CN103037885A - 与蛋白A（SpA）变体相关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防细菌感染，尤其是葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌感染的方法和组合物。本发明提供了用于刺激针对细菌的免疫应答的方法和组合物。在某些实施方案中，所述方法和组合物涉及非产毒蛋白A(SpA)变体。

Description

与蛋白A(SpA)变体相关的组合物和方法
发明背景
本申请要求2010年7月2日提交的美国临时专利申请序列号61/361,218和2010年8月4日提交的美国临时专利申请序列号61/370,725的优先权，其整体通过引用并入本文。
本发明在美国国立卫生研究院资助的AI057153、AI052474和GM007281的政府支持下完成。政府享有本发明的一些权利。
I.发明领域
本发明一般性地涉及免疫学、微生物学和病理学领域。更特别地，本发明涉及与细菌蛋白A变体相关的方法和组合物，它们可用于引发针对细菌的免疫应答。
II.背景技术
近年来，社区获得性感染和医院获得性感染两者的数量随着血管内装置使用的增加而增加。医院获得性(医院内)感染是发病率和死亡率的一个主要原因，特别是在美国每年影响超过两百万名患者。最常见的感染是尿路感染(33％的感染)，其后是肺炎(15.5％)、手术部位感染(14.8％)和原发性血流感染(13％)(Emorl和Gaynes，1993)。
主要的医院内病原体包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、凝固酶阴性葡萄球菌(主要为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis))、肠球菌属(enterococcus spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。虽然这些病原体导致的感染数目大致相同，但是它们可引起的疾病的严重程度与抗生素抗性分离株的出现频率一起使得金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌被列为最重要的医院内病原体。
通过产生毒素或侵染，葡萄球菌可以在人和其他动物中引起多种疾病。葡萄球菌毒素还是食物中毒的常见原因，因为该细菌可在保存不当的食物中生长。
表皮葡萄球菌是正常皮肤的共生菌，也是导致受损医疗装置感染和手术部位感染的重要条件性病原菌。表皮葡萄球菌感染的医疗装置包括心脏起搏器、脑脊液分流器、持续性不卧床式腹膜透析导管、整形外科装置和人工心脏瓣膜。
金黄色葡萄球菌是具有高发病率和死亡率的医院内感染的最常见原因。它是骨髓炎、心内膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、脓肿和中毒性休克综合征一些病例的原因。金黄色葡萄球菌可以在干燥表面存活，这增加传播的机会。任何金黄色葡萄球菌感染可引起葡萄球菌烫伤样皮肤综合征(staphylococcal scalded skin syndrome)，这是对吸收到血流中的外毒素的皮肤反应。它还可以导致可危及生命的称为脓毒症的一类败血症。成问题的是，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)已成为医院获得性感染的主要原因。
通常用抗生素治疗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，其中青霉素是首选药物，而万古霉素用于耐甲氧西林分离株。针对抗生素显示广谱耐药性的葡萄球菌菌株的比例已经越来越高，对有效的抗微生物治疗构成威胁。此外，最近耐万古霉素金黄色葡萄球菌菌株的出现引起对MRSA菌株出现并传播却没有有效疗法的担心。
对葡萄球菌感染的抗生素治疗的替代方法正在研究之中，其使用靶向葡萄球菌抗原的抗体。该疗法包括施用多克隆抗血清(WO00/15238，WO00/12132)或用抗脂磷壁酸的单克隆抗体治疗(WO98/57994)。
一种替代方法是用主动接种产生针对葡萄球菌的免疫应答。已对金黄色葡萄球菌的基因组进行测序并确定了许多编码序列(WO02/094868，EP0786519)，这可导致鉴定到潜在抗原。对表皮葡萄球菌也是如此(WO01/34809)。作为对该方法的改进，其他人已经鉴定出被葡萄球菌感染患者的超免疫血清识别的蛋白质(WO01/98499，WO02/059148)。
金黄色葡萄球菌向细胞外环境分泌大量的毒力因子(Archer，1998；Dinges等，2000；Foster，2005；Shaw等，2004；Sibbald等，2006)。如同大多数分泌蛋白，这些毒力因子通过Sec机制穿过细胞质膜转运。通过Sec机制分泌的蛋白具有N端前导肽，一旦前体蛋白被Sec易位子捕获，该前导肽则被前导肽酶去除(Dalbey和Wickner，1985；van Wely等，2001)。最近的基因组分析表明，放线菌和厚壁菌(Firmicutes)的成员编码以Sec非依赖性的方式识别蛋白质亚类型的其他分泌系统(Pallen，2002)。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的ESAT-6(早期分泌性抗原靶标(early secreted antigen target)6kDa)和CFP-10(培养滤液抗原(culturefiltrate antigen)10kDa)是在结核分枝杆菌中称为ESX-1或Snm的这种新分泌系统的第一底物(Andersen等，1995；Hsu等，2003；Pym等，2003；Stanley等，2003)。在金黄色葡萄球菌中，两个ESAT-6样因子(称为EsxA和EsxB)通过Ess途径(ESAT-6分泌系统，ESAT-6 secretion system)分泌(Burts等，2005)。
靶向金黄色葡萄球菌或其产生的胞外蛋白的第一代疫苗获得了有限的成功(Lee，1996)。仍需要开发针对葡萄球菌感染的有效疫苗。还需要治疗葡萄球菌感染的其他组合物。
发明概述
蛋白A(SpA)(SEQ ID NO：33)是金黄色葡萄球菌的细胞壁锚定的表面蛋白，它使细菌逃避固有和适应性免疫应答。蛋白A结合免疫球蛋白的Fc部分，与B细胞受体VH3结构域相互作用从而不正常地刺激B细胞增殖和凋亡，与von Willebrand因子A1结构域结合来激活细胞内凝集(intracellular clotting)，并且还结合TNF受体-1从而导致葡萄球菌性肺炎的发病。由于蛋白A捕获免疫球蛋白并显示毒性特征，该表面分子可作为人疫苗发挥功能的可能未被仔细研究。在本文中，本发明人证明，不能结合免疫球蛋白从而去除其产毒潜力的(即非产毒的)蛋白A变体刺激针对葡萄球菌疾病进行保护的体液免疫应答。
在某些实施方案中，所述SpA变体是包含变体A、B、C、D和/或E结构域的全长SpA变体。在某些方面，所述SpA变体包含与SEQ IDNO：34的氨基酸序列有80、90、95、98、99或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一些实施方案中，所述SpA变体包含SpA的区段。所述SpA的区段可包含至少或至多1、2、3、4、5个或更多个IgG结合结构域。所述IgG结构域可以是至少或至多1、2、3、4、5个或更多个变体A、B、C、D或E结构域。在某些方面，所述SpA变体包含至少或至多1、2、3、4、5个或更多个变体A结构域。在另一方面，所述SpA变体包含至少或至多1、2、3、4、5个或更多个变体B结构域。在又一方面，所述SpA变体包含至少或至多1、2、3、4、5个或更多个变体C结构域。在另一方面，所述SpA变体包含至少或至多1、2、3、4、5个或更多个变体D结构域。在某些方面，所述SpA变体包含至少或至多1、2、3、4、5个或更多个变体E结构域。在另一方面，所述SpA变体包含以多种组合和排列的结构域A、B、C、D和E的组合。所述组合可包含全部或部分的SpA信号肽区段、SpA区域X区段和/或SpA分选信号区段。在另一些方面，SpA变体不包含SpA信号肽区段、SpA区域X区段和/或SpA分选信号区段。在某些方面，变体A结构域包含SEQ ID NO：4的第7、8、34和/或35位的替换。在另一方面，变体B结构域包含SEQID NO：6的第7、8、34和/或35位的替换。在又一方面，变体C结构域包含SEQ ID NO：5的第7、8、34和/或35位的替换。在某些方面，变体D结构域包含SEQ ID NO：2的第9、10、36和/或37位的替换。在另一方面，变体E结构域包含SEQ ID NO：3的第6、7、33和/或34位的替换。
在某些方面，SpA结构域D变体或其等同物可包含SEQ ID NO：2以下位的突变：第9和36位；第9和37位；第9和10位；第36和37位；第10和36位；第10和37位；第9、36和37位；第10、36和37位；第9、10和36位；或第9、10和37位。在另一方面，类似的突变可包括在一个或更多个结构域A、B、C或E中。
在另一些方面，SEQ ID NO：2的第9位的氨基酸谷氨酰胺(Q)(或其他SpA结构域中的其类比氨基酸)可被替换为以下氨基酸：丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第9位的谷氨酰胺可被替换为精氨酸(R)。在另一方面，SEQ ID NO：2的第9位的谷氨酰胺或其等同物可被替换为赖氨酸或甘氨酸。可明确地排除替换中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
在另一方面，SEQ ID NO：2的第10位的氨基酸谷氨酰胺(Q)(或其他SpA结构域中的其类比氨基酸)可被替换为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第10位的谷氨酰胺可被替换为精氨酸(R)。在另一方面，SEQ ID NO：2中第10位的谷氨酰胺或其等同物可被替换为赖氨酸或甘氨酸。可明确地排除替换中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
在某些方面，SEQ ID NO：2的第36位的天冬氨酸(D)(或其他SpA结构域中的其类比氨基酸)可被替换为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第36位的天冬氨酸可被替换为谷氨酸(E)。在另一方面，SEQ ID NO：2的第36位的天冬氨酸或其等同物可被替换为丙氨酸或丝氨酸。可明确地排除替换中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
在另一方面，SEQ ID NO：2的第37位的天冬氨酸(D)(或其他SpA结构域中的其类比氨基酸)可被替换为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第37位的天冬氨酸可被替换为谷氨酸(E)。在另一方面，SEQ ID NO：2的第37位的天冬氨酸或其等同物可被替换为丙氨酸或丝氨酸。可明确地排除替换中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
在一个具体实施方案中，SEQ ID NO：2的第9位的氨基(或另一SpA结构域中的类比氨基酸)被替换为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)。在某些方面，SEQ ID NO：2的第9位的氨基酸被替换为甘氨酸。在另一方面，SEQID NO：2的第9位的氨基酸被替换为赖氨酸。
在一个具体实施方案中，SEQ ID NO：2的第10位的氨基(或另一SpA结构域中的类比氨基酸)被替换为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)。在某些方面，SEQ ID NO：2的第10位的氨基酸被替换为甘氨酸。在另一方面，SEQID NO：2的第10位的氨基酸被替换为赖氨酸。
在一个具体实施方案中，SEQ ID NO：2的第36位的氨基(或另一SpA结构域中的类比氨基酸)被替换为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)。在某些方面，SEQ ID NO：2的第36位的氨基酸被替换为丝氨酸。在另一方面，SEQID NO：2的第36位的氨基酸被替换为丙氨酸。
在一个具体实施方案中，SEQ ID NO：2的第37位的氨基(或另一SpA结构域中的类比氨基酸)被替换为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)或缬氨酸(V)。在某些方面，SEQ ID NO：2的第37位的氨基酸被替换为丝氨酸。在另一方面，SEQID NO：2的第37位的氨基酸被替换为丙氨酸。
在某些方面，所述SpA变体包含以下替换：(a)SpA结构域A、B、C、D和/或E的IgG Fc结合亚结构域中干扰或降低与IgG Fc结合的一个或更多个氨基酸替换，和(b)SpA结构域A、B、C、D和/或E的VH3结合亚结构域中干扰或降低与VH3结合的一个或更多个氨基酸替换。在又一些方面，所述SpA变体的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：2-6的氨基酸序列有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(包括其间所有数值和范围)同一性的氨基酸序列。
在另一方面，所述SpA变体包括(a)SpA结构域D的IgG Fc结合亚结构域中或其他IgG结构域中相应氨基酸位置处干扰或降低与IgG Fc结合的一个或更多个氨基酸替换，和(b)SpA结构域D的VH3结合亚结构域中或其他IgG结构域中相应氨基酸位置处干扰或降低与VH3结合的一个或更多个氨基酸替换。在某些方面，结构域D的IgG Fc结合亚结构域的氨基酸残基F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35(SEQ ID NO：2，QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES)被修饰或替换。在某些方面，结构域D的VH3结合亚结构域的氨基酸残基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47(SEQ ID NO：2)被修饰或替换以减弱与Fc或VH3的结合。在另一些方面，可以将结构域A、B、C和/或E的相应位置改造成相应的修饰或替换。通过将结构域D的氨基酸序列与SpA其他IgG结合结构域的一个或更多个氨基酸序列比对来确定相应位置，例如参见图2A。在某些方面，氨基酸替换可以是其他20个氨基酸中的任一个。在另一方面，可以从可能的氨基酸替换中特别地排除保守氨基酸替换。在另一些方面仅包括非保守替换。在任何情况下，考虑降低该结构域的结合以显著降低SpA毒性的任何替换或替换组合。结合的显著降低是指引入对象后产生最小毒性或不产生毒性的变体，可以使用本文所述的体外方法来对其进行评价。
在某些实施方案中，变体SpA包含至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个SpA结构域D肽变体。在某些方面，SpA变体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个或更多个氨基酸残基被替换或修饰——包括但不限于结构域D的IgGFc结合亚结构域的F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35(SEQ ID NO：2)以及结构域D的VH3结合亚结构域的Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47(SEQ ID NO：2)。在本发明的一个方面中，SEQ ID NO：2的第9和/或10位(或其他结构域的相应位置)的谷氨酰胺残基被突变。在另一方面，SEQ ID NO：2的第36和/或37位(或其他结构域的相应位置)的天冬氨酸残基被突变。在另一方面，第9和10位谷氨酰胺以及第36和37位天冬氨酸残基被突变。本文所述纯化的非产毒SpA或SpA-D突变体/变体不再能显著结合(即显示亲合力减弱或被干扰)Fcγ或F(ab)2VH3，并且也不刺激B细胞凋亡。这些非产毒的蛋白A变体可以用作亚单位疫苗，而且提高体液免疫应答并赋予对金黄色葡萄球菌攻击的保护性免疫。与野生型全长蛋白A或野生型SpA结构域D相比，用SpA-D变体免疫使蛋白A特异性抗体增加。使用葡萄球菌攻击和脓肿形成的小鼠模型观察发现，用非产毒蛋白A变体免疫产生对葡萄球菌感染和脓肿形成的显著保护。因为基本上所有金黄色葡萄球菌菌株都表达蛋白A，用非产毒蛋白A变体免疫人可以中和该毒力因子，从而建立保护性免疫。在某些方面，保护性免疫对耐药葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株(例如USA300和其他MRSA)的感染提供保护或改善。
一些实施方案包括蛋白A变体在用于治疗细菌和/或葡萄球菌感染的方法和组合物中的用途。本申请还提供包含蛋白A变体或其免疫原性片段的免疫原性组合物。在某些方面，所述免疫原性片段是蛋白A结构域D区段。另外，本发明提供可用于治疗(例如在对象中限制葡萄球菌脓肿形成和/或持续)或预防细菌感染的方法和组合物。在一些情况下，用于刺激免疫应答的方法涉及向对象施用有效量的包含或编码全部或部分蛋白A变体多肽或抗原(在某些方面以及其他细菌蛋白)的组合物。其他细菌蛋白包括但不限于(i)分泌的毒力因子和/或细胞表面蛋白质或肽，或(ii)编码分泌的毒力因子和/或细胞表面蛋白质或肽的重组核酸分子。
在另一些方面，可以向对象施用蛋白A变体的全部或部分，例如变体蛋白A结构域D区段。本发明的多肽可以配制成可药用组合物。所述组合物还可以包含至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种另外的葡萄球菌抗原或其免疫原性片段中的一个或更多个(例如Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla (例如H35突变体)、IsdC、SasF、vWbp或vWh)。可以与蛋白A变体联合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限于52kDa玻连蛋白(vitronectin)结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa(GenBank CAC80837)、Aap(GenBank登录号AJ249487)、Ant(GenBank登录号NP 372518)、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白(Fibronectin)结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO 00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白(参见PCT公开WO2007/113222、WO2007/113223、WO2006/032472、WO2006/032475、WO2006/032500，其中每个均通过引用整体并入本文)。葡萄球菌抗原或免疫原性片段可以与蛋白A变体同时施用。葡萄球菌抗原或免疫原性片段可以与蛋白A变体可在同一组合物中施用。蛋白A变体还可以是编码蛋白A变体的重组核酸分子。重组核酸分子可以编码蛋白A变体和至少一种葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。本文所用术语“调节”涵盖词语“增强”或“抑制”的含义。活性“调节”可以是增强或降低活性。本文所用术语“调节物”是指影响某部分(moiety)之功能的化合物，包括上调、诱导、刺激、增强、阻止、下调或抑制蛋白质、核酸、基因、有机体等。
在某些实施方案中，所述方法和组合物使用或包含或编码蛋白A变体或抗原的全部或部分。在另一些方面，蛋白A变体可以与分泌的因子或表面抗原联合使用，所述因子或表面抗原包括但不限于分离的Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp或vWh多肽或其免疫原性区段中的一种或更多种。可以与蛋白A变体联合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限于52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO 00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白。在某些实施方案中，可以从本发明的制剂中特别地排除Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh、52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO 00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种。
下表列出SpA变体与多种其他的葡萄球菌抗原的多种组合
表1.SpA与葡萄球菌抗原的组合。
  Eap  +  +   +  +  +  +   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  Ebh  +   +  +  +  +   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  Emp   +  +  +  +   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  EsaB  +  +  +   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  EsaC  +  +   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  EsxA  +   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  EsxB   +   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  SdrC   +  +  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +  +
  SdrD  +  +  +   +  +   +  +  +  +  +   +  +  +
  SdrE  +  +   +  +   +  +  +  +  +   +  +  +
  IsdA  +   +  +   +  +  +  +  +   +  +  +
  IsdB   +  +   +  +  +  +  +   +  +  +
  ClfA  +   +  +  +  +  +   +  +  +
  ClfB   +  +  +  +  +   +  +  +
  Coa  +  +  +  +   +  +  +
  Hla  +  +  +   +  +  +
HlaH35A  +  +   +  +  +
IsdC  +   +  +  +
SasF   +  +  +
vWbp  +  +
vWh  +
  Ebh  +  +  +  +  +   +   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  Emp  +  +  +  +   +   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  EsaB  +  +  +   +   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  EsaC  +  +   +   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  EsxA  +   +   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  EsxB   +   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  SdrC   +   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  SdrD   +   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  SdrE   +  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  IsdA  +   +   +   +   +  +   +  +   +  +   +
  IsdB  +  +  +  +  +  +   +   +   +   +
  ClfA  +  +  +  +  +   +   +   +   +
  ClfB  +  +  +  +   +   +   +   +
  Coa  +  +  +   +   +   +   +
  Hla  +  +   +   +   +   +
  HlaH35A  +   +   +   +   +
  IsdC   +   +   +   +
  SasF   +   +   +
  vWbp   +   +
  vWh   +
  Emp  +   +  +   +   +  +  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  EsaB   +  +   +   +  +  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  EsaC  +   +   +  +  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  EsxA   +   +  +  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  EsxB   +  +  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  SdrC  +  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  SdrD  +   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  SdrE   +  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  IsdA  +   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  IsdB   +  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  ClfA  +  +  +  +  +  +  +   +  +
  ClfB  +  +  +  +  +  +   +  +
  Coa  +  +  +  +  +   +  +
  Hla  +  +  +  +   +  +
 HlaH35A  +  +  +   +  +
  IsdC  +  +   +  +
  SasF  +   +  +
  vWbp   +  +
  vWh  +
  EsaB  +  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  EsaC  +  +   +  +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  EsxA  +   +  +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  EsxB   +  +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  SdrC  +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  SdrD   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  SdrE   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  IsdA   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  IsdB   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  ClfA   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  ClfB   +   +   +   +   +   +   +   +
  Coa   +   +   +   +   +   +   +
  Hla   +   +   +   +   +   +
  HlaH35A   +   +   +   +   +
  IsdC   +   +   +   +
  SasF   +   +   +
  vWbp   +   +
 vWh   +
  EsaC  +  +  +   +  +   +  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  EsxA  +  +   +  +   +  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  EsxB  +   +  +   +  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  SdrC   +  +   +  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  SdrD  +   +  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  SdrE   +  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  IsdA  +  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  IsdB  +   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  ClfA   +   +   +  +  +   +   +  +  +
  ClfB   +   +  +  +   +   +  +  +
  Coa   +  +  +   +   +  +  +
  Hla  +  +   +   +  +  +
 HlaH35A  +   +   +  +  +
  IsdC   +   +  +  +
  SasF   +  +  +
  vWbp  +  +
  vWh  +
  EsxA  +  +  +  +  +  +  +  +   +  +  +  +  +   +   +   +
  EsxB  +  +  +  +  +  +  +   +  +  +  +  +   +   +   +
  SdrC  +  +  +  +  +  +   +  +  +  +  +   +   +   +
  SdrD  +  +  +  +  +   +  +  +  +  +   +   +   +
  SdrE  +  +   +   +  +   +  +   +  +   +  +   +
  IsdA  +   +   +  +   +  +   +  +   +  +   +
  IsdB   +   +  +   +  +   +  +   +  +   +
  ClfA   +  +   +  +   +  +   +  +   +
  ClfB  +   +  +   +  +   +  +   +
  Coa   +  +   +  +   +  +   +
  Hla  +   +  +   +  +   +
 HlaH35A   +  +   +  +   +
  IsdC  +   +  +   +
  SasF   +  +   +
  vWbp  +   +
  vWh   +
  EsxB  +  +  +  +  +  +  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  SdrC  +  +  +  +  +  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  SdrD  +  +  +  +  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  SdrE  +  +  +  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  IsdA  +  +  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  IsdB  +  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  ClfA  +  +   +   +   +  +   +  +   +
  ClfB  +   +   +   +  +   +  +   +
  Coa   +   +   +  +   +  +   +
  Hla   +   +  +   +  +   +
  HlaH35A   +  +   +  +   +
  IsdC  +  +  +  +
SasF  +  +  +
vWbp  +  +
vWh  +
  SdrC  +  +  +  +  +   +   +  +  +  +  +  +   +   +
  SdrD  +  +  +  +   +   +  +  +  +  +  +   +   +
  SdrE  +  +  +   +   +  +  +  +  +  +   +   +
  IsdA  +  +   +   +  +  +  +  +  +   +   +
  IsdB  +   +   +  +  +  +  +  +   +   +
  ClfA   +   +  +  +  +  +  +   +   +
  ClfB   +  +  +  +  +  +   +   +
  Coa  +  +  +  +  +   +   +
  Hla  +  +  +  +   +   +
 HlaH35A  +  +  +   +   +
  IsdC  +  +   +   +
SasF  +   +   +
vWbp   +   +
vWh   +
  SdrD  +  +   +  +  +   +   +  +  +  +   +   +  +
  SdrE  +   +  +  +   +   +  +  +  +   +   +  +
  IsdA   +  +  +   +   +  +  +  +   +   +  +
  IsdB  +  +   +   +  +  +  +   +   +  +
  ClfA  +  +  +  +   +   +  +  +  +
  ClfB  +  +  +   +   +  +  +  +
  Coa  +  +   +   +  +  +  +
  Hla  +   +   +  +  +  +
 HlaH35A   +   +  +  +  +
  IsdC   +  +  +  +
  SasF  +  +  +
  vWbp  +  +
  vWh  +
  SdrE  +  +   +  +  +   +  +   +  +   +   +   +
  IsdA  +   +  +  +   +  +   +  +   +   +   +
  IsdB   +  +  +   +  +   +  +   +   +   +
  ClfA  +  +   +  +   +  +   +   +   +
  ClfB  +   +  +   +  +   +   +   +
  Coa   +  +   +  +   +   +   +
  Hla  +   +  +   +   +   +
  HlaH35A   +  +   +   +   +
  IsdC  +   +   +   +
  SasF   +   +   +
  vWbp   +   +
  vWh   +
  IsdA  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +
  IsdB  +  +   +  +  +  +   +  +  +   +
  ClfA  +   +  +  +  +   +  +  +   +
  ClfB   +  +  +  +   +  +  +   +
  Coa  +  +  +   +  +  +   +
  Hla  +  +   +  +  +   +
 HlaH35A  +   +  +  +   +
  IsdC   +  +  +   +
SasF  +  +   +
vWbp  +   +
vWh   +
  IsdB  +   +  +  +   +   +   +   +  +   +
  ClfA   +  +  +   +   +   +   +  +   +
  ClfB  +  +   +   +   +   +  +   +
  Coa  +   +   +   +   +  +   +
  Hla   +   +   +   +  +   +
 HlaH35A   +   +   +  +   +
  IsdC   +   +  +   +
  SasF   +  +   +
  vWbp  +   +
  vWh   +
  ClfA  +  +  +  +  +  +  +  +  +
  ClfB  +  +  +  +  +  +  +  +
  Coa  +  +  +  +  +  +  +
  Hla  +  +  +  +  +  +
 HlaH35A  +  +  +  +  +
  IsdC  +  +  +  +
  SasF  +  +  +
  vWbp  +  +
  vWh  +
  ClfB  +  +  +  +  +   +   +  +
  Coa  +  +  +  +   +   +  +
  Hla  +  +  +   +   +  +
 HlaH35A  +  +   +   +  +
  IsdC  +   +   +  +
  SasF   +   +  +
  vWbp   +  +
  vWh  +
  Coa  +  +  +  +  +  +   +
  Hla  +  +  +  +  +   +
 HlaH35A  +  +  +  +   +
  IsdC  +  +  +   +
  SasF  +  +   +
  vWbp  +   +
  vWh   +
  Hla  +  +  +   +  +  +
 HlaH35A  +  +   +  +  +
  IsdC  +   +  +  +
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在另一些方面，分离的蛋白A变体为多聚化(例如二聚化)的或为两个或更多个多肽或肽区段的线性融合物。在本发明的某些方面，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个分离的细胞表面蛋白或其区段的多聚体或串联体(concatamer)。串联体是具有一个或更多个重复肽单元的线性多肽。SpA多肽或片段可以是连续的，或者被间隔子(spacer)或其他肽序列(例如一个或更多个另外的细菌肽)分隔。在另一方面，所述多聚体或串联体中包含的其他多肽或肽可以包括但不限于Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh或其免疫原性片段中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种。可以与蛋白A变体联合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限于52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白。
术语“蛋白A变体”或“SpA变体”是指包含SpA IgG结构域的多肽，所述结构域具有干扰与Fc和VH3的结合的两个或更多个氨基酸替换。在某些方面，SpA变体包括变体结构域D肽以及SpA多肽变体及其区段，它们是非产毒的并且刺激针对葡萄球菌属细菌蛋白A和/或表达其的细菌的免疫应答。
本发明的一些实施方案包括在对象中引发针对葡萄球菌属细菌或葡萄球菌的免疫应答的方法，其包括向对象提供有效量的蛋白A变体或其区段。在某些方面，在对象中引发针对葡萄球菌属细菌或葡萄球菌的免疫应答的方法包括向对象提供有效量的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19种或更多种分泌蛋白和/或细胞表面蛋白或其区段/片段。分泌蛋白或细胞表面蛋白包括但不限于Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp和/或vWh蛋白及其免疫原性片段。可以与蛋白A变体联合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限于52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连接白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO 00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白。
本发明的一些实施方案包括包含多肽、肽或蛋白质的组合物，所述多肽、肽或蛋白质与蛋白A或作为分泌的细菌蛋白或细菌细胞表面蛋白的第二蛋白质或肽具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性。在本发明的另一实施方案中，组合物可包含与蛋白A结构域D多肽(SEQ ID NO：2)、结构域E(SEQID NO：3)、结构域A(SEQ ID NO：4)、结构域C(SEQ ID NO：5)、结构域B(SEQ ID NO：6)具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质，或者组合物可以包含编码蛋白A结构域D、结构域E、结构域A、结构域C或结构域B多肽的核酸序列。在某些方面，蛋白A多肽区段具有SEQ IDNO：8的氨基酸序列。本领域已知相似性或同一性(优选同一性)并且可以使用很多不同程序确定蛋白质(或核酸)是否与已知序列具有序列同一性或相似性。使用本领域已知的标准技术确定序列同一性和/或相似性，所述技术包括但不限于Smith & Waterman的局部序列同一性算法(1981)、Needleman & Wunsch的序列同一性比对算法(1970)、Pearson& Lipman的相似性搜索法(1988)、计算机执行的这些算法(GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.的Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、Devereux等(1984)描述的Best Fit序列程序(优选使用默认设置)或通过观察。优选地，通过使用本领域技术人员已知并容易确定的比对工具计算同一性百分比。同一性百分比基本上是相同的氨基酸数除以比较的氨基酸总数再乘以100。
另一些实施方案包括在对象中刺激针对葡萄球菌属细菌的保护性或治疗性免疫应答的方法，其包括向对象施用有效量的组合物，所述组合物包含(i)SpA变体，例如变体SpA结构域D多肽或其肽；或(ii)编码这种SpA多肽变体或其肽的核酸分子；或(iii)与本文所述细菌蛋白的任何组合或排列一起施用SpA变体结构域D多肽。在一个优选的实施方案中，所述组合物不是葡萄球菌属细菌。在某些方面，所述对象是人或奶牛。在另一方面，所述组合物配制成可药用制剂。所述葡萄球菌可以是金黄色葡萄球菌。
另一些实施方案包括疫苗，其包含具有分离的SpA变体多肽或本文所述蛋白质或肽的任何其他组合或排列的可药用组合物，其中所述组合物能刺激针对葡萄球菌属细菌的免疫应答。所述疫苗可包含分离的SpA变体多肽或所述蛋白质或肽的任何其他组合或排列。在本发明的某些方面，分离的SpA变体多肽或所述蛋白质或肽的任何其他组合或排列是多聚化(例如二聚化)的或串联的。在另一方面，疫苗组合物具有少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.05％(或其中衍生的任何范围)的其他葡萄球菌蛋白的污染。组合物还可以包含分离的非SpA多肽。通常，所述疫苗包含佐剂。在某些方面，本发明的蛋白质或肽与佐剂连接(共价或非共价)，优选地，佐剂与所述蛋白质化学缀合。
在又一些实施方案中，疫苗组合物是可药用组合物，其具有编码SpA变体多肽的全部或部分或本文所述蛋白质或肽的任何其他组合或排列的重组核酸，其中所述组合物能刺激针对葡萄球菌属细菌的免疫应答。所述疫苗组合物可以包含编码SpA变体多肽的全部或部分或本文所述蛋白质或肽的任何其他组合或排列的重组核酸。在某些实施方案中，所述重组核酸包含异源启动子。优选地，所述重组核酸是载体。更优选地，所述载体是质粒或病毒载体。在一些方面，所述疫苗包含含有所述核酸的重组非葡萄球菌属细菌。所述重组非葡萄球菌可以是沙门氏菌(Salmonella)或另一种革兰氏阳性细菌。所述疫苗可以包含可药用赋形剂，更优选佐剂。
另一些实施方案包括在对象中刺激针对葡萄球菌属细菌的保护性或治疗性免疫应答的方法，其包括向对象施用有效量的SpA变体多肽或其区段/片段的组合物，并且该组合物还包含Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp或vWh蛋白质或其肽中的一种或更多种。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含非葡萄球菌属细菌。在另一方面，所述组合物配制成可药用制剂。所治疗对象的葡萄球菌可以是金黄色葡萄球菌。本发明的方法还包括SpA变体组合物，其包含多种组合分泌的毒力因子和/或细胞表面蛋白中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19种或更多种，例如Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp或vWh。在某些方面，疫苗制剂包括Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp和vWh。在某些方面，抗原组合可以包括(1)SpA变体和IsdA；(2)SpA变体和ClfB；(3)SpA变体和SdrD；(4)SpA变体和Hla或Hla变体；(5)SpA变体以及ClfB、SdrD和Hla或Hla变体；(6)SpA变体、IsdA、SdrD和Hla或Hla变体；(7)SpA变体、IsdA、ClfB和Hla或Hla变体；(8)SpA变体、IsdA、ClfB和SdrD；(9)SpA变体、IsdA、ClfB、SdrD和Hla或Hla变体；(10)SpA变体、IsdA、ClfB和SdrD；(11)SpA变体、IsdA、SdrD和Hla或Hla变体；(12)SpA变体、IsdA和Hla或Hla变体；(13)SpA变体、IsdA、ClfB和Hla或Hla变体；(14)SpA变体、ClfB和SdrD；(15)SpA变体、ClfB和Hla或Hla变体；或(16)SpA变体、SdrD和Hla或Hla变体。
在某些方面，递送本发明组合物的细菌在延长或持续的生长或脓肿形成方面被限制或减弱。在另一方面，SpA变体可以在被减弱的细菌中过表达以进一步增强或补充免疫应答或疫苗制剂。
术语“EsxA蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型EsxA多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌EsxA蛋白的免疫应答的变体。
术语“EsxB蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型EsxB多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌EsxB蛋白的免疫应答的变体。
术语“SdrD蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型SdrD多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌SdrD蛋白的免疫应答的变体。
术语“SdrE蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型SdrE多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌SdrE蛋白的免疫应答的变体。
术语“IsdA蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型IsdA多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌IsdA蛋白的免疫应答的变体。
术语“IsdB蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型IsdB多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌IsdB蛋白的免疫应答的变体。
术语“Eap蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型Eap多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌Eap蛋白的免疫应答的变体。
术语“Ebh蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型Ebh多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌Ebh蛋白的免疫应答的变体。
术语“Emp蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型Emp多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌Emp蛋白的免疫应答的变体。
术语“EsaB蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型EsaB多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌EsaB蛋白的免疫应答的变体。
术语“EsaC蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型EsaC多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌EsaC蛋白的免疫应答的变体。
术语“SdrC蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型SdrC多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌SdrC蛋白的免疫应答的变体。
术语“ClfA蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型ClfA多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌ClfA蛋白的免疫应答的变体。
术语“ClfB蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型ClfB多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌ClfB蛋白的免疫应答的变体。
术语“Coa蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型Coa多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌Coa蛋白的免疫应答的变体。
术语“Hla蛋白”指下包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型Hla多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌Hla蛋白的免疫应答的变体。
术语“IsdC蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型IsdC多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌IsdC蛋白的免疫应答的变体。
术语“SasF蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型SasF多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌SasF蛋白的免疫应答的变体。
术语“vWbp蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型vWbp(von Willebrand因子结合蛋白，von Willebrand factor binding protein)多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌vWbp蛋白的免疫应答的变体。
术语“vWh蛋白”指包含来自葡萄球菌属细菌的分离的野生型vWh(von Willebrand因子结合蛋白同系物，von Willebrand factor bindingprotein homolog)多肽及其区段的蛋白质和能刺激针对葡萄球菌属细菌vWh蛋白的免疫应答的变体。
免疫应答指有机体中的体液应答、细胞应答或体液和细胞应答两者。免疫应答可以通过测定进行测量，所述测定包括但不限于测量特异性识别蛋白质或细胞表面蛋白的抗体的存在或量的测定、测量T细胞活化或增殖的测定和/或测量一种或更多种细胞因子活性调节或表达调节的测定。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与EsxA蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，EsxA蛋白具有SEQID NO：11的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与EsxB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，EsxB蛋白具有SEQID NO：12的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与SdrD蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，SdrD蛋白具有SEQID NO：13的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与SdrE蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，SdrE蛋白具有SEQID NO：14的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与IsdA蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，IsdA蛋白具有SEQ IDNO：15的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与IsdB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，IsdB蛋白具有SEQ IDNO：16的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的一些实施方案包括组合物，其包括与EsaB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，EsaB蛋白具有SEQID NO：17的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与ClfB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，ClfB蛋白具有SEQ IDNO：18的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与IsdC蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，IsdC蛋白具有SEQ IDNO：19的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与SasF蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，SasF蛋白具有SEQ IDNO：20的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与SdrC蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，SdrC蛋白具有SEQID NO：21的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与ClfA蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，ClfA蛋白具有SEQ IDNO：22的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与Eap蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，Eap蛋白具有SEQ IDNO：23的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与Ebh蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，Ebh蛋白具有SEQ IDNO：24的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与Emp蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，Emp蛋白具有SEQ IDNO：25的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与EsaC蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，EsaC蛋白具有SEQID NO：26的氨基酸序列的全部或部分。EsaC多肽的序列可以在蛋白质数据库中找到，并且包括但不限于登录号ZP_02760162(GI：168727885)、NP_645081.1(GI：21281993)和NP_370813.1(GI：15923279)，其中每个均通过引用本申请的优先权日时的内容并入本文。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与Coa蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，Coa蛋白具有SEQ IDNO：27的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与Hla蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，Hla蛋白具有SEQ IDNO：28的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与vWa蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，vWa蛋白具有SEQ IDNO：29的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的另一些实施方案中，组合物可包含与vWbp蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白质。在某些方面，vWbp蛋白具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的全部或部分。
在某些方面，多肽或区段/片段可以具有与参照多肽的氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或更高同一性的序列。术语“相似性”指具有下述序列的多肽，即所述序列具有与参照多肽相同或者构成对参照多肽之保守替换的特定百分比氨基酸。
本文所述多肽可以在SEQ ID NO：2-30或SEQ ID NO：32-34的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000个或更多个连续的氨基酸内(或其中衍生的任何范围内)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个变体氨基酸。
本文所述多肽区段可以包括SEQ ID NO：2-30或SEQ ID NO：33-34的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000个或更多个连续的氨基酸(或其中衍生的任何范围)。
该组合物可以配制成可药用组合物。在本发明的某些方面，葡萄球菌属细菌是金黄色葡萄球菌。
在另一些方面，可以多于一次向对象施用组合物，并且可以施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20次或更多次。组合物的施用包括但不限于经口、肠胃外、皮下、肌内、静脉内或其多种组合，包括吸入或抽吸。
在另一些实施方案中，组合物包含编码本文所述多肽或其区段/片段的重组核酸分子。通常编码本文所述多肽的重组核酸分子含异源启动子。在某些方面，本发明的重组核酸分子是载体，在另一些方面载体是质粒。在某些实施方案中，载体是病毒载体。在某些方面，组合物包括含有或表达本文所述多肽的重组非葡萄球菌属细菌。在一些具体方面，重组非葡萄球菌属细菌是沙门氏菌或另一种革兰氏阳性细菌。组合物通常施用给哺乳动物，例如人对象，但是也考虑施用给能引发免疫应答的其他动物。在另一些方面，含有或表达所述多肽的葡萄球菌属细菌是金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中，所述免疫应答是保护性免疫应答。
在另一些实施方案中，组合物包含编码Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、SpA、vWbp或vWh蛋白或肽或其变体中一个或更多个的全部或部分的重组核酸分子。可以与本文所述多肽联合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限于52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO 00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白。在一些具体方面，细菌是重组非葡萄球菌属细菌，例如沙门氏菌或其他革兰氏阳性细菌。
本发明的组合物通常施用给人对象，但是也考虑施用给能由葡萄球菌属细菌引发免疫应答的其他动物，特别是牛、马、山羊、绵羊和其他家畜，即哺乳动物。
在某些方面，葡萄球菌属细菌是金黄色葡萄球菌。在另一些实施方案中，免疫应答是保护性免疫应答。在另一些方面，本发明的方法和组合物可以用于预防、改善、减少或治疗组织或腺体感染，例如乳腺感染(特别是乳腺炎)和其他感染。其他方法包括但不限于在未显示感染征兆的对象中预防性降低细菌负荷，特别是怀疑或有风险被目标细菌定殖的对象，例如在住院、治疗和/或康复期间被感染或有感染风险或怀疑被感染的患者。
对本发明一个方面所讨论的任何实施方案都适用于本发明的其他方面。特别地，对SpA变体多肽或肽或核酸的内容所讨论的任何实施方案都可以实施于其他抗原，反之亦然，所述抗原如Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh、52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO 00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白(或核酸)。还应理解可以从所要求的组合物中特别排除Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh、52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO 01/60852)、Aaa、Aap，Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素酰胺酶、Cna、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US 2002/0169288)、HarA、HBP、免疫显性ABC转运蛋白、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运蛋白、MHC II类似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO 00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO 00/12689)、SEA外毒素(WO 00/02523)、SEB外毒素(WO 00/02523)、SitC和Ni ABC转运蛋白、SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻连蛋白结合蛋白中的任何一个或更多个。
本发明的一些实施方案包括含或不含细菌的组合物。组合物可包括或可不包括减毒或有活力或完整的葡萄球菌属细菌。在某些方面，组合物包含非葡萄球菌的细菌或者不包含葡萄球菌。在某些实施方案中，细菌组合物包含分离的或重组表达的葡萄球菌蛋白A变体或编码它的核苷酸。组合物可以是或包含以如下方式改变的重组改造的葡萄球菌属细菌：所述方式即包括在分泌的毒力因子或细胞表面蛋白方面对细菌进行特定的改变。例如，可重组修饰该细菌以表达与比未修饰时相比更多的毒力因子或细胞表面蛋白。
术语“分离的”可以指基本不含其来源中的细胞物质、细菌物质、病毒物质或培养基(通过重组DNA技术产生时)或者化学前体或其他化学物(化学合成时)的核酸或多肽。另外，分离的化合物指可作为分离的化合物施用给对象的化合物，换言之，如果该化合物吸附到柱上或包埋在琼脂凝胶中则不会被简单地认为是“分离的”。另外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不作为片段形式天然存在和/或在功能状态不常见的核酸或蛋白质片段。
本发明的部分(如多肽、肽、抗原或免疫原)可以缀合或者共价或非共价连接至其他部分(如佐剂、蛋白质、肽、支持物、荧光部分或标记)。术语“缀合”或“免疫缀合”广义地用于定义一个部分与另一物质的有效连接，并且不旨在仅仅指任何类型的有效连接，特别不限于化学“缀合”。特别考虑的是重组融合蛋白质。本发明的组合物还可包含佐剂或可药用赋形剂。佐剂可共价或非共价偶联到本发明的多肽或肽上。在某些方面，所述佐剂化学缀合至蛋白质、多肽或肽。
术语“提供”使用其普通含义，指“提供或配备以供使用”。在一些实施方案中，通过施用蛋白质来直接提供所述蛋白质，而在另一些实施方案中，通过施用编码蛋白质的核酸来有效地提供蛋白质。在某些方面，本发明考虑的组合物包括核酸、抗原、肽和/或表位的多种组合。
对象将患有(例如，诊断为葡萄球菌感染)、被怀疑患有或有风险发生葡萄球菌感染。本发明的组合物包括免疫原性组合物，其中包含有效量的抗原或表位以达到预期目的。更特别地，有效量是刺激或引发免疫应答或提供对感染的抵抗、改善或缓和所必需的活性成分的量。在更具体的方面，有效量预防、减轻或改善疾病或感染的症状，或延长被治疗对象的存活。有效量的测定在本领域技术人员能力范围内，尤其在参考本文提供的详细公开内容的情况下。对于本发明方法中使用的任何制剂，可以从体外研究、细胞培养和/或动物模型测定初步估计有效量或剂量。例如，可以在动物模型中制定剂量，以达到期望的免疫应答或循环抗体浓度或效价。这些信息可用于更准确地确定对人有效的剂量。
实施例部分的实施方案应被理解为可应用于本发明所有方面的本发明的实施方案。
尽管本公开内容支持指代仅仅择一的替代和“和/或”的定义，但是除非明确指明指代仅仅择一的替代或者替代方案彼此排斥，否则权利要求中所使用的术语“或”用于表示“和/或”。它也表示任何用术语“或”列举的内容也可以被特别地排除。
在本申请中，术语“约”用于表示数值包括测定该数值所用装置或方法的误差的标准差。
根据长期存在的专利法，除非特别指明，当在权利要求书或说明书中词语“包含”未联合使用表明数量的词时，表示一个或更多个。
根据以下的详细描述本发明的其他目的、特点和优点会更明确。然而应理解，详细的说明和具体的实例虽然说明本发明的具体实施方案，但是仅通过示例方式给出，本领域技术人员根据此详细的说明会明确本发明精神和范围内的多种变化和改进。
附图说明
为了实现并可以详细理解本发明上述特征、优点和目的以及会明确的其他内容，在附图中显示了更具体的描述和上文简要概括的一些本发明实施方案。这些附图是本说明书的一部分。但应注意附图说明了本发明的某些实施方案，因此不应认为限制于附图的范围。
图1A-1B.(图1A)蛋白A前体的一级结构，其具有N端YSIRK基序信号肽，称为E、D、A、B、C的串联重复的五个免疫球蛋白结合结构域，区域X和LPXTG分选信号。(图1B)在合成蛋白A前体之后，葡萄球菌经由Sec途径分泌该产物，并且分选酶A在T与G残基之间切割LPXTG分选信号。脂质II内氨基的亲核攻击分选酶-蛋白A硫酯连接的中间体形成酰胺键，其使蛋白A连接至细胞壁包膜并且使其能够展示在细菌表面。
图2.蛋白A的SpA结构域D、B细胞受体的VH3Fab结构域与免疫球蛋白的Fcγ结构域之间的分子相互作用的三维模型。所述模型来源于两种晶体结构(Graille等，2000和Gouda等，1992)，其揭示出参与能够形成这些复合物的离子键形成的侧链残基。SpA-D的Gln-9和Gln-10促进与Fcγ的结合，而Asp-36和Asp37能够与VH3Fab形成复合物。
图3.左图-考马斯亮蓝染色SDS-PAGE揭示经纯化的His标记的SpA、SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A，人IgG和分选酶A(SrtA，对照蛋白)的迁移位置。右图-考马斯亮蓝染色SDS-PAGE揭示在用His标记的SpA、SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A或SrtA进行预装载的Ni-NTA柱上，通过人IgG的亲和色谱洗脱的蛋白A-免疫球蛋白复合物的洗脱液。
图4.对人免疫球蛋白(hIgG)、人F(ab)2IgG片段和人免疫球蛋白的Fc片段(hFc)进行定量的ELISA测定。板上涂有等量的His标记的SpA、SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A或SrtA。将hIgG-HRP、F(ab)2-HRP和hFc-HRP添加到板上并孵育1小时。记录450nm处的吸光度并绘图以确定半最大效价。
图5.将经纯化的SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A或PBS模拟对照注入到小鼠腹膜内并且分析其在实验性BALB/c小鼠的脾中减少B细胞群体的能力。注射4小时后处死小鼠，移出其脾、将组织匀浆，然后用针对B细胞的CD19抗体进行染色。通过FACS分选对B细胞数目进行定量。
图6.非产毒的蛋白A疫苗的产生。a，金黄色葡萄球菌Newman株和USA300 LAC的蛋白A(SpA)翻译产物，其具有N末端信号肽(白色框)、5个免疫球蛋白结合结构域(IgBD，称为E、D、A、B和C)、可变区域X和C末端分选信号(黑色框)。b，5个IgBD和非产毒SpA-DKKAA的氨基酸序列，其中标明了三α-螺旋束(H1、H2和H3)和谷氨酰胺(Q)9、10和天冬氨酸(D)36、37的位置。c，存在或不存在人免疫球蛋白(hIgG)时，用Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化的SpA、SpA-D、SpA-DKKAA或SrtA的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE。d，ELISA检测固定化的SpA、SpA-D或SpA-DKKAA与人IgG及其Fc或F(ab)2片段和von Willebrand因子(vWF)之间的结合。e，通过FACS对模拟免疫或者用SpA-D或SpA-DKKAA处理的BALB/c小鼠脾组织中的CD19+淋巴细胞进行定量。
图7.非产毒蛋白A疫苗预防脓肿形成。BALB/c小鼠经模拟免疫(PBS)或SPA、SPA-D和SPA-DKKAA接种并被金黄色葡萄球菌Newman株攻击后，尸检分离的肾组织的组织病理。薄切片组织用苏木精-伊红染色。白色箭头标识多形核白细胞(PMN)浸润。深色箭头标识葡萄球菌脓肿区域。
图8.非产毒蛋白A疫苗产生的抗体阻断SpA的B细胞超抗原功能。a，将针对SpA-DKKAA产生的兔抗体在固定了抗原的基质上纯化，并且通过考马斯亮蓝染色SDS-PAGE进行分析。抗体用胃蛋白酶酶切，在SpA-DKKAA基质上通过第二轮亲和层析纯化F(ab)2片段.SpA-DKKAA特异性F(ab)2干扰SpA或SpA-D与人免疫球蛋白(hIgG)(b)或vonWillebrand因子(vWF)(c)的结合。
图9.全长非产毒蛋白A产生改善的免疫应答。a，将全长SpAKKAA在Ni-NTA琼脂糖凝胶上纯化并通过考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析。b，通过FACS对模拟免疫或者用SpA或SpAKKAA处理的BALB/c小鼠脾脏组织的CD19+B淋巴细胞进行定量。c，ELISA检测固定化的SpA或SpAKKAA与人IgG及其Fc或F(ab)2片段或von Willebrand因子(vWF)的结合。d，针对白喉类毒素(CRM197)和非产毒SpAKKAA或SpA-DKKAA的人或小鼠血清抗体效价。通过定量点印迹(quantitative dot blot)检测有DTaP免疫史和葡萄球菌感染史的人志愿者(n＝16)以及已被金黄色葡萄球菌Newman株或USA 300 LAC感染或者经SpAKKAA或SpA-DKKAA免疫的小鼠(n＝20)。
图10.葡萄球菌感染不产生保护性免疫。将BALB/c小鼠(n＝20)用金黄色葡萄球菌Newman株感染或模拟攻击(PBS)30天并用氯霉素治疗清除感染。随后两组动物均用金黄色葡萄球菌Newman株攻击，在第4天尸检后分析肾组织匀浆的细菌载荷(CFU)。
图11.经PBS、SpA、SpA-D和SpA-DKKAA处理的小鼠中脓肿形成比较。
图12A-12C.(A)ELISA检测固定化的SpA、SpA-D、SpA-DKKAA或SpA-DGGSS与人IgG及其Fc或F(ab)2片段和IgM的结合。比较SpA-DKKAA和SpA-DGGSS与每种配体结合相对于SpA-D结合的统计学显著性；比较SpA-D结合与SpA结合(n＝3)；*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。(B)ELISA检测从SpA-D、SpA-DKKAA和SpA-DGGSS主动免疫小鼠(n＝5)中收集的超免疫血清样本的交叉反应性抗体水平。(C)经PBS、SpA-D、SpA-DKKAA和SpA-DGGSS处理的小鼠中的脓肿形成。
发明详述
金黄色葡萄球菌是人皮肤和鼻孔的共生菌，并且是血流、皮肤及软组织感染的首要原因(Klevens等，2007)。近期金黄色葡萄球菌疾病死亡率大幅增加归因于通常对抗生素不敏感的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的传播(Kennedy等，2008)。在一项大型回顾性研究中，在美国所有医院收治者中MRSA感染的发病率是4.6％(Klevens等，2007)。在美国，94,300名MRSA感染者年医疗保健费用超过24亿美元(Klevens等，2007)。目前的MRSA流行已成为公共健康危机，需要开发预防性疫苗加以应对(Boucher和Corey，2008)。迄今还没有FDA许可的预防金黄色葡萄球菌疾病的疫苗。
本发明人在本文中描述了蛋白A(葡萄球菌的细胞壁锚定表面蛋白)在产生可作为亚单位疫苗的变体中的用途。金黄色葡萄球菌感染的发病是随细菌通过外伤、手术伤口或医疗器械侵入皮肤或血流而开始的(Lowy，1998)。虽然侵入的病原体可被吞噬和杀死，但葡萄球菌也可以逃脱固有免疫防御并在器官组织中引发感染，诱发吸引巨噬细胞、中性粒细胞和其他吞噬细胞的炎症应答(Lowy，1998)。因为宿主试图防止金黄色葡萄球菌的传播，免疫细胞到感染部位的反应性侵入伴随着液化性坏死，并能清除坏死的组织碎片(Lam等，1963)。这种病变通过显微镜可观察到含有坏死组织、白细胞和细菌中央病灶的细胞过多区域(Lam等，1963)。除非葡萄球菌脓肿通过手术排除并用抗生素治疗，否则弥散性感染和败血症会导致致命结果(Sheagren，1984)。
II.葡萄球菌抗原
A.葡萄球菌蛋白A(SpA)
所有金黄色葡萄球菌菌株都表达蛋白A的结构基因(spa)(Jensen，1958；Said-Salim等，2003)，该蛋白是已经充分表征的毒力因子，其细胞锚定表面蛋白产物(SpA)包含五个高度同源的称为E、D、A、B和C的免疫球蛋白结合结构域(Sjodahl，1977)。这些结构域在氨基酸水平显示约80％的同一性，长56至61个残基，并且组织成串联重复形式(Uhlen等，1984)。SpA被合成为前体蛋白，其具有N末端YSIRK/GS信号肽和C末端LPXTG基序分选信号(DeDent等，2008；Schneewind等，1992)。在葡萄球菌表面展示有非常丰富的细胞壁锚定蛋白A(DeDent等，2008；Sjoquist等，1992)。蛋白A的每个免疫球蛋白结合结构域都由反向平行的α-螺旋构成，它们组装成三螺旋束并结合免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域(Deisenhofer，1981；Deisenhofer等，1978)、IgM的VH3重链(Fab)(即B细胞受体)(Graille等，2000)、von Willebrand因子的A1结构域[vWF A1是一种血小板配体](O′Seaghdha等，2006)和位于呼吸道上皮表面(Gomez等，2004；Gomez等，2007)的肿瘤坏死因子α(TNF-α)受体I(TNFRI)(Gomez等，2006)。
SpA通过与IgG的Fc部分结合来阻碍中性粒细胞吞噬葡萄球菌(Jensen，1958；Uhlen等，1984)。另外，SpA能通过结合von Willebrand因子AI结构域激活血管内凝血(Hartleib等，2000)。血浆蛋白如纤维蛋白原和纤连蛋白在葡萄球菌(CIfA和CIfB)和血小板整合素GPIIb/IIIa之间起桥梁的作用(O′Brien等，2002)，该作用通过蛋白A和vWF AI的相互作用得到补充，从而使葡萄球菌通过GPIb-α血小板受体捕获血小板(Foster，2005；O′Seaghdha等，2006)。SpA还结合TNFRI，并且该相互作用促成葡萄球菌性肺炎的发病(Gomez等，2004)。SpA通过TNFR1介导的TRAF2、p38/c-Jun激酶、有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和Rel-转录因子NF-KB活化来激活促炎症信号传导。SpA结合还诱导TNFR1的脱落，该活性似乎需要TNF-转化酶(TACE)(Gomez等，2007)。所有上述SpA活性都通过它的5个IgG结合结构域介导，并且可以通过氨基酸替换来干扰，所述氨基酸是最初根据蛋白A和人IgG1相互作用的需要所限定的氨基酸(Cedergren等，1993)。
SpA还通过捕获含VH3的IgM的Fab区(B细胞受体)发挥B细胞超抗原作用(Gomez等，2007；Goodyear等，2003；Goodyear和Silverman，2004；Roben等，1995)。静脉内攻击后，葡萄球菌蛋白A(SpA)突变显示减少的器官组织中葡萄球菌负荷，并且形成脓肿的能力明显降低(本文所述)。野生型金黄色葡萄球菌感染期间，脓肿在48小时内形成，并且可以用光学显微镜通过苏木精-伊红染色的肾组织超薄切片观察到，最初标志为多形核白细胞(PMN)的内流。感染第5天，脓肿大小增加并包封有中心金黄色葡萄球菌群，周围是嗜酸、无定形物质层和大的PMN套。组织病理学显示脓肿病变中心接近金黄色葡萄球菌病灶处有大量的PMN坏死，并覆盖有健康的吞噬细胞。本发明人还观察到在脓肿病变区周围是一圈坏死的PMN，其紧邻将健康肾组织与感染病变区隔开的嗜酸假包膜。缺少蛋白A的金黄色葡萄球菌变种不能建立脓肿的组织病理学特性，并在感染过程中被清除。
在之前的研究中，Cedergren等(1993年)在SpA结构域B的Fc片段结合亚结构域中、L17D、N28A、I31A和K35A改造出5个单独的替换。这些作者创造这些蛋白来测试从SpA的一个结构域与Fc1的复合物的三维结构中收集到的数据。Cedergren等测定了这些突变对稳定和结合的影响，但没有考虑使用这些替换来生产疫苗抗原。
Brown等(1998)描述了设计用于以SpA为基础改造得到新蛋白质的研究，其允许所述蛋白在用作亲和配体时使用更有利的洗脱条件。研究的突变包括单突变Q13A、Q14H、N15A、N15H、F17H、Y18F、L21H、N32H或K39H。Brown等报道Q13A、N15A、N15H和N32H替换对解离常数值几乎没有影响，Y18F替换导致与野生型SpA相比结合亲和力降低2倍。Brown等还报道L21H和F17H替换分别使结合亲合力减少5倍和100倍。作者还研究了两个串联结构域的类似替换。因此，Brown等的研究涉及产生具有更有利洗脱谱的SpA，因此使用His替换以使结合亲和力发生pH敏感性改变。Brown等未提及使用SpA作为疫苗抗原。
Graille等(2000)描述了SpA结构域D与人IgM抗体Fab片段的晶体结构。通过分析晶体结构，Graille等将Q26、G29、F30、Q32、S33、D36、D37、Q40、N43、E47或L51残基确定为与Fab片段相互作用的结构域D氨基酸残基，并且确定了形成结构域D亚结构域间界面的氨基酸残基。Graille等确定了这两个蛋白质之间的分子相互作用，但未提及使用任何相互作用残基的替换来生产疫苗抗原。
O′Seaghdha等(2006年)描述的研究涉及阐明结构域D的哪个亚结构域结合vWF。作者在Fc或VH3结合亚结构域生成单突变，即氨基酸残基F5A、Q9A、Q10A、F13A、Y14A、L17A、N28A、I31A、K35A、G29A、F30A、S33A、D36A、D37A、Q40A、E47A或Q32A。作者发现vWF与Fc结合同样的亚结构域。O′Seaghda等确定了负责与vWF结合的结构域D亚结构域，但未提及使用任何相互作用残基的替换来生产疫苗抗原。
Gomez等(2006)描述了使用单突变F5A、F13A、Y14A、L17A、N21A、I31A、Q32A和K35A来鉴定负责激活TNFR1的残基。Gomez等未提及使用任何相互作用残基的替换来生产疫苗抗原。
带亲和标签的重组蛋白A是包括5个IgG结构域(EDCAB)(Sjodahl，1977)但缺乏C末端区域X(Guss等，1984)的多肽，将其从重组大肠杆菌中纯化并用作疫苗抗原(Stranger-Jones等，2006)。由于SpA在结合IgG Fc部分中的作用，所以无法测量针对蛋白A的特异性体液免疫应答(Stranger-Jones等，2006)。本发明人通过产生SpA-DQ9，10K；D36，37A克服了这一障碍。经重组蛋白A(SpA)免疫的BALB/c小鼠对金黄色葡萄球菌菌株静脉内攻击显示出显著的保护：与野生型相比，金黄色葡萄球菌负荷减少2.951 log(P＞0.005；Student t-检验)(Stranger-Jones等，2006)。SpA特异性抗体可以在脓肿形成之前导致吞噬清除和/或影响脓肿中上述将免疫细胞和金黄色葡萄球菌区域隔开的嗜酸性障碍的形成，因为这些在蛋白A突变株感染中不形成。5个SpA结构域(即由三螺旋束形成的结构域，称为E、D、A、B和C)每个显示类似的结合特性(Jansson等，1998)。含或者不含Fc和VH3(Fab)配体的结构域D的溶液结构和晶体结构已经解开，这些配体在不同的位点以非竞争性的方式结合蛋白A(Graille等，2000)。已知参与IgG结合的残基(FS、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和K35)的突变对于vWFAI和TNFR1结合也是必需的(Cedergren等，1993；Gomez等，2006；O′Seaghdha等，2006)，而对VH3相互作用重要的残基(Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43、E47)未显示出对其他结合活性的影响(Graille等，2000；Jansson等，1998)。SpA特异性靶向在表面表达VH3家族相关IgM的B细胞亚群，即VH3型B细胞受体(Roben等，1995)。与SpA相互作用后，这些B细胞增殖并凋亡，导致优先的并且延长的先天样B淋巴细胞(即边缘区B细胞和滤泡B2细胞)缺失(Goodyear等，2003；Goodyear等，2004)。
蛋白A表面展示和功能的分子基础。蛋白A在细菌细胞质中以前体形式合成并通过其YSIRK信号肽在横壁(cross wall)(即葡萄球菌的细胞分裂间隔)处分泌(图1)(DeDent等，2007；DeDent等，2008)。在切割C末端LPXTG分选信号后，蛋白A通过分选酶A锚定到细菌肽聚糖交联桥(crossbridge)上(Mazmanian等，1999；Schneewind等，1995；Mazmanian等，2000)。蛋白A是丰度最高的葡萄球菌表面蛋白；几乎所有金黄色葡萄球菌菌株都表达该分子(Cespedes等，2005；Kennedy等；Said-Salim等，2003)。葡萄球菌每个分裂周期转换其15-20％的细胞壁(Navarre和Schneewind，1999年)。鼠水解酶切割肽聚糖的聚糖链和细胞壁肽，从而释放连接有C末端细胞壁二糖四肽的蛋白A到细胞外基质中(Ton-That等，1999)。因此，通过生理学设计，蛋白A不仅锚定在细胞壁上并且在细菌表面展示，还在宿主感染时释放到到周围组织(Marraffini等，2006)。
蛋白A捕获细菌表面的免疫球蛋白，并且此生物化学活性使葡萄球菌能逃避宿主的固有和获得性免疫应答(Jensen，1958；Goodyear等，2004)。有趣的是，蛋白A的区域X(Guss等，1984)(将IgG结合结构域连接到LPXTG分选信号/细胞壁锚定的重复结构域)也许是葡萄球菌基因组中变异性最高的部分(Said-Salim，2003年；Schneewind等，1992)。蛋白A(SpA)的5个免疫球蛋白结合结合域的每个均由三螺旋束形成，并且被称为E、D、A、B和C，它们显示类似的结构和功能特性(Sjodahl，1977；Jansson等，1998)。含或者不含Fc和VH3(Fab)配体的结构域D的溶液结构和晶体结构已经解出，这些配体在不同的位点以非竞争性方式结合蛋白A(Graille等，2000)。
在晶体结构复合物中，Fab通过由4个VH区β-股(β-strand)形成的表面与结构域D的螺旋II和螺旋III相互作用(Graille2000)。结构域D的螺旋II的主轴与所述股的方向约成50°，结构域D的螺旋内部分最靠近C0股。Fab的相互作用位点远离Ig轻链和重链的恒定区。相互作用涉及结构域D的下列残基：螺旋II的Asp-36，螺旋II和螺旋III之间环的ASP-37和Gln-40，以及几个其他残基(Graille2000)。这两个相互作用表面都主要由极性侧链构成，参与相互作用的结构域D的三个负电荷残基和在2A2Fab上的两个正电荷残基提供两个分子间的整体静电吸引。在Fab和结构域D之间鉴定的5个极性相互作用中，三个在侧链之间。在Arg-H19和Asp-36之间形成盐桥，在Tyr-H59和Asp-37之间以及Asn-H82a和Ser-33之间形成两个氢键。由于Asp-36和Asp-37在蛋白A的所有五个IgG结合结构域中是保守的，本发明人对这些残基进行了突变。
负责Fab结合的SpA-D位点在结构上与介导Fcγ结合的结构域表面分隔开。Fcγ与结构域D的相互作用主要涉及螺旋I的残基，并且有较少螺旋II残基参与(Gouda等，1992；Deisenhofer，1981)。除Gln-32(两个复合物中的轻微接触)外没有介导Fcγ相互作用的残基参与Fab结合。为了研究这些不同的Ig结合位点之间的空间关系，这些复合物中的SpA结构域被叠加来构建Fab、SpA-结构域D和Fcγ分子之间复合物的模型。在这个三重模型中，Fab和Fcγ在螺旋II的相反面形成“三明治”夹心，而没有证据表明任一相互作用存在空间位阻。这些结果表明了pA结构域是如何可以在小体积(即56-61个氨基酸)的情况下同时显示两种活性，这解释了Fab与单个结构域的相互作用是非竞争性的实验证据。SpA-D和Fcγ之间的相互作用残基是Gln-9和Gln-10。
与此不同，IgG的Fc部分对结构域D的占据阻断其与vWF A1的相互作用，并且也可能阻断与TNFR1的相互作用(O′Seaghdha等，2006)。对IgG Fc结合必不可少的残基(F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和K35)的突变对于vWF A1和TNFR1结合也是必需的(O′Seaghdha等，2006；Cedergren等，1993；Gomez等，2006)，而对于VH3相互作用必需的残基(Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43、E47)对IgG Fc、vWF A或TNFR1的结合活性没有影响(Jansson等，1998；Graille等，2000)。蛋白A免疫球蛋白Fab结合活性靶向在表面表达VH3家族相关IgM的B细胞亚群，即这些分子作为VH3型B细胞受体发挥作用(Roben等，1995)。与SpA相互作用后，这些B细胞迅速增殖而后凋亡，导致优先的和延长的先天样B淋巴细胞(即边缘区B细胞和滤泡B2细胞)缺失(Goodyear和Silverman，2004；Goodyear和Silverman，2003)。超过40％的循环B细胞被蛋白A相互作用所靶向，VH3家族是赋予针对病原体的保护性体液应答的最大人B细胞受体家族(Goodyear和Silverman，2004年，Goodyear和Silverman，2003)。因此，蛋白A的作用类似于葡萄球菌超抗原(Roben等，1995)，但后一类的分子(例如SEB、TSST-1、TSST-2)与T细胞受体形成复合物，不适当地刺激宿主的免疫应答，从而引发葡萄球菌感染的特征性疾病特征(Roben等，1995；Tiedemann等，1995)。这些发现总体证明了蛋白A在建立葡萄球菌感染和调节宿主免疫应答中的作用。
总之，蛋白A结构域可以视为展示两种不同的界面以与宿主分子结合，并且开发基于蛋白A的任何疫苗都必须考虑产生的变体不会扰乱宿主细胞信号转导、血小板聚集、免疫球蛋白隔离，或者B细胞增殖和凋亡的诱导。这些蛋白A变体还应可以用于分析疫苗产生阻止上述SpA活性并在其双结合界面占据五个重复结构域的抗体的能力。该目标在本申请中首次被明确和解决，并且详细描述了可用作人安全疫苗的蛋白A变体的产生方法。为了干扰IgG Fcγ、vWFAI和TNFR1结合，对谷氨酰胺(Q)9和10[编号来自于Uhlen等，1984描述的SpA结构域D]进行突变，对这两个谷氨酰胺产生赖氨酸替换，预期这些替换消除第一个结合界面的配体属性。为了干扰IgM Fab VH3的结合，对天冬氨酸(D)36和37进行了突变，其每个都是与B细胞受体结合所需的。D36和D37均由丙氨酸替换。在重组分子SpA-DQ9，10K；D36，37A中将Q9，10K和D36，37A突变进行了组合，并检测蛋白A的结合属性。此外，在小鼠和兔中对SpA-D和SpA-DQ9，10K；D36，37A进行免疫研究并分析[1]特异性抗体(SpA-DAb)的产生；[2]SpA-D Ab阻止蛋白A与其四个不同的配体结合的能力，和[3]SpA-D Ab对产生针对葡萄球菌感染的保护性免疫的作用。(参见下文实施例部分)。
B.葡萄球菌凝固酶
凝固酶是由葡萄球菌属细菌产生的将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的酶。Coa和vWh无需蛋白水解就能激活凝血酶原(Friedrich等，2003)。凝固酶·凝血酶原复合物识别纤维蛋白原作为特异性底物，将其直接转化成纤维蛋白。活性复合物的晶体结构表明D1和D2结构域与凝血酶原结合，其Ile1-Val2N末端插入到Ile16口袋，通过构象变化诱导酶原的功能活性位点(Friedrich等，2003)。α-凝血酶的外部位点(Exosite)I(纤维蛋白原识别位点)和凝血酶原上的外部位点前体(proexosite)I被Coa的D2封闭(Friedrich等，2003)。尽管如此，四聚体(Coa-凝血酶原)2复合物的结合在新位点以高亲和力结合纤维蛋白原(Panizzi等，2006)。这个模型解释了凝固酶的凝集特性和高效的纤维蛋白原转化(Panizzi等，2006)。
纤维蛋白原是大的糖蛋白(Mr～340,000)，由三对Aα-，Bβ-和γ-链共价连接形成的“三聚体的二聚体”构成，其中A和B指凝血酶切割释放的纤维蛋白肽(fibrinopeptide)(Panizzi等，2006)。延伸的分子折叠成三个独立的结构域，含所有6条链的N末端的中央片段E以及主要由Bβ-和γ-链的C末端构成两个侧翼片段D。这些球状结构域由长的三螺旋结构连接。凝固酶-凝血酶原复合物将人纤维蛋白原转换成自聚合的纤维蛋白，该复合物不是循环中的凝血酶抑制剂的靶标(Panizzi等，2006)。因此，葡萄球菌凝固酶绕过了生理性凝血途径。
所有金黄色葡萄球菌菌株均分泌凝固酶和vWbp(Bjerketorp等，2004；Field和Smith，1945)。虽然早期工作报道了凝固酶对葡萄球菌感染的发病机理的重要作用(Ekstedt和Yotis，1960；Smith等，1947年)，但近期使用分子遗传学工具进行的研究在小鼠心内膜炎、皮肤脓肿和乳腺炎模型中没有观察到毒力表型，从而对上述观点提出质疑(Moreillon等，1995；Phonimdaeng等，1990)。通过生成金黄色葡萄球菌Newman株(具有完全毒力的临床分离株(Duthie等，1952))的等基因变体，本文描述了在小鼠致命菌血症和肾脓肿模型中，coa突变体的确显示毒力缺陷。根据本发明人的经验，金黄色葡萄球菌8325-4不具有完全毒力，推断这株菌的突变损害可能不能在体内揭示毒力缺陷。此外，针对Coa或vWbp的抗体干扰金黄色葡萄球菌Newman株感染的发病，其程度反映了基因缺失的影响。Coa和vWbp贡献于葡萄球菌脓肿形成和致命菌血症，并且还可在亚单位疫苗中作为保护性抗原发挥作用。
生物化学研究证明了针对Coa和vWbp的抗体的生物学价值。通过结合抗原并阻断其与凝血因子的结合，抗体防止Coa·凝血酶原和vWbp·凝血酶原复合物的形成。被动转移研究揭示Coa和vWbp抗体保护实验动物免于葡萄球菌脓肿形成和致命攻击。因此，Coa和vWbp中和性抗体产生针对葡萄球菌疾病的免疫保护。
早期研究揭示抵抗血液中的细胞吞噬需要凝固酶(Smith等，1947)，本发明人观察到在来匹卢定处理的小鼠血液中Δcoa突变体有类似的现象(参见下文实施例3)。因为vWbp对人凝血酶原比对小鼠凝血酶原显示更高的亲和力，因此怀疑人血液中的ΔvWbp变体也是如此。此外，脓肿损伤中Coa和vWbp的表达以及它们在嗜酸假包膜周围(葡萄球菌脓肿区(SAC))或外周纤维蛋白壁上的大量分布提示，分泌的凝固酶有助于这些损伤的发生。对此假说进行了测试，的确Δcoa突变体在建立脓肿方面有缺陷。相应的测试(用特异性抗体阻断Coa功能)产生了同样的效果。因此，认为纤维蛋白凝集是葡萄球菌脓肿建立中的关键事件，这可用于开发保护性疫苗。由于其对人凝血酶原的功能重叠，认为Coa和vWbp二者都是疫苗开发的极佳候选者。
C.其他葡萄球菌抗原
过去几十年的研究发现金黄色葡萄球菌外毒素、表面蛋白和调节分子是重要的毒力因子(Foster，2005；Mazmanian等，2001；Novick，2003)。对这些基因的调控已取得很大进展。例如，葡萄球菌通过分泌在阈值浓度下结合相应受体的自诱导肽进行细菌普查(bacterial census)，从而激活磷酸级联反应并且转录激活很多外毒素基因(Novick，2003年)。葡萄球菌感染的发病依赖于这些毒力因子(分泌的外毒素，胞外多糖和表面粘附素)。葡萄球菌疫苗的开发受到葡萄球菌侵染机制的多面性的阻碍。公认活减毒微生物是高效的疫苗；这类疫苗引发的免疫应答通常比非复制性免疫原引发的幅度更大并且持续时间更长。对此，一种解释可能是活减毒菌株在宿主内建立有限的感染，模仿自然感染的早期阶段。本发明的一些实施方案涉及的组合物和方法包括革兰氏阳性菌的SpA多肽和肽的变体以及其他免疫原性细胞外蛋白、多肽和肽(包括分泌的和细胞表面的蛋白质或多肽)在减轻感染或对其进行免疫中的用途。在一些具体的实施方案中，细菌是葡萄球菌属细菌。胞外蛋白、多肽或肽包括但不仅限于所靶向细菌的分泌蛋白和细胞表面蛋白。
人病原体金黄色葡萄球菌穿过细菌包膜分泌两种ESAT-6样蛋白EsxA和EsxB(Burts等，2005年，通过引用并入本文)。葡萄球菌esxA和esxB按照转录顺序与其他六个基因形成簇(esxA esaA essA esaB essBessC esaC esxB)。缩写esa、ess和esx分别表示ESAT-6分泌辅助、系统和细胞外(secretion accesory，system，extracellular)，这取决于所编码的蛋白质是否发挥辅助(esa)或直接(ess)分泌的作用，或分泌到(esx)细胞外环境中。整个八个基因的簇在本文中称为Ess簇。EsxA和EsxB的合成或分泌需要esxA、esxB、essA、essB、和essC的全部。不能表达EsxA、EsxB和EssC的突变体在金黄色葡萄球菌鼠脓肿发病中显示出缺陷，表明该专门的分泌系统可能是人体细菌发病的通用策略。对几个抗原(包括EspA、EspB、Rv3483c和Rv3615)已报道通过ESX-1途径分泌非WXG100底物(Fortune等，2005；MacGurn等，2005；McLaughlin等，2007；Xu等，2007)。还证明在病原性分枝杆菌中替代性ESX-5途径分泌WXG100和非WXG100蛋白两者(Abdallah等，2007；Abdallah等，2006)。
金黄色葡萄球菌Ess途径可以被视为配备了专门的转运组件(Ess)、辅助因子(Esa)和相应分泌底物(Esx)的分泌模块。EsxA和EsxB分泌需要EssA、EssB和EssC。因为EssA、EssB和EssC都被预测为跨膜蛋白，所以设想这些蛋白质形成分泌装置。ess基因簇的一些蛋白可主动转运分泌的底物(作为马达发挥作用)，而其他可调节转运(调节因子)。所实现的调节可以是针对(但不限于)分泌多肽的转录或翻译后机制、分选特定底物到确定的位置(例如细胞外基质或宿主细胞)，或感染期间分泌事件的时间。对此，还不清楚所有分泌的Esx蛋白是作为毒素发挥功能还是间接促成发病。
葡萄球菌依赖对宿主细胞的表面蛋白介导的粘附或对组织的侵染作为逃避免疫防御的策略。此外，在感染期间，金黄色葡萄球菌利用表面蛋白螯合宿主的铁。金黄色葡萄球菌发病涉及的大多数表面蛋白质带有C末端分选信号，即，它们通过分选酶与细胞壁包膜共价连接。此外，缺乏表面蛋白锚定所需基因(即分选酶A和B)的葡萄球菌菌株在几个不同疾病的小鼠模型中显示毒力的明显缺陷。因此，表面蛋白抗原是有效的疫苗靶标，因为相应基因对于葡萄球菌疾病的发生至关重要，并且其可以在本发明的多种实施方案中予以利用。分选酶超家族是负责将表面蛋白毒力因子锚定到肽聚糖细胞壁层的革兰氏阳性菌转肽酶。在金黄色葡萄球菌中已鉴定两种分选酶同工型，SrtA和SrtB。这些酶已被证明识别底物蛋白的LPXTG基序。SrtB同工型在血红素铁的获得和铁的体内平衡中显示重要作用，而SrtA同工型在革兰氏阳性菌的发病中发挥关键作用，这是通过将粘附素和其他蛋白共价锚定到细胞壁肽聚糖上来调节细菌粘附宿主组织的能力。在某些实施方案中，本文所述的SpA变体可以与其他葡萄球菌蛋白联合使用，所述蛋白如Coa、Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsaB、EsxA、EsxB、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasF、vWbp和/或vWh蛋白。
本发明的某些方面包括涉及蛋白质性组分的方法和组合物，所述蛋白质性组分包括多肽、肽或编码SpA变体和其他葡萄球菌抗原(例如Ess途径转运的其他蛋白或分选酶底物)的核酸。这些蛋白质可以通过缺失、插入和/或替换进行修饰。
Esx多肽包括葡萄球菌属细菌Esx蛋白的氨基酸序列。Esx序列可以来自于特定的葡萄球菌属物种(如金黄色葡萄球菌)，也可以来自于特定的菌株例如Newman株。在某些实施方案中，EsxA序列是来自于Mu50株的SAV0282(与Newman株具有相同的氨基酸序列)，它可以通过GenBank登录号Q99WU4(gi|68565539)获得，其通过引用并入本文。在另一些实施方案中，EsxB序列是来自于Mu50株的SAV0290(与Newman株具有相同的氨基酸序列)，它可以通过GenBank登录号Q99WT7(gi|68565532)获得，其通过引用并入本文。在另一些实施方案中，可以使用其他由Ess途径转运的多肽，其序列可由本领域技术人员使用数据库和可获得的网络资源确定。
分选酶底物多肽包括但不限于葡萄球菌属细菌的SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC或SasF蛋白的氨基酸序列。分选酶底物多肽序列可以来自于特定的葡萄球属物种(如金黄色葡萄球菌)，也可以来自于特定的菌株，例如Newman株。在某些实施方案中，SdrD序列来自于N315株并可使用GenBank登录号NP_373773.1(gi|15926240)获取，其通过引用并入本文。在另一些实施方案中，SdrE序列来自于N315株并可使用GenBank登录号NP_373774.1(gi|15926241)获取，其通过引用并入本文。在另一些实施方案中，IsdA序列是来自于Mu50株的SAV1130(与Newman株具有相同的氨基酸序列)并且可以使用GenBank登录号NP_371654.1(gi|15924120)获得，其通过引用并入本文。在另一些实施方案中，IsdB序列是来自于Mu50株的SAV1129(与Newman株具有相同的氨基酸序列)并且可以使用GenBank登录号NP_371653.1(gi|15924119)获得，其通过引用并入本文。在另一些实施方案中，也可以使用由Ess途径转运或由分选酶加工的其他多肽，其序列可由本领域技术人员使用数据库和可获得的网络资源确定。
本发明可以使用的多种蛋白质的例子可以通过分析数据库中提交的细菌基因组而确定，它们包括但不限于登录号NC_002951(GI：57650036和GenBank CP000046)、NC_002758(GI：57634611和GenBankBA000017)、NC_002745(GI：29165615和GenBank BA000018)、NC_003923(GI：21281729和GenBank BA000033)、NC_002952(GI：49482253和GenBank BX571856)、NC_002953(GI：49484912和GenBank中BX571857)、NC_007793(GI：87125858和GenBank CP000255)NC_007795(GI：87201381和GenBank CP000253)，每个均通过引用并入本文。
本文所用“蛋白质”或“多肽”是指含有至少十个氨基酸残基的分子。在一些实施方案中，使用蛋白质或多肽的野生型形式，但是在本发明的许多实施方案中，使用经修饰的蛋白质或多肽来产生免疫应答。上述术语可互换使用。“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”或“变体”是指其化学结构(特别是其氨基酸序列)与野生型蛋白质或多肽相比发生改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，经修饰的/变体蛋白质或多肽具有至少一种改变的活性或功能(应理解蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。本发明特别考虑的是，可针对一种活性或功能来改变被修饰的/变体蛋白质或多肽，而在其它方面保留野生型活性或功能(如免疫原性)。
在某些实施方案中，蛋白质或多肽(野生型或经修饰的)的大小可以包括但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个(以及其中衍生的任何范围)氨基分子或更多，或者本文所述或所引用的对应氨基序列的衍生物。考虑的是，可通过截短(使其短于相应的野生型形式)来突变多肽，也可通过融合或缀合具有特定功能(例如用于靶向或定位、用于增强免疫原性、用于纯化目的等)的异源蛋白质序列来改变多肽。
本文使用的“氨基分子”是指本领域所知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质性分子的残基是连续的，没有任何非氨基分子间插氨基分子残基的序列。在另一些实施方案中，所述序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在一些具体实施方案中，蛋白质性分子的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分所间插。
因此，术语“蛋白质性组合物”涵盖氨基分子序列，所述序列包含天然合成蛋白质中20种常见氨基酸的至少一种或者至少一种经修饰的或非常见氨基酸。
可采用本领域技术人员所知的任何技术来制造蛋白质性组合物，所述技术包括(i)通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，(ii)从天然来源中分离蛋白质性化合物，或(iii)化学合成蛋白质性物质。之前已经公开了多种基因的核苷酸及蛋白质、多肽和肽的序列，还可以在公认的计算机化数据库中找到上述序列。其中一个数据库是国立生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(网址为ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文公开的或为本领域普通技术人员所知的技术来扩增和/或表达这些基因的编码区。
SpA、凝固酶和其他本发明多肽的氨基酸序列变体可以是替换、插入或缺失变体。相比野生型，本发明多肽中的变化可影响多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个非连续或连续的氨基酸。变体可包含与本文提供或引用的任何序列(例如SEQID NO：2-8或SEQ ID NO：11-30)有至少50％、60％、70％、80％或90％(包括其间所有数值和范围)同一性的氨基酸序列。变体可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个替换的氨基酸。来自任何葡萄球菌属菌种和菌株的Ess途径加工或分泌的多肽或其他表面蛋白(参见表1)或分选酶底物都被考虑在本文所述的组合物和方法中使用。
缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质中的一个或多个残基。可以缺失单个残基，或者可以缺失多个连续的氨基酸。可将终止密码子(通过替换或插入)引入编码核酸序列中以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽非末端位点处加入物质。这可包括插入一个或多个残基。还可产生称作融合蛋白的末端添加。这些融合蛋白包括本文描述或引用的一个或更多个肽或多肽的多聚体或串联体。
替换变体通常包含在蛋白质一个或多个位点处将一种氨基酸替换为另一种，并可被设计成调节多肽的一个或多个特性，同时丢失或不丢失其它功能或特性。替换可以是保守性的，即将一种氨基酸替换成形状和电荷相似的氨基酸。保守性替换为本领域所熟知，包括例如以下改变：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守性改变通常包括将残基替换成化学性质上不相似的残基，如极性或带电氨基酸替换非极性或不带电氨基酸，反之亦然。
表2.金黄色葡萄球菌菌株示例性表面蛋白
  SAV号   SA号   表面   MW2   Mu50   N315   Newman   MRSA252*   MSSA476*
 SAV0111   SA0107   Spa   492   450   450   520   516   492
 SAV2503   SA2291   FnBPA   1015   1038   1038   741   -   1015
 SAV2502   SA2290   FnBPB   943   961   961   677   965   957
 SAV0811   SA0742   ClfA   946   935   989   933   1029   928
 SAV2630   SA2423   ClfB   907   877   877   913   873   905
  Np   Np   Cna   1183   -   -   -   1183   1183
 SAV0561   SA0519   SdrC   955   953   953   947   906   957
 SAV0562   SA0520   SdrD   1347   1385   1385   1315   -   1365
 SAV0563   SA0521   SdrE   1141   1141   1141   1166   1137   1141
  Np   Np   Pls   -   -   -   -   -   -
 SAV2654   SA2447   SasA   2275   2271   2271   2271   1351   2275
 SAV2160   SA1964   SasB   686   2481   2481   2481   2222   685
  SA1577   SasC   2186   213   2186   2186   2189   2186
 SAV0134   SA0129   SasD   241   241   241   241   221   241
 SAV1130   SA0977   SasE/IsdA   350   350   350   350   354   350
 SAV2646   SA2439   SasF   635   635   635   635   627   635
 SAV2496   SasG   1371   525   927   -   -   1371
 SAV0023   SA0022   SasH   772   -   772   772   786   786
 SAV1731   SA1552   SasI   895   891   891   891   534   895
 SAV1129   SA0976   SasJ/IsdB   645   645   645   645   652   645
  SA2381   SasK   198   211   211   -   -   197
  Np   SasL   -   232   -   -   -   -
 SAV1131   SA0978   IsdC   227   227   227   227   227   227
本发明的蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者，可以从细菌中分离出非重组或重组的蛋白质。还考虑可将含有上述变体的细菌应用于本发明的组合物和方法中。因此，不需要分离蛋白质。
本文中使用的术语“功能等同密码子”是指编码同一氨基酸的密码子(如精氨酸或丝氨酸的六个密码子)，也指编码生物学等同氨基酸的密码子(见下表2)。
表3.密码子表
Figure BDA00002686453900511
还应当理解，只要该序列满足上文设定的标准(包括保持与蛋白质表达相关的蛋白质生物活性(例如免疫原性))，氨基酸和核酸序列可包含额外的残基(如额外的N端或C端氨基酸或分别地5′或3′序列)，但仍然基本如本文公开的序列之一所示。末端序列的添加特别适用于核酸序列，例如，其可包含位于编码区5′或3′部分之侧翼的多种非编码序列。
下文是基于改变蛋白质的氨基酸来产生变体多肽或肽的讨论。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可以替换为其他氨基酸，伴随有或没有与结构(例如抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点)的相互结合能力的明显损失。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定蛋白质的功能活性，因此可在蛋白质序列(及其DNA编码序列)中进行某些氨基酸替换，而仍产生具有期望特性的蛋白质。因此，本发明人考虑可在基因的DNA序列中进行多种改变。
考虑在本发明的组合物中，每毫升中多肽、肽和/或蛋白总量为约0.001mg至约10mg。组合物中的蛋白质浓度可以是约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或其中衍生的任何范围)。这其中约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％可以是SpA变体或凝固酶，并且可以与其他肽或多肽(例如其他细菌肽和/或抗原)联合使用。
本发明考虑了施用SpA变体多肽或肽来影响预防性治疗或治疗效果，其针对葡萄球病原体感染相关的疾病或病症的发生。
在某些方面，将葡萄球菌抗原的组合用于生产有效治疗或预防葡萄球菌感染的免疫原性组合物。葡萄球菌感染经历几个不同阶段。例如，葡萄球菌的生活周期包含共生定殖，通过进入邻近组织或血流起始感染，和/或在血液中厌氧性扩增。金黄色葡萄球菌毒力决定簇与宿主防御机制相互作用可诱导并发症如心内膜炎、转移性脓肿形成和败血症综合征。细菌表面上的不同分子参与感染周期的不同阶段。某些抗原的组合可引发免疫应答，其针对葡萄球菌感染的多个阶段进行保护。可在动物模型测定和/或使用调理吞噬测定来测量免疫应答的效力。
D.多肽和肽的生产
本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、肽和蛋白质及其免疫原性片段。例如，对特定多肽进行测定或使用以引发免疫应答。在一些具体实施方案中，也可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成本发明蛋白质的全部或部分。多种自动合成仪是可购得的，且可以根据已知的方案加以使用。参见例如Stewart和Young(1984)、Tam等(1983)、Merrifield(1986)、Barany和Merrifield(1979)，其均通过引用并入本文。
或者，可使用重组DNA技术，其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染入合适的宿主细胞并在适于表达的条件下培养细胞。
本发明的一个实施方案包括利用转移至细胞(包括微生物)的基因来产生和/或呈现多肽或肽。可将目的多肽或肽的基因转移到合适的宿主细胞中，接着在合适条件下培养细胞。重组表达载体的产生和其中包含的元件是现有技术公知的，并在本文中简单讨论。或者，要生产的蛋白质可以是分离并纯化的由细胞正常合成的内源蛋白质。
本发明的另一实施方案使用了自体B淋巴细胞细胞系，所述细胞系转染有表达免疫原产物(更具体地为具有免疫原活性的蛋白质)的病毒载体。哺乳动物宿主细胞系的其它实例包括但不限于Vero和HeLa细胞、其他B和T细胞系(如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji)以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞。此外，可选择调节插入序列表达的或以期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可以对蛋白质功能是重要的。不同宿主细胞在蛋白质的翻译后加工和修饰方面具有特征性和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统来确保所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。
可使用多种选择系统，包括但不限于分别位于tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。此外，还可使用代谢物抗性作为选择基础：dhfr赋予对甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性；gpt赋予对霉酚酸的抗性；neo赋予对氨基糖苷G418的抗性；hygro赋予对潮霉素的抗性。
动物细胞可以两种方式在体外增殖：非锚着依赖性细胞，其在整个培养物体积中悬浮生长，或者锚着依赖性细胞，其需要附着在固体基底上进行增殖(即单层类型的细胞生长)。
来源于连续的已建立细胞系的非锚着依赖性或悬浮培养物是大规模生产细胞和细胞产物的最常用方法。但是，悬浮培养的细胞具有局限性，例如致瘤潜力和低于贴附细胞的蛋白质产量。
当本文具体提及蛋白质时，优选表示天然或重组蛋白质，或者任选地已去除任何信号序列的蛋白质。所述蛋白质可直接从葡萄球菌菌株分离出来或者通过重组DNA技术产生。蛋白质的免疫原性片段可并入本发明的免疫原性组合物中。它们是包含连续取自蛋白质氨基酸序列的至少10个氨基酸、20个氨基酸、30个氨基酸、40个氨基酸、50个氨基酸或100个氨基酸(包括其间所有值和范围)的片段。另外，此类免疫原性片段与针对葡萄球菌蛋白产生的抗体或者与用葡萄球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体具有免疫反应性。免疫原性片段还包括当以有效剂量施用时(单独地或作为结合载体的半抗原)引发针对葡萄球菌感染之保护性或治疗性免疫应答的片段，在某些方面，其具有针对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染的保护作用。这些免疫原性片段可包含例如缺少N端前导序列和/或跨膜结构域和/或C端锚定结构域的蛋白质。在一个优选方面中，本发明的免疫原性片段包含与本文所述或引用得多肽的所选区段序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或者至少97-99％同一性(包括其间所有值和范围)的蛋白质的基本上全部的细胞外结构域。
本发明的免疫原性组合物还包含由一种或更多种葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白免疫原性片段构成的融合蛋白。这些融合蛋白可以通过重组产生，可包含至少1、2、3、4、5或6种葡萄球菌蛋白或区段的一部分。或者，融合蛋白可包含至少1、2、3、4或5种葡萄球菌蛋白的多个部分。它们可在同一蛋白质中组合不同的葡萄球菌蛋白和/或多个相同的蛋白质或蛋白质片段或者其免疫原性片段(形成多聚体或串联体)。或者，本发明还包括葡萄球菌蛋白或其免疫原性片段的各个融合蛋白，所述融合蛋白具有异源序列，例如其提供T-细胞表位或纯化标签(例如：β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP))、表位标签(例如FLAG、myc标签、多聚组氨酸)或者病毒表面蛋白质(例如流感病毒血凝素)或细菌蛋白质(例如破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197)。
IV.核酸
在某些实施方案中，本发明涉及编码本发明蛋白质、多肽、肽的重组多核苷酸。包括SpA、凝固酶和其他细菌蛋白的核酸序列，所有均通过引用并入本文，并且可以用于制备肽或多肽。
本申请所用术语“多核苷酸”是指重组的或从总基因组核酸中分离出的核酸分子。术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(长度少于等于100个残基的核酸)、重组载体，包括如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括基本与其天然存在的基因或蛋白质编码序列分离的调控序列。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是RNA、DNA(基因组，cDNA或合成的)、其类似物或其组合。多核苷酸内可以存在另外的编码或非编码序列，但这不是必须的。
在该方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括正确转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。本领域技术人员会理解该术语涵盖表达或可适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白质和突变体的基因组序列、表达盒、cDNA序列和经改造的小核酸区段。编码全部或部分多肽的核酸可以包含编码一种或更多种本文所述或引用之氨基酸序列的多核苷酸中10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000个或更多个核苷酸、核苷或碱基对(包括其间所有值和范围)的连续核酸序列。还考虑的是可由包含变化的核酸(具有稍有不同核酸序列但仍编码相同或基本类似的蛋白质)编码特定多肽(参见上表3)。
在一些具体的实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和整合编码SpA变体或凝固酶的核酸序列的重组载体。术语“重组”可以与多核苷酸或多肽联合使用，并且一般指体外产生和/或操作的多肽或多核苷酸，或该分子的复制产物。
在另一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和整合编码SpA变体或凝固酶多肽或肽的核酸序列的重组载体在对象中产生免疫应答。在多种实施方案中，本发明的核酸可用于基因疫苗。
本发明中所用的核酸区段可以与其它核酸序列(例如启动子、多聚腺苷酸化信号、额外的限制性酶切位点、多克隆位点、其它编码区段等)相组合，从而使它们的全长可变化很大。因此，考虑到可使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选受到制备简便性和在预定使用的重组核酸方案的限制。在某些情况下，核酸序列可编码具有额外异源编码序列的多肽序列，例如以允许纯化所述多肽、转运、分泌、翻译后修饰或者为了治疗益处(例如靶向或效力)。如上所述，可将标签或其他异源多肽添加到修饰的多肽编码序列，其中“异源”指与所修饰多肽不同的多肽。
在另一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和重组载体，在其序列内包含来自SEQ ID NO：1(SpA结构域D)或SEQ ID NO：3(SpA)的连续核酸序列或其他核酸序列，所述其他核酸序列编码凝固酶或其他分泌毒力因子和/或表面蛋白，包括由Ess途径转运的蛋白、分选酶加工的蛋白或通过引用并入本文的蛋白质。
在某些实施方案中，本发明提供的多核苷酸变体与本文公开的序列具有基本同一性；它们包括使用本文所述方法(如使用标准参数的BLAST分析)与本发明多核苷酸序列比较具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高(包括其间所有数值和范围)序列同一性的那些。
与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸的使用也在本发明考虑之内。
A.载体
本发明的多肽可由载体中包含的核酸分子编码。所使用的术语“载体”是指载体核酸分子，异源核酸序列可插入其中以引入到其可复制和表达的细胞中。核酸序列可以是“异源的”，这是指其所在环境对于待引入载体的细胞或者被整合入的核酸而言是外源的，其包含与所述细胞或核酸中之序列同源的序列，但是该序列处于宿主细胞或核酸中通常不存在它的位置。载体包括DNA、RNA、质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员将通过标准重组技术(例如Sambrook等，2001；Ausubel等，1996，两者均通过引用并入本文)容易地构建载体。除了编码SpA变体多肽之外，载体还可编码其他多肽序列，例如一种或更多种其他细菌肽、标签或免疫原性增强肽。编码这些融合蛋白的有用载体包括pIN载体(Inouye等，1985)、编码一段组氨酸的载体和用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性融合蛋白的pGEX载体，以用于后期纯化和分离或切割。
术语“表达载体”是指含有编码能够转录的基因产物之至少一部分的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子随后翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可含有多种“控制序列”，其表示可操作性连接的编码序列在特定宿主生物体内转录和可能的翻译所需的核酸序列。除了调控转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可含有用作其他功能的核酸序列，其在本文中有描述。
1.启动子和增强子
“启动子”是控制序列。启动子通常是控制转录起始和速率的核酸序列区域。它可含有可结合调节性蛋白和分子(例如RNA聚合酶及其他转录因子)的遗传元件。短语“可操作性位于”、“可操作性连接”、“控制之下”和“处于转录控制之下”表示启动子相对于核酸序列处于控制该序列的转录起始和表达的正确功能的位置和/或方向。启动子可以或可以不与“增强子”配合使用，所述增强子是指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。
自然地，利用在选择用于表达的细胞类型或生物体中有效指导DNA区段表达的启动子和/或增强子可以是重要的。分子生物学领域技术人员一般知道使用启动子、增强子和细胞类型的组合用于蛋白质表达(参见Sambrook等，2001，通过引用并入本文)。采用的启动子可以是组成型、组织特异性或可诱导的，在某些实施方案中，在特定条件下(例如大规模生产重组蛋白质或肽)可指导引入的DNA区段高水平表达。
在本发明的背景下，可利用多种元件/启动子来调节基因的表达。作为可响应于特定刺激而活化的核酸序列区域的这些可诱导元件的实例包括但不限于：免疫球蛋白重链(Banerji等，1983；Gilles等，1983；Grosschedl等，1985；Atchinson等，1986，1987；Imler等，1987；Weinberger等，1984；Kiledjian等，1988；Porton等；1990)、免疫球蛋白轻链(Queen等，1983；Picard等，1984)、T细胞受体(Luria等，1987；Winoto等，1989；Redondo等；1990)、HLA DQ α和/或DQ β(Sullivan等，1987)、β干扰素(Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn等，1988)、白介素-2(Greene等，1989)、白介素-2受体(Greene等，1989；Lin等，1990)、MHC II类5(Koch等，1989)、MHC II类HLA-DR α(Sherman等，1989)、β-肌动蛋白(Kawamoto等，1988；Ng等；1989)、肌肉肌酸激酶(MCK)(Jaynes等，1988；Horlick等，1989；Johnson等，1989)、前白蛋白(转甲状腺素)(Costa等，1988)、弹性蛋白酶I(Ornitz等，1987)、金属硫蛋白(MTII)(Karin等，1987；Culotta等，1989)、胶原酶(Pinkert等，1987；Angel等，1987)、白蛋白(Pinkert等，1987；Tronche等，1989，1990)、α-甲胎蛋白(Godbout等，1988；Campere等，1989)、γ-珠蛋白(Bodine等，1987；Perez-Stable等，1990)、β-珠蛋白(Trudel等，1987)、c-fos(Cohen等，1987)、c-Ha-Ras(Triesman，1986；Deschamps等，1985)、胰岛素(Edlund等，1985)、神经细胞粘附分子(NCAM)(Hirsh等，1990)、α1-抗胰蛋白酶(Latimer等，1990)、H2B(TH2B)组蛋白(Hwang等，1990)、小鼠和/或I型胶原(Ripe等，1989)、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)(Chang等，1989)、大鼠生长素(Larsen等，1986)、人血清淀粉样蛋白A(SAA)(Edbrooke等，1989)、肌钙蛋白I(TN I)(Yutzey等，1989)、血小板衍生生长因子(PDGF)(Pech等，1989)、杜氏肌营养不良(Klamut等，1990)、SV40(Banerji等，1981；Moreau等，1981；Sleigh等，1985；Firak等，1986；Herr等，1986；Imbra等，1986；Kadesch等，1986；Wang等，1986；Ondek等，1987；Kuhl等，1987；Schaffner等，1988)、多形瘤(Swartzendruber等，1975；Vasseur等，1980；Katinka等，1980，1981；Tyndell等，1981；Dandolo等，1983；de Villiers等，1984；Hen等，1986；Satake等，1988；Campbell等，1988)、逆转录病毒(Kriegler等，1982，1983；Levinson等，1982；Kriegler等，1983，1984a，b，1988；Bosze等，1986；Miksicek等，1986；Celander等，1987；Thiesen等，1988；Celander等，1988；Choi等，1988；Reisman等，1989)、乳头状瘤病毒(Campo等，1983；Lusky等，1983；Spandidos和Wilkie，1983；Spalholz等，1985；Lusky等，1986；Cripe等，1987；Gloss等，1987；Hirochika等，1987；Stephens等，1987)、乙肝病毒(Bulla等，1986；Jameel等，1986；Shaul等，1987；Spandau等，1988；Vannice等，1988)、人免疫缺陷病毒(Muesing等，1987；Hauber等，1988；Jakobovits等，1988；Feng等，1988；Takebe等，1988；Rosen等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp等，1989；Braddock等，1989)、巨细胞病毒(CMV)IE(Weber等，1984；Boshart等，1985；Foecking等，1986)、长臂猿类人猿白血病病毒(Holbrook等，1987；Quinn等，1989)。
可诱导元件包括但不限于：MT II-佛波酯(TFA)/重金属(Palmiter等，1982；Haslinger等，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等，1987；Karin等，1987；Angel等，1987b；McNeall等，1989)；MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)-糖皮质激素(Huang等，1981；Lee等，1981；Majors等，1983；Chandler等，1983；Lee等，1984；Ponta等，1985；Sakai等，1988)；β-干扰素-聚(rI)x/聚(rc)(Tavernier等，1983)；腺病毒5E2-ElA(Imperiale等，1984)；胶原酶-佛波酯(TPA)(Angel等，1987a)；基质裂解素-佛波酯(TPA)(Angel等，1987b)；SV40-佛波酯(TPA)(Angel等，1987b)；鼠MX基因-干扰素，新城疫病毒(Hug等，1988)；GRP78基因-A23187(Resendez等，1988)；α-2-巨球蛋白-IL-6(Kunz等，1989)；中间丝蛋白-血清(Rittling等，1989)；MHC I类基因H-2κb-干扰素(Blanar等，1989)；HSP70-ElA/SV40大T抗原(Taylor等，1989，1990a，1990b)；增殖蛋白-佛波酯/TPA(Mordacq等，1989)；肿瘤坏死因子-PMA(Hensel等，1989)；以及甲状腺刺激激素α基因-甲状腺素(Chatterjee等，1989)。
认为用于控制本发明肽或蛋白质编码多核苷酸表达的特定启动子不是关键性的，只要其能够在靶细胞(优选细菌细胞)中表达多核苷酸即可。当靶向人细胞时，优选使得多核苷酸编码区域位于邻近能够在人细胞中表达的启动子并且处于其控制之下。一般而言，此类启动子可包括细菌、人或病毒启动子。
在向对象施用载体以表达蛋白质的实施方案中，考虑用于所述载体的理想启动子是不被细胞因子下调的启动子，或者是足够强到即使下调也能产生引发免疫应答的有效量的SpA变体的启动子。这样的非限制性实例有CMV IE和RSV LTR。可使用组织特异性启动子，特别是如果表达是在希望表达抗原的细胞(例如树突状细胞或巨噬细胞)中进行的话。哺乳动物MHC I和MHC II启动子是此类组织特异性启动子的实例。
2.起始信号和内部核糖体结合位点(IRES)
特异性起始信号也可以是编码序列有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员能够容易地确定这一点并提供必要的信号。
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)元件产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5′-甲基加帽依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988，Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可与异源开放读码框相连。多个开放读码框可一起转录，其各自被IRES隔开，形成多顺反子信使。可使用单个启动子/增强子转录单个信使有效地表达多个基因(参见美国专利5,925,565和5,935,819，其通过引用并入本文)。
3.选择和筛选标记物
在本发明的某些实施方案中，可通过在表达载体中编码筛选或选择标记物从而在体外或体内鉴定含有本发明核酸构建物的细胞。当转录和翻译时，标记物赋予细胞可鉴定的改变，使得容易鉴定含有所述表达载体的细胞。通常，选择标记物是赋予允许进行选择的性质的标记物。阳性选择标记物是指标记物的存在允许其的选择的标记物，而阴性选择标记物是指其存在阻碍其的选择的标记物。阳性选择标记物的实例有抗药性标记物。
B.宿主细胞
本文使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换地使用。所有这些术语还包括其后代(其为任意和所有的后代)。应了解，由于人为或偶然的突变，可能并非所有后代都是相同的。在表达异源核酸序列的情形下，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其包括任何可进行转化的、能够复制载体或表达由载体编码的异源基因的生物体。宿主细胞可以并且已用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，其表示外源核酸(例如重组的蛋白质编码序列)转移或引入宿主细胞的过程。经转化细胞包括原代对象细胞及其后代。
宿主细胞可来源于原核生物或真核生物，包括细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，用以复制载体或者表达核酸序列的部分或全部。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，并且它们可通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)(其是活培养物和遗传物质存档的机构(www.atcc.org))获得。
C.表达系统
存在多种表达系统，其包括上述组合物的至少一部分或全部。基于原核生物和/或真核生物的系统可用于本发明，以产生核酸序列或其相应多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是可购得的并且易于得到。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白质表达，例如美国专利5,871,986、4,879,236中所述(其两者均通过引用并入本文)，并且其可购得，如INVITROGEN的MAXBAC
Figure BDA00002686453900602
2.0以及CLONTECH
Figure BDA00002686453900603
的BACPACKTM BACULOVIRUS EXPRESSIONSYSTEM。
除了公开的本发明表达系统之外，其它表达系统实例包括STRATAGENE
Figure BDA00002686453900604
的COMPLETE CONTROLTM可诱导哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮素诱导受体，或者其pET表达系统(一种大肠杆菌表达系统)。可诱导表达系统的另一个例子是INVITROGEN
Figure BDA00002686453900605
的T-REXTM(四环素调节表达)系统，其是使用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达系统。INVITROGEN
Figure BDA00002686453900606
还提供了酵母表达系统，称为甲醇毕赤酵母(Pichia methanolicaPichia methanolica)表达系统，其设计成在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白质。本领域技术人员了解如何表达载体(例如表达构建物)，以产生核酸序列或其相应多肽、蛋白质或肽。
III.多糖
本发明的免疫原性组合物还可包含荚膜多糖，包括下列一种或多种：PIA(也称为PNAG)和/或金黄色葡萄球菌V型和/或VIII型荚膜多糖和/或表皮葡萄球菌I型和/或II型和/或III型荚膜多糖。
A.PIA(PNAG)
目前已清楚鉴定为PS/A、PIA和SAA的多种形式葡萄球菌表面多糖是同一化学实体——PNAG(Maira-Litran等，2004)。因此，术语PIA或PNAG涵盖所有这些多糖或衍生自它们的寡糖。
PIA是多糖细胞间粘附素，其由N-乙酰基和O-琥珀酰基成分取代的β-(1→6)-连接葡糖胺组成。此多糖在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都存在，并可从任一来源中分离出来(Joyce等，2003；Maira-Litran等，2002)。例如，PNAG可分离自金黄色葡萄球菌MN8m株(WO04/43407)。分离自表皮葡萄球菌的PIA是生物膜的整合成分。它负责介导细胞-细胞粘附，可能也发挥为生长的群落屏蔽宿主免疫应答的功能。先前称为聚-N-琥珀酰-β-(1→6)-葡糖胺(PNSG)的多糖最近显示出不具有预期的结构，这是因为对N-琥珀酰基化的鉴定是不正确的(Maira-Litran等，2002)。因此，之前称为PNSG现在被称为PNAG的多糖也涵盖在术语PIA中。
PIA(或PNAG)可具有不同的大小，从超过400kDa到75～400kDa到10～75kDa到最多由30个重复单位(N-乙酰基和O-琥珀酰基组分取代的β-(1→6)-连接的葡糖胺)组成的寡糖不等。任何大小的PIA多糖或寡糖都可用于本发明的免疫原性组合物中，在一方面多糖超过40kDa。可通过本领域已知的任何方法实现大小的调整，例如微流体化(microfluidization)、超声照射或化学切割(WO 03/53462、EP497524、EP497525)。在某些方面PIA(PNAG)至少或至多40～400kDa、40～300kDa、50～350kDa、60～300kDa、50～250kDa和60～200kDa。
由于乙酸酯对氨基的取代，PIA(PNAG)可具有不同程度的乙酰化。体外产生的PIA的氨基几乎完全被取代(95～100％)。或者，可使用具有少于60％、50％、40％、30％、20％、10％乙酰化的脱乙酰化PIA(PNAG)。脱乙酰化PIA(PNAG)的使用是优选的，因为PNAG的非乙酰化表位在介导调理素杀伤革兰氏阳性细菌(优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌)方面是高效的。在某些方面，PIA(PNAG)具有40kDa至300kDa的大小，并且是脱乙酰化的，从而少于60％、50％、40％、30％或20％的氨基是乙酰化的。
术语脱乙酰化的PNAG(dPNAG)是指其中少于60％、50％、40％、30％、20％或10％的氨基是乙酰化的PNAG多糖或寡糖。在某些方面，通过化学处理天然多糖使得PNAG脱乙酰化形成dPNAG。例如，用碱溶液处理天然PNAG，使得pH升高至高于10。例如，用0.1～5M、0.2～4M、0.3～3M、0.5～2M、0.75～1.5M或1M的NaOH、KOH或NH4OH处理PNAG。在20～100、25～80、30～60或30～50或35～45℃的温度下处理至少10～30分钟，或者1、2、3、4、5、10、15或20个小时。dPNAG可如WO 04/43405所述制备。
多糖可以可与载体蛋白缀合或是非缀合的。
B.来自金黄色葡萄球菌的5型和8型多糖
大多数在人体中造成感染的金黄色葡萄球菌含有5型或8型多糖。约60％的人菌株是8型，约30％的是5型。5型和8型荚膜多糖抗原的结构由Moreau等(1990)和Fournier等(1984)所描述。两者都在重复单元中具有FucNAcp以及可用于引入巯基的ManNAcA。其结构为：
5型
→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
最近(Jones，2005)，NMR光谱将结构修正为：
5型
→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
可使用本领域技术人员公知方法(参见美国专利6,294,177)从合适的金黄色葡萄球菌菌株提取多糖。例如，ATCC 12902是5型金黄色葡萄球菌菌株，ATCC 12605是8型金黄色葡萄球菌菌株。
多糖具有天然大小，或者可通过如微流体化、超声照射或化学处理改变其大小。本发明还涵盖衍生自金黄色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。本发明免疫原性组合物中包含的5型和8型多糖优选如下所述与载体蛋白缀合或者是非缀合的。或者，本发明的免疫原性组合物包含5型或8型多糖。
C.金黄色葡萄球菌336抗原
在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物包含美国专利6,294,177中所述的金黄色葡萄球菌336抗原。所述336抗原包含β-连接己糖胺，其不含O-乙酰基，并特异性结合针对金黄色葡萄球菌336型(以ATCC 55804保藏)的抗体。在一个实施方案中，所述336抗原是多糖，其具有天然大小，或者可通过如微流体化、超声照射或化学处理改变其大小。本发明还涵盖了衍生自336抗原的寡糖。336抗原可以是与载体蛋白缀合的或者是非缀合的。
D.来自表皮葡萄球菌的I、II和III型多糖
在与免疫接种中使用多糖有关的问题中，事实是多糖本身是弱的免疫原。优选地，本发明中所用的多糖与提供旁观T细胞的蛋白质运载体相连以改善免疫原性。此类可缀合多糖免疫原的运载体的实例包括白喉和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔槭血蓝蛋白(KLH)和纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD)、绿脓假单胞菌外蛋白A(rEPA)、来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任一的片段。适用的片段包括含有T辅助细胞表位的片段。特别地，来自流感嗜血杆菌的蛋白D片段优选含有所述蛋白N端的1/3。蛋白D是来自流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白(EP 0 594 610 B1)，其为潜在的免疫原。另外，葡萄球菌蛋白可用作本发明多糖缀合物中的运载体蛋白。
特别有利地用于葡萄球菌疫苗背景中的载体蛋白是葡萄球菌α类毒素。其天然形式可与多糖缀合，因为缀合加工减少毒性。优选地，由于残存毒性较低，所以优选经遗传改造解毒的α毒素(例如His35Leu或His35Arg变体)用作运载体。或者，通过用交联剂甲醛或戊二醛处理对α毒素进行化学解毒。遗传解毒的α毒素任选地是化学解毒的，优选地通过用交联剂甲醛或戊二醛处理以进一步降低毒性。
可通过任何已知方法(例如美国专利4,372,945、4,474,757和4,356,170)将多糖与运载体蛋白相连。优选地，进行CDAP缀合化学方法(参见WO95/08348)。在CDAP中，优选使用氰基化剂1-氰基-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)合成多糖-蛋白质缀合物。氰基化反应可在相对温和条件下进行，其避免了碱敏感多糖的水解。该合成允许直接偶联运载体蛋白。
缀合优选包括在运载体蛋白和多糖之间产生直接连接。任选地，可在运载体蛋白和多糖之间引入间隔物(例如二氢己二酸(adipic dihydride，ADH))。
IV.免疫应答和测定
如上文所述，本发明涉及引发或诱导对象中针对SpA变体或凝固酶肽的免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答可保护或治疗患有、怀疑患有或有风险发生感染或相关疾病(特别是与葡萄球菌有关的那些)的对象。本发明的免疫原性组合物的一种用途是通过在进行医院中或其他增加感染风险的环境中的行为前接种对象来预防医院内感染。
A.免疫测定
本发明包括实施血清学测定以评价本发明组合物是否诱导或引发免疫应答及其程度。有许多类型的免疫测定可以实施。本发明所涵盖的免疫测定包括但不限于美国专利4,367,110(双单克隆抗体夹心法测定)和美国专利4,452,901(western印迹)所述的那些。其他测定包括体外和体内的带标记配体的免疫沉淀和免疫细胞化学。
免疫测定一般是结合测定。某些优选免疫测定是本领域已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。在一个实例中，将抗体或抗原固定在所选表面(例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔、试片或柱支持物)上。然后，将怀疑含有目标抗原或抗体的测试组合物(例如临床样品)添加到孔中。在结合以及清洗以除去非特异性结合的免疫复合物之后，可检测所结合的抗原或抗体。检测一般通过添加另一种与可检出标记相连的特异性针对目标抗原或抗体的抗体来实现。此类ELISA被称为“夹心法ELISA”。检测也可通过以下实现：添加特异性针对目标抗原的第二抗体，然后添加对第二抗体有结合亲和力的第三抗体，第三抗体连接有可检出标记。
也可实施竞争性ELISA，其中测试样品竞争性结合已知量的经标记抗原或抗体。通过在与经包被的孔一起孵育之前或其间，将样品与已知经标记物质混合来确定未知样品中反应性物质的量。样品中反应性物质的存在减少了可用于结合孔的经标记物质的量，因此减少了最终的信号。不论所使用的形式如何，ELISA都具有某些共同的特征，例如包被、孵育或结合，清洗以除去非特异性结合的物质，以及检测所结合的免疫复合物。
抗原或抗体也可以连接到固相支持物上，例如板，珠，试片，膜，或柱基质，并且将待分析样品加到固定化的抗原或抗体上。用抗原或抗体包被平板时，一般将抗原或抗体溶液在平板孔内孵育过夜或特定时间。然后清洗平板的孔，去除不完全吸附的物质。然后用与测试抗血清抗原中性的非特异性蛋白“包被”孔内任何残留的表面。这包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和乳粉溶液。包被允许阻断固定化表面的非特异性吸附位点，从而减少抗血清非特异性结合到表面产生的背景。
B.细菌感染的诊断
除了如上所述使用蛋白质、多肽和/或肽，以及结合这些多肽、蛋白质和/或肽的抗体来治疗或预防感染之外，本发明还考虑以多种方式使用这些多肽、蛋白质、肽和/或抗体，包括不论是在患者中还是在也可被污染的医疗器械上检测葡萄球菌的存在以诊断感染。根据本发明，检测感染存在的优选方法包括下列步骤：获得怀疑被一种或多种葡萄球菌物种或菌株感染的样品，例如取自个体的样品(例如来自其血液、唾液、组织、骨、肌肉、软骨或皮肤)。分离出样品之后，可利用本发明多肽、蛋白质、肽和/或抗体进行诊断测定，以检测葡萄球菌的存在，并且确定样品中此类存在的这种测定技术是本领域技术人员公知的，包括例如放射性免疫测定、western印迹分析和ELISA测定的方法。一般来说，根据本发明，考虑了下述诊断感染的方法，其中将怀疑感染葡萄球菌的样品加入到本发明的多肽、蛋白质、肽、抗体或单克隆抗体中，通过与所述多肽、蛋白质和/或肽结合的抗体或者与样品中所述抗体结合的多肽、蛋白质和/或肽来指示葡萄球菌。
因此，本发明的抗体可用于预防葡萄球菌的感染(即被动免疫)，用于治疗进行中的感染，或者用作研究工具。本文使用的术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、猿源化抗体和人源化抗体或灵长动物源化抗体以及Fab片段，例如保持所述抗体结合特异性的片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物。因此，本发明考虑了使用单链抗体，例如抗体可变重链和轻链。任意这些类型抗体或抗体片段的产生是本领域技术人员公知的。产生针对细菌蛋白质的抗体的具体实例可见美国专利申请公开20030153022，其整体通过引用并入本文。
可直接用可检出标记对任意上述多肽、蛋白质、肽和/或抗体进行标记，用以鉴定和定量葡萄球菌。用于免疫测定的标记物是本领域技术人员一般所知的，包括酶、放射性同位素以及荧光、发光和显色物质，包括有色颗粒(例如胶体金或乳胶珠)。合适的免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)。
C.保护性免疫
在本发明的一些实施方案中，蛋白质性组合物向对象提供了保护性免疫。保护性免疫是指机体建立特异性免疫应答的能力，其保护对象免于发生某种物质参与的特定疾病或病症，其中涉及针对所述物质的免疫应答。免疫原性有效量能够赋予对象保护性免疫。
本文说明书和前附权利要求书中使用的术语多肽或肽是指通过肽键彼此共价相连的一段氨基酸。根据本发明，不同的多肽具有不同的功能。根据一个方面，多肽衍生自为诱导接受者中的主动免疫应答而设计的免疫原，根据本发明的另一方面，多肽衍生自在例如动物中引发主动免疫应答后产生的、且可用于诱导接受者中的被动免疫应答的抗体。但是，在这两种情况下，多肽均可根据任何可用的密码子由多核苷酸编码。
本文使用的短语“免疫应答”或其等同词“免疫学应答”是指在接受患者中产生针对本发明蛋白质、肽、碳水化合物或多肽的体液应答(由抗体介导)、细胞应答(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)或体液和细胞应答两者。这些应答可以是由施用免疫原诱导的主动应答，或者是由施用抗体、含抗体的物质或预致敏T细胞诱导的被动应答。呈递与I类或II类MHC分子相结合的多肽表位引发细胞免疫应答，从而活化抗原特异性CD4(+)T辅助细胞和/或CD8(+)细胞毒T细胞。应答也可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱细胞、树突状细胞、星形细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或其他固有免疫组分的活化。本文所用“主动免疫”指任何通过施用抗原赋予对象的免疫力。
本文使用的“被动免疫”是指不向对象施用抗原而赋予对象的任何免疫力。因此“被动免疫”包括但不限于施用活化的免疫效应物，其包括免疫应答的细胞介导物或蛋白质介导物，例如单克隆和/或多克隆抗体。单克隆或多克隆抗体组合物可用于被动免疫，用以预防或治疗携带被所述抗体识别的抗原的生物体的感染。抗体组合物可包含与多种抗原结合的抗体，所述抗体可与多种生物相关。抗体组分可以是多克隆抗血清。在某些方面中，从已用抗原攻击的动物或第二对象亲和纯化抗体。或者，可使用抗体混合物，其是针对相同、相关或不同微生物或生物体(例如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌，包括但不限于葡萄球菌)中存在之抗原的单克隆和/或多克隆抗体的混合物。
可通过向患者施用免疫球蛋白(Ig)和/或其他免疫因子给予患者或对象被动免疫，所述免疫球蛋白和/或其他免疫因子获得自供体或其他具有已知免疫反应性的非患者来源。在另一些方面中，可向作为球蛋白来源或供体的对象施用本发明的抗原组合物，所述球蛋白响应于抗原组合物的攻击而产生，其含有针对葡萄球菌属或其他生物体的抗体(“超免疫球蛋白”)。如此处理的对象贡献出血浆，然后通过常规血浆分级分离方法从中获得超免疫球蛋白，并施用给另一对象从而赋予其对葡萄球菌属感染的抗性或者治疗。根据本发明，超免疫球蛋白特别可用于免疫受损的个体、接受了介入手术的个体或者时间不允许个体响应于接种而产生自身抗体的情况。对于涉及被动免疫的示例性方法和组合物，参见美国专利6,936,258、6,770,278、6,756,361、5,548,066、5,512,282、4,338,298和4,748,018，每个均通过引用以整体并入本文。
出于本说明书和权利要求的目的，术语“表位”和“抗原决定簇”可互换地用于表示抗原上B和/或T细胞应答或识别的部位。B细胞表位可由连续氨基酸形成，或者由通过蛋白质三级折叠而靠近的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后仍保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理之后丢失。表位通常包括有独特空间构象的至少3个、更常见至少5个或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括例如X-射线晶体衍射和二维核磁共振。参见例如EpitopeMapping Protocols(1996)。可在简单的免疫测定中鉴定出识别相同表位的抗体，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。对于CD8细胞，T细胞识别约9个氨基酸的连续表位，而对于CD4细胞，为约13～15个氨基酸。可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定鉴定出识别表位的T细胞，该增殖决定于测定预致敏T细胞响应于表位的3H-胸苷掺入(Bruke等，1994)、测定抗原依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tigges等，1996)或者测定细胞因子分泌。
可通过增殖测定(CD4(+)T细胞)或CTL(细胞毒T淋巴细胞)测定来确定细胞介导免疫应答的存在。体液应答和细胞应答对免疫原的保护性或治疗性作用的相对贡献可通过以下方式进行区分：从经免疫的同基因动物中分别分离IgG和T细胞，在第二对象中测量保护性或治疗性作用。
本文和权利要求中使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换地使用，并表示作为动物或接受者免疫应答的一部分发挥作用的几类结构上相关蛋白质中的任一种，所述蛋白质包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白。
在正常生理条件下，抗体存在于血浆及其他体液中以及某些细胞的膜中，其由称为B细胞的淋巴细胞类型或者其功能等同物产生。IgG类别的抗体由通过二硫键连接的四条多肽链组成。完整IgG分子的四条链是两条相同的重链(称为H链)和两条相同的轻链(称为L链)。
为了产生多克隆抗体，用抗原或抗原片段(通常与佐剂一起，必要时，与载体偶连)免疫宿主例如兔、山羊。随后从宿主的血清中收集针对所述抗原的抗体。可针对所述抗原亲和纯化多克隆抗体，使其成为单特异性的。
单克隆抗体的产生可通过用抗原超免疫适当的供体，或者使用脾的脾细胞或细胞系的原代培养物进行离体生产(Anavi，1998；Huston等，1991；Johnson等，1991；Memaugh等，1995)。
本文及权利要求中所用的短语“抗体的免疫部分”包括抗体的Fab片段、抗体的Fv片段、抗体的重链、抗体的轻链、由抗体的重链和轻链组成的异二聚体、抗体轻链的可变片段、抗体重链的可变片段以及抗体的单链变体(也称为scFv)。另外，该术语包括嵌合免疫球蛋白，其是来源于不同物种的融合基因的表达产物。所述物种之一可以是人，此时嵌合免疫球蛋白称为人源化的。通常，抗体的免疫部分与其所来源的完整抗体竞争特异性结合抗原。
任选地，抗体(或优选地，抗体的免疫部分)可以与其他蛋白质化学缀合或者表达为融合蛋白。出于本说明书和所附权利要求的目的，所有此类融合蛋白均包含在抗体或抗体免疫部分的定义中。
本文使用的术语“免疫原性物质”或“免疫原”或“抗原”可互换地用于表示在施用给接受者后(单独地、与佐剂一起或者呈现于展示载剂上)能够诱导针对其自身的免疫应答的分子。
D.治疗方法
本发明的方法包括治疗由葡萄球菌属病原体引起的疾病或病症。本发明的免疫原性多肽可被施用到被葡萄球菌属感染或怀疑曾暴露于葡萄球菌属的人中，诱导免疫应答。对于葡萄球菌属暴露测试阳性或基于可能的暴露而被视为有感染风险的个体可以使用本发明的方法。
特别地，本发明涵盖葡萄球菌感染(特别是医院获得的医院内感染)的治疗方法。本发明的免疫原性组合物和疫苗对于择期手术来说特别有利。这些患者预先知晓手术的日期，因此可预先进行接种。本发明的免疫原性组合物和疫苗对于接种医疗保健工作者也是有利的。
在一些实施方案中，所述治疗在佐剂或运载体或其他葡萄球菌抗原存在下施用。此外，在某些实例中，治疗包括施用常用于抗细菌感染的其他药剂，例如一种或多种抗生素。
用于接种的多肽可需要(但不必需)缀合所述肽至免疫原性载体蛋白，例如乙肝表面抗原、钥孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。进行这些缀合的方法是本领域公知的。
V.疫苗和其他药物组合物和施用
A.疫苗
本发明包括预防或减轻葡萄球菌感染(特别是医院获得的医院内感染)的方法。因此，本发明考虑在主动和被动免疫两种实施方案中使用的疫苗。被认为适合用作疫苗的免疫原性组合物可以从免疫原性SpA多肽如SpA变体D结构域或免疫原性凝固酶制备。在另一些实施方案中，SpA或凝固酶可与其他分泌的毒力蛋白、表面蛋白或其免疫原性片段联合使用。在某些方面，将抗原性物质充分透析以去除不期望的小分子量分子，和/或冻干以备配制进期望的载剂。
对基于蛋白质/肽的疫苗而言其他选择包括引入编码抗原的核酸作为DNA疫苗。对此，近期的报道描述了构建重组痘苗病毒，并成功使用此类构建体免疫小鼠，用于引发保护性免疫应答，所述重组疫苗病毒表达10个连续的最小CTL表位(Thomson，1996)或者来自几种微生物的B细胞、细胞毒T淋巴细胞(CTL)和T辅助细胞(Th)表位的组合(An，1997)。因此，对成功利用肽、肽脉冲处理抗原呈递细胞(antigen presentingcell，APC)和编码肽的构建体在体内有效引发保护性免疫应答已在文献中有充分的证据。美国专利5,958,895和5,620,896中示例了使用核酸序列作为疫苗。
包含多肽或肽序列作为活性成分的疫苗的制备一般为本领域公知，如美国专利4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792和4,578,770所示例，所有专利都通过引用并入本文。这种疫苗通常以注射剂(作为液体溶液或混悬液)的形式制备；还可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂也可以被乳化。活性免疫原性成分通常与可药用并与活性成分相容的赋形剂相混合。合适的赋形剂例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，疫苗可含有一定量的辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或者增强疫苗效力的佐剂。在一些具体实施方案中，疫苗与一些物质的组合一起进行配制，如美国专利6,793,923和6,733,754所述，其通过引用并入本文。
疫苗可常规地通过胃肠外注射(例如皮下注射或肌内注射)来施用。适用于其他施用方式的另外制剂包括栓剂，以及在某些情况下的口服制剂。对于栓剂，传统粘合剂和运载体可包括例如聚亚烷基二醇(polyalkalene glycol)或甘油三脂；这些栓剂可由含有活性成分(范围为约0.5％至约10％，优选约1％至约2％)的混合物形成。口服制剂包含常用的赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末剂的形式，并且包含约10％至约95％(优选约25％至约70％)的活性成分。
多肽、肽和编码肽的DNA构建体可以配制成中性或盐形式的疫苗。可药用盐包括酸加成盐(由肽的游离氨基形成)和与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。
疫苗一般以与药剂剂型相容的方式、以治疗有效和免疫原性的量来施用。施用量取决于待治疗的对象，包括个体免疫系统合成抗体的能力和所期望的保护程度。待施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。但是，合适的剂量范围为每次接种几百微克左右的活性成分。初次施用和加强免疫的适用方案也是可变的，但一般为初次施用之后再进行后续接种或其他施用。
应用的方式可以是多种多样的。疫苗施用的任何常规方法都是可应用的。认为这些方法包括在生理学可接受的固体基质中口服应用，或者在生理学可接受的分散剂以肠胃外、通过注射等来施用。疫苗的剂量取决于施用途径，且根据对象的体形和健康状况而变化。
在某些情形中，期望多次施用疫苗，例如2、3、4、5、6次或更多次施用。接种一般间隔1、2、3、4、5、6、7、8至5、6、7、8、9、10、11、12周，包括其间所有范围。期望间隔1～5年进行定期加强免疫维持抗体的保护性水平。在免疫过程之后可测定针对抗原的抗体，如美国专利3,791,932、4,174,384和3,949,064所述。
1.运载体
给定的组合物的免疫原性可能有所不同。因此往往有必要加强宿主的免疫系统，这可通过将肽或多肽偶联至运载体来实现。示例性并优选的运载体为匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作运载体。将多肽缀合到运载体蛋白的手段为本领域所熟知，包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮联苯胺。
2.佐剂
可通过使用免疫应答的非特异性刺激剂(称为佐剂)来增强多肽或肽组合物的免疫原性。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，如细胞因子、毒素或合成组合物。多种佐剂可用于增强抗体针对SpA多肽变体或凝固酶或本文所述任何其他细菌蛋白质或组合的抗体应答。佐剂可(1)滞留体内的抗原使其缓慢释放；(2)将参与免疫应答的细胞吸引到施用部位；(3)诱导免疫系统细胞的增殖或活化；或(4)促进抗原在对象整个身体中的扩散。
佐剂包括但不限于水包油乳剂、油包水乳剂、矿物盐、多核苷酸和天然物质。可使用的具体佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、铝盐(例如氢氧化铝或其他铝化合物)、MDP化合物(如thur-MDP和nor-MDP)、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。也可使用RIBI，其包含在2％角鲨烯/吐温80乳剂中的三种从细菌中提取的组分——MPL、海藻糖二分枝酸酯(trehalosedimycolate，TDM)和细胞壁骨架(cell wall skeleton，CWS)。还可使用MHC抗原。其他佐剂或方法示例于美国专利6,814,971、5,084,269、6,656,462，每个均通过引用并入本文。
对疫苗实现佐剂效应的多种方法包括使用制剂如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)，通常以磷酸盐缓冲液中约0.05％至约0.1％的溶液使用，其与以约0.25％溶液使用的合成多聚糖(Carbopol
Figure BDA00002686453900711
)混合，通过以约70℃至约101℃的温度分别热处理30秒至2分钟来聚集疫苗中的蛋白质。还可采用以下方法来产生佐剂效应：通过用胃蛋白酶处理的(Fab)白蛋白抗体的再次活化进行聚集；与细菌细胞(例如短小棒状杆菌(C.parvum))、内毒素或革兰氏阴性菌的脂多糖组分混合；在生理学可接受的油载剂(例如二缩甘露醇一油酸(Aracel A))中乳化；或用作为封闭底物的20％全氟化碳(Fluosol-DA
Figure BDA00002686453900712
)溶液乳化。
通常优选的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂(包含灭活的结核分枝杆菌的免疫应答非特异性刺激物)、弗氏不完全佐剂和氢氧化铝。
在一些方面，优选将佐剂选择为Th1或Th2型应答的优先诱导物。高水平Th1型细胞因子倾向于偏好诱导针对给定抗原的细胞介导之免疫应答，而高水平Th2型细胞因子则倾向于偏好诱导针对抗原的体液免疫应答。
Th1和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上，一些人支持称为Th1主导或Th2主导的免疫应答。但是，常常方便地以Mosmann和Coffman在鼠CD4+T细胞克隆中所述的形式定义细胞因子家族(Mosmann和Coffman，1989)。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有关。经常直接与Th1型免疫应答诱导相关的其他细胞因子(例如IL-12)不由T细胞产生。与之不同，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。
除佐剂之外，还可能需要共施用生物应答调节剂(biologic responsemodifier，BRM)来增强免疫应答。BRM已显示能够上调T细胞免疫或下调细胞活性抑制物。这些BRM包括但不局限于西咪替丁(CIM；1200mg/天)(Smith/Kline，PA)或低剂量的环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)和细胞因子如γ-干扰素、IL-2或IL-12，或编码参与免疫辅助功能的蛋白质(如B-7)的基因。
B.脂质组分和部分
在某些实施方案中，本发明涉及包含一种或多种与核酸或多肽/肽结合的脂质的组合物。脂质是不溶于水且可用有机溶剂萃取的物质。本领域技术人员了解除了本文具体描述的那些之外的脂质化合物，并且其涵盖在本发明的组合物和方法中。脂质组分和非脂质可以共价或非共价地彼此相连。
脂质可以是天然脂质或合成脂质。但是，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域中公知的，包括例如中性脂、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂类、鞘糖脂、糖脂、硫酸酯、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂类以及可聚合脂质，以及其组合。
与脂质相结合的核酸分子或多肽/肽可分散在含有脂质的溶液中，溶于脂质中，被脂质乳化，与脂质混合，与脂质结合，与脂质共价键合，作为悬浮物包含在脂质中或者以其他方式与脂质相相应。本发明的脂质或脂质-痘病毒-相关组合物不限于任何特定结构。例如，它们还可简单地散布于溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。在另一实例中，它们可以双层结构存在、以胶团形式存在或者具有“散的(collapsed)”结构。在另一非限制性实例中，还考虑lipofectamine(Gibco BRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-痘病毒复合物。
在某些实施方案中，组合物可包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或其间任何范围的特定脂质、脂质类型或者非脂质组分(例如佐剂、抗原、肽、多肽、糖、核酸或者本文公开的或本领域技术人员已知的其他物质)。在一个非限制性实例中，组合物可包含约10％至约20％的中性脂质，以及约33％至约34％的脑苷脂和约1％的胆固醇。在另一非限制性实例中，脂质体可包含约4％至约12％的萜烯，其中约1％的胶团具体地是番茄红素，剩余约3％至约11％的脂质体包含其他萜烯；以及约10％至约35％的磷脂酰胆碱，和约1％的非脂质组分。因此，设想本发明的组合物可包含任何组合或百分比范围的任何脂质、脂质类型或其他组分。
C.联合治疗
本发明的组合物和相关方法(特别是向患者/对象施用分泌的毒力因子或表面蛋白包括SpA变体多肽或肽和/或其他细菌肽或蛋白质)也可与传统治疗的施用联合使用。这些包括但不限于：施用抗生素，例如链霉素、环丙沙星、强力霉素、庆大霉素、氯霉素、三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲恶唑、氨苄青霉素、四环素或多种抗生素组合。
在一方面，设想多肽疫苗和/或治疗与抗细菌治疗联合施用。或者，该治疗也可以在其他试剂治疗之后或之前间隔从几分钟到几周进行。在分开施用其他试剂和/或蛋白或多核苷酸的实施方案中，通常应保证每次递送之间的长时间间隔不会过期，从而试剂和抗原组合物仍然能够对对象产生有利的联合效果。在这些情况中，考虑可以在间隔约12-24小时或约6-12小时内施用两种形式的治疗。在一些情况下，可能期望显著延长施用的时间，各次施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可采用不同组合，例如抗生素疗法为“A”，作为免疫疗法方案一部分给予的免疫原性分子如抗原为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
向患者/对象施用本发明免疫原性组合物应遵从施用这些化合物的一般方案，考虑SpA组合物或其他本文所述组合物的毒性(如果有的话)。预计可根据需要重复治疗周期。还涉及的是多种标准疗法如水化疗法(hydration)可与所述疗法组合应用。
D.一般药物组合物
在一些实施方案中，向对象施用药物组合物。本发明的一些不同方面包括向对象施用有效量的组合物。在本发明的一些实施方案中，可向患者施用葡萄球菌抗原、Ess途径成员(包括Esa或Esx类的多肽或肽)和/或分选酶底物成员，以保护其免受一种或多种葡萄球菌属病原体的感染。或者，可将编码一种或多种这种多肽或肽的表达载体给予患者作为预防性治疗。此外，这些化合物可与抗生素或抗菌素联用。这些组合物一般可溶解或分散在可药用载体或含水介质中。
除了配制成肠胃外施用的化合物(如用于静脉内注射或肌内注射的那些)，其他可药用形式包括例如用于口服施用的片剂或其他固体；缓释胶囊；以及目前所用的其他任何形式，包括霜剂、洗剂、漱口剂、吸入剂等。
可将本发明的活性化合物配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内途径的注射。根据本公开内容本领域技术人员会知道含有增加MHC I类分子表达的化合物的含水组合物。通常，这些组合物可以配制成可注射形式，既可以是液体溶液也可以是悬液；也可以配制成用于在注射前加入液体配制溶液或悬液的固体形式；制剂还可以被乳化。
可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备以游离碱或可药用盐形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散体系。在普通的储藏和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体系；制剂，包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；用于即时制备无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末剂。在所有情况下，剂型必须是无菌的，而且必须达到可易于注射的流动程度。它还应当在加工和储藏条件下是稳定的，而且应当免受微生物(如细菌和真菌)的污染作用。
可将蛋白质性组合物配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)和由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。由游离羧基形成的盐也可来自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。可通过例如使用包衣(如卵磷脂)，通过维持所需的粒径(对于分散体系的情况)以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，可优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现对注射组合物的延长吸收。
通过将所需量的活性化合物掺入具有上面所列举的多种成分的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，根据需要再进行过滤除菌。一般地，通过将多种无菌活性成分掺入无菌载剂(其含有基本分散介质和所需的其他上面所列举的成分)来制备分散体系。对用于制备无菌注射液的无菌粉末剂而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，由预先经过滤除菌的溶液产生活性成分和所有其他期望成分的粉末剂。
本发明组合物的施用通常可经由任何常见的途径。这包括但不局限于口服、经鼻或含服施用。或者，可通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或静脉内注射来施用。在某些实施方案中，疫苗组合物可以是吸入的(例如美国专利6,651,655，其通过引用具体并入本文中)。这些组合物通常作为可药用的组合物(含有生理学可接受的载体、缓冲剂或其他赋形剂)来施用。本文使用的术语“可药用”是指在正确医学判断范围内适于接触人体和动物组织并且没有过度毒性、刺激性、变态反应或其他问题并发症且具有合理之益处/风险比的化合物、物质、组合物和/或剂型。术语“可药用载体”表示参与携带或转运化学物质的可药用的物质、组合物或介质，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
就水溶液的肠胃外施用而言，例如，必要时可适当地缓冲溶液，而且液体稀释剂应首先用足量的盐水或葡萄糖进行等渗处理。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，根据本公开内容，可采用的无菌含水介质为本领域技术人员所知。例如，可将一个剂量溶于等渗NaCl溶液中，并且加入到皮下输液中或注射到建议的输注位点(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，1990)。根据对象的状况，剂量有必要发生一些改变。不管怎样，负责施用的人会决定个体对象的合适剂量。
治疗性或预防性组合物的有效量基于预期目标来确定。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理上的离散单位，每个单位包含为产生上述与其施用(即适当途径和方案)相关的预期应答而计算得出的组合物预定量。所要施用的量(根据治疗次数和单位剂量)取决于期望的保护作用。
组合物的精确剂量也取决于医生的判断，且为特定针对每个个体的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(减轻症状还是治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。
制备后，将以与给药剂型相匹配的方式、以有效治疗或预防的量来施用溶液。可容易地以多种剂型(如上文所述的注射液类型)来施用制剂。E.体外、离体或体内施用
本文所用的术语体外施用是指对从对象中取出的或在对象体外的细胞(包括但不局限于培养细胞)进行操作。术语离体施用是指将已在体外进行了操作的细胞随后施用于对象。术语体内施用包括在对象体内进行的所有操作。
在本发明的某些方面中，可通过体外、离体或体内施用组合物。在某些体外实施方案中，将自体B淋巴细胞细胞系与本发明的病毒载体一起孵育24～48小时，或与SpA变体和/或凝固酶和/或任何其他本文所述组合物一起孵育2小时。经转导的细胞接着可用于体外分析，或用于离体施用。通过引用并入本文的美国专利4,690,915和5,199,942公开了离体操作血液单核细胞和骨髓细胞用于治疗性应用的方法。
F.抗体和被动免疫
本发明的另一方面是制备用于预防或治疗葡萄球菌感染之免疫球蛋白的方法，其包括用本发明的疫苗免疫接受者或供体以及从接受者或供体中分离免疫球蛋白或抗体的步骤。此方法制备的免疫球蛋白是本发明的另一方面。包含本发明免疫球蛋白和可药用载体的药物组合物是本发明又一方面，其可用于制备治疗或预防葡萄球菌疾病的药物。治疗或预防葡萄球菌感染的方法是本发明的另一个方面，其包括向患者施用有效量的本发明药物制剂的步骤。
用于产生多克隆抗体的接种物通常通过在生理耐受稀释剂(例如盐水或其他适于人使用的佐剂)中分散抗原组合物以形成水性组合物来制备。向哺乳动物施用免疫刺激量的接种物，然后使被接种的哺乳动物维持足以使得抗原组合物诱导出保护性抗体的时间。
可通过公知技术(例如亲和色谱)将抗体分离到期望的程度(Harlow和Lane，1988)。抗体可包括来自多种常用动物(例如山羊、灵长类动物、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人)的抗血清制备物。
根据本发明产生的免疫球蛋白可包括完整抗体、抗体片段或子片段。抗体可以是任何类型(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的完整免疫球蛋白、针对本发明两种或更多种抗原具有双特异性的嵌合抗体或杂合抗体。它们也可以是片段(例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括杂合片段。免疫球蛋白还包括天然、合成或经遗传改造的蛋白质，其通过结合特异性抗原形成复合物而如抗体一样起作用。
本发明的疫苗可施用给接受者，其随后作为应答于来自特异性疫苗之攻击而产生的免疫球蛋白的来源。这样治疗的对象可捐赠血浆，从其中可通过常规血浆分级分离方法获得超免疫球蛋白。可将超免疫球蛋白施用给另一个对象，以赋予针对葡萄球菌感染的抗性或者对其进行治疗。本发明的超免疫球蛋白特别可用于治疗或预防婴儿、免疫缺陷个体的葡萄球菌疾病，或者在需要治疗但没有时间让个体应答于疫苗接种而产生抗体的情况下用于治疗或预防葡萄球菌疾病。
本发明的另一个方面是包含两种或多种单克隆抗体(或其片段；优选人的或人源化的)的药物组合物，所述抗体与本发明至少2种免疫原性组合物成分具有反应性，所述药物组合物可用于治疗或预防革兰氏阳性细菌(优选葡萄球菌，更优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)的感染。这些药物组合物包含与本发明两种或更多种抗原具有特异性的单克隆抗体(可以是任何类型的完整免疫球蛋白)、嵌合抗体或杂合抗体。它们也可以是片段(例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括杂合片段。
制备单克隆抗体的方法是本领域公知的，可包括将脾细胞与骨髓瘤细胞融合(Kohler和Milstein，1975；Harlow和Lane，1988)。或者，可通过筛选合适的噬菌体展示文库获得单克隆Fv片段(Vaughan等，1998)。单克隆抗体可通过已知方法人源化或部分人源化。
VI.实施例
给出以下实施例以阐明本发明的多个实施方案，但不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员会了解本发明很好地适于实现目的，以及获得所提及的目标和优势以及本文中固有的目的、目标和优势。现有的实施例以及本文所述的方法是优选实施方案的代表，其为示例性的，并且不意在限制本发明的范围。本领域技术人员会了解权利要求范围所限定的在本发明宗旨之内涵盖的变动及其他用途。
实施例1
非产毒蛋白A变体作为亚单位疫苗来预防金黄色葡萄球菌感染
A.结果
金黄色葡萄球菌感染的动物模型。通过静脉内注射1x107CFU的金黄色葡萄球菌人临床分离Newman株来感染BALB/c小鼠(Baba等，2007)。感染后6小时内，99.999％的葡萄球菌从血流内消失，通过血管系统进行分布。葡萄球菌迅速分布到外周组织，最初的3小时内在肾和其他外周器官组织的细菌负荷达到1×105CFU g-1。24小时内肾组织中葡萄球菌负荷增加了1.5log CFU。感染48小时后，小鼠在多个器官发生弥散性脓肿，通过光学显微镜检查苏木精-伊红染色的肾组织超薄切片可检测到。最初的脓肿直径为524μM(±65μM)，病变标志最初为多形核白细胞(PMN)内流，并且没有携带可辨别的葡萄球菌团，大部分葡萄球菌团显示位于PMN内。在感染第5天，脓肿大小增加并且包括中心葡萄球菌群，外周是嗜酸、无定形物质层和大的PMN层。组织病理学显示在脓肿病变中心接近金黄色葡萄球菌病灶处有大量PMN坏死，并覆盖有健康的吞噬细胞。在脓肿病变周围观察到是一圈坏死的PMN，其紧邻将健康肾组织与感染病变区隔开的嗜酸无定形物质。在第15天或36天，脓肿最终达到直径≥1,524μM。在之后的时间段中，葡萄球菌负荷增加到104-106CFU g-1，生长的脓肿病变向器官包膜迁移。外周病变容易破裂，从而向腹腔或腹膜后间隙释放坏死物质和葡萄球菌。这些事件造成菌血症以及第二波脓肿，最终促成致死性结果。
为了对肾组织中的葡萄球菌负荷进行计算，处死动物，切下肾并将组织匀浆涂布到琼脂培养基上形成菌落。在感染第5天，观察到平均值为1×106CFU g-1肾组织的金黄色葡萄球菌Newman株。为了对脓肿形成进行定量，对肾进行目测检视，对每个单独的器官给出1或0的评分。最终总数除以肾总个数来计算表面脓肿百分比(表4)。另外，随机选择肾在福尔马林中固定，包埋，超薄切片并用苏木精-伊红染色。对每个肾，用显微镜观察相隔200μM的四个径向切片。计算每个切片的病变数目，取平均值对肾中脓肿数进行定量。金黄色葡萄球菌Newman株在每个肾中造成4.364±0.889个脓肿，在20个肾中的14个上观察到表面脓肿(70％)(表4)。
用扫描电子显微镜检查时发现，金黄色葡萄球菌Newman株位于脓肿中心紧密结合的菌苔中。葡萄球菌被无定形假包膜包围，它将细菌与脓肿白细胞层分隔开。在这些葡萄球菌中心簇内没有观察到免疫细胞，但是偶尔有红细胞处于细菌间。脓肿中心的细菌群(称为葡萄球菌脓肿群(staphylococcal abscess communities，SAC))看起来是均一的并被电子密集的颗粒物质包被。金黄色葡萄球菌Newman株形成的感染病变的外观动态和脓肿的形态学特性与在金黄色葡萄球菌USA300(LAC)感染的小鼠上观察到的类似，USA300(LAC)是目前在美国流行的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)克隆(Diep等，2006)。
表4.小鼠中金黄色葡萄球菌Newman株脓肿形成的遗传学要求
Figure BDA00002686453900791
a用每种攻击菌株对15只BALB/c小鼠的组感染后5天肾组织匀浆中葡萄球菌的负荷平均值，以log10 CFUg-1计算。注明了平均值的标准误(±SEM)。
b使用Student’s t检验计算统计学显著性并记录P值；认为P值＜0.05有显著性。
c以log10CFU g-1计算的细菌负荷的减少。
d通过目测测量感染后5天肾组织中的脓肿形成(％阳性)
e8-10只动物的苏木精-伊红染色肾超薄切片的组织病理学；记录每个肾中脓肿的平均数并再平均得到最终的平均值(±SEM)。
f使用Student’s t检验计算统计学显著性并记录P值；认为P值＜0.05有显著性。
金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)突变体无毒力且不能形成脓肿 分选酶A是固定金黄色葡萄球菌Newman株荚膜中的19种表面蛋白的转肽酶(Mazmanian等，1999；Mazmanian等，2000)。早期的工作发现，分选酶A在多个动物模型系统中是毒力因子，但是，该酶及其所锚定的表面蛋白在脓肿形成或持续中的作用还没有被揭示(Jonsson等，2002；Weiss等，2004)。与野生型母体相比(Baba等，2007)，在第2、5或15天，等基因srtA变体(ΔsrtA)在目测或组织病理学检查中均不能形成脓肿病变。在被strA突变体感染的小鼠中，在感染第5天从肾组织中仅能够获得1×104CFUg-1，相比野生型母体菌株减少了2.046 log10CFUg-1(P＝6.73×10-6)。MRSA菌株USA300的srtA突变体也观察到类似的缺陷(数据未显示)。扫描电子显微镜显示在其他方面均健康的肾组织中srtA突变体高度分散并且经常与白细胞结合。在感染后的第15天，srtA突变体被从肾组织中清除，相比野生型减少了≥3.51og10CFU g-1(表3)。因此，分选酶A锚定的表面蛋白使细菌能够在宿主组织中形成脓肿病变和持续存在，其中葡萄球菌扩增成群落包埋在细胞外基质中，并且由无定形假包膜把周围白细胞屏蔽。
分选酶A将具有LPXTG基序分选信号的广谱的蛋白锚定到细胞壁荚膜上，从而为很多毒力因子提供表面展示(Mazmanian等，2002)。为了鉴定葡萄球菌脓肿形成所需的表面蛋白，将bursa aurealis插入片段引入到编码具有LPXTG基序蛋白的多肽的5′编码序列中(Bae等，2004)，并且将这些突变转导入金黄色葡萄球菌Newman株。蛋白A(spa)结构基因中的突变使感染小鼠肾组织中葡萄球菌负荷减少了1.004log10(P＝0.0144)。当通过组织病理学分析它们在肾组织中形成脓肿的能力时，我们观察到spa突变体与野生型母体金黄色葡萄球菌Newman株相比不能形成脓肿(野生型金黄色葡萄球菌Newman株在每个肾中形成4.364±0.889个脓肿，相比于等基因spa突变体的0.375±0.374个病变；P＝0.0356)。
蛋白A阻断固有和获得性免疫应答。研究发现，蛋白A是金黄色葡萄球菌感染发病期间关键的毒力因子。早期工作证明蛋白A通过结合免疫球蛋白的Fc部分阻断对葡萄球菌的细胞吞噬(Jensen 1958；Uhlen等，1984)，通过von Willebrand因子激活血小板聚集(Hartleib等，2000)，通过捕获具有VH3的IgM的F(ab)2区发挥B细胞超抗原作用(Rob en等，1995)，并且通过活化TNFR1可以引发葡萄球菌肺炎(Gomez等，2004)。由于蛋白A捕获免疫球蛋白并显示毒性特性这一事实，这种表面分子作为人疫苗的可能性还没有经过仔细的研究。本发明人首次证明，不再能结合免疫球蛋白、vWF和TNFR-1从而去除了它们的产毒潜力的蛋白A变体能够刺激针对金黄色葡萄球菌病提供保护的体液免疫应答。
蛋白A表面展示和功能的分子基础。蛋白A在细菌细胞质中以前体形式合成并通过其YSIRK信号肽在横壁(即葡萄球菌的细胞分裂间隔)处分泌(图1)(DeDent等，2007；DeDent等，2008)。在切割C末端LPXTG分选信号后，蛋白A通过分选酶A锚定到细菌肽聚糖交联桥(crossbridge)上(Schneewind等，1995；Mazmanian等，1999；Mazmanian等，2000)。蛋白A是丰度最高的葡萄球菌表面蛋白；几乎所有金黄色葡萄球菌菌株都表达该分子(Said-Salim等，2003；Cespedes等，2005；Kennedy等，2008)。葡萄球菌每个分裂周期转换其15-20％的细胞壁(Navarre和Schneewind，1999年)。鼠水解酶切割肽聚糖的聚糖链和细胞壁肽，从而释放蛋白A及其所附的C末端细胞壁二糖四肽到细胞外基质中(Ton-That等，1999)。因此，通过生理学设计，蛋白A不仅锚定在细胞壁上并且在细菌表面展示，还在宿主感染时释放到到周围组织(Marraffini等，2006)。
蛋白A捕获细菌表面的免疫球蛋白，并且此生物化学活性使葡萄球菌能逃避宿主的固有和获得性免疫应答(Jensen，1958；Goodyear等，2004)。有趣的是，蛋白A的区域X(Guss等，1984)是将IgG结合结构域连接到LPXTG分选信号/细胞壁锚定的重复结构域，其也许是葡萄球菌基因组中变异性最高的部分(Schneewind等，1992；Said-Salim，2003年)。蛋白A(SpA)的5个免疫球蛋白结合结合域的每个均由三螺旋束形成，并且被称为E、D、A、B和C，它们显示类似的结构和功能特性(1977；Jansson等，1998)。含或者不含Fc和VH3(Fab)配体的结构域D的溶液结构和晶体结构已经解出，这些配体在不同的位点以非竞争性方式结合蛋白A(Graille等，2000)。
在晶体结构复合物中，Fab通过由4个VH区β-股形成的表面与结构域D的螺旋II和螺旋域III相互作用(Graille等，2000)。结构域D的螺旋II的主轴与股的方向约成50°，结构域D的螺旋内部分最靠近C0股。Fab的相互作用位点远离Ig轻链和重链的恒定区。相互作用涉及结构域D的下列残基：螺旋II的Asp-36，螺旋II和螺旋III之间环的ASP-37和Gln-40，以及SpA-D的几个其他残基(Graille等，2000)。这两个相互作用表面都主要由极性侧链构成，参与相互作用的结构域D的三个负电荷残基和在2A2Fab上的两个正电荷残基提供两个分子间的整体静电吸引。在Fab和结构域D之间鉴定的5个极性相互作用中，三个在侧链之间。在Arg-H19和Asp-36之间形成盐桥，在Tyr-H59和Asp-37以及Asn-H82a和Ser-33之间形成两个氢键。由于Asp-36和Asp-37在蛋白A的所有五个IgG结合结构域中是保守的，选择这些残基进行突变。
负责Fab结合的SpA-D位点在结构上与介导Fcγ结合的结构域表面是分开的。Fcγ与结构域D的相互作用主要涉及螺旋I的残基，并且有较少螺旋II参与(Deisenhofer，1981；Gouda等，1992)。除Gln-32(两个复合物中的轻微接触)外，没有介导Fcγ相互作用的残基参与Fab结合。为了研究这些不同的Ig结合位点之间的空间关系，这些复合物中的SpA结构域被叠加来构建Fab、SpA-结构域D和Fcγ分子之间复合物的模型。在这个三重模型中，Fab和Fcγ在螺旋II的相反面形成“三明治”夹心，而没有证据表明任一相互作用存在空间位阻。这些结果说明尽管体积小(即56-61个氨基酸)，但SpA结构域可以同时显示两种活性，这解释了Fab与单个结构域的相互作用是非竞争性的实验证据。SpA-D和Fcγ之间的相互作用残基是Gln-9和Gln-10。
与之不同，IgG的Fc部分对结构域D的占据阻断其与vWF A1的相互作用，并且也可能阻断与TNFR1的相互作用(O′Seaghdha等，2006)。对IgG Fc结合必不可少的残基(F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和K35)突变对于vWF A1和TNFR1结合也是必需的(Cedergren等，1993；Gómez等，2006；O′Seaghdha等，2006)，而对于VH3相互作用必需的残基(Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43、E47)对IgG Fc、vWFA或TNFR1的结合活性没有影响(Jansson等，1998；Graille等，2000)。蛋白A免疫球蛋白Fab结合活性靶向在表面表达VH3家族相关IgM的B细胞亚群，即这些分子作为VH3型B细胞受体发挥作用(Roben等，1995)。与SpA相互作用后，这些B细胞迅速增殖而后凋亡，导致优先的和延长的先天样B淋巴细胞(即边缘区B细胞和滤泡B2细胞)缺失(Goodyear和Silverman，2004；Goodyear和Silverman，2003)。重要的是超过40％的循环B细胞被蛋白A相互作用靶定，VH3家族是赋予针对病原体的保护性体液应答的最大人B细胞受体家族(Goodyear和Silverman，2004年，Goodyear和Silverman，2003)。因此，蛋白A的作用类似于葡萄球菌超抗原(Roben等，1995)，尽管后一类的分子(例如SEB、TSST-1、TSST-2)与T细胞受体形成复合物，不适当地刺激宿主的免疫应答，从而引发葡萄球菌感染的特征性疾病特征(Roben等，1995；Tiedemann等，1995)。这些发现总体记录了蛋白A在建立葡萄球菌感染和调节宿主免疫应答中的作用。
蛋白A的非产毒变体。本发明人开发了非产毒的葡萄球菌蛋白A变体，并且使用此试剂首次用于测量动物对蛋白A免疫的免疫应答。并且，本发明人研究了使用非产毒蛋白A变体免疫的动物是否可以产生针对葡萄球菌感染提高保护性免疫的免疫应答。
为了干扰蛋白A与IgG Fc、vWF A1和TNFR1的结合活性，对谷氨酰胺(Q)残基9和10[此处的编号来自于对SpA结构域D已建立的编号]进行了修饰，对两个谷氨酰胺进行赖氨酸或甘氨酸替换，预期这些替换会破坏野生型蛋白A与其配体间形成的离子键。双赖氨酸替换的增加的效果可能是这些带正电荷的残基组构成了与免疫球蛋白相斥的电荷。为了干扰IgM Fab VH3结合，本发明人选择SpA-D的36和37位天冬氨酸(D)，其中每个都是蛋白A与B细胞受体结合所需要的。D36和D37均由丙氨酸替换。Q9，10K和D36，37A突变在重组分子SpA-DQ9，10K；D36，37A中进行了组合并检查蛋白A的结合性质。
简言之，使用引物(GCTGCACATATGGCGCAACACGATGAAGCTCAAC[5′引物](SEQ ID NO：35)和AGTGGATCCTTATGCTTTGTTAGCATCTGC[3′引物](SEQ ID NO：36))PCR扩增金黄色葡萄球菌N315的蛋白A(spa)基因组序列，将其克隆到pET15b载体(pYSJ1，密码子48-486)(Stranger-Jones，等，2006)，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中(Studier等，1990)。来自于pYSJ1的蛋白A产物具有融合N端His标签36-265(MGSSHHHHHHSSGLVPRGS(SEQ ID NO：37))的SpA残基。IPTG诱导表达后，在Ni-NTA树脂上通过亲和层析纯化带有重组的N末端有His6标签的SpA(Stranger-Jones等，2006)。使用一对特异性引物(AACATATGTTCAACAAAGATCAACAAAGC[5′引物](SEQ ID NO：38)和AAGGATCCAGATTCGTTTAATTTTTTAGC[3′引物](SE Q ID NO：39))PCR扩增SpA的结构域D(SpA-D)，亚克隆到pET15b载体中(pHAN1，spa密码子212-261)，然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以表达和纯化重组的N末端有His6标签的蛋白。为了在SpA-D编码序列中产生突变，合成了两对引物，(对于D到A替换：CTTCATTCAAAGTCTTAAAGCCGCCCCAAGCCAAAGCACTAAC[5′引物](SEQ IDNO：40)和GTTAGTGCTTTGGCTTGGGGCGGCTTTAAGACTTTGAATGAAG[3′引物](SEQ ID NO：41)；对于Q到K替换：CATATGTTCAACAAAGATAAAAAAAGCGCCTTCTATGAAATC[5′引物](SEQ IDNO：42)和GATTTCATAGAAGGCGCTTTTTTTATCTTTGTTGAACATATG[3′引物](SEQ ID NO：43)；对于Q到G替换：CATATGTTCAACAAAGATGGAGGAAGCGCCTTCTATGAAATC[5′引物](SE Q IDNO：44)和GATTTCATAGAAGGCGCTTCCTCCATCTTTGTTGAACATATG′[3′引物](SEQ ID NO：45)。引物用于快速变化(quick-change)诱变方案。诱变后，对每个重组蛋白的DNA序列进行验证：SpA、SpA-D和SpA-DQ9，10G；D36，37A和SpA-DQ9，10K；D36，37A。所有蛋白都使用Ni-NTA色谱从重组大肠杆菌裂解物中纯化，然后用PBS透析并在4℃保存。
为了测量免疫球蛋白与蛋白A及其变体的结合，用柱缓冲液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)将200μg纯化的蛋白稀释到1ml体积，然后上样到预平衡的Ni-NTA柱(1ml柱床体积)。柱用10ml柱缓冲液清洗。200μg纯化的人IgG稀释到总体积1ml的柱缓冲液中，然后加入到每个已经加载了蛋白A和其变体的柱上。然后用5ml清洗缓冲液(10mM咪唑的柱缓冲液溶液)和5ml柱缓冲液清洗柱。蛋白质样品用2ml洗脱缓冲液(500mM咪唑的柱缓冲液溶液)洗脱，收集级分，等份样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后用考马斯亮蓝染色。如图3所示，在层析期间野生型蛋白A(SpA)和其SpA-结构域D均截留免疫球蛋白。相反，SpA-DQ9，10K；D36，37A变体没有结合免疫球蛋白。
为了对蛋白A及其变体与免疫球蛋白Fc部分和Fab的VH3结构域的结合进行定量，使用HRP缀合的人免疫球蛋白G[hIgG]、人IgG的Fc部分[hFc]和人IgG的F(ab)2部分[hF(ab)2]以及ELISA分析对结合到蛋白A及其变体上的相对量进行定量。图4中的数据证明SpA和SpA-D结合hIgG和hFc，而SpA-DQ9，10G；D36，37A和SpA-DQ9，10K；D36，37A仅显示背景结合活性。SpA结合类似量的hFc和hF(ab)2，但是相比全长SpA，SpA-D与hF(ab)2的结合减少。该结果表明，多个IgG结合结构域的存在可能协同增加了蛋白A结合B细胞受体的能力。当与SpA-D和hF(ab)2的结合力减少相比时，两个变体中仅SpA-DQ9，10K；D36，37A显示结合免疫球蛋白VH3结构域能力的显著下降。为了检查SpA-D及其变体的产毒特性，将纯化的蛋白注射到小鼠体内，经过4小时后处死并取脾。器官组织匀浆后，去除包膜物质，B细胞用荧光CD19抗体染色。然后进行FACS分析对脾组织中B细胞丰度进行定量，观察到SpA-D导致B细胞计数相比模拟(PBS)对照有5％的下降(图5)。相反，SpA-DQ9，10K；D36，37没有导致B细胞计数的下降，表明突变分子丧失了其刺激B细胞增殖和死亡的产毒特性(图5)。总之，SpA-D残基Q9、Q10、D36和D37的氨基酸替换破坏了蛋白A结构域在人类和动物组织内结合免疫球蛋白或发挥产毒功能的能力。
非产毒蛋白A变体引发疫苗保护。为了测试蛋白A及其变体是否可以发挥疫苗抗原功能，将SpA、SpA-D，SpA-DQ9，10K；D36，37A和SpA-DQ9，10K；D36，37A用弗氏完全或不完全佐剂乳化，在第1天和第11天用50μg纯化的蛋白免疫4周龄的BALB/c小鼠。通过在免疫程序之前(第0天)和之后(第21天)对动物取血来分析各组动物(n＝5)对免疫的体液免疫应答。表5表明，经免疫的小鼠仅产生针对野生型蛋白A或其SpA-D组件的温和体液免疫应答，而用SpA-DQ9，10K；D36，37A或SpA-DQ9，10K；D36，37A免疫后产生的抗体量增加了4到5倍。用1×107CFU金黄色葡萄球菌Newman株静脉内攻击后，在第4天处死动物，取其肾并进行葡萄球菌负荷分析(通过将组织匀浆涂布到琼脂平板上并对菌落形成单位(CFU)进行计数)和组织病理学分析。如所预期的，模拟(PBS)免疫的小鼠(n＝19)在肾组织中有6.46log10(±0.25)CFU，感染病变统计为每个器官(n＝10)3.7(±1.2)个脓肿(表5)。用SpA免疫动物导致在第5天减少2.51log10CFU(P＝0.0003)，每个器官为2.1(±1.2)个脓肿。后一数据表明，脓肿形成没有显著减少(P＝0.35)。用SpA-D免疫产生了类似的结果：第5天减少2.03log10CFU(P＝0.0001)，每个器官1.5(±0.8)个脓肿(P＝0.15)。相反，用SpA-DQ9，10K；D36，37A或SpA-DQ9，10G；D36，37A免疫产生增强的保护，在第4天分别减少了3.07log10和3.03log10CFU(两组结果均有统计学显著性P＜0.0001)。此外，用SpA-DQ9，10K；D36，37A和SpA-DQ9，10G；D36，37A两者免疫对葡萄球菌脓肿形成均产生显著的保护，每个器官仅发现0.5(±0.4)和0.8(±0.5)个感染病变(P＝0.02和P＝0.04)。因此，用非产毒的蛋白A变体免疫产生对蛋白A的增强的体液免疫应答，并且对葡萄球菌攻击提供保护性免疫。这些数据表明，蛋白A是预防金黄色葡萄球菌疾病的人疫苗的理想候选物。
这些令人兴奋的结果对于人疫苗的设计有几个启示。首先，产生影响蛋白A的免疫球蛋白结合结构域(单独或者两个或多个结构域的组合)的能力的替换突变可以产生适于疫苗开发的非产毒的变体。看起来与蛋白A的结构非常类似的突变IgG结合结构域的组合很可能可以产生更好的体液免疫应答，如本文报道的单独SpA结构域D。并且，蛋白A特异性抗体的可能的贡献是，抗原结合位点与微生物表面的相互作用可能可以中和葡萄球菌通过Fc部分捕获免疫球蛋白或通过VH3结合活性刺激B细胞受体的能力。
表5 非产毒蛋白A变体作为预防金黄色葡萄球菌病的疫苗抗原
Figure BDA00002686453900861
a18至20只BALB/c小鼠的组感染后4天肾组织匀浆中葡萄球菌的负荷平均值，以log10CFUg-1计算＝。注明了平均值的标准误(±SEM)。
c使用Student’s t检验计算统计学显著性并记录P值；认为P值＜0.05有显著性。
b以log10CFU g-1计算的细菌负荷的减少。
d通过目测测量感染后4天肾组织中的脓肿形成(％阳性)
e10只动物的苏木精-伊红染色肾超薄切片的组织病理学；记录每个肾中的脓肿数并平均得到最终平均值(±SEM)。
f使用Student’s t检验计算统计学显著性并记录P值；认为P值＜0.05有显著性。
SpA-D1和SpA-D2分别表示SpA-DQ9，10K；D36，37A和SpA-DQ9，10G；D36，37A。
鼠脓肿、鼠致命感染和鼠肺炎模型中的疫苗保护。为研究金黄色葡萄球菌感染性疾病建立了三个动物模型。这些模型在此用于检查蛋白A特异性抗体产生的保护性免疫的水平。
鼠脓肿—将纯化的蛋白通过肌内注射到BALB/c小鼠(24日龄雌性小鼠，每组8-10只，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)后腿进行免疫(Chang等，2003；Schneewind等，1992)。在第0天(用弗氏完全佐剂1∶1乳化)和第11天(用弗氏不完全佐剂1∶1乳化)施用纯化的SpA、SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A(50μg蛋白)。在第0、11和20天通过眶后取血样。通过ELISA检测血清中具有SpA-D和SpA-DQ9，10K；D36，37A特异性结合活性的IgG的效价。免疫的动物在第21天通过眶后注射100μl金黄色葡萄球菌Newman株或金黄色葡萄球菌USA300悬液(1×107cfu)进行攻击。为此，金黄色葡萄球菌Newman株的过夜培养物以1∶100稀释到新鲜胰蛋白胨大豆培养液中，在37℃生长3小时。将葡萄球菌离心，清洗两次，并稀释到PBS中使A600值为0.4(每ml 1×108cfu)。稀释液通过琼脂铺板和菌落形成进行试验验证。小鼠每千克体重腹腔内注射80-120mg开他敏和3-6mg甲苯噻嗪进行麻醉并通过眶后注射进行感染。在攻击后第5天或第15天，小鼠通过压缩CO2吸入法进行安乐死。取肾在1％Triton X-100中匀浆。稀释等份试样并涂布琼脂培养基进行cfu的三次测定。对于组织学检查，肾组织在10％甲醛中室温孵育24小时。组织用石蜡包埋，超薄切片，苏木精-伊红染色并用显微镜检查。
鼠致命感染—将纯化的SpA、SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A(50μg蛋白)通过肌内注射到BALB/c小鼠(24日龄的雌性小鼠，每组8-10只，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的后腿进行免疫。在第0天(用弗氏完全佐剂1∶1乳化)和第11天(用弗氏不完全佐剂1∶1乳化)施用疫苗。在第0、11和20天通过眶后取血收集血样。通过ELISA检测血清中具有SpA-D和SpA-DQ9，10K；D36，37A特异性结合活性的IgG效价。免疫的动物在第21天通过眶后注射100μl金黄色葡萄球菌Newman株或金黄色葡萄球菌USA300悬液(15×107CFU)进行攻击(34)。为此，金黄色葡萄球菌Newman株的过夜培养物以1∶100稀释到新鲜胰蛋白胨大豆培养液中，在37℃生长3小时。将葡萄球菌离心，清洗两次，并稀释到PBS中使A600值为0.4(每ml1×108CFU)并浓缩。稀释液通过琼脂铺板和菌落形成进行试验验证。小鼠每千克体重腹腔内注射80-120mg开他敏和3-6mg甲苯噻嗪进行麻醉。免疫的动物在第21天通过腹腔内注射2×1010cfu金黄色葡萄球菌Newman株或3-10×109cfu的金黄色葡萄球菌临床分离株进行攻击。监测动物14天，并记录致死疾病情况。
鼠肺炎模型—金黄色葡萄球菌Newman株或USA300(LAC)在胰蛋白胨大豆培养液/琼脂中37℃生长到OD660值达到0.5。50ml等份培养物离心、用PBS清洗并悬浮到750μl PBS中进行死亡率研究(每30μl体积含3-4×108CFU)，或悬浮到1,250μl PBS中(每30μl体积含2×108CFU)进行细菌负荷和组织病理学试验(2，3)。对于肺部感染，7周龄C57BL/6J小鼠(The Jackson Laboratory)麻醉后在左鼻孔内接种30μl金黄色葡萄球菌悬液。动物以仰卧体位置于笼中恢复并观察14天。对于主动免疫，4周龄小鼠在第0天通过肌内途径接受CFA中的20μg SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A，然后在第10天用弗氏不完全佐剂(IFA)中的20μgSpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A加强免疫。动物在第21天用金黄色葡萄球菌攻击。在免疫前以及第20天收集血清，评价特异性抗体的产生。对于被动免疫研究，7周龄小鼠在被攻击前24小时腹腔内注射接受100μl NRS(正常兔血清)或SpA-D特异性的兔抗血清。为了评价肺炎的病理相关性，感染的动物通过强制CO2吸入处死，然后摘取双侧肺。右侧肺匀浆进行肺部细菌负荷计数。左侧肺置于1％福尔马林中并用石蜡包埋，超薄切片，苏木精-伊红染色并用显微镜分析。
兔抗体—纯化的200μg SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A用作免疫原产生兔抗血清。用CFA乳化200μg蛋白用于第0天注射，然后用IFA乳化200μg蛋白在第21天和第42天注射加强。通过ELISA测定兔抗体效价。在SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A琼脂糖凝胶上用亲和层析兔血清获得纯化的抗体。通过A280吸光度测量洗脱的抗体的浓度，并通过ELISA测定特异性抗体效价。
用SpA结构域D变体主动免疫。—为了测定疫苗效果，用纯化的SpA-D或SpADQ9，10K；D36，37A主动免疫动物。作为对照，单独用佐剂免疫动物。使用SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A作为抗原测定针对蛋白A制剂的抗体效价；注意SpA-DQ9，10K；D36，37A变体不能结合IgG的Fc或Fab部分。使用上述的感染疾病模型，测量任何细菌负荷的减少(鼠脓肿和肺炎)、葡萄球菌疾病的组织病理学证据(鼠脓肿和肺炎)和对致死疾病的保护(鼠致死攻击和肺炎)。
用针对SpA结构域D变体产生的亲和纯化的兔多克隆抗体进行被动免疫。为了测定蛋白A特异性兔抗体的保护性免疫，用5mg/kg纯化的源自SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A的兔抗体被动免疫小鼠。使用固定化的SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A通过亲和层析纯化这两种抗体制剂。作为对照，用rV10抗体(鼠疫保护性抗原，对葡萄球菌感染结果没有影响)被动免疫动物。因为该变体不能结合IgG的Fc或Fab部分，使用SpA-DQ9，10K；D36，37A作为抗原测定针对所有蛋白A制剂的抗体效价。使用上述的感染疾病模型，测量细菌负荷的减少(鼠脓肿和肺炎)、葡萄球菌疾病的组织病理学证据(鼠脓肿和肺炎)和对致死疾病的保护(鼠致死攻击和肺炎)。
实施例2
用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的非产毒蛋白A疫苗
金黄色葡萄球菌的临床分离株表达蛋白A(Shopsin等，1999)，其初级翻译产物含有N末端信号肽(DeDent等，2008)、5个Ig-BD(称为E、D、A、B和C)(Sjodahl，1977)、具有8残基肽的可变重复序列的区域X(Guss等，1984)以及用于SpA细胞壁锚定的C末端分选信号(Schneewind等，1992；Schneewind等，1995)(图6)。根据氨基酸同源性(Uhlen等，1984)，IgBD的三α-螺旋束结构(Deisenhofer等，1978；Deisenhofer等，1981)及其与Fab VH3(Graille等，2000)或Fcγ(Gouda等，1998)的原子相互作用，选择谷氨酰胺9和10以及天冬氨酸36和37，因为其分别对于SpA和抗体或B细胞受体的结合非常重要。将Gln9Lys、Gln10Lys、Asp36Ala和Asp37Ala替换引入结构域D产生SpA-DKKAA(图6)。用亲和层析分析分离的SpA-D或SpA-DKKAA结合人IgG的能力(图6)。有多聚组氨酸标签的SpA-D以及全长SpA将人IgG截留在Ni-NTA上，而SpA-DKKAA和阴性对照(SrtA)则不能(图6)。对von Willebrand因子(Hartleib等，2000)也观察到类似的结果，von Willebrand因子与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)(Gomez等，2004)一起也可以通过谷氨酰胺9和10结合蛋白A(图6)。人免疫球蛋白包括60-70％的VH3型IgG。本发明人区分了Ig的Fc结构域和B细胞受体活化，并测量了人Fcγ和F(ab)2片段的结合，两者均结合全长SpA或SpA-D但是不结合SpA-DKKAA(图6)。将SpA-D注射小鼠腹腔造成BALB/c小鼠脾组织中B细胞扩增，随后发生CD19+淋巴细胞凋亡性破坏(Goodyear and Silverman，2003)(图6)。注射SpA-DKKAA没有观察到B细胞超抗原活性，而注射SpA或SpA-D之后TUNEL染色的脾组织也没有检测到凋亡细胞增加(图6)。
6周龄未接受刺激的BALB/c小鼠分别注射CFA乳化的50μg纯化的SpA、SpA-D或SpA-DKKAA，并用IFA乳化的同样抗原进行加强。本发明人观察到与SpA-D促进经活化纯系B细胞群的凋亡性破坏的假说符合，用非产毒变体免疫小鼠后产生的SpA-DKKAA特异性抗体效价与B细胞超抗原相比高10倍(Spa-D相比于SpA-DKKAA P＜0.0001，表6)。用全长SpA免疫产生的抗体效价比用SpA-D引发的抗体效价高(P＝0.0022)，这可能是由于SpA抗原的体积较大和其重复的结构域结构(表6)。但是，甚至SpA引发的抗体效价也低于SpA-DKKAA(P＝0.0003)，后者仅涵盖了蛋白A(520个残基，SEQ ID NO：33)的50个氨基酸。免疫的小鼠通过静脉内接种金黄色葡萄球菌Newman株接受攻击，攻击后4天尸检检查葡萄球菌在肾组织中形成脓肿的能力。在模拟免疫(PBS/佐剂)的小鼠匀浆的肾组织中，平均葡萄球菌负荷计为6.46log10CFUg-1(表6)。用SpA或SpA-D免疫小鼠导致葡萄球菌负荷降低，但是SpA-DKKAA免疫的小鼠表现的更明显，肾组织中金黄色葡萄球菌Newman株负荷减少了3.07log10CFUg-1(P＜0.0001，表6)。通过组织病理学分析肾中脓肿形成(图7)。模拟免疫的动物每个肾平均具有3.7(±1.2)个脓肿(表6)。用SpA-DKKAA免疫将平均脓肿数降低到0.5(±0.4)(P＝0.0204)，而用SpA或SpA-D免疫没有造成脓肿病变数的显著降低(表6)。SpA-DKKAA免疫的动物的病变大小较小，具有较少的PMN浸润和特征性缺少的葡萄球菌脓肿群(Cheng等，2009)(图7)。用SpA或SpA-D免疫的动物中的脓肿相比模拟免疫的动物显示同样的总体病变结构(图7)。
本发明人检查了SpA-DKKAA免疫是否能够针对MRSA菌株保护小鼠，并选择USA300LAC分离株用于攻击动物(Diep等，2006)。这种高毒力的CA-MRSA菌株在美国迅速传播，导致严重的人发病率和死亡率(Kennedy等，2008)。相比佐剂对照小鼠，SpA-DKKAA免疫的动物在感染的肾组织中细菌负荷降低了1.07log10 CFUg-1。金黄色葡萄球菌USA300攻击后，肾组织的组织病理学检查发现脓肿的平均数从4.04(±0.8)下降到1.6(±0.6)(P＝0.02774)。相反，SpA或SpA-D免疫没有导致细菌负荷或脓肿形成的显著降低(表6)。
兔用SpA-DKKAA免疫，并且用SpA-DKKAA亲和柱纯化特异性抗体，然后进行SDS-PAGE(图8)。SpA-DKKAA特异性IgG用胃蛋白酶切割产生Fcγ和F(ab)2片段，后者用SpA-DKKAA柱层析纯化(图8)。人IgG或vWF与SpA或SpA-D的结合被SpA-DKKAA特异性F(ab)2干扰，表明SpA-DKKAA产生的抗体中和蛋白A的B细胞超抗原功能以及其与Ig的相互作用(图8)。
为了进一步改进非产毒蛋白A的疫苗特性，本发明人生成了SpAKKAA，其包括所有5个IgBD，并在5个结构域中(E、D、A、B和C)每个均具有4个氨基酸替换—对应结构域D的Gln9Lys、Gln10Lys、Asp36Ala和Asp37Ala替换。通过亲和层析纯化多聚组氨酸标签化的SpAKKAA，并用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析(图9)。与全长SpA不同，SpAKKAA不结合人IgG、Fc和F(ab)2或vWF(图9)。SpAKKAA不显示B细胞超抗原活性，因为将该变体注射到BALB/c小鼠中没有导致脾组织中CD19+B细胞耗尽(图9)。SpAKKAA免疫产生比SpA-DKKAA免疫更高的特异性抗体效价，为小鼠提供更高的针对金黄色葡萄球菌USA300攻击的保护(表6)。攻击后4天，SpAKKAA接种的动物肾组织中葡萄球菌负荷降低了3.54log10CFUg-1(P＝0.0001)，并且还使脓肿病变数的更大的降低(P＝0.0109)(表6)。
使用SpAKKAA免疫兔。对SpA-DKKAA或SpAKKAA特异的兔抗体存有固定化的相应抗原的基质上亲和纯化，并以5mg kg-1体重的浓度注射到BALB/c小鼠腹腔内(表7)。24小时后，测定血清中的特异性抗体效价，并且通过静脉内接种金黄色葡萄球菌Newman株对动物进行攻击。对于SpA-DKKAA(P＝0.0016)或SpAKKAA(P＝0.0005)特异性抗体，被动转移降低了肾组织中葡萄球菌负荷。在组织病理学检查中，两种抗体均减少了被金黄色葡萄球菌Newman株攻击的小鼠肾中脓肿病变的丰度(表7)。所有这些数据揭示用SpA-DKKAA或SpAKKAA免疫后的疫苗保护作用是由中和蛋白A的抗体赋予的。
表6.用蛋白A疫苗主动免疫小鼠
a每种免疫的15至20只BALB/c小鼠的组感染后4天肾组织匀浆中葡萄球菌的负荷平均值，以log10 CFUg-1计算。显示了三组中具有代表性的并且是可重复的动物实验。注明了平均值的标准误(±SEM)。
b使用未配对双尾Student’s t检验计算统计学显著性并记录P值；认为P值＜0.05有显著性。
c以log10 CFU g-1计算的细菌负荷的减少。
d在葡萄球菌感染前通过ELISA测量5个随机选择的血清IgG效价的平均值。
e10只动物的苏木精-伊红染色肾超薄切片的组织病理学；记录每个肾中的脓肿平均数并再平均得到最终平均值(±SEM)。
表7.用针对蛋白A的抗体被动免疫小鼠
Figure BDA00002686453900921
a在用1×107CFU的金黄色葡萄球菌Newman株静脉内攻击前24小时将亲和纯化的抗体以5mg kg-1的浓度注射到BALB/c小鼠腹腔中。
b感染后4天没种免疫的15只BALB/c小鼠的组的肾组织匀浆中葡萄球菌的负荷平均值，以log10 CFU g-1计算。注明了平均值的标准误(±SEM)。
c使用未配对双尾Student’s t检验计算统计学显著性并记录P值；认为P值＜0.05有显著性。
d以log10 CFU g-1计算的细菌负荷的减少。
e在葡萄球菌感染前通过ELISA测量5个随机选择的血清IgG滴度的平均值。
f10只动物的苏木精-伊红染色肾超薄切片的组织病理学；记录每个肾中脓肿的平均数并再平均得到最终的平均值(±SEM)。
用有毒力的金黄色葡萄球菌感染后，小鼠没有产生针对同一菌株后续感染的保护性免疫(Burts等，2008)(图10)。通过点印迹测定这些动物中SpA-DKKAA特异性IgG的平均丰度对于Newman株和USA300LAC株分别为0.20μg ml-1(±0.04)和0.14μg ml-1(±0.01)(图9)。在SpAKKAA或SpA-DKKAA接种的动物中产生疾病保护(肾组织中葡萄球菌CFUg-1减少P.0.05log10)所需的蛋白A特异性IgG的最低浓度计算为4.05μg ml-1(±0.88)。在成年健康人体志愿者(n＝16)中SpA特异性IgG的平均血清浓度为0.21μg ml-1(±0.02)。因此，小鼠或人的金黄色葡萄球菌感染与产生高水平的针对蛋白A之中和抗体的免疫应答无关，这可能由于该分子的B细胞超抗原特性。相反，人志愿者中白喉毒素特异的IgG的平均血清浓度0.068μg ml-1(±0.20)在抗白喉的保护性免疫范围之内(Behring，1890；Lagergard等，1992)。
金黄色葡萄球菌临床分离株表达关键的毒力因子蛋白A，其B细胞超抗原活性和逃避调理细胞吞噬(opsono-phagocytic)清除的特性是葡萄球菌脓肿形成绝对需要的(Palmqvist等，2005；Cheng等，2009；Silverman和Goodyear，2006)。因此认为蛋白A可以是致病必需的毒素，为了获得保护性免疫必须中和其分子特性。通过产生不能通过Fcγ或VH3-Fab结构域结合Ig的非产毒变体，本发明人首次测量中和蛋白A的免疫应答与针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫之间的联系。与很多甲氧西林敏感性菌株不同，CA-MRSA分离株USA300LAC的毒力明显更高(Cheng等，2009)。例如用表面蛋白IsdB(Kuklin等，2006；Stranger-Jones等，2006)免疫实验动物产生抗体能够针对金黄色葡萄球菌Newman株提供保护(Stranger-Jones等，2009)，但是不能针对USA300菌株的攻击。
采用的方法包括：
菌株和培养。金黄色葡萄球菌Newman株和USA300株在37℃培养于胰蛋白胨大豆培养液(TSB)。大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)在37℃生长于添加100μg ml-1氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基。
兔抗体。使用金黄色葡萄球菌Newman株模板DNA，用两条引物gctgcacatatggcgcaacacgatgaagctcaac(SEQ ID NO：35)和agtggatccttatgcttgagctttgttagcatctgc(SEQ ID NO：36)对SpA的编码序列进行PCR扩增。用两条引物aacatatgttcaacaaagatcaacaaagc(SEQ ID NO：38)和aaggatccagattcgtttaattttttagc(SEQ ID NO：39)对SpA-D进行PCR扩增。SpA-DKKAA的序列用两套引物进行诱变，用于Q9K、Q10K的catatgttcaacaaagataaaaaaagcgccttctatgaaatc(SEQ  ID NO：42)和gatttcatagaaggcgctttttttatctttgttgaacatatg(SEQ ID NO：43)，以及用于D36A、D37A的cttcattcaaagtcttaaagccgccccaagccaaagcactaac(SEQ ID NO：40)和gttagtgctttggcttggggcggctttaagactttgaatgaag(SEQ ID NO：41)。SpAKKAA的序列由Integrated DNA Technologies，Inc.合成。将PCR产物克隆到pET-15b中产生N末端His6标签化的重组蛋白。质粒转化到BL21(DE3)中。转化子的过夜培养物按1∶100稀释到新鲜培养基中，并在37℃生长到OD6000.5，此时用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养物并继续培养3个小时。离心沉淀细菌细胞，用柱缓冲液(50mM Tris-HCI，pH7.5，150mM NaCl)悬浮，并用French pressure cell在14,000psi下破碎细胞。在40,000×g超速离心去除裂解物的膜和不溶组分。对可溶裂解物中的蛋白质进行镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA，Qiagen)亲和层析。蛋白质用含有连续递增浓度的咪唑(100-500mM)的柱缓冲液洗脱。用二辛可宁酸(BCA)测定(Thermo Scientific)测定蛋白浓度。对于抗体的产生，用弗氏完全佐剂(Difco)乳化的500μg蛋白通过囊膜注射免疫兔(6月龄新西兰白雌兔，Charles River Laboratories)。对于加强免疫，蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，并在初始免疫后24或48天注射。在第60天，对兔取血并回收血清。
纯化的抗原(5mg蛋白)共价连接到HiTrap NHS活化的HP柱(GEHealthcare)。用抗原基质在4℃亲和层析10-20ml兔血清。结合后的基质用50倍柱体积的PBS清洗，用洗脱缓冲液(1M甘氨酸，pH 2.5，0.5MNaCl)洗脱抗体，并立即用1M Tris-HCl，pH 8.5中和。纯化的抗体在4℃用PBS透析过夜。
F(ab)2片段。亲和纯化的抗体与3mg胃蛋白酶在37℃下混合30分钟。用1M Tris-HCI，pH 8.5中止反应，用缀合特异性抗原的Hi Trap NHS活化的HP柱亲和纯化F(ab)2片段。纯化的抗体用PBS在4℃透析过夜，上样到SDS-PAGE凝胶并通过考马斯亮蓝染色观察。
主动和被动免疫。用弗氏完全佐剂(Difco)乳化的50μg蛋白肌内注射免疫BALB/c小鼠(3周龄，雌性，Charles River Laboratories)。对于加强免疫，蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，并在初始免疫后11天注射。在免疫后第20天，对5只小鼠取血获得血清并用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定特异性抗体效价。
在经金黄色葡萄球菌攻击的24小时前，将PBS中的亲和纯化抗体以5mg/kg实验动物重量的浓度注射到BALB/c小鼠(6周龄，雌性，CharlesRiver Laboratories)腹腔中。通过眼眶静脉穿刺收集动物血液。通过肝素化微量红细胞压积毛细管(Fisher)移除血细胞并使用Z-凝胶血清分离微管(Z-gel serum separation micro tube，Sarstedt)收集并通过ELISA测量抗原特异性抗体效价。
小鼠肾脓肿。金黄色葡萄球菌Newman株或USA300(LAC)株的过夜培养物按1∶100稀释到新鲜TSB中并在37℃培养2小时。沉淀葡萄球菌，清洗并用PBS悬浮达到OD600 0.4(～1×108CFU ml-1)。在TSA上涂布等份样品并对形成的菌落计数来对接种物进行定量。BALB/c小鼠(6周龄，雌性，Charles River Laboratories)每千克体重腹腔内注射100mgml-开他敏和20mg ml-1甲苯噻嗪进行麻醉。用1×107CFU金黄色葡萄球菌Newman株或5x 106CFU金黄色葡萄球菌USA300株眶后注射感染小鼠。在攻击后第4天，用CO2吸入法处死小鼠。取两肾，通过在PBS，1％Triton X-100中匀浆肾组织分析单个器官中葡萄球菌负荷。将匀浆的系列稀释液涂布TSA并孵育进行菌落形成。剩余的器官进行组织病理学检查。简言之，肾在室温下用10％福尔马林固定24小时。组织用石蜡包埋，超薄切片，苏木精-伊红染色并用光学显微镜检查以对脓肿病变计数。所有的小鼠实验都在芝加哥大学的生物安全委员会(IBC)和动物管理和使用委员会(IACUC)对实验技术方案进行审查和批准之后，根据机构指导进行。
蛋白A结合。对于人IgG结合，Ni-NTA亲和柱用柱缓冲液中的200μg纯化的蛋白(SpA、SpA-D、SpA-DKKAA和SrtA)预加载。清洗后，将200μg人IgG(Sigma)加载到柱上。从清洗和洗脱液中收集蛋白样品，用SDS-PAGE凝胶电泳，然后考马斯亮蓝染色。用1μg ml-1浓度的纯化蛋白(SpA、SpAKKAA、SpA-D和SpA-DKKAA)的0.1M碳酸缓冲液(pH 9.5)包被MaxiSorp ELISA板(NUNC)，在4℃下孵育过夜。然后用5％全乳封闭板，用系列稀释的过氧化物酶缀合的人IgG、Fc或F(ab)2片段孵育一小时。清洗平板，并用OptEIA ELISA试剂(BD)显色。用1M磷酸中止反应，使用A450读数计算半最大效价和结合百分比。
von Willebrand因子(vWF)结合测定。纯化的蛋白(SpA、SpAKKAA、SpA D和SpA-DKKAA)按照上文所述进行包被和封闭。平板与1μg ml-1人vWF孵育2小时，然后清洗并用人IgG再封闭1小时。清洗后，平板用系列稀释的过氧化物酶缀合的抗人vWF抗体孵育1小时。清洗平板，并用OptEIA ELISA试剂(BD)显色。用1M磷酸中止反应，使用A450读数计算半最大效价和结合百分比。对于抑制测定，平板与10μg ml-1浓度的亲和纯化的SpAKKAA特异性的F(ab)2片段孵育1小时，然后进行配体结合测定。
脾细胞凋亡。将亲和纯化的蛋白(150μg的SpA、SpA-D、SpAKKAA和SpA-DKKAA)注射到BALB/c小鼠腹腔内(6周龄，雌性，Charles RiverLaboratories)。注射4小时后，用CO2吸入法处死动物。取脾并匀浆。用细胞滤器去除细胞碎片，悬浮的细胞转移到ACK裂解缓冲液中(0.15MNH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA)以裂解红细胞。离心沉淀白细胞，悬浮于PBS并在冰上用1∶250稀释的R-PE缀合的抗CD19单克隆抗体(Invitrogen)染色，在黑暗处放置1小时。细胞用1％FBS清洗并用4％福尔马林在4℃固定过夜。第二天，细胞用PBS稀释并用流式细胞仪分析。剩余的器官进行组织病理学检查。简言之，脾在室温下用10％福尔马林固定24小时。组织用石蜡包埋，超薄切片，用凋亡检测试剂盒(Millipore)染色并用光学显微镜检查。
抗体定量。从曾被金黄色葡萄球菌Newman株或USA300株感染30天或者曾被SpA-DKKAA/SpAKKAA如上文所述免疫的健康人体志愿者或BALB/c小鼠中收集血清。使人/小鼠IgG(Jackson ImmunologyLaboratory)、SpAKKAA和CRM197印迹到硝酸纤维素膜上。膜用5％全乳封闭，然后用人或小鼠血清孵育。通过OdysseTM红外成像系统(Li-cor)将IRDye 700DX缀合的亲和纯化的抗人/小鼠IgG(Rockland)用于对信号强度定量。涉及使用人志愿者的血的试验的技术方案的审查、批准和执行均在芝加哥大学的审查委员会(IRB)的监管下进行。
统计学分析。使用双尾Student’s t检验来分析肾脓肿、ELISA和B细胞超抗原数据的统计学显著性。
参考文献
下列参考文献通过引用具体地并入本文中，从而使得它们提供示例性方法或其它细节，以补充本文所述内容。
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Claims (77)

1.一种分离的多肽，其包含变体蛋白A(SpA)，所述变体蛋白A具有(a)干扰Fc结合的至少一个氨基酸替换和(b)干扰VH3结合的至少第二个氨基酸替换和(c)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽，其中所述变体SpA包含变体结构域D区段。
3.权利要求2的分离的多肽，其中所述SpA变体在SEQ ID NO：2的第9或10位氨基酸具有一个或更多个氨基酸替换，并且具有与SEQ IDNO：2的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列。
4.权利要求3的分离的多肽，其中所述氨基酸替换是赖氨酸残基替换谷氨酰胺残基。
5.权利要求3的分离的多肽，其还包含在SEQ ID NO：2的第36和37位氨基酸的氨基酸替换。
6.权利要求5的分离的多肽，其中所述结构域D的氨基酸序列包含在SEQ ID NO：2的第36和37位氨基酸的丙氨酸残基替换。
7.权利要求2的分离的多肽，其还包含SpA的E结构域、A结构域、B结构域或C结构域的一个或更多个变体。
8.权利要求2的分离的多肽，其包含两个或更多个D结构域区段。
9.权利要求1的分离的多肽，其还包含非蛋白A区段。
10.权利要求9的分离的多肽，其中所述非蛋白A区段是第二抗原区段。
11.权利要求10的分离的多肽，其中所述第二抗原区段是葡萄球菌抗原区段。
12.权利要求11的分离的多肽，其中所述葡萄球菌抗原区段是Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB和/或SasF区段。
13.肽组合物，其在可药用组合物中包含具有一个或更多个突变的非产毒变体蛋白A(SpA)肽，所述突变减弱所述蛋白A结构域D与IgG、Fcγ、VH3F(ab)2、von Willebrand因子(vWF)和肿瘤坏死因子α受体1(TNFR1)的结合，其中所述组合物能在有此需要的对象中刺激免疫应答。
14.权利要求13的组合物，其中所述SpA变体包含在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。
15.权利要求14的组合物，其中所述SpA变体包含在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸的赖氨酸替换。
16.权利要求14的组合物，其还包含在SEQ ID NO：2的第36和37位氨基酸的氨基酸替换。
17.权利要求15的组合物，其中所述SpA变体包含与SEQ ID NO：2有至少70％同一性的氨基酸序列。
18.权利要求13的组合物，其中所述SpA变体包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
19.权利要求13的组合物，其还包含至少第二葡萄球菌抗原。
20.权利要求19的组合物，其中所述第二抗原选自EsaB、Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB和/或SasF肽。
21.权利要求13的组合物，其中除包含所述蛋白A结构域D肽的肽外，所述组合物包含以重量计少于1％的葡萄球菌成分。
22.权利要求13的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
23.权利要求22的组合物，其中所述SpA变体与佐剂偶联。
24.包含分离的肽的免疫原性组合物，所述分离的肽包含在SEQ IDNO：2的第9、10、36和37位氨基酸有氨基酸替换的蛋白A(SpA)变体。
25.权利要求1至24中任一项的组合物，其还包含选自以下的至少一种其他葡萄球菌抗原或其免疫原性片段：Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB和SasF。
26.权利要求1至25中任一项的组合物，其还包含PIA多糖或寡糖。
27.权利要求1至26中任一项的组合物，其还包含来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的V型和/或VIII型荚膜多糖或寡糖。
28.权利要求1至27中任一项的免疫原性组合物，其中葡萄球菌荚膜多糖与蛋白质运载体缀合。
29.权利要求28的免疫原性组合物，其中所述蛋白质运载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)蛋白D、肺炎球菌溶血素和α类毒素。
30.疫苗，其包含权利要求1至29中任一项的组合物和可药用赋形剂。
31.制造疫苗的方法，其包括混合抗原以制造权利要求1至29中任一项的组合物以及添加可药用赋形剂的步骤。
32.用于预防或治疗葡萄球菌感染的方法，其包括对有此需要的患者施用权利要求30的疫苗的步骤。
33.权利要求1至29中任一项的组合物在制造用于治疗或预防葡萄球菌感染的疫苗中的用途。
34.制备用于预防或治疗葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，其包括用权利要求30的疫苗对接受者进行免疫和从所述接受者中分离免疫球蛋白的步骤。
35.通过权利要求34的方法制备的免疫球蛋白。
36.药物组合物，其包含权利要求35的免疫球蛋白和可药用赋形剂。
37.用于治疗或预防葡萄球菌感染的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求36之药物制剂的步骤。
38.权利要求36的药物制剂在制造用于治疗或预防葡萄球菌感染的药物中的用途。
39.在对象中引发针对葡萄球菌属细菌的免疫应答的方法，其包括向所述对象提供有效量的组合物，所述组合物包含在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸具有氨基酸替换的蛋白A(SpA)变体。
40.权利要求39的方法，其中通过向所述对象施用组合物来对所述对象提供有效量的SpA变体，所述组合物包含：
i)分离的SpA变体，其在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸具有氨基酸替换，或
ii)至少一种分离的重组核酸分子，其编码在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸具有氨基酸替换的SpA变体。
41.权利要求40的方法，其中所述组合物包含分离的SpA变体。
42.权利要求39的方法，其中还向所述对象施用佐剂。
43.权利要求41的方法，其中所述组合物包含佐剂。
44.权利要求41的方法，其中所述SpA变体与佐剂偶联。
45.权利要求39的方法，其中所述SpA变体与SEQ ID NO：2有至少70％的同一性，并且在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸具有氨基酸替换。
46.权利要求41的方法，其中所述组合物配制成可药用组合物。
47.权利要求39的方法，其中所述葡萄球菌属细菌是金黄色葡萄球菌。
48.权利要求39的方法，其中所述葡萄球菌属细菌耐受一种或更多种治疗。
49.权利要求48的方法，其中所述细菌是耐甲氧西林的。
50.权利要求39的方法，其还包括多于一次地向所述对象施用所述组合物。
51.权利要求39的方法，其中所述组合物经口、胃肠外、皮下、肌内或静脉内施用。
52.权利要求39的方法，其还包括向所述对象施用包含第二葡萄球菌抗原的组合物。
53.权利要求52的方法，其中所述第二葡萄球菌抗原是以下一种或更多种：Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB和SasF。
54.权利要求40的方法，其中所述组合物包含编码所述SpA变体的重组核酸分子。
55.权利要求54的方法，其中所述组合物包含表达所述SpA变体的重组非葡萄球菌属细菌。
56.权利要求55的方法，其中所述重组非葡萄球菌属细菌是沙门氏菌。
57.权利要求39的方法，其中所述对象是哺乳动物。
58.权利要求39的方法，其中所述对象是人。
59.权利要求39的方法，其中所述免疫应答是保护性免疫应答。
60.用于治疗对象中葡萄球菌感染的方法，其包括向患有、被怀疑患有或有风险发生葡萄球菌感染的对象提供有效量的分离的肽，所述肽包含在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸具有氨基酸替换的蛋白A变体。
61.权利要求60的方法，其中所述对象被诊断为持续性葡萄球菌感染。
62.权利要求60的方法，其中所述SpA变体在所述对象中引发结合蛋白A的抗体的产生。
63.权利要求62的方法，其中所述SpA变体与SEQ ID NO：2有至少80％同一性，并且在SEQ ID NO：2的第9和10位氨基酸具有氨基酸替换。
64.权利要求62的方法，其中所述SpA变体具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
65.权利要求62的方法，其中所述SpA变体与佐剂一起施用。
66.权利要求65的方法，其中所述SpA变体与佐剂偶联。
67.权利要求60的方法，其中所述SpA变体配制成可药用组合物。
68.权利要求60的方法，其还包括施用第二葡萄球菌抗原。
69.权利要求68的方法，其中所述第二葡萄球菌抗原与所述SpA变体同时施用。
70.权利要求69的方法，其中所述第二葡萄球菌抗原与所述SpA变体在同一组合物中施用。
71.权利要求69的方法，其中所述第二葡萄球菌抗原与所述SpA变体融合。
72.权利要求68的方法，其中所述第二葡萄球菌抗原是以下一种或更多种：Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB和SasF肽。
73.权利要求60的方法，其中所述葡萄球菌感染是金黄色葡萄球菌感染。
74.权利要求60的方法，其中所述肽经口、胃肠外、透皮、透粘膜、皮下、肌内或通过吸入施用。
75.权利要求60的方法，其还包括多于一次地向所述对象施用所述肽。
76.权利要求60的方法，其中所述对象是哺乳动物。
77.权利要求60的方法，其中所述对象是人。
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