificados depois de 4 horas para remover seus baços. Os tecidos dos órgãos foram homogeneizados, o material capsular foi removido e as células B foram corados com anticorpos CD19 fluorescentes. Depois da análise FACS para quantificar a abundância de células B em tecidos esplênicos, observou-se que SpA-D causou uma queda de 5% na contagem de células B em comparação com um controle simulado (PBS) (Figura 5). Em contraste, SpA-DQ9,10K;D36,37A não causou uma redução na contagem de células B, indicando que a molécula mutante tinha perdido seus atributos toxigênicos de estimular a proliferação e morte de células B (Figura 5). Em suma, substituições de aminoácidos snos resíduos de SpA-D Q9, Q10, D36, e D37 aboliram a capacidade de os domínios da Proteína A se ligarem a imunoglobulinas ou exercer funções toxigênicas em tecidos humanos e animais.

Variantes de Proteína A Não toxigênicas eliciam proteção vacínica

[000295] Para testar se a Proteína A e suas variantes podem ou não funcionar como antígenos vacínicos, SpA, SpA-D, SpA-DQ9,10K;D36,37A, e SpA-DQ9,10K;D36,37A foram emulsificadas com adjuvante de Freund completo ou incompleto e foram usadas para imunizar camundongos BALB/c com 4 semanas de idade no Dia 1 e Dia 11 com 50 μg de proteína purificada. Coortes de animais (n=5) foram analisadas quanto a respostas imunes humorais à imunização sangrando os animais antes (Dia 0) e depois do esquema de imunização (dia 21). A Tabela 5 indica que os camundongos imunizados geraram uma resposta humoral apenas escassa direcionada para a Proteína A do tipo selvagem ou seu módulo SpA-D, enquanto que a quantidade de anticorpo criada depois da imunização com SpA-DQ9,10K;D36,37A ou SpA-DQ9,10K;D36,37A foi aumentada quatro a cinco vezes. Depois do desafio intravenoso com 1 x 107 UFC de S. aureus Newman, os animais foram sacrificados no dia 4, seus rins foram removidos e analisados quanto à carga estafilocócica (plaqueando o homogeneizado tecidual sobre placas de ágar e contando as unidades formadoras de colônicas, UFC) ou histopatologia. Como esperado, os camundongos (n = 19) imunizados simuladamente (PBS) abrigaram 6,46 log10 (± 0,25) UFC no tecido renal, e as lesões infecciosas foram organizadas em 3,7 (± 1,2) abscessos por órgão (n=10) (Tabela 5). A imunização dos animais com SpA levou a uma redução de 2,51 log10 de UFC no dia 5 (P=0,0003) com 2,1 (± 1,2) abscessos por órgão. Estes últimos dados indicam que não houve redução significativa na formação de abscessos (P=0,35). A imunização com SpA-D gerou resultados similares: uma redução de 2,03 log10 de UFC no dia 5 (P=0,0001) com 1,5 (± 0,8) abscessos por órgão (P=0,15). Em contraste, a imunização com SpA-DQ9,10K;D36,37A ou SpA- DQ9,10G;D36,37A criou maior proteção, com uma redução de 3,07 log10 e 3,03 log10 UFC no dia 4, respectivamente (significância estatística P<0,0001 para ambas observações). Além disso, a imunização com SpA-DQ9,10K;D36,37A e também SpA-DQ9,10G;D36,37A gerou proteção significativa contra a formação de abscessos estafilocócicos, pois apenas 0,5 (± 0,4) e 0,8 (± 0,5) lesões infecciosas por órgão (P=0,02 e P=0,04) foram identificadas. Assim sendo, a imunização com variants da Proteína A não toxigênicas gera respostas imunes humorais aumentadas para Proteína A e proporciona imunidade protetora contra desafio estafilocócico. Estes dados indicam que a Proteína A é um candidato ideal para uma vacina humana que previne doença de S. aureus.

[000296] Estes resultados animadores têm várias implicações para o desenho de uma vacina humana. Primeiramente, a geração de mutações por substituição que afetam a capacidade de a imunoglobulina se ligar aos domínios da Proteína A, seja isoladamente ou em combinação de dois ou mais domínios, pode gerar variantes não toxigênicas apropriadas para o desenvolvimento de vacinas. Parece possível que uma combinação de domínios ligantes de IgG que se assemelham intimamente à estrutura da Proteína A pode gerar respostas imunes humorais ainda melhores como aqui relatado para o domínio D de SpA isoladamente. Além disso, um atributo possível de anticorpos específicos da Proteína A pode ser que a interação de sítios ligantes de antígenos com a superfície microbiana pode neutralizar a capacidade de os estafilococos capturarem imunoglobulinas por intermédio da sua parte Fc ou para stimular o receptor de células B por interméedio das atividades ligantes de VH3.

Modelos de proteção com vacina em abscesso murino, de infecção letal murina e de pneumonia murina.

[000297] Três modelos animais foram estabelecidos para o estudo de doença infecciosa por S. aureus. Estes modelos são aqui usados para examinar o nível de imunidade protetora proporcionada por intermédio da geração de anticorpos específicos de Proteína A.

[000298] Abscesso Murino - Camundongos BALB/c (24 dias de idade, fêmos, 8-10 camundongos por grupo, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) são imunizados por injeção intramuscular na perna traseira com proteína purificada (Chang et al., 2003; Schneewind et al., 1992). SpA, SpA-D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A purificadas (50 μg de proteína) são administradas nos dias 0 (emulsificadas 1:1 com adjuvante de Freund completo) e 11 (emulsificadas 1:1 com adjuvante de Freund incompleto). Amostras de sangue foram coletadas por sangramento retroorbital nos dias 0, 11, e 20. Os soros são examinados por ELISA quanto a titulações de IgG para atividade ligante específica de SpA-D e SpA-DQ9,10K;D36,37A. Os animais imunizados são desafiados no 21 por injeção retroorbital de 100 μL de suspensão de S. aureus Newman ou S. aureus USA300 (1 x 107 UFC). Para isto, culturas noturnas de S. aureus Newman são diluídas 1:100 em caldo tríptico de soja e desenvolvidas por 3 h a 37°C. Os estafilococos são centrifugados, lavados duas vezes, e diluídos em PBS para produzir uma A600 de 0,4 (1 x 108 UFC por mL). As diluições são verificadas experimentalmente plaqueando sobre ágar e formação de colônias. Os camundongos são anestesiados por injeção intraperitoneal de 80-120 mg de cetamina e 36 mg de xilazina por quilograma de peso corporal e receberam injeção retroorbital. No dia 5 ou 15 depois do desafio, os camundongos são sacriticados por inalação de CO2 comprimido. Os rins são removidops e homogeneizados em 1% de Triton X-100. Frações são diluídas e plaqueadas sobre meio de ágar para determinação em triplicata de UFC. Para hostologia, o tecido renal é incubado à temperatura embiente em 10% de formol por 24 h. Os tecidos são embutidos em parafina, secionados finos, corados com hematoxilinleosina, e xaminados por microscopia.

[000299] Infecção Letal Murina - Camundongos BALB/c (24 dias de idade, fêmeos, 8-10 camundontos por grupo, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) são imunizados por injeção intramuscular na perna traseira com SpA, SpA-D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A purificadas ( 50 μg de proteína). A vacina é administrada nos dias 0 (emulsificada 1:1 com adjuvante de Freund completo) e 11 (emulsificada 1:1 com adjuvante de Freund incompleto). Amostras de sangue foram coletadas por sangramento retroorbital nos dias 0, 11, e 20. Os soros são examinados por ELISA quanto às titulações de IgG com atividade ligante específica de SpA-D e SpA-DQ9,10K;D36,37A. Os animais imunizados são desafiados no dia 21 por injeção retroorbital de 100 μL de suspensão de S. aureus Newman ou S. aureus USA300 (15 x 107 UFC) (34). Para isto, culturas noturnas de S. aureus Newman são diluídas 1:100 em caldo tríptico de soja fresco e desenvolvidas por 3 h a 37°C. Os estafilococos são centrifugados, lavados duas vezes, diluídos em PBS para produzir uma A600 de 0,4 (1 x 108 UFC por mL) e concentrados. As diluições são verificadas experimentalmente plaqueando sobre ágar de formação de colônias. Os camundongos são anestesiados por injeção intraperitoneal de 80-120 mg de cetamina e 36 mg de xilazina por quilograma de peso corporal. Os animais imunizados são desafiados no dia 21 por injeção intraperitoneal com 2 x 1010 UFC de S. aureus Newman ou 3-10 x 109 UFC de isolados clínicos de S. aureus. Os animais são monitorados por 14 dias, e a doença letal é registrada.

[000300] Modelo de pneumonia murina - As cepas de S. aureus Newman ou USA300 (LAC) são desenvolvidas a 37°C em caldo tríptico de soja/ágar até uma DO660 0,5. Frações de 50-mL da cultura são centrifugadas, lavadas em PBS, e colocadas em suspensão em 750 μL de PBS para estudos de mortalidade (3-4 x 108 UFCF por volume de 30 μL), ou 1.250 μL de PBS (2 x 108 UFC por volume de 30 μL) para experimentos de carga bacteriana e histologia (2, 3). Para infecção pulmonar, camundongos C57BL/6J com 7 semanas de idade (The Jackson Laboratory) são anestesiados antes da inoculação de 30 μL de suspensão de S. aureus dentro da narina esquerda. Os animais são colocados na gaiola em uma posição supina para recuperação e observados por 14 dias. Para imunização ativa, camundongos com 4 semanas de idade recebem 20 μg de SpA-D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A em CFA no dia 0 por intermédio da via intramuscular, e em seguida, um reforço com 20 μg de SpA-D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A em adjuvante de Freund incompleto (IFA) no dia 10. Os animais são desafiados com S. aureus no dia 21. Os soros foram coletados antes da imunização e no dia 20 para avalir a produção de anticorpo específico. Para estudos de imunização passiva, camundongos com 7 semenas de idade recebem 100 μL de NRS (soro de coelho normal) ou antissoros do coelho específicos de SpA-D por intermédio de injeção intraperitoneal 24 h antes do desafio. Para avaliar os correlatos patológicos de pneumonia, os animais infectados são exterminados por intermédio de inalação forçada de CO2 antes da remoção de ambos pulmões. O pulmão direito é homogeneizado para contagem da carga bacteriana pulmonar. O pulmão esquerdo é colocado em 1% de formol e embutido em parafina, secionado fino, corado com hematoxilina-eosina, e analisado por microscopia.

[000301] Anticorpos do coelho - 200 μg de SpA-D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A purificada são usados como um imunógeno para a produção de antissoros de coelho. 200 μg de proteína são emulsificados com CFA para injeção no dia 0, e em seguida, injeções de reforço com 200 μg de proteína emulsificada com IFA nos dias 21 e 42. As titulações de anticorpo do coelho são determinadas por ELISA. Anticorpos purificados são obtidos por cromatografia de afinidade de soro do coelho em SpA-D or SpA-DQ9,10K;D36,37A Sefarose. A concentração de anticorpos eluídos é medida por absorvância a A280 e as titulações específicas do anticorpo são determinadas por ELISA.

[000302] Imunização ativa com variants do domínio D de SpA - Para determinar a eficácia da vacina, os animais são imunizados ativamente com SpA-D ou SpADQ9,10K; D36,37A purificada. Como um controle, os animaisão imunizados só com adjuvante. As titulações de anticorpo contra preparações de Proteína A são determinadas usando SpA-D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A como antígenos; note-se que a variante SpA-DQ9,10K;D36,37A não consegue se ligar à parte de Fc ou Fab de IgG. Usando modelos de doença infecciosa descritos acima, qualquer redução na carga bacteriana (abscesso e penumonia murina), evidência em histopatologia de doença estafilocócica (abscesso e pneumonia mutina) e proteção contra doença letal (desafio e pneumonia letal murina) são medidas.

[000303] Imunização passiva com anticorpos policlonais do coelho purificados por afinidade gerados contra a variante SpA- domínio D. Para determinar a imunidade protetora de anticorpos do coelho específicos de Proteína A, camundongos são imunizados passivamente com 5 mg/kg de anticorpos do coelho derivados de SpA- D ou SpA-DQ9,10K;D36,37A purificada. Ambas preparações de anticorpos são purificadas por cromatografia de afinidade usando SpA-D ou SpA- DQ9,10K;D36,37A imobilizada. Como um controle, os animais são imunizados passivamente com anticorpos rV10 (um antígeno protetor contra pestes que não tem qualquer impacto sobre o resultado de infecções estafilocócicas). As titulações de anticorpo contra todas as preparações de Proteína A são determinadas usando SpA-DQ9,10K; D36,37A como um antígeno, pois esta variante não consegue se ligar à parte Fc ou Fab de IgG. Uando os modelos de doença infecciosa descritos acima, a redução na carga bacteriana (abscesso e pneumonia murina), evidência em histopatologia de doença estafilocócica (abscesso e pneumonia murina), e proteção contra doença letal (desafio e pneumonia letal murina) são medidas.

EXEMPLO 2 VACINA DE PROTEÍNA A NÃO TOXIGÊNICA PARA INFECÇÃO POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE À METICILINA

[000304] Isolados clínicos de S. aureus expressam proteína A (Shopsin et al., 1999, cujo produto da tradução primária é constituído de um peptídeo sinalizador no terminal N (DeDent et al., 2008), cinco Ig- BDs (designados E, D, A, B e C) (Sjodahl, 1977), região X com repetições variáveis de um peptídeo de oito resíduos (Guss et al., 1984), e sinal de seleção no terminal C para a ancoragem de SpA na parede celular (Schneewind et al., 1992; Schneewind et al., 1995) (Figura 6). Guiada por homologia de aminoácidos (Uhlen et al., 1984), a estrutura com feixe de trpla hélice α de IgBDs (Deisenhofer et al., 1978;Deisenhofer et al., 1981) e suas interações atômicas com Fab VH3 (Graille et al., 2000) ou Fcy (Gouda et al., 1998), glutamina 9 e 10 foram selecionadas bem como aspartato 36 e 37 como crítico para a associação de SpA com anticorpos ou receptor de células B, respectivamente. As substituições Gln9Lys, Gln10Lys, Asp36Ala e Asp37Ala foram introduzidas no domínio D para gerar SpA-DKKAA (Figura 6). A capacidade de SpA-D ou SpA-DKKAA isolada se ligar à IgG humana foi analisada por cromatografia de afinidade (Figura 6). SpA-D marcada com poli-histidina bem como SpA de comprimento inteiro retiveram IgG humana em Ni-NTA, enquanto que SpA-DKKAA e um controle negativo (SrtA) não o fizeram (Figura 6). Um resultado similar foi observado com o fator de von Willebrand (Hartleib et al., 2000), que, junto com o receptor 1 do fator de necrose tumoral (TNFR1) (Gomez et al., 2004), também podem ser ligar à proteína A por intermédio de glutamina 9 e 10 (Figura 6). A imunoglobulina humana engloba 60-70% de igG tipo VH3. Os inventores distinguem entre domínio Fc e ativação do receptor de células B de Igs e a associação medida de fragmentos Fcy e F(ab)2 humanos, ambos ligados a SpA de comprimento inteiro ou SpA-D, mas não se ligam a SpA-DKKAA (Figura 6). A injeção de SpA-D dentro da cavidade peritoneal de camundongos resultou na expansão de células B, e em seguida, colapso apoptótico de linfócitos CD19+ no tecido do baço de camundongos BALB/c (Goodyear e Silverman, 2003) (Figura 6). A atividade do superantígeno de células B não foi observada depois da injeção com SpA-DKKAA, e coloração TUNEL do tecido esplênico deixou de detectar aumento em células apoptóticas que se segue à injeção de SpA ou SpA-D (igura 6).

[000305] Camundongos BALB/c naive com seis semanas de idade receberam injeção de 50 μg de SpA, SpA-D ou SPA-DKKAA purificada emulsificada em CFA e reforço com o mesmo antígeno emulsificado em IFA. Em concordância com a hipótese que SpA-D promove o colapso apoptótico de populações de células B clonais ativadas, os inventores observaram uma titulação dez vezes mais alta de anticorpos específicos de SpA-DKKAA depois da imunização de camundongos com a variante não toxigênica em comparação com o superantígeno de células B (Spa- D versus SpA-DKKAA P <0,0001, Tabela 6). As titulações de anticorpo por imunização com SpA de comprimento inteiro foram mais altas do que aquelas eliciadas por SpA-D (P=0,0022), o que possivelmente se deve ao tamanho maior e estrutura do do domínio reiterativo deste antígeno (Tabela 6). Contudo, mesmo SpA eliciou titulações mais baixas de anticorpo do que SpA-DKKAA (P=0,0003), que engloba apenas 50 aminoácidos de proteína A (520 resíduos, SEQ ID NO:33). O camundongos imunizados foram desafiados por inoculação intravenosa com S. aureus Newman, e capacidade de os estafilococos semearem abscessos em tecidos renais foi examinada por autopsai quatro dias depois do desafio. No tecido renal homogeneizador de camundongos imunizados similadamente (PBS/adjuvante), uma média de carga estafilocócica de 6,46 log10 UFC g-1 foi contada (Tabela 6). A imunização de camundongos com SpA ou SpA-D levou a uma redução na carga estafilocócica; entretanto, os animais vacinados com SpA-DKKAA apresentaram uma redução ainda maior, 3,07 log10 UFCF g-1 de S. aureus Newman em tecidos renais (P <0,0001, Tabela 6). A formação de abscessos nos rins foi analisada por histopatologia (Figura 7). Os animais imunizados simuladamente abrigavam uma média de 3,7 (±1,2) abscessos por rim (Tabela 6). A vacinação com SpA-DKKAA reduziu o número médio de abscessos para 0,5 (±0,4)(P= 0,0204), enquanto que a imunização com SpA ou SpA-D não causou uma redução significativa no número de lesões de abscessos (Tabela 6). As lesões de animais vacinados com SpA-DKKAA tinham um tamanho menor, com menos PMNs de infiltração e caracteristicamente careciam de populações de abscessos estafilocócicos (Cheng et al., 2009)(FIG. 7). Os abscessos em animais que teinham sido imunizados com SpA ou SpA-D apresentaram a mesma estrutura global de lesões em animais imunizados simuladamente (Figura 7).

[000306] Os inventores examinaram se a imunização com SpA-DKKAA pode proteger camundongos contra cepas de MRSA, e selecionaram o isolado de USA300 LAC para o desafio de animais (Diep et al., 2006). Esta cepa CA-MRSA altamente virulenta se dissemonou rapidamente nos Estados Unidos, causando morbidade e mortalidade humana significativa (Kennedy et al., 2008). Em comparação com os camundongos do controle com adjuvante, os animais imunizados com SpA-DKKAA abrigaram uma redução de 1,07 log10 UFC g-1 na carga bacteriana de tecidos renais infectados. O exame de histopatologia do tecido renal depois do desafio com S. aureus USA300 revelou que o número médio de abscessos foi reduzido de 4,04 (±0,8) para 1,6 (±0,6) (P=0,02774). Em contraste, a imunização com SpA ou SpA-D não causou uma redução significativa na carga bacteriana ou formação de abscessos (Tabela 6).

[000307] Coelhos foram imunizados com SpA-DKKAA e anticorpos específicos foram purificados em coluna de afiidade de SpA-DKKAA, e em seguida, por SDS-PAGE (Figura 8). IgG específica de SpA-DKKAA foi clivada com pepsina para gerar fragmentos Fcy e F(ab)2, e estes últimos foram purificados por cromatografia em coluna de SpA-DKKAA (Figura 8). A ligação de IgG ou vWF humana a SpA ou SpA-D foi perturbada por F(ab)2 específico de SpA-DKKAA, indicando que anticorpos derivados de SpA-DKKAA neutralizam função do siperatígeno de células B de proteína A bem como suas interações com Ig (Figura 8).

[000308] Para melhorar ainda mais as propriedades da vacina para proteína A não toxigênica, os inventores geraram SpAKKAA, que inclui todos os cinco IgBDs com quatro substituições de aminoácidos - substituições correspondentes a Gln9Lys, Gln10Lys, Asp36Ala e Asp37Ala do domínio D - em cada um dos seus cinco domínios (E, D, A, B e C). SpAKKAA marcada com poli-histidina foi purificada por cromatografia de afinidade e analisada por SDS-PAGE corado com Azul de Coomassie (Figura 9). Diferentemente de SpA de comprimento inteiro, SpAKKAA não se ligou a IgG, Fc and F(ab)2 ou vWF humana (Figura 9). SpAKKAA deixou de apresentar atividade do superantígeno de células B, pois a injeção da variante em camundongos BALB/c não causou uma depleção de células B CD19+ no tecido esplênico (Figura 9). A vacinação com SpAKKAA gerou titulações de anticorpo específico mais altas do que a imunização com SpA-DKKAA e produziu camundongos com elevada proteção contra desafio com S. aureus USA300 (Tabela 6). Quatro dias depois do desafio, os animais vacinados com SpAKKAA abrigavam 3,54 log10 UFC g-1 menos estafilococos em tecidos renais (P =0,0001) e causou também uma redução maior no número de lesões de abscessos (P=0,0109) (Tabela 6).

[000309] SpAKKAA foi usada para imunizar coelhos. Anticorpos leporídeos específicos para SpA-DKKAA ou SpAKKAA foram purificados por afinidade em matrizes com antígeno cognato imobilizado e injetados em uma concentração de 5 mg kg-1 de peso corporal dentro da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c (Tabela 7). Vinte e quatro horas depois, as titulações de anticorpo específico foram determinadas no soro e os animais foram desafiados por inoculação intravenosa com S. aureus Newman. A transferência passiva reduziu a carga estafilocócica em tecidos renais para anticorpos específicos de SpA-DKKAA (P=0,0016) ou SpAKKAA (P=0,0005). No exame de histopatologia, ambos anticorpos reduziram a abundância de lesões de abscessos nos rins de camundongos desafiados com S. aureus Newman (Tabela 7). Em conjunto estes dados revelam que a proteção da vacina depois da imunização com SpA-DKKAA ou SpAKKAA é conferida por anticorpos que neutralizam a proteína A. Tabela 6. Imunização de camundongos com vacinas para proteína A.

Tabela 7. Imunização passiva de camundongos com anticorpos contra proteína A.

[000310] Depois da infecção com S. aureus virulenta, os camundongos não desenvolveram imunidade protetora contra infecção subsequente com a mêsma cepa (Burts et al., 2008) (Figura 10). A abundâncoa media de IgG específica de SpA-DKKAA nestes animais doi determinada por dot blot como 0,20 μg mL—1 (±0,04) e 0,14 μg mL-1 (±0,01) para as cepas Newman e USA300 LAC, respectivamente (Figura 9). A concentração mínima de IgG específica de proteína A, necessária para proteção contra doença em animais vacinados com SpAKKAA ou SpA-DKKAA (P .0,05 log10 redução na carga estafilocócica UFC g-1 no tecido renal) foi calculada como 4,05 μg mL-1 (± 0,88). A concentração sérica media de IgG específica de SpA em volutários humanos adultos sadios (n=16) era 0,21 μg mL-1 (± 0,02). Assim sendo, as infecções por S. aureus em camundongos ou seres humanos não estão associadas a respostas imunes que geram níveis significativos de anticorpos neutralizadores direcionados contra proteína A, o que possivelmente se deve aos atributos de superantígeno de células B desta molécula. Em contraste, a concentração sérica media de IgG específica para toxina de difteria em voluntários humanos, 0,068 μg mL- 1 (± 0,20), estava dentro dafaixa para imunidade protetora contra difteria (Behring, 1890; Lagergard et al., 1992).

[000311] Isolados clínicos de S. aureus expressam proteína A, um fator de virulência essencial cuja atividade de superantígenos de células B e atributos evasivos contra depuração opsonofagocítica são absolutamente necessárias para a formação de abscessos estafilocócicos (Palmqvist et al., 2005; Cheng et al., 2009; Silverman e Goodyear, 2006). A Proteína A pode assim ser considerada como uma toxina, essencial para a patogênese, cujos atributos moleculares devem ser neutralizados para conseguir imunidade protetora. Gerando variantes não toxigênicas incapazes de se ligar a Igs por intermédio dos domínios via Fcy ou VH3-Fab, os inventores medem pela primeira vez as respostas imunes neutralizadoras de proteína A como um correlato para imunidade protetora contra infecção por S. aureus. Em contraste com muitas cepas sensíveis à meticilina, o isolado CA-MRSA de USA300 LAC é significativamente mais virulento (Cheng et al., 2009). Por exemplo, a imunização de cobaias com a proteína superficial IsdB (Kuklin et al., 2006; Stranger-Jones et al., 2006) gera anticorpos que conferem proteção contra S. aureus Newman (Stranger-Jones et al., 2009), mas não contra desafio com USA300. Os métodos utilizados incluem:

[000312] Cepas bacterianas e crescimento. Cepas de Staphylococcus aureus Newman e USA300 foram desenvolvidas em caldo tríptico de soja (TSB) a 37°C. Cepas de Escherichia coli DH5α e BL21 (DE3) foram desenvolvidas em calldo de Luria-Bertani (LB) com 100 μg mL-1 de ampicilina a 37 °C.

[000313] Anticorpos do Coelho. A sequência codificadora para SpA foi amplificada por PCR com dois iniciadores,gctgcacatatggcgcaacacgatgaagctcaac (SEQ ID NO:35) e agtggatccttatgcttgagctttgttagcatctgc (SEQ ID NO:36) usando DNA modelo de S. aureus Newman. SpA-D foi amplificada por PCR com dois iniciadores, aacatatgttcaacaaagatcaacaaagc (SEQ ID NO:38) e aaggatccagattcgtttaattttttagc (SEQ ID NO:39). A sequência para SpA- DKKAA foi mutagenizada com dois conjuntos de iniciadores, catatgttcaacaaagataaaaaaagcgccttctatgaaatc (SEQ ID NO:42) e gatttcatagaaggcgctttttttatctttgttgaacatatg (SEQ ID NO:43) para Q9K, Q10K, bem como cttcattcaaagtcttaaagccgccccaagccaaagcactaac (SEQ ID NO:40) e gttagtgctttggcttggggcggctttaagactttgaatgaag (SEQ ID NO:41) para D36A,D37A. A sequência de SpAKKAA foi sintetizada por Integrated DNA Technologies, Inc. Os produtos da PCR foram clonados em pET-15b gerando proteína recombinante marcada com His6 no terminal N. Plasmídeos foram transformados em BL21(DE3). Culturas noturnas de transformantes foram diluídas 1:100 em meio fresco e desenvolvidas a 37°C até uma DO600 0,5, e neste ponto as culturas foram induzidas com isopropil β-D-1-tiogalatopiranosideo (IPTG) 1 mM e desenvolvidas por mais três horas. As células bacterianas foram sedimentadas por centrifugação, colocadas e suspensão em tampão de coluna (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) e rompidas com uma célula de pressão French a 953 atm (14.000 psi). Os lisados foram retirados da membrana e os componentes insolúveis por ultracentrifugação a 40.000 xg. As proteínas no lisado solúvel foram submetidas a uma cromatografia de afinidade com níquel/ácido nitriloacético (Ni-NTA, Qiagen). As proteínas foram eluídas em tampão de coluna contendo concentrações sucessivamente mais altas de imidazol (100-500 mM). As concentrações de proteínas foram determinadas por análise com ácido bicincônico (BCA) (Thermo Scientific). Para geração de anticorpo, coelhos (6 meses de idade, raça Nova Zelândia, brancos, fêmeos, Charles River Laboratories) foram imunizados com 500 μg de proteína emulsificada em Adjuvante de Freund Completo (Difco) injeção subscapular. Para imunizações de reforço, proteínas emulsificadas em Adjuvante de Freund Incompleto e injeção 24 ou 48 dias depois da imunização inicial. No dia 60, os coelhos foram sangrados e o soro foi coletado.

[000314] Antígeno purificado (5 mg de proteína) foi ligado de forma covalente a colunas HP ativadas com HiTrap NHS (GE Healthcare). Antígeno acoplado a uma matriz foi usado para cromatografia de afinidade de 10-20 mL de soro de coelho a 4°C. A matriz carregada foi lavada com 50 volumes da coluna de PBS, os anticorpos foram eluídos com tampão de eluição (glicina 1 M, pH 2,5, NaCl 0,5 M) e neutralizados imediatamente com Tris-HCl 1 M, pH 8,5. Os anticorpos purificados foram dialisados durante a noite inteira contra PBS a 4°C.

[000315] Fragmentos F(ab)2. Os anticorpos purificados por afinidade foram misturados com 3 mg de pepsina a 37 i°C por 30 minutos. A reação foi extinguida com Tris-HCl 1 M, pH 8,5, e os fragmentos F(ab)2 foram purificados por afinidade com colunas HP ativadas com HiTrap NHS- conjugado com antígeno específico. Os anticorpos purificados foram dialisados de um dia para o outro contra PBS a 4°C, carregados sobre gel de SDS-PAGE e visualizados com coloração de Azul de Coomassie.

[000316] Imunização ativa e passiva. Camundongos BALB/c (3 semanas de idade, fêmeos, Charles River Laboratories) foram imunizados com 50 μg de proteína emulsificada em Adjuvante de Freund Completo (Difco) por injeção intramuscular. Para imunizações de reforço, as proteínas foram emulsificadas em Adjuvante de Freund Incompleto e injeção 11 dias depois da imunização inicial. B No 20 depois da imunização, 5 camundongos foram sangrados para obter os soros para titulações de anticorpo específico por análise imunoabsorvente ligada a enzima (ELISA).

[000317] Os anticorpos purificados por afinidade em PBS foram injetados em uma concentração de 5 mg kg-1 de peso corporal do animal dentro da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c (6 semanas de idade, fêmeos, Charles River Laboratories) 24 horas antes do desafio com S. aureus. O sangue dos animais foi coletado por intermédio de punção da veia periorbital. As células sanguíneas foram removidas com tubos capilares micro-hematócritos heparinizados (Fisher), e microtubos de separação Z-gel (Sarstedt) foram usados para coletar e medir titulações de anticorpo específico de antígeno por ELISA.

[000318] Abscesso renal do camundongo. Culturas noturnas de S. aureus Newman ou USA300 (LAC) foram diluídas 1:100 em TSB fresco e desenvolvidas por 2 horas a 37°C. Os estafilococos foram sedimentados, lavados e colocados em suspensão em PBS em um DO600 de 0,4 (~1 x 108 UFC mL-1). Os inóculos foram quantificados espalhando frações da amostra sobre TSA e contando as colônias formadas. Camundongos BALB/c (6 semanas de idade, fêmeos, Charles River Laboratories) foram anestesiados por intermédio de injeção intraperitoneal com 100 mg de cetamina e 20 mg ml-1 de xilazina por quilograma de peso corporal. Os camundongos foram infectados por injeção retro-orbital com 1 x 107 UFC de S. aureus Newman ou 5 x 106 UFC de S. aureus USA300. No dia 4 depois do desafio, os camundongos foram sacrificados por inalação de CO2. Ambos rins foram removidos, e a carga estafilocócica em um órgão foi analisada homogeneizando o tecido renal com PBS, 1% de Triton X-100. Diluições seriais do homogeneizador foram espalhadas sobre TSA e incubadas para a formação de colônias. O órgão remanescente foi examinado por histopatologia. Resumidamente, os rins foram fixados em 10% de formol por 24 horas à temperatura ambiente. Os tecidos foram ebutidos em parafina, secionados finos, corados com hematoxilina-eosina, e inspecionados por microscopia luminosa para contar as lesões de abscessos. Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as orientações institucionais segundo a revisão do protocolo experimental e aprovação pelo Institutional Biosafety Committee (IBC) e pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Universidade de Chicago.

[000319] Ligação de Proteína A. Para ligação de IgG humana, colunas de afimidade com Ni-NTA foram pré-carregadas com 200 μg de proteínas purificadas (SpA, SpA-D, SpA-DKKAA, e SrtA) em tampão de coluna. Depois de lavar, 200 μg de IgG humana (Sigma) foram carregados na coluna. Amostras de proteínas foram coletadas das lavagens e eluições, e submetidas a eletroforese em gel de SDS-PAGE, e em seguida, coloração com Azul de Coomassie. As proteínas purificadas (SpA, SpAKKAA, SpA-D e SpA-DKKAA) foram aolicadas como revestimento sobre placas MaxiSorp ELISA (NUNC) em tampão de carbonato 0,1 M (pH 9,5) em uma concentração de 1 μg ml-1 durante a noite inteira a 4°C. As placas foram em seguida bloqueadas com 5% de leite integral, e em seguida, incubação com diluições seriais de IgG humana conjugada com peroxidase, fragmentos Fc ou F(ab)2 por uma hora. As placas foram lavadas e reveladas usando reagentes OptEIA ELISA (BD). As reações foram extinguidas com ácido fosfórico 1 M, e as leituras em A450 foram usadas para calcular a titulação meia máxima e a ligação percentual.

[000320] Ensaios de ligação do fator de von Willebrand (vWF). As proteínas purificadas (SpA, SpAKKAA, SpA D e SpA-DKKAA) foram revestidas e bloqueadas como descrito acima. As placas foram incubadas com vWF humano em uma concentração de 1 μg mL-1 por duas horas, e depois lavadas e bloqueadas com IgG humana por mais uma hora. Depois de lavar, as placas foram incubadas com diluição serial de anticorpo conjugado com peroxidase e direcionado contra vWF humano por uma hora. As placas foram lavadas e reveladas usando reagentes OptEIA ELISA (BD). As reações foram extinguidas com ácido fosfórico 1 M, leituras em A450 foram usadas para calcular a titulação meia máxima e ligação percentual. Para ensaios de ligação, as placas foram incubadas com fragmentos F(ab)2 purificados por afinidade específicos para SpA-DKKAA em uma concentração de 10 μg ml-1 por uma hora antes de ensaios de ligação de ligantes.

[000321] Apoptose de esplenócitos. Proteínas purificadas por afinidade (150 μg de SpA, SpA-D, SPAKKAA, e SPA-DKKAA) foram injetadas dentro da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c (6 semanas de idade, fêmeos, Charles River Laboratories). Quatro horas depois da injeção, os animais foram sacrificados por inalação de CO2. Seus baços foram removidos e homogeneizados. Detritos celulares foram removidos usando filtro de células e as células em suspensão foram transferidas para tampão de lise ACK (NH4Cl 0,15 M, 10 mM KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM) para lisar eritrócitos. Os leucócitos foram sedimentados por centrifugação, colocados em suspensão em PBS e corados com anticorpo monoclonal anti-CD19 conjugado com R-PE diluído 1:250 (Invitrogen) sobre gelo e no escuro por uma hora. As células foram lavadas com 1% de FBS e fixadas com 4% de formol durante a noite inteira a 4°C. No dia seguinte, as células foram diluídas em PBS e analisadas por citometria de fluxo. O órgão remanescente foi examinado por histopatologia. Resumidamente, os baços foram fixados em 10% de formol por 24 horas à temperatura ambiente. Os tecidos foram embutidos em parafina, secionados finos, corados com o kit de detecção de apoptose (Millipore), e inspecionados por microscopia luminosa.

[000322] Quantificação de anticorpos. Os soros foram coletados de voluntaries humanos sadios ou camundongos BALB/c que teinham sido infectados com S. aureus Newman ou USA300 por 30 dias ourque tinham sido imunizados com SpA-DKKAA/ SpAKKAA como descrito. IgG humana/murina (Jackson Immunology Laboratory), SpAKKAA, e CRM197 foram pingadas sobre membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite integral, e em seguida, incubação com soros humano ou do camundongo. IgG anti-huamana/murina purificada por afinidade conjugada com IRDye 700DX (Rockland) foi usada para quantificar as intensidades de sinais usando o sistema de reprodução de imagens infravermelho OdysseyTM (Li-cor). Os experimentos com sangue de voluntários humanos envolveram protocolos que foram revisados, aprovados e realizados sob supervisão controladora do The University of Chicago’s Institutional Review Board (IRB).

[000323] Análise estatística. Dois testes t de Student foram realizados para analisar a significância estatística de abscessos renais, ELISA, e dados do superantígeno de células B.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[000324] As referências que se seguem, até o grau em que elas fornecem detalhes de procedimentos exemplificativos e outros detalhes suplementares àqueles aqui enunciados, são aqui especificamente incorporados como referência. 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Claims (11)

1. Polipeptídeo imunogênico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variante da proteína A (SpA) tendo (a) duas substituições de aminoácidos que interrompem a ligação ao FC e (b) duas substituições de aminoácidos que interrompem a ligação ao VH3, em que para (a) a variante SpA compreende uma substituição de resíduo de glicina em cada uma das posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 9 e 10 da SEQ ID NO: 2 e para (b) a variante SpA compreende uma substituição de resíduo de serina em cada uma das posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 36 e 37 da SEQ ID NO: 2.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (i) uma ou mais variantes de um domínio SpA E, domínio A, domínio B ou domínio C; (ii) dois ou mais segmentos do domínio D; ou (iii) um segmento não proteico A, preferencialmente um segundo segmento antigênico; em que o segundo segmento de antígeno é opcionalmente um segmento de antígeno estafilocócico, preferencialmente, um Emp, EsxA, EsxB, EsaC, Cap, Ebh, EsaB, Coa, vWbp, vWh, Ha, SdrC, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB, IsdC, CYA, C fB e / ou segmento SasF.

3. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo recombinante, como definido na reivindicação 1 ou 2, em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda: a. pelo menos um segundo antígeno estafilocócico; preferencialmente em que o segundo antígeno é selecionado dentre Esag, E-mp, ESXA, ESX8, Esac, E-ap, Ebh, coa, VWbP, VWh, Hia, Sdrc, scYD, SdrE, Peptídeo ISdA, SdB, ISdC, CIfA, cra e/ou SasF; ou b. um adjuvante, preferencialmente em que a variante SpA é acoplada a um adjuvante.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polissacarídeo ou oligossacarídeo PIA: ou um polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular tipo V e/ou tipo Vlll de S. aureus.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que um polissacarídeo capsular estafilocócico é conjugado a um transportador de proteína, de preferência, em que o transportador de proteína é selecionado do grupo que consiste em toxóide tetânico, toxóide difteria, CRM 197, proteína D de Haemophillus influenzae, pneumolisina e toxóide alfa.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que a referida composição é uma vacina.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição é utilizada para induzir uma resposta imune contra uma bactéria Staphylococcus em um indivíduo.

10. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imune contra uma bactéria estafilococos em um indivíduo.

11. Composição de acordo com a reivindicação 9 ou uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: a. a composição compreende um adjuvante; b. a bactéria staphylococcus é uma bactéria S. aureus; c. a bactéria estafilococo é resistente a um ou mais tratamentos, preferencialmente em que a bactéria estafilococo é resistente à meticilina; d. a composição é formulada para administração por via oral, parentérica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa; e. em que a composição compreende uma bactéria não- estafilocócica recombinante que expressa a variante SpA, de preferência em que a bactéria não-estafilococo recombinante é uma Salmonella; f. o sujeito é um mamífero, de preferência um humano; g. a resposta imune é uma resposta imune protetora; ou h. o sujeito tem, é suspeito de ter ou está em risco de desenvolver uma infecção estafilocócica; de preferência em que o indivíduo é diagnosticado com uma infecção estafilocócica persistente.

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