BRPI0710210A2 - composição imunogênica, vacina, métodos para preparar a vacina, e para prevenir ou tratar infecção estafilocócica, uso da composição imunogênica, e, processo para conjugar oligassacarìdeo ou polissacarìdeo capsular - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, VACINA, METODOS PARA PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OU TRATAR INYECçAO ESTAFILOCóCICA, USO DA COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, E, PROCESSO PARA CONJUGAR OLIGOSSACARIDEO OU POLISSACARIDEO CAPSULAR A presente invenção refere-se às composições imunogênicas compreendendo oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de S. aureus possuindo entre 30 e 100% de 0-acetilação. Vacinas, métodos de tratamento usando [sie] e processos para preparar uma composição imunogênica compreendendo polissacarídeos capsulares de Tipos 5 e/ou 8 com 30-100% de 0-acetilação também são descritos.

Description

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, MÉTODOS PARAPREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OU TRATAR INFECÇÃOESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,PROCESSO PARA CONJUGAR OLIGOS S ACARÍDEO OUPOLISSACARÍDEO CAPSULAR"
Campo técnico
A presente invenção refere-se ao campo das vacinas ecomposições imunogênicas, à sua manufatura e ao uso de tais composiçõesem medicina. Mais particularmente, refere-se às composições de vacinacompreendendo polissacarídeos de tipos 5 e/ou 8 de S. aureus nos quais ograu de O-acetilação está entre 30 elOO%. Também são proporcionadosmétodos para o tratamento ou a prevenção de infecções estafilocócicas usandotais vacinas.
Fundamentos
O número de infecções tanto adquiridas em comunidadequanto adquiridas em hospitais tem aumentado no decorrer dos anos recentescom o uso aumentado de dispositivos intravasculares. Infecções adquiridasem hospitais (nosocomiais) são uma causa maior de morbidez e demortalidade, mais particularmente nos E.U.A., onde elas afetam mais do que2 milhões de pacientes anualmente. Após vários estudos, cerca de 6 por centodos pacientes dos E.U.A. adquirirão uma infecção durante sua estadia emhospital.
O encargo econômico nos E.U.A. foi estimado em mais de 4,5bilhões de dólares americanos em 1992 (Emori e Gaynes, 1993, Clin.Microbiol. Rev. 6; 428). As infecções mais freqüentes são infecções do tratourinário (UTI-33% das infecções), seguidas por pneumonia (15,5%),infecções de sítio cirúrgico (14,8%) e infecções de corrente sangüíneaprimária (13%) Emori e Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).
Staphylococcus aureus, estafilococos negativos para coagulase(em sua maior parte Staphylocoeeus epidermidis), enteroeoeeus spp,Esherichia coli e Pseudomonas aeruginosa são os patógenos nosocomiaismaiores. Embora aqueles patógenos causem quase o mesmo número deinfecções, a severidade dos distúrbios que podem produzir combinada com afreqüência de isolados resistentes a antibióticos balança esta classificação nadireção de S. aureus e S. epidermidis como sendo os patógenos nosocomiaismais significativos.
Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecçõesnosocomiais com uma morbidez e uma mortalidade significativas (Romero-Vivas et al. 1995, Infect. Dis. 21; 1417). É a causa de alguns casos deosteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos e síndrome dechoque tóxico.
S. epidermidis é o comensal de pele normal que também é umpatógeno oportunista importante responsável por infecções de dispositivosmédicos implantados e infecções em sítios de cirurgia. Dispositivos médicosinfectados por S. epidermidis incluem marca-passos cardíacos, derivações defluido cerebroespinal, cateteres de diálise peritoneal ambulatorial contínua,dispositivos ortopédicos e válvulas cardíacas prostéticas.
Infecções de S. aureus e S. epidermidis são tratadas comantibióticos, com penicilina sendo a droga de escolha enquanto quevancomicina é usada para isolados resistentes à meticilina. A percentagem decepas estafilocócicas exibindo resistência de amplo espectro aos antibióticostem se tornado crescentemente prevalente desde os anos 1980's (Panlilo et al.1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), colocando sob ameaça aterapia antimicrobiana efetiva. Em adição, a emergência recente de cepa de S.aureus resistente à vancomicina tem causado medo de que cepas de S. aureusresistentes à meticilina emergirão e se disseminarão para as quais não estádisponível terapia efetiva.
Uma abordagem alternativa de uso de anticorpos contraantígenos estafilocócicos em imunoterapia passiva tem sido investigada.Terapia envolvendo a administração de anti-soros policlonais está sobdesenvolvimento (WO 00/15238, WO 00/12132) bem como o tratamento comum anticorpo monoclonal contra ácido lipoteicóico (WO 98/57994).
Uma abordagem alternativa seria o uso de vacinação ativa paragerar uma resposta imune contra estafilococos. Vários candidatos parainclusão como componentes de vacina têm sido identificados. Estes incluemproteína ligante de Fibronectina (US5840846), análogo de MHC II(US5648240), proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), GehD (US2002/0169288), proteína ligante de colágeno (US6288214), SdrF, SdrG eSdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA e SEB mutantes (WO 00/02523) eproteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852).
O genoma de S. aureus tem sido seqüenciado e muitas dasseqüências codificadoras têm sido identificadas (EP786519, W002/094868).O mesmo é verdade para S. epidermidis (WO 01/34809). Como umrefinamento desta abordagem, outros têm identificado proteínas que sãoreconhecidas por soros hiper-imunes de pacientes que têm sofrido de infecçãoestafilocócica (WOOl/98499, WO 02/059148).
A primeira geração de vacinas contra S. aureus ou contra asexoproteínas que ela produz têm alcançado sucesso limitado (Lee 1996Trends Microbiol. 4; 162). Ainda permanece uma necessidade para odesenvolvimento de vacinas efetivas contra infecções estafilocócicas.
Descrição das figuras
Figura 1 - Seqüências de polipeptídeo de proteínas parainclusão em uma composição imunogênica. Tabela 1 proporciona informaçãosobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.
Figura 2 - Seqüências de nucleotídeos codificadoras deproteínas para inclusão em uma composição imunogênica. Tabela 1proporciona informação sobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.
Figura 3 - Purificação de alfa-toxina sob condições nativas.Painel A mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de amostraspreparadas durante a purificação de alfa-toxina. Pista 1 - marcadores de pesomolecular, pista 2 - fração solúvel contendo alfa-toxila sobre-expressada,pista 3 - fluxo através da coluna de Ni-NTA, pista 4 - frações eluídas comtampão B 10%, pista 5 - frações eluídas com tampão B 20%, pista 6 - fraçõeseluídas com tampão B 30%, pista 7 - frações eluídas com tampão B 50%,pista 8 - frações eluídas com tampão B 75%, pista 9 e 10 frações eluídas comtampão B 100%, pista 11 bactérias em T=O antes da indução, pista 12 -bactérias em T=4 horas após a indução, pista 13 - lisado de célula, pista 14 -fração solúvel, pista 15 - fração insolúvel. Painel B mostra uma SDS-PAGEcorada com coommassie de 10, 5, 2 e 1 μΐ^ da alfa-toxina purificada.
Figura 4 - Purificação de SdrC sob condições desnaturantes.Painel A mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de amostraspreparadas durante a purificação de alfa-toxina. Pista M - marcadores de pesomolecular, pista Início - sobrenadante formado da fração insolúvel contendoSdrC sobre-expressado, pista FTl- fluxo através da coluna de Ni-NTA, pistaC - frações eluídas com tampão de lavagem C, pista D - frações eluídas comtampão D, pista E - frações eluídas com tampão E. Painel B mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de 1, 2, 5 e 10 μΙ, de SdrC purificado.
Figura 5 - Resultados de ELISA para anti-soros contraproteínas estafilocócicas em placas revestidas com proteínas purificadas.Resultado de combinação camundongos pré - usando soros combinadosextraídos de camundongos pré-inoculação. Resultado de combinaçãocamundongos pós III - usando soros de camundongo combinados extraídospós-imunização. Resultado de combinação coelho pré - usando soroscombinados extraídos de coelhos pré-inoculação. Resultado de combinaçãocoelho pós III usando soros de coelho combinados extraídos pós-imunização.
Figura 6 - Resultados de ELISA para anti-soros decamundongo produzidos contra proteínas estafilocócicas em placas revestidascom estafilococos mortos.
Painel A usa placas revestidas com células inteiras mortas desorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células inteirasmortas de sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com célulasinteiras mortas de S. epidermidis.
A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado deELISA usando anti-soros de camundongos imunizados três vezes com aproteína estafilocócica indicada. A linha marcada com sinais de diamantemostra o resultado de ELISA para soros de camundongo pré-imunes.
Figura 7 - Resultados de ELISA para anti-soros de coelhoproduzidos contra proteínas estafilocócicas em placas revestidas comestafilococos mortos.
Painel A usa placas revestidas com células inteiras mortas desorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células inteirasmortas de sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com célulasinteiras mortas de S. epidermidis.
A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado deELISA usando anti-soros de coelhos imunizados três vezes com a proteínaestafilocócica indicada (exceto para HarA onde apenas uma imunização foidada). A linha marcada com sinais de diamante mostra o resultado de ELISApara soros de coelho pré-imunes.
Descrição detalhada
A presente invenção descreve composições imunogênicas quecompreendem Polissacarídeos de S. aureus de Tipos 5 e/ou 8 nos quais ooligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 e/ou de Tipo 8 está entre30% e 100% O-acetilado. Em modalidades particulares, a composiçãoimunogênica da invenção adicionalmente compreende proteína(s)estafilocócica(s) ou PNAG. PNAG está elevadamente conservada dentrebactérias Gram-positivas e proporciona proteção contra uma ampla variedadede bactérias enquanto que polissacarídeos de Tipos 5 e 8 são imunógenospotentes que geram uma resposta imune contra a maioria das cepas de S.aureus que é a causa mais comum de infecção nosocomial.
Polissacarídeos
As composições imunogênicas da invenção compreendempolissacarídeos dos tipos 5 e 8 e PNAG de S. aureus qualquer um dos quaisou ambos os quais estão entre 30% e 100% O-acetilados.
Poli-glicosamina N-acetilada (PNAG)
PNAG é uma adesina intercelular de polissacarídeo e écomposta de um polímero de glicosamina β-(1—>6)-ligada, opcionalmentesubstituída com constituintes N-acetila e/ou O-succinila. Este polissacarídeoestá presente em ambas S. aureus e S. epidermidis e pode ser isolado dequalquer fonte (Joyce et al. 2003, Carbohydrate Research 338; 903; MairaLitran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por exemplo, PNAG pode serisolada de cepa MN8m de S. aureus (WO 04/43407). A preparação dedPNAG é descrita em WO 04/43405.
Foi recentemente mostrado que o polissacarídeo previamenteconhecido como poli-N-succinil-P-(l-^6)-glicosamina (PNSG) não possui aestrutura esperada porque a identificação da N-succinilação foi incorreta(Maira-Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Portanto o polissacarídeoformalmente conhecido como PNSG e agora verificado em ser PNAGtambém é incluído pelo termo PNAG.
PNAG pode ser de tamanhos diferentes variando de mais de400kDa a entre 75 e 400kDa a entre 10 e 75kDa para oligossacarídeoscompostos de até 30 unidades repetidas (de glicosamina β-(1—>6)-ligada,opcionalmente substituída com constituintes N-acetila e O-succinila).
Qualquer tamanho de oligossacarídeo ou polissacarídeo de PNAG pode serusado em uma composição imunogênica da invenção, por exemplo umtamanho de acima de 40kDa pode ser usado. O ajuste do tamanho pode serrealizado por qualquer método conhecido na arte, por exemplo pormicrofluidização, irradiação ultra-sônica ou por clivagem química (WO03/53462, EP497524, EP497525).
Faixas de tamanho de PNAG são por exemplo 40-400kDa, 50-35OkDa, 40-300kDa, 60-300kDa, 50-250kDa e 60-200kDa.
PNAG pode possuir grau de acetilação diferente devido àsubstituição nos grupos amino por acetato. PNAG produzida in vitro estáquase totalmente substituída nos grupos amino (95-100%).
Alternativamente, pode ser usada uma PNAG acetiladapossuindo menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% de N-acetilação.Uso de uma PNAG acetilada permite morte opsônica de bactérias Gram-positivas, opcionalmente S. aureus e/ou S. epidermidis (WO 04/43405). Emuma modalidade, a PNAG possui um tamanho entre 40kDa e 3 OOkDa e édesacetilada de modo que menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5%dos grupos amino estejam N-acetilados.
Em uma modalidade, a PNAG não está O-succinilada ou estáO-succinilada em menos do que 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 ou 0,1% de resíduos.
O termo PNAG desacetilada (dPNAG) refere-se a umoligossacarídeo ou polissacarídeo PNAG no qual menos do que 50%, 40%,30%, 20%, 10% or 5% dos grupos amino estão acetilados.
Como aqui usado, o termo PNAG inclui ambas as formasacetiladas e desacetiladas do sacarídeo.
Em uma modalidade, PNAG é desacetilada para formardPNAG, por tratamento químico do polissacarídeo nativo. Por exemplo, aPNAG nativa é tratada com uma solução básica de tal modo que o pH subapara acima de 10. Por exemplo a PNAG é tratada com NaOH, KOH ouNH4OH 0,1-5M, 0,2-4M, 0,33M, 0,5-2M, 0,75-l,5M ou 1M. Tratamento épor pelo menos 10 ou 30 minutos, ou 1,2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20 horas em umatemperatura de 20-100, 25-80, 30-60 or 30-50 ou 35-45°C. dPNAG pode serpreparada como descrito em WO 04/43405.
Em uma modalidade, o(s) polissacarídeo(s) incluído(s) nacomposição imunogênica da invenção é (são) conjugado(s) em uma proteínacarreadora como descrito abaixo ou alternativamente não é (são)conjugado(s).
Polissacarídeos de Tipo 5 e de Tipo 8 de S. aureus
A maioria das cepas de S. aureus que causa infecção emhomem contém polissacarídeos quer de Tipo 5 quer de Tipo 8.
Aproximadamente 60% de cepas de humano são de Tipo 8 eaproximadamente 30% são de Tipo 5. As estruturas de antígenospolissacarídeo capsular de Tipo 5 e de Tipo 8 são descritas em Moreau et al.Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) e Fournier et al. Infect. Immun. 45; 87(1984). Ambas possuem FucNVAcp em sua unidade repetida bem comoManNAcA que pode ser usado para introduzir um grupo sulfidrila.
Recentemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106(2005)) espectroscopia em NMR revisou as estruturas dos polissacarídeoscapsulares para:
Tipo 5
—>4)-p-D-ManNAcA-(1 ->4)-a-L-FucNAc(30Ac)-(1 ->3)-p-D-FucNAc-(1Tipo 8
—>3)-p-D-ManNAcA(40Ac)-(1 -»3)-a-L-FucNAc(1 ->3)-a-D-FucNAc(1 -»·
Polissacarídeos podem ser extraídos da cepa apropriada de S.aureus usando métodos bem conhecidos pelo homem experiente, por exemplocomo descrito em US6294177 ou Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367.Por exemplo, ATCC 12902 uma cepa de S. aureus de Tipo 5 e ATCC 12605 éuma cepa de S. aureus de Tipo 8.
Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamentepodem ser de tamanho ajustado, por exemplo por microfluidização, irradiaçãoultra-sônica ou por tratamento químico. A invenção também cobre osoligossacarídeos derivados de polissacarídeos de tipos 5 e 8 de S. aureus.
Os oligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares de tipos 5e/ou 8 incluídos na composição imunogênica da invenção estão O-acetilados.
Em uma modalidade, o grau de O-acetilação do oligossacarídeo oupolissacarídeo capsular de tipo 5 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%,50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90%ou 80-90%. Em uma modalidade, o grau de O-acetilação do oligossacarídeoou polissacarídeo capsular de tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%. 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%,70-90% ou 80-90%. Em uma modalidade, o grau de O-acetilação dosoligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares de tipo 5 e de tipo 8 é ΙΟ-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%.
O grau de O-acetilação do oligossacarídeo ou polissacarídeopode ser determinado por qualquer método conhecido na arte, por exemplo,por NMR de próton (Lemercinier e Jones 1996, Carbohydrate Resarch 296;83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical Analysis30; 1233-1247, WO 05/033148 ou WO 00/56357). Um outro métodocomumente usado é aquele descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180;249-261.
Grupos O-acetila podem ser removidos por hidrólise, porexemplo pelo tratamento com uma base tal como hidrazina anidra (Konadu etal. 1994; Infect. Immun. 62; 5048-5054) ou tratamento com NaOH 0,1 N por1-8 horas. Com o propósito de manter níveis altos de O-acetilação nooligossacarídeo ou polissacarídeo de tipos 5 e/ou 8, tratamentos que levariamà hidrólise dos grupos O-acetila são minimizados. Por exemplo tratamento emextremos de pH são minimizados.
Os polissacarídeos de tipos 5 e 8 incluídos na composiçãoimunogênica da invenção estão normalmente conjugados em uma proteínacarreadora como descrito abaixo ou alternativamente estão não-conjugados.
As composições imunogênicas da invenção alternativamentecontêm polissacarídeo quer de tipo 5 quer de tipo 8.
Antígeno 336 de S. aureus
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende o antígeno 336 de S. aureus descrito em US6294177.
O antígeno 336 compreende hexosamina β-ligada, não contémgrupos O-acetila e especificamente se liga em anticorpos para S. aureus Tipo336 depositado sob ATCC 55804.
Em uma modalidade, o antígeno 336 é um polissacarídeo que éde tamanho nativo ou alternativamente pode ser dimensionado, por exemplopor microfluidização, irradiação ultra-sônica ou por tratamento químico. Ainvenção também cobre oligossacarídeos derivados do antígeno 336.
O antígeno 336, onde incluído na composição imunogênica dainvenção opcionalmente está conjugado em uma proteína carreadora comodescrito abaixo ou alternativamente está não-conjugado.
PoIissacarideos de Tipos I, II e III de S. epidermidis
Cepas ATCC-31432, SE-360 e SE-IO de S. epidermidis sãocaracterísticas de três tipos capsulares diferentes I, II e III respectivamente(Ichiman e Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Polissacarídeoscapsulares extraídos de cada sorotipo de S. epidermidis constituem ospolissacarídeos de Tipos I, II e III. Polissacarídeos podem ser extraídos porvários métodos incluindo o método descrito em US4197290 ou como descritoem Ichiman et al. 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176.
Em uma modalidade da invenção, a composição imunogênicacompreende oligossacarídeos ou polissacarídeos de tipos I e/ou II e/ou III deS. epidermidis.
Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamentepodem ser de tamanho ajustado, por exemplo por microfluidização, irradiaçãoultra-sônica ou clivagem química. A invenção também cobre osoligossacarídeos extraídos de cepas de S. epidermidis.
Estes polissacarídeos estão não-conjugados ou sãoopcionalmente conjugados como descrito abaixo.
Conjugação de polissacarídeos
Dentre os problemas associados com o uso de polissacarídeosem vacinação, está o fato de que os polissacarídeos per se são imunógenosinsatisfatórios. Estratégias, que tem sido planejadas para suplantar esta faltade imunogenicidade, incluem a ligação do polissacarídeo em carreadoresprotéicos grandes, que proporcionam auxílio de célula-T espectadora.Exemplos de carreadores que podem ser usados para copulação emimunógenos polissacarídeo ou oligossacarídeo incluem os toxóides de Difteriae Tétano (DT, DT Crm 197 e TT), Hemocianina de Lapa Buraco de Fechadura(KLH), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) e o derivado deproteína purificado de Tuberculina (PPD), proteína D de Haemophilusinfluenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer um dos acima.Fragmentos adequados para uso incluem fragmentos incluindo epitopos decélula T-auxiliadora. Em particular framento de proteína D opcionalmenteconterá o 1/3 N-terminal da proteína. Proteína D é uma proteína ligante deIgD de Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 BI).
Uma proteína carreadora alternativa para uso na composiçãoimunogênica da invenção é uma proteína estafilocócica única ou seufragmento ou uma proteína de fusão compreendendo pelo menos ouexatamente 1, 2, 3 ou 4 ou mais das proteínas estafilocócicas ou seusfragmentos listados na sessão abaixo.
Uma proteína carreadora nova que seria particularmentevantajosa para uso no contexto de uma vacina estafilocócica é o alfa-toxóideestafilocócico. A forma nativa pode estar conjugada em um polissacarídeoporque o processo de conjugação reduz a toxicidade. Opcionalmente umaalfa-toxina geneticamente destoxificada tal como as variantes His35Leu ouHis35Arg são usadas como carreadoras porque a toxicidade residual é maisbaixa. Alternativamente a alfa-toxina é quimicamente destoxificada pelotratamento com um agente reticulante, formaldeído ou glutaraldeído. Umaalfa-toxina geneticamente destoxificada é opcionalmente quimicamentedestoxificada, opcionalmente pelo tratamento com um agente reticulante,formaldeído ou glutaraldeído para reduzir mais a toxicidade.
Os polissacarídeos podem ser ligados na(s) proteína(s)carreadora(s) por método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S.4.372.945 de Armor et al., Patente U.S. 4.474.757, WO e Jennings et al.,Patente U.S. 4.356.170). Opcionalmente, química de conjugação de CDAP érealizada (veja W095/08348).
Em CDAP, o reagente de cianilação tetrafluoro-borato de 1-ciano-dimetil-amino-piridínio (CDAP) é opcionalmente usado para a síntesede conjugados de polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode serconduzida sob condições relativamente brandas, que evita a hidrólise dospolissacarídeos alcalinamente sensíveis. Esta síntese permite a copulaçãodireta em uma proteína carreadora.
O polissacarídeo pode ser solubilizado em água ou umasolução salina. CDAP pode ser dissolvido em acetonitrila e adicionadoimediatamente na solução de polissacarídeo. O CDAP reage com os gruposhidroxila do polissacarídeo para formar um éster de cianato. Após a etapa deativação, a proteína carreadora é adicionada. Grupos amino de lisina reagemcom o polissacarídeo ativado para formar uma ligação covalente de isouréia.
Após a reação de copulação, um excesso grande de glicina é então adicionadopara extinguir os grupos funcionais ativados residuais. O produto é entãopassado através de uma coluna de permeação em gel para remover a proteínacarreadora não reagida e os reagentes residuais.Proteínas
A composição imunogênica da invenção opcionalmenteadicionalmente compreende uma proteína estafilocócica, por exemplo umaproteína de S. aurens ou de S. epidermidis. Algumas modalidades da invençãocontêm proteínas de ambas S. aureus e S. epidermidis.
Composições imunogênicas da invenção compreendem umaproteína isolada que compreende uma seqüência de aminoácidos que possuipelo menos 85% de identidade, opcionalmente pelo menos 90% deidentidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97-99% ou identidadeexata, em relação àquela de qualquer seqüência da figura 1.
Onde uma proteína é especificamente aqui mencionada, éopcionalmente uma referência a uma proteína de comprimento total, nativa ourecombinante, ou opcionalmente uma proteína madura na qual qualquerseqüência de sinal tem sido removida. A proteína pode ser isolada diretamenteda cepa estafilocócica ou produzida por técnicas de DNA recombinante.Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composiçãoimunogênica da invenção. Estes são fragmentos compreendendo pelo menos10 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos,pelo menos 40 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos ou pelo menos 100aminoácidos, tomados contiguamente da seqüência de aminoácidos daproteína. Em adição, tais fragmentos imunogênicos são tipicamenteimunogenicamente reativos com anticorpos gerados contra as proteínasestafilocócicas ou com anticorpos gerados pela infecção de um hospedeiromamífero com estafilococos ou contem epitopos de célula-T. Em umamodalidade, fragmentos imunógenos também incluem fragmentos que quandoadministrados em uma dose efetiva, (quer sozinhos quer como um haptenoligado em um carreador), geram uma resposta imune protetora contra infecçãoestafilocócica, opcionalmente é protetor contra infecção de S. aureus e/ou S.epidermidis. Um tal fragmento imunógeno pode incluir, por exemplo, aproteína faltante de uma seqüência líder N-terminal, e/ou um domínio detransmembrana e/ou um domínio de âncora C-terminal. Em uma modalidade,o fragmento imunógeno de acordo com a invenção compreendesubstancialmente todo o domínio extracelular de uma proteína que possuipelo menos 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade, em relação àquelade uma seqüência selecionada de Figura 1 sobre o comprimento inteiro daseqüência de fragmento.
Em uma modalidade, composições imunogênicas da invençãopodem conter proteínas de fusão de proteínas estafilocócicas, ou fragmentosde proteínas estafilocócicas. Tais proteínas de fusão podem ser preparadasrecombinantemente e podem compreender uma porção de pelo menos 2, 3, 4,5 ou 6 proteínas estafilocócicas, por exemplo as combinações de proteínasestafilocócicas listadas abaixo. Alternativamente, uma proteína de fusão podecompreender uma multitude de porções de pelo menos 2, 3, 4 ou 5 proteínasestafilocócicas. Estas podem combinar proteínas estafilocócicas diferentes ouseus fragmentos na mesma proteína. Alternativamente, a invenção tambéminclui proteínas de fusão individuais de proteínas estafilocócicas ou seusfragmentos, como uma proteína de fusão com seqüências heterólogas taiscomo um proporcionador de epitopos de célula-T ou marcadores depurificação, por exemplo: β-galactosidase, glutatione-S-transferase, proteínasfluorescentes verdes (GFP), marcadores de epitopo tais como FLAG,marcador myc, poli-histidina, ou proteínas de superfície viral tal comohemaglutinina de vírus da gripe, ou proteínas bacterianas tais como toxóidedo tétano, toxóide da difteria, CRMl97. A proteína de fusão pode estarpresente na composição imunogênica da invenção como uma proteína livreou pode ser uma proteína carreadora ligada em um sacarídeo.
Proteínas
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãoadicionalmente compreende uma ou mais das proteínas mencionadas abaixoou seus fragmentos imunógenos. Muitas das proteínas caem dentro decategorias de proteínas ligantes de componente extracelular, proteínastransportadoras ou toxinas e reguladores de virulência. A composiçãoimunogênica da invenção opcionalmente adicionalmente compreende umaproteína ligante de componente extracelular estafilocepa estafilocócica ouuma proteína transportadora estafilocepa estafilocócica ou uma toxinaestafilocepa estafilocócica ou um regulador de virulência estafilocepaestafilocócica. A composição imunogênica da invenção opcionalmentecompreende pelo menos ou exatamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínasestafilocócicas.
Tabela 1
A seguinte tabela exibe números de SEQ das seqüências deproteína e seqüências de DNA que são encontradas em Figura 1 e Figura 2respectivamente. SA indica uma seqüência de S. aureus e SE indica umaseqüência de S. epidermidis.
<table>table see original document page 16</column></row><table><table>table see original document page 17</column></row><table>
Proteínas ligantes de componente extracelular
Proteínas ligantes de componente extracelular são proteínasque se ligam em componentes extracelulares de hospedeiro. O termo inclui,mas não é limitado às adesinas.
Exemplos de proteínas ligantes de componente extracelularincluem receptor de laminina (Naidu et al. J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177),proteína ligante de saliva/SitC/MntC (US5 801234, Wiltshire e Foster Infec.Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al. Infect. Immun. 2002, 70;6805), EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS) (Park et al. 1999, J. Biol.Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33;2347), SBI (Zhang et al. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211),autolisina (Rupp et al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), CTfA ( US6008341,McDevitt et al. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al.Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al. Microbiology 2000,146; 1535), Lipase GehD (US2002/0169288), SasA (Roche et al.Microbiology 2003, 149 ; 643), SasC (Roche et al. Microbiology 2003, 149 ;643), SasK (Roche et al. Microbiology 2003, 149 ; 643), FnbA (Flock et al.Mol Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth etal. 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína ligante de colágeno Cna (Visei et al.2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), SdrD (WO99/27109), SdrE (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al. 1988 J. GenMicrobiol. 134; 75), Npase (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA(Lonenz et al. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Langet al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain eHermann symposium on Staph Denmark 1417th 2000), SSP-I (Veenstra et al.1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178;537), proteína ligante de heparina de 17 kDa HBP (Fallgren et al. 2001, J.Med. Microbiol. 50; 547), proteína ligante de Vitronectina (Li et al. 2001,Curr. Microbiol. 42; 361), proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig(WO 97/48727) e MAP (US5648240)
Proteína ligante de saliva/SitC/MntC
Esta é uma proteína transportadora ABC que é um homólogode adesina PsaA em S. pneumoniae. E uma lipoproteína elevadamenteimunogênica de 32kDa que está distribuída em toda a parede celularbacteriana (Cockayne et al. Infect. Immun. 1998 66; 3767). É expressada emS. aureus e S. epidermidis como uma lipoproteína de 32kDa e umhomólogo de 40kDa está presente em S. hominis. Em S. epidermidis, é umcomponente de um operon regulado por ferro. Mostra homologia considerávelcom ambas adesinas incluindo FimA de Streptococcus parasanguis,e com lipoproteínas de uma família de transportadores ABC com funções detransporte de ferro metálico putativo ou provado. Portanto SitC estáincluída como uma proteína ligante extracelular e como um transportador deíon ferro.A proteína ligante de saliva descrita em US5.801.234 tambémé uma forma de SitC e pode ser incluída em uma composição imunogênica dainvenção.
CTfA e ClfB
Ambas estas proteínas possuem atividade de ligação defibrinogênio e acionam S. aureus para formar agrupamentos na presença deplasma. Contêm um motivo LPXTG comum às proteínas associadas à parede.
CTfA é descrita em US6008341 e ClfB é descrita em WO99/27109.
Coagulase (FbpA)
Esta é uma proteína ligante de fibrinogênio que aciona S.aureus para formar agrupamentos na presença de plasma. É descrita emreferências relacionadas com Coagulase : Phonimdaeng et al. (J. Gen.Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393-404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) e Shopsin et al. (J.CLin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456). Em uma modalidade, fragmentospara inclusão na composição imunogênica da invenção incluem a proteínamadura na qual o peptídeo de sinal tem sido removido (aminoácidos 27 àterminação-C).
Coagulase possui três domínios distintos. Aminoácidos 59-297que são uma região de espiral enrolada, aminoácidos 326-505 que são umaregião rica em prolina e glicina, e o domínio C-terminal do aminoácido 506 a645 que possui uma conformação de folha beta. Cada um destes domínios éum fragmento que pode ser incorporada na composição imunogênica dainvenção.
SdrG
Esta proteína é descrita em WO 00/12689. SdrG é encontradaem estafilococos negativos para coagulase e é um proteína associada à paredecelular contendo uma seqüência LPXTG.SdrG contém um peptídeo de sinal (aminoácidos 1-51), umaregião contendo sítios de ligação de fibrinogênio e sítios de ligação decolágeno (aminoácidos 51 -825), dois domínios CnaB (aminoácidos 627-698 e738-809), uma região de repetição de SD (aminoácidos 825-1000) e umdomínio de âncora (aminoácidos 1009-1056).
Em uma modalidade fragmentos de SdrG incluempolipeptídeos nos quais o peptídeo de sinal e/ou as repetições de SD e odomínio de âncora têm sido removidos. Estes incluem polipeptídeoscompreendendo ou consistindo de aminoácidos 50-825, aminoácidos 50-633,aminoácidos 50-597 (SEQ ID NO 2 de WO 03/76470), aminoácidos 273-597(SEQ ID NO 4 de WO 03/76470), aminoácidos 273-577 (SEQ ID NO 6 deWO 03/76470) aminoácidos 1-549, aminoácidos 219-549, aminoácidos225-549, aminoácidos 219-528, aminoácidos 225-528 of SEQ ID NO: 70 ou20 ou 21.
Opcionalmente, um polipeptídeo SdrG possuindo umaseqüência pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%homóloga à seqüência de SEQ ID NO: 70, 20 ou 21 é incorporado nacomposição imunogênica da invenção.
As composições da invenção opcionalmente compreendem umfragmento dos polipeptídeos SdrG descritos acima.
Em uma modalidade fragmentos possuem o peptídeo de sinale/ou o domínio de repetição de SD e/ou o domínio de âncora deletados. Porexemplo seqüências correspondendo aos aminoácidos 1713, 1-549, 225-549,225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36-689 de SEQ ID 70 ou seqüênciaspossuindo 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade emrelação à SEQ ID 70 ou 20 ou 21.
Em uma modalidade, fragmentos com o peptídeo de sinaldeletado possuem um resíduo de metionina na terminação-N do fragmentopara garantir tradução correta.
Em uma modalidade, o fragmento possui a seguinte seqüência:
MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVXNNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE
LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKKVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVI KAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDS FTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTD YVD KYENIKAHLKLTS YIDKS KVPNNNT KLDVE YKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGST
IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDD YAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYD PNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVL VTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY
VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDE
EbhA e EbhB
EbhA e EbhB são proteínas que são expressadas em ambas S.aureus e S. epidermidis (Clarke e Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680,Williams et al. Infect. Immun. 2002, 20; 6805) e que se ligam emfibronectina. Visto que fibronectina é um componente importante de matrixextracelular, EbhA e EbhB possuem uma função importante em aderência deestafilococos em matriz extracelular de hospedeiro.
As proteínas Ebh são grandes, possuindo um peso molecularde 1,1 megadaltons. É vantajoso o uso de um fragmento da proteína Ebh emvez de a seqüência completa devido à facilidade de produção e de formulação.A região central da proteína contém repetições imperfeitas que contêm sítiosde ligação de fibronectina. Fragmentos contendo um ou mais dos domíniosrepetidos descritos abaixo são alguns fragmentos adequados paraincorporação na composição imunogênica da invenção.
Proteínas Ebh contêm unidades de repetição imperfeitas de127 aminoácidos em comprimento que são caracterizadas por conterem aseqüência de consenso:
L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A
ou.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...Μ..L.{33}Α.{12}
OU
.....I/ν..Α. . .τ/ν..AK.ALN/DG..NL.-AK..Α.{6}L..LN.AQK. .L. .QI/V. .Α. .V..
V.{6}Α..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S-NY/F.N/DAD..Κ..AY/F..AV..Α..I/V.N
/D.......
Onde 7 significa qualquer aminoácido e '.{10}' significaquaisquer 10 aminoácidos e LV indica escolhas alternativas de aminoácido.
Por referência à seqüência descrita em Kuroda et al. (2001)Lancet 357; 1225-1240, e Tabela 2, as seqüências repetidas dentro deproteínas Ebh são prontamente deduzidas.
Em uma modalidade, fragmentos a serem incluídos nacomposição imunogênica da invenção incluem proteínas contendo de uma,duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 dasunidades repetidas de 127 aminoácidos. Tais fragmentos podem consistir de1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais repetições da região repetida de 127aminoácidos e podem consistir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maisrepetições com resíduos de aminoácido adicionais presentes em qualquer umadas ou em ambas as extremidades do fragmento. Opcionalmente o fragmentoé o polipeptídeo H2 de cerca de 44kDa abarcando três repetições(aminoácidos 3202-3595) como descrito em Clarke et al. Infection andImmunity 70, 66806687, 2002. Tais fragmentos opcionalmente serão capazesde se ligarem em fibronectina e/ou de produzirem anticorpos que são reativoscontra a proteína Ebh inteira.
As proteínas Ebh são capazes de se ligarem em fibronectina.Em uma modalidade, fragmentos destas seqüências de polipeptídeos retêm acapacidade para se ligarem em fibronectina. Ligação em fibronectina pode seravaliada por ELISA como descrito por Clarke et al. (Infection and Immunity70; 6680-6687 2002).
Em uma modalidade, o fragmento é um que compreende umepitopo de célula-T auxiliadora ou célula-B, por exemplo aquelesfragmentos/peptídeos descritos em Tabelas 3 e 4.
TABELA 2 Seqüências de repetição da seqüência decomprimento total de Ebh.
A seqüência de comprimento total de Ebh é descrita emKuroda et al. (2001) Lancet 357; 12251240. A seguinte tabela mostra osresíduos de aminoácido nos quais repetições de 127 aminoácidos começam eterminam dentro da seqüência de comprimento total.
<table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table>
Tabela 3 Predição de epitopo de célula-B para uma repetiçãode 127 aminoácidos:
A seqüência de comprimento total é descrita em Kuroda et al.(2001) Lancet 357; 1225-1240. Uma destas repetições, codificada pelosaminoácidos 3204-3331 da seqüência de comprimento total foi escolhida pararealizar a predição de epitopo:
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQN VHAVN DIKQTTQSLNTAMTGLKRGVAN H NQ WQSDN WN ADTNKKND YN N A YNHANDIINGNAQHPVI
<table>table see original document page 24</column></row><table>
- As colunas "Início" e "Término" apresentam a posição dosepitopos de célula-B preditos na repetição de 127 aminoácidos.
- As colunas "Iniciação" e "Terminação" apresentam a posiçãodos epitopos de célula-B preditos na seqüência de comprimento total de Ebh
Tabela 4 Predição de epitopo de célula-T auxiliadora em Ebh:
A seqüência de comprimento total é descrita no bando dedados TrEMBL5 referência de seqüência Q8NWQ6. Uma destas repetições,codificada pele,
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQ,foi escolhida pi SAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQWQSDNYVNADTNKKNDYNIS
NHANDIINGNAQHPVI
<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table>
- A coluna "Posição na repetição" apresenta a posição dosepitopos de célula-T preditos na repetição
- A coluna "Posição na seqüência" apresenta a posição dosepitopos de célula-T preditos na seqüência de comprimento total de EbhFragmentos das proteínas da invenção podem serempregados para produzir o polipeptídeo de comprimento totalcorrespondente por síntese de peptídeo; portanto, estes fragmentospodem ser empregados como intermediários para produzir as proteínas decomprimento total da invenção.
Em uma modalidade, são usadas variantes nas quais vários, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácidos são substituídos, deletados, ou adicionadosem qualquer combinação.
Proteína ligante de elastina (EbpS)
EbpS é uma proteína contendo 486 aminoácidos com um pesomolecular de 83kDa. Está associada com a membrana citoplasmática de S.aureus e possui três regiões hidrofóbicas que mantêm a proteína na membrana(Downer et al. 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park et al. 1996, J. Biol. Chem.271; 15803).
Duas regiões entre aminoácidos 1-205 e 343-486 estãoexpostas na superfície sobre a face externa da membrana citoplásmica. Odomínio de ligação de ligante de EbpS está localizado entre os resíduos 14-34na terminação-N (Park et al. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).
Em uma modalidade, o fragmento a ser incorporado nacomposição imunogênica da invenção é o fragmento exposto na superfíciecontendo a região de ligação de elastina (aminoácidos 1-205). Opcionalmenteos fragmentos não contêm a alça exposta inteira mas devem conter a região deligação de elastina (aminoácidos 14-34). Um fragmento alternativo quepoderia ser usado consiste de aminoácidos formando a segunda alça expostana superfície (aminoácidos 343-486). Fragmentos alternativos contendo até 1,2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menos em uma ou ambas as extremidadestambém são possíveis.
Receptores de laminina
O receptor de laminina de S. aureus desempenha um papelimportante em patogenicidade. Uma feição característica da infecção éinvasão de corrente sangüínea que permite formação de abscesso metastáticodisseminada. Invasão de corrente sangüínea requer a capacidade paraextravasar através da membrana basal vascular. Isto é realizado através daligação em laminina por intermédio do receptor de laminina (Lopes et al.Science 1985, 229; 275).
Receptores de laminina estão expostos em superfície e estãopresentes em muitas cepas de estafilococos incluindo S. aureus e S.epidermidis.
SBI
Sbi é uma segunda proteína ligante de IgG em adição àproteína A e é expressada na maioria das cepas de S. aureus (Zhang et al.1998, Microbiology 144; 985).A terminação-N da seqüência de Sbi possui uma seqüência desinal típica com um sítio de clivagem após aminoácido 29. Portanto umfragmento de Sbi que poderia ser usado em uma composição imunogênica dainvenção inicia no resíduo de aminoácido 30, 31, 32 ou 33 e continua até aterminação-C de Sbi, por exemplo de SEQ ID NO: 26.
O domínio ligante de IgG de Sbi tem sido identificado comouma região na direção de terminação-N da proteína dos aminoácidos 41-92.Este domínio é homólogo aos domínios ligantes de IgG de proteína A.
O domínio ligante de IgG mínimo de Sbi contém a seguinteseqüência:
QTTQNN YVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK** *** * *** * * * * *
* - denota aminoácidos que são similares entre os domíniosligantes de IgG
Em uma modalidade, um fragmento de Sbi a ser incluído nacomposição imunogênica da invenção contém um domínio ligante de IgG.Este fragmento contém a seqüência de consenso para um domínio ligante deIgG como designado por * como mostrado na seqüência acima.Opcionalmente o fragmento contém ou consiste da seqüência completamostrada acima. Opcionalmente, o fragmento contém ou consiste deaminoácidos 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33-146, 30-150, 33-150, 30-160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 ou 33-210 de Sbi, porexemplo de SEQ ID NO:26.
Um fragmento pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10substituições de aminoácido das seqüências indicadas.
Um fragmento pode conter repetições múltiplas (2, 3, 4, 5, 6,7,8, 9 ou 10) do domínio ligante de IgG.
EFB - FIB
Fib é uma proteína ligante de fibrinogênio de 19kDa que ésecretada para dentro do meio extracelular por S. aureus. E produzida portodos os isolados de S. aureus testados (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin.Microbiol. 33; 2347).
S. aureus agrupa-se na presença de fibrinogênio e liga-se emsuperfícies revestidas com fibrinogênio. Esta capacidade facilita acolonização estafilocepa estafilocócica de cateteres e células endoteliais.
Fib contém uma seqüência de sinal na terminação-N daproteína com um sítio de clivagem putativo a cerca do aminoácido 30. Emuma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende ouconsiste da seqüência da proteína madura (de cerca de aminoácido 30 até aterminação-C da proteína).
Fbe - EfB/FIG
Fbe é uma proteína ligante de fibrinogênio que é encontradaem muitos isolados de S. epidermidis e possui um peso molecular deduzido de119 kDa (Nilsson et ai. 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Sua seqüência estárelacionada com aquela do fator de agrupamento de S. aureus (CTfA).Anticorpos contra Fbe podem bloquear a ligação de S. epidermidis em placasrevestidas com fibrinogênio e em cateteres (Pei e Flock 2001, J. Infect. Dis.184; 52).
Fbe possui uma seqüência de sinal putativa com um sítio declivagem entre aminoácidos 51 e 52. Portanto um fragmento potencial de Fbecontém a forma madura de Fbe se estendendo do aminoácido 52 até aterminação-C (aminoácido 1.092).
O domínio de Fbe do aminoácido 52 até o aminoácido 825 éresponsável pela ligação de fibrinogênio. Em uma modalidade, o fragmentode Fbe consiste de ou contém aminoácidos 52825.
A região entre aminoácido 373 e 516 de Fbe mostra aconservação maior entre Fbe e CTfA. Em uma modalidade, o fragmentocontém aminoácidos 373-516 de Fbe.Aminoácidos 825 - 1041 de Fbe contêm uma regiãoelevadamente repetitiva composta de resíduos de ácido aspártico e de serinaserialmente repetidos.
IsaA/PisA
IsaA é uma proteína de 29kDa, também conhecida como PisAque, como tem sido mostrado, é uma proteína estafilocócica imunodominantedurante sepsia em pacientes hospitalizados (Lorenz et al. 2000, FEMSImmunol. Med. Microb. 29; 145).
Os primeiros 29 aminoácidos da seqüência de IsaA sãoconsiderados como sendo uma seqüência de sinal. Em uma modalidade, ofragmento de IsaA a ser incluído em uma composição imunogênica dainvenção contém resíduos de aminoácido 30 em diante, até o final daseqüência codificada.
Proteína ligante de fibronectina
Proteína A ligante de fibronectina contém vários domínios queestão envolvidos em ligação de fibronectina (WO 94/18327). Estes sãochamados de Dl, D2, D3 e D4. Em uma modalidade fragmentos de proteínaA ou B ligante de fibronectina compreendem ou consistem de Dl, D2, D3,D4, D1-D2, D2-D3, D3-D4, D1-D3, D2-D4 ou D1-D4.
Proteína ligante de fibronectina contém uma seqüência de sinalde 36 aminoácidos. Por exemplo:
VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA
Opcionalmente, a proteína madura omitindo esta seqüência desinal é incluída na composição imunogênica da invenção.
Proteínas transportadoras
A parede celular de bactérias Gram-positivas atua como umabarreira prevenindo a difusão livre de metabólitos para dentro da bactéria.Uma família proteínas orquestra a passagem de nutrientes essenciais paradentro da bactéria e são portanto essenciais para a viabilidade da bactéria. Otermo proteína transportadora cobre proteínas envolvidas na etapa inicial deligação em metabólitos tal como ferro bem como aquelas envolvida emtransporte real do metabólito para dentro da bactéria.
Ferro molecular é um co-fator essencial para crescimentobacteriano. São secretados sideróforos que se ligam em ferro livre e então sãocapturados por receptores de superfície bacteriana que liberam ferro paratransporte através da membrana citoplásmica. Aquisição de ferro é críticapara o estabelecimento de infecções humanas de modo que a geração de umaresposta imune contra esta classe de proteínas leva a uma perda de viabilidadeestafilocepa estafilocócica.
Exemplos de proteínas transportadoras incluem transportadorImunodominante ABC (Burnie et ai. 2000 Infect. Immun. 68; 3200), IsdA(Mazmanian et al. 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian et al. 2002 PNAS99; 2293), IsdC (WO 06/59247), transportador de Mg2+, SitC (Wiltshire eFoster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) e transportador Ni ABC.
Transportador Imunodominante ABC
Transportador Imunodominante ABC é uma proteína bemconservada que pode ser capaz de gerar uma resposta imune que é protetoracruzada contra diferentes cepas estafilocócicas (Mei et al. 1997, Mol.Microbiol. 26; 399). Anticorpos contra esta proteína têm sido encontrados empacientes com septicemia (Burnie et al. 2000, Infect. Immun. 68; 3200).
Fragmentos opcionais de transportador imunodominante ABCincluirão os peptídeos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS,VDWLR, RGFL, KIKVYVGNYDFWYQS, TV1WSHDRHFLYNNV e/ouTETFLRGFLGRMLFS porque estas seqüências contêm epitopos que sãoreconhecidos pelo sistema imune humano.
IsdA-IsdB
Os genes isd (determinante de superfície regulado por ferro) deS. aureus codificam proteínas responsáveis pela ligação de hemoglobina epassagem de ferro de hemoglobina para o citoplasma, onde atua como umnutriente essencial. IsdA e IsdB estão localizadas na parede celular deestafilococos . IsdA parece estar exposta sobre a superfície de bactéria porqueé suscetível à digestão por proteinase K. IsdB foi parcialmente digeridasugerindo que está parcialmente exposta sobre a superfície da bactéria(Mazmanian et al. 2003 Science 299; 906).
IsdA e IsdB são ambas proteínas de 29kDa que se ligam emhemoglobina. Sua expressão é regulada pela disponibilidade de ferro via orepressor Fur. Sua expressão será alta durante infecção em um hospedeiroonde a concentração de ferro será baixa.
Também são conhecidas como FrpA e FrpB (Morrissey et al.2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA e FrpB são as proteínas de superfíciemaiores com uma carga alta. Tem sido mostrado que proporcionam umacontribuição maior para adesão em plástico.
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende um fragmento de IsdA e/ou IsdB que é descrito em WO01/98499 ou WO 03/11899.
Toxinas e reguladores de virulência
Membros desta família de proteínas incluem toxina tais comoalfa-toxina, hemolisina, enterotoxina B e TSST-I bem como as proteínas queregulam a produção de toxinas tal como RAP.
Alfa-toxina (HIa)
Alfa-toxina é um determinante de virulência importanteproduzido pela maioria das cepas de S. aureus. É uma toxina formadora deporo com atividade hemolítica. Tem sido mostrado que anticorpos contra alfa-toxina neutralizam os efeitos prejudiciais e letais de alfa-toxina em modelosanimais (Adiam et al. 1977 Infect. Immun. 17; 250). Plaquetas, célulasendoteliais e células mononucleares de humano são suscetíveis aos efeitos dealfa-toxina.A toxicidade alta de alfa-toxina requer que ela deve serdestoxificada antes de ser usada como um imunógeno. Isto pode ser realizadopor tratamento químico, por exemplo por tratamento com formaldeído,glutaraldeído de outros reagentes reticulantes ou por conjugação química delaem polissacarídeos bacterianos como descrito abaixo.
Uma outra maneira de remover a toxicidade é introduzir mutaçõespontuais que removem a toxicidade ao mesmo tempo retendo a antigenicidade datoxina. A introdução de uma mutação pontual em aminoácido 35 de alfa-toxinaonde um resíduo de histidina é substituído por um resíduo de leucina resulta naremoção de toxicidade simultaneamente restando a imunogenicidade (Menzies eKernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). Histidina 35 parece ser crítica paraoligomerização apropriada requerida para formação de poro e mutação desteresíduo leva à perda de toxicidade.
Quando incorporada em composições imunogênicas dainvenção, alfa-toxina é opcionalmente destoxificada por mutação de His 35,por exemplo por substituição de His 35 por Leu ou Arg. Em uma modalidadealternativa, alfa-toxina é destoxificada por conjugação em outroscomponentes da composição imunogênica, por exemplo polissacarídeoscapsulares ou PNAG, opcionalmente em polissacarídeo de tipo 5 de S. aureustype e/ou PNAG e/ou polissacarídeo de tipo 8 de S. aureus.
Proteína ativadora de RNAIII (RAP)
RAP em si mesma não é uma toxina, mas é uma reguladora daexpressão de fatores de virulência. RAP é produzida e secretada porestafilococos. Ativa o sistema regulatório agr de outros estafilococos e ativa aexpressão e a subseqüente liberação de fatores de virulência tais comohemolisina, enterotoxina B e TSST-1.
Outras proteínas imunodominantes
Proteína associada à acumulação (Aap)
Aap é uma proteína de 140kDa que é essencial para aacumulação de cepas de S. epidermidis sobre superfícies (Hussain et al.Infect. Immun. 1997, 65; 519). Cepas expressando esta proteína produziramquantidades significativamente maiores de biofilme e Aap parece estarenvolvida em formação de biofilme. Anticorpos contra Aap são capazes deinibir a formação de biofilme e de inibir a acumulação de S. epidermidis.
Antígeno secretório estafilocepa estafilocócica SsaA
SsaA é uma proteína fortemente imunogênica de 3 OkDaencontrada em ambas S. aureus e S. epidermidis (Lang et al. 2000 FEMSImmunol. Med. Microbiol. 29; 213). Sua expressão durante endocarditesugeriu um papel de virulência específico para as patogêneses da doençainfecciosa.
SsaA contém uma seqüência líder N-terminal e um sítio declivagem por peptídade se sinal. O peptídeo líder é seguido por uma regiãohidrofílica de aproximadamente 100 aminoácidos do resíduo 30 até o resíduo130.
Um fragmento opcional de SsaA a ser inserido na composiçãoimunogênica da invenção é composto da proteína madura (aminoácidos 27 atéterminação-C ou aminoácidos 30 até terminação-C).
Um outro fragmento opcional contém a área hidrofílica deSsaA desde o aminoácido 30 até o aminoácido 130.
Combinações
Infecções estafilocócicas progridem através de vários estágiosdiferentes. Por exemplo, o ciclo de vida estafilocepa estafilocócica envolvecolonização comensal, iniciação de infecção pelo acesso aos tecidosconjuntivos ou à corrente sangüínea, multiplicação anaeróbica no sangue,interação entre determinantes de virulência de S. aureus e os mecanismos dedefesa do hospedeiro e indução de complicações incluindo endocardite,formação de abscesso metastático e síndrome de sepsia. Moléculas diferentessobre a superfície da bactéria estarão envolvidas em diferentes etapas do ciclode infecção. Pela seleção da resposta imune contra uma combinação deantígenos particulares envolvidos em processos diferentes de infecçãoestafilocócica, múltiplos aspectos de função estafilocepa estafilocócica sãoafetados e isto pode resultar em boa eficácia de vacina.
Em particular, combinações de certos antígenos de classesdiferentes, alguns dos quais estão envolvidos em adesão em célulashospedeiras, alguns dos quais estão envolvidos em aquisição de ferro ououtras funções de transporte, alguns dos quais são toxinas ou reguladores devirulência e antígenos imunodominantes podem produzir uma resposta imuneque protege contra os múltiplos estágios de infecção.
Algumas combinações de antígenos são particularmenteefetivas em indução de uma resposta imune. Esta pode ser medida porqualquer um dos ensaios de modelo animal como descrito nos exemplos e/ouusando um ensaio opsonofagocítico como descrito nos exemplos. Sem odesejo de estar ligado à teoria, considera-se que tais combinações efetivas deantígenos são permitidas por numerosas características da resposta imune àcombinação de antígenos. Os próprios antígenos são normalmente expostossobre a superfície de células estafilocócicas, tendem a ser conservados mastambém tendem a não estarem presentes em quantidade suficiente sobre asuperfície celular para uma resposta bactericida ótima ocorrer usandoanticorpos produzidos contra o antígeno único. Combinação dos antígenos dainvenção pode resultar na formulação produzindo uma combinação vantajosade anticorpos que interagem com a célula estafilocepa estafilocócica além deum limite crítico. Neste nível crítico, anticorpos suficientes de qualidadesuficiente se ligam na superfície da bactéria para permitirem quer extermínioeficiente por complemento quer neutralização da bactéria. Isto pode sermedido quer em modelo de desafio animal quer em um ensaio de opsonizaçãocomo descrito nos exemplos.
Composições imunogênicas da invenção preferidascompreendem uma pluralidade de proteínas selecionadas de pelo menos duascategorias diferentes de proteína, possuindo funções diferentes dentro deestafilococos. Exemplos de tais categorias de proteínas são proteínas ligantesextracelulares, proteínas transportadoras tais como proteínas de aquisição deFe, toxinas ou reguladores de virulência e outras proteínas imunodominantes.
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica dainvenção adicionalmente compreende um número de proteínas igual a oumaior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 selecionadas de 2, 3 ou 4 grupos diferentesselecionados de:
• Grupo a) proteínas ligantes de componente extracelular;
• Grupo b) proteínas transportadoras;
• Grupo c) toxinas ou reguladores de virulência
• Grupo d) proteínas estruturais.
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica dainvenção adicionalmente compreende um número de proteínas igual a oumaior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 selecionadas de 2, 3 ou 4 dos seguintes grupos:
• grupo a) - pelo menos uma proteína ligante de componenteextracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada dogrupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante desaliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB(FIB), SBI, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF5 lipase GehD, SasA,SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA,SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteínaligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;
grupo b) - pelo menos uma proteína transportadoraestafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo consistindode transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, transportador deMg2+, HarA, SitC e transportador Ni ABC;
• grupo c) - pelo menos um regulador de virulênciaestafilocepa estafilocócica, toxina ou seu fragmento selecionado do grupoconsistindo de alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina, proteínaativadora de RNA III (RAP);
• grupo d) - pelo menos uma proteína estrutural estafilocepaestafilocócica ou seu fragmento imunogênico selecionada do grupoconsistindo de MRPII e autolisina.
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica dainvenção compreende um número de proteínas igual a ou maior do que 2, 3,4, 5 ou 6 selecionadas de 2 ou 3 dos seguintes grupos:
• grupo a) - pelo menos uma proteína ligante de componenteextracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento imunogênicoselecionada do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante desaliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, LipaseGehD, SasA,, SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA,Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante deVitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;
• grupo b) - pelo menos uma proteína transportadoraestafilocepa estafilocócica ou seu fragmento imunogênico selecionada dogrupo consistindo de transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC,HarA, transportador de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC;
• grupo c) - pelo menos um regulador de virulênciaestafilocepa estafilocócica, toxina ou seu fragmento imunogênico selecionadodo grupo consistindo de alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina,proteína ativadora de RNA III (RAP).
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica dainvenção contém pelo menos uma proteína selecionada de grupo a) e umaproteína adicional selecionada de grupo b) e/ou grupo c).
Em uma outra modalidade, a composição imunogênica dainvenção contém pelo menos um antígeno selecionado de grupo b) e umaproteína adicional selecionada de grupo c) e/ou grupo a).
Em uma outra modalidade, a composição imunogênica dainvenção contém pelo menos um antígeno selecionado de grupo c) e umaproteína adicional selecionada de grupo a) e/ou grupo b).
Uma combinação opcional de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende receptor de laminina e 1, 2, 3, 4 ou 5outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SitC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende EbhA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende EbhB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende EbpS e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB5 IsdA, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende EFB(FIB) e 1, 2, 3, 4 ou 5 outrosantígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SBI e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende autolisina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outrosantígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende CTfA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SdrC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SdrD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SdrE e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SdrG e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC. HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina e RAP.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SdrH e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SasF e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende Lipase GehD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outrosantígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SasF e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende FnbA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende FnbB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende Cna e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende ClfB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende FbpA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende Npase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC5 HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende IsaA/PisA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outrosantígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SsaA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende EPB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB5 IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SSP-I e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SSP-2 e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende HPB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende proteína ligante de Vitronectina e 1, 2,3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA5 IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende proteína ligante de fibrinogênio e 1, 2,3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende coagulase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outrosantígenos selecionados do grupo consistindo de transportadorimunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC,transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende Fig e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende MAP e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg , SitC, transportador Ni ABC,alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende transportador imunodominante ABC e1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de receptorde laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteínaligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD,SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, ClfB,FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-I, SSP-2, HBP, proteína ligante deVitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende IsdA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante desaliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrC, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, LipaseGehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, C1FB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA,EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligantede fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L dealfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende IsdB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante desaliva/SitC/MntC, EbhA5 EbhB5 proteína ligante de Elastina (EbpS)5 EFB(FIB)5 SBI5 autolisina, CTfA, SdrC5 SdrG5 SdrH5 SasF5 Lipase GehD5 SasA5FnbA5 FnbB5 Cna5 CTfA5 ClfB5 FbpA5 Npase5 IsaA/PisA, SsaA5 EPB5 SSP-I5SSP-2, HBP5 proteína ligante de Vitronectina5 proteína ligante defibrinogênio, coagulase, Fig5 MAP5 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L dealfa-toxina, RAP5 Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende SitC e I5 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, Proteína ligantede saliva/SitC/MntC, EbhA5 EbhB5 proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB(FIB)5 SBI5 autolisina, CTfA5 SdrC5 SdrD5 SdrE, SdrG, SdrH, SasF, LipaseGehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, ClfB, FbpA5 Npase5 IsaA/PisA, SsaA5EPB5 SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligantede fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L dealfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende alfa-toxina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outrosantígenos selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteínaligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA5 SdrC5 SdrD5 SdrE5 SdrG5 SdrH5SasF5 Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB5 FbpA5 Npase5 IsaA/PisA,SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteínaligante de fibrinogênio, coagulase, Fig5 MAP5 transportador imunodominanteABC5 IsdA5 IsdB5 IsdC5 HarA5 transportador de Mg2+, SitC, transportador NiABC, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende variante H35L ou H35R dealfa-toxinae 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo dereceptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB3proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC,SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase GehD, SasA5 FribA, FnbB, Cna, ClfB,FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante deVitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP,transportador imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportadorde Mg2+, SitC, transportador Ni ABC, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composiçãoimunogênica da invenção compreende RAP e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenosselecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante desaliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF5 LipaseGehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB,SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante defibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador imunodominante ABC,IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,Aap e SsaA.
Outras combinações de proteína na composição imunogênicada invenção compreendem IsdA e IsdB; IsdA e CTfA; IsdA e ClfB; IsdA eSdrC; IsdA e SdrD; IsdA e SdrE; IsdA e SdrG; IsdA e SasF;IsdB e CTfA;IsdB e ClfB; IsdB e SdrC; IsdB e SdrD; IsdB e SdrE; IsdB e SdrG; IsdB eSasF; CTfA e ClfB; CTfA e SdrC; CTfA e SdrD; CTfA e SdrE; CTfA e SasF;ClfB e SdrC; ClfB e SdrD; ClfB e SdrE; ClfB e SasF; SdrC e SdrD; SdrC eSdrE; SdrC e SasF; SdrD e SdrE; SdrD e SasF; SdrE e SasF.
Nas combinações acima e abaixo, as proteínas especificadaspodem estar opcionalmente presentes na composição imunogênica dainvenção como um fragmento ou uma proteína de fusão como descrito acima.
Combinações de três proteínas
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãoadicionalmente compreende três componentes de proteína em umacombinação de alfa-toxina, uma proteína ligante de componente extracelular(por exemplo uma adesina) e uma proteína transportadora (por exemplo umaproteína ligante de ferro).
Em uma tal combinação, a alfa-toxina pode ser quimicamentedestoxificada ou geneticamente destoxificada por introdução de mutação(ões)pontual(ais), por exemplo a mutação pontual de His35Leu. A alfa-toxina estápresente como uma proteína livre ou alternativamente está conjugada em umcomponente polissacarídeo ou PNAG da composição imunogênica.
Exemplos de combinações incluem:
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupoconsistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,CTfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB,FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante deVitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdB e uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupoconsistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-I, SSP-2, HBP,proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e uma adesina selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina,EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), CTfA, SdrC,SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, autolisina, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase,SSP-1, SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante defibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdB e uma adesina selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina,EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), autolisina,CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase,SSP-1, SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante defibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e receptor de laminina.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e EbhA.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e EbhB.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e EbpS.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e EFB (FIB).
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e SdrG.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e CTfA.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e ClfB.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e FnbA.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e coagulase.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e Fig.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e SdrH.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e SdrC.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e SdrD.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e SdrE.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,IsdA e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Sbi.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdB.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdA.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e SdrC.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Ebh ouseu fragmento como descrito acima.
Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e SdrC.
Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e Ebh ouseu fragmento como descrito acima.
Uma composição imunogênica da invenção compreendendoIsaA, Sbi ou SdrC.
Seleção de antígenos expressados em linhagens clonaisdiferentes
Análise da ocorrência de fatores de virulência em relação coma estrutura de população de Staphylococcus aureus mostrou presença variávelde genes de virulência em populações naturais de S. aureus.
Dentre os isolados clínicos de Staphylococcus aureus, foimostrado que pelo menos cinco linhagens clonais são elevadamenteprevalentes (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(l):345-52). Foi mostradoque alfa-hemolisina (hla), proteína A ligante de fibronectina (fiibA) e fator Aagrupante (clfA) estão presentes na maioria dos isolados de identidade delinhagem, sugerindo um papel importante destas proteínas na sobrevivênciade S. aureus (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(l):345-52). Além disso, deacordo com Peacock et al. 2002 pareceu que as distribuições de fnbA, ctfA,coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-toxina), alfa-toxina e ica não estão relacionadas com a estrutura clonalsubjacente sugerindo transferência horizontal considerável destes genes.
Em contrário, outros genes de virulência tal como proteína Bligante de fibronectina (fnbB), beta-hemolisina (hlb), proteína ligante decolágeno (cna), TSST-I (tst) e gene de resistência a meticilina (mecA) estãofortemente associados com linhagens específicas (Booth et al., 2001 Infect.Immun. 69(l):345-52). Similarmente, Peacock et al. 2002 (Infect. Immun.70(9):4987-96) mostraram que as distribuições das enterotoxinas, tst, dasexfolatinas (eta e etb), beta- e delta-toxinas, dos genes sdr (sdrD, sdrE e bbp),cna, ebpS e efb dentro da população estão todas elevadamentesignificativamente relacionadas com complexos clonais derivados de MLST.
Dados de NILST não proporcionam evidência de que cepasresponsáveis por doença nosocomial representam uma subpopulação distintadas cepas causadoras de doença adquirida em comunidade ou cepasrecuperadas de veículos assintomáticos (Feil et al., 2003 J Bacteriol.185(11):3307-16).
Em uma modalidade, composições imunogênicas da invençãosão efetivas contra estafilococos de linhagens clonais diferentes.
Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende1, 2, 3, 4, ou pelo menos 1 proteína que é expressada na maioria dos isoladosde estafilococos. Exemplos de tais proteínas incluem alfa-hemolisina (hla),proteína A ligante de fibronectina (fiibA) e fator A agrupante (ctfA),coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-toxina), ica, transportador imunodominante ABC, RAP, autolisina (Rupp etal. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA,SPOIIIE (), SsaA, EbpS, SasF (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643),EFB(FIB), SBI, ClfB5 IsdA, IsdB, FnbB, Npase, EBP, proteína II ligante sialode Osso, IsaB/PisB (Lorenz et al. FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29;145), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Rocheet al. 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology149; 643), precursor aureolisina (AUR)/Seppl e autolisina nova.
Em uma modalidade alternativa, 2 ou mais proteínas que sãoexpressadas em conjuntos diferentes de cepas clonais são incluídas nacomposição imunogênica da invenção. Opcionalmente a combinação deantígenos permitirá que seja gerada uma resposta imune que é efetiva contramúltiplas cepas clonais, ou contra todas as cepas clonais. Por exemplocombinações incluem FnbB e beta-hemolisina, FnbB e Cna, FnbB e TSST-1,FnbB e mecA, FnbB e SdrD, FnbB e SdrF5 FnbB e EbpS, FnbB e Efb, beta-hemolisina e Cna, beta-hemolisina e TSST-I5 beta-hemolisina e mecA, beta-hemolisina e SdrD, beta-hemolisina e SdrF, beta-hemolisina e EbpS, beta-hemolisina e Efb, Cna e TSST-1, Cna e mecA, Cna e SdrD, Cna e SdrF, Cnae EbpS, Cna e Efb, TSST-I e mecA, TSST-I e SdrD, TSST-I e SdrF, TSST-Ie EbpS, TssT-I e Efb, MecA e SdrD, MecA e SdrF, MecA e EbpS, MecA eEfb, SdrD e SdrF, SdrD e EbpS, SdeD e Efb, SdrF e EbpS, SdrF e Efb, e,EbpS e Efb.
As combinações descritas acima podem ser combinadas comcomponentes adicionais descritos acima.
Proteção contra S. aureus e S. epidermidis
Em uma modalidade da invenção a composição imunogênicaproporciona uma resposta imune efetiva contra mais do que uma cepa deestafilococos, por exemplo contra cepas de ambas S. aureus e S. epidermidis.Por exemplo, uma resposta imune protetora é gerada contra sorotipos de tipos5 e 8 de S. aureus.
Um uso da composição imunogênica da invenção é prevenirinfecções nosocomiais, por exemplo em pacientes eletivos para cirurgia, porinoculação antes do tratamento hospitalar. Neste estágio, é difícil predizeracuradamente a quais cepas estafilocócicas o paciente será exposto. Portanto évantajosa a inoculação com uma vacina que é capaz de gerar uma respostaimune efetiva contra várias cepas de estafilococos.
Uma resposta imune efetiva é definida como uma respostaimune que dá proteção significativa em um modelo de desafio decamundongo ou ensaio de opsonofagocitose como descrito nos exemplos.Proteção significativa em um modelo de desafio de camundongo, -porexemplo aquele do exemplo 5, é definida como um aumento na LD50 emcomparação com os camundongos inoculados com veículo de pelo menos10%, 20%, 50%, 100% ou 200%. Proteção significativa em um modelo dedesafio de rato de algodão, por exemplo aquele de exemplo 8, é definidacomo um decréscimo de LogCFU/nariz médio observado de pelo menos 10%,20%, 50%, 70% ou 90%. E sabido que a presença de anticorpos deopsonização está correlacionada com a proteção, portanto proteçãosignificativa é indicada por um decréscimo na contagem bacteriana de pelomenos 10%, 20%, 50%, 70% ou 90% em um ensaio de opsonofagocitose, porexemplo aquele de exemplo 7.
Várias das proteínas incluindo transportador imunodominanteABC, proteína ativadora de RNA III, receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA,SsaA, EbhA/EbhB, EbpS e Aap estão bem conservadas entre S. aureus e S.epidermidis e exemplo 8 mostra que IsaA, CTfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA eSbi podem gerar resposta imune reativa cruzada (por exemplo reativa cruzadaentre pelo menos uma cepa de S. aureus e pelo menos uma cepa de S.epidermidis). PIA também está bem conservada entre S. aureus e S.epidermidis.
Portanto em uma modalidade, a composição imunogênica dainvenção compreenderá PNAG e polissacarídeos dos tipos 5 e 8 e uma, duas,três ou quatro das proteínas acima.
Vacinas
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãoé misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável, e opcionalmentecom um adjuvante para formar uma vacina.
As vacinas da presente invenção podem ser adjuvantadas,particularmente quando intencionadas para uso em uma população idosa mastambém para emprego em populações infantis. Adjuvantes adequadosincluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfatode alumínio ou alume, mas também podem ser outros sais de metal tais comoaqueles de cálcio, de magnésio, de ferro ou de zinco, ou podem ser umasuspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, sacarídeoscatiônica ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.
E preferido que o adjuvante seja selecionado para ser umindutor preferencial de um tipo THl de resposta. Tais níveis altos de citocinasde tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas porcélula a um dado antígeno, enquanto que níveis altos de citocinas de tipo Th2tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.
A distinção de resposta imune dos tipos Thl e Th2 não éabsoluta. Em realidade um indivíduo suportará uma resposta imune que édescrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2.Contudo, muitas vezes é conveniente considerar as famílias de citocinas emtermos do que descrito em clones de célula CD4 +ve T murina por Mosmanne Coffman (Mosmann, T.R. e Coffinan, R.L. (1989) "THl e TH2 cells:different patterns of lymphokine secretion Iead to different fimctionalproperties" (Annual Review of Immunology, 7, pl45-173). Tradicionalmente,as respostas de tipo Thl estão associadas com a produção das citocinas INF-γe IL-2 por linfócitos-T. Outras citocinas muitas vezes diretamente associadascom a indução de respostas imunes de tipo Thl não são produzidas porcélulas-T, tal como IL-12. Em contraste, respostas de tipo Th2 estãoassociadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas adjuvantesadequados que promovem uma resposta predominantemente Thl incluem:Monofosforil-lipídeo A ou um seu derivado (ou lipídeo A destoxificado emgeral - veja por exemplo W02005107798), particularmente monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para sua preparação veja GB 2220211A); e uma combinação de monofosforil-lipídeo A, preferivelmentemonofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado, junto com quer um sal de alumínio(por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsãode óleo-em-água. Em tais combinações, antígeno e 3D-MPL estão contidosnas mesmas estruturas particuladas, permitindo liberação mais eficiente desinais antigênicos e imunoestimulatórios. Estudos têm mostrado que 3D-MPLé capaz de adicionalmente intensificar a imunogenicidade de um antígenoabsorvido em alume [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].
Um sistema intensificado envolve a combinação de ummonofosforil-lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente acombinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou umacomposição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol comodescrito em WO 96/33739. Uma formulação adjuvante particularmentepotente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água é descrita em WO 95/17210. Em uma modalidade a composiçãoimunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21.A formulação também pode compreender uma emulsão de óleo-em-água etocoferol (WO 95/17210). CpG não-metilado contendo oligonucleotídeos(WO 96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (W00226757e W003507822) também são indutores preferenciais de uma resposta THl esão adequados para uso na presente invenção.
Adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo desais de metal, emulsões de óleo-em-água, agonista de receptores semelhantesa Toll, (em particular agonista de receptor 2 semelhante a Toll, agonista dereceptor 3 semelhante a Toll, agonista de receptor 4 semelhante a Toll,agonista de receptor 7 semelhante a Toll, agonista de receptor 8 semelhante aToll e agonista de receptor 9 semelhante a Toll), saponinas ou suascombinações.
Um adjuvante que pode ser usado com as composições devacina da invenção são preparações de vesícula de membrana externa oubolha de cepas de bactérias Gram-negativas tais como aquelas ensinadas porW002/09746 - particularmente bolhas de N. meningitidis. Propriedadesadjuvantes de bolhas podem ser melhoradas pela retenção de LOS(lipooligossacarídeo) sobre sua superfície (e.g. através de extração comconcentrações baixas de detergente [por exemplo desoxicolato 0-0,1% d]).LOS pode ser destoxificado através de mutações msbB(-) ou htrB(-)discutidas em W002/09746. Propriedades adjuvantes também podem sermelhoradas pela retenção de PorB (e opcionalmente remoção de PorA) debolhas estafilocócicas. Propriedades adjuvantes também podem sermelhoradas por truncamento da estrutura de sacarídeo de núcleo externo deLOS sobre bolhas estafilocócicas - por exemplo via a mutação IgtB(-)discutida em W02004/014417. Alternativamente, o LOS acima mencionado(e.g. idolado de uma cepa msbB(-) e/ou IgtB(-)) pode ser purificado e usadocomo um adjuvante nas composições da invenção.
Um outro adjuvante que pode ser usado com as composiçõesda invenção pode ser selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou umseu derivado, um oligonucleotídeo imunoestimulatório, um alquil-glicosaminida-fosfato, uma emulsão de óleo-em-água ou suas combinações.Um outro adjuvante preferido é um sal de metal em combinação com outroadjuvante. E preferido que o adjuvante seja um agonista de receptorsemelhante a Toll em particular um agonista de um receptor 2, 3, 4, 7, 8 ou 9semelhante a Toll, ou uma saponina, em particular Qs21. É adicionalmentepreferido que o sistema adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes dalista acima. Em particular as combinações preferivelmente contêm umasaponina (em particular Qs21) adjuvante e/ou um agonista de receptor 9semelhante a Toll tal como um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendoCpG. Outras combinações preferidas compreendem uma saponina (emparticular QS21) e um agonista de receptor 4 semelhante a Toll tal comomonofosforil-lipídeo A ou seu derivado 3-desacilado, 3 D-MPL, ou umasaponina (em particular QS21) e um ligante de receptor 4 semelhante a Toll4tal como um alquil-glicosaminida-fosfato.
Adjuvantes particularmente preferidos são combinações de3D-MPL e QS21 (EP 0.671.948 BI), emulsões de óleo-em-águacompreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), ou 3D-MPL formulado com outros veículos (EP 0.689.454 BI). Outros sistemasadjuvantes preferidos compreendem uma combinação de 3 D MPL, QS21 eum oligonucleotídeo CpG como descrito em US6558670, US6544518.
Em uma modalidade o adjuvante é um ligante de receptor 4semelhante a Toll (TLR), preferivelmente um antagonista tal como umderivado de lipídeo A particularmente monofosforil-lipídeo A ou maisparticularmente monofosforil-lipídeo A 3-desacilado (3D-MPL).
3D-MPL está disponível na GlaxoSmithKline BiologicalsNorth America e primariamente promove respostas de células CD4+ T comum fenótipo de EFN-g (Thl). Pode ser produzido de acordo com os métodosdescritos em GB 2.220.211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil-lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nascomposições da presente invenção é usado 3D-MPL de partícula pequena.3D-MPL de partícula pequena possui um tamanho de partícula tal que podeser esterilmente filtrado através de um filtro de 0,22 μιη. Tais preparaçõesestão descritas em Pedido de Patente Internacional de No. WO 94/21292.Derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados em seremagonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitados a:
OMl 74 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoil-óxi-tetradecanoil-amino]-4-o-fosfono-P-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]-a-D-glicopiranosil-di-hidrogeno-fosfato), (WO-95/14026)
OM 294 DP (3S, 9 R) -3-[(R)-dodecanoil-óxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10-diol, 1,10-bis(di-hidrogeno-fosfato) (W099 /64301 e WO 00/0462 )
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-dodecanoil-óxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]-decan-l,10-diol, 1-di-hidrogeno-fosfato 10-(6amino-hexanoato) (WO 01/46127)
Outros ligantes TLR4 que podem ser usados são alquil-glicosaminida-fosfatos (AGPs) tais como aqueles descritos em W09850399ou US6303347 (processes para a preparação de AGPs também são descritos),ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como descrito em US6764840.Alguns AGPs são agonistas de TLR4, e alguns são antagonistas de TLR4.
Ambos são considerados como adjuvantes úteis.
Outro imunoestimulante preferido para uso na presenteinvenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponinaisolada da árvore sul-americana Quilaja Saponaria Molina e foi primeirodescrita como possuindo uma atividade adjuvante por Dalsgaard et al. Em1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44,Springer Verlag, Berlin, p243-254). Têm sido isolados por HPLC fragmentospurificados de Quil A que retêm atividade adjuvante sem a toxicidadeassociada com Quil A (EP 0.362.278), por exemplo QS7 e QS21 (tambémconhecidas como QA7 e QA21). QS-21 é uma saponina natural derivada dacasca de Quillaja saponaria Molina que induz as células-T citotóxicas CD8+(CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante e é umasaponina preferida no contexto da presente invenção.
Têm sido descritas formulações particulares de QS21 que sãoparticularmente preferidas, estas formulações compreendem um esterol(W096/33739). As saponinas formando parte da presente invenção podem serseparadas na forma de micelas, micelas mistas (preferencialmente, mas nãoexclusivamente com sais biliares) ou podem estar na forma de matrizes deISCOM (EP 0.109.942 BI), lipossomos ou estruturas coloidais relacionadastais como complexos multiméricos semelhantes a anel ou semelhantes averme ou estrutura em camadas/lipídicas e lamelas quando formuladas comcolesterol e lipídeo, ou em uma emulsão de óleo-em-água (por exemplo comoem WO 95/17210). As saponinas podem estar preferivelmente associadascom um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio(WO 98/15287).
Preferivelmente, a saponina é apresentada na forma de umlipossomo, ISCOM ou uma emulsão de óleo-em-água.
Um sistema intensificado envolve a combinação de ummonofosforil-lipídeo A (ou lipídeo A destoxificado) e um derivado desaponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como descritoem WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 estáextinta com colesterol como descrito em WO 96/33739. Uma formulação deadjuvante particularmente potente envolvendo tocoferol com ou sem QS21e/ou 3D-MPL em uma emulsão de óleo-em-água é descrita em WO 95/17210.Em uma modalidade a composição imunogênica compreende uma saponina,que pode ser QS21.
Oligonucleotídeos imunoestimulatórios ou qualquer outroagonista de receptor 9 semelhante a Toll (TLR) também podem ser usados.Os oligonucleotídeos preferidos para uso em adjuvantes ou vacinas dapresente invenção são oligonucleotídeos contendo CpG, preferivelmentecontendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelomenos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Ummotivo CpG é um nucleotídeo citosina seguido por um nucleotídeo guanidina.Os oligonucleotídeos CpG da presente invenção são tipicamentedesoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida o internucleotídeo nooligonucleotídeo é uma ligação fosforoditioato, ou mais preferivelmente umaligação fosforotioato, embora ligações fosfodiéster e outras ligações deinternucleotídeo estão dentro do escopo invenção. Também estão incluídosdentro do escopo da invenção os oligonucleotídeos com ligações deinternucleotídeo. Métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforotioato oufosforoditioato são descritos em US5.666.153, US5.278,302 e W095/26204.
Exemplos de oligonucleotídeos preferidos possuem asseguintes seqüências. As seqüências preferivelmente contêm ligações deinternucleotídeo modificadas com fosforotioato.
OLIGO 1(SEQ ID NO:l): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GACGGC ACC ACG
OLIGO 4 (SEQ ID N0:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (SEQ ID N0:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCCG (CpG 5456)Oligonucleotideos CpG alternativos podem compreender asseqüências preferidas acima pelo fato de que possuem adições ou deleçõesinconseqüentes nas mesmas.
Os oligonucleotídeos CpG utilizados na presente invençãopodem ser sintetizados por qualquer método conhecido na arte (por exemploveja EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem sersintetizados utilizando um sintetizador automático.
O adjuvante pode ser uma emulsão de óleo-em-água ou podecompreender uma emulsão de óleo-em-água em combinação com outrosadjuvantes. A fase oleosa do sistema de emulsão preferivelmente compreendeum óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bemconhecido na arte. Metabolizável pode ser definido como "sendo capaz de sertransformado por metabolismo" (Dorland1S Illustrated Medicai Dictionary,W.B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleovegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que é não tóxico para orecipiente e é capaz de ser transformado por metabolismo. Nozes, sementes, egrãos são fontes comuns de óleos vegetais. Oleos sintéticos também são partedesta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis tal comoNEOBEE® e outros. Esqualeno (2,6,10,15,19, 23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em grandesquantidades em óleo de fígado de tubarão, e em quantidades menores emazeite de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz, e levedura, e éum óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. Esqualeno é umóleo metabolizável em virtude do fato de que é um intermediário nabiossíntese de colesterol (Merck Index, 10a Edição, entrada no.8619).
Tocóis (e.g. vitamina E) também são muito usados emadjuvantes de emulsões de óleo (EP 0.382.271 BI; US5667784; WO95/17210). Tocóis utilizados em emulsões de óleo (preferivelmente emulsõesde óleo-em-água) da invenção podem ser formulados como descrito em EP0.382.271 BI, pelo fato de que tocóis podem ser dispersões de gotícuias detocol, opcionalmente compreendendo um emulsificador, de preferivelmentemenor do que 1 micrômetro em diâmetro. Alternativamente, os tocóis podemser usados em combinação com outro óleo, para formar a fase oleosa de umaemulsão de óleo. Exemplos de emulsões de óleo que podem ser usadas emcombinação com o tocol são aqui descritos, tais como os óleos metabolizáveisdescritos acima.
Tem sido sugerido que os adjuvantes de emulsão de óleo-em-água são por si úteis como composições adjuvantes (EP 0.399.843B), tambémcombinações de emulsões de óleo-em-água e outros agentes ativos têm sidodescritos como adjuvantes para vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO99/12565; WO 99/11241). Outros adjuvantes de emulsão de óleo têm sidodescritos, tais como emulsões de água-em-óleo (US 5.422.109; EP 0.480.982B2) e água em óleo em emulsões aquosas (US 5,424,067;EP 0 480 981 B).Todos os quais formam os sistemas preferidos de emulsão de óleo (emparticular quando incorporando tocóis) para formar adjuvantes e composiçõesda presente invenção.
Mais preferivelmente a emulsão de óleo (por exemploemulsões de óleo-em-água) adicionalmente compreende um emulsificador talcomo TWEEN 80 e/ou um esterol tal como colesterol.
Uma emulsão de óleo preferida (preferivelmente emulsão deóleo-em-água) compreende um óleo não-tóxico, metabolizável, tal comoesqualano, esqualeno ou um tocoferol tal como alfa-tocoferol (epreferivelmente ambos esqualeno e alfa-tocoferol) e opcionalmente umemulsificador (ou tensoativo) tal como Tween 80. Um esterol(preferivelmente colesterol) também pode ser incluído.
O método de produzir emulsões de óleo-em-água é bemconhecido pelo homem experiente na arte. Comumente, o métodocompreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensoativo talcomo uma solução de PB S/TWEEN8 0™, seguido por homogeneizaçãousando um homogeneizador, estaria claro para um homem experiente na arteque um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de umaagulha de seringa seria adequado para homogeneizar volumes pequenos delíquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidizador(máquina Ml 105 Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de2 minutos na pressão de entrada máxima de 600 kPa (pressão de saída decerca de 85.000 kPa)) poderia ser adaptado pelo homem experiente na artepara produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação poderiaser realizada por experimentação rotineira compreendendo a medição daemulsão resultante até que fosse obtida uma preparação com gotículas de óleodo diâmetro requerido em uma emulsão de óleo-em-água, o óleo e oemulsificador devem estar em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser,por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.
O tamanho das gotículas de óleo verificado dentro da emulsãode óleo-em-água estável é preferivelmente menor do que 1 micrômetro, podeestar dentro da faixa de substancialmente 30-600 nm, preferivelmentesubstancialmente ao redor de 30-500 nm em diâmetro, e mais preferivelmentesubstancialmente 150-500 nm em diâmetro, e em particular cerca de 150 nmem diâmetro conforme medido por espectroscopia de correlação de fóton.Com relação a isto, 80% em número das gotículas de óleo devem estar dentrodas faixas preferidas, mais preferivelmente mais do que 90% e muito maispreferivelmente mais do que 95% em número das gotículas de óleo estãodentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentespresentes nas emulsões de óleo da presente invenção estãoconvencionalmente dentro da faixa de 0,5-20% ou 2 a 10% de óleo (dovolume de dose total), tal como esqualeno; e quando presente, de 2 a 10% dealfa-tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensoativo, tal como monooleato depolioxietileno-sorbitana. Preferivelmente a razão de óleo (preferivelmenteesqualeno): tocol (preferivelmente α-tocoferol) é igual a ou menor do que 1porque esta proporciona uma emulsão mais estável. Um emulsificador, talcomo Tween80 ou Span 85 também pode estar presente em um nível de cercade 1%. Em alguns casos pode ser vantajoso que as vacinas da presenteinvenção adicionalmente contenham um estabilizador.
Exemplos de sistemas de emulsão preferidos são descritos emWO 95/17210, WO 99/11241 e WO 99/12565 que descrevem adjuvantes deemulsão baseados em esqualeno, α-tocoferol, e TWEEN 80, opcionalmenteformulados com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL. Assim em umamodalidade particularmente preferida da presente invenção, o adjuvante dainvenção pode adicionalmente compreender outros imunoestimulantes, taiscomo LPS ou seus derivados, e/ou saponinas. Exemplos de outrosimunoestimulantes são aqui descritos e em "Vaccine Design - The Subunitand Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6,Eds. Powell, M.F., e Newman, M.J., Plenum Press, New York e London,ISBN 0-306-44867-X.
Em um aspecto preferido o adjuvante e as composiçõesimunogênicas de acordo com a invenção compreendem uma saponina(preferivelmente QS21) e/ou um derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL)em uma emulsão de óleo descrita acima, opcionalmente com um esterol(preferivelmente colesterol). Adicionalmente a emulsão de óleo(preferivelmente a emulsão de óleo-em-água) pode conter span 85 e/oulecitina e/ou tricaprilina. Adjuvantes compreendendo uma emulsão de óleo-em-água, um esterol e uma saponina são descritos em WO 99/12565.
Tipicamente para administração humana a saponina(preferivelmente QS21) e/ou o derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL)estará presente em uma dose para humano da composição imunogênica dentroda faixa de ^g- 200μg, tal como 10-100μg, preferivelmente 10μg - 50μgpor dose. Tipicamente a emulsão de óleo (preferivelmente a emulsão de óleo-em-água) compreenderá de 2 a 10% de óleo metabolizável. Preferivelmentecompreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa-tocoferol e de 0,3a 3% (preferivelmente 0,4 - 2%) de emulsificador (preferivelmente tween 80[monooleato de polioxietileno-sorbitana]). Onde ambos esqualeno e alfa-tocoferol estão presentes, preferivelmente a razão de esqualeno: alfa-tocoferolé igual a ou menor do que 1 porque esta proporciona uma emulsão maisestável. Span 85 (trioleato de sorbitana) também pode estar presente em umnível de 0,5 a 1% nas emulsões usadas na invenção. Em alguns casos pode servantajoso que as composições imunogênicas e vacinas da presente invençãoadicionalmente conterão um estabilizador, por exemplo outrosemulsificadores/tensoativos, incluindo ácido caprílico (Merck Index 10Edition, entrada no. 1739), dos quais Tricaprilina é particularmente preferida.
Onde esqualeno e uma saponina (preferivelmente QS21) estãoincluídos, é também benéfica a inclusão de um esterol (preferivelmentecolesterol) na formulação porque isto permitirá uma redução no nível total deóleo na emulsão. Isto acarreta um custo reduzido de manufatura, melhoria doconforto total da vacinação, e também melhorias qualitativas e quantitativasdas respostas imunes resultantes, tal como produção de IFN-γ melhorada.Conseqüentemente, o sistema adjuvante da presente invenção tipicamentecompreende uma razão de óleo metabolizávehsaponina (p/p) dentro da faixade 200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma"baixa em óleo" cuja faixa preferida é de 1:1 a 200:1, preferivelmente 20:1 a100:1, e mais preferivelmente substancialmente 48:1, esta vacina retém aspropriedades adjuvantes benéficas de todos os componentes, com um perfil dereatogenicidade muito reduzida. Conseqüentemente, as modalidadesparticularmente preferidas possuem uma razão de esqualeno:QS21 (p/p)dentro da faixa de 1:1 a 250:1, também uma faixa preferida é 20:1 a 200:1,preferivelmente 20:1 a 100:1, e mais preferivelmente substancialmente 48:1.Preferivelmente um esterol (mais preferivelmente colesterol) também estáincluído em uma razão de saponina:esterol como aqui descrita.
Os sistemas de emulsão da presente invenção preferivelmentepossuem um tamanho de gotícula de óleo pequeno na faixa submicrométrica.Mais preferivelmente os tamanhos de gotícula de óleo estarão dentro da faixade 120 a 750 nm, e mais preferivelmente de 120-600nm em diâmetro.
Uma formulação adjuvante particularmente potente (paracombinação final com AIPO4 nas composições imunogênicas da invenção)envolve uma saponina (preferivelmente QS21), um derivado de LPS(preferivelmente 3D-MPL) e uma emulsão de óleo (preferivelmenteesqualeno e alfa-tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água) como descritoem WO 95/17210 ou em WO 99/12565 (em particular formulação adjuvante11 em Exemplo 2, Tabela 1).
Exemplos de um agonista de TLR 2 incluem peptidoglicano oulipoproteína. Imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod sãoagonistas de TLR7 conhecidos. RNA de fita única também é um agonista deTLR conhecido (TLR8 em humanos e TLR7 em camundongos), enquanto queDNA de fita dupla e poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico - um miméticocomercial de RNA viral) são exemplos de agonistas de TLR 3. 3D-MPL é umexemplo de um agonista de TLR4 enquanto que CPG é um exemplo de umagonista de TLR9.
A composição imunogênica pode compreender um antígeno eum imunoestimulante adsorvidos sobre um sal de metal. Formulações devacina baseadas em alumínio nas quais o antígeno e o imunoestimulantemonofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL), estão adsorvidos sobre amesma partícula são descritas em EP 0.576.478 BI, EP 0.689.454 BI, e EP0.633.784 BI. Nestes casos então antígeno é primeiro adsorvido sobre o salde alumínio seguido por adsorção do imunoestimulante 3D-MPL sobre asmesmas partículas de sal de alumínio. Tais processos primeiro envolvem asuspensão de 3D-MPL por sonificação em um banho de água até que aspartículas alcancem um tamanho de entre 80 e 500 nm. O antígeno étipicamente adsorvido sobre sal de alumínio por uma hora na temperaturaambiente sob agitação. A suspensão de 3DMPL é então adicionada noantígeno adsorvido e a formulação é incubada na temperatura ambiente por 1hora, e então mantida a 4°C até o uso.
Em outro processo, o imunoestimulante e o antígeno estãosobre partículas de metal separadas, como descrito em EP 1126876. Oprocesso melhorado compreende a adsorção de imunoestimulante, sobre umapartícula de sal metálico, seguida pela adsorção do antígeno sobre outrapartícula de sal metálico, seguida pela misturação das partículas metálicasdiscretas para formar uma vacina. O adjuvante para uso na presente invençãopode ser uma composição adjuvante compreendendo um imunoestimulante,adsorvido sobre uma partícula de sal metálico, caracterizado pelo fato de quea partícula de sal metálico está substancialmente livre de outro antígeno.
Ademais, são proporcionadas vacinas pela presente invenção as quais sãocaracterizadas pelo fato de que o imunoestimulante é adsorvido sobrepartículas de sal metálico que estão substancialmente livres de outro antígeno,e pelo fato de que as partículas de sal metálico que adsorvem o antígeno estãosubstancialmente livres de outro imunoestimulante.
Conseqüentemente, a presente invenção proporciona umaformulação adjuvante compreendendo imunoestimulante que tem sidoadsorvido sobre uma partícula de um sal metálico, caracterizada pelo fato deque a composição está substancialmente livre de outro antígeno. Além disso,esta formulação adjuvante pode ser uma intermediária que, se um taladjuvante for usado, é requerida para a manufatura da vacina.
Conseqüentemente é proporcionado um processo para a manufatura de umavacina compreendendo misturar uma composição adjuvante que é um ou maisimunoestimulantes adsorvidos sobre uma partícula de metal com um antígeno.Preferivelmente, o antígeno tem sido pré-adsorvido sobre uma partícula demetal. O citado sal metálico pode ser idêntico ou similar ao sal metálico que éadsorvido sobre o imunoestimulante. Preferivelmente o sal de metal é um salde alumínio, por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.
A presente invenção adicionalmente proporciona umacomposição de vacina compreendendo imunoestimulante adsorvido sobreuma primeira partícula de um sal metálico, e antígeno adsorvido sobre um salmetálico, caracterizada pelo fato de que as primeira e segunda partículas desal metálico são partículas separadas.
Mutações ou derivados de LOS ou LPS ou derivados delipídeo A aqui descritos são planejados para serem menos tóxicos (e.g. 3D-MPL) do que os lipopolissacarídeos nativos e são equivalentesintercambiáveis com respeito a quaisquer usos destes grupos aqui descritos.
Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições dainvenção compreende um veículo lipossomo (preparado por técnicasconhecidas a partir de fosfolipídeos (tal como dioleoil-fosfatidil-colina[DOPC]) e opcionalmente um esterol [tal como colesterol]). Tais veículoslipossomo podem trazer derivados de lipídeo A [tal como 3D-MPL - vejaacima] e/ou saponinas (tal como QS21 - veja acima). Em uma modalidade oadjuvante compreende (por dose de 0,5 mL) O5I-IOmg, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2, ou0,5-1 mg (e,g, 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 ou 1 mg) de fosfolipídeo (por exemploDOPC), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,125-0,25 mg (e,g, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μ§) de derivado delipídeo A (por exemplo 3DMPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de saponina (por exemplo QS21).
Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições dainvenção compreende uma emulsão de óleo-em-água preparada a partir de umóleo metabolizável (tal como esqualeno), um emulsificador (tal como Tween80) e opcionalmente um tocol (tal como alfa-tocoferol). Em uma modalidadeo adjuvante compreende (por dose de 0,5 mL) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8, ou 5-6mg (e,g, 2-3, 5-6, ou 10-11 mg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno),0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4, ou 2-3 mg (e,g, 0,9-1,1, 2-3 ou 4-5 mg) deemulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente 0,5-20, 115, 2-12, 4-10,5-7 mg (e,g, 11-13, 5-6, ou 2-3 mg) de tocol (tal como alfa-tocoferol).
Este adjuvante pode opcionalmente adicionalmentecompreender 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (e.g. 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50μg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Este adjuvante pode opcionalmente conter 0,025-2,5, 0,05-1,5,0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,1250,25 mg (e,g, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 ou 0,125mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (e,g, 5-15,40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3 D-MPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg)de saponina (por exemplo QS21).
Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições dainvenção compreende fosfato de alumínio e um derivado de lipídeo A (talcomo 3D-MPL). Este adjuvante pode compreender (por dose de 0,5 mL) 100-750, 200-500, ou 300-400 μg Al como fosfato de alumínio, e 5-60, 10-50, ou20-30 μg (e.g. 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de derivado de lipídeo A(por exemplo 3D-MPL).
As preparações de vacina da presente invenção podem serusadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio deadministração de citada vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estasadministrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular,intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração mucosal nostratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. Administração intranasal devacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferida (porque otransporte nasofaringeal de pneumococos pode ser mais efetivamenteprevenido, atenuando assim a infecção em seu estágio mais inicial). Embora avacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, os seuscomponentes também podem ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ouem tempos diferentes (por exemplo polissacarídeos pneumocócicos poderiamser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após aadministração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina paracoordenação ótima das respostas imunes uma com relação à outra). Para co-administração, o adjuvante Thl opcional pode estar presente em qualqueruma ou em todas as administrações diferentes, por exemplo, pode estarpresente em combinação com o componente proteína bacteriana da vacina.Por exemplo, polissacarídeos podem ser administrados IM (ou ID) e proteínasbacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Em adição, as vacinas dainvenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses dereforço.
A quantidade de antígeno conjugado em cada dose de vacina éselecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetorasem efeitos colaterais adversos, significativos, em vacinas típicas. Talquantidade variará dependendo de qual imunógeno específico é empregado ecomo é apresentado. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 0,1-100 μg de polissacarídeo, tipicamente 0,1-50 μg, 0,l-10μg, l-10μg ou I^gpara conjugados de polissacarídeo.
O conteúdo de antígenos de proteína na vacina estarátipicamente dentro da faixa de l-100μg, 550μg ou 5 - 25μg. Após umavacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações dereforço adequadamente espaçadas.
Preparação de vacina é geralmente descrita em VaccineDesign ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & NewmanMJ.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação com lipossomos édescrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.
As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas emsolução ou liofilizadas. Opcionalmente a solução é liofilizada na presença deum açúcar tal como sacarose, trealose ou lactose. É típico que sejamliofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso. Liofilizaçãopode resultar em uma composição (vacina) mais estável.
Métodos
A invenção também inclui método de preparação dascomposições imunogênicas e vacinas da invenção.
Em uma modalidade, o processo da invenção, é um métodopara preparar uma vacina compreendendo as etapas de misturar antígenospara preparar a composição imunogênica da invenção e adicionar umexcipiente farmaceuticamente aceitável.
Métodos de tratamento
A invenção também inclui método de tratamento de infecçãoestafilocócica, particularmente de infecções nosocomiais adquiridas emhospital.
Esta composição imunogênica ou vacina da invenção éparticularmente vantajosa em casos de cirurgia eletiva. Tais pacientes saberãoantecipadamente a data da cirurgia e poderão ser inoculadosantecipadamente. Visto que não é sabido se o paciente será exposto à infecçãopor S. aureus ou S. epidermidis, é preferido inocular com uma vacina dainvenção que protege contra ambas, como descrito acima. Tipicamenteadultos acima de 16 aguardando cirurgia eletiva são tratados com ascomposições imunogênicas e vacinas da invenção. Alternativamente criançasde 3-16 anos de idade aguardando cirurgia eletiva são tratadas com ascomposições imunogênicas e vacinas da invenção.
Também é possível inocular trabalhadores de cuidado da saúdecom a vacina da invenção.
As preparações de vacina da presente invenção podem serusadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio deadministração de citada vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estasadministrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular,intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração aos tratosoral/alimentar, respiratório, genitourinários.
A quantidade de antígeno em cada dose de vacina éselecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetorasem efeitos colaterais adversos, significativos em vacinas típicas. Talquantidade variará dependendo do imunógeno específico empregado e decomo ele é apresentado. O conteúdo de proteína da vacina tipicamente estarádentro da faixa de l-10 μg, 5-5 μg, tipicamente dentro da faixa de 10-25μg.Uma quantidade ótima para uma vacina particular pode ser determinada porestudos padrão envolvendo observação de respostas imunes apropriadas emindivíduos. Após uma vacinação inicial, indivíduos podem receber uma oumais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
Embora vacinas da presente invenção possam seradministradas por qualquer rota, administração das vacinas desejadas paradentro da pele (ID) forma uma modalidade da presente invenção. Pelehumana compreende uma cutícula externa "córnea", chamada de stratumcorneum, que reveste a epiderme. Sob esta epiderme está uma camadachamada de derme, que por sua vez reveste o tecido subcutâneo.Pesquisadores têm mostrado que injeção de uma vacina na pele, e emparticular na derme, estimula uma resposta imune, que também pode estarassociada com um número de vantagens adicionais. Vacinação intradermalcom as vacinas aqui descritas forma uma característica opcional da presenteinvenção.
A técnica convencional de injeção intradermal, o"procedimento mantoux", compreende etapas de limpar a pele, e então esticarcom uma mão, e com o bisel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31)faceando para cima a agulha é inserida em um ângulo entre 10° e 15°. Umavez o bisel da agulha é inserido, o cilindro da agulha é abaixado eadicionalmente avançado enquanto proporciona uma ligeira pressão paraelevar a agulha sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamenteformando deste modo uma bolha ou um inchaço sob a superfície da pele,seguido por remoção lenta da agulha.
Mais recentemente, dispositivos que são especificamenteprojetados para administrar agentes líquidos para dentro ou através da peletêm sido descritos, por exemplo os dispositivos descritos em WO 99/34850 eEP 1092444. Também dispositivos de injeção de jato descritos por exemploem WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US5.064.413, US 5.520. 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos deadministração intradermal das preparações de vacina podem incluir seringas eagulhas convencionais, ou dispositivos projetados para liberação balística devacinas sólidas (WO 99/27961), ou emplastros transdermais (WO 97/48440;WO 98/28037); ou aplicadas sobre a superfície da pele (liberação transdermalou transcutânea WO 98/20734 ; WO 98/28037).
Quando as vacinas da presente invenção são para seremadministradas à pele, ou mais especificamente para dentro da derme, a vacinaestá em um volume de líquido pequeno, particularmente um volume de entrecerca de 0,05 mL e 0,2 mL.
O conteúdo de antígenos nas vacinas intradermais ou de peleda presente invenção pode ser similar às doses convencionais comoencontradas em vacinas intramusculares (veja acima). Contudo, é umacaracterística das vacinas intradermais ou de pele que as formulações podemser de "dose baixa". Conseqüentemente os antígenos de proteína em vacinasde "dose baixa" estão opcionalmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10μg, opcionalmente 0,1 a 5 μg por dose; e os antígenos de polissacarídeo(opcionalmente conjugado) podem estar presentes dentro da faixa de 0,01-1 μg, e opcionalmente entre 0,01 e 0,5 μg de polissacarídeo por dose.
Como aqui usado, o termo "liberação intradermal" significa aliberação de vacina para a região da derme na pele. Contudo, a vacina nãonecessariamente estará localizada exclusivamente na derme. A derme é acamada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfíciena pele humana, mas há uma certa quantidade de variação entre indivíduos eem partes diferentes do corpo. Em geral, pode ser esperado alcançar a dermeindo-se 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme está localizada entre ostratum corneum e a epiderme na superfície e a camada subcutânea abaixo.
Dependendo do modo de liberação, a vacina pode finalmenteestar localizada apenas ou primariamente dentro da derme, ou pode serfinalmente distribuída dentro da epiderme e a derme.
Uma modalidade da invenção é um método de prevenção oude tratamento de infecção ou doença estafilocepa estafilocócicacompreendendo a etapa de administrar uma composição imunogênica ouvacina da invenção a um paciente em necessidade da mesma.
Uma outra modalidade da invenção é um uso da composiçãoimunogênica da invenção na manufatura de uma vacina para o tratamento oua prevenção de doença ou infecção estafilocócica, opcionalmente de infecçãoestafilocócica após cirurgia.
O termo 'infecção estafilocócica' inclui infecção causada por S.aureus e/ou S. epidermidis e outras cepas estafilocócicas capazes de causareminfecção em um hospedeiro mamífero, opcionalmente hospedeiro humano.
Os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende"aqui são intencionados pelos inventores para serem opcionalmentesubstituíveis pelos termos "consistindo de", "consistem de" e "consiste de",respectivamente, em cada caso.Todas as referências ou pedidos de patente citados dentro desterelatório descritivo de patente são aqui incorporadas como referências.
Com o propósito de que esta invenção possa ser melhorentendida, os seguintes exemplos são mostrados. Estes exemplos são apenaspara propósitos de ilustração, e não são para serem entendidos de nenhummodo como limitantes do escopo da invenção.
Exemplos
Exemplo 1 Construção de plasmídeo para expressarproteínas recombinantes
A: Clonagem.
Sítios de restrição apropriados engenhados emoligonucleotídeos específicos para o gene estafilocepa estafilocócicapermitiram clonagem direcional do produto de PCR no plasmídeo pET24d oupQE-30 de expressão em E. coli de tal modo que uma proteína pudesse serexpressada como uma proteína de fusão contendo um marcador decromatografia de afinidade (His)6 na terminação-N ou -C.
Os iniciadores usados foram:Alfa-toxina - 5'-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3' e
5' CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3'
EbpS - 5'-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3' e
5'CCCAAG CTTTTATG GAATAACGATTTGTTG-31
CTfA - 5'-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3, e
5'C C CAAG CTTTTACTCTG GAATTG GTTCAATTTC-31
FnbpA - 5 '-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3' e
5'CCCAAGCTTTTATG CTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3'
Sbi - 5 '-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' e
5' G GAACTG CAGTTATTTC CAGAATGATAATAAATTAC-3'
SdrC - 5'-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-31 e51CCC AAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3'SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' e5' CC CAAG CTTTTATTCGTCATCATAGTATC CG-3'Ebh - 5AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3' e5, AAAAGT ACTC ACTTGATTCATCGCTTCAG-3'Aaa - 5 '-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3' e5'G C G CG CTCGAGATG GATGAATG CATAG CTAGA-3,IsaA - 5'-CATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATC AAGC-31 e
5'-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3'HarA - 5 '-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' e5TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3'Autolisina glicosaminidase - 5'-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3' e
5 '-C AGTCTCGAGTTTTAC AGCTGTTTTTGGTTG-3'Autolisina amidase - 5'-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3' e
5'GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3'IsdA - 5 '-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3' e5'ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAG CTTTAGAG CTTG-3'IsdB - 5'-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3' e5'-GAAG C CAT G G CAG CAG CTGAAGAAACAG GT G G-3'MRPII - 5'-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3' e5' AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTC ATT-3'
Os produtos de PCR foram primeiro introduzidos no vetor declonagem pGEM-T (Novagen) usando células bacterianas Top 10, de acordocom as instruções do fabricante. Este construto intermediário foi preparadopara facilitar clonagem adicional em um vetor de expressão. Transformantescontendo o inserto de DNA foram selecionados por análise com enzima derestrição. Após digestão, uma alíquota de -20 μί da reação foi analisada poreletroforese em gel de agarose (0,8 % de agarose em um tampão Tris-acetato-EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados por iluminação UVapós eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio. Um padrão detamanho molecular de DNA (escada de 1 kb, Life Technologies) foisubmetido à eletroforese em paralelo com as amostras de teste e foi usadopara estimar o tamanho dos fragmentos de DNA. Plasmídeo purificado dostransformantes selecionados para cada clonagem foi então seqüencialmentedigerido até completitude com enzimas de restrição apropriadas comorecomendado pelo fabricante (Life Technologies). O fragmento de DNAdigerido foi então purificado usando colunas spin baseadas em gel de sílicaantes da ligação com o plasmídeo pET24d ou pQE-30. Clonagem de Ebh(fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atl-amidase, Atl-glicosamina,MRPII, IsaA foi realizada usando o plasmídeo pET24d e clonagem de CTfA,SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, alfa-toxina e Sbi foi realizada usando oplasmídeo pQE-30.
B: Produção de vetor de expressão.
Para preparar o plasmídeo de expressão pET24d ou pQE-30para ligação, ele foi similarmente digerido até a completitude com enzimas derestrição apropriadas. Um excesso molar de aproximadamente 5 vezes dosfragmentos digeridos em relação ao vetor preparado foi usado para programara reação de ligação. Uma reação de ligação padrão de -20 \\L (~16°C, -16horas), usando métodos bem conhecidos na arte, foi realizada usando T4DNA ligase (-2,0 unidades/reação, Life Technologies). Uma alíquota daligação (-5 μί) foi usada para transformar células eletro-competentesM15(pREP4) ou BT21::DE3 de acordo com métodos bem conhecidos na arte.Após um período de desenvolvimento de -2-3 horas a 37°C em -1,0 mL decaldo LB, as células transformadas foram plaqueadas sobre placas de ágar LBcontendo ampicilina (100 \igJmL) e/ou canamicina (30μg/mL). Anticorposforam incluídos na seleção. Placas foram incubadas durante a noite a 37°Cpor -16 horas. Colônias individuais ApR/KanR foram selecionadas compalitos e usadas para "patch" inocular placas frescas LB ApR/KanR bemcomo uma cultura de caldo LB Ap/Kan de —1,0 mL. Ambas as placas patch ea cultura de caldo foram incubadas durante a noite a 37°C em uma incubadorapadrão (de placas) ou em um banho de água agitado. Uma análise de PCRbaseada em célula inteira foi empregada para verificar que transformantescontinham o inserto de DNA. Aqui, a cultura de caldo LB Ap/Kan de -1,0mL noturna foi transferida para um tubo de polipropileno de 1,5 mL e ascélulas foram colhidas por centrifugação em uma microcentrífuga Beckmann(-3 min., temperatura ambiente, -12.000 X g). A pelota celular foi suspensaem -200 μί de água estéril, e uma alíquota de -10 μί foi usada paraprogramar uma reação PCR de volume final de -50 μΐ, contendo osiniciadores de amplificação tanto diretos quanto inversos. A etapa dedesnaturação inicial a 95°C foi aumentada para 3 minutos para garantirrompimento térmico das células bacterianas e liberação de DNA plasmídeo.Um ciclador térmico ABI Model 9700 e um perfil de amplificação térmica detrês etapas, de 32 ciclos, i.e. 95°C, 45 s; 55-58°C, 45 s, 72°C, 1 min., foramusados para amplificar o fragmento BASB203 das amostras de transformantelisado. Após amplificação térmica, uma alíquota de - 20 μί da reação foianalisada por eletroforese em gel de agarose (0,8 % de agarose em um tampãoTris-acetato-EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados poriluminação UV após eletroforese em gel e coloração com brometo de etídioUm padrão de tamanho molecular de DNA (escada de 1 kb, LifeTechnologies) foi submetido à eletroforese em paralelo com as amostras deteste e foi usado para estimar o tamanho dos produtos de PCR.Transformantes que produziram o produto de PCR de tamanho esperadoforam identificados como cepas contendo um construto de expressão deproteína. Cepas contendo plasmídeo de expressão foram então analisadas paraa expressão induzível de proteína recombinante.
C: Análise de expressão de transformantes positivos para PCR.
Uma alíquota da cultura de semente noturna (-1,0 mL) foiinoculada em um frasco Erlenmeyer de 125 mL contendo -25 mL de caldoLB Ap/Kan e foi crescida a 37°C com agitação (-250 rpm) até que aturbidez da cultura alcançasse O.D.600 de -0,5, i.e. fase mid-log(normalmente cerca de 1,5 - 2,0 horas). Neste momento aproximadamentemetade da cultura (-12,5 mL) foi transferido para um segundo frasco de125 mL e expressão de proteína recombinante foi induzida pela adição deIPTG (solução de estoque 1,0 M preparada em água estéril, Sigma) parauma concentração final de 1,0 mM. Incubação de ambas culturas não-induzidas e induzidas por IPTG continuou por um adicional de -4 horas a37°C com agitação. Amostras (-1,0 mL) de ambas as culturas não-induzidae induzida foram removidas após o período de indução e as células foramcoletadas por centrifugação em uma microcentrífuga na temperaturaambiente por -3 minutos. Pelotas celulares individuais foram suspensas em-50 μL de água estéril, então misturadas com um volume igual de tampãode amostra 2X Laemelli SDS-PAGE contendo 2-mercapto-etanol, edeixadas em banho de água fervente por -3 min para desnaturar a proteína.Volumes iguais (~15μί) de ambos os lisados celulares brutos induzidospor IPTG e não-induzidos foram carregados em duplicada sobre gel depoliacrilamida glicerina/Tris 12% (espessura de 1 mm Mini-gels, Novex).As amostras de lisado induzido e não-induzido foram submetidas àeletroforese juntas com marcadores de peso molecular pré-corados(SeeBlue, Novex) sob condições convencionais usando um tampão decorrida padrão de SDS/Tris/glicina(BioRad). Após eletroforese, um gel foicorado com azul brilhante coommassie R250 (BioRad) e então descoradapara visualizar a(s) proteína(s) nova(as) induzível(eis) por IPTG. Osegundo gel foi electroblotted sobre membrana de PVDF (tamanho de porode 0,45 micrômetro, Novex) por ~2 horas a 4°C usando uma aparelhagemde blotting BioRad Mini-Protean II e tampão de transferência de metanolde Towbin (20 %). Bloqueio da membrana e incubações de anticorpo foramrealizados de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Um anticorpomonoclonal anti-RGS (His)3, seguido por um segundo anticorpo de coelhoanti-camundongo conjugado em HRP (QiaGen)5 foram usados paraconfirmar a expressão e a identidade da proteína recombinante.Visualização do padrão reativo de anticorpo anti-His foi realizada querusando um substrato insolúvel ABT quer usando um Hyperfilm com osistema quimioluminescente Amersham ECL.
Exemplo 2 Produção de proteína recombinante
Cepa bacteriana
Uma cepa de expressão recombinante de E. coli M15(pREP4)contendo um plasmídeo (pQE30) ou BL21::DE3 contendo plasmídeo pET24dcodificador de proteína estafilocócica foi usada para produzir massa celularpara purificação de proteína recombinante.
Meio
O meio de fermentação usado para a produção de proteínarecombinante consistiu de caldo 2X YT (Difco) contendo 100μg/mL de Ape/ou 30 μg/mL de Km. Antiespumante foi adicionado no meio para ofermentador a 0,25 mL/L (Antifoam 204, Sigma). Para induzir expressão daproteína recombinante, IPTG (Isopropil-P-D-Tiogalactopiranosideo) foiadicionado no fermentador (1 mM, final).
Produção de proteínas recombinantes
Sob condições nativas
IPTG foi adicionado em uma concentração final de 1 mM e acultura foi crescida por 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a6.000 rpm por 10 minutos e a pelota foi ressuspensa em tampão fosfato(KH2PO4, K2HPO4 50 mM, pH 7) incluindo um coquetel de inibidor deprotease. Esta amostra foi submetida à Iise de pressão francesa usando pressãode 150.000 kPa (2 corridas). Após centrifugação por 30 minutos a 15.000rpm, o sobrenadante foi reservado para purificação adicional e NaCl foiadicionado para 0,5 Μ. A amostra foi então carregada em uma resina Ni-NTA (coluna XK 16 Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada emKH2PO4, K2HPO4 50 mM, pH 7. Após carregamento da amostra, a coluna foilavada com Tampão A (NaH2PO4 0,2 M pH7, NaCl 0,3 M, glicerol 10%).Para eluir a proteína ligada, uma gradiente escalonado foi usado no qualproporções diferentes de tampão B (NaH2PO4 0,2 M pH7, NaCl 0,3 M,glicerol 10% e imidazol 200 mM) foram adicionadas no tampão A. Aproporção de tampão B foi gradualmente aumentada de 10% para 100%.Após purificação, a fração eluída contendo a proteína foi reunida, concentradae dialisada contra KH2P04/K2HP04 0,002 M pH7, NaCl 0,15 M.
Este método foi usado para purificar CTfA, SdrG, IsdA, IsaB,HarA, Atl-glicosamina e alfa-toxina.
Sob condições desnaturantes
IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM e acultura foi crescida por 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a6.000 rpm por 10 minutos e a pelota foi ressuspensa em tampão fosfato(K2HPO4, KH2PO4 50 mM pH 7) incluindo um coquetel de inibidor deprotease. Esta amostra foi submetida à Iise de pressão francesa usando pressãode 150.000 kPa (2 corridas). Após centrifugação por 30 minutos a 15.000rpm, a pelota foi lavada com tampão fosfato incluindo uréia 1 Μ. A amostrafoi centrifugada por 30 min a 15.000 rpm e a pelota foi ressuspensa em uréia8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5M, Tris-HCl 0,01 M pH 8 e mantida durante anoite na temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 20 minutos a15.000 rpm e o sobrenadante foi coletado para purificação adicional. Aamostra foi então carregada em uma resina Ni-NTA (coluna XK 16Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada em uréia 8 M, NaH2PO4 0,1Μ, NaCl 0,5 Μ, Tris-HCl 0,01 M ρΗ 8. Após passagem do fluxo, a coluna foilavada sucessivamente com tampão A (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5M, Tris 0,01 M, pH 8.0), tampão C (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 Μ, 0.5M NaCl,Tris 0,01 M, pH 6,3), tampão D (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M,Tris 0,01 M, pH 5.9) e tampão E (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M,Tris 0,01 M, pH 4.5). A proteína recombinante foi eluída da coluna durante aslavagens com tampão D e Ε. A proteína recombinante desnaturada pôde sersolubilizada em solução destituída de uréia. Para este propósito, a proteínadesnaturada contida em uréia 8 M foi sucessivamente dialisada contra uréia 4M, Na2PO4 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,1, uréia 2 M, NaH2PO4 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,1, arginina 0,5 Me KH2P04/K2HP04 0,002 M pH7,l, NaCl0,15 M, arginina 0,5 M.
Este método foi usado para purificar Ebh (fragmento H2),AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidase e IsaA.
As proteínas purificadas foram dialisadas por SDS-PAGE. Osresultados de uma proteína purificada sob condições nativas (alfa-toxina) e deuma proteína purificada sob condições desnaturantes (SdrC) são mostradosem Figuras 3 e 4.
Exemplo 3 Preparação de conjugados de polisssacarídeocapsular de S. aureus usando CDAP
Química de ativação e copulação para PS8 nativo usandoCDAP:
SA08-TT004
Ativação e copulação foram realizadas na temperaturaambiente sob agitação contínua. 10 mg de polissacarídeo nativo foramdissolvidos para obter uma concentração de PS final de 2,5 mg/mL em NaCl0,2 Μ. A solução foi então ajustada para pH 6,0+/-0,2 antes da etapa deativação.
No tempo 0, 50 μL, de uma solução de CDAP (100 mg/mLrecém-preparado em acetonitrila /WFI, 50/50) foram adicionadosmanualmente para alcançar uma razão apropriada de CDAP/PS (0,5/1).
Após 1,5 minutos o pH foi elevado para pH 9,00+/-0,05 poradição de NaOH 0,5 M.
Adição de NaOH demora cerca de 1 minutos e pH éestabelecido em pH 9,00+/-0,05 até adição de veículo.
No tempo de 4,5 minutos, 1,5 mL de TT (10 mg/mL em NaCl0,2 M) foram adicionados para alcançar a razão apropriada de Proteína /PS(1,5/1); pH foi imediatamente ajustado para pH de copulação de 9,00+/0,05.A solução é deixada por uma hora sob regulação de pH manual.
Após a etapa de copulação, 0,5 mL de glicina 2 M (razãogly/PS (p/p): 7,5/1) foi adicionado; pH foi imediatamente ajustado para9,00+/-0,05. A solução foi deixada por 30 minutos sob regulação de pHmanual. Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5 μme injetado em Sephacryl S400HR (XK16/100). A vazão de fluxo foi fixadaem 30 mL/h, usando NaCl 150 mM.
As frações de eluição foram analisadas por resorcina e porμΒΟΑ. Frações de interesse foram reunidas e filtradas sobre Sterivex 0,22 μm.
O conjugado resultante teve uma razão deTT/PS (p/p) final de1,05 como avaliado pelos ensaios de resorcinol e de Lowry.
Exemplo 4 Preparação de conjugados de polissacarídeocapsular de S. aureus usando CDAP em polissacarídeos de tamanhoajustado
Química de ativação e copulação para PS8 de tamanhoajustado usando CDAP
PS é pesado tendo por base conteúdo de umidade teórico de10%. 2 g de PS úmido, nativo foram dissolvidos durante a noite em WFI emuma concentração inicial de 10 mg/mL. Antes do ajuste de tamanho, asolução de PS nativo foi clarificada em um filtro de corte de 5 μm.Uma aparelhagem homogeneizadora EMLILSIFLEX C-50, naqual a célula de homogeneização foi substituída por uma câmara de interaçãoMicrofluidics Ρ20Υ-0.75μηι, foi usada para reduzir o peso molecular e aviscosidade do polissacarídeo antes da etapa de ativação.
A redução de tamanho foi realizada a 68.948 kPa durante osprimeiros ciclos e então a 103.421 kPa para os 60 ciclos seguintes. Oprogresso da redução de tamanho foi seguido em processo pela medição daviscosidade. O ajuste de tamanho foi interrompido após 70 ciclos quando oalvo de 2,74 ± 0,2 mPa.s foi alcançado.
Ativação e copulação foram realizadas na temperaturaambiente sob agitação contínua.
mg de polissacarídeo 8 de tamanho ajustado foram diluídospara obter uma concentração final de PS de 5 mg/mL em NaCl 0,2 M.
No tempo 0, 375 μΐ. de uma solução de CDAP (100 mg/mLrecém-preparada em acetonitrila/WFI, 50/50) foram adicionadosmanualmente para alcançar a razão apropriada de CDAP/PS (0,75/1).
Após 1 minuto o pH foi elevado para pH 9,00+/-0,05 pelaadição de NaOH 0,5 M.
No tempo 2,5 minutos, 10 mL de TT a 10 mg/mL em NaCl 0,2M NaCl foram adicionados para alcançar a razão apropriada de Proteína/PS(2/1); pH foi imediatamente ajustado para pH de copulação de 9,00+/0,05. Asolução foi deixada por 55 minutos sob regulação de pH manual.
Após etapa de copulação, 2,5 mL de glicina 2 M (razão degly/PS (p/p): 7,5/1) foram adicionados; pH foi imediatamente ajustado para9,00+/-0,05 pelo regulador. A solução foi deixada por 30 minutos sobregulação de pH manual.
Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de5 pme injetado em Sephacryl S400HR (XK26/100). A vazão de fluxo foifixada em 60 mL/h.As frações de eluição foram analisadas por resorcinol e pordosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e filtradas emMillipack200 de 0,22 μιη.
O conjugado resultante possui uma razão final de TT/PS de-1,94.
Exemplo 5 Preparação de conjugados de polissacarídeocapsular de S. aureus usando EDAC
Química de ativação e copulação usando EDAC:
Conjugado de polissacarídeo capsular de tipo 8 - TT de S.aureu:
Derivação de PS
Ativação e copulação foram realizadas em temperaturaambiente sob agitação contínua.
mg de polissacarídeo nativo foram diluídos para obter umaconcentração final de polissacarídeo de 5 mg/mL em água. A solução foiajustada para pH 4,5-5,0 com HCl 0,5 N e então 66 μg de ADH foramadicionados (2,2 mg/mg PS). Após dissolução completa, 60 mg de EDACforam adicionados (2 mg/mg PS). Após 70 min o pH foi elevado para pH 7,5com NaOH 1 N para interromper a reação. ADH livre foi removido porpurificação em Sephacryl S100HR (XK 16/40). A vazão de fluxo foi fixadaem 60 mL/h usando NaCl 0,2 M como tampão de eluição. Uma redução detamanho foi feita por sonificação de 15 min permitindo uma filtração em filtromillex (0,22 μπι).
Copulação
Toxóide de tétano foi adicionado em 5 a 10 mg depolissacarídeo derivado em NaCl 0,2 Meo pH foi ajustado para pH 5,0 oupH 6,0 pela adição de HCl 0,5 N. EDAC foi dissolvido em tampão Tris 0,1 MpH 7,5 e então adicionado durante um período de 10 min (1/5 vol cada 2min). De acordo com as condições usadas (veja Tabela 6), a reação foiinterrompida após entre 30 e 180 minutos pela adição de Tris-HCllM de pH7,5. Antes da purificação em Sephacryl S400HR, o conjugado foi clarificadousando um filtro Minisart 5 μιη . Alternativamente, o conjugado foiclarificado por uma etapa de sonificação de 5 minutos. O conjugado foi entãoinjetado em Sephacryl S400HR (XK16/100). A vazão de fluxo foi fixada em30 mL/h usando NaCl 150 mM como tampão de eluição. A combinação deeluição foi selecionada baseando-se em perfis de resorcinol e μΒΟΑ (quemedem dosagem de polissacarídeo e de proteína respectivamente). Oconjugado foi filtrado em uma membrana de esterilização de 0,22 μηι(Millipack 20) a 10 mL/min.
Tabela 5
<table>table see original document page 84</column></row><table>
Tabela 5: * copulação feita em pH 6,0
Os conjugados resultantes possuem as seguintes característicasmostradas em Tabela 6:
Tabela 6
<table>table see original document page 84</column></row><table>
Polissacarídeo de tipo 8 de S. aureus também foi tratado pormicrofluidização antes de derivação com ADH
Derivação de PS
Ativação e copulação foram realizadas em temperaturaambiente sob agitação contínua.
200 mg de polissacarídeo de tamanho ajustado são diluídospara obter uma concentração final de PS de 10 mg/mL em água. Então 440mg de ADH foram adicionados (2,2 mg/mg PS). A solução foi ajustadapara pH 4,7 com HCl 1 N antes da adição de 400 mg de EDAC (2 mg/mgPS). Após 60 min o pH foi elevado para pH 7,5 com NaOH 5 Mpara interromper a reação. A mistura foi concentrada em Amicon Ultra(corte de 10.000 MWCO). Antes da purificação em Sephacryl S200HR(XK16/100), o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5 μηι.A vazão de fluxo foi fixada em 30 mL/h usando NaCl 0,150 M como tampãode eluição.
Copulação
100 mg de TT foram adicionados em 50 mg de polissacarídeoderivado em NaCl 0,2 Ml. O pH foi ajustado para pH 5,0 ± 0,02 pela adiçãode HCl 0,3 N. EDAC foi dissolvido em tampão Tris 0,1M de pH 7,5 e entãoadicionado durante um período de 10 min (1/10 vol cada minuto). De acordocom as condições usadas (veja Tabela 8), a reação foi interrompida após entre30 e 180 minutos pela adição de Tris-HCl 1 M pH 7,5. Antes da purificaçãoem Sephacryl S400HR, o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisartde 5 μηι . O conjugado foi então injetado em Sephacryl S400HR(XK50/100). A vazão de fluxo foi fixada em 60 mL/h usando NaCl 150 mMcomo tampão de eluição. A combinação de eluição foi selecionadatendo por base perfis de resorcinol e pBCA (que medem a dosagem depolissacarídeo e de proteína respectivamente). Então, o conjugado foifiltrado em uma membrana de esterilização de 0,22 μm (Millipack 20)a 10 mL/min.
Tabela 7
<table>table see original document page 85</column></row><table>
* EDAC adicionado em "uma vez"Tabela 8
<table>table see original document page 86</column></row><table>
Exemplo 6 Preparação de conjugados de polissacarídeocapsular de S. aureus Capsular usando EDAC em polissacarídeo 8 de S.aureus de-O-acetilado
De-O-acetilação
NaOH 0,1 N foi adicionado em 16 mL de PS detamanho ajustado (10 mg/mL) para obter uma concentração final dePS de 9 mg/mL e uma concentração final de NaOH de 0,1 N. Após umtratamento de 1 ou 2 h a 37°C, o PS teve um nível de O-acetilação de 35 e-12% (dosagem de Hestrin) respectivamente em comparação com o PS nãotratado.
NaOH 0,1 N foi adicionado em 19 mL de PS detamanho ajustado (10 mg/mL) para obter uma concentração final de PSde 9,5 mg/mL e uma concentração final de NaOH de 0,05 N. Após umtratamento de 1 ou 2 h a 37°C, PS teve um nível de O-acetilação de 78e 58% (dosagem de Hestrin) respectivamente em comparação com o PS nãotratado.
A etapa de derivação foi realizada como mostrado previamentepara um PS não tratado.
Tabela 9
<table>table see original document page 86</column></row><table>Remoção dos grupos O-acetila resultou em umadisponibilidade aumentada de grupos carboxílico reativos. De fato, o nível dederivação de um PS possuindo apenas 12% de grupos O-acetila foi ± 2,5-vezes superior ao daquele possuindo 78% de grupos O-acetila.
Copulação foi realizada como mostrado previamente para umPS não tratado.
Tabela 10
<table>table see original document page 87</column></row><table>
Tabela 11
<table>table see original document page 87</column></row><table>
Exemplo 7 Conjugação de dPNAG
Ativação e copulação de dPNAG:
Conjugados de dPNAG-TT
Os seguintes conjugados foram produzidos usando asabordagens descritas aqui abaixo:
dPNAG-ΤΤΟΙΟ: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-LC-SPDP
dPNAG-TTOl 1: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-LC-SPDP
dPNAG-TT012: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-SPDP
dPNAG-TT014: dPNAG-SPDP + DTT tratado TT-SPDP
dPNAG-TTOl7:DTT tratado dPNAG-SPDP + TT-LC-SPDP
dPNAG-TT019: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-SPDP
dPNAG-TT020: dPNAG-S-GMBS +DTT tratado TT-SPDP
dPNAG
1 g de PNAG foi dissolvido em HCl 5 N em uma concentraçãode 20mg/mL e foi incubado por 1 hora. Foi então neutralizado com NaOH 5Ν. A solução foi clarificada em uma membrana de 5 μπι e purificada emSephacryl S400HR. Frações de interesse, correspondendo ao "tamanhomolecular médio" (veja, Infection e Immunity, 70: 4433-4440 (2002)), foramreunidas e concentradas antes do tratamento de de-N-acetilação.
A solução foi ajustada em NaOH IMe deixada 24 horas a37°C. Após neutralização, o produto foi submetido à diálise e concentração.
Ativação de dPNAG
S-GMBS (N-(y-Maleimido-butiriloxi)-sulfo-succimida, Pierce)foi adicionada em dPNAG em NaCl 0,2 M (razão de S-GMBS/PS (p/p): 1/1) eincubado 2h na temperatura ambiente em pH 7,0 (regulação de pH usandoNaOH 1 M). GMBS em excesso e subprodutos foram removidos porpurificação em Toyopearl HW-40F usando PBS, EDTA 10 mM, NaCl 50 mMpH 7,2 como tampão de eluição com uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h.A combinação de eluição foi selecionada em função da densidade óptica(UV=206 nm) e então concentrada em tubos Vivaspin 3.000 MWCO ouAmicon Ultra 10.000 MWCO.
Copulação
dPNAG ativado por GMBS e TT-SPDP reduzido por DTTforam misturados na temperatura ambiente. De acordo com as condiçõesusadas a reação foi interrompida após 20-120 min pela adição de cisteína (4mg/mL em tampão fosfato de Na de pH 8,0) por 30 minutos. O conjugado foiclarificado em um filtro de 5 μm e injetado em resina Sephacryl S300HR(XK16/100) para purificação. Eluição foi realizada em NaCl 200 mM comuma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h. As frações de eluição foramanalisadas por hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesseforam reunidas e filtradas em Sterivex 0,22 μm. O conjugado final foi testadopara composição de polissacarídeo (dosagem de hexosamina) e de proteína(dosagem de Lowry).Tabela 12
<table>table see original document page 89</column></row><table>
*Não realizado no lote usado na conjugação mas estimado em um lote prévio por NMRusando o mesmo método de N-acetilação.
Tabela 13
<table>table see original document page 89</column></row><table>dPNAG-SPDP:
Um excesso molar de 5 vezes de SPDP (N-Succinimidil-3-(2-Piridilditio)Propionato, MW: 312,4, Pierce) dissolvido em DMSO (dimetil-sulfóxido, Merck) foi adicionado em 100 mg de dPNAG a 5mg/mL emfosfato de Na 100 mM, pH 7,2) e incubado 1 h na temperatura ambiente.Antes da purificação em Sephacryl S100HR (XK16/40) a mistura reacionalfoi concentrada para ± 6 mL em Amicon Ultra 10.000 MWCO (centrifugaçãoa 3000 rpm durante 28 min). Eluição foi realizada em tampão fosfato pH 7,4com uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h. As frações de interesse (lidas em206 nm) foram reunidas e concentradas para 1,1 mL em Amicon Ultra 10.000MWCO (centrifugação a 3000 rpm durante 30 min).
TT-SPDP:
Um excesso molar de 15 vezes de SPDP (Pierce) dissolvidoem DMSO (dimetil-sulfóxido, Merck) foi adicionado em 1 g de TT (50mg/mL) em fosfato de Na 100 mM, pH 7,2 e incubado 80 min na temperaturaambiente. Então o produto foi injetado em Sephacryl S100HR (XK16/40) eeluído em acetato de Na 100 mM = pH 5,6, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM comuma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h. A combinação de eluição foiselecionada em função da densidade óptica (UV=280nm) e então concentradapara 19,6 mL em Amicon Ultra 10.000 MWCO (centrifugação a 3000 rpmdurante 75 min).
TT-LC-SPDP foi produzido como TT-SPDP mas usando LC-SPDP (6-[3-(2piridilditio)-propionamido]-hexanoato de succinimidila, Pierce)e em um tempo de incubação de 60 min.
TT-SH ou TT-LC-SH
DTT foi adicionado em TT-SPDP ou TT-LC-SPDP em umarazão de DTT/TT (mg/mg) de 0,7/1. Após 2 h na temperatura ambiente, aliberação de piridina-2-tiona foi seguida por sua absorbância característica em343 nm. A proteína tiolada foi purificada de DTT em excesso por filtração emgel (PD-10, Amersham). Após concentração em Amicon Ultra 10.000MWCO, o conteúdo de proteína foi estimado por dosagem de Lowry.
dPNAG-SPDP + TT-SH ou TT-LC-SH (dPNAG-TT014 e 016)
Copulação foi realizada na temperatura ambiente sobcondições de agitação e com uma razão inicial de TT/PS (p/p) de 2/1.
dPNAG e TT-SH foram misturados com o objetivo de obteruma concentração final de PS de 20 mg/mL e uma concentração final deproteína de40 mg/mL. Após 30 min, grupos sulfidrila não reagidos foramextintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).
dPNAG e TT-LC-SH foram misturados com o objetivo deobter uma concentração final de PS de 10 mg/mL e uma concentração final deproteína de20 mg/mL. Após 75 min, grupos sulfidrila não reagidos foramextintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).
Então o conjugado é clarificado usando um filtro Minisart de 5μιη e injetado em Sephacryl S300HR (XK16/100). Eluição foi realizada emNaCl 200 mM com uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h.
As frações de eluição foram analisadas por dosagem dehexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas efiltradas em Sterivex 0,22 μπι.
Os conjugados resultantes possuem uma razão final de TT/PS(p/p) de 2,18 (TT-SH) e 2,24 (TT-LCSH).
Tiolação de dPNAG
11,6 mg de DTT (1,4-Ditiotreitol, Boerhinger Mannheim,MW: 154,24) foram adicionados em 16,5 mg de dPNAG-SPDP. Após 2 h natemperatura ambiente, a liberação de piridina-2-tiona foi seguida por suaabsorbância característica em 343 nm. O PS tiolado foi purificado do DTT emexcesso por filtração em gel (Toyopearl HW40F) e então concentrado para860 μl. em Amicon Ultra 10.000 MWCO.
dPNAG-SH + TT-SPDP (dPNAG-TT017)
Copulação foi realizada na temperatura ambiente sob agitaçãocontínua e com uma razão inicial de relação TT/PS (p/p) de 1,7/1.
dPNAG-SH e TT-SPDP foram misturados com o objetivo deobter uma concentração final de PS de 7,73 mg/mL e uma concentração finalde proteína de 13,3 mg/mL. Após 90 min, grupos sulfidrila não reagidos foramextintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).
Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de5 μιη e injetado em Sephacryl S300HR (XK16/100). Eluição foi realizada emNaCl 200 mM com uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h.
As frações de eluição são analisadas por dosagem dehexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas efiltradas em Sterivex 0,22 μιη.
O conjugado resultante possui uma razão final de TT/PS (p/p) de 2,74.
Exemplo 8 Formulação
Composições de adjuvante
Os conjugados foram inoculados quer não adjuvantados queradjuvantados com adjuvante A, possuindo a seguinte composição:Composição de Adjuvante AQualitativa Quantitativa (por dose de 0,5 mL)
Lipossomos:
- DOPC 1 mg
- colesterol 0,25 mg3DMPL 50 μgQS2150 μg
Tampão KH2PO4 13,124 mgTampão Na2HPO4 10,290 mgNaCl 2,922 mg(100mM)
Solvente WFI q.s. ad 0,5 mLpH 6,1
1. Concentração total de PO4 = 50 mMExemplo 9
Experimentos em animais.
Camundongos fêmeas CD-1, de 8 a 10 semanas de idade, sãoobtidos de Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para estudos deletalidade, cinco grupos de 9 a 11 camundongos CD-I são desafiadosintraperitonealmente (i.p.) com diluições seriais de S. aureus crescida sobreplacas de CSA. Os tamanhos inoculares variam de -1010 a 108CFU/camundongo. Mortalidade é avaliada em uma base diária por 3 dias. Asdoses letais 50% (LD50s) são estimadas pelo uso de um modelo de probit darelação de dose-resposta. A hipótese nula de LD50s comuns foi testada peloteste de taxa de probabilidade. Bacteremia subletal é iniciada por desafio dosgrupos de 8 a 20 pela rota intravenosa (i.v.) com -2x10 CFU/camundongoou pela rota i.p. com ~ 2 χ IO7 CFU/camundongo. Após inoculação grupos deanimais separados são sangrados da cauda em tempos específicos, e os níveisde bacteremia são estimados por contagens de placa quantitativa realizadasem duplicata sobre placas de ágar de soja tríptica com sangue de ovelha 5%(Becton Dickinson Microbiology Systems). Significância estatística édeterminada pela modificação de Welch do teste t de Student não-pareado.
Exemplo 10
Imunogenicidade de conjugados de dPNAG-TT e PS8-TTde S. aureus
Grupos de 30 camundongos foram inoculadossubcutaneamente com conjugado de PS8-TT de S. aureus em uma dose desacarídeo de 3 μg, quer adjuvantado quer combinado com adjuvante A, nosdias O, 14, 28 e 42. No dia O, os camundongos receberam uma primeira dosede sacarídeo incluindo entre 0,001 e 0,013 μg. As outras três imunizaçõesforam feitas com uma dose de 0,3 μg em solução salina. No dia 55 soro foicoletado dos camundongos e cada amostra de soro foi testada por ELISA paraavaliar a resposta imune contra PS8. Grupos de 10 camundongos foramusados nos grupos de controle e estes foram inoculados com quer soluçãosalina quer solução salina contendo adjuvante A.
O PS8 purificado foi revestido a 2 μg/mL em solução salinatamponada com fosfato (PBS) sobre placas de microtítulo de ligação alta(Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas comPBS-BSA 1% por 30 min na temperatura ambiente com agitação. Os anti-soros de camundongos foram pré-diluídos 1/100, então diluições adicionaisduplas foram realizadas em microplacas que foram incubadas a 37°C por 1hora. Após lavagem, anticorpo murino lavado foi detectado usando IgG(H+L) de Cabra Anti-Camundongo affiniPure conjugada com peroxidase deJackson ImmunoLaboratories inc. (ref: 115-035-003) diluída 1:5.000 emPBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por 30minutos na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4mg de OPD (Sigma) + 5 μL de H2O2 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M depH 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura ambiente. A reação foiinterrompida com 50 μί de HCl, e a densidade óptica foi lida a 490 nm emrelação a 650 nm.
Os resultados foram expressados em títulos de ponto-médio eo GMT foi calculado para 30 amostras (10 para controles). Os resultados sãomostrados em Tabela 14 abaixo.
Tabela 14
<table>table see original document page 94</column></row><table>
Grupos de 30 camundongos foram inoculadossubcutaneamente com conjugados de dPNAG-TT de S. aureus (contendodPNAG que estava entre 10% e 30% N-acetilado) em uma dose desacarídeo de 0,31 ^g em NaCl 200 mM, quer não-adjuvantado quercombinado com adjuvante A. Os camundongos receberam trêsinoculações nos dias 0, 14 e 28. No dia 41 ou 42 soro foi coletado doscamundongos e cada amostra de soro foi testada por ELISA para avaliar aresposta imune contra PNAG. Grupos de 10 camundongos foram usadosnos grupos de controle e estes foram inoculados com solução salina oucom apenas adjuvante.
Anti-PNAG ELISA:
PNAG purificado (2,5 μg/mL) misturado com HSA metilado(2,5 μg/mL) diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foirevestido sobre placas de microtítulo de ligação alta (Nunc Maxisorp) durantea noite a 4°C.
As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1%, 30 min naRT com agitação. Os anti-soros de camundongos foram pré-diluídos1/100, então diluições adicionais duplas foram feitas em microplacas eincubadas na temperatura ambiente com agitação por 1 hora. Apóslavagem, anticorpo murino lavado foi detectado usando IgG (H+L) deCabra Anti-Camundongo afflniPure conjugada com peroxidase de JacksonImmunoLaboratories inc. (ref: 115-035-003) diluída 1:5.000 em PBS-BSA 0,2%-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por30 minutos na temperatura ambiente com agitação. A cor foi reveladausando 4 mg de OPD (Sigma) + 5 μί de H2O2 por 10 mL de tampãocitrato 0,1 M de pH 4,5 por 15 minutos no escuro na temperaturaambiente. A reação foi interrompida com 50 μΐ. de HCl, e a densidadeóptica foi lida a 490 nm em relação a 650 nm.
Um GMT foi calculado para 30 amostras (10 para controles).
Tabela 15
<table>table see original document page 95</column></row><table>
Exemplo 11 Imunogenicidade de conjugados de PS*-TT Resultados
<table>table see original document page 95</column></row><table>Exemplo 12
Ensaio de opsonofagocitose.
O extermínio opsonofagocítica in vitro de S. aureus porleucócitos polimorfonucleares de humano (PMNs) é realizada como descritoem Xu et al. 1992 Infect. Immun. 60; 1358. PMNs de humano são preparadosde sangue heparinizado por sedimentação em dextrano T250 3%. A misturareacional opsônica (1 mL) contém ~ IO6 PMNs em meio RPMI 1640suplementado com 10% de soro fetal bovino termicamente inativado, -108CFU de S-aureus, e 0,1 mL de soro de teste ou de preparação de IgG. Soro decoelho hiper-imunizado é usado como um controle positivo, e 0,1 mL de sorode coelho não-imune foi usado como uma fonte completa para as amostras deIgG. As misturas reacionais são incubadas a 37°C, e amostras bacterianas sãotransferidas a 0, 60, e 120 min para dentro de água e subseqüentementediluídas, espalhadas sobre placas de ágar de soja tríptica, e inoculadas a 37°Cpara contagem bacteriana após incubação durante a noite.
Exemplo 13
Imunogenicidade de proteínas estafilocócicas emcamundongos e coelhos
Animais foram imunizados com proteínas estafilocócicaspurificadas com o propósito de gerar soros hiper-imunes. Camundongosforam imunizados três vezes (dias 0, 14 e 28) com 10 μg de cada uma dasproteínas adjuvantadas em Specol. Coelhos foram imunizados três vezes (dias0, 21 e 42) com 20 μg de cada uma das proteínas adjuvantadas em Specol.Soros imunes foram coletados e avaliados em ELISA de anti-células inteirasmortas e anti-proteína.
ELISA anti-proteína:
A proteína purificada foi revestida a 1 μg/mL em soluçãosalina tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de microtítulo de ligaçãoalta (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas comPBS-BSA 1%, por 30 min na RT com agitação. As amostras de teste foramentão diluídas 1/1.000 e incubadas na temperatura ambiente por 1 hora comagitação. Após lavagem, anticorpo de coelho ou murino foi detectado usandoIgG (H+L) de Cabra Anti-Camundongo AffiniPure conjugada comperoxidase (ref: 115-035-003) ou IgG (H+L) de Cabra Anti-CoelhoAffiniPure (ref: 11-035-003) de Jackson ImmunoLaboratories inc. diluída1:5000 em PBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por30 min. na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4mg de OPD (Sigma) + 5 μί H2O2 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de pH4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura ambiente. A reação foiinterrompida com 50 pL de HCl5 e a densidade óptica foi lida a 490 nm emrelação a 650 nm.
A O.D. para uma diluição de 1/1.000 de Pós III foi comparadacom a O.D. obtida com a mesma diluição de soros Pré-imunes.
Resultados gerados com soros de camundongos e de coelhossão apresentados em Figura 5. Uma soroconversão boa contra cada antígenofoi observada. Avaliação de soros direcionados contra SBI foi prejudicadadevido à atividade de ligação de Ig desta proteína.
ELISA anti-células inteiras mortas:
Células inteiras mortas (inativadas por calor ou formaldeído)de S. aureus tipos 5 e 8 ou S. epidermidis cepa Hay foram revestidas a 20μg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sobre placas demicrotítulo de ligação alta (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C comevaporação. As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1% 30 min natemperatura ambiente com agitação. Proteína A foi neutralizada pela adiçãode 10 μg/mL de Anti-Proteina A de Galinha Purificada por Afinidade (ICLref: CPA-65A-2) diluída em PBS-tween 0,05% seguido por incubação por 1hora na temperatura ambiente. As amostras de teste foram então diluídas duasvezes sobre a microplaca em PBS-0,05% a partir de uma diluição inicial a1/10 e incubadas por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. Apóslavagem, anticorpo de coelho ou murino foi detectado usando IgG (H+L) deCabra Anti-Camundongo AffmiPure conjugada com peroxidase (ref: 115-035-003) ou IgG (H+L) de Cabra Anti-Coelho AffmiPure (ref: 11-035-003)de Jackson ImmunoLaboratories inc. diluída 1:5000 em PBS-tween 0,05%.Os anticorpos de detecção foram incubados por 30 min. na temperaturaambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5μL H2O2 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de pH 4,5 for 15 minutos noescuro, na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 μL deHCl, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em relação a 650 nm.
Deve ser notado que os níveis de expressão de proteínas emestafilococos variarão dependendo das condições de cultura. Portanto umresultado negativo pode refletir a escolha de condições de cultura incorretasem vez de uma falta de imunogenicidade.
Os resultados usando soros de camundongos são mostrados emTabela 17 e alguns dos gráficos são mostrados em figura 6. Umreconhecimento fraco de S. aureus cepa 5 é observado com sorosdirecionados contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. Reconhecimento de S.aureus cepa 8 é apenas observado com soro direcionado contra Sbi.Reconhecimento fraco de S. epidermidis Hay é observado com sorosdirecionados contra Atl amidase, MRPII, IsdA, IsaA, Ebh, Aaa e Sbi.
Uma seleção de resultados gerados usando soros de coelho émostrada em figura 7 e resumida em Tabela 18. Reconhecimento muito bomdas três cepas foi observado com IsaA e IsdB. Um reconhecimento fraco dastrês cepas foi observado com HarA embora animais apenas receberam umainjeção em vez de três injeções usadas para as outras proteínas.
Tabela 17
<table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table>Tabela 18
<table>table see original document page 99</column></row><table>
Exemplo 14
Eficácia de combinações de proteínas estafilocócicas emum modelo de colonização nasal.
Quinze grupos de ratos de algodão foram inoculados comcombinações de oito antígenos estafilocócicos e cinco ratos de algodão queatuaram como controles não foram tratados com antígeno. Estes dezesseisgrupos são os seguintes:
Grupo 1 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, AAA5 alfa-toxina, SdrC,
SdrG5Ebh3SbiGrupo 2 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, IsdA, IsdB, CTfA, SdrC,Ebh, FnbpAGrupo 3 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, HarA, IsdA, MRPII, IsdB,AAA, alfa-toxinaGrupo 4 - Atl-glicosamina, HarA, IsdA, AAA, CTfA, IsaA, Ebh,Sbi
Grupo 5 - HarA, MRPI1, AAA, alfa-toxina, CTfA, SdrC, Ebh,FnbpA
Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, alfa-toxina, CT£\, SdrG, Sbi, FnbpA
Grupo 7 - Atl-aminidase, IsdA, MRPII, AAA, IsaA, SdrG, Ebh,FnbpA
Grupo 8 - Controle
Grupo 9 - Atl-glicosamina, IsdA, MRPII, alfa-toxina, IsaA, SdrC,Sbi5FnbpA
Grupo 10 - Atl-glicosamina, MRPII, IsdB, AAA, CTfA5 IsaA,SdrC, SdrG
Grupo 11- Atl-aminidase, MRPII, IsdB, alfa-toxina, CTfA, IsaA,Ebh5 Sbi
Grupo 12 - Atl-glicosamina, HarA5 IsdB5 alfa-toxina, IsaA, SdrG5Ebh5 FnbpA
Grupo 13 - Atl-amidase, HarA5 IsdB5 AAA5 IsaA5 SdrC5 Sbi5FnbpA
Grupo 14 -Atl-glicosamina, Atl-amidase, HarA, MRPII, CTfA,SdrG, Sbi, FnbpA
Grupo 15 - Atl-amidase, HarA, IsdA, alfa-toxina, CTfA, IsaA,SdfC, SdrG
Grupo 16 - HarA, IsdA, MRPII, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi
Cada mistura de antígenos continha 3 μg de cada antígenomisturados com um adjuvante feito de lipossomos contendo MPL e QS21. Osratos de algodão foram inoculados três vezes nos dias 1, 14 e 28 doexperimento. Duas semanas após inoculação, as eficácias das imunizaçõesforam ensaiadas usando um ensaio de colonização nasal como descrito emKokai-Kun et al. (2003) Antimicrob. Agents. Chemother. 47; 1589-1597.Análise de regressão linear múltipla clássica foi realizadasobre os dados usando programa de computador "Design Expert 6". Apresença de um antígeno foi codificada como +1 e a ausência de um antígenopor -1. Usando a equação do modelo foi possível determinar quais antígenosforam os antígenos chave que produziram um decréscimo grande no númerode colônias por nariz.
Resultados
Os resultados do ensaio de colonização nasal são mostradosem Tabela 19. O grupo de controle teve um logCFU/nariz médio de 3,51335 eum decréscimo em colonização nasal pôde ser visto para todos os grupos deratos de algodão com proteínas estafilocócicas. Grupos 4, 9 e 13 mostraram odecréscimo mais alto em colonização nasal com um decréscimo de mais de 2logs em CFU/nariz. Grupos 12 e 16 também deram bons resultados,mostrando um decréscimo de cerca de logs em CFU/nariz.
Tabela 19
<table>table see original document page 101</column></row><table>
A contribuição de antígenos específicos dentro da mistura deantígenos foi calculada usando análise de regressão múltipla dos dados decolonização nasal. O modelo final contém os sete melhores antígenos.Resultados para estes antígenos são mostrados em Tabela 20. Dentro docontexto da mistura de proteínas, a inclusão de HarA deu o decréscimo maisalto em colonização nasal, seguido por IsaA, Sbi, SdrC, autolisina-glicosamina, MRPII e Ebh.
Tabela 20 Efeitos em diferença de loqCFU/nariz e razão deCFU/nariz para os sete melhores antígenos no modelo e valores de ρcorrespondentes.
<table>table see original document page 102</column></row><table>

Claims (23)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 deS. aureu, em que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 estáentre 30% e 100% O-acetilado.
2. Composição imunogênica, caracterizado pelo fato decompreender oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 deS. aureus, em que o polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular de Tipo 8 estáentre 30% e 100% O-acetilado.
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular deTipo 5 está entre 30% e 100% O-acetilado.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender PNAGestafilocepa estafilocócica.
5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que o PNAG está menos do que 40% N-acetilado.
6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmenteoligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 1, e/ou Tipo II e/ou TipoIII de S. epidermidis.
7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de compreenderadicionalmente um antígeno 336 de S. aureus 336.
8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmenteuma proteína estafilocócica ou seu fragmento.
9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento éuma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupoconsistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,CTfA, SdrC, SdrD, SdrE5 SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,Fig e MAP.
10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-8, caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento éuma proteína transportadora selecionada do grupo consistindo detransportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportadorde Mg2+, SitC e transportador Ni ABC.
11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-8, caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento éuma toxina ou regulador de virulência selecionada do grupo consistindo dealfa-toxina (HIa), mutante H35R de alfa-toxina, proteína ativadora de RNA III (RAP).
12. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 8 a 11, caracterizada pelo fato de compreender 2 ou maisproteínas estafilocócicas selecionadas de pelo menos 2 grupos diferentesselecionados de:a) pelo menos uma proteína ligante de componenteextracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada dogrupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante desaliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD,SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-I,SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio,coagulase, Fig e MAP;b) pelo menos uma proteína transportadora estafilocepaestafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo detransportador imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportadorde Mg2+, SitC e transportador Ni ABC;c) pelo menos um regulador de virulência estafilocepaestafilocócica, toxina ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo dealfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina, proteína ativadora de RNA III(RAP).
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que um polissacarídeoestafilocepa estafilocócica está conjugado em um carreador protéico.
14. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 4 a 13, caracterizada pelo fato de que o PNAG estáconjugado em uma proteína carreadora.
15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora compreendeuma proteína estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupoconsistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,Fig, MAP, transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC,transportador de Mg , SitC e transportador Ni ABC, alfa-toxina (Hla),mutante H35R de alfa-toxina e proteína ativadora de RNA III (RAP).
16. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é toxóide detétano, toxóide de difteria, CRMl97, proteína D de Haemophilus influenzae,exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa, alfa-toxóide e pneumolisinapneumocepa estafilocócica.
17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicaçõesde 1 a 16, caracterizada pelo fato de que uma resposta imune é gerada contraambas S. aureus e S. epidermidis.
18. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender acomposição imunogênica como definida nas reivindicações 1 a 17 e umexcipiente farmaceuticamente aceitável.
19. Método para preparar a vacina, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de misturar a composição imunogênica como definidaem as reivindicações 1 a 18 e adicionar um excipiente farmaceuticamenteaceitável.
20. Método para prevenir ou tratar infecção estafilocócica,caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar a vacina comodefinida na reivindicação 18a um paciente em necessidade da mesma.
21. Uso da composição imunogênica como definida nasreivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura davacina para o tratamento ou a prevenção de infecção estafilocócica.
22. Processo para conjugar oligossacarídeo ou polissacarídeocapsular de Tipo 5 ou 8 de S. aureus, caracterizado pelo fato de compreenderas etapas de:a) dissolver o oligossacarídeo ou polissacarídeo de Tipo 5 ou 8em água ou em uma solução salina;b) adicionar um agente de cianilação (por exemplo CDAP)para formar um polissacarídeo ou oligossacarídeo ativado;c) adicionar uma proteína carreadora de modo que gruposamino reajam com o polissacarídeo ativado para formar uma ligaçãocovalente de isouréia.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 estáentre 30% e 100% O-acetilado.
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