EA015833B1 - Иммуногенная композиция - Google Patents

Иммуногенная композиция Download PDF

Info

Publication number
EA015833B1
EA015833B1 EA200801839A EA200801839A EA015833B1 EA 015833 B1 EA015833 B1 EA 015833B1 EA 200801839 A EA200801839 A EA 200801839A EA 200801839 A EA200801839 A EA 200801839A EA 015833 B1 EA015833 B1 EA 015833B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
immunogenic composition
alpha
toxin
staphylococcal
Prior art date
Application number
EA200801839A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801839A1 (ru
Inventor
Филипп Деноэль
Жан Пулман
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0606416A external-priority patent/GB0606416D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200801839A1 publication Critical patent/EA200801839A1/ru
Publication of EA015833B1 publication Critical patent/EA015833B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]

Abstract

Изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим капсулярный полисахарид или олигосахарид из S. aureus типа 5 и/или 8 с О-ацетилированием на 30-100%. Описаны также вакцины, способы лечения с использованием иммуногенной композиции, содержащей капсулярные полисахариды типа 5 и/или 8 с О-ацетилированием на 30-100%, и способы изготовления иммуногенной композиции, содержащей капсулярные полисахариды типа 5 и/или 8 с О-ацетилированием на 30-100%.

Description

Изобретение относится к области стафилококковых иммуногенных композиций и вакцин, к их изготовлению и к применению таких композиций в медицине. Более конкретно, оно относится к вакцинным композициям, содержащим полисахариды из 8. аигеик типа 5 и/или 8, в которых степень Оацетилирования составляет 30-100%. Предложены также способы лечения или предупреждения стафилококковых инфекций с использованием таких вакцин.
Предшествующий уровень техники
В связи с тем, что все больше используются внутрисосудистые устройства, в последние годы увеличивается количество вне- и внутрибольничных инфекций. Внутрибольничные (нозокомиальные) инфекции представляют собой основную причину заболеваемости и смертности, в частности в США, где они ежегодно поражают более 2 миллионов пациентов. Согласно различным исследованиям приблизительно 6% пациентов в США поражаются инфекцией во время их нахождения в больнице. В 1992 году экономическое бремя в США составило более 4,5 миллиардов долларов (Ешоп аиб Саупек, 1993, С1ш. М1сгоЫо1. Веу. 6; 428). Наиболее частыми инфекциями являются инфекции мочевых путей (ϋΤΙ - 33% от общего количества инфекций), за ними следует пневмония (15,5%), инфекции в месте хирургического вмешательства (14,8%) и первичные инфекции системы кровообращения (13%) (Ешоп апб Саупек, 1993, С11п. М1сгоЫо1. Веу. 6; 428).
81арйу1ососсик аигеик, коагулазонегативные стафилококки (в основном 81арйу1ососсик ер1бегт1б1к), Еп1егососсик крр, ЕкйепсЫа со11 и Ркеиботопак аегидшока являются основными нозокомиальными патогенами. Хотя эти патогены вызывают почти одинаковое количество инфекций, тяжесть вызываемых ими расстройств в совокупности с частотой изолятов, резистентных к антибиотикам, склоняет чашу весов в сторону 8. аигеик и 8. ер1бегт1б1к как наиболее важных нозокомиальных патогенов.
81арйу1ососсик аигеик чаще всего является причиной нозокомиальных инфекций со значительной заболеваемостью и смертностью (Вошего-У1уак е! а1 1995, 1пГес1. Όίκ. 21; 1417). Он является причиной ряда случаев остеомиелита, эндокардита, септического артрита, пневмонии, абсцессов и синдрома токсического шока.
8. ер1бегт1б18 представляет собой нормальный кожный комменсал, который также является важным оппортунистическим патогеном, ответственным за инфекции имплантируемых медицинских устройств и инфекции в месте хирургического вмешательства. Медицинские устройства, инфицированные 8. ер1бегт1б18, включают сердечные кардиостимуляторы, шунты спинномозговой жидкости, катетеры для непрерывного амбулаторного перитонеального диализа, ортопедические устройства и искусственные клапаны сердца.
Инфекции 8. аигеик и 8. ер1бегш1б1к лечат антибиотиками, причем лекарственным средством выбора является пенициллин, а ванкомицин используют в случае изолятов, чувствительных к метициллину. Процентная доля стафилококковых штаммов, демонстрирующих широкий спектр резистентности к антибиотикам, увеличивается с 1980-х годов (РапШо е! а1 1992, 1пГес!. Соп1го1. Нокр. Ер1бетю1. 13; 582), ставя под угрозу эффективную антимикробную терапию. Кроме того, недавнее появление штамма 8. аигеик, резистентного к ванкомицину, вызывает опасения, что возникнут и распространятся штаммы 8. аигеик, резистентные к метициллину, в отношении которых эффективная терапия недоступна.
Был исследован альтернативный подход к использованию антител против стафилококковых антигенов в пассивной иммунотерапии. Разрабатывается терапия, включающая введение поликлональных антисывороток (\νϋ 00/15238, \νϋ 00/12132), а также лечение моноклональным антителом против липотейхоевой кислоты (\νϋ 98/57994).
Альтернативным подходом может быть применение активной вакцинации для формирования иммунного ответа против стафилококков. Идентифицированы несколько кандидатов для включения в качестве вакцинных компонентов. Они включают фибронектинсвязывающий белок (И8 5840846), аналог главного комплекса гистосовместимости МНС II (И8 5648240), фибриногенсвязывающий белок (И8 6008341), СеЮ (И8 2002/0169288), коллагенсвязывающий белок (И8 6288214), 8бгЕ, 8бгС и 8бгН (\νϋ 00/12689), мутантные экзотоксины 8ЕА и 8ЕВ (\νϋ 00/02523) и витронектинсвязывающий белок с молекулярной массой 52 кДа (\νϋ 01/60852).
Геном 8. аигеик секвенирован, и множество кодирующих последовательностей идентифицировано (ЕР 786519, νθ 02/094868). То же самое справедливо для 8. ер1бегт1б1к (\νϋ 01/34809). В продолжение этого подхода, другие исследователи идентифицировали множество белков, которые распознаются гипериммунными сыворотками от пациентов, страдающих стафилококковой инфекцией (\νϋ 01/98499, νθ 02/059148).
Первое поколение вакцин против 8. аигеик или против экзобелков, которые он продуцирует, были удовлетворительными с ограниченным успехом (Бее 1996 Тгепбк МюгоЫо1. 4; 162). Потребность в разработке эффективных вакцин против стафилококковых инфекций остается.
Описание графических материалов
Фиг. 1 - полипептидные последовательности белков для включения в иммуногенную композицию. В табл. 1 приведена информация о том, какой белок представлен каждой 8ЕС Ш.
Фиг. 2 - нуклеотидные последовательности, кодирующие белки для включения в иммуногенную
- 1 015833 композицию. В табл. 1 приведена информация о том, какой белок кодируется каждой 8ΕΟ Ш.
Фиг. 3 - очистка альфа-токсина в нативных условиях. Блок А демонстрирует окрашенный кумасси гель после 8Ό8-ΡΑΟΕ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) образцов, полученных в процессе очистки альфа-токсина. Полоса 1 - маркеры молекулярной массы, полоса 2 - растворимая фракция, содержащая сверхэкспрессированный альфа-токсин, полоса 3 - поток через колонку Νί-ΝΤΑ, полоса 4 - фракции, элюируемые 10% буфером В, полоса 5 - фракции, элюируемые 20% буфером В, полоса 6 - фракции, элюируемые 30% буфером В, полоса 7 - фракции, элюируемые 50% буфером В, полоса 8 - фракции, элюируемые 75% буфером В, полосы 9 и 10 - фракции, элюируемые 100% буфером В, полоса 11 - бактерии в момент Т=0 перед индукцией, полоса 12 -бактерии в момент Т=4 ч после индукции, полоса 13 - клеточный лизат, полоса 14 - растворимая фракция, полоса 15 - нерастворимая фракция.
Блок В демонстрирует окрашенный кумасси гель после 8Э8-РАСЕ 10, 5, 2 и 1 мкл очищенного альфа-токсина.
Фиг. 4 - очистка 8йгС в денатурирующих условиях. Блок А демонстрирует окрашенный кумасси гель после 8Э8-РАСЕ образцов, полученных в процессе очистки альфа-токсина. Полоса М - маркеры молекулярной массы, полоса Старт - супернатант, отделенный от нерастворимой фракции, содержащей сверхэкспрессированный 8ФС. полоса ΕΤ1 - поток через колонку Νί-ΝΤΑ, полоса С - фракции, элюируемые промывочным буфером С, полоса Ό - фракции, элюируемые буфером Ό, полоса Е - фракции, элюируемые буфером Е. Блок В демонстрирует окрашенный кумасси гель после 8Ό8-ΡΑΟΕ 1, 2, 5 и 10 мкл очищенного 8йтС.
Фиг. 5 - результаты ЕБ18Л (твердофазный иммуноферментный анализ) для антисывороток против стафилококковых белков в планшетах, покрытых очищенными белками. Мышиный пул до - результат с использованием объединенных сывороток, полученных от мышей до инокуляции. Мышиный пул после III - результат с использованием объединенных сывороток, полученных от мышей после иммунизации. Кроличий пул до - результат с использованием объединенных сывороток, полученных от кроликов до инокуляции. Кроличий пул после III - результат с использованием объединенных сывороток, полученных от кроликов после иммунизации. Контр. - отрицательный контроль.
Фиг. 6 - результаты ΕΗ8Α для мышиных антисывороток, полученных против стафилококковых белков в планшетах, покрытых убитыми стафилококками. Блок А - использованы планшеты, покрытые убитыми целыми клетками 8. аигеик серотипа 5. Блок В - использованы планшеты, покрытые убитыми целыми клетками 8. аигеик серотипа 8. Блок С - использованы планшеты, покрытые убитыми целыми клетками 8. ерИегтИк. Линия с квадратиками показывает результат ΕΟ8Α с использованием антисывороток от мышей, трижды подвергнутых иммунизации указанным стафилококковым белком. Линия с ромбиками показывает результат ΕΗ8Α для неиммунных мышиных сывороток.
Фиг. 7 - результаты ΕΟ8Α для кроличьих антисывороток, полученных против стафилококковых белков в планшетах, покрытых убитыми стафилококками. Блок А - использованы планшеты, покрытые убитыми целыми клетками 8. аигеик серотипа 5. Блок В - использованы планшеты, покрытые убитыми целыми клетками 8. аигеик серотипа 8. Блок С - использованы планшеты, покрытые убитыми целыми клетками 8. ерПеттИк.
Линия с квадратиками показывает результат ΕΟ8Α с использованием антисывороток от кроликов, трижды подвергнутых иммунизации указанным стафилококковым белком (за исключением Η^τΑ, где была сделана только одна иммунизация). Линия с ромбиками показывает результат ΕΟ8Α для неиммунных кроличьих сывороток.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении раскрыты иммуногенные композиции, содержащие полисахариды из 8. аигеик типа 5 и/или 8, где капсулярный полисахарид или олигосахарид типа 5 и/или типа 8 Оацетилирован на 30-100%. В конкретных воплощениях иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит ΡΝΑΟ (поли-Ы-ацетилированный глюкозамин) или стафилококковый(ые) белок(белки). ΡΝΑΟ является высококонсервативным у грамположительных бактерий и обеспечивает защиту против широкого спектра бактерий, тогда как полисахариды типа 5 и типа 8 являются мощными иммуногенами, которые вызывают иммунный ответ против большинства штаммов 8. аитеик, которые чаще всего являются причиной нозокомиальной инфекции.
Полисахариды
Иммуногенные композиции по изобретению содержат ΡΝΑΟ и полисахариды из 8. аигеик типа 5 и типа 8, каждый из которых или оба О-ацетилированы на 30-100%.
Поли-Х-ацетилированный глюкозамин (ΡΝΛΟ)
ΡΝΑΟ представляет собой полисахаридный межклеточный адгезии и состоит из полимера β-(1 ^-6)связанного глюкозамина, возможно замещенного Ν-ацетильным и/или О-сукцинильным составляющими. Этот полисахарид присутствует как в 8. аитеик, так и в 8. ерИеттИк и может быть выделен из любого источника (1оусе е! а1 2003, СатЬойуйга!е Векеагсй 338; 903; Майа-БИгаи е! а1 2002, Шее!. Итт. 70; 4433). Например, ΡΝΑΟ может быть выделен из штамма МЕ8т 8. аигеик (АО 04/43407). Получение άΡΝΑΟ описано в АО 04/43405.
- 2 015833
Недавно было показано, что полисахарид, ранее известный как поли-Ы-сукцинил-в-(1 ^-6)глюкозамин (ΡΝ8Ο), не имеет ожидаемую структуру, поскольку идентификация Ν-сукцинилирования не была корректной (Майа-ййгап е! а1. 2002, 1пГес1. 1тип. 70; 4433). Поэтому полисахарид, который формально известен как ΡΝ8Ο и, как теперь установлено, представляет собой ΡΝΑΟ, также охвачен термином ΡΝΑΟ.
ΡΝΑΟ может быть разных размеров, варьирующих от свыше 400 кДа до 75-400 кДа, до 10-75 кДа, до олигосахаридов, состоящих из вплоть до 30 повторяющихся звеньев (3-('1и6)-связанный глюкозамин, возможно замещенный Ν-ацетильным и О-сукцинильным составляющими). В иммуногенной композиции по изобретению может быть использован полисахарид или олигосахарид ΡΝΆΟ любого размера, например размером свыше 40 кДа. Нужного размера можно достичь любым способом, известным в данной области, например микрофлюидизацией, обработкой ультразвуком или химическим расщеплением (МО 03/53462, ЕР 497524, ЕР 497525).
Диапазоны размеров ΡΝΑΟ составляют, например, 40-400 кДа, 50-350 кДа, 40-300 кДа, 60-300 кДа, 50-250 кДа и 60-200 кДа.
ΡΝΑΟ может иметь разную степень ацетилирования в результате замещения ацетатом по аминогруппам. ΡΝΑΟ, продуцируемый ΐη уйго, почти полностью замещен по аминогруппам (95-100%).
Альтернативно, может быть использован деацетилированный ΡΝΑΟ с Ν-ацетилированием менее чем на 50, 40, 30, 20, 10 или 5%. Использование деацетилированного ΡΝΑΟ обеспечивает опсонический киллинг грамположительных бактерий, возможно 8. аигеиз и/или 8. е]ж1егпш118 (МО 04/43405). В одном воплощении ΡΝΑΟ имеет размер от 40 до 300 кДа и деацетилирован так, что менее 50, 40, 30, 20, 10 или 5% аминогрупп Ν-ацетилированы.
В одном из воплощений ΡΝΑΟ не О-сукцинилирован или О-сукцинилирован менее чем по 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 или 0,1% остатков.
Термин деацетилированный ΡΝΑΟ (άΡΝΑΟ) относится к полисахариду или олигосахариду ΡΝΑΟ, в котором менее 50, 40, 30, 20, 10 или 5% аминогрупп ацетилированы.
Используемый здесь термин ΡΝΑΟ охватывает как ацетилированные, так и деацетилированные формы сахарида.
В одном из воплощений ΡΝΑΟ деацетилирован с образованием άΡΝΑΟ химической обработкой нативного полисахарида. Например, нативный ΡΝΑΟ обрабатывают основным раствором до повышения рН до более 10. Например, ΡΝΑΟ обрабатывают 0,1-5М, 0,2-4М, 0,3-3М, 0,5-2М, 0,75-1,5М или 1М \аО11, КОН или ΝΗ4ΟΗ. Обработку проводят в течение по меньшей мере 10 или 30 мин или 1, 2, 3, 4, 5,10, 15 или 20 ч при температуре 20-100, 25-80, 30-60 или 30-50 или 35-45°С. άΡΝΑΟ может быть получен как описано в МО 04/43405.
В одном из воплощений полисахарид(ы), входящий(ие) в состав иммуногенной композиции по изобретению, конъюгирован(ы) с белком-носителем как описано ниже или, альтернативно, не конъюгирован(ы).
Полисахариды из 8. аигеиз типа 5 и типа 8
Большинство штаммов 8. аигеиз, вызывающих инфекцию у человека, содержат полисахариды типа 5 или типа 8. Приблизительно 60% человеческих штаммов представляют собой штаммы типа 8 и приблизительно 30% представляют собой штаммы типа 5. Структуры антигенов капсулярных полисахаридов типа 5 и типа 8 описаны в Могеаи е! а1 СагЬоЬуОиИе Кез. 201; 285 (1990) и Еоит1еге1 а1 Ю'есТ 1ттип. 45; 87 (1984). Оба имеют ΕисNΑср в их повторяющейся структурной единице, а также МаηNΑсΑ, которые могут быть использованы для введения сульфгидрильной группы.
Недавно (1опез СагЬо11Ус!га1е Кезеагсй 340, 1097-1106 (2005)) методом ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектроскопии структура капсулярных полисахаридов была скорректирована:
Тип 5
->4)-β-ϋ-Μ3ηΝΑοΑ-(1 -+4)-α-Ι_-ΕιιοΝΑο(30Αο)-(1 -+3)-β-ϋ-ΕυοΝΑο-(1 -»
Тип 8
->3)- 3-О-МапЫАсА(4ОАс)-(1 ^-3)- а4_-ГисМАс(1-»3)- а-О-ЕисЫАс(1н>
Полисахариды могут быть экстрагированы из соответствующего штамма 8. аигеиз способами, общеизвестными специалистам в данной области, например способами, описанными в И8 6294177 или 1пбесйоп аηά 1ттиш(у (1990) 58(7); 2367. Например, АТСС 12902 представляет собой штамм 8. аигеиз типа 5, и АТСС 12605 представляет собой штамм 8. аигеиз типа 8.
Полисахариды имеют нативный размер или, альтернативно, их размер может быть изменен, например микрофлюидизацией, обработкой ультразвуком или химической обработкой. Изобретение также охватывает олигосахариды, производные полисахаридов 8. аигеиз типа 5 и 8.
Капсулярный полисахарид или олигосахарид типа 5 и/или 8, входящий иммуногенную композицию по изобретению, О-ацетилирован. В одном из воплощений степень О-ацетилирования капсулярного полисахарида или олигосахарида типа 5 составляет 10-100, 20-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 50-90, 60-90, 70-90 или 80-90. В одном из воплощений степень О-ацетилирования капсу
- 3 015833 лярного полисахарида или олигосахарида типа 8 составляет 10-100, 20-100, 30-100, 40-100, 50-100%. 60100, 70-100, 80-100, 90-100, 50-90, 60-90, 70-90 или 80-90%. В одном из воплощений степень Оацетилирования капсулярных полисахаридов или олигосахаридов типа 5 и типа 8 составляет 10-100, 20100, 30-100, 40-100, 50-100. 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 50-90, 60-90, 70-90 или 80-90%.
Степень О-ацетилирования полисахарида или олигосахарида может быть определена любым методом, известным в данной области, например методом протонного ЯМР (Ьетегс1шег апб 1опс5 1996, СагЬойубШе Яекеатсй 296; 83-96, 1опе5 апб Ьетегшшег 2002, 1 Рйаттасеи11са1 апб Вютебюа1 апа1у8Щ 30; 1233-1247, \νϋ 05/033148 или XVО 00/56357). Еще один широко используемый метод описан в НеЛпп (1949) 1. В1о1. Сйет. 180; 249-261.
О-Ацетильные группы могут быть удалены гидролизом, например обработкой основанием, таким как безводный гидразин (Копаби е! а1 1994; 1п1ес1. 1ттип. 62; 5048-5054) или обработкой 0,1 н. ЫаОН в течение 1-8 ч. Для поддержания высоких уровней О-ацетилирования полисахарида или олигосахарида типа 5 и/или 8 обработки, которые могут привести к гидролизу О-ацетильных групп, минимизируют. Например, минимизируют обработку при экстремальных значениях рН.
Полисахариды типа 5 и 8, входящие в иммуногенную композиция по изобретению, возможно конъюгированы с белком-носителем как описано ниже или, альтернативно, не конъюгированы.
Иммуногенные композиции по изобретению альтернативно содержат полисахарид либо типа 5, либо типа 8.
Антиген 336 8. аигеиз
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит антиген 336 8. аитеик, описанный в И8 6294177.
Антиген 336 содержит β-связанный гексозамин, не содержит О-ацетильные группы и специфически связывается с антителами против 8. аитеик типа 336, депонированными в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 55804.
В одном из воплощений антиген 336 представляет собой полисахарид, который имеет нативный размер или, альтернативно, его размер может быть изменен, например микрофлюидизацией, обработкой ультразвуком или химической обработкой. Изобретение также охватывает олигосахариды, получаемые из антигена 336.
Антиген 336, будучи включенным в иммуногенную композицию по изобретению, возможно конъюгирован с белком-носителем как описано ниже или, альтернативно, не конъюгирован.
Полисахариды из 8. ерШегшШЬ типа I, II и III
Штаммы АТСС-31432, 8Е-360 и 8Е-10 8. ер|бепшб15 характерны для трех разных капсулярных типов, I, II и III соответственно (1сЫтап апб УокЫба 1981, 1. Арр1. Вас1епо1. 51; 229). Капсулярные полисахариды, экстрагированные из каждого серотипа 8. ер|бепшб15. являются полисахаридами типов I, II и III. Полисахариды могут быть экстрагированы несколькими способами, в том числе способом, описанным в И8 4197290, или как описано в КЫтаи е! а1 1991, 1. Арр1. Вас1епо1. 71; 176.
В одном из воплощений изобретения иммуногенная композиция содержит полисахариды или олигосахариды из 8. ер|бепшб15 типа I, и/или II, и/или III.
Полисахариды имеют нативный размер, или, альтернативно, их размер может быть изменен, например микрофлюидизацией, обработкой ультразвуком или химическим расщеплением. Изобретение также охватывает олигосахариды, экстрагированные из штаммов 8. ер|бепшб15.
Эти полисахариды не конъюгированы или возможно конъюгированы как описано ниже.
Конъюгирование полисахаридов
Среди проблем, связанных с использованием полисахаридов в вакцинации, существует проблема, заключающаяся в том, что полисахариды сами по себе являются плохими иммуногенами. Стратегии, разработанные для преодоления этой недостаточной иммуногенности, включают связывание полисахарида с крупными белками-носителями, которые обеспечивают неспецифическую Т-клеточную помощь. В одном из воплощений полисахариды, используемые в изобретении, связаны с белком-носителем, который обеспечивает неспецифическую Т-клеточную помощь. Примеры этих носителей, которые могут быть использованы для связывания с полисахаридными или олигосахаридными иммуногенами, включают дифтерийный и столбнячный анатоксины (ИТ, ИТ Сгт197 и ТТ), гемоцианин лимфы улитки (КИН), экзопротеин А Ркеиботопак аетидшока (гЕРА) и очищенное белковое производное туберкулина (РРИ), белок И из НаеторЫ1и8 шПиепхае, пневмолизин или фрагменты любого из вышеуказанных. Фрагменты, подходящие для использования, включают фрагменты, охватывающие Т-хелперные эпитопы. В частности, фрагмент белка И возможно будет содержать Ν-концевую 1/3 белка. Белок И представляет собой белок НаеторЫ1и8 (пПиепхае, связывающий !дИ (ЕР 0594610 В1).
Альтернативный белок-носитель для использования в иммуногенной композиции по изобретению представляет собой единичный стафилококковый белок или его фрагмент или слитый белок, содержащий по меньшей мере или точно 1, 2, 3 или 4 или более стафилококковых белков или их фрагментов, перечисленных в приведенном ниже разделе.
Новый белок-носитель, который может быть особенно предпочтительным для применения в контексте стафилококковой вакцины, представляет собой стафилококковый альфа-анатоксин. Нативная
- 4 015833 форма может быть конъюгирована с полисахаридом, поскольку процесс конъюгации снижает токсичность. Возможно, генетически детоксифицированный альфа-токсин, такой как варианты Н1к35Ьеи или Ηίκ 35 Лтд, используют в качестве носителя, поскольку остаточная токсичность ниже. Альтернативно, альфа-токсин химически детоксифицируют путем обработки поперечно-связывающим реагентом, формальдегидом или глутаральдегидом. Генетически детоксифицированный альфа-токсин возможно химически детоксифицирован, возможно путем обработки поперечно-связывающим реагентом, формальдегидом или глутаральдегидом, для дополнительного снижения токсичности.
Полисахариды могут быть связаны с белком(ами)-носителем(ями) любым известным способом (например, как описано Ык1н1е в патенте США 4372945, Агтог е1 а1. в патенте США 4474757, \УО и 1епптдк е1 а1. в патенте США 4356170). Возможно, осуществляют химическое конъюгирование с использованием СПАР (см. \\'О 95/08348).
Цианилирующий реагент 1-циано-диметиламинопиридиния тетрафторборат (СЭАР) возможно используют для синтеза конъюгатов полисахарид-белок. Реакция цианилирования может быть осуществлена в относительно мягких условиях, которые позволяют избежать гидролиза чувствительных к щелочам полисахаридов. Этот синтез делает возможным прямое связывание с белком-носителем.
Полисахарид может быть солюбилизирован в воде или физиологическом растворе. СО АР может быть растворен в ацетонитриле и сразу добавлен к раствору полисахарида. СЭАР взаимодействует с гидроксильными группами полисахарида с образованием цианатного эфира. После стадии активации добавляют белок-носитель. Аминогруппы лизина взаимодействуют с активированным полисахаридом с образованием изомочевинной ковалентной связи. После реакции сочетания затем добавляют большой избыток глицина, чтобы заблокировать остаточные активированные функциональные группы. Продукт затем пропускают через колонку для гельпроникающей хроматографии для удаления непрореагировавшего белка-носителя и остаточных реагентов.
Белки
Иммуногенная композиция по изобретению возможно дополнительно содержит стафилококковый белок, например белок из 8. аитеик или 8. ер1йетт1й1к. Некоторые воплощения по изобретению содержат белки и из 8. аигеик, и из 8. ер1йетт1й1к.
Иммуногенные композиции по изобретению содержат выделенный белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность, возможно по меньшей мере 90%-ную идентичность, по меньшей мере 95%-ную идентичность, по меньшей мере 9799%-ную или полную идентичность с любой последовательностью, представленной на фиг. 1.
Если в данном описании конкретно упоминается белок, то он возможно относится к рекомбинантному полноразмерному белку или возможно зрелому белку, в котором удалена любая сигнальная последовательность. Белок может быть выделен непосредственно из стафилококкового штамма или может быть получен по технологии рекомбинантных ДНК. В иммуногенную композицию по изобретению могут быть включены иммуногенные фрагменты белка. Они представляют собой фрагменты, содержащие по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот, поменьшей мере 40 аминокислот, по меньшей мере 50 аминокислот или по меньшей мере 100 аминокислот, взятые последовательно из аминокислотной последовательности этого белка. Кроме того, такие иммуногенные фрагменты типично иммунологически реакционноспособны с антителами, вырабатываемыми против стафилококковых белков, или с антителами, вырабатываемыми в результате инфицирования хозяина-млекопитающего стафиллококками, или содержат Т-клеточные эпитопы. В одном из воплощений иммуногенные фрагменты также включают фрагменты, которые при введении в эффективной дозе (либо сами по себе, либо в виде гаптена, связанного с носителем), вызывают защитный иммунный ответ против стафилококковой инфекции, возможно защитный против инфекции 8. аитеик и/или 8. ер1ЙетнЙ15. Такой иммуногенный фрагмент может включать, например, белок без Ν-концевой лидерной последовательности, и/или трансмембранный домен, и/или С-концевой заякоривающий домен. В одном из воплощений иммуногенный фрагмент по изобретению содержит, по существу, весь внеклеточный домен белка, который имеет по меньшей мере 85, 90, 95, 97 или 99%-ную идентичность с последовательностью, выбранной из последовательностей, представленных на фиг. 1, по всей длине последовательности фрагмента.
В одном из воплощений иммуногенные композиции по изобретению могут содержать слитые белки стафилококковых белков или фрагменты стафилококковых белков. Такие слитые белки могут быть получены рекомбинантно и могут содержать одну часть по меньшей мере из 2, 3, 4, 5 или 6 стафилококковых белков, например комбинации стафилококковых белков, перечисленных ниже. Альтернативно, слитый белок может содержать множество частей из по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 стафилококковых белков. Они могут представлять собой комбинацию разных стафилококковых белков или их фрагментов в одном и том же белке. Альтернативно, изобретение также охватывает индивидуальные слитые белки из стафилококковых белков или их фрагментов, такие как слитый белок с гетерологичными последовательностями, такими как провайдер Т-клеточных эпитопов или метки очистки, например β-галактозидазу, глутатион-8-трансферазу, зеленые флуоресцентные белки (СЕР), эпитопные метки, такие как ГЬАС, тус 1ад. полигистидин, или вирусные поверхностные белки, такие как гемагглютинин вируса гриппа, или бакте
- 5 015833 риальные белки, такие как столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, СКМ197. Слитый белок может присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в виде свободного белка, или он может представлять собой белок-носитель, связанный с сахаридом.
Белки
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более белков, упомянутых ниже, или их иммуногенные фрагменты. Многие белки попадают в категории белков, связывающихся с внеклеточными компонентами, белков-транспортеров или токсинов и регуляторов вирулентности. Иммуногенная композиция по изобретению возможно дополнительно содержит стафилококковый белок, связывающийся с внеклеточным компонентом, или стафилококковый белок-транспортер, или стафилококковый токсин, или регулятор вирулентности. Иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит по меньшей мере или точно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 стафилококковых белков.
Таблица 1
В приведенной ниже таблице указаны номера 8ЕР ΙΌ предпочтительных белковых последовательностей и последовательностей ДНК, которые находятся соответственно на фиг. 1 и 2. 8А обозначает последовательность 8. аигеиз, а 8Е обозначает последовательность 8. ер1бегш1б18.
Название Белковая последовательность Последовательность ДНК
Иммунодоминантный АВС транспортер
ЗА 8ΕΩ ΙΟ 1 8ΕΩ ГО 34
8Е 8ΕΩ 10 2 6ΕΩ ГО 35
Рецептор ламинина
ЗА 8ΕΩ Ю 3 8ΕΩ ГО 36
ЗЕ 8ΕΩ 10 4 8ΕΩ ГО 37
Секреторный антиген А ЗваА 5А1
5А2 8ΕΩ Ю 5 8ΕΩ ГО 38
ЗЕ 8ΕΩ Ю 6 3ΕΩ ГО 39
8ΕΩ Ю 7 8ΕΩ ГО 40
ЗйС
ЗА 8ΕΩ Ю 8 8ΕΩ Ю41
ЗЕ 8ΕΩ Ю 9 3ΕΩ Ю42
1баА/Р|£А(188А)
ЗА 8ΕΩ ГО 10 8ΕΩ ГО 43
ЗЕ 8ΕΩ Ю 11 8ΕΩ Ю44
ЕЫ1А/В
ЗА ЕЬНА 8ΕΩΙΟ12 8ΕΩ Ю45
ЗА ЕЬЫЗ 8ΕΩΙΟ13 8ΕΩ ГО 46
ЗЕ ЕЬНА 8ΕΩ Ю 14 8ΕΩ Ю47
ЗЕ ЕЫ1В 8ΕΩ Ю 15 8ΕΩ ГО 48
Ассоциирующийся с аккумуляцией белок Аар
ЗА 8ΕΩ ГО 16 8ΕΩ Ю49
ЗЕ 8ΕΩ Ю 17 8ΕΩ ГО 50
ΗΝΑ III активирующий белок НАР
ЗА 8ΕΩ Ю 18 8ΕΩ ГО 51
ЗЕ 8ΕΩ Ю 19 8ΕΩ ГО 52
Е1С/8с1гС
ЗА 8ΕΩ ГО 20 8ΕΩ ГО 53
ЗЕ 8ΕΩ ГО 21 8ΕΩ ГО 54
Эластинсвязывающий белок ЕЬрЗ ЗА
ЗЕ 8ΕΩ Ю 22 8ΕΩ ГО 55
8ΕΩ Ю 23 8ΕΩ ГО 56
Внеклеточный белок ЕРВ ЗА 8ΕΩ Ю 24 8ΕΩ Ю 57
альфа-токсин ЗА 8ΕΩ Ю 25 8ΕΩ ГО 58
8ΒΙ ЗА 8ΕΩ Ю 26 8ΕΩ ГО 59
130А ЗА 8ΕΩ Ю 27 8ΕΩ ГО 60
ΙδάΒ ЗА 8ΕΩ Ю 28 8ΕΩ ГО 61
8с1гС ЗА 6ΕΩ ГО 29 8ΕΩ ГО 62
СНА ЗА 8ΕΩ ГО 30 8ΕΩ ГО 63
ЕпЬА ЗА 8ΕΩ ГО 31 8ΕΩ ГО 64
СИВ ЗА 8ΕΩ ГО 32 8ΕΩ ГО 65
Коагулаза ЗА 8ΕΩ ГО 33 8ΕΩ ГО 66
РпЬВ ЗА 8ΕΩ ГО 67 8ΕΩ ГО 77
МАР ЗА 8ΕΩ Ιϋ .68 8ΕΩ ГО 78
НагА ЗА 8ΕΩ ГО 69 8ΕΩ ГО 79
Аутолизин глюкозаминидаза ЗА 8ΕΩ ГО 70 8ΕΩ ГО 80
Аутолизин амидаза ЗА 8ΕΩ 10 71 8ΕΩ ГО 81
ЕЬЬ фрагмент ЗА 8ΕΩ ГО 72 8ΕΩ Ю 82
Аутолизин Αηΐ ЗА 8ΕΩ ГО 73 8ΕΩ ГО 83
ЗбгС ЗА 8ΕΩ ГО 74 8ΕΩ ГО 84
МИРИ ЗА 8ΕΩ ГО 75 8ΕΩ ГО 85
8с1гС ЗА 8ΕΩ ГО 76 8ΕΩ ГО 86
8с1гЕ ЗА 8ΕΩ ГО 87 8ΕΩ ГО 88
бдЮ ЗА 8ΕΩ Ю 89 8ΕΩ ГО 90
ЗавР ЗА 8ΕΩ ГО 91 8ΕΩ ГО 92
- 6 015833
Белки, связывающиеся с внеклеточными компонентами
Белки, связывающиеся с внеклеточными компонентами, представляют собой белки, которые связываются с внеклеточными компонентами хозяина. Этот термин охватывает адгезины, но не ограничивается ими.
Примеры белков, связывающихся с внеклеточными компонентами, включают рецептор ламинина (Νηίάιι е! а1 1. Меб. МюгоЬюк 1992, 36; 177), 81!С/Мп!С/связывающий белок слюны (И8 5801234, ХУбЫиге апб Роз!ег 1пГес. 1ттип. 2001, 69; 5198), ЕЬкА (АУПНапъ е! а1 1пГес1. 1ттип. 70; 6805), ЕЬкВ, эластинсвязывающий белок (ЕЬр8) (Рагк е! а1 1999, 1. Вю1. Сйет. 274; 2845), ЕРВ (ΡΙΒ) (ЛУаЯГеИ апб Р1оск 1995, 1. С11п. МюгоЬюк 33; 2347), 8ΒΙ (7капд е! а1 РЕМ8 1ттип. Меб. МюгоЬюк 2000, 28; 211), аутолизин (Вирр е! а1 2001, 1. 1пГес!. ϋΐδ. 183; 1038), С1ГА (И8 6008341, \1с1)е\П1 е! а1 Мо1. МюгоЬюк 1994, 11; 237), 8бгС, 8бгС (МсСгеа е! а1 МюгоЬю1оду 2000, 146; 1535), 8бгН (МсСгеа е! а1 М1сгоЬю1оду 2000, 146; 1535), липаза СекЭ (И8 2002/0169288), 8азА (Воске е! а1 МюгоЬю1оду 149; 643), 8азС (Воске е! а1 МюгоЬю1оду 2003,149; 643), 8азК (Воске е! а1 МюгоЬю1оду 2003, 149; 643), РпЬА (Р1оск е! а1 Мо1 МюгоЬюк 1994, 12; 599, И8 6054572), РпЬВ (νθ 97/14799, Воо!к е! а1 2001 1пГес. 1ттип. 69; 345), коллагенсвязывающий белок Спа (У1за е! а1 2000, 1. Вю1. Сйет. 275; 39837), С1ГВ (νθ 99/27109), 8бгЭ (νθ 99/27109), 8бгЕ (νθ 99/27109), РЬрА (Ркоштбаепд е! а1 1988 1. Сеп МюгоЬюк 134; 75), Νρη^ (Р1оск 2001 1. Вас!епо1. 183; 3999), ИаА/ИзА (Топеих е! а1 РЕМ8 1ттипо. Меб. МюгоЬюк 2000, 29; 145), 8заА (Балд е! а1 РЕМ8 1ттипо1. Меб. МюгоЬюк 2000, 29; 213), ЕРВ (Низзат апб Негтапп зутрозшт оп 8!арк Эептагк 14-17'к 2000), 88Р-1 (УеепзПа е! а1 1996, 1. Вас!епо1. 178; 537), 88Р-2 (Уеетйга е! а1 1996, 1. Вас!епо1. 178; 537), 17 кДа гепаринсвязывающий белок НВР (Ра11дгеп е! а1 2001, 1. Меб. МюгоЬюк 50; 547), витронектинсвязывающий белок (Ь1 е! а1 2001, Сигг. МюгоЬюк 42; 361), фибриногенсвязывающий белок, коагулаза, Р1д (νθ 97/48727) и МАР (И8 5648240)
8ИС/Мп1С/связывающий белок слюны
8йС/Мп!С/связывающий белок слюны представляет собой АВС белок-транспортер, который является гомологом адгезина РзаА у 8. рпеитошае. Он представляет собой высокоиммуногенный липопротеин 32 кДа, который распределяется через бактериальную клеточную стенку (Соскаупе е! а1., 1пГес!. 1ттип. 1998 66; 3767). Он экспрессируется в 8. аигеиз и 8. ер1бегт1б1з в виде липопротеина 32 кДа, и гомолог 40 кДа присутствует в 8. котищ. У 8. ер1бегт1б1з он является компонентом железо-регулируемого оперона. Он демонстрирует значительную гомологию как с адгезинами, включающими Р1тА 8!гер!ососсиз ра^азалди^з, так и с липопротеинами семейства АВС транспортеров с выясненными или предполагаемыми функциями переноса металла железа. Таким образом, 81!С включен как в виде внеклеточного связывающего белка, так и в виде транспортера ионов металла.
Связывающий белок слюны, раскрытый в И8 5801234, также представляет собой форму 8ЙС и может быть включен в иммуногенную композицию по изобретению.
СИА и СИВ
Оба этих белка обладают фибриногенсвязывающей активностью и инициируют образование колоний 8. аигеиз в присутствии плазмы крови. Они содержат мотив ЬРХТО, общий с белками, ассоциированными с клеточной стенкой.
С1ГА описан в И8 6008341, а С1ГВ описан в νθ 99/27109.
Коагулаза (РЬрА)
Эта коагулаза представляет собой фибриногенсвязывающий белок, который инициирует образование колоний 8. аигеиз в присутствии плазмы крови. Он описан в ссылках, относящихся к коагулазе: Ркоштбаепд е! а1. (1. Сеп. МюгоЬю. 1988, 134:75-83), Ркоштбаепд е! а1. (Мо1. МюгоЬю1 1990; 4:393-404), Скеипд е! а1. (1пГес!. 1ттип. 1995; 63:1914-1920) и 8корзт е! а1. (1. С1т. МюгоЬюк 2000; 38:3453-3456). В одном из воплощений фрагменты для включения в иммуногенную композицию по изобретению включают зрелый белок, в котором удален сигнальный пептид (аминокислоты от 27 до С-конца).
Коагулаза имеет три разных домена. Аминокислоты 59-297, представляющие собой область свернутой спирали, аминокислоты 326-505, представляющие собой изобилующую пролином и глицином область, и С-концевой домен от аминокислоты 506 до аминокислоты 645, который имеет конформацию бета-слоя. Каждый из этих доменов является фрагментом, который может быть включен в иммуногенную композицию по изобретению.
8бгС
Этот белок описан в νθ 00/12689. 8бгС обнаружен у коагулазоотрицательных стафилококков и представляет собой белок, ассоциированный с клеточной стенкой, содержащий последовательность ЬРХТС.
8бгС содержит сигнальный пептид (аминокислоты 1-51), область, содержащую сайты связывания фибриногена и сайты связывания коллагена (аминокислоты 51-825), два домена СпаВ (аминокислоты 627-698 и 738-809), область 8Ό повторов (аминокислоты 825-1000) и заякоривающий домен (аминокислоты 1009-1056).
В одном из воплощений фрагменты 8бгС включают полипептиды, в которых удалены сигнальный пептид и/или 8Ό повторы и заякоривающий домен. Они включают полипептиды, содержащие или состоящие из аминокислот 50-825, аминокислот 50-633, аминокислот 50-597 (8ЕО ΙΌ ΝΟ 2 в νθ
- 7 015833
03/76470), аминокислот 273-597 (8Ер II) N0 4 в ^0 03/76470), аминокислот 273-577 (8Ер ГО N0 6 в ^'0 03/76470), аминокислот 1-549, аминокислот 219-549, аминокислот 225-549, аминокислот 219-528, аминокислот 225-528 в 8Е(/ ГО N0: 70 или 20 или 21.
Возможно, в иммуногенную композицию по изобретению включен полипептид 86гО, имеющий последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 или 100% гомологичную последовательности 8ЕР ГО N0: 70, 20 или 21.
Композиции по изобретению возможно содержат фрагмент описанных выше полипептидов 86гО.
В одном из воплощений во фрагментах сигнальный пептид и/или домен 81) повторов и/или заякоривающий домен удалены, например, последовательности, соответствующие аминокислотам 1-713, 1549, 225-549, 225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36-689 из 8ЕР ГО 70, или последовательности, имеющие 85%-ную, 90%-ную, 92%-ную, 95%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность с 8Е(/ ГО 70, или 20, или 21.
В одном из воплощений фрагменты, в которых сигнальный пептид удален, имеют метиониновый остаток на \-конце фрагмента для обеспечения правильной трансляции.
В одном из воплощений фрагмент имеет следующую последовательность:
ΜΕΕΝ3ν0ϋνΚΠ3ΝΤΟΟΕΠ3Ο5Νϋ033ΏΕΕΚΝθνΐΝΝΝΡ3ΙΝΤΟΌΝΝ0ΧΙΚΚΕΕΤΝΝΥϋΘΙΕΚΚ3ΕΌΚΤΕ3ΤΤΝ νθΕΝΕΑΤΡΠ0ΚΤΡ(2ϋΝΊΉΙ,ΤΕΕΕνΚΕ585νΕ85Ν88ΙϋΤΑ00Ρ8ΗΤΤΙΝΚΕΕ5ν0Τ3ϋΝνΕΟ5Ην8ϋΡΑΝ8ΚΙ , ΚΕ3ΝΤΕ3ΟΚΕΕΝΤΙΕ0ΡΝΚνΚΞΌ3ΤΤ30Ρ3(3ΥΤΝΙΠΕΚΙ3Ν0ΠΕ
ЬЬНЬРХЫЕУЕЫКАКРЬЗТТЗАОРЗХКЯУТУПОЬААЕОСЗНТЫНЫКХТПОЗХТЕСУООЗЕСУХКАНОАЕНЫУ
ΌνΤΕΕνΠΌΚνΚ3Ο0ΤΜΤνθΙϋΚΝΤνΡ3ΌΕΤ03ΡΤΙΡΚΙΚΠΝ3αΕΙΙΑΤαΤΥΌΝΚΝΚ0ΙΤΥΤΡΤϋΥνΠΚΥΕΝΙΚ
ΑΗΠΚΠΤ3ΥΙϋΚ3ΚνΡΝΝΝΤΚΠθνΕΥΚΤΑΠ38νΝΚΤΙΤνΕΥ0ΡΡΝΕ№ΤΑΝΠ03ΜΡΤΝΙ0ΤΚΝΗΤνΕ0ΤΙΥΙΝΡ ΠΒΥ3ΑΚΕΤΝνΝΙ8(3Ν<3ΌΕ(33Τ
ΙΙϋΟ3ΤΙΙΚνΥΚνσΏΝ0ΝηΡϋ8ΝΚΙΥΟΥ3ΕΥΕϋνΤΝΟΟΥΑ0ΕαΝΝΝϋνΝΙΝΡ(3ΝΙΟ3ΡΥΙΙΚνΐ8ΚΥΟΡΝΚ0ϋ
ΥΤΤΙ00τνΤΜ0ΤΤΙΝΕΥΤσΕΡΡΤΑ3ΥΟΝΤΙΑΡ3Τ3300Ο0ΟΏ£ΡΡΕΚΤΥΚΙΟΠΥνΜΕΕνθΚΠΘΙ0ΝΤΝΠΝΕΚΡ
ЬЗМУЪУГЬТУРООТЗКЗУКТОЕПОКУОРПСЬЮКЗЬТУК1ТРЕТРЕ<ЗУТРТЬКНЗОТЫРАЬОЗЕаНЗУт7Т1ЫС
ΟϋΌΜΤΙΟεΟΡΥΟΤΡΚΥβΙΑΝΥ νΗΥΠΤΝΚΟΟΐρΘΟΟΕΚΟΙ3θνκνΤΠΚΟΕΝαΝΙΙ3ΤΤΤΤΌΕΝσΚΥΟΡΙ)Ν1Ν3ΘΝΥΐνΗΡΟΚΡ3ΘΜΤΟΤΤΤ03σθ ΟΟΕΟϋΑΠΘΕΕνΗντIΤΌΗϋΌ РЗIϋΝΟΥΥΏϋΕ
ЕЬЬА и ЕЬЬВ
ЕЬБЛ и ЕЬББ представляют собой белки, которые экспрессируются в 8. аигеиз и 8. ер1с1ептс118 (С1агке апб Боз!ег, 1п£ес!. 1шшип. 2002, 70; 6680 , ^ПНашз е! а1., 1п£ес!. 1шшип. 2002, 20; 6805) и которые связываются с фибронектином. Поскольку фибронектин представляет собой важный компонент внеклеточного матрикса, ЕЬБЛ и ЕЬББ обладают важной функцией в сцеплении стафилококков с внеклеточным матриксом хозяина.
Белки ЕЫ1 крупные, имеющие молекулярную массу 1,1 МДа. С точки зрения легкости продуцирования и образования предпочтительно использовать фрагмент белка ЕЫг а не полную последовательность. Центральная область белка содержит неполные повторы, которые содержат сайты связывания фибронектина. Фрагменты, содержащие один или более повторяющихся доменов, описанных ниже, представляют собой некоторые фрагменты, подходящие для включения в иммуногенную композицию по изобретению.
Белки ЕЫ1 содержат неполные повторяющиеся единицы длиной 127 аминокислот, характеризующиеся тем, что они содержат консенсусную последовательность:
Ъ.С.{10}А.{13}0.{2б}Ь...М..Ь.{33}А или
или
.....1/ν. .А. . ,1/ν. .ΑΚ-ΑΤΝ/ϋΟ. ,ΝΙι. .АК. .А. {6 }Ь. .ЬЫ.АОК. .Ь. ,<21/У. .А. .V. .
V.(б}А.,ΣΝ/ϋ.ΑΜ..Ь..,Ι/ν.ϋ/Ε..,ΤΚ.5.ΝΥ/Ρ.Ν/ϋΆϋ.-К. .ΑΥ/Ρ..АУ. ,А.,Ι/ν.Ν /ϋ.......
где . обозначает любую аминокислоту, .{10} обозначает любые 10 аминокислот, и Ι/ν показывает альтернативные выборы аминокислоты.
Ссылаясь на последовательность, раскрытую в Кигоба е! а1 (2001) Бапсе! 357; 1225-1240, и таблицу 2, последовательности повторов в белках ЕЬБ легко устанавливаются.
В одном из воплощений фрагменты, которые включены в иммуногенную композицию по изобретению, включают белки, содержащие одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти повторяющихся единиц из 127 аминокислот. Такие фрагменты могут состоять из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более повторов области повторов из 127 аминокислот или могут состоять из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более повторов с дополнительными аминокислотными остатками, присутствующими
- 8 015833 на любом или обоих концах фрагмента. Возможно, фрагмент представляет собой полипептид Н2 из приблизительно трех повторов, охватывающих 44 кДа (аминокислоты 3202-3595), как описано в С1агке е! а1., 1пГесПоп аиб 1шшипйу 70, 6680-6687, 2002. Такие фрагменты возможно способны связываться с фибронектином и/или активировать антитела, которые реагируют против полноразмерного белка БЫ1.
Белки БЫ1 способны связываться с фибронектином. В одном из воплощений фрагменты этих полипептидных последовательностей сохраняют способность связываться с фибронектином. Связывание с фибронектином можно оценить твердофазным иммуноферментным анализом (ББ18А), как описано С1агке е! а1 (1п1ес!1оп аиб 1шшиийу 70; 6680-6687 2002).
В одном из воплощений фрагмент представляет собой фрагмент, содержащий В-клеточный или Тхелперный эпитоп, например фрагменты/пептиды, указанные в табл. 3 и 4.
Таблица 2. Последовательности повторов в полноразмерной последовательности БЫ1.
Полноразмерная последовательность БЫ1 раскрыта в Кигоба е! а1 (2001) Бапсе! 357; 1225-1240. В приведенной ниже таблице представлены аминокислотные остатки, по которым повторы из 127 аминокислот начинаются и заканчиваются в полноразмерной последовательности.
Начало Конец
1 3204 3330
2 3331 3457
3 3457 3583
4 3583 3709
5 3709 3835
6 3835 3961
7 3961 4087
8 4200 4326
9 4326 4452
10 4452 4578
11 4578 4704
12 4704 4830
13 4830 4956
14 4956 5082
15 5082 5208
16 5208 5334
17 5334 5460
18 5460 5586
19 5585 5711
20 5711 5837
21 5837 5963
22 5963 6089
23 6089 6215
24 6215 6341
25 6341 6467
26 6467 6593
27 6593 6719
28 6719 6845
29 6845 6971
30 6971 7097
31 7097 7223
32 7223 7349
33 7349 7475
34 7475 7601
35 7601 7727
36 7727 7853
37 7852 7978
38 7978 8104
39 8104 8230
40 8230 8356
41 8356 8482
42 8482 8608
43 8604 8730
44 8858 8984
- 9 015833
Таблица 3. Прогнозирование В-клеточного эпитопа для повтора из 127 аминокислот Полноразмерная последовательность раскрыта в Кигоба е! а1 (2001) Ьапсе! 357; 1225-1240. Один из этих повторов, кодируемый аминокислотами 3204-3331 полноразмерной последовательности, выбран для проведения прогнозирования эпитопов:
ΜθνΝΤνΝΩΚΑΑ8νΚ3ΤΚΟΑΕΟΘΩΟΝΕΟ^ΚΤΕΑΤΝΑΙΤΗΑ30ίΝ(3ΑΟΚΝΑΙ_ΤΟΩνΝ 3ΑΩΝνΗΑνΝΟ1ΚαΤΤα3ίΝΤΑΜΤ(31ΚΚΘνΑΝΗΝα\/να8ΟΝΥνΝΑ0ΤΝΚΚΝΟΥΝΝΑΥ ΝΗΑΝΟΙΙΝΟΝΑΩΗΡνί
Начало Конец Последовательность эпитопа Старт Стоп
5 10 ΤνΝΩΚΑ 3208 3213
14 19 ΚδΤΚϋΑ 3217 3222
21 33 ΟΟΟαΝΙΟΚΑΚΤΕΑ 3224 3236
42 51 □1_ΝΟΑΟΚΝΑΙ_ 3245 3254
66 74 ϋΙΚΩΤΤΩδί 3269 3277
100 112 ΑΩΤΝΚΚΝΩΥΝΝΑΥ 3303 3315
117 123 ΩΙΙΝΩΝΑ 3320 3326
В колонках Начало и Конец указана позиция прогнозируемых В-клеточных эпитопов в повторе из 127 аминокислот.
В колонках Старт и Стоп указана позиция прогнозируемых В-клеточных эпитопов в полноразмерной последовательности ЕЬй.
Таблица 4. Прогнозирование Т-хелперного эпитопа в ЕЫ1
Полноразмерная последовательность раскрыта в базе данных ТгЕМВЬ, ссылка на последовательность Ο8ΝΆΟ6. Один из этих повторов, кодируемый аминокислотами 3204-3331 полноразмерной последовательности, выбран для проведения прогнозирования эпитопов:_____________
Позиция повтора Последовательность эпитопа Позиция последовательности
1 ΜϋνΝΤνΝΩΚ 3204
3 νΝΤνΝΩΚΑΑ 3206
6 νΝΩΚΑΑδνΚ 3209
26 Ι.ΩΡΑΚΤΕΑΤ 3229
37 ΙΤΗΑ8ΩΙ_ΝΩ 3240
43 Ι_ΝΩΑΩΚΝΑΙ_ 3246
51 Ι_ΤΩΩ\/Ν8ΑΩ 3254
55 νΝδΑΩΝνΗΑ 3258
61 νΗΑΧ/ΝΩΙΚΩ 3264
64 \/ΝΩΙΚΩΤΤΩ 3267
67 ΙΚΩΤΤΩδίΝ 3270
74 1_ΝΤΑΜΤ(3Ι_Κ 3277
78 МТСЬККбУА 3281
81 Ι,ΚΚΘνΑΝΗΝ 3284
85 νΑΝΗΝΩΜΩ 3288
91 ννοδϋΝΥνΝ 3294
92 νΩδΟΝΥνΝΑ 3295
97 ΥνΝΑϋΤΝΚΚ 3301
98 νΝΑϋΤΝΚΚΝ 3302
108 ΥΝΝΑΥΝΗΑΝ 3311
112 ΥΝΗΑΝΩΙΙΝ 3315
118 ΙΙΝΘΝΑΩΗΡ 3321
119 ΙΝΟΝΑΩΗΡν 3322
В колонке Позиция повтора указана позиция прогнозируемых Т-клеточных эпитопов в повторе.
В колонке Позиция последовательности указана позиция прогнозируемых Т-клеточных эпитопов в полноразмерной последовательности ЕЬй.
Фрагменты белков по изобретению могут быть использованы для продуцирования соответствующего полноразмерного полипептида пептидным синтезом, поэтому эти фрагменты могут быть использованы в качестве промежуточных фрагментов для продуцирования полноразмерных белков по изобретению.
- 10 015833
В одном из воплощений использованы варианты, в которых несколько, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 или 1 аминокислот(а) замещены(а), удалены(а) или добавлены(а) в любой комбинации.
Эластинсвязывающий белок (ЕЬр8)
ЕЬр8 представляет собой белок, содержащий 486 аминокислот, имеющий молекулярную массу 83 кДа. Он ассоциируется с цитоплазматической мембраной 8. аигеик и имеет три гидрофобные области, которые удерживают белок в мембране (Эо^пег е! а1 2002, 1. ΒίοΙ. Сйет. 277; 243; Рагк е! а1 1996, 1. ΒίοΙ. Сйет. 271; 15803).
Две области между аминокислотами 1-205 и 343-486 представлены на внешней поверхности цитоплазматической мембраны. Лигандсвязывающий домен ЕЬр8 расположен между остатками 14-34 на Ν’конце (Рагк е! а1 1999, 1. ΒίοΙ. Сйет. 274; 2845).
В одном из воплощений фрагмент, который включают в иммуногенную композицию по изобретению, представляет собой представленный на поверхности фрагмент, содержащий эластинсвязывающую область (аминокислоты 1-205). Возможно фрагменты не содержат полностью представленную петлю, но должны содержать эластинсвязывающую область (аминокислоты 14-34). Альтернативный фрагмент, который может быть использован, состоит из аминокислот, образующих вторую представленную на поверхности петлю (аминокислоты 343-486). Также возможны альтернативные фрагменты, содержащие на вплоть до 1, 2, 5, 10, 20, 50 меньше аминокислот по одному или обоим концам.
Рецепторы ламинина
Рецептор ламинина 8. аигеик играет важную роль в патогенности. Характерным признаком инфицирования является инвазия через кровоток, которая дает возможность образования обширного метастатического абсцесса. Для инвазии через кровоток требуется способность проникать из сосудов в ткани через сосудистую базальную мембрану. Это достигается за счет связывания с ламинином через рецептор ламинина (Борек е! а1 8с1епсе 1985, 229; 275).
Рецепторы ламинина представлены на поверхности и присутствуют во многих штаммах стафилококков, включая 8. аигеик и 8. ерйегтШк. 8ΒΙ
8Ь1 является вторым связывающимся с 1дС белком в дополнение к белку А, и он экспрессируется в большинстве штаммов 8. аигеик (Ζ1ι;·ιη§ е! а1 1998, М1сгоЬю1оду 144; 985).
Ν-Конец последовательности 8Ь1 имеет типичную сигнальную последовательность с сайтом расщепления после аминокислоты 29. Поэтому фрагмент 8Ь1, который может быть использован в иммуногенной композиции по изобретению, начинается с аминокислотного остатка 30, 31, 32 или 33 и продолжается до С-конца 8Ь1, например в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 26.
Связывающийся с 1дС домен в 8Ь1 идентифицирован как область в направлении Ν-конца белка от аминокислоты 41-92. Этот домен гомологичен связывающимся с 1дС доменам белка А.
Минимальный связывающийся с 1дС домен в 8Ь1 содержит следующую последовательность:
ΟΤΤΟΝΝΥνΤΟΟΟΚΑΡΥΟνΒΗΕΚΟΙΤΕΕΟΚΝΟΥΙКТЪНЕНРЕВАОЕУРЗЕЗЪК ** * ·* * * ·* 4е ★ * * обозначает аминокислоты, которые сходны между связывающими с 1дС доменами.
В одном из воплощений фрагмент 8Ь1, который включают в иммуногенную композицию по изобретению, содержит связывающийся с 1дС домен. Этот фрагмент содержит консенсусную последовательность для связывающегося с 1дС домена, обозначенную звездочкой *, как показано в вышеуказанной последовательности. Возможно, этот фрагмент содержит или состоит из полной последовательности, указанной выше. Возможно, этот фрагмент содержит или состоит из аминокислот 30-92, 33-92, 30-94, 3394, 30-146, 33-146, 30-150, 33-150, 30-160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 или 33-210 в 8Ь1, например в 8ЕЦ ΙΌ N0:26.
Фрагмент может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен из указанных последовательностей.
Фрагмент может содержать множественные повторы (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) связывающегося с 1дС домена.
ЕЕВ-Е1В
Е1Ь представляет собой фибриногенсвязывающий белок 19 кДа, который секретируется 8. аигеик во внеклеточную среду. Он продуцируется всеми протестированными изолятами 8. аигеик (\Уак11е11 апб Е1оск 1995, 1. Сйп. МюгоЬю! 33; 2347).
8. аигеик образует скопления в присутствии фибриногена и связывается с поверхностями, покрытыми фибриноргеном. Эта способность способствует колонизации стафилококками катетеров и эндотелиальных клеток.
Е1Ь содержит сигнальную последовательность на Ν-конце белка с предполагаемым сайтом расщепления примерно по аминокислоте 30. В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит или состоит из последовательности зрелого белка (приблизительно от аминокислоты 30 до С-конца белка).
- 11 015833
Е1)е-ЕЕВ/Е1С
ЕЬе представляет собой фибриногенсвязывающий белок, который обнаружен во множестве изолятов 8. ер1бетт1б18 и имеет выведенную молекулярную массу 119 кДа (Νίΐδδοη е1 а1 1998. 1п£ес1. 1ттип. 66; 2666). Его последовательность родственна последовательности фактора слипания из 8. аигеиз (С1£А). Антитела против ЕЬе могут блокировать связывание 8. ер1бегт1б18 с планшетами, покрытыми фибриногеном, и с катетерами (Ре1 апб Е1оск 2001, 1. 1п£ес1. Όίδ. 184; 52).
ЕЬе имеет предполагаемую сигнальную последовательностью с сайтом расщепления между аминокислотами 51 и 52. Поэтому потенциальный фрагмент ЕЬе содержит зрелую форму ЕЬе, простирающуюся от аминокислоты 52 до С-конца (аминокислота 1,092).
Домен ЕЬе от аминокислоты 52 до аминокислоты 825 ответственен за связывание с фибриногеном. В одном из воплощений фрагмент ЕЬе состоит из или содержит аминокислоты 52-825.
Область между аминокислотами 373 и 516 в ЕЬе демонстрирует наибольшую консервативность между ЕЬе и С1£А. В одном из воплощений этот фрагмент содержит аминокислоты 373-516 ЕЬе.
Аминокислоты 825-1041 ЕЬе содержат много раз повторяющуюся область, состоящую из тандемно повторяющихся остатков аспарагиновой кислоты и серина.
ЬаА/РйА
1заА представляет собой белок 29 кДа, также известный как Р1зА, и, как было показано, является иммунодоминантным стафилококковым белком во время сепсиса у госпитализированных пациентов (Ьогепх е1 а1 2000, ЕЕМ8 1ттипо1. Меб. М1сгоЬ. 29; 145).
Считается, что первые 29 аминокислот последовательности 1заА представляют собой сигнальную последовательность. В одном из воплощений фрагмент 1заА, который включают в иммуногенную композицию по изобретению, содержит остатки 30 аминокислот дальше к концу кодируемой последовательно сти.
Фибронектинсвязывающий белок
Фибронектинсвязывающий белок А содержит несколько доменов, которые вовлечены в связывание с фибронектином (УО 94/18327). Они названы Ό1, Ό2, Ό3 и Ό4. В одном из воплощений фрагменты фибронектинсвязывающего белка А или В содержат или состоят из Ό1, Ό2, Ό3, Ό4, Ό1-Ό2, Ό2-Ό3, Ό3Ό4, Ό1-Ό3, И2-О4или Ό1-Ό4.
Фибронектинсвязывающий белок содержит сигнальную последовательность из 36 аминокислот, например:
\К\\МОТ41НКНК1,01АА8\Т1 ,С1Т\11\\'С1\1О101ЖЕАА
Возможно, в иммуногенную композицию по изобретению включают зрелый белок, не имеющий эту сигнальную последовательность.
Белки-тр анспортеры
Клеточная стенка грамположительных бактерий действует как барьер, препятствующий свободной диффузии метаболитов в бактерию. Семейство белков организовывает прохождение необходимых питательных веществ в бактерию, и поэтому они необходимы для жизнеспособности бактерии. Термин белок-транспортер охватывает белки, вовлеченные в начальную стадию связывания с метаболитами, такими как железо, а также вовлеченные в фактическое транспортирование метаболита в бактерию.
Молекулярное железо представляет собой кофактор, необходимый для роста бактерий. Секретируются сидерофоры, которые связывают свободное железо и затем захватываются бактериальными поверхностными рецепторами, которые доставляют железо для транспорта через цитоплазматическую мембрану. Захват железа является критическим для приживаемости человеческих инфекций, чтобы формирование иммунного ответа против этого класса белков приводило к утрате жизнеспособности стафилококков.
Примеры белков-транспортеров включают иммунодоминантный АВС транспортер (Витше е1 а1 2000 1п£ес1. 1тип. 68; 3200), 1збА (Махташап е1 а1 2002 ΡNΑ8 99; 2293), ПбВ (Махташап е1 а1 2002 ΡNΑ8 99; 2293), ПбС (УО 06/59247), транспортер Мд2+, 8ЙС (АУПЫиге и Еоз1ет 2001 1п£ес1. 1ттип. 69; 5198) и Νί АВС транспортер.
Иммунодоминантный АВС транспортер
Иммунодоминантный АВС транспортер представляет собой достаточно консервативный белок, который может обладать способностью формировать иммунный ответ, перекрестно-защитный против различных штаммов стафилококка (Ме1 е1 а1 1997, Мо1. МюгоЬю1. 26; 399). Антитела против этого белка обнаружены у пациентов с сепсисом (Витше е1 а1 2000, 1п£ес1. 1ттип. 68; 3200).
Возможные фрагменты иммунодоминантного АВС транспортера включают пептиды ΌΚΉΕΕΝ, ΟΝΥΏ, КНУРЕ. КТТЬЬК, ОУТТ8Ь8, У1ЖЕК К6ЕЬ, К1КУУУС1\У1)Е\\'УТ)8. ТУ1\\'8Н1ЖНЕЕУ\\У и/или ТЕТЕЬКСЕЬОРМЬЕ8, поскольку эти последовательности содержат эпитопы, которые распознаются иммунной системой человека.
ПбА-КОВ
Гены 1зб (железо-регулируемая поверхностная детерминанта) 8. аитеиз кодируют белки, ответственные за связывание с гемоглобином и прохождение железа гема в цитоплазму, где оно действует в качестве необходимого питательного вещества. !збА и !збВ локализуются в клеточной стенке стафилокок
- 12 015833 ков. 1кбА, по-видимому, представлен на поверхности бактерии, поскольку он чувствителен к расщеплению протеиназой К. 1кбВ частично расщепляется, что свидетельствует о том, что он частично представлен на поверхности бактерии (Ма/ташаи с1 а1 2003 8с1еисе 299; 906).
1кбА и 1кбВ оба представляют собой белки 29 кДа, которые связывают гем. Их экспрессия регулируется доступностью железа через репрессор Риг. Их экспрессия высокая во время инфекции у хозяина, у которого концентрация железа низкая.
Они также известны как РгрА и РгрВ (Мотккеу е1 а1 2002, 1иГес1. 1ттии. 70; 2399). РгрА и РгрВ представляют собой основные поверхностные белки с высоким зарядом. Было показано, что они вносят основной вклад в адгезию на пластике.
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит фрагмент 1кбА и/или 1кбВ, который описан в νθ 01/98499 или νθ 03/11899.
Токсины и регуляторы вирулентности
Члены этого семейства белков включают токсин, такой как альфа-токсин, гемолизин, энтеротоксин В и Τ88Τ-1, а также белки, которые регулируют продукцию токсинов, такие как ВАР.
Альфа-токсин (Н1а)
Альфа-токсин является важной детерминантой вирулентности, продуцируемой большинством штаммов 8. аигеик. Он представляет собой порообразующий токсин, обладающий гемолитической активностью. Было показано, что антитела против альфа-токсина нейтрализуют вредные и летальные эффекты альфа-токсина в животных моделях (Аб1ат е1 а1 1977 1пГес1. 1ттии. 17; 250). Человеческие тромбоциты, эндотелиальные клетки и мононуклеарные клетки чувствительны к эффектам альфа-токсина.
Высокая токсичность альфа-токсина требует, чтобы он был обезврежен перед использованием в качестве иммуногена. Этого можно достичь химической обработкой, например обработкой формальдегидом, глутаральдегидом или другими поперечно-сшивающими реагентами, или химическим конъюгированием его с бактериальными полисахаридами как описано ниже.
Еще один путь детоксикации заключается в осуществлении точечных мутаций, которые удаляют токсичность с сохранением антигенности токсина. Введение точечной мутации по аминокислоте 35 альфа-токсина, где гистидиновый остаток заменяется лейциновым остатком, приводит в результате к детоксикации с сохранением иммуногенности (МегШек аиб Кегиоб1е 1996; 1пГес1. 1ттии. 64; 1839). Гистидин 35, по-видимому, является критическим для должной олигомеризации, требуемой для порообразования, и мутация этого остатка приводит к утрате токсичности.
При введении в иммуногенные композиции по изобретению альфа-токсин возможно подвергают детоксикации посредством мутации Н15 35, например заменой гистидина НЕ 35 лейцином Ьеи или аргинином Агд. В альтернативном воплощении альфа-токсин подвергают детоксификации посредством конъюгирования с другими компонентами иммуногенной композиции, например капсулярными полисахаридами или РИАС, возможно с полисахаридом 8. аигеик типа 5, и/или полисахаридом 8. аигеик типа 8, и/или РИАС.
ΚΝΑ III активирующий белок (КАР)
ВАР сам по себе не является токсином, но является регулятором экспрессии факторов вирулентности. ВАР продуцируется и секретируется стафилококками. Он активирует регуляторную систему других стафилококков и активирует экспрессию и последующее высвобождение факторов вирулентности, таких как гемолизин, энтеротоксин В и Τ88Τ-1.
Другие иммунодоминантные белки
Белок, ассоциированный с аккумуляцией (Аар).
Аар представляет собой белок 140 кДа, который необходим для аккумуляции штаммов 8. ер1бегпибЕ на поверхностях (Никкаш е1 а1 1иГес1. 1ттии. 1997, 65; 519). Штаммы, экспрессирующие этот белок, продуцируют значительно большее количество биопленки, и представляется, что Аар вовлечен в образование биопленки. Антитела против Аар способны ингибировать образование биопленки и ингибировать аккумуляцию 8. ер|бепшбЕ.
Секреторный антиген стафилококков 8хаА
8каА представляет собой сильно иммуногенный белок массой 30 кДа, обнаруженный как у 8. Аигеик, так и 8. ер|бепшбЕ (Ьаид е1 а1., 2000 РЕМ8 1ттиио1. Меб. МюгоЬю1. 29; 213). Его экспрессия во время эндокардита свидетельствует о вирулентной роли, специфичной к патогенезу инфекционного заболевания.
8каА содержит Ν-концевую лидерную последовательность и сайт расщепления сигнальной пептидазой. За лидерным пептидом следует гидрофобная область, состоящая из приблизительно 100 аминокислот от остатка 30 до остатка 130.
Возможный фрагмент 8каА, который вводят в иммуногенную композицию по изобретению, состоит из зрелого белка (аминокислоты от 27 до С-конца или аминокислоты от 30 до С-конца).
Дополнительные возможные фрагменты содержат гидрофильную область 8каА от аминокислоты 30 до аминокислоты 130.
Комбинации
Стафилококковые инфекции проходят несколько различных стадий. Например, жизненный цикл
- 13 015833 стафилококков включает комменсальную колонизацию, инициацию инфицирования организацией доступа в прилегающие ткани или кровоток, анаэробное размножение в крови, взаимодействие между детерминантами вирулентности 8. аигеик и защитными механизмами хозяина и индуцирование осложнений, включающих эндокардит, метастатический абсцесс и септический синдром. В разные стадии инфекционного цикла вовлечены разные молекулы на поверхности бактерии. Нацеливание иммунного ответа против комбинации конкретных антигенов, вовлеченных в разные процессы стафилококковой инфекции, отражается на разнообразных аспектах функционирования стафилококков, и это может приводить к хорошей эффективности вакцины.
В частности, комбинации некоторых антигенов из разных классов, некоторые из которых вовлечены в адгезию к клеткам-хозяевам, некоторые из которых вовлечены в захват железа или другие функции транспортера, некоторые из которых являются токсинами или регуляторами вирулентности, и иммунодоминантных антигенов могут вызывать иммунный ответ, который защищает от многих стадий инфицирования.
Некоторые комбинации антигенов особенно эффективны при индуцировании иммунного ответа. Это может быть измерено либо в анализах на животных моделях, которые описаны в примерах, и/или с использованием опсонофагоцитарного анализа, который описан в примерах. Без какой бы то ни было связи с теорией, считается, что такие эффективные комбинации антигенов возможны ввиду множества характеристик иммунного ответа на комбинацию антигенов. Сами антигены обычно представлены на поверхности клеток стафилококков, они консервативны, но также имеют тенденцию не быть представленными в достаточном количестве на поверхности клетки для оптимального бактерицидного ответа, чтобы происходило использование антител, активированных против единственного антигена. Комбинирование антигенов по изобретению может привести в результате к формированию преимущественной комбинации антител, которые взаимодействуют с клеткой стафилококка за пределами критического порога. При этом критическом уровне достаточное количество антител достаточного качества связываются с поверхностью бактерии, обеспечивая либо эффективный киллинг комплементом, либо нейтрализацию бактерии. Это может быть измерено либо в модели сенсибилизации животного, либо в анализе опсонизации, как изложено в примерах.
Предпочтительные иммуногенные композиции по изобретению содержат множество белков, выбранных из по меньшей мере двух разных категорий белка, имеющих разные функции в организме стафилококков. Примерами таких категорий белков являются белки, связывающиеся с внеклеточными компонентами, белки-транспортеры, такие как белки захвата Ее, токсины или регуляторы вирулентности и другие иммунодоминантные белки.
В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит множество белков, не менее 2, 3, 4, 5 или 6, выбранных из 2, 3 или 4 разных групп, выбранных из следующих групп:
группа (а) белки, связывающиеся с внеклеточными компонентами;
группа (б) белки-транспортеры;
группа (в) токсины или регуляторы вирулентности;
группа (г) структурные белки.
В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит множество белков, не менее 2, 3, 4, 5 или 6, выбранных из 2, 3 или 4 следующих групп:
группа (а) - по меньшей мере один стафилококковый белок, связывающийся с внеклеточными компонентами, или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, БйС/Мп1С/связывающего белка слюны, ЕЫ1А. ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕЕВ (ΕΙΒ), 8ΒΙ, СНА, БбтС, 86τΌ, БбтЕ, БбтС, БбтН, БакЕ, липазы СейЭ, БакА, БакВ, БакС, БакЭ, БакК, ЕпЬА, ЕпЬВ, Спа, СИВ, ЕЬрА, Ыраке, 18аА/Р18А, БкаА, ЕРВ, 88Р-1, 88Р-2, НВР, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Е1д и МАР;
группа (б) - по меньшей мере один стафилококковый белок-транспортер или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, 1к6А, 1к6В, 1к6С, транспортера Мд2+, НагА, БИе и N1 АВС транспортера;
группа (в) - по меньшей мере один стафилококковый регулятор вирулентности, токсин или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из альфа-токсина (Н1а), мутанта альфа-токсина Н35В, ΡΝΛ III активирующего белка (ВАР);
группа (г) - по меньшей мере один стафилококковый структурный белок или его иммуногенный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из МКРП и аутолизина.
В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит множество белков, не менее 2, 3, 4, 5 или 6, выбранных из 2 или 3 из следующих групп:
группа (а) - по меньшей мере один стафилококковый белок, связывающийся с внеклеточными компонентами, или его иммуногенный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8йС/Мп1С/связывающего белка слюны, ЕЬйА, ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕЕВ (Е1В), 8В1, аутолизина, С1ИА, БбтС, 86τΌ, БбтЕ, БбтС, БбтН, БакЕ, липаза СеИЭ, БакА, БакВ, БакС, БакЭ, БакК, ЕпЬА, ЕпЬВ, Спа, СНВ, ЕЬрА, ^аке, 1каА/Р1кА, БкаА, ЕРВ, БР-1, ББР-2, НВР, витронектинсвязывающего белка,
- 14 015833 фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Ид и МАР;
группа (б) - по меньшей мере один стафилококковый белок-транспортер или его иммуногенный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, 1кбА, 1кбВ, 1кбС, НагА, транспортера Мд2+, 8йС и N1 АВС транспортера;
группа (в) - по меньшей мере один стафилококковый регулятор вирулентности, токсин или его иммуногенный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из альфа-токсина (Н1а), мутанта альфа-токсина Н35В, ВNА III активирующего белка (ВАР).
В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один белок, выбранный из группы (а), и дополнительный белок, выбранный из группы (б) и/или группы (в).
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы (б), и дополнительный белок, выбранный из группы (в) и/или группы (а).
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы (в), и дополнительный белок, выбранный из группы (а) и/или группы (б).
Возможная комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит рецептор ламинина и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ГбА. ЕбВ. ИбС, НагА, транспортера Мд24, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8ЬС и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ИбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕЫ1А и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ВбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕЫ1В и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ВбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕЬр8 и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ИбВ, ЫА, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕЕВ(ИВ) и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ИбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8ВI и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ВбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит аутолизин и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ИбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфатоксина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит С1ГА и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ВбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8бгС и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ВбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8бгЭ и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ВбВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8бгЕ и 1, 2,
3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС
- 15 015833 транспортера, ЫА, ΙδάΒ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8йгС и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, ΙδάΒ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В и ВАР.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8йгН и 1, 2,
3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, НйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8а&Е и 1, 2,
3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, НйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8йе, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит липазу СеНЭ и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, НйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфатоксина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8а&Е и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1§йВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕпЬА и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1§йВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕпЬВ и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1§йВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит Спа и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, НйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит СНВ и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, НйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕЬрА и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1§йВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ^аке и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1кйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит НаА/РЦА и 1,
2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1кйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8каА и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1кйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит ЕРВ и 1, 2,
3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1кйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 88Р-1 и 1, 2,
3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ЫА, 1кйВ, ЫС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35В, ВАР, Аар и 8каА.
- 16 015833
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит 88Р-2 и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит НРВ и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит витронектинсвязывающий белок и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит фибриногенсвязывающий белок и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит коагулазу и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит Р1д и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белков в иммуногенной композиции по изобретению содержит МАР и 1, 2,
3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, [ьбВ, [збС, НагА, транспортера Мд2+, 8ЙС, N1 АВС транспортера, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит иммунодоминантный АВС транспортер и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8йС/Мп1С/связывающего белка слюны, ЕЬйА, ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕРВ (ИВ), 8ВГ аутолизина, С1ИА, 8бгС, 8бгИ, 8бгЕ, 8бгС, 8бгН, липазы СейИ, 8акА, РпЬА, РпЬВ, Спа, С1ИА, СНВ, РЬрА, ^аке, [каА/Р^кА. 8каА, ЕРВ, 88Р-1, 88Р-2, НВР, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Р1д, МАР, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит ИбА и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8йС/Мп1С/связывающего белка слюны, ЕЬйА, ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕРВ (ИВ), 8ВГ аутолизина, С1ИА, 8бгС, 8бгС, 8бгЕ, 8бгС, 8бгН, 8акР, липазы СейИ, 8акА, РпЬА, РпЬв, Спа, С1РА, СЙВ, РЬрА, ^аке, ИаА/Р^А, 8каА, ЕРВ, 88Р-1, 88Р-2, НВР, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Р1д, МАР, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит ИбВ и 1, 2, 3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8йС/Мп1С/связывающего белка слюны, ЕЬйА, ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕРВ (ИВ), 8ВГ аутолизина, С1ИА, 8бгС, 8бгС, 8бгН, 8акР, липазы СейИ, 8акА, РпЬА, РпЬВ, Спа, С1ИА, СЙВ, РЬрА, ^аке, ИаА/РщА, 8каА, ЕРВ, 88Р-1, 88Р-2, НВР, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Р1д, МАР, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит 8ЙС и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8йС/Мп1С/ связывающего белка слюны, ЕЬйА, ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕРВ (ИВ), 8ВГ аутолизина, С1ИА, 8бгС, 8бгИ, 8бгЕ, 8бгС, 8бгН, 8акР, липазы СейИ, 8акА, РпЬА, РпЬВ, Спа, С1ИА, СИВ, РЬрА, ^аке, ВаАПкА, 8каА, ЕРВ, 88Р-1, 88Р-2, НВР, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Р1д, МАР, альфа-токсина, мутанта альфа-токсина Н35Ь или Н35К, КАР, Аар и 8каА.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит альфа-токсин и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8йС/Мп1С/связывающего белка слюны, ЕЬйА, ЕЬйВ, эластинсвязывающего белка (ЕЬр8), ЕРВ (ИВ), 8ВГ аутолизина, С1ИА, 8бгС, 8бгИ, 8бгЕ, 8бгС, 8бгН, 8акР, липазы СейИ, 8акА, РпЬА, РпЬВ, Спа, СИВ, РЬрА, ^аке, ИаА/Р^А, 8каА, ЕРВ, 88Р-1, 88Р-2, НВР, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Р1д, МАР, иммунодоминантного АВС транспортера, ИбА, ИбВ, ИбС, НагА, транспортера Мд2+, 8йС, N1 АВС транспортера, Аар и 8каА.
- 17 015833
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит альфа-токсина Н35Ь или Н35В вариант и 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8ПС/Мп!С/связывающего белка слюны, ΕΝΧ, ΕΝιΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΕΒ (ИВ), 8ВЕ аутолизина, С1Х, 8ИгС, 8άΓΌ, 8άτΕ, 8ИгО, 8άτΗ, 8а§Е, липазы ОеИО, 83!^, ΕώΑ, ЕпЬВ, Спа, СИВ, ΕЬрΑ, Храке, [заЛ/Ρ^зЛ. 8^-^, ΕΡΒ, 88Ρ-1, 88Ρ-2, ΗΒΡ, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Ид, ΜΑΡ, иммунодоминантного ΑΒС транспортера, ΜΑ, [κάΒ, ЫС, Η-γΑ, транспортера Мд2+, 8ИС, Νί ЛΒС транспортера, Аар и 88-Α.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит ΒΑΡ и 1, 2, 3,4 или 5 дополнительных антигенов, выбранных из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8ПС/Мп!С/связывающего белка слюны, ΕΝιΑ, ΕΝιΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΕΒ (ΠΒ), 8ΒΕ аутолизина, С1Х, 8ИгС, 8ИЮ, 8ИгБ, 8ИгС, 8άτΗ, 8а§Е, липазы ОеИО, 8αδΑ, ΕώΑ, ΕώΒ, Спа, ΟΓΒ, ΕЬрΑ, ^азе, IзаΑ/Ρ^зΑ, 8^-^, ΕΡΒ, 88Ρ-1, 88Ρ-2, ΗΒΡ, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Ид, ΜΑΡ, иммунодоминантного ΑΒС транспортера, ΜΑ, ΜΒ, МС, Η-γΑ, транспортера Мд2+, 8ИС, Νί ΑΒС транспортера, Аар и 8§αΑ.
Еще одна комбинация белка в иммуногенной композиции по изобретению содержит ΜΑ и ΜΒ; ΜΑ и ΟΧ; ΜΑ и ΟΓΒ; ΜΑ и 8ИгС; ΜΑ и 8άιΌ; ΜΑ и 8άτΕ; ΜΑ и 8ИгС; ΜΑ и 8азБ; ΜΒ и ОХ;
ΜΒ и ΟΓΒ; ΜΒ и 8ИгС; ΜΒ и 8άιΌ; ΜΒ и 8άτΕ; ΜΒ и 8ИгС; ΜΒ и 8азБ; С1Х и ΟΓΒ; ΟΓΑ и 8ИгС;
С1Х и 8άΓΌ; ΟίΑ и 8άΕ; ΟίΑ и 8азБ; ΟΓΒ и 8ИгС; ΟΓΒ и 8άτΌ; ΟΓΒ и 8άΕ; ΟΓΒ и 8азБ; 8ИгС и 8άτΌ;
8ИгС и 8άΕ; 8ИгС и 8азБ; 8ИгЭ и 8άΕ; 8άιΌ и 8азБ; 8άΕ и 8азБ.
В приведенных выше и ниже комбинациях перечисленные белки возможно могут присутствовать в иммуногенной композиции по изобретению в виде фрагмента или слитого белка, как описано выше.
Комбинации трех белков
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению также содержит три белковых компонента в комбинации альфа-токсина, белка, связывающегося с внеклеточными компонентами (например адгезина), и белка-транспортера (например белка, связывающего железо).
В такой комбинации альфа-токсин может быть химически детоксифицированным или генетически детоксифицированным путем введения точечной(ых) мутации(ий), например точечной мутации Ηίδ35ΕΌΐ.ι. Альфа-токсин присутствует в виде свободного белка или, альтернативно, конъюгирован с полисахаридным или ΡΝΑΟ компонентом иммуногенной композиции.
Примеры комбинаций включают: иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и белок, связывающийся с внеклеточными компонентами, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8ПС/Мп!С/связывающего белка слюны, ΕΝιΑ, ΕЬйΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΡΒ (ΗΒ), 8ΒΕ аутолизина, ΟΓΑ, 8ИгС, 8ИгО, 8άτΗ, липазы ОеИО, 8αδΑ, ΕώΑ, ΕώΒ, Спа, ΟΓΒ, ΕЬрΑ, кразе, IзаΑ/Ρ^зΑ, 8δαΑ, ΕΡΒ, 88Ρ-1, 88Ρ-2, ΗΒΡ, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Е1д и ΜΑΡ;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΒ и белок, связывающийся с внеклеточными компонентами, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8ПС/Мп!С/связывающего белка слюны, ΕΝΧ, ΕЬйΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΕΒ (ΠΒ), 8ΒΕ аутолизина, ΟΓΑ, 8ИгС, 8άΓΌ, 8άτΕ, 8ИгО, 8άτΗ, липазы ОеИО, 8αδΑ, ΕώΑ, ΕώΒ, Спа, ΟΓΒ, ΕЬрΑ, Мазе, IзаΑ/Ρ^зΑ, 8δαΑ, ΕΡΒ, 88Ρ-1, 88Ρ-2, ΗΒΡ, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Е1д и ΜΑΡ;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и адгезии, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, ΕΝΧ, ΕЬйΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΕΒ (ΠΒ), ΟΓΑ, 8ИгС, 8άΓΌ, 8άτΕ, 8ИгО, 8άτΗ, аутолизина, ΕώΑ, ΕώΒ, Спа, С!®, ΕЬрΑ, Мазе, 88Ρ-1, 88Ρ-2, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Е1д и ΜΑΡ;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΒ и адгезии, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, ΕΝιΑ, ΕЬйΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΕΒ (Ε®), аутолизина, ОХ, 8ИгС, 8άΓΌ, 8άτΕ, 8ИгО, 8άτΗ, ΕώΑ, ΕώΒ, Спа, СИΒ, ΕЬрΑ, Мазе, 88ρ-1, 88Ρ-2, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Е1д и ΜΑΡ;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и рецептор ламинина; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и ΕΝΧ;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и ΕΝ1Β;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и БЬр8; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и ΕΕΒ (ΕΓΒ);
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и 8ИгС; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и С1Х; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и ΟΓΒ; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и ΕπΕΑ; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и коагулазу; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и Б1д;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и 8άτΗ;
иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ΜΑ и 8ИгС;
- 18 015833 иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ВбА и 8бЮ; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ВбА и 8бгЕ; иммуногенную композицию, содержащую альфа-токсин, ЕбА и МАР; иммуногенную композицию, содержащую ЕаА и 8Ы;
иммуногенную композицию, содержащую ЕаА и ВбВ; иммуногенную композицию, содержащую ЕаА и ВбА; иммуногенную композицию, содержащую ЕаА и 8бгС;
иммуногенную композицию, содержащую ЕаА и ЕЬЫ или его фрагмент, как описано выше; иммуногенную композицию, содержащую 8Ь1 и 8бгС;
иммуногенную композицию, содержащую 8Ь1 и ЕЬЫ или его фрагмент, как описано выше; иммуногенную композицию по изобретению, содержащую ЕаА. 8Ь1 или 8бгС.
Выбор антигенов, экспрессируемых в различных клональных линиях дифференцировки
Анализ распространения факторов вирулентности в отношении структуры популяции 8(ар11у1ососси8 аигеик продемонстрировал вариабельное присутствие генов вирулентности в природных популяциях 8. аигеик.
Показано, что среди клинических изолятов 81ар11у1ососси5 аигеик по меньшей мере пять клональных линий значительно преобладают (Воо(11 е! а1., 2001 1пГес! 1ттип. 69(1):345-52). Показано, что альфагемолизин (Ы1а), фибронектинсвязывающий белок А (ГпЬА) и фактор слипания А (с1ГА) присутствуют в большинстве изолятов независимо от идентичности линий, что свидетельствует о важной роли этих белков в жизнеспособности 8. аигеик (Воо!Ы е! а1., 2001 1пГес! 1ттип. 69(1):345-52). Кроме того, согласно Реасоск е! а1. 2002 распределения ГпЬА, с1ГА, коагулазы, §ра, тар, ρν1 (лейкоцидин Пантона-Валентайна), Ы1д (гамма-токсин), альфа-токсина и юа, по всей вероятности, не связано с основной клональной структурой, что свидетельствует о значительном горизонтальном переносе этих генов.
Напротив, другие гены вирулентности, такие как фибронектинсвязывающий белок В (ГпЬВ), бетагемолизин (ЫЬ), коллагенсвязывающий белок (спа), Т88Т-1 (!Г) и ген резистентности к метициллину (тесА) строго ассоциируются со специфическими линиями (Воо!Ы е! а1., 2001 1пГес! 1ттип. 69(1):345-52). Аналогично, Реасоск е! а1. (1пГес! 1ттип. 2002, 70(9):4987-96) продемонстрировали, что распределения энтеротоксинов, !§!, эксфолатинов (е!а и е!Ь), бета- и дельта-токсинов, генов 86γ(86γΌ, кбгЕ и ЬЬр), спа, еЬр8 и еГЬ в популяции в значительной степени связано с МЬ8Т-производными клональными комплексами.
Данные по МЬ8Т не дают доказательства, что штаммы, ответственные за нозокомиальное заболевание, представляют собой субпопуляцию, отличающуюся от штаммов, вызывающих внебольничное заболевание, или штаммов, выделенных из бессимптомных носителей (Гей е! а1., I. Вас!егю1. 2003, 185(11):3307-16).
В одном из воплощений иммуногенные композиции по изобретению эффективны против стафилококков различных клональных линий.
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит 1, 2, 3, 4 или по меньшей мере 1 белок, который экспрессируется в большинстве изолятов стафилококков. Примеры таких белков включают альфа-гемолизин (Ы1а), фибронектинсвязывающий белок А (ГпЬА) и фактор слипания А (с1ГА), коагулазу, §ра, тар, ρν1 (лейкоцидин Пантона-Валентайна), Ы1д (гамма-токсин), юа, иммунодоминантный АВС транспортер, ВАР, аутолизин (Вирр е! а1 2001, I. 1пГес!. Όίδ. 183; 1038), рецепторы ламинина, 8ЙС, ВаА/РщА, 8РОШЕ (), 8§аА, ЕЬр8, 8а§Г (ВосЫе е! а1 2003, МюгоЬю1оду 149; 643), ЕГВ(Г1В), 8В1, СКВ, ВбА, ВбВ, ГпЬВ, Ыраке, ЕВР, костный сиалосвязывающий белок II, ЕаВ/РЩВ (Гоген/ е! а1 ГЕМ8 1ттипо. Меб. МюгоЬ. 2000, 29; 145), 8а§Н (ВосЫе е! а1 2003, МюгоЬю1оду 149; 643), МВР1, 8а5Э (ВосЫе е! а1 2003, МюгоЬю1оду 149; 643), 8а§Н (ВосЫе е! а1 2003, М1сгоЬю1оду 149; 643), ауреолизиновый предшественник (АИВ)/8ерр1 и новый аутолизин.
В альтернативном воплощении 2 или более белков, которые экспрессируются в различных наборах клональных штаммов, включены в иммуногенную композицию по изобретению. Возможно, комбинация антигенов будет обеспечивать формирование иммунного ответа, эффективного против множественных клональных штаммов или против всех клональных штаммов. Например, комбинации включают в себя ЕпЬВ и бета-гемолизин, ЕпЬВ и Спа, ГпЬВ и Т88Т-1, ГпЬВ и тесА, ГпЬВ и 8бЮ, ГпЬВ и 8бгЕ, ГпЬВ и ЕЬр8, ГпЬВ и Е1Ь, бета-гемолизин и Спа, бета-гемолизин и Т88Т-1, бета-гемолизин и тесА, бетагемолизин и 86γΌ, бета-гемолизин и 8бгГ, бета-гемолизин и ЕЬр8, бета-гемолизин и ЕГЬ, Спа и Т88Т-1, Спа и тесА, Спа и 8бЮ, Спа и 8бгГ, Спа и ЕЬр8, Спа и ЕГЬ, т88Т-1 и тесА, Т88Т-1 и 8бЮ, Т88Т-1 и 8бгГ, Т88Т-1 и ЕЬр8, ΤδδΤ-1 и ЕГЬ, МесА и 8бЮ, МесА и 8бгГ, МесА и ЕЬр8, МесА и ЕГЬ, 8бгЭ и 8бгГ, 86γΌ и ЕЬр8, 8беЭ и ЕГЬ, 8бгГ и ЕЬр8, 8бгГ и ЕГЬ, и, ЕЬр8 и ЕГЬ.
Вышеописанные комбинации можно комбинировать с дополнительными компонентами, описанными выше.
Защита против 8. аигеиз и 8. ерШегтШк
В одном из воплощений по изобретению иммуногенная композиция обеспечивает эффективный иммунный ответ против более чем одного штамма стафилококков, например против штаммов из 8. аигеик и 8. ер|бепшбА Например, защитный иммунный ответ формируется против серотипов 8. аигеик
- 19 015833 типа 5 и типа 8.
Одно из применений иммуногенной композиции по изобретению заключается в предупреждении нозокомиальных инфекций, например у пациентов, перенесших плановую операцию, путем инокуляции перед госпитальным лечением. На этой стадии сложно точно спрогнозировать, с какими штаммами стафилококка столкнется пациент. Поэтому предпочтительно инокулировать вакциной, способной формировать эффективный иммунный ответ против различных штаммов стафилококков.
Эффективный иммунный ответ определяется как иммунный ответ, который обеспечивает существенную защиту в модели сенсибилизации мыши или опсонофагоцитарном анализе, как описано в примерах. Существенная защита в модели сенсибилизации мыши, например как в примере 5, определяется как увеличение средней летальной дозы (ЬО50) по сравнению с мышами, инокулированными носителем по меньшей мере на 10, 20, 50, 100% или 200%. Существенная защита в модели сенсибилизации крысы, например как в примере 8, определяется как уменьшение среднего наблюдаемого ЬодСЕи/нос по меньшей мере на 10, 20, 50, 70 или 90%. Присутствие опсонизирующих антител, как известно, коррелирует с защитой, поэтому на существенную защиту указывает уменьшение количества бактерий по меньшей мере на 10, 20, 50, 70 или 90% в опсонофагоцитарном анализе, например как в примере 7.
Некоторые белки, включающие иммунодоминантный ЛВС транспортер, ΚΝΑ III активирующий белок, рецепторы ламинина, 8ЙС, I8аЛ/Ρ^8Α, 8δΗΑ, Ε№Α/Ε№Β, ЕЬр8 и Аар достаточно консервативны у 8. аигеиз и 8. Ер1йегт1й18, и в примере 8 показано, что I8аЛ, СНА., 1зйВ, 8йг6, ΗπιΆ. ΡώρΑ и 8Ь1 могут вызывать перекрестно-реактивный иммунный ответ (например перекрестно-реактивный между по меньшей мере одним штаммом 8. аигеиз и по меньшей мере одним штаммом 8. ер|йепшйО). ΡΙΑ также достаточно консервативен между 8. аигеиз и 8. ер|йепшй18.
Таким образом, в одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит ΡΝΑΟ и полисахариды типа 5 и типа 8 и один, два, три или четыре из белков, указанных выше.
Вакцины
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению смешана с фармацевтически приемлемым эксципиентом и возможно с адъювантом с образованием вакцины.
Вакцины по настоящему изобретению могут быть адъювантными, особенно когда они предназначены для применения у пожилого населения, а также для применения у детского населения. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, или фосфат алюминия, или алюминиевые квасцы, но также могут представлять собой соли других металлов, таких как кальций, магний, железо или цинк, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированных Сахаров, катионно или анионно дериватизированных сахаридов, или полифосфазены.
Предпочтительно, чтобы выбранный адъювант представлял собой избирательный индуктор ответа ТН1-типа. Такие высокие уровни цитокинов ТЫ-типа благоприятствуют индукции опосредованных клетками иммунных ответов на введенный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов Тп2-типа благоприятствуют индукции гуморальных иммунных ответов на антиген.
Различие иммунных ответов ТЫ- и Тп2-тила не является абсолютным. В реальности у индивида будет поддерживаться иммунный ответ, который описан как преимущественно ТЫ или преимущественно Тп2. Тем не менее, часто удобно рассматривать семейства цитокинов исходя из описанного для мышиных СЭ4 +уе Т-клеточных клонов Мосманом и Коффманом (Мозтапп, Т.К. апй СоГГтап, К.Ь. (1989) ТН1 апй ТН2 се11з: ййОегеп! райегпз оГ 1утр1юкше зесгейоп 1еай !о йЫегегИ Гипс1юпа1 ргорейгез. Αηηиа1 Ке\зе\\· оГ 1ттипо1о§у, 7, р145-173). Традиционно, ответы ТЫ-типа ассоциированы с продукцией Тлимфоцитами цитокинов интерферона гамма(ЮТ-у) и интерлейкина 1Ь-2. Другие цитокины, часто напрямую ассоциирующиеся с индукцией иммунных ответов ТЫ-типа, не продуцируются Т-клетками, такими как 1Ь-12. Напротив, ответы Тп2-типа связаны с секрецией 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10. Подходящие адъювантные системы, которые стимулируют преимущественно ответ ТЫ, включают: моноосфориллипид А или его производные (или детоксифицированный липид А в общем - см., например, МО 2005107798), в частности 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид Α (30-1080) (информацию о его получении смотри в ΟΒ 2220211 А); и комбинацию монофсфориллипида А, предпочтительно 3-де-Оацилированного монофосфориллипида А, вместе с либо солью алюминия (например фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо эмульсией масло в воде. В таких комбинациях антиген и 3О-МГ0 содержатся в одинаковых дисперсных структурах, с учетом более эффективной доставки антигенных иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 30-1000 способен дополнительно усиливать иммуногенность антигена, адсорбированного на квасцах |Т1юе1еп е! а1. Уассше (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В1].
Усиленная система включает в себя комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3^-МΡ^, как описано в МО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 гасится холестерином, как описано в МО 96/33739. Особенно сильнодействующий адъювантный препарат, включающий 0821, ^^Ο^ΡΟ- и токоферол в эмульсии масло в воде, описан в МО 95/17210. В одном из воплощений иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821. Препарат также может содержать эмульсию масло в воде и токо
- 20 015833 ферол (νθ 95/17210). Неметилированные СрС, содержащие олигонуклеотиды (νθ 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (νθ0226757 и νθ03507822) также являются предпочтительными индукторами ТН1-ответа и подходят для применения в настоящем изобретении.
Конкретными адъювантами являются адъюванты, выбранные из группы солей металлов, эмульсий масло в воде, агонистов То11-подобных рецепторов (в частности агонист То11-подобного рецептора 2, агонист То11-подобного рецептора 3, агонист То11-подобного рецептора 4, агонист То11-подобного рецептора 7, агонист То11-подобного рецептора 8 и агонист То11-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций.
Адъювант, который может быть использован в композиции вакцины по изобретению, представляет собой препарат в виде пузырьков или везикул внешней мембраны из грамотрицательных бактериальных штаммов, о которых сообщается в νθ 02/09746, в частности везикул N. тешпдШЛк. Адъювантные свойства везикул могут быть улучшены за счет удерживания ЬОБ (липополисахарида) на ее поверхности (например, посредством экстракции низкими концентрациями детергента [например, 0-0,1% дезоксихолатом]). ЬОБ может быть детоксифицирован посредством ткЬВ(-) или ЫгВ(-) мутаций, рассмотренных в νθ 02/09746. Свойства адъюванта также могут быть улучшены за счет удержания РогВ (и возможно удаления РогА) из везикул менингококков. Свойства адъювантов также могут быть улучшены усечением внешней коровой сахаридной структуры ЬОБ на везикулах менингококков, например посредством 1дВ(-) мутации, рассмотренной в νθ 2004/014417. Альтернативно, вышеупомянутый ЬОБ (например выделенный из штамма ткЬВ(-) и/или 1дВ(-)) может быть очищен и использован в качестве адъюванта в композициях по изобретению.
Дополнительные адъюванты, которые могут быть использованы с композициями по изобретению, могут быть выбраны из следующей группы: сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид, алкилглюкозаминидфосфат, эмульсия масло в воде или их комбинации. Дополнительный предпочтительный адъювант представляет собой соль металла в комбинации с другим адъювантом. Предпочтительно, адъювант представляет собой агонист То11-подобного рецептора, в частности агонист То11-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности Ок21. Кроме того, предпочтительно, адъювантная система включает два или более адъювантов из приведенного выше перечня. В частности, комбинации предпочтительно содержат сапониновый (в частности Ок21) адъвант и/или агонист То11-подобного рецептора 9, например иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий СрС. Другие предпочтительные комбинации содержат сапонин (в частности ОБ21) и агонист То11подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А или его 3-деацилированное производное, 3ΌМРЬ, или сапонин (в частности ОБ21) и лиганд То11-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминида фосфат.
Особенно предпочтительными адъювантами являются комбинации 3Э-МРЬ и ОБ21 (ЕР 0671948 В1), эмульсии масло в воде, содержащие 3Э-МРЬ и РБ21 (\УО 95/17210, VО 98/56414), или 3Э-М1РЕ приготовленный в виде препарата с другими носителями (ЕР 0689454 В1). Другие предпочтительные адъювантные системы содержат комбинацию 3П-МРЬ, ОБ21 и СрС олигонуклеотид, как описано в ИБ 6558670, ИБ 6544518.
В одном из воплощений адъювант представляет собой лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК) 4, предпочтительно агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно 3 деацилированный монофосфориллипид А (3Э-МРЬ).
3Э-МРЬ поставляется С1ахоБтййК1те Вю1одюа1к №г111 Атенса и прежде всего промотирует СЭ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом интерферон гамма 1Е№у (Тй1). Он может быть продуцирован способами, раскрытыми в СВ 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно, в композициях по настоящему изобретению используют 3Э-МРЬ с небольшим размером частиц. 3Э-МРЬ имеет небольшой размер частиц, так что он может быть подвергнут стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в международной патентной заявке VО 94/21292. Синтетические производные липида А известны и являются агонистами ТЬК 4, включая, но не ограничиваются ими: ОМ174 (2-дезокси-
6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-О-глюкопиранозил]-2-[(К)3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-О-глюкопиранозилдигидрофосфат) (\УО 95/14026), ОМ 294 ЭР (3Б,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис(дигидрофосфат) (\УО 99/64301 и VО 00/0462) ОМ 197 МР-Ас ЭР (3Б,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино] декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (\УО 01/46127).
Другими лигандами ТЬК4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (АСР), например описанные в VО 9850399 или ИБ 6303347 (способы получения АСР также раскрыты), или фармацевтически приемлемые соли АСР, раскрытые в ИБ 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК4, а некоторые являются антагонистами ТЬК4. Считается, что оба полезны в качестве адъювантов.
Другой предпочтительный иммуностимулятор для применения в настоящем изобретении представ
- 21 015833 ляет собой 0ι.ιί1 А и его производные. 0ш1 А представляет собой сапониновый препарат, выделенный из южноамериканского дерева 0ш1а)а 8ароиапа Мо1ша и впервые описанный как обладающий адъювантной активностью ЭаЕдаагб е! а1. в 1974 году (8ароши аб-туаий, АгсЫу. Гиг б1е декапИе УпиГогасйиид, Уо1. 44, 8ргшдег Уег1ад, Вегйи, р243-254). Очищенные фрагменты Οιιί1 А были выделены высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), которая сохраняет адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с Ош1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известные как 0А7 и 0А21). 08-21 представляет собой природный сапонин, выделенный из коры 0ш11а)а кароиапа Мо1ша, который индуцирует СГО8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), клетки ТЫ и преобладающий ответ в виде антител 1дС2а, и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения.
Были описаны конкретные препараты 0821. которые являются особенно предпочтительными, и эти препараты дополнительно содержат стерин (νθ 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл, смешанных мицелл (предпочтительно, но не исключительно с солями желчных кислот) или могут быть в форме матриц 18СОМ (ЕР 0109942 В1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как спиралевидные или кольцевидные мультимерные комплексы или липидные/слоистые структуры и ламеллы, если они приготовлены с холестерином и липидом, или в форме эмульсии масло в воде (например как в νθ 95/17210). Сапонины предпочтительно могут быть ассоциированными с металлической солью, такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (νο 98/15287).
Предпочтительно, сапонин представлен в форме липосомы, 18СОМ или эмульсии масло в воде.
Усиленная система включает в себя комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицитрованного липида А) и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3П-МРЬ, как раскрыто в νθ 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен холестерином, как раскрыто в νθ 96/33739. Особенно сильный адъювантный препарат, включающий в себя токоферол с 0821 и/или 3Э-МРЫ или без них в эмульсии масло в воде, описан в νθ 95/17210. В одном из воплощений иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821.
Также могут быть использованы иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист То11-подобного рецептора (ТЬВ) 9. Предпочтительные олигонуклеотиды для использования в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению представляют собой олигонуклеотиды, содержащие СрС, предпочтительно содержащие два или более динуклеотидных мотивов СрС, разделенные по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрС представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. СрС олигонуклеотиды по настоящему изобретению типично представляют собой дезоксинуклеотиды. В предпочтительном воплощении промежуточный нуклеотид в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоат или более предпочтительно фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфир и другие межнуклеотидные связи входят в объем изобретения. Также в объем изобретения входят олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоата описаны в И8 5666153, И8 5278302 и νθ 95/26204.
Примеры предпочтительных олигонуклеотидов имеют указанные ниже последовательности. Эти последовательности предпочтительно содержат фосфоротиоатные модифицированные межнуклеотидные связи. ОЬЮО 1(8Ер ГО N0:1): ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826) ОЬЮО 2 (8ЕО ГО N0:2): ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758) ОЬЮО 3(8Ер ГО ^:3): АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС ОЬЮО 4 (8ЕО ГО ^:4): ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ СТС СТТ (СрС 2006) ОЬЮО 5 (8ЕО ГО ^:5): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668) ОЬЮО 6 (8ЕО ГО ^:6): ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456)
Альтернативные СрС олигонуклеотиды могут содержать вышеприведенные предпочтительные последовательности, имеющие несущественные делеции или вставки.
СрС олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники (см., например, ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды удобно синтезировать с использованием автоматического синтезатора.
Адъювант может представлять собой эмульсию масло в воде или может содержать эмульсию масло в воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы предпочтительно содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло общеизвестно в данной области техники. Метаболизируемое может быть определено как способное к трансформации путем метаболизма ГОоНаибЕ 111и81га1еб Мебюа1 Оюйоиагу, ν.Β. 8аибегк Сотраиу, 25'1' ебШои (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное или синтетическое масло, не токсичное для реципиента и способное к трансформации в результате метаболизма. Обычными источниками растительных масел являются орехи, семена и зерна. Синтетические масла также являются частью изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла, такие как NЕОΒЕЕ® и другие. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом масле, масле проростков пшеницы, масле рисовых отрубей и в дрожжах, и представляет собой особенно предпочтительное масло для применения по изобретению. Сквален представляет собой метаболизируе
- 22 015833 мое масло ввиду того, что оно представляет собой промежуточное соединение в биосинтезе холестерина (Мегск 1пбех, 104Ь ЕбШои, еи!гу по. 8619).
Токолы (например витамин Е) также часто используются в адъювантах на основе масляной эмульсии (ЕР 0382271 В1; И8 5667784; \У0 95/17210). Токолы, используемые в масляных эмульсиях (предпочтительно эмульсии масло в воде) по изобретению, могут быть приготовлены как описано в ЕР 0382271 В1, то есть токолы могут представлять собой возможно содержащие эмульгатор дисперсии токоловых капель, имеющих диаметр предпочтительно меньше 1 мкм. Альтернативно, токолы могут быть использованы в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Здесь описаны примеры масляных эмульсий, которые могут быть использованы в комбинации с токолом, такие как вышеописанные метаболизируемые масла.
Адъюванты-эмульсии масло в воде сами по себе описаны как полезные в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843В), также комбинации эмульсий масло в воде и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (\У0 95/17210; \У0 98/56414; \У0 99/12565; \У0 99/11241). Описаны другие адъюванты-масляные эмульсии, такие как эмульсии вода в масле (И8 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии вода в масле в воде (И8 5424067; ЕР 0480981 В). Для образования адъювантов и композиций по настоящему изобретению из всех форм предпочтительными являются масляные эмульсионные системы (в частности, при введении токолов).
Наиболее предпочтительно, масляная эмульсия (например эмульсии масло в воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Τ\νΕΕΝ 80 и/или стерин, такой как холестерин. Предпочтительная масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло в воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как альфа-токоферол (и предпочтительно и сквален, и альфа-токоферол) и возможно эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Тмееп 80. Также может быть включен стерин (предпочтительно холестерин). Способ получения эмульсий масло в воде хорошо известен специалистам в данной области техники. В общем, способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностно-активным веществом, таким как раствор ΡΒ8/ ΤνΕΕΝ80™ (ΡΒ8 - забуференный фосфатами физиологический раствор), с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что способ, включающий пропускание смеси дважды через иглу шприца, может быть подходящим для гомогенизации небольших объемов жидкости. Аналогично, способ эмульгирования в микрофлюидизаторе (М1108 М1сгоДи141ск тасЫие, максимально 50 пропусканий, в течение 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (6х105 Па) (давление на выходе приблизительно 850 бар (850х105 Па)) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптирования можно достичь проведением рутинных экспериментов, включающих измерение получающейся эмульсии до тех пор, пока не будет получен препарат с каплями масла требуемого диаметра. В эмульсии масло в воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, забуференный фосфатами физиологический раствор.
Размер масляных капель, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло в воде, предпочтительно составляет менее 1 мкм, может быть в пределах по существу 30-600 нм, предпочтительно, по существу, приблизительно 30-500 нм в диаметре, и наиболее предпочтительно, по существу, 150-500 нм в диаметре, и в частности, приблизительно 150 нм в диаметре, измеренном при помощи фотонно-корреляционной спектрометрии. В этой связи 80% количества масляных капель должны находиться в предпочтительных диапазонах, более предпочтительно, более 90% и наиболее предпочтительно более 95% количества масляных капель находятся в пределах определенного размера. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно находятся в диапазоне 0,5-20% или от 2 до 10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если присутствует, от 2 до 10% альфатокоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтилен-сорбитанмоноолеат. Предпочтительно, соотношение масло (предпочтительно сквален): токол (предпочтительно альфа-токоферол) равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Эмульгатор, такой как Тмееп 80 или 8рап 85, также может присутствовать на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях, предпочтительным может быть, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
Примеры предпочтительных эмульсионных систем описаны в ν0 95/17210, ν0 99/11241 и ν0 99/12565, в которых раскрыты адъюванты-эмульсии на основе сквалена, α-токоферола и ΤνΕΕΝ 80, возможно в составе с иммуностимуляторами 0821 и/или 3Б-МРБ. Поэтому, в частности, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения адъювант по изобретению дополнительно может содержать дополнительные иммуностимуляторы, такие как ЬР8 или его производные, и/или сапонины. Примеры дополнительных иммуностимуляторов описаны здесь и в Уассше Оекфп - Тйе 8иЬиш! апб Аб_)иуап! Арргоасй 1995, Рйагтасеи!1са1 Β^ο!есйпο1οду, Уо1ите 6, Ебк. Ро\ге1Е М.Е., апб №\утап. М.Б, Р1епит Ргекк, Νο\ν Уогк апб Бопбоп, Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х.
В предпочтительном аспекте адъювант и иммуногенные композиции по изобретению содержат сапонин (предпочтительно 0821) и/или производное БР8 (предпочтительно 3Б-МРБ) в вышеописанной
- 23 015833 масляной эмульсии, возможно со стерином (предпочтительно холестерином). Дополнительно, масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло в воде) может содержать 8рап 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в νθ 99/12565.
В типичных случаях для введения людям сапонин (предпочтительно 0821) и/или производное ЬР8 (предпочтительно 3О-МРЬ) присутствуют в дозе иммуногенной композиции для введения людям в количестве в пределах 1-200 мкг, например 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. Типично, масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло в воде) содержит от 2 до 10% метаболизируемого масла. Предпочтительно она содержит от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфа-токоферола и от 0,3 до 3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно Т\гееп 80 [полиоксиэтиленсорбитана моноолеат]). Если присутствуют и сквален, и альфа-токоферол, предпочтительно соотношение сквален:альфатокоферол равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. 8рап 85 (сорбитана триолеат) также может присутствовать на уровне от 0,5 до 1% в эмульсиях, используемых в данном изобретении. В некоторых случаях может быть предпочтительным, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества, включающие каприловую кислоту (Мегск тбех 10'1' Εάίΐίοη, еп1гу по. 1739), из которых особенно предпочтителен трикаприлин.
Если в состав включены сквален и сапонин (предпочтительно 0821), то также полезно включать в состав стерин (предпочтительно холестерин), поскольку это позволяет снизить общий уровень масла в эмульсии. Это приводит к уменьшению производственную себестоимости, улучшению общего комфорта вакцинации, а также качественному и количественному улучшению результирующих иммунных ответов, например к улучшению продукции ΙΕΝ-γ. Соответственно, адъювантная система по настоящему изобретению типично имеет соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в пределах от 200:1 до 300:1, настоящее изобретение также может быть использовано в форме с низким содержанием масла, предпочтительное соотношение в которой составляет от 1:1 до 200:1, предпочтительно от 20:1 до 100:1 и наиболее предпочтительно по существу 48:1, и эта вакцина сохраняет благоприятные адъювантные свойства всех компонентов при значительно уменьшенном профиле реактогенности. Соответственно, в особенно предпочтительных воплощениях соотношение сквален:0521 (мас./мас.) находится в пределах от 1:1 до 250:1, предпочтительно в пределах от 20:1 до 200:1, предпочтительно от 20:1 до 100:1 и наиболее предпочтительно по существу 48:1. Предпочтительно, в состав также входит стерин (наиболее предпочтительно холестерин) при описанном здесь соотношении сапонин:стерин.
Эмульсионные системы по настоящему изобретению предпочтительно имеют масляные капли небольшого размера в субмикронном диапазоне. Наиболее предпочтительно, размеры масляных капель находятся в диапазоне от 120 до 750 нм и наиболее предпочтительно 120-600 нм в диаметре.
Особенно сильный адъювантный препарат (для конечной комбинации с А1РО4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает в себя сапонин (предпочтительно 0821), производное ЬР8 (предпочтительно 3П-МРЬ) и масляную эмульсию (предпочтительно сквален и альфа-токоферол в эмульсии масло в воде), как описано в νθ 95/17210 или в νθ 99/12565 (в конкретном адъювантном препарате 11 в примере 2, таблица 1).
Примеры агониста ТЬК. 2 включают пептидогликан или липопротеин. Имидазохинолины, такие как имиквимод и резиквимод, представляют собой известные агонисты ТЬК7. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом ТЬК (ТЬК8 у людей и ТЬК7 у мышей), тогда как двухцепочечная РНК и поли 1С (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - коммерческий синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов ТЬК 3. 3П-МРЬ является примером агониста ТЬК4, а СРС является примером агониста ТЬК9.
Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соль металла. Основанные на алюминии препараты вакцины, где антиген и иммуностимулятор 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А (3П-МРЬ) адсорбированы на одной и той же частице, описаны в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1, и ЕР 0633784 В1. В этих случаях антиген сначала адсорбируют на соль алюминия, затем осуществляют адсорбцию иммуностимулятора 30-МРЬ на тех же самых частицах соли алюминия. В таких способах сначала осуществляют суспендирование 30-МРЬ путем обработки ультразвуком в водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера от 80 до 500 нм. Антиген обычно адсорбируют на соль алюминия в течение одного часа при комнатной температуре при встряхивании. Затем к адсорбированному антигену добавляют суспензию 3П-МРЬ, и препарат инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем хранят при 4°С до использования.
В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных металлических частицах, как описано в ЕР 1126876. Усовершенствованный способ включает адсорбцию иммуностимулятора на частицу соли металла, затем адсорбцию антигена на другую частицу соли металла, затем смешивание дискретных металлических частиц с образованием вакцины. Адъювантом для использования в настоящем изобретении может быть адъювантная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающаяся тем, что частица соли металла по существу не несет на себе другой антиген. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены вакцины, которые отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, которые, по существу, не не
- 24 015833 сут на себе другой антиген, и тем, что частицы соли металла, на которых адсорбирован антиген, по существу, не несут на себе другой иммуностимулятор.
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена адъювантная композиция, содержащая иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, отличающаяся тем, что эта композиция, по существу, не содержит другой антиген. Кроме того, эта адъювантная композиция может представлять собой промежуточный препарат, который, если используется такой адъювант, требуется для изготовления вакцины. Соответственно предложен способ изготовления вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, в которой один или более иммуностимуляторов адсорбирован(ы) на частице металла с антигеном. Предпочтительно антиген предварительно был адсорбирован на соли металла. Указанная металлическая соль может быть идентичной или аналогичной металлической соли, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Предпочтительно соль представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице металлической соли, и антиген, адсорбированный на металлической соли, отличающаяся тем, что первая и вторая частица металлической соли представляют собой отдельные частицы.
Описанные здесь производные или мутации ЬР8 или ЬО8 или производные липида А сконструированы так, что они менее токсичны (например 3О-МРЬ), чем нативные липополисахариды, и представляют собой взаимозаменяемые эквиваленты в отношении любых применений этих группировок, описанных здесь.
В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит липосомный носитель (изготовленный известными методами из фосфолипидов (таких как диолеоилфосфатидилхолин ЩОРС]) и возможно стерина [такого как холестерин]). Такие липосомные носители могут нести на себе производные липида А [такие как 3О-МРЬ, см. выше] и/или сапонины (такие как 0821. смотри выше). В одном из воплощений адъювант содержит (на дозу 0,5 мл) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 или 0,5-1 мг (например, 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 или 1 мг) фосфолипида (например, ИОРС), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60,10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3О-МРЬ) и 5-60,10-50, или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, 0821).
В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит эмульсию масло в воде, приготовленную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Тетееп 80) и возможно токола (такого как альфа-токоферол). В одном из воплощений адъювант содержит (на 0,5 мл дозу) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8 или 5-6 мг (например 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 или 2-3 мг (например 0,9-1,1, 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Т\уееп 80) и возможно 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (например, 1113, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как альфа-токоферол).
Этот адъювант дополнительно может содержать 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3О-МРЬ).
Этот адъювант возможно может содержать 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3П-МРЬ), и 560, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, Р821).
В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3О-МРЬ). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750, 200-500 или 300-400 мкг А1 в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например 3О-МРЬ). Вакцинные препараты по настоящему изобретению могут быть использованы для защиты или лечения млекопитающего, чувствительного к инфекции, путем введения указанной вакцины системным путем или через слизистые оболочки. Эти способы введения могут включать инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, интрадермальным или подкожным путем; или путем введения через слизистые оболочки рта/пищеварительного тракта, респираторного, мочеполового тракта. Интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита является предпочтительным (так как носоглоточное носительство пневмококков может быть предотвращено более эффективно и, в результате, инфекция может быть ослаблена на своей самой ранней стадии). Хотя вакцина по изобретению может быть введена в виде разовой дозы, ее компоненты также можно вводить совместно одновременно или в разные моменты времени (например, пневмококковые сахаридные конъюгаты могут быть введены раздельно, одновременно или через 12 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов относительно друг друга). Для совместного введения возможный ТЫ адъювант может присутствовать в любом из или всех разных введениях, например он может присутствовать в комбинации с бактериальным белковым компонентом вакцины. В дополнение к одному пути введения можно использовать 2 разных пути введения. Например, полисахариды можно вводить внутримышечно
- 25 015833 (ВМ) (или интрадермально (ИД)), а бактериальные белки можно вводить интраназально (ИН) (или ИД). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить ВМ для примирующих доз и ИН для бустер-доз.
Количество конъюгированного антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое вызывает иммунопротективный ответ без существенных неблагоприятных побочных эффектов в обычных вакцинах. Такое количество варьирует в зависимости от того, какой специфический иммуноген используется и как он презентирован. Как правило, ожидается, что каждая доза будет содержать 0,1-100 мкг полисахарида, обычно 0,1-50, 0,1-10, 1-10 или 1-5 мкг для полисахаридных конъюгатов.
Содержание белковых антигенов в вакцине в типичных случаях будет находиться в пределах 1-100 мкг, 5-50 или 5-25 мкг. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций, адекватно разделенных по времени.
Приготовление вакцин в общем описано в Уассше Эекщп (ТНе киЬиш! аиб афиуаи! арргоасй (ебк Ро\ге11 М.Е. & №\\шап М.1.) (1995) Р1еиит Ргекк Νο\ν Уогк). Инкапсулирование в липосомы описано ЕиПейои в патенте И8 4235877.
Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в виде растворов или лиофилизированными. Возможно, раствор лиофилизируют в присутствии сахара, такого как сахароза, трегалоза или лактоза. Предпочтительно, они лиофилизированы, и непосредственно перед применением их разводят. В результате лиофилизации можно иметь более стабильную композицию (вакцину).
Способы
Изобретение также охватывает способ изготовления иммуногенных композиций и вакцин по изобретению.
В одном из воплощений способ по изобретению представляет собой способ изготовления вакцины, включающий стадии смешивания антигенов с получением иммуногенной композиции по изобретению и добавления фармацевтически приемлемого эксципиента.
Способы лечения
Изобретение также охватывает способ лечения стафилококковой инфекции, в частности внутрибольничных нозокомиальных инфекций.
Данная иммуногенная композиция или вакцина по изобретению особенно полезна для применения в случаях плановой операции. Такие пациенты заранее знают дату операции и могут быть инокулированы заранее. Поскольку не известно, подвергнется ли пациент инфицированию 8. аигеик или 8. ерИегιηίάίκ. предпочтительно инокулировать вакциной по изобретению, которая защищает против обеих инфекций, как описано выше. Типично, взрослых пациентов в возрасте свыше 16 лет, ожидающих плановое хирургическое вмешательство, лечат иммуногенными композициями и вакцинами по изобретению. Альтернативно, детей в возрасте 3-16 лет, ожидающих плановое хирургическое вмешательство, лечат иммуногенными композициями и вакцинами по изобретению.
Вакциной по изобретению можно инокулировать также патронажных медицинских работников.
Препараты вакцины по настоящему изобретению могут быть использованы для защиты или лечения млекопитающего, чувствительного к инфекции, путем введения указанной вакцины системным путем или через слизистую оболочку. Эти введения могут включать инъекцию внутримышечным, интраперитонеальным, интрадермальным или подкожным путем; или путем введения через слизистую оболочку в ротовую полость/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракты.
Количество антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое вызывает иммунопротективный ответ без существенных неблагоприятных побочных эффектов в типичных вакцинах. Такое количество варьирует в зависимости от того, какой специфический иммуноген используется и как он презентирован. Содержание белка в вакцине типично находится в диапазоне 1-100, 5-50 мкг, типично в диапазоне 10-25 мкг. Оптимальное количество для конкретной вакцины может быть установлено стандартными исследованиями, включающими отслеживанием иммунных ответов у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций, адекватно разделенных по времени.
Хотя вакцины по настоящему изобретению могут быть введены любым путем, введение желательных вакцин в кожу (ИД) составляет одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит внешнюю роговую кутикулу, называемую роговым слоем, которая покрывает эпидермис. Под этим эпидермисом расположен слой, называемый дермой, которая, в свою очередь, покрывает подкожную ткань. Исследователи продемонстрировали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, с которым также может быть ассоциировано множество дополнительных преимуществ. Интрадермальная вакцинация описанными здесь вакцинами составляет возможный признак настоящего изобретения.
Общепринятая методика интрадермальной инъекции, процедура Манту, включает стадии очистки кожи и затем оттягивания одной рукой и стадию, на которой срезом узкой иглы (26-31 гейджей), направленным вверх, иглу вводят под углом 10-15°. После введения среза иглы тело иглы опускают и далее продвигают, в то же время прикладывая слабое давление для подъема ее под кожей. Жидкость затем очень медленно впрыскивают, образуя таким образом пузырек или бугорок на поверхности кожи, и затем иглу медленно вытягивают.
- 26 015833
Относительно недавно были описаны устройства, которые специально разработаны для введения жидких агентов в кожу или через кожу, например устройства, описанные в νθ 99/34850 и ЕР 1092444, а также устройства для струйной инъекции, описанные, например, в νθ 01/13977, И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, и8 4940460, νθ 97/37705 и νθ 97/13537. Альтернативные способы интрадермального введения вакцинных препаратов могут включать традиционные шприцы и иглы, или устройства, разработанные для баллистической доставки твердых вакцин (νθ 99/27961), или трансдермальные пластыри (νθ 97/48440; νθ 98/28037); или наносимые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка νθ 98/20734; νθ 98/28037).
Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или, более конкретно, в дерму, вакцина находится в малом объеме жидкости, в частности в объеме от приблизительно 0,05 до 0,2 мл.
Содержание антигенов в вакцинах для кожного или интрадермального введения по настоящему изобретению может быть сходным с обычными дозами в вакцинах для внутримышечного введения (смотри выше). Тем не менее, особенность вакцин для кожного или интрадермального введения заключается в том, что препараты могут содержать низкую дозу. Соответственно, белковые антигены в вакцинах с низкой дозой предпочтительно присутствуют в количестве от 0,1 до 10 мкг, предпочтительно от 0,1 до 5 мкг на дозу; и полисахаридные (предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг и возможно от 0,01 до 0,5 мкг полисахарида на дозу.
Использованный здесь термин интрадермальная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Тем не менее, вакцина не обязательно должна находиться исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мм от поверхности человеческой кожи, но существует некоторая степень варьирования между индивидами и в различных частях организма. В общем можно ожидать, что дермы можно достичь на глубине 1,5 мм под поверхностью кожи. Дерма располагается между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем ниже. В зависимости от способа доставки вакцина, в конечном счете, может быть локализована исключительно или в основном в дерме, или она, в конечном счете, может быть распределена между эпидермисом и дермой.
Одно из воплощений изобретения представляет собой способ предупреждения или лечения стафилококковой инфекции или заболевания, включающий стадию введения иммуногенной композиции или вакцины по изобретению нуждающемуся в этом пациенту.
Еще одно воплощение изобретения представляет собой применение иммуногенной композиции по изобретению в изготовлении вакцины для лечения или предупреждения стафилококковой инфекции или заболевания, возможно стафилококковой инфекции после хирургического вмешательства.
Термин стафилококковая инфекция охватывает инфекцию, вызванную 8. аигеик и/или 8. ер1бегт1б1к и другими стафилококковыми штаммами, способными вызывать инфекцию у млекопитающих, возможно людей.
В данном описании в каждом случае термины содержащий, содержат и содержит и соответственно термины состоящий из, состоят из и состоит из возможно взаимозаменяемы.
Все источники информации и патентные заявки, процитированные в данном описании, включены в данное описание посредством ссылки.
Для лучшего понимания данного изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации, и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструкция плазмиды для экспрессии рекомбинантных белков.
А. Клонирование.
Подходящие сайты рестрикции, сконструированные в олигонуклеотидах, специфические для стафилококкового гена, давали возможность для направленного клонирования продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) в экспрессирующуюся плазмиду Е.сой рЕТ24б или рОЕ-30 таким образом, чтобы белок мог экспрессироваться в виде слитого белка, содержащего последовательность для аффинной хроматографии (Н1к)6 по N или С-концу.
Использованными праймерами были:
- 27 015833
Альфа-токсин - б'-СССССАТССССАСАТТСТСАТАТТААТАТТААААС-З' и 5'СССААССТТТТААТТТСТСАТТТСТТСТТТТТС-З'
ЕЬр8 - 5'-С0СС6АТССССТ066ТСТААТААТТТТ/\АА6АТС-3' и б'СССААОСТТТТАТСОААТААССАТТТСТТО-З'
СНА - 5’-СеСОСАТССАСТСААААТАСТ6ТТАСеСААТС-3’ и б’СССААССТТТТАСТСТССААТТСОТТСААТТТС-З'
ЕпЬрА - 5'-СОС6САТССАСАСАААСААСТ6СААСТААС63' и 5!СССААОСТТТТАТ6СТТТОТСАТТСТТТТТСАААСЗ!
8Ы - б'-ССССбАТССААСАСССААСАААСТТС-З' и 5'6СААСТССА6ТТАТТТССА6ААТОАТААТАААТТАС-3' ЗбгС - б'-ССССОАТССССАСААСАТАССААТССАб-З' и б'СССААССТТТТАТСТТТСТТСТТССТАеТАОС-З' ЗбгС - б'-СССССАТСССАССАСААТТСАОТАСААО-З' и 5'СССААССТТТТАТТССТСАТСАТА6ТАТССО-3' ЕЫ1 - 5'-ААААСТАСТСАССАССАССАССАСС-3' и б'ААААСТАСТСАСТТСАТТСАТСбСТТСАС-З' Ааа- 5-6С6ССССАТСССАСААССТТСТАСАСААСАТАС-3' и б'ССССОСТССАСАТОСАТСААТССАТАССТАСА-З' |8аАб'-бСАТССАТСССАССАТСАССАТСАССАССААбТАААСбТТСАТСААбС-З' и б'-АССАСТССАСТТАСААТССССААССАССТАААСС-З' НагА - б'-ССАСССАТОССАОААААТАСАААТАСТТС-З1 и б'ТТТТСТССАбСАТТТТАСАТТСАСТААСТТС-З1
Аутолизин глюкозаминидаза 5'-САА6ТСССАТ6ОСТСАСАССАСАСАА6АТСААС-3'и б'-САСТСТС6А6ТТТТАСАССТСТТТТТ06ТТ0-3'
Аутолизин амидаза - б'-АССТСАТАТОССТТАТАСТСТТАСТАААСС-З' и б'СССССТСбАСТТТАТАТТбТСССАТСТСО-З' ΙεάΑ - б'-СААбТСССАТСбСААСАСААбСТАССААСССААС-З' и б'АССАСТСТСбАСТААТТСТТТАбСТТТАСАбСТТС-З' ΙδάΒ - б'-ТАТТСТССАОССТТТСАСТСТСТССАТСАТТТО-З' и б'СААСССАТСбСАОСАбСТОААОАААСАССТОС-З' ΜΚΡΙΙ - б'-САТТАСАССАТСОТТАААССТСАА6С6ААА-3' и б'АССТбТСТССАСТОСбАТТбТАССТТСАТТ-З’.
Продукты ПЦР сначала вводили в клонирующий вектор рСЕМ-Т (Коуадеп) с использованием бактериальных клеток Тор 10 в соответствии с указаниями производителя. Эту промежуточную конструкцию получали для дополнительного облегчения клонирования в векторе экспрессии. Трансформанты, содержащие вставку ДНК, отбирали путем рестрикционного ферментативного анализа. После расщепления аликвоту реакционной смеси приблизительно 20 мкл анализировали методом электрофореза в агарозном геле (0,8% агароза в буфере ТгЕ-ацетат-ЭДТА (ТАЕ)). Фрагменты ДНК визуализировали в ультрафиолетовым (УФ) излучением после электрофореза в геле и окрашивания этидийбромидом. Стандарт молекулярной массы ДНК (лестница 1 Кб, Е1Ге Тескпо1од1ез) подвергали электрофоретическому анализу параллельно с тестируемыми образцами и использовали для оценки размера фрагментов ДНК. Плазмиду, очищенную из выбранных трансформантов для каждого клонирования затем последовательно расщепляли до завершения соответствующими рестриктазами в соответствии с рекомендациями производителя (I лГе Тескпо1од1ез). Расщепленный фрагмент ДНК затем очищали с использованием силикагелевых колонок для центрифугирования, после чего лигировали с плазмидой рЕТ24б или р9Е-30. Клонирование ЕЬк (фрагмент Н2), АаА, 1збА, 1збВ, НагА, А!1-амидазы, А!1-глюкозамина, МВР11, 1заА осуществляли с использованием плазмиды рЕТ24б, и клонирование С1ГА, 8бгС, 8бгЕ, РпЬрА, 8бгС/РЬе, альфа-токсина и 8Ь1 осуществляли с использованием плазмиды р9Е-30.
- 28 015833
Б. Продуцирование вектора экспрессии.
Для получения экспрессионной плазмиды рЕТ24б или рЦЕ-30 для лигирования ее аналогично расщепляли до завершения с использованием соответствующих рестриктаз. Приблизительно 5-кратный молярный избыток расщепленных фрагментов по отношению к полученному вектору использовали для программирования реакции лигирования. Общеизвестными в данной области способами стандартную, приблизительно 20 мкл, реакцию лигирования (приблизительно 16°С, приблизительно 16 ч) осуществляли с использованием Т4 ДНК лигазы (приблизительно 2,0 единиц/реакцию, ЬгТе Тесйпо1од1ек). Аликвоту лигируемой смеси (приблизительно 5 мкл) использовали для трансформации М15(рКЕР4) или ВТ21::ИЕ3 электрокомпентентных клеток в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. После приблизительно 2-3 часового периода роста при 37°С в приблизительно 1,0 мл среды Луриа-Бертани (ЬВ) трансформированные клетки высевали на планшеты с ЬВ агаром, содержащие ампициллин (100 мкг/мл) и/или канамицин (30 мкг/мл). Антибиотики включали в отбор. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С в течение приблизительно 16 ч. Индивидуальные АрК/КапК колонии точечно отбирали стерильными острыми тонкими палочками и использовали для инокуляции свежеприготовленных ЬВ АрК/КапК планшетов, а также приблизительно 1,0 мл ЬВ Ар/Кап культуры в бульоне. И инокулированный планшет, и культуру в бульоне инкубировали в течение ночи при 37°С в стандартном инкубаторе (планшеты) или водяной бане со встряхиванием. Основанный на целых клетках ПЦР-анализ использовали для подтверждения, что трансформанты содержат вставку ДНК. Для этого приблизительно 1,0 мл ночной культуры ЬВ Ар/Кап в бульоне переносили в полипропиленовую пробирку емкостью 1,5 мл, и клетки собирали центрифугированием в микроцентрифуге Весктап (приблизительно 3 мин, комнатная температуры, приблизительно 12000/д). Клеточный осадок суспендировали в приблизительно 200 мкл стерильной воды, и аликвоту приблизительно 10 мкл использовали для программирования конечного объема приблизительно 50 мкл реакционной смеси для ПЦР, содержащего праймеры для прямой и обратной амплификации. Начальную стадию денатурации при 95°С увеличивали до 3 минут для обеспечения температурного разрушения бактериальных клеток и высвобождения плазмидной ДНК. Термоциклер АВI Мобе1 9700 и 32-цикловый трехшаговый температурный профиль амплификации, т.е. 95°С, 45 с; 55-58°С, 45 с, 72°С, 1 мин использовали для амплификации фрагмента ВА8В203 из образцов лизированных трансформантов. После температурной амплификации аликвоту реакционной среды приблизительно 20 мкл анализировали электрофорезом в агарозном геле (0,8% агароза в буфере Тпк-ацетат-ЭДТА (ТАЕ)). Фрагменты ДНК визуализировали УФ-облучением после гель-электрофореза и окрашивания этидийбромидом. Стандарт молекулярной массы ДНК (лестница 1 Кб, ЬгТе Тесйпо1од1ек) подвергали электрофоретическому анализу параллельно с тестируемыми образцами и использовали для оценки размера продуктов ПЦР. Трансформанты, которые продуцировали продукт ПЦР ожидаемого размера идентифицировали как штаммы, содержащие белковую экспрессионную конструкцию. Штаммы, содержащие экспрессионную плазмиду, затем анализировали в отношении индуцируемой экспрессии рекомбинантного белка.
В. Анализ экспрессии ПЦР-положительных трансформантов.
Аликвоту ночной затравочной культуры (приблизительно 1,0 мл) инокулировали в колбу Эрленмейера емкостью 125 мл, содержащую приблизительно 25 мл бульона ЬВ Ар/Кап и выращивали при 37°С при встряхивании (приблизительно 250 об/мин) до тех пор, пока мутность культуры не достигала О.И.600 приблизительно 0,5, т.е. средняя фаза логарифмического роста (обычно приблизительно 1,5-2,0 ч). В этот момент времени приблизительно половину культуры (приблизительно 12,5 мл) переносили во вторую колбу емкостью 125 мл, и экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением ГРТС (изопропилтиогалактозид) (1,0М исходный раствор, приготовленный в стерильной воде, 81дта) до конечной концентрации 1,0 мМ. Инкубацию ГРТС-индуцированных и неиндуцированных культур продолжали в течение еще приблизительно 4 ч при 37°С при встряхивании. Образцы (приблизительно 1,0 мл) индуцированных и неиндуцированных культур отбирали после периода индукции, и клетки собирали центрифугированием в микроцентрифуге при комнатной температуре в течение приблизительно 3 мин. Индивидуальные клеточные осадки суспендировали в приблизительно 50 мкл стерильной воды, затем смешивали с равным объемом 2Х буфера для образца для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8И8-РАСЕ) по Лэмли, содержащего 2-меркаптоэтанол, и помещали в баню с кипящей водой приблизительно на 3 мин для денатурации белка. Равные объемы (приблизительно 15 мкл) неочищенных ГРТС-индуцированных и неиндуцированных клеточных лизатов наносили на 12% Тпк/глициновый полиакриламидный гель (минигели толщиной 1 мм, №хех) в двух повторах. Образцы индуцированных и неиндуцированных лизатов подвергали электрофорезу вместе с предварительно окрашенными маркерами молекулярной массы (8ееВ1ие, №хех) в обычных условиях с использованием стандартного 8И8/Тпк/глицинового буфера для анализа (ВюКаб). После электрофореза один гель окрашивали кумасси бриллиантовым голубым К250 (ВюКаб) и затем обесцвечивали для визуализации нового(ых) 1РТС-индуцибельного(ых) белка(ов). Второй гель подвергали электроблоттингу на поливинилиденфторидную (РУИР) мембрану (размер пор 0,45 мкм, №хех) в течение приблизительно 2 ч при 4°С с использованием аппарата для блоттинга ВюКаб М1ш-Рго1еап II и метанольного (20%) буфера для
- 29 015833 переноса Тоубина (То\\Ът). Блокирование мембраны и инкубации антитела осуществляли способами, хорошо известными в данной области. Моноклональное антитело против ВС8 (Н1з)3, затем второе кроличье антитело против антител мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена (НКР) (О1аСеп) использовали для подтверждения экспрессии и идентичности рекомбинантного белка. Визуализацию картины реактивных антител против Н1з осуществляли с использованием АВТ нерастворимого субстрата или с использованием НурегШт с системой хемилюминисценции АтегзНат ЕСЬ.
Пример 2. Продуцирование рекомбинантного белка.
Бактериальный штамм.
Рекомбинантный экспрессионный штамм Е. сой М15(рВЕР4), содержащий плазмиду (рОЕ30), или ВЬ21::ПЕ3, содержащий плазмиду рЕТ24й, кодирующую стафилококковый белок, использовали для продуцирования клеточной массы для очистки рекомбинантного белка.
Среды.
Ферментационная среда, используемая для продуцирования рекомбинантного белка, состояла из 2Х ΥΤ бульона (Эйсо), содержащего 100 мкг/мл Ар и/или 30 мкг/мл Кт. К среде добавляли антивспениватель для ферментера в концентрации 0,25 мл/л (АпйГоат 204, 81дта). Для индуцирования экспрессии рекомбинантного белка в ферментер добавляли рекомбинантный 1РТС (изопропил р-Э-тиогалактопиранозид) (1 мМ, конечная).
Продуцирование рекомбинантных белков.
В нативных условиях.
1РТС добавляли в конечной концентрации 1 мМ, и культуру выращивали в течение еще 4 ч. Культуру затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин, и осадок ресуспендировали в фосфатном буфере (50 мМ КгНРО4, КНгРО4 рН7), включающем в себя коктейль ингибиторов протеаз. Этот образец подвергали лизису под прессом Френча с использованием давления 1500 бар (150000 кПа) (дважды). После центрифугирования в течение 30 мин при 15000 об/мин супернатант сохраняли для дополнительной очистки и добавляли №1С1 до 0,5М. Образец затем наносили на смолу №-№ТА (колонка ХК 16 Рйагтас1а, смола №-№ТА О1адеп), уравновешенную в 50 мМ К2НРО4, КН2РО4 рН 7. После нанесения образца колонку промывали буфером А (0,2М NаΗ2РО4 рН 7, 0,3М №С1, 10% глицерин). Для элюирования связавшегося белка использовали пошаговый градиент, при котором различные пропорции буфера Б (0,2М NаΗ2РО4 рН7, 0,3М №С1, 10% глицерин и 200 мМ имидазол) добавляли к буферу А. Долю буфера Б постепенно увеличивали с 10 до 100%. После очистки элюируемую фракцию, содержащую белок, объединяли, концентрировали и диализировали против 0,002М КН2РО4/К2НРО4 рН 7, 0,15М №С1.
Этот способ использовали для очистки С1ГА, 8йгС, 1зйА, 1заВ, НагА, АЙ-глюкозамина и альфатоксина.
В денатурирующих условиях.
1РТС добавляли в конечной концентрации 1 мМ, и культуру выращивали в течение 4 дополнительных часов. Культуру затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин и осадок ресуспендировали в фосфатном буфере (50 мМ К2НРО4, КН2РО4 рН 7), включающем в себя коктейль ингибиторов протеаз. Этот образец подвергали лизису под прессом Френча с использованием давления 1500 бар (150000 кПа) (дважды). После центрифугирования в течение 30 мин при 15000 об/мин осадок промывали фосфатным буфером, включающим в себя 1М мочевину. Образец центрифугировали в течение 30 мин при 15000 об/мин и осадок ресуспендировали в 8М мочевине, 0,1 М NаΗ2РО4, 0,5М №С1, 0,01М Тп8-НС1 рН8 и хранили в течение ночи при комнатной температуре. Образец центрифугировали в течение 20 мин при 15000 об/мин и супернатант собирали для дополнительной очистки. Образец затем наносили на смолу №-ОТА (колонка ХК 16 Рйагтааа, смола №-№ТА О1адеп), уравновешенную в 8М мочевине, 0,1М NаΗ2РО4, 0,5М №С1, 0,01 М Тп8-НС1 рН8. После прохождения потока колонку последовательно промывали буфером А (8М мочевина, 0,1М NаΗ2РО4, 0,5М №С1, 0,01 М Тпз, рН 8,0), буфером В (8М мочевина, 0,1М NаΗ2РО4, 0,5М №С1, 0,01 М Тпз, рН 6,3), буфером Г (8М мочевина, 0,1М NаΗ2РО4, 0,5М №С1, 0,01 М Тпз, рН 5,9) и буфером Д (8М мочевина, 0,1М NаΗ2РО4, 0,5М №С1, 0,01 М Тпз, рН 4,5). Рекомбинантный белок элюировали с колонки во время промывок буфером Г и Д. Денатурированный рекомбинантный белок может быть солюбилизирован в растворе, лишенном мочевины. С этой целью денатурированный белок, содержащийся в 8М мочевине, последовательно диализовали против 4М мочевины, 0,1М №2РО4, 0,01М ТИ8-НС1, рН7,1, 2М мочевины, 0,1М NаΗ2РО4, 0,01М Тг1з-НС1, рН 7,1, 0,5М аргинина и 0,002М КН2РО4/К2НРО4 рН7,1, 0,15М №С1, 0,5М аргинина.
Этот способ использовали для очистки ЕЬН (фрагмент Н2), АаА, 8йгС, ЕпЬрА, 8Ь1, АЙ-амидазы и 1заА.
Очищенные белки анализировали методом 8Э8-РАСЕ. Результаты для одного белка, очищенного в нативных условиях (альфа-токсин), и одного белка, очищенного в денатурирующих условиях (8йгС), показаны на фиг. 3 и 4.
Пример 3. Получение конъюгатов капсулярного полисахарида 8. аигеиз с использованием 1-циано4-(диметиламино)-пиридиния тетрафторбората (СПАР).
Химия активации и сочетания для нативного Р88 с использованием СЭАР: 8А08-ТТ004.
Активацию и сочетание осуществляли при комнатной температуре при непрерывном перемешива- 30 015833 нии. 10 мг нативного полисахарида растворяли с получением конечной концентрации Р8 2,5 мг/мл в 0,2М №С1. Перед стадией активации раствор доводили до рН 6,0+/-0,2.
В момент времени 0 50 мкл раствора СО АР (100 мг/мл свежеприготовленного в смеси ацетонитрил/вода для инъекций (νΕΙ), 50/50) добавляли вручную до достижения соответствующего соотношения СИАР/Р8 (0,5/1). Через 1,5 мин рН поднимали до рН 9,00+/-0,05 добавлением 0,5М М10Н. Добавление №0Н занимает приблизительно 1 мин, и рН стабилизирован при значении рН 9,00+/-0,05 вплоть до добавления носителя.
В момент времени 4,5 мин добавляли 1,5 мл ТТ (10 мг/мл в 0,2М №1С1) до достижения подходящего соотношения белок/Р8 (1,5/1); рН немедленно доводили до рН 9,00+/-0,05. Раствор оставляли на один час при ручной регуляции рН. После стадии сочетания добавляли 0,5 мл 2М глицина (соотношение д1у/Р8 (мас./мас.): 7,5/1); рН немедленно доводили до 9,00+/-0,05. Раствор оставляли на 30 минут при ручной регуляции рН. Затем конъюгат осветляли с использованием 5 мкм фильтра М1шкаг1 и впрыскивали на 8ерйасгу1 8400НК (ХК16/100). Скорость потока фиксировали при 30 мл/ч с использованием 150 мМ №С1.
Элюируемые фракции анализировали резорцинолом и цБСА. Интересующие фракции объединяли и фильтровали на 0,22 мкм 81епуех.
Полученный конъюгат имел конечное соотношение ТТ/Р8 (мас./мас.) 1,05, что было определено в анализах с резорцинолом и анализах Лоури.
Пример 4. Получение конъюгатов капсулярного полисахарида 8. аигеик с использованием СИАР на полисахаридах измененного размера.
Химия активации и сочетания для Р88 измененного размера с использованием СИАР.
Р8 взвешивали из расчета теоретического содержания влаги 10%. 2 г нативного влажного Р8 в течение ночи растворяли в νΕΙ при исходной концентрации 10 мг/мл. Перед изменением размера раствор нативного Р8 осветляли на отсекающем фильтре 5 мкм.
Гомогенизатор ЕМЫБ8[ЕЬЕХ С-50, в котором гомогенизирующая ячейка заменена камерой для взаимодействий МкгоДшбюк Г20У-0,75 мкм, использовали перед стадией активации для уменьшения молекулярной массы и вязкости полисахарида. Уменьшение размера осуществляли при 10000 ф/кв.дюйм (68947570 Па) в течение первых 10 циклов и затем при 15000 ф/кв.дюйм (103421355 Па) в течение следующих 60 циклов. За процессом уменьшения размера следили по результатам измерения вязкости. Изменение размера прекращали через 70 циклов при достижении требуемого значения 2,74 ± 0,2 сПз.
Активацию и сочетание осуществляли при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. 50 мг полисахарида 8 измененного размера разбавляли до получения конечной концентрации Р8 5 мг/мл в 0,2М №С1.
В момент времени 0 375 мкл раствора СИАР (100 мг/мл свежеприготовленного в смеси ацетонитрил/νΕΙ, 50/50) добавляли вручную до достижения соответствующего соотношения СИАР/Р8 (0,75/1). Через 1 мин рН увеличивали до рН 9,00+/-0,05 добавлением 0,5М №0Н.
В момент времени 2,5 мин добавляли 10 мл ТТ в концентрации 10 мг/мл в 0,2М №1С1 до достижения соответствующего соотношения белок/Р8 (2/1); рН немедленно доводили до рН сочетания 9,00+/0,05. Раствор оставляли стоять в течение 55 мин при ручной регуляции рН.
После стадии сочетания добавляли 2,5 мл 2М глицина (соотношение д1у/Р8 (мас./мас.): 7,5/1); рН немедленно доводили до 9,00+/-0,05 при помощи регулятора. Раствор оставляли стоять в течение 30 минут при ручной регуляции рН.
Затем конъюгат осветляли с использованием 5 мкм фильтра М1шкап и впрыскивали на 8ерйасгу1 8400НК (ХК26/100). Скорость потока фиксировали на уровне 60 мл/ч.
Элюируемые фракции анализировали резорцинолом и по дозе белка. Интересующие фракции объединяли и фильтровали через 0,22 мкм М1Шраск20.
Полученный конъюгат имел конечное соотношение ТТ/Р8 1,94.
Пример 5. Получение конъюгатов капсулярного полисахарида 8. аигеик с использованием 1-этил-3(диметиламинопропил)карбодиимида (ЕИАС).
Химия активации и сочетания с использованием ЕИАС.
Конъюгат капсулярный полисахарид 8. аигеик типа 8-ТТ.
Дериватизация Р8.
Активацию и сочетание осуществляли при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. 30 мг нативного полисахарида разбавляли до получения конечной концентрации полисахарида в воде 5 мг/мл. Раствор доводили до рН 4,5-5,0 добавлением 0,5н. НС1 и затем добавляли 66 мкг алкогольдегидрогеназы (АИН) (2,2 мг/мг Р8). После полного растворения добавляли 60 мг ЕИАС (2 мг/мг Р8). Через 70 мин рН увеличивали до рН 7,5 добавлением 1н. М10Н для прекращения реакции. Свободный АИН удаляли путем очистки на 8ерйасгу1 8100НК (ХК 16/40). Устанавливали скорость потока 60 мл/ч, используя 0,2М №1С1 в качестве элюирующего буфера. Уменьшение размера осуществляли путем обработки ультразвуком в течение 15 мин, обеспечивая стерильную фильтрацию через фильтр тШех (0,22 мкм).
Сочетание.
- 31 015833
Столбнячный анатоксин добавляли к 5-10 мг дериватизированного полисахарида в 0,2М №С1, и рН доводили до рН 5,0 или рН 6,0 добавлением 0,5н. НС1. Е^ΑС растворяли в 0,1М Тпз буфере рН 7,5 и затем добавляли в течение 10 мин (1/5 об./об. каждые 2 мин). В соответствии с используемыми условиями (смотри табл. 6) реакцию останавливали в промежутке между 30 и 180 мин путем добавления 1М ТГ18-НС1 рН 7,5. Перед очисткой на 8ерЬасгу1 8400НК конъюгат осветляли с использованием 5 мкм фильтра М1п1заг1. Альтернативно, конъюгат осветляли проведением стадии обработки ультразвуком в течение 5 мин. Конъюгат затем впрыскивали на 8ерЬасгу1 8400НК (ХК16/100). Фиксировали скорость потока 30 мл/ч с использованием 150 мМ №С1 в качестве элюирующего буфера. Элюируемый пул отбирали по профилям резорцинола и рВСА (которые измеряют соответственно дозировку полисахарида и белка). Конъюгат фильтровали через стерилизующую мембрану 0,22 мкм (МШ1раск 20) со скоростью 10 мл/мин.
Таблица 5
Конъюгат Время сочетания [Р8 (АН)] (мг/мл) [ТТ (АН)] (мг/мл) [реагент ΕϋΑΟ] (мг/мг Р8)
8А08-ТТ011 40 мин 3,58 6,45 0,5/1
8А08-ТТ015* 180 мин 2 4,0 0,25/1
8А08-ТТ017 30 мин 3,75 7,5 0,25/1
8А08-ТТ018 50 мин 3,75 7,5 0,10/1
Таблица 5: * сочетание осуществляли при рН 6,0
Полученные конъюгаты имели следующие характеристики, представленными в табл. 6. Таблица 6
Полисахарид 8. аигеиз типа 8 также обрабатывали микрофлюидизацией, после чего осуществляли дериватизацию с использованием ΑΌΗ.
Дериватизация Ρ8.
Активацию и сочетание осуществляли при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. 200 мг полисахарида измененного размера разбавляли до получения конечной концентрации Ρ8 в воде 10 мг/мл. Затем добавляли 440 мг ΑΌΗ (2,2 мг/мг Ρ8). Раствор доводили до рН 4,7 добавлением 1 н. НС1, затем добавляли 400 мг Е^ΑС (2 мг/мг Ρ8). Через 60 мин рН увеличивали до рН 7,5 добавлением 5М ШО11 для прекращения реакции. Смесь концентрировали на Αт^сοη ИНта (отсечка молекулярной массы (ММСО) 10000). Перед очисткой на 8ерЬасгу1 8200НК (ХК16/100) конъюгат осветляли с использованием 5 мкм фильтра Мш18агТ Скорость потока устанавливали 30 мл/ч с использованием 0,150 М ШС1 в качестве элюирующего буфера.
Сочетание.
100 мг ТТ добавляли к 50 мг дериватизированного полисахарида в 0,2М №С1. рН доводили до рН 5,0 ± 0,02 добавлением 0,3 н. НС1. Е^ΑС растворяли в 0,1М буфере Тпз с рН 7,5 и затем добавляли в течение 10 мин (1/10 об./об. каждую минуту). В соответствии с используемыми условиями (см. таблицу 8) реакцию останавливали между 30 и 180 мин добавлением 1М Тпз-НС1 рН 7,5. Перед очисткой на 8ерЬасгу1 8400НК конъюгат осветляли с использованием 5 мкм фильтра МпмзаП. Конъюгат затем впрыскивали на 8ерЬасгу1 8400НК (ХК50/100). Скорость потока устанавливали на уровне 60 мл/ч с использованием 150 мМ №С1 в качестве элюирующего буфера. Элюируемый пул отбирали по профилям резорцинола и рВСА (которые измеряют соответственно дозу полисахарида и белка). Затем конъюгат фильтровали через стерилизующую мембрану 0,22 мкм (МШ1раск 20) со скоростью 10 мл/мин.
Таблица 7
Конъюгат Время сочетания [Р8 (АН)] (мг/мл) [ТТ (АН)] (мг/мл) [реагент ЕОАС] (мг/мг Р8)
8А08-ТТ045 65 мин 3,83 7,66 0,1
8А08-ТТ046 45 мин 3,75 7,5 0,2
8А08-ТТ047 30 мин 5,0 15,0 0,2
8А08-ТТ048 120 мин 5,0 10,0 0,05
8А08-ТТ049* 50 мин 5,0 10,0 0,1
* Е^ΑС добавляли за один раз
- 32 015833
Таблица 8
Конъюгат 1п. соотношение ТТ/Р8 (масс./масс.) Р. соотношение ТТ/Р8 (масс./масс.) Υ. Р8 рек. (%) Выход после фильтрации (%)
5А08-ТТ045 2/1 2,20/1 57 101
8А08-ТТ046 2/1 2,80/1
8А08-ТТ047 3/1 Гель- Не очищен
8А08-ТТ048 2/1 3,35 30 101
8А08-ТТ049 2/1 3,5 24 106
Пример 6. Получение конъюгатов капсулярного полисахарида 8. аигеик с использованием ЕЭАС на де-О-ацетил ированном полисахариде 8. аигеик типа 8.
Де-О-ацетилирование.
0,1н. №011 добавляли к 16 мл Р8 измененного размера (10 мг/мл) до достижения конечной концентрации Р8 9 мг/мл и конечной концентрации №0Н 0,1 н. После обработки в течение 1 или 2 ч при 37°С Р8 имел уровень О-ацетилирования соответственно 35 и 12% (доза НекШп) относительно необработанного Р8. 0,1н. №0Н добавляли к 19 мл Р8 измененного размера (10 мг/мл) до достижения конечной концентрации Р8 9,5 мг/мл и конечной концентрации №0Н 0,05 н. После обработки в течение 1 или 2 ч при 37°С Р8 имел уровень О-ацетилирования соответственно 78 и 58% (доза НекШп) относительно необработанного Р8.
Стадию дериватизации выполняли как продемонстрировано ранее для необработанного Р8. Таблица 9
Конъюгат Уровень О-ацетила % ΑϋΗ/Ρδ масс./масс.* %
8А08-ТТ056 35 9,3
8А08-ТТ057 12 13,1
8А08-ТТ058 78 5,3
8А08-ТТ059 58 8,2
ΤNВ8-анализ (анализ с использованием тринитробензолсульфоновой кислоты).
Удаление О-ацетильных групп приводило к увеличению доступности реакционноспособных карбоксильных групп. Действительно, уровень дериватизации Р8, имеющих только 12% О-ацетильных групп, в ± 2,5 раза превосходил уровень дериватизации Р8, имеющих 78% О-ацетильных групп.
Сочетание выполняли как продемонстрировано ранее для необработанного Р8.
Таблица 10
Таблица 11
Конъюгат Ιη. соотношение ТТ/Р8 (масс./масс.) Р. соотношение ТТ/Р8 (масс./масс.) Υ. Р8 рек. (%) Выход после фильтрации (%)
5А08-ТТ056 2/1 1,70/1 51,3 100
8А08-ТТ057 2/1 1,78/1 63,0 105,4
8А08-ТТ058 2/1 2,08/1 46,3 99,6
8А08-ТТ059 2/1 1,86/1 50,8 99,2
- 33 015833
Пример 7. Конъюгация άΡΝΑΟ. Активация и сочетание άΡΝΑΟ.
Конъюгаты άΡΝΑΟ-ТТ.
С использованием описанных ниже подходов были получены следующие конъюгаты:
6ΡΝΑ(3-ΤΤ010: άΡΝΑΟ-8-ΘΜΒ8 + ϋΤΤ обработанный ТТ-1-С-8РОР
0ΡΝΑ6-ΤΤ011: 6ΡΝΑ6-8-6ΜΒ8 + ϋΤΤ обработанный ТТ-1-С-8Р0Р
6ΡΝΑΘ-ΤΤ012: άΡΝΑ8-8-ΟΜΒ8 + ϋΤΤ обработанный ΤΤ-δΡϋΡ
6ΡΝΑΘ-ΤΤ014: όΡΝΑ6-δΡϋΡ + ϋΤΤ обработанный ΤΤ-δΡϋΡ άΡΝΑ(3-ΤΤ017ΌΤΤ обработанный άΡΝΑΟ-δΡϋΡ + ΤΤ-1_0-8ΡϋΡ άΡΝΑ8-ΤΤ019: ΰΡΝΑ(3-8-ΟΜΒ8 + ϋΤΤ обработанный ΤΤ-δΡϋΡ 6ΡΝΑ6-ΤΤ020: άΡΝΑΟ-8-СМВб +ϋΤΤ 1геа1е0 ΤΤ-δΡϋΡ άΡΝΑΟ.
г ΡΝΑΟ растворяли в 5н. НС1 в концентрации 20 мг/мл и инкубировали в течение 1 ч. Затем ее нейтрализовали 5н. ΝοΟΙ I. Раствор осветляли на 5 мкм мембране и очищали на 8ерйасгу1 8400НК. Интересующие фракции, соответствующие среднему молекулярному размеру (см. ШёсНоп аиб 1ттиийу, 70: 4433-4440 (2002)), объединяли и концентрировали, а затем де-№ацетилировали.
Раствор регулировали 1М ΝιιΟΙ I и оставляли стоять в течение 24 ч при 37°С. После нейтрализации продукт подвергали диализу и концентрированию.
Активация άΡΝΑΟ.
8-ОМВ8 (№(у-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимид, Ρ^е^се) добавляли к άΡΝΑΟ в 0,2М №С1 (соотношение З-ОМВЗ^З (мас./мас.): 1/1) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре при рН 7,0 (рН регулировали с использованием 1М №ОН). Избыток ОМВ8 и побочные продукты удаляли путем очистки на Тоуореаг1 НА-40Г с использованием ГВ8 (забуференный фосфатами физиологический раствор), 10 мМ ЭДТА, 50 мМ №С1 рН 7,2 в качестве элюирующего буфера с фиксированной скоростью потока 60 мл/ч. Элюируемый пул отбирали в зависимости от оптической плотности (ИУ=206 нм) и затем концентрировали в пробирках УАакрт с 3000 МАСО или Лткои И11га с 10000 МАСО.
Сочетание.
ОМВ8-активированный άΡΝΑΟ и восстановленный дитиотрейтолом (ОТТ) ТТ-δΡΌΡ смешивали и перемешивали при комнатной температуре. В соответствии с используемыми условиями реакцию гасили через 20-120 мин путем добавления цистеина (4 мг/мл в Ш-фосфатном буфере, рН 8,0) в течение 30 мин. Конъюгат осветляли на фильтре 5 мкм и впрыскивали на смолу 8ерйасгу1 8300НК (ХК16/100) для очистки. Элюирование осуществляли в 200 мМ №С1 с фиксированной скоростью потока 30 мл/ч. Элюируемые фракции анализировали гексозамином и по дозе белка. Интересующие фракции объединяли и фильтровали через 0,22 мкм 81епуех. Конечный конъюгат тестировали в отношении композиции полисахарида (доза гексозамина) и белка (доза Лоури).
Таблица 12
Конъюгат Уровень Ν-ацетилирования % [άΡΝΑδ] мг/мл [ТТ] мг/мл Уровень Ρδ (мг) Время сочетания (мин)
άΡΝΑΘ-ТТОЮ 10* 15 15 30 120
(1ΡΝΑΘ-ΤΤ011 10* 12 24 20 120
6ΡΝΑΘ-ΤΤ012 10* 17,5 35 22 80
άΡΝΑΘ-ΤΤ019 34 5 10 10 20
6ΡΝΑΟ-ΤΤ020 34 2 2 10 20
*Не осуществляли на партии, используемой в конъюгировании, но оценивали на предыдущей партии методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с использованием такого же способа де-Νацетилирования.
Таблица 13
Конъюгат Ιη. соотношение ТТ/Р8 (масс./масс.) Р. соотношение ТТ/Р8 (масс./масс.) Выход Р8 рек. (%) Выход после фильтрации (%)
άΡΝΑΘ-ТТОЮ 1/1 1,86/1 43 99
(1ΡΝΑΘ-ΤΤ011 2/1 2,86/1 56 99
άΡΝΑΘ-ΤΤ012 2/1 2,29/1 61 108
4ΡΝΑΘ-ΤΤ019 2/1 1,45/1 81 97
άΡΝΑΘ-ΤΤ020 1/1 0,89/1 82 109
- 34 015833 артс-8рпр.
5-Кратный молярный избыток 8ΡΌΡ Щ-скцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат, ММ: 312,4, Р1егсе), растворенного в ДМСО (диметилсульфоксид, Мегск) добавляли к 100 мг бРЛЛС в концентрации 5 мг/мл в 100 мМ №1-фосфате. рН 7,2) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Перед очисткой на 8ерйасгу1 8100НК (ХК16/40) реакционную смесь концентрировали до ± 6 мл на Аткоп ИИга с 10000 Μ\νί'Ό (центрифугирование при 3000 об/мин в течение 28 мин). Элюирование осуществляли в фосфатном буфере при рН 7,4 с фиксированной скоростью потока 60 мл/ч. Интересующие фракции (считывание при 206 нм) объединяли и концентрировали до 1,1 мл на Лшкоп ИИга с 10000 Μ\νί'Ό (центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 мин).
ΤΤ-8ΡΌΡ.
15-Кратный молярный избыток 8ΡΌΡ (Ркгсе), растворенного в ДМСО (диметилсульфоксид, Мегск) добавляли к 1 г ТТ (50 мг/мл) в 100 мМ Ла-фосфате, рН 7,2 и инкубировали в течение 80 мин при комнатной температуре. Затем продукт впрыскивали на 8ерйасгу1 8100НК. (ХК16/40) и элюировали в 100 мМ №1-ацетате рН 5,6, 100 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА при фиксированной скорости потока 60 мл/ч. Элюируемый пул отбирали в зависимости от оптической плотности (УФ=280 нм) и затем концентрировали до 19,6 мл на Лшкоп ИИга с 10,000 Μ\νί.Ό (центрифугирование при 3000 об/мин в течение 75 мин).
ΤΤ-^-8ΡΌΡ получали в виде ΤΤ-8ΡΌΡ, но с использованием Ρ£’-8ΡΩΡ (сукцинимидил-6-[3-(2пиридилдитио)-пропионамидо]гексаноат, Ρκιγ^) и времени инкубации 60 мин.
ΤΤ-8Η или ГГ-ЬС-8Н.
ΌΤΤ добавляли к ΤΤ-8ΡΌΡ или ΤΤ-^-8ΡΌΡ в соотношении ΌΤΤ/ΤΤ (мг/мг) 0,7/1. После 2 ч при комнатной температуре высвобождение пиридин-2-тиона отслеживали по его характеристическому поглощению при 343 нм. Тиолированный белок очищали от избытка ΌΤΤ гель-фильтрацией (ΡΌ-10, Атег8Йат). После концентрирования на Аткоп ИИга с 10000 Μ\νί.Ό содержание белка оценивали дозировкой Лоури.
6Ρ\Α(.ι-8ΡΙ)Ρ + ΤΤ-8Η или ТТ-РС-8Н (άΡ^Ο-ΤΙΌΝ и 016).
Сочетание осуществляли при комнатной температуре при непрерывном перемешивании и при исходном соотношении ΤΤ/Ρ8 (мас./мас.) 2/1.
άΡΧΑΟ и ΤΤ-8Η смешивали для получения конечной концентрации Ρ8 20 мг/мл и конечной концентрации белка 40 мг/мл. Через 30 мин непрореагировавшие сульфгидрильные группы гасили добавлением 2-йодацетамида (Мегск).
άΡΧΑΟ и ΤΤ-Ρί'.'-8Η смешивали для получения конечной концентрации Ρ8.
мг/мл и конечной концентрации белка 20 мг/мл. После 75 мин непрореагировавшие сульфгидрильные группы гасили добавлением 2-йодацетамида (Мегск).
Затем конъюгат осветляли с использованием фильтра Мшкай 5 мкм и впрыскивали на 8ерйасгу1 8300НК (ХК16/100). Элюирование осуществляли в 200 мМ №1С1 при фиксированной скорости потока 30 мл/ч.
Элюруемые фракции анализировали гексозамином и дозировкой белка. Интересующие фракции объединяли и фильтровали через 0,22 мкм 81епуех.
Полученные конъюгаты имели конечное соотношение ΤΤ/Ρ8 (мас./мас.) 2,18 (ΤΤ-8Η) и 2,24 (ΤΤЬС-8Н).
Тиолирование άΡΧΑΟ.
11,6 мг ΌΤΤ (1,4-дитиотрейтол, ВоегЫпдег Маппйе1т, ММ: 154,24) добавляли к 16,5 мг άΡΗΑΟ8ΡΌΡ. После 2 ч при комнатной температуре высвобождение пиридин-2-тиона контролировали по его характерной абсорбции при 343 нм. Тиолированный Ρ8 очищали от избытка ΌΤΤ гель-фильтрацией (ЛоуореаН Н^40Р) и затем концентрировали до 860 мкл на Аткоп ИИга с 10,000 М^С0.
^АС-БН + ΤΤ-8ΡΌΡ (аΡNΑ6-ΤΤ017).
Сочетание осуществляли при комнатной температуре при непрерывном перемешивании и при исходном соотношении ΤΤ/Ρ8 (мас./мас.) 1,7/1.
άΡNΑС-8Η и ΤΤ-8ΡΌΡ смешивали для получения конечной концентрации Ρ8 7,73 мг/мл и конечной концентрации белка 13,3 мг/мл. Через 90 мин непрореагировавшие сульфгидрильные группы гасили добавлением 2-йодацетамида (Мегск).
Затем конъюгат осветляли с использованием фильтра Мшкай 5 мкм и впрыскивали на 8ерйасгу1 8300НК (ХК16/100). Элюирование осуществляли при 200 мМ №1С.’1 и фиксированной скорости потока 30 мл/ч. Элюируемые фракции анализировали гексозамином и дозировкой белка. Интересующие фракции объединяли и фильтровали на 0,22 мкм 81епуех.
Полученный конъюгат имел конечное соотношение ΤΤ/Ρ8 (мас./мас.) 2,74.
Пример 8. Приготовление композиций.
Адъювантные композиции.
Конъюгаты инокулировали либо без адъювантов, либо с адъювантом А, имеющим следующую композицию: Композиция Адъюванта А Качественная/количественная (на дозу 0,5 мл).
Липосомы:
^ОΡС 1 мг;
- 35 015833 холестерин 0,25 мг;
3Б-МРЬ 50 мкг;
Р821 50 мкг;
буфер КН2РО4 3,124 мг;
буфер Ш2НРО4 0,290 мг;
№С1 2,922 мг;
(100 мМ) \1·'Ι сколько требуется с добавлением 0,5 мл растворителя;
рН6,1.
1. Общая концентрация РО4 = 50 мМ.
Пример 9. Эксперименты на животных.
Самки мышей СБ-1 в возрасте 8-10 недель были доставлены из СЬаг1е§ КАег ЬаЬога1опе8, Кш§81оп, Ма§8. Для исследований летальности пять групп по 9-11 мышей СБ-1 сенсибилизируют интраперитонеально (и.п.) серийными разведениями 8. аигеи8, выращенных на планшетах С8А. Количество инокулируемого материала варьирует от приблизительно 1010 до 108 колониеобразующих единиц (СЕИ))/мышь. Смертность оценивают ежесуточно в течение 3 суток. 50% летальные дозы (ЬЭ50) оценивают, используя пробит-модель зависимости доза-ответ. Нуль-гипотезу обычных ЬБ50 тестировали с использованием отношения правдоподобия. Сублетальную бактериемию инициируют путем сенсибилизации групп из 8-20 мышей внутривенным (в.в.) путем с приблизительно 2 х 106 СЕИ/мышь или и.п. путем с приблизительно 2 х 107 СЕИ/мышь. После инокуляции у отдельных групп животных в определенные моменты времени отбирают образцы крови из хвоста, и уровни бактериемии оценивают по количественной визуализации в двух повторах планшетов с трипсинизированным соевым агаром и 5% крови овцы (Вес1оп И1скш8оп М1сгоЬЫоду 8уз1етз). Статистическую значимость определяют с использованием непарного ΐ-теста Стьюдента в модификации Уэлча (Ае1сК).
Пример 10. Иммуногенность конъюгатов 8. аигеиз Р88-ТТ и бΡNΑΘ-ТТ.
Группы из 30 мышей подкожно инокулировали конъюгатом 8. аигеиз Р88-ТТ при дозе сахарида 3 мкг, либо без адъюванта, либо в комбинации с адъювантом А в день 0, 14, 28 и 42. В день 0 мыши получали первую дозу сахарида, составляющую от 0,001 до 0,013 мкг. Дополнительно осуществляли три иммунизации дозой 0,3 мкг в физиологическом растворе. В день 55 у мышей отбирали сыворотку крови, и каждый образец сыворотки крови тестировали твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЬ18А) для оценки иммунного ответа против Р88. Группы из 10 мышей использовали в контрольных группах, и их инокулировали физиологическим раствором или физиологическим раствором, содержащим адъювант А.
Очищенный Р88 в течение ночи при 4°С наносили в концентрации 2 мкг/мл в РВ8 на обладающие высоким связыванием микротитрационные планшеты (Νιιιιο Мах18огр). Планшеты блокировали РВ8-В8А 1% в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Мышиную антисыворотку предварительно разбавляли 1/100, затем дополнительно готовили двукратные разведения в микропланшетах, которые инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После промывки связанные мышиные антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой козьего 1дО против мышиных антител а£Е1шРиге (Н+Ь) (геЕ: 115-035-003) 1аскзоп 1ттипоЕаЬога1опе8 1пс., разведенного в соотношении 1:5000 в 0,05%РВ8-Т^ееп. Детекционные антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Окрашивание проявляли с использованием 4 мг ОРИ (81§та) + 5 мкл Н2О2 на 10 мл 0,1 М цитратного буфера с рН 4,5 в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали 50 мкл НС1, и оптическую плотность регистрировали при 490 нм относительно 650 нм.
Результаты выражали в виде медианных титров, и среднегеометрические титры (ОМТ) рассчитывали для 30 образцов (10 для контролей). Результаты представлены в табл. 14 ниже.
Конъюгат 5А08-ТТ011 Таблица 14 Титр антител против Р88 (ОМТ), не адсорбированных 4714 Титр антител против Р88 (СМТ) Адъювант А 2109
5А08-ТТ015 2806 5631
8А08-ТТ017 3770 4396
5А08-ТТ018 5349 4748
Контроль 50 50
Группы из 30 мышей подкожно инокулировали конъюгатами 8. аигеиз бΡNΑΘ-ТТ (содержащими бΡNΑΘ, который на 10-30% Ν-ацетилирован) при дозе сахарида 0,3 мкг в 200 мМ №С1, либо без адъюванта, либо в комбинации с адъювантом А. Мыши получали три инокуляции в дни 0, 14 и 28. В день 41 или 42 у мышей отбирали образцы сыворотки крови, и каждый образец сыворотки крови тестировали ЕЬ18А для оценки иммунного ответа против ΡNΑΘ. Группы из 10 мышей использовали в контрольных группах, и их инокулировали физиологическим раствором или только адъювантом.
- 36 015833
ЕМБА с антителами против РNΛС.
Очищенные РNΛС (2,5 мкг/мл), смешанные с метилированным НБА (2,5 мкг/мл), разбавленным в РВБ, наносили на обладающие высокой связывающей способностью микротитровальные планшеты (Хипс Мах1когр) в течение ночи при 4°С.
Планшеты блокировали 1% РВБ-ВБА в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Мышиные антитела предварительно разбавляли 1/100, затем дополнительно осуществляли двукратные разведения в микропланшетах и инкубировали при комнатной температуре с встряхиванием в течение 1 ч. После промывки связанное мышиное антитело детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой козьего 1дС против мышиных антител аЕПшРиге (Н+Ь) (геИ: 115-035-003) 1асккоп 1ттипоЬаЬога1ог1ек 1пс, разведенных 1:5000 в 0,05% РВБ-ВБА 0,2%-Т^ееп. Детекционные антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Окрашивание проявляли с использованием 4 мг ОРИ (Б1§та) + 5 мкл Н2О2 на 10 мл 0,1 М цитратного буфера с рН 4,5 в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали 50 мкл НС1, и оптическую плотность регистрировали при 490 нм относительно 650 нм.
СМТ рассчитывали по средним титрам для 30 образцов (10 для контролей).
Таблица 15
Конъюгат βΜΤ антител против) ΡΝΑΘ, не адсорбированных ΟΜΤ антител против ΡΝΑ6 Адъювант А
άΡΝΑΟ-ΤΤΟΙΟ 1371 28465
(1ΡΝΑΟ-ΤΤ011 1133 40899
άΡΝΑΘ-ΤΤ019 425 13429
άΡΝΑΘ-ΤΤ020 656 10080
άΡΝΑΟ-ΤΤ014 342 9806
άΡΝΑΟ-ΤΤ017 203 8094
άΡΝΑβ-ΤΤ012 398 40509
άΡΝΑΟ-ΤΤ016 719 7937
Контроль 50 50
Пример 11. Иммуногенность конъюгатов РБ*-ТТ, полученных способом с использованием СИАР. Результаты.
Таблица 16
Соп]ида1е ОМТ антител против Р88 после трех инокуляций у мышей ОМТ антител против Р88 после двух инокуляций у мышей
8АР88-ТТ-04 Зресо! 207068 41326
8АР88-ТТ-04 Адъювант А 47405 15577
8АР88-ТТ-04 А1РО4 7380 4510
8ресо1 50
Адъювант А 50
А1РО4 50
Пример 12. Опсонофагоцитарный анализ.
Опсонофагоцитарный киллинг Б.аигеик человеческими полиморфноядерными лейкоцитами (РМ^ ΐπ уИго осуществляют как описано в Хи е1 а1., 1992 Ы'есЕ 1ттип. 60; 1358. Человеческие РМN получают из гепаринизированной крови седиментацией в 3% декстране Т-250. Смесь для реакции опсонизации (1 мл) содержит приблизительно 106 РМN в среде КРМ1 1640, дополненной 10% температурно инактивированной фетальной телячьей сывороткой, приблизительно 108 СЕИ Б. аигеик, и 0,1 мл тестируемой сыворотки или препарата 1дС. Гипериммунизированную кроличью сыворотку используют в качестве положительного контроля, и 0,1 мл неиммунной кроличьей сыворотки используют в качестве полного источника для 1дС-образцов. Реакционные смеси инкубируют при 37°С, и бактериальные образцы переносят через 0, 60 и 120 мин в воду и затем разбавляют, распределяют на агаровых планшетах с трипсинизированной соей и инкубируют при 37°С для подсчета бактерий после инкубации в течение ночи.
Пример 13. Иммуногенность стафилококковых белков у мышей и кроликов.
Животных иммунизировали очищенными стафилококковыми белками для получения гипериммунной сыворотки крови. Мышей трижды иммунизировали (в дни 0, 14 и 28) 10 мкг каждого белка с адъювантом в Бресо1. Кроликов трижды иммунизировали (в дни 0, 21 и 42) 20 мкг каждого белка с адъювантом в Бресо1. Иммунные сыворотки крови собирали и оценивали в ЕИ1БА антител против белка и убитых антителами целых клеток.
ЕИ1БА антител против белка.
Очищенный белок в течение ночи при 4°С наносили в концентрации 1 мкг/мл в РВБ на обладающие
- 37 015833 высоким связыванием микротитровальные планшеты (Аипс Мах1зогр). Планшеты блокировали РВ8-В8А 1% в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Тестируемые образцы затем разбавляли 1/1000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с встряхиванием. После промывки связанное мышиное или кроличье антитело детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой козьего Ι§Θ против мышиных антител аРйшРиге (Н+Ь) (геР: 115-035-003) или конъюгированного с пероксидазой козьего Ιβθ против кроличьих антител аРйшРиге (Н+Ь) (геР: 11-035-003) 1аскзоп 1ттипоЬаЬогаХопез 1пс, разведенных 1:5000 в 0,05% РВ8-Х\\;еехх. Детекционные антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Окрашивание проявляли с использованием 4 мг ОРЭ (81§та) + 5 мкл Н2О2 на 10 мл 0,1 М цитратного буфера с рН 4,5 в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали 50 мкл НС1, и оптическую плотность регистрировали при 490 нм относительно 650 нм. Ο.Ό. для разведения 1/1000 Роз! III сравнивали с Ο.Ό, полученной для того же самого разведения преиммунной сыворотки крови.
Результаты, полученные с мышиной и кроличьей сывороткой крови, представлены на фиг. 5. Наблюдается хорошая сероконверсия против каждого антигена. Оценка сыворотки крови, направленной против 8ΒΙ, ухудшена из-за 1д-связывающей активности этого белка.
ΡΡΙ8Λ убитых антителами целых клеток.
Убитые целые клетки (инактивированные теплом или формальдегидом) 8. аигеиз типа 5 и 8 или 8. ер1бегт1б18 штамм Нау в течение ночи при 4°С с выпариванием наносили в концентрации 20 мкг/мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе (РВ8), на обладающие высоким связыванием микротитрационные планшеты (Шххс Мах1зогр). Планшеты блокировали РВ8-В8А 1% в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Белок А нейтрализовали добавлением 10 мкг/мл аффинно очищенных антител цыпленка против белка А ДСБ геР: СРА-65А-2), разведенных в РВ8-Т\\-еехх 0,05%, с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. Тестируемые образцы затем разбавляли в два раза в микропланшете в РВ8-0,05% из исходного разведения 1/10 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с встряхиванием. После промывки связанное мышиное или кроличье антитело детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой козьего ΙβΘ против мышиных антител аРйшРиге (Н+Ь) (геР: 115-035-003) или конъюгированного с пероксидазой козьего ΙβΘ против кроличьих антител аРРхшРиге (Н+Ь) (геР: 11-035-003) 1аскзоп йппюпо! лЬогаХопез Ιη^ разведенных 1:5000 в 0,05% РВ8-Тмееп. Эти детекционные антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием. Окрашивание проявляли с использованием 4 мг ОРЭ (81§та) + 5 мкл Н2О2 на 10 мл 0,1 М цитратного буфера с рН 4,5 в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл НС1 и оптическую плотность регистрировали при 490 нм относительно 650 нм.
Следует отметить, что уровни экспрессии белков у стафилококков варьируют в зависимости от культуральных условий. Таким образом, отрицательный результат может отражать выбор некорректных условий выращивания, а не отсутствие иммуногенности.
Результаты с использованием образцов мышиной сыворотки крови представлены в табл. 17, и некоторые графики изображены на фиг. 6. Слабое распознавание 8. аигеиз штамма 5 наблюдается с образцами сыворотки крови, направленными против 8бгС, БпЬрА, ЕЬй, 8Ь1 и каА. Распознавание 8. аигеиз штамма 8 наблюдается только с сывороткой крови, направленной против 8Ь1. Слабое распознавание 8. ер1бегт1б18 Нау наблюдается с сывороткой крови, направленной против АН амидазы, МЕРН, кбА, каА, ЕЬй, Ааа и 8Ь1.
Отбор результатов, полученных с использованием образцов кроличьей сыворотки крови, представлен на фиг. 7 и суммирован в табл. 18. Очень хорошее распознавание трех штаммов обнаружено для каА и кбВ. Слабое распознавание трех штаммов наблюдается с НагА, хотя животным производилась только одна инъекция, а не три инъекции, используемые для других белков.
Таблица 17
Название белка Реакция на 5А5
1еаА (+)
СКА
АН амидаза -
ЗсХгС
Глюкозамидаза
ΙδάΑ
Альфа-токсин
8гсХС ++
ЕЫ1 +
АаА
ΜΚΡΙΙ
8Ь| ++
ЕпЬрА +
Реакция на 6А8 Реакция на 5Е Нау
ω (+)
(+) (+)
++
-
- -
- ++
-
(+) -
+
++
++
++ +++
+ (+>
- 38 015833
Таблица 18
Название белка Реакция на 5А5 Реакция на 5А8 Реакция на 5Е Нау
1заА +++ +++ +++
СНА + ++ ++
АН амидаза ++ +
ΙδάΒ +++ +++ +++
загс + + +
Глюкозамидаза - -
НагА (1 инъекц.) + + +
ΙδάΑ -
Альфа-токсин +
8гс1С - - -
ЕЬЬ - + -
АаА - - -
ΜΚΡΙΙ - ++
ЗЫ +++
РпЬрА _ - ++ ++
Пример 14. Эффективность комбинации стафилококковых белков в модели назальной колонизации.
Пятнадцать групп из трех хлопковых хомяков инокулировали комбинациями восьми стафилококковых антигенов, и пять хлопковых хомяков, которые выступали в качестве контролен, не обрабатывали антигеном.
Эти шестнадцать групп являются следующими:
группа 1 - АН-глюкозамин, АН-амидаза, ААА, альфа-токсин, 86гС, 86гС, ЕЬИ, 8Ы;
группа 2 - АН-глюкозамин, АН-амидаза , 1збА, 1з6В, С11А, 86гС, ЕЬИ, РиЬрА;
группа 3 - АН-глюкозамин, АН-амидаза, НагА, 1збА, МВР11, 1збВ, ААА, альфа-токсин;
группа 4 - АН-глюкозамин, НагА, 1збА, ААА, С1ГА, .1каА, ЕЬИ, 8Ь1;
группа 5 - НагА, МВР11, ААА, альфа-токсин, С1ГА, 86гС, ЕЬИ, РиЬрА;
группа 6 - 1збА, 1з6В, ААА, альфа-токсин, С1ГА, 86гС, 8Ь1, РиЬрА;
группа 7 - АН-аминидаза, 1збА, МВР11, ААА, 1заА, 86гС, ЕЬИ, РиЬрА;
группа 8 - контроль;
группа 9 - АН-глюкозамин, 1збА, МВР11, альфа-токсин, 1заА, 86гС, 8Ь1, РиЬрА;
группа 10 -АН-глюкозамин, МВР11, 1збВ, ААА, С1ГА, 1заА, 86гС, 86гС;
группа 11 - АН-аминидаза, МВР11, 1збВ, альфа-токсин, С1ГА, 1заА, ЕЬИ, 8Ь1;
группа 12 -АН-глюкозамин, НагА, 1збВ, альфа-токсин, 1заА, 86гС, ЕЬИ, РиЬрА;
группа 13 - АН-амидаза, НагА, 1збВ, ААА, 1заА, 86гС, 8Ь1, РиЬрА;
группа 14 -АН-глюкозамин, АИ-амидаза, НагА, МВР11, С1ГА, 86гС, 8Ь1, РиЬрА;
группа 15 -АИ-амидаза, НагА, 1збА, альфа-токсин, С1ГА, 1заА, 8бГС, 86гС;
группа 16 - НагА, ЫА, МВРП, 1збВ, 86гС, 86гС, ЕЬИ, 8Ь1.
Каждая смесь антигенов содержала по 3 мкг каждого антигена, смешанного с адъювантом, состоящего из липосом, содержащих МРР и ^821. Хлопковым хомякям трижды производили инокуляцию в дни 1, 14 и 28 эксперимента. Через две недели после инокуляции эффективность иммунизации оценивали с использованием анализа назальной колонизации, как описано в Кока1-Кии е! а1 (2003) АиНтюгоЬ. АденК СИетоШег. 47; 1589-1597.
Классический анализ множественной линейной регрессии проводили по данным с использованием программы Без^и Ехрег! 6. Присутствие антигена кодировали как +1, а отсутствие антигена как -1. С использованием уравнения в модели можно определить, какие антигены являются ключевыми антигенами, которые вызывают значительное снижение количества колоний на нос.
Результаты.
Результаты анализа назальной колонизации представлены в табл. 19. Контрольная группа имела средний 1одСРи/нос 3,51335, и можно видеть уменьшение назальной колонизации для всех групп хлопковых хомяков, инокулированных стафилококковыми белками. Группы 4, 9 и 13 продемонстрировали наибольшее уменьшение назальной колонизации со снижением свыше 2 1од величины СРИ/нос. Группы 12 и 16 также дали хорошие результаты, продемонстрировав снижение приблизительно на 2 1од величины СРИ/нос.
- 39 015833
Таблица 19
Группа Обнаруженный средний БодСЕи/нос Спрогнозированный БодСЕи/нос
1 1,77527 2,03560
2 2,90435 2,52684
3 1,96556 2,23033
4 1,27748 1,21872
5 1,67304 1,93128
6 2,79745 2,98193
7 2,21481 2,30705
8 3,51355 3,47317
9 1,22480 1,44080
10 2,03085 1,93204
11 2,02522 1,81581
12 1,53402 1,70996
13 1,36063 1,49100
14 2,31201 1,73909
15 2,22979 1,98223
16 1,58109 1,44004
Вклад специфических антигенов в смеси антигенов рассчитывали с использованием множественного регрессионного анализа данных назальной колонизации. Конечная модель содержит семь наилучших антигенов. Результаты для этих антигенов представлены в табл. 20. В контексте белковой смеси включение НагА дало наибольшее уменьшение назальной колонизации, затем следуют ЬаА, 8Ь1, 8бгС, аутолизин-глюкозамин, МВР11 и ЕЬЫ.
Таблица 20. Эффекты различия 1оцСЕЦ7нос и отношения СРИ/нос ДЛЯ семи наилучших антигенов в модели и соответствующие р-значения

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная композиция, содержащая капсулярный полисахарид или олигосахарид из 8. аигеиз типа 5 и/или 8, где капсулярный полисахарид или олигосахарид типа 5 О-ацетилирован на 30-100% и конъюгирован с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СВМ197, белка Э НаеторЫйиз тЕиеп/ае, экзобелка А Рзеиботопаз аегидтоза, пневмококкового пневмолизина и альфа-анатоксина, и содержащая стафилококковый белок или его фрагмент, который представляет собой С1ГА.
  2. 2. Иммуногенная композиция, содержащая капсулярный полисахарид или олигосахарид из 8. аигеиз типа 5 и/или 8, где капсулярный полисахарид или олигосахарид типа 8 О-ацетилирован на 30-100% и конъюгирован с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СВМ197, белка Э НаеторЫйиз тЕиеп/ае, экзобелка А Рзеиботопаз аегидтоза, пневмококкового пневмолизина и альфа-анатоксина, и содержащая стафилококковый белок или его фрагмент, который представляет собой С1ГА.
  3. 3. Иммуногенная композиция по п.2, где капсулярный полисахарид или олигосахарид типа 5 Оацетилирован на 30-100%.
  4. 4. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-3, содержащая стафилококковый РЫЛО (поли-Νацетилированный глюкозамин).
    - 40 015833
  5. 5. Иммуногенная композиция по п.4, где ΡΝΑΟ Ν-ацетилирован менее чем на 40%.
  6. 6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая капсулярный полисахарид или олигосахарид из 8. ер|ИетиИ|з типа I, и/или II, и/или III.
  7. 7. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая антиген 336 8. аигеиз.
  8. 8. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-7, дополнительно содержащая стафилококковый белок или его фрагмент.
  9. 9. Иммуногенная композиция по п.8, содержащая 2 или более стафилококковых белков, выбранных по меньшей мере из 2 разных групп, выбранных из следующих:
    а) по меньшей мере один стафилококковый белок, связывающийся с внеклеточным компонентом, или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из рецептора ламинина, 8ПС/Мп!С/связывающего белка слюны, ΕΝιΑ, ΕΝιΒ, эластинсвязывающего белка (БЬр8), ΕΕΒ (Ε®), 8ΒΕ аутолизина, СИХ, 8ИгС, 8άΓΌ, 8ΗγΕ, 8ИгО, 8ΗγΗ, липазы ОеИО, 8азΑ, ΕώΑ, ΕώΒ, Спа, С1®, ΕьрΑ, ^азе, IзаЛ/Ρ^зΑ, 8заЛ, ΕΡΒ, 88Ρ-1, 88Ρ-2, витронектинсвязывающего белка, фибриногенсвязывающего белка, коагулазы, Εί§ и ΜΑΡ;
    б) по меньшей мере один стафилококковый белок-транспортер или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из иммунодоминантного ΑΒС транспортера, ΜΑ, ΗάΒ, МС, Η-γΑ, транспортера Мд2+, 8ИС и Νί ΑΒС транспортера;
    в) по меньшей мере один стафилококковый регулятор вирулентности, токсин или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из альфа-токсина (Ша), мутанта альфа-токсина Η35Β, ΚΝΑ III активирующего белка (ΒΑΡ).
  10. 10. Иммуногенная композиция по любому из пп.4-9, где ΡΝΑΟ конъюгирован с белком-носителем.
  11. 11. Иммуногенная композиция по п.10, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СВМ197, белка Ό Ηаеторй^1из тПиеп/ае, экзобелка Α РзеиИотопаз аегидшоза, пневмококкового пневмолизина и альфа-анатоксина.
  12. 12. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-11, где эффективный иммунный ответ формируется и против 8. аигеиз, и против 8. ерИегт1И1з.
  13. 13. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп.1-12 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
  14. 14. Способ изготовления вакцины, включающий стадии смешивания антигенов с получением иммуногенной композиции по любому из пп.1-12 и добавления фармацевтически приемлемого эксципиента.
  15. 15. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-12 в изготовлении вакцины для лечения или предупреждения стафилококковой инфекции.
EA200801839A 2006-03-30 2007-03-29 Иммуногенная композиция EA015833B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78724906P 2006-03-30 2006-03-30
US78758706P 2006-03-30 2006-03-30
GB0606416A GB0606416D0 (en) 2006-03-30 2006-03-30 Immunogenic composition
PCT/EP2007/053057 WO2007113222A2 (en) 2006-03-30 2007-03-29 Immunogenic composition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801839A1 EA200801839A1 (ru) 2009-08-28
EA015833B1 true EA015833B1 (ru) 2011-12-30

Family

ID=38515803

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801839A EA015833B1 (ru) 2006-03-30 2007-03-29 Иммуногенная композиция
EA201101164A EA020459B1 (ru) 2006-03-30 2007-03-29 Иммуногенная композиция

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101164A EA020459B1 (ru) 2006-03-30 2007-03-29 Иммуногенная композиция

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20100021503A1 (ru)
EP (4) EP3141261A1 (ru)
JP (1) JP2009531387A (ru)
KR (1) KR101541383B1 (ru)
CN (1) CN103169960A (ru)
AU (2) AU2007233705B2 (ru)
BR (1) BRPI0710210A2 (ru)
CA (1) CA2647441C (ru)
CR (2) CR10348A (ru)
EA (2) EA015833B1 (ru)
IL (2) IL193565A (ru)
MA (1) MA30343B1 (ru)
MX (1) MX337528B (ru)
MY (1) MY148405A (ru)
NO (1) NO20083722L (ru)
NZ (2) NZ570805A (ru)
SG (1) SG170090A1 (ru)
WO (1) WO2007113222A2 (ru)
ZA (1) ZA200808246B (ru)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100351260C (zh) 2002-11-12 2007-11-28 布赖汉姆妇女医院 葡萄球菌感染的多糖疫苗
SI1896065T2 (sl) * 2005-06-27 2014-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Postopek za pripravo cepiv
US8146781B2 (en) * 2007-08-09 2012-04-03 Huhtamaki, Inc. Dispenser for viscous condiments
US9181329B2 (en) 2007-08-31 2015-11-10 The University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against Staphylococcal lung diseases and conditions
EP2185190B1 (en) 2007-08-31 2015-06-24 University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions
CA2716706C (en) 2008-03-03 2014-02-18 Irm Llc Compounds and compositions as tlr activity modulators
EP2268307A1 (en) * 2008-04-16 2011-01-05 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
RU2532911C2 (ru) * 2008-07-21 2014-11-20 Дзе Брихэм Энд Уимен'З Хоспитал, Инк. Способы и композиции, относящиеся к синтетическим бета-1,6-глюкозаминолигосахаридам
US8758765B2 (en) 2008-07-29 2014-06-24 The University Of Chicago Compositions and methods related to Staphylococcal bacterium proteins
WO2011127032A1 (en) 2010-04-05 2011-10-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) antibodies as an enhancer of immune response
PL2414387T3 (pl) 2009-04-03 2016-06-30 Univ Chicago Kompozycje i sposoby związane z wariantami białka A (SpA)
EP2419129A2 (en) 2009-04-14 2012-02-22 Novartis AG Compositions for immunising against staphylococcus aerus
CN102762226A (zh) 2009-06-10 2012-10-31 诺华有限公司 含苯并萘啶的疫苗
TW201544119A (zh) * 2009-06-22 2015-12-01 Wyeth Llc 組合物及製備金黃色葡萄球菌血清型５及８莢膜多醣結合物之免疫原性組合物之方法
PE20110023A1 (es) * 2009-06-22 2011-01-31 Wyeth Llc Composiciones inmunogenicas de antigenos de staphylococcus aureus
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
TWI445708B (zh) 2009-09-02 2014-07-21 Irm Llc 作為ｔｌｒ活性調節劑之化合物及組合物
JP5988492B2 (ja) 2009-09-02 2016-09-07 ノバルティス アーゲー Ｔｌｒ活性モジュレーターを含む免疫原性組成物
ES2812523T3 (es) 2009-09-30 2021-03-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugación de polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus de tipo 5 y de tipo 8
PT2493498T (pt) 2009-10-30 2017-05-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Purificação de sacáridos capsulares de staphylococcus aureus tipo 5 e tipo 8
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
EP2512478B1 (en) 2009-12-15 2017-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals SA Homogeneous suspension of immunopotentiating compounds and uses thereof
WO2011119759A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Irm Llc Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc.
WO2011133227A2 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Ancora Pharmaceuticals Inc. Synthetic oligosaccharides for staphyloccocus vaccine
ES2657588T3 (es) 2010-05-06 2018-03-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacunas de bioconjugados de bacterias grampositivas capsulares
KR20130093084A (ko) 2010-07-02 2013-08-21 더 유니버시티 오브 시카고 단백질 Ａ(ＳｐＡ) 변이체와 관련된 조성물 및 방법
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
US9095540B2 (en) 2010-09-09 2015-08-04 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
JP5557328B2 (ja) * 2010-10-07 2014-07-23 Ｎｏｋ株式会社 中空糸炭素膜の製造方法
MX350170B (es) * 2010-12-22 2017-08-28 Wyeth Llc Composición inmunogénica estable de antígenos de staphylococcus aureus.
AU2012266880A1 (en) * 2011-03-16 2013-10-03 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods for inducing immune responses against bacteria in the genus staphylococcus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
CA2845259A1 (en) 2011-08-15 2013-02-21 The University Of Chicago Compositions and methods related to antibodies to staphylococcal protein a
JP6204930B2 (ja) * 2012-03-05 2017-09-27 ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア 多価ワクチンによる黄色ブドウ球菌感染症からの保護
EP2636750A1 (en) 2012-03-06 2013-09-11 Roche Diagniostics GmbH Compatible solute ectoine as well as derivatives thereof for enzyme stabilization
EP3805395A1 (en) 2012-04-26 2021-04-14 University Of Chicago Staphylococcal coagulase antigens and methods of their use
EP2841101B1 (en) 2012-04-26 2019-08-07 University Of Chicago Compositions and methods related to antibodies that neutralize coagulase activity during staphylococcus aureus disease
ES2670863T3 (es) 2013-02-01 2018-06-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Administración intradérmica de composiciones inmunológicas que comprenden agonistas del receptor de tipo Toll
GB201310008D0 (en) 2013-06-05 2013-07-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition for use in therapy
WO2015021390A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 The Regents Of The University Of California Nanoparticles leverage biological membranes to target pathogens for disease treatment and diagnosis
US20170000875A1 (en) 2013-12-02 2017-01-05 Arytha Biosciences, Llc Toxoid preparation and uses thereof
CN106163504B (zh) 2014-03-20 2021-02-09 加利福尼亚大学董事会 水凝胶毒素-吸收或结合纳米颗粒
EP3229833A1 (en) 2014-12-10 2017-10-18 GlaxoSmithKline Biologicals SA Method of treatment
US10610493B2 (en) 2015-04-29 2020-04-07 The Regents Of The University Of California Detoxification using nanoparticles
GB201600075D0 (en) * 2016-01-03 2016-02-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenci composition
AU2017218768B2 (en) * 2016-02-12 2022-03-31 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to antibodies that neutralize coagulase activity during staphylococcus aureus disease
JP7296386B2 (ja) 2017-09-05 2023-06-22 スカラブ ゲノミクス， エルエルシー 組換えタンパク質の発現を改善するための方法および組成物
CN111867623A (zh) 2018-02-12 2020-10-30 英尼穆内公司 Toll样受体配体
CA3152520A1 (en) * 2019-08-27 2021-03-04 OneBioPharma, Inc. Antimicrobial vaccine compositions
US11173199B2 (en) 2019-11-13 2021-11-16 Alopexx Inc. Low contaminant compositions
KR20230117105A (ko) 2020-11-04 2023-08-07 엘리고 바이오사이언스 큐티박테리움 아크네스 재조합 파지, 그의 제조 방법 및 용도

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056360A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against antigens from bacteriae
US20020031528A1 (en) * 1996-09-11 2002-03-14 Fattom Ali Ibrahim Staphylococcus aureus antigen-containing whole cell vaccine
WO2003061558A2 (en) * 2001-09-19 2003-07-31 Nabi Biopharmaceuticals Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations
WO2005000346A1 (en) * 2003-06-23 2005-01-06 Baxter International Inc. Carrier proteins for vaccines
WO2006032472A2 (en) * 2004-09-22 2006-03-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition for use in vaccination against staphylococcei
WO2006065553A2 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Nabi Biopharmaceuticals Glycoconjugate vaccines containing peptidoglycan

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5452794A (en) 1977-09-30 1979-04-25 Kousaku Yoshida Extracting of polysacchride from capusle containing epidermis staphylococus
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
AU614755B2 (en) 1987-06-05 1991-09-12 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DK0382271T3 (da) 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoler som adjuvanser i vacciner
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
ATE188613T1 (de) 1992-06-25 2000-01-15 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5425946A (en) * 1992-08-31 1995-06-20 North American Vaccine, Inc. Vaccines against group C Neisseria meningitidis
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
US6054572A (en) 1993-02-05 2000-04-25 Smithkline Beecham Corporation, P.L.C. Fibronectin binding protein; monoclonal antibody and their use in preventing bacterial adhesion
JP4028593B2 (ja) 1993-03-23 2007-12-26 グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム ３−ｏ脱アシル化モノホスホリルリピドａ含有ワクチン組成物
KR100376361B1 (ko) 1993-09-22 2003-07-18 헨리 엠. 잭슨 파운데이션 포 더 어드벤스먼트 오브 밀리터리 메디신 면역원성구조체의제조를위하여신규한시아닐레이팅시약을사용하여용해성탄수화물을활성화하는방법
JP3967769B2 (ja) 1993-11-17 2007-08-29 オーエム・ファルマ グルコサミンジサッカライド、それらの製造法、それらを含む医薬組成物およびそれらの使用
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6008341A (en) 1994-08-22 1999-12-28 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin S. aureus fibrinogen binding protein gene
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
JPH11514870A (ja) 1995-10-16 1999-12-21 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 新規な唾液結合タンパク質
GB9521146D0 (en) 1995-10-16 1995-12-20 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6737248B2 (en) 1996-01-05 2004-05-18 Human Genome Sciences, Inc. Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
DE69734601T2 (de) 1996-05-16 2006-08-03 The Texas A & M University System, College Station Zusammensetzung von kollagenbindungsprotein und verfahren zu deren verwendungen
AU3399197A (en) 1996-06-18 1998-01-07 Alza Corporation Device for enhancing transdermal agent delivery or sampling
SE9602496D0 (sv) 1996-06-20 1996-06-20 Bengt Guss Method and means for producing a fibrinogen binding protein and its use in biotechnology
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
JP4153999B2 (ja) 1996-12-20 2008-09-24 アルザ・コーポレーション 経皮作用剤流量を強化するための組成物と方法
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6610293B1 (en) 1997-06-16 2003-08-26 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2302554C (en) 1997-09-05 2007-04-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
EP2319931A1 (en) 1997-11-26 2011-05-11 Inhibitex, Inc. Extracellular matrix-binding proteins from staphylococcus aureus
EP1035867A1 (en) 1997-12-02 2000-09-20 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
WO1999064301A1 (fr) 1998-06-08 1999-12-16 Sca Emballage France Emballage a remise a plat rapide
EP1091928B1 (fr) 1998-06-30 2007-02-28 OM Pharma Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant
EP1097213B1 (en) 1998-07-10 2009-09-23 U.S. Medical Research Institute of Infectious Diseases Vaccine against staphylococcus intoxication
JP5490341B2 (ja) * 1998-07-15 2014-05-14 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染のための多糖ワクチン
WO2000012689A1 (en) 1998-08-31 2000-03-09 The Provost Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Polypeptides and polynucleotides from coagulase-negative staphylococci
MXPA01002119A (es) * 1998-08-31 2003-03-27 Inhibitex Inc Vacunas multicomponentes.
EP1121149A4 (en) 1998-08-31 2002-03-20 Inhibitex Inc IMMUNOTHERAPY METHOD FOR STAPHYLOCOCCAL INFECTIONS INCLUDING DONOR SELECTION AND DONOR STIMULATION
WO2000015238A1 (en) 1998-09-14 2000-03-23 Nabi COMPOSITIONS OF β-GLUCANS AND SPECIFIC IGIV
HU228473B1 (en) 1998-10-16 2013-03-28 Smithkline Beecham Biolog Adjuvant systems and vaccines
US6936258B1 (en) 1999-03-19 2005-08-30 Nabi Biopharmaceuticals Staphylococcus antigen and vaccine
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
BRPI0010612B8 (pt) 1999-04-19 2021-05-25 Smithkline Beecham Biologicals S A vacinas
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
WO2001034809A2 (en) 1999-11-09 2001-05-17 Glaxo Group Limited Staphylococcus epidermidis nucleic acids and proteins
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
SE0000514D0 (sv) 2000-02-17 2000-02-17 Biostapro Ab A 52 kDa protein from coagulase negative staphylococci and fragments
GB0014907D0 (en) 2000-06-20 2000-08-09 Univ Sheffield Antigenic polypeptides
WO2002007822A2 (en) 2000-07-21 2002-01-31 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Carbamate compounds for use in preventing or treating neuropathic pain and cluster and migraine headache-associated pain
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
ES2298269T3 (es) 2000-09-26 2008-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales.
AT410798B (de) 2001-01-26 2003-07-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen
US20020169288A1 (en) 2001-03-15 2002-11-14 Magnus Hook Collagen-binding adhesin from staphylococcus epidermidis and method of use
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
JP4404627B2 (ja) 2001-08-02 2010-01-27 ユニヴァーシティー オヴ シェフィールド 抗原性ポリペプチド
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
DE60230670D1 (de) 2001-12-11 2009-02-12 Merck & Co Inc Staphylococcus aureus exopolysaccharid und verfahren
WO2003076470A1 (en) 2002-03-05 2003-09-18 Inhibitex, Inc. Monoclonal and polyclonal antibodies recognizing coagulase-negative staphylococcal proteins
NZ574530A (en) 2002-08-02 2010-12-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine compositions comprising L2 and/or L3 immunotype lipooligosaccharides from lgtB-neisseria minigitidis
WO2004030699A1 (en) * 2002-10-03 2004-04-15 Intercell Ag Use of molecules which interact with the haptoglobin receptor ligand binding
CN100351260C (zh) 2002-11-12 2007-11-28 布赖汉姆妇女医院 葡萄球菌感染的多糖疫苗
US7723087B2 (en) 2002-11-12 2010-05-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nucleic acid molecules for enhanced production of a bacterial polysaccharide and methods of use thereof
CA2517439C (en) * 2003-03-07 2013-07-23 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
CN1918176A (zh) * 2004-02-18 2007-02-21 默克公司 用于诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫反应的多肽
SI1748791T1 (sl) 2004-05-11 2010-07-30 Staat Der Nederlanden - Minister Van Vws Neisseria meningitidis IgtB LOS kot adjuvans
CA2581746A1 (en) 2004-10-25 2006-06-08 The University Of Western Ontario Staphylococcus aureus isd protein-based anti-infectives

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020031528A1 (en) * 1996-09-11 2002-03-14 Fattom Ali Ibrahim Staphylococcus aureus antigen-containing whole cell vaccine
WO2000056360A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against antigens from bacteriae
WO2003061558A2 (en) * 2001-09-19 2003-07-31 Nabi Biopharmaceuticals Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations
WO2005000346A1 (en) * 2003-06-23 2005-01-06 Baxter International Inc. Carrier proteins for vaccines
WO2006032472A2 (en) * 2004-09-22 2006-03-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition for use in vaccination against staphylococcei
WO2006065553A2 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Nabi Biopharmaceuticals Glycoconjugate vaccines containing peptidoglycan

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHASIN NAVNEET ET AL.: "Identification of a gene essential for O-acetylation of the Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide" MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 27, no. 1, January 1998 (1998-01), pages 9-21, XP002452587 ISSN: 0950-382X page 16, right-hand column, paragraph 2 *
FATTOM A. I. ET AL.: "Antigenic determinants of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharide vaccines" INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY. WASHINGTON, US, vol. 66, no. 10, October 1998 (1998-10), pages 4588-4592, XP002153789 ISSN: 0019-9567 abstract page 4588, right-hand column, paragraph 3 page 4589, left-hand column, paragraph 2 page 4591, left-hand column, paragraph 4 page 4588, right-hand column, paragraph 3 *
FATTOM A. I. ET AL.: "Development of StaphVAX(TM), a polysaccharide conjugate vaccine against S. aureus infection: from the lab bench to phase III clinical trials VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 22, no. 7, 17 February 2004 (2004-02-17), pages 880-887, XP004487442 ISSN: 0264-410X the whole document *
JONES C.: "Revised structures for the capsular polysaccharides from Staphylococcus aureus Types 5 and 8, components of novel glycoconjugate vaccines" CARBOHYDRATE RESEARCH, ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHING COMPANY. AMSTERDAM, NL, vol. 340, no. 6, 2 May 2005 (2005-05-02), pages 1097-1106, XP004818368 ISSN: 0008-6215 the whole document *
MAIRA-LITRAN T. ET AL.: "COMPARATIVE OPSONIC AND PROTECTIVE ACTIVITIES OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS CONJUGATE VACCINES CONTAINING NATIVE OR DEACETYLATED STAPHYLOCOCCAL POLY-N-ACETYL-BETA-(1-6)-GLUCOSAMINE" INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY OF MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 73, no. 10, October 2005 (2005-10), pages 6752-6762, XP009058830 ISSN: 0019-9567 abstract. *
MAIRA-LITRAN T. ET AL: "Immunochemical Properties of the Staphylococcal Poly-N-Acetylglucosamine SurfacePolysaccharide" INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY. WASHINGTON, US, vol. 70, no. 8, August 2002 (2002-08), pages 4433-4440, XP002980605 ISSN: 0019-9567 abstract *
MOREAU M. ET AL.: "STRUCTURE OF THE TYPE 5 CAPSULAR POLYSACCHARIDE OF STAPHYLOCOCCUS-AUREUS" CARBOHYDRATE RESEARCH, vol. 201, no. 2, 1990, pages 285-298, XP002452578 ISSN: 0008-6215 the whole document *
PROPST M. ET AL.: "Opsonophagocytosis of Staphylococcus aureus type 5: Involvement of the 0-acetyl moiety on the capsular polysaccharide" ABSTRACTS OF THE GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, THE SOCIETY, WASHINGTON, DC, US, vol. 98, 17 May 1998 (1998-05-17), page 242, XP009089825 ISSN: 1060-2011 abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
MY148405A (en) 2013-04-30
EP2476433A1 (en) 2012-07-18
IL193565A0 (en) 2009-08-03
EP3141261A1 (en) 2017-03-15
ZA200808246B (en) 2014-11-26
EA201101164A1 (ru) 2012-05-30
AU2011201158B2 (en) 2013-08-22
NZ595178A (en) 2013-03-28
KR101541383B1 (ko) 2015-08-03
CA2647441C (en) 2021-02-23
JP2009531387A (ja) 2009-09-03
CN103169960A (zh) 2013-06-26
KR20080111115A (ko) 2008-12-22
US20180104323A1 (en) 2018-04-19
WO2007113222A2 (en) 2007-10-11
CA2647441A1 (en) 2007-10-11
CR10348A (es) 2008-10-29
EA020459B1 (ru) 2014-11-28
AU2007233705A1 (en) 2007-10-11
NO20083722L (no) 2008-12-19
US20100021503A1 (en) 2010-01-28
MA30343B1 (fr) 2009-04-01
SG170090A1 (en) 2011-04-29
CR20150097A (es) 2015-04-14
NZ570805A (en) 2011-10-28
EA200801839A1 (ru) 2009-08-28
EP2476434A1 (en) 2012-07-18
AU2011201158A1 (en) 2011-04-07
IL227934A0 (en) 2013-09-30
WO2007113222A3 (en) 2007-11-29
AU2007233705B2 (en) 2010-12-23
EP1998802A2 (en) 2008-12-10
BRPI0710210A2 (pt) 2011-05-24
MX337528B (es) 2016-03-09
IL193565A (en) 2013-10-31
IL227934A (en) 2015-04-30
MX2008012405A (es) 2008-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015833B1 (ru) Иммуногенная композиция
US10548963B2 (en) Immunogenic composition for use in vaccination against staphylococci
JP5491853B2 (ja) 免疫原性組成物
RU2484846C2 (ru) Мультивалентная композиция на основе конъюгата пневмокковый полисахарид-белок
EA015551B1 (ru) Конъюгатные вакцины
JP2001510169A (ja) Ｂ型髄膜炎菌性ポーリンおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ多糖体を含む免疫原性結合体
RU2521501C2 (ru) Иммуногенная композиция для применения в вакцинации против стафилококков
JP2002508009A (ja) ラクトフェリンおよび関連分子を用いた感染性因子を不活化する方法および組成物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM