ES2657588T3 - Vacunas de bioconjugados de bacterias grampositivas capsulares - Google Patents

Vacunas de bioconjugados de bacterias grampositivas capsulares Download PDF

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Abstract

Un organismo procariota huésped gramnegativo, en el que dicho organismo procariota huésped es E. coli, que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glicosiltransferasa de una bacteria Grampositiva, en la que dicha bacteria Grampositiva es Staphylococcus aureus; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una glicosiltransferasa de una bacteria Gramnegativa, en la que dicha bacteria Gramnegativa es Pseudomonas aeruginosa; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína transportadora, en la que dicha proteína transportadora comprende la secuencia consenso de aminoácidos D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa.

Description

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La divulgación se refiere además a procedimientos para producir proteínas glicosiladas en un organismo procariota huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica glicosiltransferasas nativas de un primer organismo procariota y que también codifica glicosiltransferasas nativas de un segundo organismo procariota que es diferente del primer organismo procariota. La presente divulgación se refiere adicionalmente a la producción de proteínas N-glicosiladas con polisacáridos capsulares de bacterias grampositivas, que se sintetizan mediante una combinación de diferentes glicosiltransferasas de diferentes organismos. La divulgación se refiere además a la producción de proteínas glicosiladas en un organismo procariota huésped que comprende una secuencia de nucleótidos introducida que codifica glicosiltransferasas nativas solo para un organismo procariota Grampositivo.
La presente divulgación se refiere además a plásmidos, tales como, plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. La divulgación también incluye plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 6; SEQ. ID NO: 7; SEQ. ID NO: 8 y SEQ. ID NO: 16. La divulgación también se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11; y SEQ. ID NO: 12. Además, la divulgación se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 15; SEQ. ID NO: 15; SEQ. ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ. ID NO: 19; SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 27.
La divulgación se refiere además a células bacterianas transformadas, tales como, por ejemplo, células bacterianas transformadas con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 2; SEQ. ID NO: 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18; SEQ. ID NO: 19 y SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21; y SEQ. ID NO: 27. La presente divulgación se refiere además a una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 5; SEQ. ID NO: 8; SEQ. ID NO: 9; SEQ. ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11; SEQ. ID NO: 12; SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 14; SEQ. ID NO: 15 y SEQ. ID NO: 16.
La presente divulgación se refiere además a un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra una infección causada por bacterias grampositivas y otras bacterias en un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica, que comprende: una proteína que comprende al menos una secuencia consenso insertada D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; y uno o más oligosacáridos o polisacáridos, siendo el uno o más oligosacáridos o polisacáridos que iguales o diferentes que otro de uno o más oligosacáridos o polisacáridos, de una bacteria Grampositiva unida a dicha secuencia consenso.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para identificar un polisacárido diana para su uso en la glucosilación de una proteína con dicho polisacárido diana, en su totalidad o en parte. Comprendiendo dicha proteína glicosilada el polisacárido diana puede usarse, por ejemplo, en composiciones de vacuna. En una realización, el procedimiento para identificar un polisacárido diana incluye: identificar una bacteria Grampositiva, tal como S. aureus, como diana; identificar una primera unidad de repetición de un polisacárido producido por dicha bacteria grampositiva que comprende al menos tres monómeros; identificar un polisacárido producido por una bacteria de una especie gramnegativa que comprende una segunda unidad de repetición que comprende dos de los mismos monómeros que dicha primera unidad de repetición.
La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para modificar una bacteria de una primera especie bacteriana, tal como una especie gramnegativa. En una realización, el procedimiento incluye: identificar una primera unidad de repetición de un polisacárido de una especie grampositiva, tal como S. aureus, que comprende tres monómeros; identificar un polisacárido producido por una bacteria de una segunda especie gramnegativa que comprende otra unidad de repetición que comprende dos de los mismos monómeros que la primera unidad de repetición; insertar en dicha bacteria de una primera especie gramnegativa una o más secuencias de nucleótidos que codifican glicosiltransferasas que ensamblan un trisacárido que comprende: a) dicha segunda unidad de repetición; y b) un monómero de dicha primera unidad de repetición no presente en dicha segunda unidad de repetición; insertar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína; e insertar una secuencia de nucleótidos que codifica una OTasa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa una ruta para la biosíntesis de antígeno O dependiente de wzx/wzy, ilustrada por la biosíntesis de antígeno O O11 de P. aeruginosa. Los nombres de proteínas supuestamente responsables de las reacciones presentadas se indican arriba o debajo de las flechas, incluidos uridina difosfato (UDP) y uridina monofosfato (UMP).
La Figura 2 representa una ruta propuesta para la biosíntesis del polisacárido capsular de serotipo 5 (CP5) de S. aureus modificado genéticamente en E. coli. Las enzimas proporcionadas por el grupo de antígeno O de P. aeruginosa O11 están indicados como en la figura 1. Las enzimas de CP5 de S. aureus se indican como Cap5 (compárese con la Figura 6). WecB y WecC son enzimas de E. coli requeridas para la producción de UDP-ManNAcA. Otras proteínas y enzimas representadas incluyen uridina difosfato (UDP), uridina monofosfato (UMP) y coenzima A (CoA).
La Figura 3 representa una ruta propuesta para la biosíntesis del polisacárido capsular de serotipo 8 (CP8) de S. aureus modificado genéticamente. Los nombres genéticos se indican con flechas (compárense con las figuras 1,
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2 y 6). UDP, UMP: difosfato de uridina, monofosfato de uridina. CoA: coenzima A.
La figura 4 representa la superposición estructural de la unidad de repetición (RU) de antígeno O de S. aureus capsular y de P. aeruginosa.
La figura 5A representa el análisis SDS-PAGE de la elongación del antígeno O O11 incompleto (unidad de repetición) por enzimas de S. aureus.
La figura 5B representa la inmunodetección de la elongación del antígeno O O11 incompleto por enzimas DE S. aureus.
La figura 6 representa una estrategia en una realización de la invención para la construcción de los grupos de genes quiméricos O11/CP55 y O11/CP8.
La figura 7A representa un CP5 LPS polimerizado de una realización de la invención detectada en extractos de lípidos de E. coli.
La figura 7B representa CP8 LPS polimerizado de una realización de la invención detectada en extractos de lípidos de E. coli.
La figura 8A representa la producción de LPS CP5 recombinante de una realización de la invención analizada por SDS-PAGE y teñida con plata en función del gen de resistencia a antibióticos en el plásmido pLAFR que contiene el grupo quimérico en células W3110 ΔwecA.
La figura 8B drepresenta la producción de CP5 LPS recombinante de una realización de la invención analizada por SDS PAGE, teñida con plata e inmunodetección en dependencia del gen de resistencia a antibióticos en el plásmido pLAFR que contiene el grupo quimérico en células W3110 ΔwecA.
La figuras 9 representa la producción de LPS CP5 recombinante de una realización analizada mediante SDS PAGE y mediante inmunodetección en dependencia del promotor frente al grupo quimérico en células W3110 ΔwecA.
La figura 10A muestra los resultados del análisis por HPLC de una realización de RU recombinante de CP5 de la presente invención producida usando el grupo de CP5 quimérico (SEQ ID: 2).
La figura 10B muestra los resultados del análisis por HPLC de una realización de RU recombinante de CP8 de la presente invención producida usando un grupo de CP8 quimérico que carece de la cap8I polimerasa.
La figura 11A muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP5 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 37 minutos que se ve en lafigura 10A.
La figura 11B muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP5 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 40 minutos que se ve en lafigura 10A.
La figura 11C muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 32 minutos vistos en la figura 10B.
La figura 11D muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 38 minutos vistos en la figura 10B.
La figura 11E muestra los resultados del análisis MALDI-MS/MS del pico específico generado por la expresión de una realización del grupo CP8 quimérico de la presente invención en E. coli que eluye a los 45 minutos vistos en la figura 10B.
La figura 11F muestra los resultados del análisis por HPLC de una realización de la optimización de la estructura de glucanos.
La figura11G presenta los resultados del análisis por HPLC del repertorio completo de glucanos CP5 presente en UndPP en células de E. coli en una realización de la presente invención.
La figura 11H presenta los resultados del análisis por HPLC de glucanos CP5 desacetilados y homogeneidad de RU en una realización de la invención.
La figura 11I proporciona los resultados del análisis por HPLC del repertorio de glucanos CP8 presente en UndPP en células E. coli en una realización de la presente invención.
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La figura 11J muestra los resultados de HPLC, En una realización de la presente invención, de desacetilación de glucanos CP8 y homogeneidad de RU.
La figura 11K presenta resultados de HPLC que muestran la reducción en la polimerización RU y el aumento en LLO inducida por la coexpresión de wzzO7 con el grupo quimérico CP8 en una realización de la presente invención.
La figura 12 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de cromatografía de afinidad con Ni2+ del bioconjugado EPA-CP5 purificado a partir de células en realizaciones de la presente invención sin y con el gen de la flipasa de S. aureus cap5K (SEQ ID NO: 2 y 3).
La figura 13A presenta el análisis del bioconjugado CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención purificado con cromatografía de afinidad de Ni2+ y cromatografía de intercambio aniónico.
La figura 13B representa las masas M/Z encontradas para el sitio de glucosilación en el péptido tripsinizado DNNNSTPTVISHR unido glicosídicamente a través de N a la masa de RU O-acetilada (m/z = 2088 ([M + H]+)) de acuerdo con una realización de la presente invención. El recuadro ilustra la estructura de RU unida al péptido.
La figura 13C representa las masas de M/Z encontradas para el sitio de glucosilación en el péptido tripsinizado DQNR unido a N glicosídicamente a la masa de RU O-acetilada (m/z = 1165 ([M + H]+)) de acuerdo con una realización de la presente invención. El recuadro ilustra la estructura de RU unida al péptido.
La figura 13D representa un análisis de cromatografía de afinidad de Ni2+y cromatografía de intercambio aniónico bioconjugado de CP8-EPA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 13E representa el bioconjugado de CP5-EPA purificado a partir de células que contienen 3 (izquierda)
o 2 plásmidos (calle derecha) para la producción de glicoconjugados de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 13F representa el análisis de cromatografía de afinidad Ni2+ del bioconjugado CP8-EPA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 14A presenta un análisis de MALDI de alta masa de un bioconjugado de CP5-EPA purificado de una realización de la invención producida utilizando el sistema de 3 plásmidos de la figura 13A.
La figura 14B muestra la caracterización por cromatografía de exclusión por tamaño del bioconjugado de CP5-EPA de una realización de la invención producida usando el sistema de 3 plásmidos de la figura 13A.
La figura 14C muestra el análisis de SDS PAGE e inmunodetección del bioconjugado de CP5-Hla purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 14D presenta los resultados del bioconjugado de CP5-AcrA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 14E presenta los resultados del bioconjugado de CP5-ClfA purificado de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 15A representa los anticuerpos específicos anti-CP5 generados en ratones mediante bioconjugado de CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 15B representa los anticuerpos específicos anti-CP5 producidos en conejo por bioconjugado de CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 16A ilustra la actividad opsonofagocítica in vitro (en S. aureus Reynolds) de anticuerpos específicos de CPS generados por inmunización de conejos con CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 16B ilustra la actividad opsonofagocitosis in vitro (en S. aureus USA 100) de anticuerpos específicos de CP5 generados por inmunización de conejos con CP5-EPA de acuerdo con una realización de la presente invención.
La figura 17A representa los resultados de la inmunización pasiva usando anticuerpos anti-CP5-EPA, de acuerdo con una realización de la presente invención, en ratones a los que se ha inyectado i.p. ~3,6.107 UFC de las cepa Reynolds de S. aureus.
La figura 17B representa los resultados de la inmunización pasiva usando anticuerpos anti-CP5-EPA, de acuerdo con una realización de la invención, en ratones a los que se ha inyectado 2 mg de CP5-EPA IgG.
La figura 17C representa los resultados de la inmunización pasiva usando anticuerpos anti-CP5-EPA, De acuerdo con una realización de la invención, en ratones a los que se ha inyectado 300 µg de CP5-EPA IgG,
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CapG es una 2-epimerasa, cataliza la forma de epimerización UDP-L-6dTa1NAc a UDP-LFucNAc en CP5 de S. aureus. CapH en CP5 de S. aureus es una O-acetiltransferasa.
CapH en CP8 es una transferasa similar a capI de CP5 de S. aureus. CapI en CP5 de S. aureus es una glicosiltransferasa que cataliza la transferencia de UDP-ManNAcA en el transportador de lípidos-D-FucNAc-L-FucNAc produciendo el lípido-D-FucNAc-L-FucNAc-ManNAcA del transportador.
CapI en CP8 es una polimerasa que es similar a CapJ en CP5 de S. aureus. CapJ en CP5 de S. aureus es una polimerasa. CapJ en CP8 es una O-acetiltransferasa similar a CapH en CP5 de S. aureus. CapK en CP5 de S. aureus es una flipasa en CapK en CP8 de S. aureus es una flipasa similar a CapK en CP5. CapL es una transferasa que cataliza la transferencia de UDP-L-FucNAc en tramsportador lipídico -D-FucNAc-L-
FucNAc que produce transportador de lípidos -D-FucNAc-L-FucNAc en CP5 de S. aureus.
CapM es una transferasa que cataliza la transferencia de UDP-D-FucNAc en el transportador productor de lípido transportadorD-FucNAc en CP5 de S. aureus. CapN is a 4-reductasa que cataliza la reducción de UDP-2-acetamido-2, 6-didesoxi-D-xilo-4-hexulosa a UDP-D-
FucNAc en CP5 de S. aureus.
CapO es una deshidrogenasa que cataliza la conversión de UDP-D-ManNAc en UDP-ManNAcA en CP5 de S. aureus. CapP es una 2-epimerasa que cataliza la epimerización de UDP-D-GlcNAc a UDP-D-ManNAc en CP5 de S. aureus. UFC se refiere a unidades formadoras de colonias. ClfA se refiere al factor de aglutinación A de S. aureus, una proteína anclada en la pared celular. La vacuna conjugada se refiere a una vacuna creada mediante la unión covalente de un antígeno polisacárido a una
proteína transportadora. La vacuna conjugada provoca respuestas inmunitarias antibacterianas y memoria inmunológica. En bebés y personas mayores se puede inducir una respuesta inmune protectora contra antígenos de polisacáridos si estos antígenos se conjugan con proteínas que inducen una respuesta dependiente de células T.
La secuencia consenso se refiere a una secuencia de aminoácidos, -D/E -X -N -Z -S/T-, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina, dentro de la cual se encuentra el sitio de unión de carbohidratos a glicoproteínas ligadas a N.
El polisacárido capsular se refiere a una capa gruesa de tipo mucosa de polisacárido. Los polisacáridos capsulares son solubles en agua; habitualmente ácidos que consisten en unidades que se repiten regularmente de uno a varios monosacáridos/monómeros.
CP5 se refiere a polisacárido capsular de tipo 5 de Staphylococcus aureus o polisacárido capsular de serotipo 5. CP8 se refiere a polisacárido capsular de tipo 8 de Staphylococcus aureus o polisacárido capsular de serotipo 8. D-FucNAc se refiere a N-acetil D-fucosamina. ECA se refiere al antígeno común enterobacteriano. ELISA se reifere a ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas, una técnica bioquímica utilizada principalmente en
inmunología para detectar la presencia de un anticuerpo o un antígeno en una muestra. EPA o EP Ar se refieren a la exoproteína A de P. aeruginosa recombinante no tóxica La vacuna glicoconjugada se refiere a una vacuna que consiste en un transportador proteico unido a un
oligosacárido antigénico. Glicosiltransferasa se refiere a enzimas que actúan como un catalizador para la transferencia de una unidad monosacárida desde un azúcar de nucleótido activado a una molécula aceptora de glicosilo.
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de proteína adecuado. Para producir una versión de EPA que puede estar glicosilada, los ácidos nucleicos que codifican EPA deben modificarse mediante la inserción de sitios de glucosilación como se discutió anteriormente.
Los portadores proteicos destinados para su uso en realizaciones de la invención preferiblemente deben tener ciertas características inmunológicas y farmacológicas. Desde una perspectiva inmunológica, preferentemente, un portador de proteína debería: (1) tener epítopes de células T; (2) ser capaz de administrar un antígeno a células presentadoras de antígeno (APC) en el sistema inmune; (3) ser potente y duradero; y (4) ser capaz de generar una respuesta de IgG sistémica específica de antígeno. Desde una perspectiva farmacológica, un portador de proteína debería, preferentemente: (1)ser no ser tóxico; y (2) ser capaz de liberar antígenos de manera eficiente a través de las barreras epiteliales intactas. Más preferentemente, Además de estas características inmunológicas y farmacológicas, un portador de proteína considerado para uso en la producción de un bioconjugado bacteriano debe:
(1) secretarse fácilmente en el espacio periplásmico; y (2) ser capaz de tener epítopos de antígeno fácilmente introducidos como bucles o secuencias lineales en él. Informado por esta divulgación y conocimiento de un experto en la materia, un experto en la técnica puede considerar e identificar rutinariamente portadores de proteínas adecuados que pueden usarse en realizaciones particulares de la invención.
En una realización de la invención, la proteína AcrA de Campylobacter es un portador de proteína.
En una realización más de la invención, la exotoxina de P. aeruginosa (EPA) desintoxicada genéticamente es un portador de proteína en el cual el organismo objetivo para el cual se desea una vacuna es S. aureus. A diferencia de AcrA que contiene sitios de glucosilación naturales, EPA no contiene tales sitios de glucosilación natural y necesita ser modificado por inserción de sitios de glucosilación (por ejemplo, inserción de ácidos nucleicos que codifican la secuencia consenso optimizada como se discutió anteriormente en la secuencia de ácido nucleico que codifica EPA). En una realización adicional, EPA se modifica para introducir dos sitios de glucosilación que permitirán la glucosilación con el S. aureus antígeno. Aún en una realización adicional, se introducen dos secuencias de consenso como se discute en el Ejemplo 10 de WO 2009/104074.
La secuencia de aminoácidos de EPA, como se modificó en una realización de esta invención para contener dos sitios de glucosilación, se proporciona como la SEQ ID NO: 13 (con secuencia señal) y la SEQ ID NO.: 14 (sin secuencia señal). Los sitios de glucosilación en la SEQ ID NO: 13 son DNNNS y DQNRT en las posiciones 260DNNNS y 402DQNRT. Los sitios de glucosilación en la SEQ ID NO: 14 son DNNNS y DQNRT en las posiciones 241DNNNS y 383DQNRT.
Una proteína transportadora tal como EPA es una proteína sobre la que pueden añadirse sitios de N-glucosilación en la producción de un bioconjugado bacteriano. Los sitios de N-glucosilación requieren la introducción de las secuencias consenso discutidas previamente, a saber, inserción de D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina. Hemos encontrado que dichas secuencias consenso preferiblemente se introducen en bucles de superficie, mediante inserción en lugar de mutación y mediante el uso de restos flanqueantes insertados adicionalmente y mediante la mutación de restos flanqueantes para optimizar el funcionamiento del sitio de N-glucosilación.
Algunos antígenos de subunidades proteicas bien caracterizados de S. aureus son la hemolisina alfa (toxina alfa, Hla), factor de aglutinación alfa (ClfA), IsdB y Panton-Valentine Leukocidina (PVL).
Hla es una toxina secretora de poros secretada y un factor de virulencia esencial de MRSA en un modelo de ratón de S. aureus neumonía. El nivel de expresión de Hla por S. independiente Aureus cepas se correlaciona directamente con su virulencia. Inmunización activa con una forma mutante de Hla (Hla H35L, SEQ ID NO: 5), que no puede formar poros (Menzies, B. E., y D. S. Kernodle. 1996. La inmunización pasiva con antisuero contra un mutante de toxina alfa no tóxica de Staphylococcus aureus es protectora en un modelo murino. Infect Immun 64:1839-41; Jursch, R., A. Hildebrand, G. Hobom, J. Tranum-Jensen, R. Ward, M. Kehoe y S. Bhakdi. 1994. Residuos de histidina cerca del extremo N de la toxina alfa estafilocócica como indicadores de regiones que son críticas para la oligomerización y la formación de poros. Infect Immun 62 (6): 2249-56), se demostró que genera respuestas de inmunoglobulina G específicas de antígeno y para proporcionar protección contra la neumonía por estafilococos. La transferencia de anticuerpos específicos de HLA protege a los animales ingenuos contra S. aureus desafiar y prevenir la lesión de las células epiteliales de los pulmones seres humanos durante la infección (Bubeck Wardenburg, J., A. M. Palazzolo-Ballance, M. Otto, O. Schneewind y F. R. DeLeo. 2008. La leucocidina Panton-Valentine no es un determinante de la virulencia en los modelos murinos de la enfermedad de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina asociada a la comunidad. J Infect Dis 198:1166-70). Para usarse como vacuna, se requiere la mutación H35L en Hla para eliminar la toxicidad de la proteína (Menzies, B. E., y D. S. Kernodle. 1994. Mutagénesis dirigida al sitio del gen de la toxina alfa de Staphylococcus aureus: papel de las histidinas en la actividad de la toxina in vitro y en un modelo murino. Infect Immun 62:1843-7). ClfA contiene un dominio resistente a la proteasa que se usa para la inmunización. La inmunización pasiva de ratones con anticuerpos anti-ClfA y anti-CP5 efectivamente esterilizó las glándulas mamarias en el modelo de infección de la glándula mamaria (Tuchscherr, L. P., F. R. Buzzola, L. P. Alvarez, J. C. Lee y D. O.Sordelli. 2008. Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice. Infect Immun 76: 5738-44).
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En una realización adicional de la presente invención, un polisacárido modificado producido por una ruta biosintética de LPS modificado comprende:
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Usando la tecnología de la invención, se pueden producir bioconjugados bacterianos que son inmunogénicos. Se pueden hacer modificaciones genéticas permitiendo en vivo conjugación de polisacáridos bacterianos en las proteínas deseadas y en las posiciones deseadas.
Otro aspecto de la divulgación implica la producción de cápsulas de LPS o LPS modificados conjugados con un portador proteico usando la ruta biosintética de LPS modificada como se discutió anteriormente.
Una realización adicional de la divulgación incluye una construcción de secuencia de nucleótidos que codifica el grupo de biosíntesis de polisacáridos completo Cap5 y Cap8, en la que los genes transportadores eliminados son capA, capB y capC de S. aureus (véase la figura 6).
Una realización adicional de la invención incluye la integración del grupo quimérico CP5/O11 (SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 17) o el grupo quimérico CP8/O11 (SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 18 o SEQ ID NO. 19) en el genoma de una célula huésped. Una realización adicional de la invención implica la integración en el genoma de una célula huésped: (a) el grupo quimérico CP5/O11 (SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 17) o el grupo quimérico CP8/O11. (SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 18 o SEQ ID NO. 19); (b) ácidos nucleicos que codifican la OTasa; y (c) ácidos nucleicos que codifican una proteína con o sin una secuencia consenso introducida.
Otra realización de la presente divulgación se refiere a plásmidos, tales como, por ejemplo, plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 2; SEQ. ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18 y SEQ. ID NO: 19. La invención también incluye plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 14 y SEQ. ID NO: 15. La invención también se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ ID NO: 16; SEQ. ID NO: 6; SEQ. ID NO: 7 y SEQ. ID NO: 8. La invención también se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ ID NO: 10; SEQ. ID NO: 11 y SEQ. ID NO: 12. Además, la invención se refiere a plásmidos que comprenden una o más de SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 27.
Las realizaciones de la presente divulgación se refieren además a células bacterianas transformadas, tales como, por ejemplo, incluidas células bacterianas transformadas con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 2; SEQ. ID NO. 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18; SEQ. ID NO: 19; SEQ. ID NO: 20; SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 27. Se incluye adicionalmente en la invención una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. Se incluye adicionalmente una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21. La presente invención se refiere adicionalmente a una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 16, SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. La divulgación se refiere además a células bacterianas transformadas, tales como, por ejemplo, incluidas células bacterianas transformadas con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 17; SEQ. ID NO: 18; y SEQ. ID NO: 19, y en el que dicha célula bacteriana expresa una glicosiltransferasa nativa de P. aeruginosa y una glicosiltransferasa nativa de S. aureus CP5 y/o CP8. Además, se incluye en la divulgación una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO: 17; SEQ ID NO: 18 y SEQ. ID NO: 19 en el que dicha célula bacteriana expresa una glicosiltransferasa nativa de P. aeruginosa, una glicosiltransferasa nativa de S. aureus CP5 y/o CP8 y PglB. Todavía adicionalmente se incluye en la presente divulgación (a) una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende la SEQ. ID NO. 19, en el que dicha célula bacteriana expresa una glicosiltransferasa nativa de P. aeruginosa, una glicosiltransferasa nativa de S. aureus CP8, Wzz de E. coli serovar 07 y PglB; (b) una célula bacteriana transformada con un plásmido que comprende una o más de SEQ. ID NO. 19 y SEQ. ID NO. 20, en el que dicha célula bacteriana expresa una glicosiltransferasa nativa de P. aeruginosa, una glicosiltransferasa nativa de S. aureus CP8, Wzz (regulador de longitud), EPA y PglB; y (c) una célula bacteriana que comprende una o más de SEQ. ID NO. 16; SEQ.
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aureus que contiene al menos un componente inmunogénico o fragmento de un S. aureus polisacárido y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos componentes o fragmentos inmunogénicos pueden incluir, por ejemplo, un polisacárido de S. aureus de al menos aproximadamente dos monómeros de longitud o al menos aproximadamente tres monómeros de longitud. En un aspecto adicional de la invención, una RU de S. aureus comprende dichos monómeros. Tales unidades repetitivas pueden incluir, por ejemplo, una RU de S. aureus de al menos 1 (uno) de longitud.
Se pueden obtener componentes inmunogénicos o fragmentos de la divulgación, por ejemplo, mediante el cribado de polisacáridos o polipéptidos producidos de forma recombinante o mediante síntesis química, o, por ejemplo, seleccionando el bioconjugado que comprende un polisacárido y una proteína. Los componentes inmunogénicos de selección o fragmentos de la divulgación se pueden realizar usando uno o más de varios ensayos diferentes. Por ejemplo, los ensayos de selección incluyen ELISA y otros ensayos conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización, los componentes o fragmentos inmunogénicos se identifican por la capacidad del polisacárido y/o proteína para estimular anticuerpos IgG contra bacterias grampositivas, como los polisacáridos S. aureus CP5 o CP8, según lo determinado por, por ejemplo, la respuesta inmune obtenida en ratones (figura 15A) y en conejos (figura 15B) midiendo anticuerpos específicos anti-CP5 (cuantificados mediante ELISA) contra el candidato de vacuna de glicoconjugado CP5-EPA y otros medios conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.
En una realización, los componentes o fragmentos inmunogénicos se identifican por la capacidad del polisacárido y/o proteína para estimular la actividad opsónica, como la muerte opsonofagocítica, según lo determinado por, por ejemplo, por la muerte de S. aureus (actividad "in vitro") con anticuerpos anti-CP5-EPA de conejo (obtenidos en el Ejemplo 7 a continuación, véase la Figura 15B) y otros medios conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
En otra realización adicional, los componentes o fragmentos inmunogénicos se identifican por la capacidad del polisacárido y/o proteína para estimular la inmunidad humoral y/o mediada por células contra bacterias grampositivas, tal como S. aureus, según lo determinado por, por ejemplo, mediante protección contra infección bacteriana ("desafío") usando inmunización activa en ratones (Figura 18) con CP5-EPA y otros medios conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
En una realización de la presente invención, una composición de vacuna de la invención puede basarse en una glicoproteína que comprende un componente inmunogénico o fragmento de un S. aureus polisacárido de la invención y opcionalmente además que comprende un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En realizaciones adicionales de la presente invención, una composición de vacuna puede basarse en una glicoproteína que comprende un componente inmunogénico o fragmento de un S. aureus proteína de la invención y que comprende opcionalmente además un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional de la invención, una composición de vacuna puede basarse en una glicoproteína que comprende un componente inmunogénico o fragmento de un P. aeruginosa proteína de la invención y que comprende opcionalmente además un vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Es bien conocido por los expertos en la técnica cómo modificar una vacuna para administración a un tipo de mamífero, por ejemplo, ratones, para la administración a otro tipo de mamífero, por ejemplo, seres humanos. Por ejemplo, un experto sabrá fácilmente que la eliminación de la etiqueta de histidina del portador proteico de una glicoproteína utilizada en una composición de vacuna en ratones haría que la glicoproteína fuera adecuada para la administración en una composición de vacuna en seres humanos. Por ejemplo, eliminación del marcador de HISTIDINA (marcador HIS) en portadores de proteínas como, por ejemplo, EPA (SEQ ID NO: 13), ClfA (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12), y Hla (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16) se reconocería por su uso en una glicoproteína para la administración a un ser humano.
Se debe entender que la mejora de cualquiera de los síntomas de un grampositivo, por ejemplo, S. aureus, u otra infección bacteriana o enfermedad es un objetivo clínico deseable, incluida una disminución de la dosificación de la medicación utilizada para la infección o enfermedad causada por un grampositivo, por ejemplo, una infección o enfermedad causada por S. aureus, u otra infección o enfermedad causada por bacterias, o un aumento en la producción de anticuerpos en el suero o la mucosa de los pacientes. Será evidente para los expertos en la técnica que algunas de las composiciones de vacuna de la divulgación son útiles para prevenir una infección grampositiva, por ejemplo, una infección por S. aureus u otra infección bacteriana, algunos son útiles para tratar una infección grampositiva, por ejemplo, una infección por S. aureus u otra infección bacteriana, y algunas son útiles tanto para prevenir como para tratar tales infecciones.
Las realizaciones de la presente invención tales como vacunas y otros agentes farmacéuticos pueden prepararse opcionalmente usando vehículos excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, como es bien conocido en la técnica y aparente a la luz de esta memoria descriptiva. Un excipiente, diluyente o adyuvante puede ser un material sólido, semisólido o líquido que puede servir como vehículo o medio para el ingrediente activo. A la luz de esta memoria descriptiva, un experto en la técnica en el campo de la preparación de composiciones puede seleccionar fácilmente la forma y el modo de administración apropiados dependiendo de las características
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