TW201615211A - 新穎多醣體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供新穎大腸桿菌(E.coli)O多糖體O25B。本文亦提供包括用於O25B產生之酶(例如糖基轉移酶)之原核宿主細胞。本文所提供之宿主細胞產生O25B生物偶聯物(bioconjugates),其中該等生物偶聯物包括O25B連接至載體蛋白。本文另外提供包括O25B及/或包括O25B之生物偶聯物之組合物,例如醫藥組合物。該等組合物可用作抵抗ExPEC感染之疫苗,且可進一步包括一或多種其他生物偶聯物。

Description

新穎多醣體及其用途
本文揭示大腸桿菌(E.coli)抗原O25B之結構以及O25B之用途、製備O25B之方法及包括O25B之生物偶聯物。申請者已鑑別負責產生O25B之大腸桿菌基因簇且充分表徵O25B抗原之結構。因此,本文提供能夠在宿主細胞中產生O25B之核酸。本文亦提供包括能夠產生O25B之核酸之宿主細胞(例如重組改造之宿主細胞)。該等宿主細胞可用於生成包括連接至載體蛋白之O25B之生物偶聯物,該等生物偶聯物可用於(例如)調配治療劑(例如疫苗)。本文所闡述之O25B抗原亦可用於生成抗體,該等抗體可用於(例如)治療方法(例如個體之被動免疫)中。本文另外提供包括O25B(單獨或與其他大腸桿菌抗原(例如O1、O2及O6及其亞血清型)組合)之組合物,該等組合物用於治療方法中,例如對宿主接種疫苗以抵抗大腸桿菌(例如腸外病原性(例如尿路病原性)大腸桿菌)感染。
腸外病原性大腸桿菌(ExPEC)每年會引起各種造成重大發病率、死亡率及成本之感染。泌尿道感染係人類中由ExPEC引起之最常見病狀。然而,ExPEC亦引起危及生命之病狀,例如腦膜炎及敗血病。
抗生素細菌抗性係抵抗細菌感染中之主要問題,且多藥物抗性(MDR)大腸桿菌菌株正愈加普遍。Schito等人,2009,Int.J.Antimicrob.Agents 34(5):407-413;及Pitout等人,2012,Expert Rev. Anti.Infect.Ther.10(10):1165-1176。因此,需要研發抵抗ExPEC之有效疫苗。
在一態樣中,本文提供包括編碼能夠產生本文所揭示新穎多糖體大腸桿菌O25B之酶(例如糖基轉移酶)之核酸之原核宿主細胞。本文亦提供包括編碼能夠產生其他大腸桿菌抗原(例如O25A、O1、O2及O6及其亞血清型)之酶(例如糖基轉移酶)之核酸之宿主細胞。本文所提供之宿主細胞可天然表現特異性產生所關注O抗原之核酸,或可使宿主細胞表現該等核酸,亦即,在某些實施例中,該等核酸對宿主細胞為異源性。在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼在蛋白質N-糖基化中活躍之其他酶之核酸,舉例而言,本文所提供之宿主細胞可進一步包括編碼寡糖基轉移酶之核酸或編碼其他糖基轉移酶之核酸。在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼載體蛋白(例如寡糖及/或多糖體可附接以形成生物偶聯物之蛋白質)之核酸。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。參見5.3部分。
在一具體實施例中,本文提供包括大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO:12)或與大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO:12)約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之原核宿主細胞。在一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供包括大腸桿菌rfb(upec163)基因 簇或與大腸桿菌rfb(upec163)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之原核宿主細胞。在一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供包括大腸桿菌rfb(upec177)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec177)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之原核宿主細胞。在一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供經重組改造以包括(例如藉由將一或多種載體/質粒引入宿主細胞中)一種、兩種、三種、四種或多種下列基因(或與下列基因中之一者約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸)之原核宿主細胞:rmlB(SEQ ID NO:1)、rmlD(SEQ ID NO:2)、rmlA(SEQ ID NO:3)、rmlC(SEQ ID NO:4)、wzx(SEQ ID NO:5)、wekA(SEQ ID NO:6)、wekB(SEQ ID NO:7)、wzy(SEQ ID NO:8)、wbbJ(SEQ ID NO:9)、 wbbK(SEQ ID NO:10)及/或wbbL(SEQ ID NO:11)。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶(例如異源性寡糖基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供經重組改造以包括(例如藉由將一或多種載體/質粒引入宿主細胞中)一種、兩種、三種、四種或多種下列部分之原核宿主細胞:(i)dTDP-葡萄糖4,6-去水酶;(ii)dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶;(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶;(iv)dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶;(v)O抗原翻轉酶;(vi)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶;(vii)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶;(viii)O抗原聚合酶;(ix)O-乙醯基轉移酶;(x)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶;及/或(xi)dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶。在一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶(例如異源性寡糖基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在某些實施例中,本文所提供之原核宿主細胞包括一或多種基因之缺失或功能不活化。參見5.3.1部分。在一具體實施例中,waaL 基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb基因簇(或rfb簇中之一或多者基因)中之一或多者自本文所提供之原核宿主細胞之基因組缺失或功能不活化。
由本文所提供之原核宿主細胞表現之載體蛋白可選自彼等熟習此項技術者已知之任何載體蛋白,例如去毒之綠膿桿菌(P.aeruginosa)外毒素A(EPA;例如參見Ihssen等人(2010)Microbial cell factories 9,61)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒之金黃色葡萄球菌(S.aureus)溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素之去毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白之承載結構域、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素及其去毒變體、空腸彎曲桿菌(C.jejuni)AcrA及空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。在一具體實施例中,由本文所提供之原核宿主細胞表現之載體蛋白係去毒假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(EPA)。在某些實施例中,本文所提供宿主細胞之載體蛋白包括使載體蛋白靶向宿主細胞之周質間隙中之信號序列。在一具體實施例中,信號序列係來自大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MalE)、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovorans)果膠酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)木聚糖內切酶(XynA)、不耐熱大腸桿菌腸毒素LTIIb、芽孢桿菌木聚糖內切酶XynA或大腸桿菌鞭毛蛋白(FlgI)。在某些實施例中,編碼由本文所提供之宿主細胞表現之載體蛋白之核酸序列經改造(例如經由重組技術)以編碼以下中之一或多者:共有序列Asn-X-Ser(Thr),其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);及/或共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在某些實施例中,由本文所提供之宿主細胞表現之載體蛋白包括該等共有序列中之兩者、三者、四者、五者或更多者。參見5.3.2部分。
在另一態樣中,本文提供產生包括N-連接至大腸桿菌O抗原(例如大腸桿菌O25B)之載體蛋白(例如EPA)之N-糖基化載體蛋白(在本文中亦稱為生物偶聯物)之方法,該方法包括:在適於產生蛋白質之條件下培養本文所闡述之宿主細胞,及純化N-糖基化載體蛋白。使用宿主細胞(例如大腸桿菌)產生蛋白質及分離藉由宿主細胞產生之蛋白質之方法在業內已眾所周知。參見5.3部分。
在另一態樣中,本文提供藉由本文所提供之宿主細胞產生之生物偶聯物。在一具體實施例中,本文提供包括N-連接至大腸桿菌O25B之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物。參見5.4部分。
在一具體實施例中,本文提供包括連接至下文所呈現式O25B之化合物之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,載體蛋白N-連接至式O25B之O抗原。
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至下文所呈現式O25B’之化合物之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,載體蛋白N-連接至式O25B’之O抗原。
在另一態樣中,本文提供來自ExPEC大腸桿菌菌株之分離O抗原,其中該菌株產生O25B。在另一具體實施例中,本文提供來自大腸桿菌菌株upec138之分離O抗原。在一具體實施例中,本文提供來自大腸桿菌菌株upec163之分離O抗原。在另一具體實施例中,本文提供來自大腸桿菌菌株upec177之分離O抗原。參見部分5.2。
在另一態樣中,本文提供下文所呈現式O25B之分離大分子之群體:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,群體中至少80%之大分子之n介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。
在另一態樣中,本文提供下文所呈現式O25B’之分離大分子之群體:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,群體中至少80%之大分子之n介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。
在另一態樣中,本文提供使用O25B及/或包括O25B之生物偶聯物生成抗O25B抗體之方法。本文另外提供根據該等方法產生之抗體。參見5.5部分。
在另一態樣中,本文提供包括本文所提供之生物偶聯物及/或本文所提供之大分子(或其群體)之組合物(例如醫藥組合物)。參見5.6部分。
在一具體實施例中,本文提供包括含有式O25B結構之大分子之組合物(例如醫藥組合物):
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15 至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
在另一具體實施例中,本文提供包括含有式O25B’結構之大分子之組合物(例如醫藥組合物):
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
在另一具體實施例中,本文提供包括本文所闡述之生物偶聯物之組合物(例如醫藥組合物),其中該生物偶聯物包括連接至下文所呈現式O25B之化合物之載體蛋白(例如EPA):
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,載體蛋白N-連接至式O25B’之O抗原。
在另一具體實施例中,本文提供包括本文所闡述之生物偶聯物之組合物(例如醫藥組合物),其中該生物偶聯物包括連接至下文所呈現式O25B’之化合物之載體蛋白(例如EPA): 其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,載體蛋白N-連接至式O25B’之O抗原。
在某些實施例中,本文所提供之醫藥組合物包括一或多種其他大腸桿菌O抗原,其中該等抗原並非O25B(例如式O25B或式O25B’),例如除彼等來自大腸桿菌O25B血清型之抗原外之來自大腸桿菌之O抗原(例如ExPEC);及/或一或多種包括連接至大腸桿菌O抗原之載體蛋白之生物偶聯物,其中該抗原並非O25B(例如式O25B或式O25B’)。該等組合物可包括一或多種包括ExPEC O抗原之其他大分子及/或一或多種其他生物偶聯物,例如O1A、O2及/或O6大分子及/或O1A、O2及/或O6生物偶聯物。
在一具體實施例中,本文提供除O25B大分子(例如包括式O25B或式O25B’之大分子)及/或O25B生物偶聯物(例如包括連接至式O25B或式O25B’之載體蛋白之生物偶聯物)外亦包括一或多種包括ExPEC O抗原之其他大分子及/或一或多種其他生物偶聯物之組合物(例如醫藥組合物),其中該等其他大分子包括選自由以下組成之群之結構:a. 式O25A
g. 式O2
在一具體實施例中,本文提供除O25B大分子(例如包括式O25B或式O25B’之大分子)及/或O25B生物偶聯物(例如包括連接至式O25B或式O25B’之載體蛋白之生物偶聯物)外亦包括一種、兩種、三種、四種、五種、六種或七種大分子或包括該等大分子之生物偶聯物之組合物(例如醫藥組合物),其中該等其他大分子包括選自由以下組成之群之結構:
d. 式O1C’
在另一具體實施例中,本文提供包括以下部分之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;及(ii)O1大分子或包括O1之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1A。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1B。 在另一具體實施例中,該O1大分子係O1C。
在另一具體實施例中,本文提供包括以下部分之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;及(ii)O2大分子或包括O2之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。
在另一具體實施例中,本文提供包括以下部分之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;及(ii)O6大分子(例如包括支鏈Glc單糖(O6Glc)或支鏈GlcNAc單糖(O6GlcNAc)之O6大分子)或包括O6之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O6大分子係包括支鏈Glc單糖(O6Glc)之O6大分子。
在另一具體實施例中,本文提供包括下列部分中之兩者之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;(ii)O1大分子或包括O1之生物偶聯物;(iii)O2或包括O2之生物偶聯物;及/或(iv)O6大分子(例如包括支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖之O6大分子)或包括O6之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1A。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1B。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1C。在另一具體實施例中,該O6大分子係包括支鏈Glc單糖之O6大分子(在本文中亦稱為O6Glc)。
在另一具體實施例中,本文提供包括O25B大分子、O1A大分子、O2大分子及包括支鏈Glc單糖之O6大分子之組合物(例如醫藥組合物)。在某些實施例中,該等大分子偶聯至載體蛋白。
在另一態樣中,本文提供預防個體(例如人類個體)之ExPEC感染之方法,其包括向個體投與醫藥上有效量之本文所闡述之組合物(例如免疫原性組合物)。參見部分5.7。
在另一態樣中,本文提供治療個體(例如人類個體)之感染之方法,其中個體感染ExPEC,該等方法包括向個體投與醫藥上有效量之本文所闡述之組合物(例如免疫原性組合物)。參見部分5.7。
在另一態樣中,本文提供誘導個體(例如人類個體)之抵抗ExPEC 之免疫反應之方法,其包括向個體投與醫藥上有效量之本文所闡述之組合物(例如免疫原性組合物)。參見部分5.7。
在另一態樣中,本文提供誘導在個體(例如人類個體)中產生抵抗ExPEC之調理吞噬抗體之方法,其包括向個體投與醫藥上有效量之本文所闡述之組合物(例如免疫原性組合物)。參見部分5.7。
術語及縮寫:OPS:O多糖體;革蘭氏陰性(Gram-negative)細菌之O抗原。OPS在本文中亦稱為O抗原。
rfb簇:編碼能夠合成O抗原骨架結構之酶機構之基因簇(例如大腸桿菌基因簇)。術語rfb簇可適用於任一O抗原生物合成簇,包含彼等來自並不屬大腸桿菌屬(Escherichia)之細菌者。
waaL:編碼具有位於周質中之活性位點之膜結合酶之O抗原連接酶基因。所編碼酶將十一異戊二烯基磷酸酯(UPP)結合O抗原轉移至脂質A核心中,從而形成脂多糖。
wecA:wec簇中所編碼之第一基因。所編碼蛋白質催化GlcNAc磷酸酯自UDP-GlcNAc至UPP之轉移以形成UPP結合GlcNAc。
ECA:腸桿菌普通抗原。
RU:重複單元。如本文中所使用,RU設定為等於生物重複單元BRU。BRU闡述O抗原之RU,此乃因該抗原係在活體內合成。
UPP:十一異戊二烯基焦磷酸酯。
LLO:脂質連接寡糖。
2AB:2胺基苯甲醯胺。
MS:質譜。
O25B:術語O25B係指來自本文所鑑別大腸桿菌之O25B抗原(大腸桿菌血清型O25之亞血清型)。本文所提及之O25B涵蓋上文所鑑別之式O25B及式O25B’。
O25A:術語O25A係指大腸桿菌之O25A抗原(大腸桿菌血清型O25之亞血清型)。本文所提及之O25A涵蓋上文所鑑別之式O25A及式O25A’。
O1A:術語O1A係指大腸桿菌之O1A抗原(大腸桿菌血清型O1之亞血清型)。本文所提及之O1A涵蓋上文所鑑別之式O1A及式O1A’。
O1B:術語O1B係指大腸桿菌之O1B抗原(大腸桿菌血清型O1之亞血清型)。本文所提及之O1B涵蓋上文所鑑別之式O1B及式O1B’。
O1C:術語O1C係指大腸桿菌之O1C抗原(大腸桿菌血清型O1之亞血清型)。本文所提及之O1C涵蓋上文所鑑別之式O1C及式O1C’。
O2:術語O2係指大腸桿菌之O2抗原(大腸桿菌血清型O2)。本文所提及之O2中涵蓋上文所鑑別之式O2及式O2’。
O6:術語O6係指大腸桿菌之O6抗原(大腸桿菌血清型O6)。本文所提及之O6A涵蓋上文所鑑別之式O6A及式O6A’。
生物偶聯物:術語生物偶聯物係指在宿主細胞背景中製得之蛋白質(例如載體蛋白)及抗原(例如O抗原(例如O25B))之間之偶聯物,其中宿主細胞機構將抗原連接至蛋白質(例如N-連接)。糖偶聯物包含生物偶聯物以及藉由其他方式(例如藉由蛋白質及糖抗原之化學鏈接)製得之糖抗原(例如寡糖及多糖體)偶聯物。
在結合數值使用時,術語「約」係指在所提及數值之±1、±5或±10%內之任一數值。
如本文中所使用,在向個體投與治療劑(例如本文所闡述之組合物)之背景中,術語「有效量」係指具有預防及/或治療效應之治療劑之量。在某些實施例中,「有效量」係指足以達成一種、兩種、三種、四種或多種下列效應之治療劑之量:(i)減小或改善ExPEC感染或與其有關之症狀之嚴重程度;(ii)減小ExPEC感染或與其有關之症狀之持續時間;(iii)預防ExPEC感染或與其有關之症狀之進展;(iv)引起 ExPEC感染或與其有關之症狀之消退;(v)預防ExPEC感染或與其有關之症狀之發生或發作;(vi)預防ExPEC感染或與其有關之症狀之復發;(vii)減少與ExPEC感染有關之器官衰竭;(viii)減少患有ExPEC感染之個體之住院;(ix)減小患有ExPEC感染之個體之住院期限;(x)增加患有ExPEC感染之個體之存活;(xi)消除個體之ExPEC感染;(xii)抑制或減少個體中之ExPEC複製;及/或(xiii)增強或改良另一療法之預防或治療效應。
如本文中所使用,在向個體投與兩種或更多種療法之背景中,術語「組合」係指使用一種以上療法。術語「組合」之使用並不限制向個體投與療法之順序。舉例而言,第一療法(例如本文所闡述之組合物)可在向個體投與第二療法之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之前)、與其同時或之後(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之後)投與。
如本文中所使用,術語「個體」係指動物(例如鳥、爬行動物及哺乳動物)。在另一實施例中,個體係哺乳動物,包含非靈長類動物(例如駱駝、驢、斑馬、牛、豬、馬、山羊、綿羊、貓、狗、大鼠及小鼠)及靈長類動物(例如猴、黑猩猩及人類)。在某些實施例中,個體係a非人類動物。在一些實施例中,個體係農場動物或寵物(例如狗、貓、馬、山羊、綿羊、豬、驢或雞)。在另一實施例中,個體係人類。在另一實施例中,個體係人類嬰兒。在另一實施例中,個體係人類兒童。在另一實施例中,個體係人類成人。在另一實施例中,個體係老人。在另一實施例中,個體係早產人類嬰兒。術語「個體」及 「患者」在本文中可互換使用。
如本文中所使用,術語「早產人類嬰兒」係指在小於37週孕齡下出生之人類嬰兒。
如本文中所使用,術語「人類嬰兒」係指新生兒至1歲人類。
如本文中所使用,術語「人類幼兒」係指1歲至3歲之人類。
如本文中所使用,術語「人類兒童」係指1歲至18歲之人類。
如本文中所使用,術語「人類成人」係指18歲或更老之人類。
如本文中所使用,術語「老人」係指65歲或更老之人類。
圖1:用於O25A生物合成之路徑。箭頭指示個別酶轉化,指示酶名稱。在細胞質中藉由O抗原簇中所提供之酶或藉由革蘭氏陰性宿主細胞之管家酶來製備核苷酸活化糖。羰基磷酸轉移酶(WecA)將D-GlcNAc磷酸酯添加至十一異戊二烯基磷酸酯(UP)上,從而形成GlcNAc-UPP。特異性糖基轉移酶然後藉由添加單糖來進一步伸長UPP-GlcNAc分子,從而形成生物重複單元(BRU)寡糖(WekABC WbuB)。酶之指示順序並不係指在BRU合成期間之事件序列(藉由< >指示)。BRU然後藉由Wzx翻轉至周質間隙中。Wzy以線性方式使周質BRU聚合以形成O抗原多糖體。藉由Wzz控制聚合物長度。許多細菌寡糖及多糖體組合於UPP上且然後轉移至其他分子中,亦即,UPP係用於細菌中之寡糖及多糖體之一般構建平臺。在大腸桿菌及大部分其他革蘭氏陰性細菌中,O抗原藉由大腸桿菌酶WaaL自UPP轉移至脂質A核心以形成脂多糖(LPS)。
圖2:藉由大腸桿菌O25A rfb簇及O抗原例示之用於wzx/wzy依賴性O抗原合成之rfb簇、結構及路徑。A.展示位於galF基因與gnd基因之間之大腸桿菌菌株E47a之rfb簇結構。基因展示為箭頭且根據基因產物之功能指示填充:黑色係用於核苷酸活化之單糖生物合成之基 因,其並非大腸桿菌之管家譜(彼等基因編碼於基因組中之其他地方)之一部分,黑色/白色斜條紋係負責將單一單糖單元添加至BRU、翻轉酶wzx及聚合酶wzy之糖基轉移酶。B.所呈現O25A O抗原之BRU之化學結構(參見Fundin等人,2003,Magnetic Resonance in Chemistry 41,4)。
圖3. A.O25A、O25B及O16 BRU結構。B.O25A、O25B及O16之間之O抗原生物合成簇(rfb簇)對比。黑色填充基因係涉及核苷酸活化之單糖生物合成之基因,斜條紋係預測糖基轉移酶基因,灰色填充指示BRU處理或轉運基因,且垂直條紋展示O-乙醯基轉移酶同源性。灰色框指示基因之間高於25%之同源性評分;指示詳細值。黑色及灰色箭頭展示用於wzy(O25A及O25B特異性)及O25B 3’區域(O25B特異性)之分型PCR寡核苷酸之退火位置。
圖4.來自流行病學研究之血清型分佈。根據事件對社區獲得性UTI試樣中所鑑別之大腸桿菌O抗原血清型進行分組。
圖5.來自含有O25陽性凝集表型之臨床分離物之LPS之銀染色及西方染色(Western stain)分析。菌株編號指示於凝膠泳道上方。生長個別純系且藉由離心收穫OD正規化生物質。將小粒溶於SDS PAGE Lämmli緩衝液中且使用蛋白酶K處理以水解試樣中之所有蛋白質。對A中所展示之PAGE凝膠實施標準銀染色,且在B中展示探測含有來自含有商業O25凝集抗血清之相同試驗凝膠之電轉移材料之硝基纖維素膜。
圖6. O25A及O25B試樣之2AB HPLC跡線。製備來自菌株upec138(虛線)及upec436(實線)之2AB標記LLO試樣。收集峰且藉由箭頭指示自圖7中所詳述之MS/MS斷裂圖案推斷之相應BRU結構。
圖7.在母體離子m/z=1022(A;來自菌株upec138)或m/z=1021(B;來自upec_436)之50’及62’洗脫時間下自圖6中所指示峰獲得之MS/MS 斷裂離子系列。相對於假設BRU之草圖來展示離子系列。
圖8.源自O25B陽性臨床分離物之2AB標記LLO試樣之去乙醯化。 收集自含有O25B基因型之臨床分離物之2AB標記LLO獲得之50’洗脫時間下的O25B特異性峰,且在使用(實線)或不使用(虛線)NaOH處理用於ND Cal之Special Patent Program O-乙醯基之水解之後藉由正相HPLC來進行分析。
圖9. O25A及O25B生物偶聯物之單糖組成分析。產生O25生物偶聯物,純化,且處理以用於單糖組成分析。展示試樣之C18 HPLC跡線。將O25A(實線)及O25B(虛線)源試樣與來自商業來源之單糖混合物(Glc、GlcNAc、Rha、FucNAc)進行比較。單糖之洗脫時間由箭頭指示。
圖10.O25A生物偶聯物之表徵。藉由SDS PAGE分析4S-EPA-O25A生物偶聯物之經純化最終主體且藉由直接考馬斯染色(direct Coomassie staining)(C)及西方印跡(Western blotting)使用抗EPA抗血清或抗O25抗血清觀測。
圖11.O25B生物偶聯物之表徵。藉由SDS PAGE分析4S-EPA-O25B生物偶聯物之經純化最終主體且藉由直接考馬斯染色(C)及西方印跡使用抗EPA抗血清或抗O25抗血清觀測。
圖12. O1 O抗原基因生物合成及化學結構。A.展示O1A菌株大腸桿菌G1632(登錄編號:GU299791)之rfb簇及側翼基因。黑色、灰色及條紋色代碼與上文所闡述彼等用於圖2者相同。B.展示O1亞血清型之化學BRU結構。
圖13.來自含有O1陽性凝集表型之臨床分離物之LPS之分析。A.銀染色及B.使用抗O1抗血清之西方印跡。
圖14.O1臨床分離物中之O1A之鑑別。藉由LLO指紋分析來分析來自O1臨床分離物之2AB標記LLO試樣。A.展示自60’及其後之正相 HPLC跡線。使每一試樣之基線移位以觀測共遷移峰。upec編號指示臨床菌株。B.m/z=1849.6(Na+加合物)之MS/MS斷裂離子系列。草圖指示O1A之2 BRU之寡糖中之斷裂離子圖案及可探測糖苷鍵斷裂。
圖15.O1生物偶聯物。藉由使用EPA表現質粒(pGVXN659)及以下5種不同pglB表現質粒轉變之大腸桿菌細胞(W3110 △rfbO16::rfbO1 △waaL)進行之EPA-O1糖蛋白之小規模表現測試:A,p114:表現含有pglB之未經密碼子最佳化之HA標籤;B,p939:含有pglB之經密碼子最佳化之HA標籤;C,p970:不含pglB之經密碼子最佳化之HA標籤;D,含有天然糖基化位點N534Q且不含pglB之經密碼子最佳化之HA標籤;及E,不含天然糖基化位點N534Q且不含pglB之經密碼子最佳化之HA標籤。生長細胞且使用阿拉伯糖及IPTG誘導,在37℃下過夜培育之後,收穫細胞且製備周質蛋白提取物。然後藉由SDS PAGE分離提取物,藉由電印跡轉移至硝基纖維素膜中,且使用抗EPA血清進行免疫檢測。
圖16.使用抗O1血清檢測圖15中所闡述之生物偶聯物。
圖17. O6基因及化學結構。A.大腸桿菌CFT073(基因庫AE014075.1)之O抗原生物合成簇(rfb簇)及側翼基因。指示根據BLAST之假設基因功能且指示O6 O抗原生物合成之特異性基因。B.所報導O6 BRU結構(Jann等人,Carbohydr.Res.263(1994)217-225)之化學結構。
圖18.具有支鏈Glc之O6之鑑別。藉由LLO指紋分析來分析來自O6臨床分離物之2AB標記LLO試樣。A.展示自60’及其後之正相HPLC跡線。自含有Glc及GlcNAC支鏈之參考菌株CCUG11309(細實線)及11311(虛線)製備提取物。重疊圖展示所指示BRU之洗脫時間之顯著差異。B.將如由upec編號所指示來自臨床分離物之提取物與來自A之參考菌株進行比較。
圖19. O2 O抗原基因生物合成及化學結構。A.菌株大腸桿菌G1674(登錄編號:GU299792)之O抗原生物合成簇(rfb簇)及側翼基因。黑色、灰色及條紋色代碼係如先前圖(例如圖2)中所闡述。B.O2抗原之化學BRU結構。
圖20.來自含有O2陽性凝集表型之臨床分離物之LPS之分析。A.銀染色。B.使用抗O2抗血清之西方印跡。
圖21.來自菌株W3110 △waaL △rfbW3110::rfbO2 △wekS之OPS分析。展示藉由正相HPLC進行之2AB標記LLO分析之層析圖。
圖22.藉由抗O25A及抗O25B MBP抗血清在西方印跡分析中識別O25A及O25B LPS。在電轉移自upec436(O25A)及upec138(O25B)製得之LPS試樣之後獲得兩種硝基纖維素膜且藉由SDS-PAGE分離。兩種膜之裝載圖案相同,左泳道:來自upec438之O25A LPS,中間泳道:來自upec138之O25B LPS。使用MBP生物偶聯物對兔實施免疫。 左圖:抗O25B-MBP抗血清;右圖:抗O25A-MBP抗血清。
圖23.O2 OPS BRU之MS/MS光譜。來自菌株CCUG25之2AB標記LLO提取物之43.5min下洗脫峰中m/z=989.4之Na+加合物的MS/MS光譜。指示O2 BRU草圖及有關Y離子系列,從而證實預期單糖序列。
圖24.含有臨床前研究中所使用之O1A、O2及O6抗原之EPA生物偶聯物。產生OPS聚糖並純化,且藉由SDS PAGE進行分析並藉由考馬斯染色進行觀測。
圖25展示使用來自經O1A-EPA(G1)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc及O25B(G12)構成之四價組合物免疫之大鼠之血清獲得的平均ELISA效價,抵靠使用自菌株upec032純化之O1A-LPS塗覆之ELISA板進行探測。
圖26展示使用來自經O2A-EPA(G4)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc及O25B(G12)構成之四價組合物免 疫之大鼠之血清獲得的平均ELISA效價,抵靠使用自菌株CCUG25純化之O2 LPS塗覆之ELISA板進行探測。
圖27展示使用來自經O6Glc-EPA(G7)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc及O25B(G12)構成之四價組合物免疫之大鼠之血清獲得的平均ELISA效價,抵靠使用自菌株CCUG11309純化之O6Glc-LPS塗覆之ELISA板進行探測。
圖28展示使用來自經O25B-EPA(G9)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由O1A、O2、O6Glc及O25B(G12)構成之四價組合物免疫之大鼠之血清獲得的平均ELISA效價,抵靠使用自菌株upec177純化之O25B-LPS塗覆之ELISA板進行探測。
圖29:源自免疫前(空圓)以及免疫後42天(填充正方形)之大鼠之血清之調理指數,其中使用一個初免劑量及兩個加強劑量之指示劑量之單價疫苗。(A)O2-EPA免疫;(B)O6-EPA免疫;(C)O25B-EPA免疫。
圖30:使用來自使用包括大腸桿菌抗原O1A、O2、O6Glc及O25B之四價疫苗接種疫苗之人類個體之血清獲得的ELISA效價。僅在接種疫苗組中觀察到在注射後(在注射之後30天)及注射前(第1天)之間ELISA效價顯著增加(*代表統計學顯著性)。
圖31:使用來自使用包括大腸桿菌抗原O1A、O2、O6Glc及O25B之四價疫苗接種疫苗之人類個體之血清獲得的調理指數(OI)。繪示免疫反應,如由在注射之前及之後針對安慰劑及四價疫苗之組份(O1A-EPA(31A)、O2-EPA(31B)、O6Glc-EPA(31C)及O25B-EPA(31D))之OI所指示。注射前(定義為第1天)由V2(訪視2)代表,且注射後(定義為第30天)由V4(訪視4)代表。僅在接種疫苗組中觀察到在注射後與注射前之間OI顯著增加(由*指示,其中多個*代表增加之顯著程度)。NS:並無顯著差異。
圖32:在第1天(接種疫苗前)及在30天之後(接種疫苗後)來自接種疫苗個體之血清針對O25A LPS(黑條)及O25B LPS(灰條)之ELISA效價(表示為EC50值)。觀察到在兩種血清型:O25A LPS(黑條)及O25B LPS(灰條)中在注射後(在注射之後30天)及注射前(第1天)之間ELISA效價統計學顯著增加。
圖33:來自接種疫苗個體之血清針對表現大腸桿菌菌株之O25A(黑線)及O25B(灰線)之反應性。虛灰線:血清型O75菌株,陰性對照。圖33顯示,來自接種疫苗個體之疫苗誘導之血清IgG抗體對O25A及O25B菌株具有強烈反應。
本文揭示大腸桿菌抗原O25B之結構以及O25B之用途、製備O25B之方法及包括O25B之生物偶聯物。申請者已鑑別負責產生O25B之大腸桿菌基因簇且充分表徵O25B抗原之結構。因此,本文提供能夠在宿主細胞中產生O25B之核酸。本文亦提供包括能夠產生O25B之核酸之宿主細胞(例如重組改造之宿主細胞)。該等宿主細胞可用於生成包括連接至載體蛋白之O25B之生物偶聯物,該等生物偶聯物可用於(例如)調配治療劑(例如疫苗)。本文所闡述之O25B抗原亦可用於生成抗體,該等抗體可用於(例如)治療方法(例如個體之被動免疫)中。本文另外提供包括O25B(單獨或與其他大腸桿菌抗原(例如O1、O2及O6及其亞血清型)組合)之組合物,該等組合物用於治療方法中,例如對宿主接種疫苗以抵抗大腸桿菌(例如尿路病原性大腸桿菌)感染。
5.1 核酸及蛋白質
在一態樣中,本文提供與O25B產生相關之分離核酸,例如編碼大腸桿菌O25B rfb簇之一或多種蛋白質之核酸。彼等熟習此項技術者應瞭解,因基因代碼之簡並,具有特異性胺基酸序列之蛋白質可由多種不同核酸編碼。因此,彼等熟習此項技術者應理解,本文所提供之 核酸可以序列不同於本文所提供序列之方式有所改變,此並不影響由核酸編碼之蛋白質之胺基酸序列。
在一具體實施例中,本文提供編碼大腸桿菌O25B rfb之核酸簇。 在一具體實施例中,本文提供編碼大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO:12)之核酸。在另一具體實施例中,本文提供編碼與SEQ ID NO:12約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之核酸。Upec138係O25B血清型之大腸桿菌菌株之一實例。熟習此項技術者認識到,現可容易地自臨床分離物根據本文所闡述之方法獲得來自此血清型之其他菌株,且該等其他菌株之實例係upec177及upec163。因此,在本文中提及該等O25B菌株之rfb基因簇或來自該簇之個別基因之任何地方,其意欲包含來自其他O25B菌株之相應基因簇或基因。另外,可藉由對來自該等其他分離物之rfb基因簇或視需要個別基因進行測序來發現所提供序列,且提供編碼同源蛋白之同源序列作為基因簇或基因。在藉由提及具有某一百分比之基因簇或基因來提及同源基因簇或基因之任何實施例中,該同源序列較佳地編碼具有與來自參考菌株或序列之功能相同之功能之蛋白質。
在另一具體實施例中,本文提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之核酸。在一具體實施例中,本文提供編碼大腸桿菌rfb(upec163)基因簇之核酸。在另一具體實施例中,本文提供編碼與大腸桿菌rfb(upec163)基因簇約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之核酸。
在另一具體實施例中,本文提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之核酸。在一具體實施例中,本文提供編碼大腸桿菌rfb(upec177)基因簇之核酸。在另一具體實施例中,本文提供編碼與大腸桿菌rfb(upec177)基因簇約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之核酸。
在另一實施例中,本文提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:1(大腸桿菌O25B rfb簇之rmlB基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:1 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:2(大腸桿菌O25B rfb簇之rmlD基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:2 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:3(大腸桿菌O25B rfb簇之rmlA基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:3 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:4(大腸桿菌O25B rfb簇之rmlC基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:4 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:5(大腸桿菌O25B rfb簇之wzx基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:5 75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:6(大腸桿菌O25B rfb簇之wekA基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:6 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:7(大腸桿菌O25B rfb簇之wekB基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:7 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:8(大腸桿菌O25B rfb簇之wzy基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:8 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:9(大腸桿菌O25B rfb簇之wbbJ基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:9 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:10(大腸桿菌O25B rfb簇之wbbK基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:10 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸包括SEQ ID NO:11(大腸桿菌O25B rfb簇之wbbL基因)或由其組成。在另一具體實施例中,本文所提供編碼大腸桿菌O25B rfb簇之蛋白質之核酸與SEQ ID NO:11 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。
在另一態樣中,本文提供由本文所提供之核酸編碼之蛋白質。 在一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:1編碼之dTDP-葡萄糖4,6-去水酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:2編碼之dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:3編碼之葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:4編碼之dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:5編碼之O抗原翻轉酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:6編碼之dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:7編碼之UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基轉移酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:8編碼之O抗原聚合酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:9編碼之O-乙醯基轉移酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:10編碼之UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶。在另一具體實施例中,本文提供由SEQ ID NO:11編碼之dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶。
5.2 大腸桿菌O抗原
在一態樣中,本文提供O25、O1、O2及O6血清型之分離大腸桿菌抗原。
在一具體實施例中,本文提供來自大腸桿菌菌株upec138之分離O抗原。在另一具體實施例中,本文提供來自大腸桿菌菌株upec163之 分離O抗原。在另一具體實施例中,本文提供來自大腸桿菌菌株upec177之分離O抗原。
在另一具體實施例中,本文提供式O25B之分離大腸桿菌O25B抗原:
在另一具體實施例中,本文提供式O25B’之分離大腸桿菌O25B抗原:
在另一態樣中,本文提供下文所呈現式O25B之分離大分子之群體:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,群體中至少80%之大分子之n介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20 至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。
在另一態樣中,本文提供下文所呈現式O25B’之分離大分子之群體: 其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,群體中至少80%之大分子之n介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。
可用於本文所闡述之組合物(例如治療組合物,例如疫苗;參見部分5.6)中之其他大腸桿菌抗原包含O25A以及O1、O2及O6抗原及其亞血清型。
在一實施例中,將O25A抗原(例如呈分離形式或作為生物偶聯物之一部分)用於本文所提供之組合物中(例如與O25B抗原組合(或包括O25B抗原之生物偶聯物))。在一具體實施例中,O25A抗原係式O25A:
在另一具體實施例中,O25A抗原係式O25A’:
在一實施例中,將O1A抗原(例如呈分離形式或作為生物偶聯物之一部分)用於本文所提供之組合物中(例如與O25B抗原組合(或包括O25B抗原之生物偶聯物))。在一具體實施例中,O1A抗原係式O1A:
在另一具體實施例中,O1A抗原係式O1A’:
在一實施例中,將O1B抗原(例如呈分離形式或作為生物偶聯物之一部分)用於本文所提供之組合物中(例如與O25B抗原組合(或包括O25B抗原之生物偶聯物))。在一具體實施例中,O1B抗原係式O1B:
在另一具體實施例中,O1B抗原係式O1B’:
在一實施例中,將O1C抗原(例如呈分離形式或作為生物偶聯物之一部分)用於本文所提供之組合物中(例如與O25B抗原組合(或包括O25B抗原之生物偶聯物))。在一具體實施例中,O1C抗原係式O1C:
在另一具體實施例中,O1C抗原係式O1C’:
在一實施例中,將O2抗原(例如呈分離形式或作為生物偶聯物之一部分)用於本文所提供之組合物中(例如與O25B抗原組合(或包括O25B抗原之生物偶聯物))。在一具體實施例中,O2抗原係式O2:
在另一具體實施例中,O2抗原係式O2’:
在一實施例中,將O6抗原(例如呈分離形式或作為生物偶聯物之一部分)用於本文所提供之組合物中(例如與O25B抗原組合(或包括O25B抗原之生物偶聯物))。在一具體實施例中,O6抗原係式O6K2(在本文中亦稱為O6Glc):
在另一具體實施例中,O6抗原係式O6K2’(在本文中亦稱為O6Glc’):
在另一具體實施例中,O6抗原係式O6K54(在本文中亦稱為O6GlcNAc):
在另一具體實施例中,O6抗原係式O6K54’(在本文中亦稱為O6GlcNAc’):
5.3 宿主細胞
本文提供能夠產生大腸桿菌O抗原及包括該等大腸桿菌O抗原之生物偶聯物之宿主細胞(例如原核宿主細胞)。在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞包括(例如天然或經由基因改造)一或多種本文所闡述之核酸。參見部分5.1。在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞產生一或多種本文所闡述之大腸桿菌O抗原,及/或產生包括一或多種本文所闡述之大腸桿菌O抗原之生物偶聯物。參見部分5.2。
在一態樣中,本文提供包括編碼能夠產生本文所揭示新穎多糖體大腸桿菌O25B之酶(例如糖基轉移酶)之核酸之原核宿主細胞。本文亦提供包括編碼能夠產生其他大腸桿菌抗原(例如O25A、O1、O2及O6及其亞血清型)之酶(例如糖基轉移酶)之核酸之宿主細胞(參見部分5.2)。本文所提供之宿主細胞可天然表現能夠產生所關注O抗原之核酸,或可使宿主細胞表現該等核酸,亦即,在某些實施例中,該等核酸對宿主細胞為異源性且使用業內已知之基因方式引入宿主細胞中。在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼在蛋白質N-糖基化中活躍之其他酶之核酸,舉例而言,本文所提供之宿主細胞可進一步包括編碼寡糖基轉移酶之核酸或編碼其他糖基轉移酶之核酸。例如參見部分5.3.3。在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼載體蛋白(例如可附接寡糖及多糖體以形成生物偶聯物之蛋白質)之核酸。例如參見部分5.3.2(關於載體蛋白之闡述)及部分5.4(關於生物偶聯物之闡述)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
Upec138係在本文中鑑別為屬O25B血清型之大腸桿菌菌株,且該菌株(及通常O25B血清型之菌株)之rfb基因簇已在本文中首次鑑別為包括產生新穎大腸桿菌多糖體O25B之基因。在一具體實施例中,本文提供包括大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO:12)或與SEQ ID NO:12約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之原核宿主細胞。在一具體實施例中,藉由基因操縱將大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO:12)引入宿主細胞中(舉例而言,使基因簇表現於一或多種質粒上或整合至宿主細胞基因組中(例如參見國際專利申請案第PCT/EP2013/068737號))。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外 之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在另一具體實施例中,rfb簇之一些或所有基因對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該寡糖基轉移酶對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該載體蛋白對宿主細胞為異源性。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
Upec163係在本文中鑑別為屬O25B血清型之大腸桿菌菌株,且該菌株(及通常O25B血清型之菌株)之rfb基因簇已在本文中首次鑑別為包括產生新穎大腸桿菌多糖體O25B之基因。在另一具體實施例中,本文提供包括大腸桿菌rfb(upec163)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec163)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之原核宿主細胞。在一具體實施例中,藉由基因操縱將大腸桿菌rfb(upec163)基因簇引入宿主細胞中(舉例而言,使基因簇表現於一或多種質粒上或整合至宿主細胞基因組中(例如參見國際專利申請案第PCT/EP2013/068737號))。在另一實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在另一具體實施例中,rfb簇之一些或所有基因對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該寡糖基轉移酶對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該載體蛋白對宿主細胞為異源性。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
Upec177係在本文中鑑別為屬O25B血清型之大腸桿菌菌株,且該菌株(及通常O25B血清型之菌株)之rfb基因簇已在本文中首次鑑別為 包括產生新穎大腸桿菌多糖體O25B之基因。在另一具體實施例中,本文提供包括大腸桿菌rfb(upec177)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec177)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇之原核宿主細胞。在一具體實施例中,藉由基因操縱將大腸桿菌rfb(upec177)基因簇引入宿主細胞中(舉例而言,使基因簇表現於一或多種質粒上或整合至宿主細胞基因組中(例如參見國際專利申請案第PCT/EP2013/068737號))。在另一實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在另一具體實施例中,rfb簇之一些或所有基因對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該寡糖基轉移酶對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該載體蛋白對宿主細胞為異源性。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供產生O25B之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞包括rmlBrmlDrmlArmlCwzxwekAwekBwzywbbJwbbK及/或wbbL。可使用重組方式改造該等宿主細胞以包括一或多種包括rmlBrmlDrmlArmlCwzxwekAwekBwzywbbJwbbK及/或wbbL基因之質粒。在某些實施例中,將該一或多種質粒整合至宿主細胞基因組中。在一具體實施例中,該rmlB包括SEQ ID NO:1或由其組成,或與SEQ ID NO:1 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該rmlD包括SEQ ID NO:2或由其組成,或與SEQ ID NO:2 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該rmlA包括SEQ ID NO:3或由其組成,或與SEQ ID NO:3 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該rmlC包括SEQ ID NO:4或由其組成,或與SEQ ID NO:4 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wzx包括SEQ ID NO:5或由其組成,或與SEQ ID NO:5 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wekA包括SEQ ID NO:6或由其組成,或與SEQ ID NO:6 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wekB包括SEQ ID NO:7或由其組成,或與SEQ ID NO:7 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wzy包括SEQ ID NO:8或由其組成,或與SEQ ID NO:8 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wbbJ包括SEQ ID NO:9或由其組成,或與SEQ ID NO:9 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wbbK包括SEQ ID NO:10或由其組成,或與SEQ ID NO:10 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在一具體實施例中,該wbbL包括SEQ ID NO:11或由其組成,或與SEQ ID NO:11 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在另一具體實施例 中,基因rmlBrmlDrmlArmlCwzxwekAwekBwzywbbJwbbKwbbL中之一些或全部對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該寡糖基轉移酶對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該載體蛋白對宿主細胞為異源性。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供產生O25B之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞包括一種、兩種、三種、四種或更多種(例如所有)下列基因(或與下列基因中之一者約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源且較佳地編碼具有相同功能之蛋白質之核酸):rmlB(SEQ ID NO:1)、rmlD(SEQ ID NO:2)、rmlA(SEQ ID NO:3)、rmlC(SEQ ID NO:4)、wzx(SEQ ID NO:5)、wekA(SEQ ID NO:6)、wekB(SEQ ID NO:7)、wzy(SEQ ID NO:8)、wbbJ(SEQ ID NO:9)、wbbK(SEQ ID NO:10)及/或wbbL(SEQ ID NO:11)。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括rmlB(SEQ ID NO:1)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造 以包括編碼dTDP-葡萄糖4,6-去水酶(例如由rmlB編碼之dTDP-葡萄糖4,6-去水酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:1約或至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括rmlD(SEQ ID NO:2)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶(例如由rmlD編碼之dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體 實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括rmlA(SEQ ID NO:3)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶(例如由rmlA編碼之葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括rmlC(SEQ ID NO:4)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶(例如由rmlC編碼之dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wzx(SEQ ID NO:5)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造 以包括編碼O抗原翻轉酶(例如由wzx編碼之O抗原翻轉酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wekA(SEQ ID NO:6)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼鼠李糖基轉移酶(例如由wekA編碼之dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:6至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另 一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。 在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大陽桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wekB(SEQ ID NO:7)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼wekB葡萄糖基轉移酶(例如由wekB編碼之UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:7至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主 細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wzy(SEQ ID NO:8)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼O抗原聚合酶(例如由wzy編碼之O抗原聚合酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:8至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wbbJ(SEQ ID NO:9)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造 以包括編碼O-乙醯基轉移酶(例如由wbbJ編碼之O-乙醯基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:9至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wbbK(SEQ ID NO:10)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼葡萄糖基轉移酶(例如由wbbK編碼之UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:10至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體 實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括wbbL(SEQ ID NO:11)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括編碼鼠李糖基轉移酶(例如由wbbL編碼之dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶)之核酸序列。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞,其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括與SEQ ID NO:11至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及/或O25B生物偶聯物(亦即連接至大腸桿菌O25B抗原之載體蛋白)之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞天然包括或經改造以包括至少一種、兩種、三種、四種或更多種(例如所有)下列部分:(i)與SEQ ID NO:1至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(ii)與SEQ ID NO:2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(iii)與SEQ ID NO:3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(iv)與SEQ ID NO:4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(v)與SEQ ID NO:5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(vi)與SEQ ID NO:6至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(vii)與SEQ ID NO:7至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(viii)與SEQ ID NO:8至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(ix)與SEQ ID NO:9至少80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;(x)與SEQ ID NO:10至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列;及/或(xi)與SEQ ID NO:11至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一具體實施例中,該宿主細胞經改造以包括該等序列中之每一者,亦即,該等序列對該宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供產生O25B之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞包括以下中之兩者:(i)wbbJ(SEQ ID NO:9)或與SEQ ID NO:9約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸;(ii)wbbK(SEQ ID NO:10)或與SEQ ID NO:10約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸;及/或(iii)wbbL(SEQ ID NO:11)或與SEQ ID NO:11約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列: 包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供產生O25B之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞包括以下中之每一者:(i)wbbJ(SEQ ID NO:9)或與SEQ ID NO:9約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸;(ii)wbbK(SEQ ID NO:10)或與SEQ ID NO:10約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸;及(iii)wbbL(SEQ ID NO:11)或與SEQ ID NO:11約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之核酸。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一具體實施例中,本文提供產生O25B之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),其中該宿主細胞包括:(i)dTDP-葡萄糖4,6-去水酶;(ii)dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶;(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶;(iv)dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶;(v)O抗原翻轉酶;(vi)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶;(vii)UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基轉 移酶(viii)O抗原聚合酶;(ix)O-乙醯基轉移酶;(x)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶及/或(xi)dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶。在一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。 在另一具體實施例中,(i)dTDP-葡萄糖4,6-去水酶;(ii)dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶;(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶;(iv)dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶;(v)O抗原翻轉酶;(vi)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶;(vii)UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基轉移酶(viii)O抗原聚合酶;(ix)O-乙醯基轉移酶;(x)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶及/或(xi)dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶中之一些或全部對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該寡糖基轉移酶對宿主細胞為異源性。在另一具體實施例中,該載體蛋白對宿主細胞為異源性。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一態樣中,本文提供產生大腸桿菌O25A之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),亦即,該宿主細胞包括能夠合成大腸桿菌O25A之酶(例如參見圖3)。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一態樣中,本文提供產生大腸桿菌O1之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),亦即,該宿主細胞包括能夠合成大腸桿菌O1之酶(例如參見圖12)。在一具體實施例中,本文提供產生大腸桿菌O1A之宿主細胞。在一具體實施例中,本文提供產生大腸桿菌O1B之宿主細胞。在一具體實施例中,本文提供產生大腸桿菌O1C之宿主細胞。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一態樣中,本文提供產生大腸桿菌O2之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),亦即,該宿主細胞包括能夠合成大腸桿菌O2之酶(例如參見圖19)。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
在另一態樣中,本文提供產生大腸桿菌O6之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞),亦即,該宿主細胞包括能夠合成大腸桿菌O6之酶(例如參見圖17)。在一具體實施例中,本文提供產生包括支鏈Glc單糖之大腸桿菌O6或包括支鏈GlcNAc單糖之O6抗原之宿主細 胞。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
本文另外提供能夠產生一種以上類型之大腸桿菌O抗原之原核宿主細胞(例如重組改造之原核宿主細胞)。在一具體實施例中,本文提供能夠產生下列部分中之兩者之宿主細胞:O25B、O25A、O1(例如O1A、O1B、O1C)、O2及O6。在另一具體實施例中,本文提供能夠產生O25B及O25A、O1(例如O1A、O1B、O1C)、O2及O6中之一或多者之宿主細胞。在另一具體實施例中,原核宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸序列。在另一具體實施例中,原核宿主細胞進一步包括編碼以下部分之核酸序列:包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987)。在一具體實施例中,宿主細胞係大腸桿菌。
5.3.1 基因背景
可使用彼等熟習此項技術者已知之任一宿主細胞產生本文所闡述之大腸桿菌O抗原(例如O25B)及包括本文所闡述之大腸桿菌O抗原(例如O25B)的生物偶聯物,包含archea古生菌、原核宿主細胞及真核宿主細胞。用於產生本文所闡述之大腸桿菌O抗原及包括本文所闡述之大腸桿菌O抗原之生物偶聯物的實例性原核宿主細胞包含但不限於大腸桿菌屬、志賀氏桿菌(Shigella)屬、克雷伯氏菌(Klebsiella)屬、黃 單胞菌(Xhantomonas)屬、沙門氏菌(Salmonella)屬、耶爾森菌(Yersinia)屬、乳球菌(Lactococcus)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、鏈黴菌(Streptomyces)屬、鏈球菌屬、葡萄球菌(Staphylococcus)屬、芽孢桿菌屬及梭菌(Clostridium)屬。在一具體實施例中,用於產生本文所闡述之大腸桿菌O抗原及包括本文所闡述之大腸桿菌O抗原之生物偶聯物的宿主細胞係大腸桿菌。
在某些實施例中,用於產生本文所闡述之大腸桿菌O抗原及生物偶聯物之宿主細胞經改造以包括異源性核酸,例如編碼一或多種載體蛋白之異源性核酸及/或編碼一或多種蛋白質之異源性核酸(例如編碼一或多種蛋白質之基因)。在一具體實施例中,可將編碼涉及糖基化路徑(例如原核及/或真核糖基化路徑)之蛋白質之異源性核酸引入本文所闡述之宿主細胞中。該等核酸可編碼包含但不限於寡糖基轉移酶及/或糖基轉移酶之蛋白質。可使用彼等熟習此項技術者已知之任一方法(例如電穿孔、藉由熱休克進行化學轉變、天然轉變、噬菌體轉導及偶聯)將異源性核酸(例如編碼載體蛋白之核酸及/或編碼其他蛋白質(例如涉及糖基化之蛋白質)之核酸)引入本文所闡述之宿主細胞中。在具體實施例中,使用質粒將異源性核酸引入本文所闡述之宿主細胞中,舉例而言,藉由質粒(例如表現載體)使異源性核酸表現於宿主細胞中。在另一具體實施例中,使用國際專利申請案第PCT/EP2013/068737號中所闡述之插入方法將異源性核酸引入本文所闡述之宿主細胞中。
在某些實施例中,可將其他改質引入(例如使用重組技術)本文所闡述之宿主細胞中。舉例而言,編碼形成可能競爭或干擾糖基化路徑(例如競爭或干擾一或多種以重組方式引入宿主細胞中之涉及糖基化之異源性基因)之一部分之蛋白質之宿主細胞核酸(例如基因)可在宿主 細胞背景(基因組)中以使其不活化/功能失調之方式缺失或改質(亦即,缺失/改質之宿主細胞核酸並不編碼功能蛋白或並不編碼任何蛋白質)。在某些實施例中,在核酸自本文所提供之宿主細胞之基因組缺失時,其由期望序列(例如可用於糖蛋白產生之序列)代替。
可在宿主細胞中缺失(及在一些情形下經其他期望核酸序列代替)之實例性基因包含涉及糖脂生物合成之宿主細胞之基因(例如waaL)(例如參見Feldman等人,2005,PNAS USA 102:3016-3021)、脂質A核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、結腸酸簇(wc)、莢膜多糖體簇、十一葵烯醇-p生物合成基因(例如uppSuppP)、und-P再循環基因、涉及核苷酸活化之糖生物合成之代謝酶、腸桿菌普通抗原簇及原噬菌體O抗原改質簇(例如gtrABS簇)。在一具體實施例中,對本文所闡述之宿主細胞進行改質,從而其並不產生任何除來自ExPEC之期望O抗原(例如O25B)外之O抗原。在一具體實施例中,waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb基因簇中之一或多者自本文所提供之原核宿主細胞之基因組缺失或功能不活化。在一實施例中,本文所使用之宿主細胞係產生O25B抗原之大腸桿菌,其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因及gtrS基因自宿主細胞之基因組缺失或功能不活化。在另一實施例中,本文所使用之宿主細胞係產生O25B抗原之大腸桿菌,其中waaL基因及gtrS基因自宿主細胞之基因組缺失或功能不活化。
在某些實施例中,本文所提供之經改質宿主細胞可用於蛋白質糖基化。可設計蛋白質糖基化以產生生物偶聯物用於疫苗調配物,例如含有大腸桿菌多糖體抗原(例如O25(例如O25B)、O1、O2及O6)之疫苗。
5.3.2 載體蛋白
可在本文中使用適用於產生偶聯物疫苗(例如用於疫苗之生物偶 聯物)之任何載體蛋白,舉例而言,可將編碼載體蛋白之核酸引入本文所提供之宿主中以用於產生包括載體蛋白連接至ExPEC抗原(例如O25B)之生物偶聯物。實例性載體蛋白包含(但不限於)去毒之綠膿桿菌外毒素A(EPA;參見例如Ihssen等人(2010)Microbial cell factories 9,61)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒之金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素之去毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白之承載結構域、肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素及其去毒變體、空腸彎曲桿菌AcrA及空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。對於EPA而言,各種去毒蛋白質變體已闡述於文獻中且可用作載體蛋白。
在某些實施例中,將用於生成本文所述之生物偶聯物之載體蛋白改質,例如以蛋白質具有較小毒性及/或更易於糖基化之方式改質。在一個特定實施例中,將用於生成本文所述之生物偶聯物之載體蛋白改質,使得載體蛋白中糖基化位點之數目最大,以允許投與較低濃度之蛋白質(例如以免疫原性組合物、以其生物偶聯物形式)之方式。
在某些實施例中,對本文所闡述之載體蛋白進行改質以較通常與載體蛋白有關之糖基化位點(例如相對於與原始/天然(例如「野生型」)狀態之載體蛋白有關之糖基化位點數)多包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個糖基化位點。在具體實施例中,藉由在蛋白質初級結構之任何地方插入糖基化共有序列(例如Asn-X-Ser(Thr),其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)(參見WO 2006/119987))來引入糖基化位點。可藉由(例如)以下 方式來引入該等糖基化位點:將新胺基酸添加至蛋白質初級結構中(亦即,完全或部分地添加糖基化位點),或使蛋白質中之現有胺基酸依序發生突變以生成糖基化位點(亦即,並不向蛋白質中添加胺基酸,但使蛋白質之所選胺基酸發生突變以形成糖基化位點)。彼等熟習此項技術者應認識到,可易於使用業內已知之方式(例如包含改質編碼蛋白質之核酸序列之重組方式)來改質蛋白質之胺基酸序列。在具體實施例中,將糖基化共有序列引入載體蛋白之特異性區域中,例如蛋白質之表面結構、蛋白質之N或C末端及/或由蛋白質鹼基處之二硫橋鍵穩定之迴路。在某些實施例中,經典5胺基酸糖基化共有序列可由離胺酸殘基延伸以用於更有效地糖基化,且由此所插入共有序列可編碼5、6或7個應插入或代替受體蛋白胺基酸之胺基酸。在一特定實施例中,載體蛋白係包括4個共有糖基化序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(SEQ ID NO:15)之去毒EPA,且具有如SEQ ID NO:13中所提供之胺基酸序列。
在某些實施例中,用於生成本文所闡述之生物偶聯物之載體蛋白包括「標籤」,亦即容許分離及/或鑑別載體蛋白之胺基酸序列。 舉例而言,向本文所闡述之載體蛋白中添加標籤可用於純化蛋白質且由此純化包括加標籤載體蛋白之偶聯物疫苗。可用於本文中之實例性標籤包含但不限於組胺酸(HIS)標籤(例如六組胺酸標籤或6Xhis標籤)、FLAG-TAG及HA標籤。在某些實施例中,本文所使用之標籤可去除,例如在其不再需要時(例如在純化蛋白質之後)藉由化學試劑或藉由酶方式去除。
在某些實施例中,本文所闡述之載體蛋白包括使載體蛋白靶向表現載體蛋白之宿主細胞之周質間隙的信號序列。在一具體實施例中,信號序列係來自大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MalE)、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌果 膠酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢桿菌屬木聚糖內切酶(XynA)、不耐熱大腸桿菌腸毒素LTIIb、芽孢桿菌木聚糖內切酶XynA或大腸桿菌鞭毛蛋白(FlgI)。
5.3.3 糖基化機構
本文所提供之宿主細胞包括及/或可經改質以包括編碼能夠產生來自ExPEC之O抗原(例如O25(例如O25B)、O1、O2及/或O6抗原)之基因機構(例如糖基轉移酶)的核酸。參見部分5.1。
糖基轉移酶
本文所提供之宿主細胞包括編碼能夠產生ExPEC O抗原之糖基轉移酶之核酸,該等ExPEC O抗原係(例如)來自血清型O25(例如O25A或O25B,參見圖3B)、O1(參見圖12)、O2(參見圖19)及O6(例如產生包括支鏈Glc單糖之O6抗原或包括支鏈GlcNAc單糖之O6抗原之O6血清型,參見圖17)之大腸桿菌之O抗原。實例性核酸闡述於部分5.1中。 在某些實施例中,編碼能夠產生ExPEC O抗原之糖基轉移酶之一些或所有核酸由本文所提供之宿主細胞天然表現(舉例而言,核酸存在於宿主細胞之「野生型」背景中)。編碼能夠產生ExPEC O抗原之糖基轉移酶之一些或所有核酸並不由本文所提供之宿主細胞天然表現,亦即,一些或所有核酸對宿主細胞為異源性。可使用業內已知之方法(例如部分5.3中所闡述之方法)改造宿主細胞以包括特異性核酸,例如部分5.1中所闡述之核酸。
在一具體實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼能夠產生O25B血清型之大腸桿菌O抗原(亦即本文所闡述之O25B抗原)之糖基轉移酶的核酸。在一具體實施例中,該等核酸編碼來自upec138(SEQ ID NO:12)之rfb簇或與SEQ ID NO:12約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇。
在另一具體實施例中,該等核酸編碼來自upec163之rfb簇或與來 自upec163之rfb簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇。在另一具體實施例中,該等核酸編碼來自upec177之rfb簇或與來自upec177之rfb簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致或同源之基因簇。
在另一具體實施例中,該等編碼能夠產生O25B血清型之大腸桿菌O抗原之糖基轉移酶之核酸係O25B血清型的基因,其中該等基因係rmlB(SEQ ID NO:1)、rmlD(SEQ ID NO:2)rmlA(SEQ ID NO:3)、rmlC(SEQ ID NO:4)、wzx(SEQ ID NO:5)、wekA(SEQ ID NO:6)、wekB(SEQ ID NO:7)、wzy(SEQ ID NO:8)、wbbJ(SEQ ID NO:9)、wbbK(SEQ ID NO:10)及wbbL(SEQ ID NO:11)。參見表3及9。
在一具體實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼能夠產生O25A血清型之大腸桿菌O抗原(亦即本文所闡述之O25A抗原)之蛋白質(例如糖基轉移酶)的核酸。在另一具體實施例中,該等編碼能夠產生O25A血清型之大腸桿菌O抗原之蛋白質(例如糖基轉移酶)之核酸係O25血清型的基因,其中該等基因係rmlBrmlDrmlArmlCwzxwekAwekBwekCwzyfnlAfnlBfnlCwbuB及/或wbuC。參見Wang等人(2010)J Clin Microbiol 48,2066-2074;基因庫GU014554;及表2。
在另一具體實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼能夠產生O2血清型之O抗原大腸桿菌之糖基轉移酶的核酸。在另一具體實施例中,該等編碼能夠產生O2血清型之大腸桿菌O抗原之糖基轉移酶之核酸係O2血清型的基因,其中該等基因係rmlBrmlDrmlArmlCwzxwekPwekQwekRwzyfdtAfdtB及/或fdtC。See Li等人(2010)J Microbiol Methods 82,71-77;Fratamico等人,2010,Canadian Journal of Microbiology 56,308-316;及表5。
在另一具體實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼能夠產生O6血清型之O抗原大腸桿菌之糖基轉移酶的核酸。See Welch等人,2002,PNAS USA 99(26):17020-17024;Jann等人,Carbohydr.Res.263(1994)217-225及Jansson等人,Carbohydr.Res.131(1984)277-283。在一具體實施例中,該O6血清型包括支鏈Glc單糖。
在另一具體實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼能夠產生O1血清型之O抗原大腸桿菌之糖基轉移酶的核酸。在一具體實施例中,該O1血清型係O1A。在另一具體實施例中,該等編碼能夠產生O1血清型之大腸桿菌O抗原之糖基轉移酶之核酸係O1血清型的基因,其中該等基因係rmlBrmlDrmlArmlCwzxmnaAwekMwzywekN及/或wekO
寡糖基轉移酶
寡糖基轉移酶將脂質-連接之寡糖轉移至包括N-糖基化共有基序(例如Asn-X-Ser(Thr),其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15))之初生多肽鏈之天門冬醯胺酸殘基中(參見WO 2006/119987)。例如參見WO 2003/074687及WO 2006/119987,其揭示內容之全部內容以引用方式併入本文中。
在某些實施例中,本文所提供之宿主細胞包括編碼寡糖基轉移酶之核酸。編碼寡糖基轉移酶之核酸可對宿主細胞為原始性,或可使用基因方式引入宿主細胞中,如上文所闡述。寡糖基轉移酶可來自業內已知之任一來源。在一具體實施例中,寡糖基轉移酶係來自彎曲桿菌(Campylobacter)之寡糖基轉移酶。在另一具體實施例中,寡糖基轉移酶係來自空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)之寡糖基轉移酶(亦即pglB;例如參見Wacker等人,2002,Science 298:1790-1793;亦例如參見NCBI基因編號:3231775,UniProt登錄編號:O86154)。在另一 具體實施例中,寡糖基轉移酶係來自紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)之寡糖基轉移酶(例如參見NCBI基因編號:7410986)。
5.4 生物偶聯物
在某些實施例中,可使用本文所闡述之宿主細胞來產生包括本文所闡述連接至載體蛋白之大腸桿菌O抗原(例如O25B;參見部分5.2)之生物偶聯物。業內已知使用宿主細胞產生該等生物偶聯物之方法。例如參見WO 2003/074687及WO 2006/119987。
另一選擇為,可藉由化學合成來製備糖偶聯物,亦即,在宿主細胞外側(在活體外)製備。舉例而言,可使用彼等熟習此項技術者已知之方法(包含藉助使用活化多糖體/寡糖以及蛋白質載體中之反應性基團)來使本文所闡述之大腸桿菌O抗原(例如O25B)偶聯至載體蛋白。例如參見Pawlowski等人,2000,Vaccine 18:1873-1885;及Robbins等人,2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978),其揭示內容以引用方式併入本文中。該等方式包括:自宿主細胞提取抗原性多糖體/寡糖,純化多糖體/寡糖,以化學方式活化多糖體/寡糖,及使多糖體/寡糖偶聯至載體蛋白。
如本文所闡述之生物偶聯物具有優於糖偶聯物之有利性質,舉例而言,生物偶聯物在製造中需要較少化學物質且在所生成最終產物方面更加連貫。因此,生物偶聯物優於以化學方式產生之糖偶聯物。
在一具體實施例中,本文提供包括連接至本文所闡述之ExPEC O抗原之載體蛋白之生物偶聯物。參見部分5.2。
在一具體實施例中,本文提供包括N-連接至大腸桿菌O25B之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物。
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至下文所呈現式O25B之化合物之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,載體蛋白N-連接至式O25B之O抗原,亦即,O25B連接至以下載體蛋白之Asn殘基:包括序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14);或包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)。
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至下文所呈現式O25B’之化合物之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。在一具體實施例中,載體蛋白N-連接至式O25B’之O抗原。
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至O25A抗原之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O25A抗原包括式O25A: 或O25A’:
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至O1抗原之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O1抗原係O1A,舉例而言,該抗原包括式O1A: 或O1A’:
在另一具體實施例中,該O1抗原係O1B,舉例而言,該抗原包括式O1B: 或O1B’:
在另一具體實施例中,該O1抗原係O1C,舉例而言,該抗原包括式O1C: 或O1C’:
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至O2抗原之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O2抗原包括式O2: 或O2’
在另一具體實施例中,本文提供包括連接至O6抗原之載體蛋白(例如EPA)之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O6抗原包括式O6Glc: O6GlcNAc: O6Glc’: 或O6GlcNAc’:
可藉由業內已知用於純化蛋白質之任一方法來純化本文所闡述之生物偶聯物,例如藉由層析(例如離子交換、陰離子交換、親和層析及尺寸管柱層析)、離心、差異溶解性或藉由用於純化蛋白質之任一其他標準技術。例如參見Saraswat等人,2013,Biomed.Res.Int.312709號(第1-18頁);亦參見WO 2009/104074中所闡述之方法。另外,可使生物偶聯物融合至本文所闡述或另外業內已知之異源性多肽序列以促進純化。用於純化特定生物偶聯物之實際條件部分地取決於合成策略(例如合成產生對重組產生)及諸如生物偶聯物之電荷、疏水性及/或親水性等因素且為彼等熟習此項技術者所明瞭。
5.5 抵抗O25B之抗體
本文所闡述之O25B抗原(參見部分5.2)及/或包括本文所闡述之O25B抗原之生物偶聯物(參見部分5.4)可用於誘發抵抗ExPEC之中和抗體。在一具體實施例中,可將本文所闡述之O25B抗原及/或包括本文所闡述之O25B抗原之生物偶聯物投與個體(例如人類、小鼠、兔、大鼠、天竺鼠等)以誘導包含產生抗體的免疫反應。可使用熟習此項技術者已知之技術(例如免疫親和層析、離心、沈澱等)來分離該等抗體。
此外,可使用本文所闡述之O25B抗原自抗體文庫篩選抗體。舉例而言,可將分離O25B固定至固體載體(例如矽膠、樹脂、衍生化塑膠膜、玻璃珠粒、棉花、塑膠珠粒、聚苯乙烯珠粒、氧化鋁凝膠或多糖體、磁性珠粒),且篩選以用於結合至抗體。另一選擇為,可將擬篩選抗體固定至固體載體上且篩選以用於結合至O25B。可使用任一篩選分析(例如淘選分析、ELISA、表面電漿共振或業內已知之其他抗體篩選分析)來篩選結合至O25B之抗體。所篩選抗體文庫可為市售抗體文庫、活體外生成文庫或藉由自感染EXPEC之個體鑑別及選殖或分離抗體獲得之文庫。可根據業內已知之方法來生成抗體文庫。在一特定實施例中,藉由選殖抗體且將其用於噬菌體顯示文庫或噬菌粒顯示文庫中來生成抗體文庫。
使用O25B及/或O25B之生物偶聯物鑑別或誘發之抗體可包含免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分,亦即含特異性結合至O25B之抗原結合位點之分子。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類之免疫球蛋白分子。抗體包含但不限於單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)及抗獨特型(抗Id)抗體(包含(例如)抗Id抗體至使用本文所闡述之方法誘 發或鑑別之抗體)及任一上述抗體之表位結合片段。在一具體實施例中,使用O25B及/或O25B之生物偶聯物誘發或鑑別之抗體係人類或人類化單株抗體。
使用O25B及/或O25B之生物偶聯物誘發或鑑別之抗體可用於監測療法效能及/或疾病進展。可使用業內已知之任一免疫分析系統來用於此目的,包含但不限於使用諸如以下等技術之競爭性及非競爭性分析系統:放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、「夾心式」免疫分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、免疫放射分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析及免疫電泳分析。
使用O25B及/或O25B之生物偶聯物誘發或鑑別之抗體可用於(例如)自複數種大腸桿菌菌株檢測大腸桿菌O25B菌株及/或診斷大腸桿菌O25B菌株感染。
5.6 組合物 5.6.1 包括宿主細胞之組合物
在一態樣中,本文提供包括本文所闡述之宿主細胞之組合物。該等組合物可用於生成本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)之方法中,舉例而言,可在適於產生蛋白質之條件下培養組合物。隨後,可使用業內已知之方法自該等組合物分離生物偶聯物。
包括本文所提供宿主細胞之組合物可包括其他適於維持及存活本文所闡述宿主細胞之組份,且可另外包括藉由宿主細胞產生蛋白質所需或對其有益之其他組份,例如用於誘導型啟動子之誘導劑,例如阿拉伯糖、IPTG。
5.6.2 包括抗原及/或生物偶聯物之組合物
在另一態樣中,本文提供包括一或多種本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)之組合物(例如醫藥組合物)及包括一或多種本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)之組合物(例如醫藥組合物)。在一具體實 施例中,本文所提供之組合物包括一或多種本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)。在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括一或多種本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)。在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括一或多種本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)及一或多種本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)。本文所闡述之組合物可用於治療及預防個體(例如人類個體)之腸外病原性大腸桿菌(ExPEC)感染。參見部分5.7。
在某些實施例中,除包括本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)及/或本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)外,本文所闡述之組合物(例如醫藥組合物)亦包括醫藥上可接受之載劑。如本文中所使用,術語「醫藥上可接受之」意指已獲得聯邦或州政府管理機構批准或已列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認藥典中可用於動物(且更特定而言用於人類)中。在醫藥上可接受之載劑之背景中,本文所用之術語「載劑」係指與醫藥組合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。亦可採用鹽水溶液及右旋糖與甘油水溶液作為液體載劑、特定而言用於可注射溶液。適宜賦形劑包含澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及諸如此類。適宜醫藥載體之實例由E.W.Martin闡述於「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。
在一具體實施例中,本文提供包括連接至本文所闡述之抗原(例如部分5.2中所闡述之ExPEC O抗原)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白)之組合物。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括連接至大腸桿菌O25B(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括連接至大腸桿菌O25A(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括連接至大腸桿菌O1(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1A。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1B。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1C。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括連接至大腸桿菌O2(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括連接至大腸桿菌O6(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。在一具體實施例中,該O6大分子係包括支鏈Glc單糖之O6大分子。
在另一具體實施例中,本文提供包括以下部分之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;及(ii)O1大分子或包括O1之生物偶聯物。參見部分5.2。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1A。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1B。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1C。
在另一具體實施例中,本文提供包括以下部分之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;及(ii)O2大分子或包括O2之生物偶聯物。參見部分5.2及5.4。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。
在另一具體實施例中,本文提供包括以下部分之組合物(例如醫 藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;及(ii)O6大分子(例如包括支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖之O6大分子)或包括O6之生物偶聯物。參見部分5.2及5.4。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O6大分子係包括支鏈Glc單糖之O6大分子。
在另一具體實施例中,本文提供一種組合物(例如醫藥組合物),其包括大腸桿菌O25B(參見部分5.2)或包括O25之生物偶聯物(參見部分5.4)及下列部分至少中之一者:(i)大腸桿菌O1或包括O1之生物偶聯物(參見部分5.2及5.4);(ii)大腸桿菌O2或包括O2之生物偶聯物(參見部分5.2及5.4);及/或(iii)大腸桿菌O6或包括O6之生物偶聯物(參見部分5.2及5.4)。在另一具體實施例中,該O1係O1A。在另一具體實施例中,該O1係O1B。在另一具體實施例中,該O1係O1C。在另一具體實施例中,該O6係包括支鏈Glc單糖之O6。
在另一具體實施例中,本文提供包括下列部分中之兩者之組合物(例如醫藥組合物):(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包括O25(例如O25A或O25B)之生物偶聯物;(ii)O1大分子或包括O1之生物偶聯物;(iii)O2大分子或包括O2之生物偶聯物;及/或(iv)O6大分子(例如包括支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖之O6大分子)或包括O6之生物偶聯物。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1A。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1B。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1C。在另一具體實施例中,該O6大分子係包括支鏈Glc單糖之O6大分子。
在另一具體實施例中,本文提供一種組合物(例如醫藥組合物),其包括含有大腸桿菌O25B之生物偶聯物及含有大腸桿菌O1A之生物偶聯物。該等生物偶聯物闡述於部分5.4中。
在另一具體實施例中,本文提供一種組合物(例如醫藥組合物), 其包括含有大腸桿菌O25B之生物偶聯物及含有大腸桿菌O1B之生物偶聯物。該等生物偶聯物闡述於部分5.4中。
在另一具體實施例中,本文提供一種組合物(例如醫藥組合物),其包括含有大腸桿菌O25B之生物偶聯物及含有大腸桿菌O1C之生物偶聯物。該等生物偶聯物闡述於部分5.4中。
在另一具體實施例中,本文提供一種組合物(例如醫藥組合物),其包括含有大腸桿菌O25B之生物偶聯物及含有大腸桿菌O2之生物偶聯物。該等生物偶聯物闡述於部分5.4中。
在另一具體實施例中,本文提供一種組合物(例如醫藥組合物),其包括含有大腸桿菌O25B之生物偶聯物及含有大腸桿菌O6之生物偶聯物。該等生物偶聯物闡述於部分5.4中。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括以下載體蛋白:連接至大腸桿菌O25B(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP);(ii)連接至O1血清型(例如O1A)之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP);(iii)連接至O2血清型之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.1.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP);及(iv)連接至O6血清型之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。
在某些實施例中,前述組合物包括連接至除O1、O2、O6或O25外大腸桿菌血清型之大腸桿菌O抗原之載體蛋白(例如部分5.3.2中所闡述之載體蛋白,例如EPA或MBP)。其他有用大腸桿菌血清型闡述於(例如)下文之實例1及表1中。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括O25(例如O25A或O25B)大分子。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括O1大分子(例如O1A、O1B或O1C)。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括O2大分子。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括O6大分子(例如包括支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖之O6大分子)。
在另一具體實施例中,本文所提供之組合物包括O25(例如O25A或O25B)大分子、O1大分子、O2大分子及O6大分子(例如包括支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖之O6大分子)。在一具體實施例中,該O25大分子係O25B大分子。在另一具體實施例中,該O1大分子係O1A。在另一具體實施例中,該O6大分子係包括支鏈Glc單糖之O6大分子。
本文所提供之組合物可用於誘發投與組合物之宿主中之免疫反應,亦即免疫原性。因此,本文所闡述之組合物可用作抵抗ExPEC感染之疫苗,或可用於治療ExPEC感染,且可因此調配為醫藥組合物。參見部分5.7。
包括本文所闡述生物偶聯物及/或大分子之組合物可包括任一適用於醫藥投與之其他組份。在具體實施例中,本文所闡述之組合物係單價調配物。在其他實施例中,本文所闡述之組合物係多價調配物,例如二價、三價及四價調配物。舉例而言,多價調配物包括一種以上之本文所闡述之生物偶聯物或大腸桿菌O抗原。關於大腸桿菌O抗原及生物偶聯物之闡述,參見分別部分5.2及5.4。在一具體實施例中,本文所闡述之組合物係包括大分子或生物偶聯物之四價調配物,其中該等化合價係來自O25B、O1A、O6及O2血清型/亞血清型之大腸桿菌O抗原。
在某些實施例中,本文所闡述之組合物另外包括防腐劑,例如汞衍生物硫柳汞。在一具體實施例中,醫藥本文所闡述之組合物包括0.001%至0.01%硫柳汞。在其他實施例中,本文所闡述之醫藥組合物 並不包括防腐劑。
在某些實施例中,本文所闡述之組合物(例如免疫原性組合物)包括佐劑,或與佐劑組合投與。與本文所闡述之組合物組合投與之佐劑可在投與該組合物之前、同時或之後投與。在一些實施例中,術語「佐劑」係指如下化合物:其在與本文所闡述之組合物一起或作為其一部分投與時會增加、增強及/或加強對生物偶聯物之免疫反應,但在單獨投與化合物時並不生成對生物偶聯物之免疫反應。在一些實施例中,佐劑對聚生物偶聯物肽生成免疫反應且並不產生過敏或其他不良反應。佐劑可藉由若干機制增強免疫反應,包含(例如)淋巴球募集、刺激B及/或T細胞及刺激巨噬球。
佐劑之具體實例包含但不限於鋁鹽(alum)(例如氫氧化鋁、磷酸鋁及硫酸鋁)、3去-O-醯化單磷醯基脂質A(MPL)(參見英國專利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween 80;ICL Americas公司)、咪唑并吡啶化合物(參見國際申請案第PCT/US2007/064857號,公開為國際公開案第WO2007/109812號)、咪唑并喹喔啉化合物(參見國際申請案第PCT/US2007/064858號,公開為國際公開案第WO2007/109813號)及皂苷(例如QS21)(參見Kensil等人,Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(Powell及Newman編輯,Plenum Press,NY,1995);美國專利第5,057,540號)。在一些實施例中,佐劑係弗羅因德氏佐劑(Freund’s adjuvant)(完全或不完全)。其他佐劑係視情況與免疫刺激劑(例如單磷醯基脂質A)組合之水包油型乳液(例如角鯊烯或花生油)(參見Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。另一佐劑係CpG(Bioworld Today,Nov.15,1998)。
在某些實施例中,本文所闡述之組合物經調配以適用於投與個體之預期途徑。舉例而言,本文所闡述之組合物可經調配以適用於皮 下、非經腸、經口、皮內、經皮、結腸、腹膜腔內及直腸投與。在一具體實施例中,醫藥組合物可經調配以用於靜脈內、經口、腹膜腔內、鼻內、氣管內、皮下、肌內、局部、皮內、經皮或肺部投與。
在某些實施例中,本文所闡述之組合物另外包括一或多種緩衝劑,例如磷酸鹽緩衝劑及蔗糖-磷酸鹽-麩胺酸鹽緩衝劑。在其他實施例中,本文所闡述之組合物並不包括緩衝液。
在某些實施例中,本文所闡述之組合物另外包括一或多種鹽,例如氯化鈉、氯化鈣、磷酸鈉、麩胺酸單鈉及鋁鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、alum(硫酸鉀鋁)或該等鋁鹽之混合物)。在其他實施例中,本文所闡述之組合物並不包括鹽。
本文所闡述之組合物可與投與說明一起包含於容器、包裝或分配器中。
可在使用之前儲存本文所闡述之組合物,舉例而言,組合物可冷凍(例如在約-20℃下或在約-70℃下)儲存;儲存於冷藏條件下(例如在約4℃下);或儲存在室溫下。
5.7 預防及治療用途
本文提供治療及預防個體之腸外大腸桿菌(ExPEC)感染之方法,其包括向個體投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)。在一具體實施例中,使用本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)來預防個體(例如人類個體)之ExPEC感染,亦即,使用本文所闡述之組合物對個體接種疫苗以抵抗ExPEC感染。在另一具體實施例中,使用本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)來治療感染ExPEC之個體。
本文亦提供誘導個體之抵抗ExPEC之免疫反應之方法,其包括向個體投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之 生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)。在一實施例中,該個體在投與時患有ExPEC感染。在另一實施例中,該個體在投與時並不患有ExPEC感染。
本文亦提供誘導在個體中產生抵抗ExPEC之調理吞噬抗體之方法,其包括向個體投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)。在一實施例中,該個體在投與時患有ExPEC感染。在另一實施例中,該個體在投與時並不患有ExPEC感染。
在一具體實施例中,本文提供預防個體之大腸桿菌(例如ExPEC)感染之方法,其中該方法包括向有需要之個體投與有效量之部分5.6.2中所闡述之組合物。本文所提供預防個體之ExPEC感染之方法使得在個體中誘導免疫反應,其包括向個體投與部分5.6.2中所闡述之組合物。熟習此項技術者應理解,本文所闡述誘導個體之免疫反應之方法使得對個體接種疫苗以抵抗O抗原存在於組合物中之ExPEC菌株之感染。
在一具體實施例中,本文提供治療個體之大腸桿菌(例如ExPEC)感染之方法,其中該方法包括向有需要之個體投與有效量之部分5.6.2中所闡述之組合物。
在某些實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由ExPEC之任一血清型、亞血清型或菌株引起之ExPEC感染。在某些實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療一種以上ExPEC血清型之ExPEC感染。
在一具體實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分 5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由O25血清型之大腸桿菌引起之感染。在一具體實施例中,該O25血清型係O25B。在一具體實施例中,該O25血清型係O25A。
在一具體實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由O1血清型之大腸桿菌引起之感染。在一具體實施例中,該O1血清型係O1A。在另一具體實施例中,該O1血清型係O1B。在另一具體實施例中,該O1血清型係O1C。
在一具體實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由O2血清型之大腸桿菌引起之感染。
在一具體實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由O6血清型之大腸桿菌引起之感染。
在一具體實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由兩種或更多種下列大腸桿菌血清型引起之感染:O25(例如O25B及O25A)、O1(例如O1A、O1B及O1C)、O2及/或O6。
在一具體實施例中,由本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)誘導之免疫反應有效預防及/或治療由下列大腸桿菌血清型 中之每一者引起之感染:O25(例如O25B及O25A)、O1(例如O1A、O1B及O1C)、O2及O6。
為治療患有ExPEC感染之個體或針對ExPEC感染對個體實施免疫,可向個體投與本文所闡述之單一組合物,其中該組合物包括一種、兩種、三種、四種或更多種本文所闡述之大腸桿菌抗原。參見部分5.2。另一選擇為,為治療患有ExPEC感染之個體或針對ExPEC感染對個體實施免疫,可向個體投與多種本文所闡述之生物偶聯物,舉例而言,可向個體投與兩種、三種、四種或更多種部分5.4中所闡述之生物偶聯物。另一選擇為,為治療患有ExPEC感染之個體或針對ExPEC感染對個體實施免疫,可向個體投與多種本文所闡述之組合物,舉例而言,可向個體投與兩種、三種、四種或更多種部分5.6.2中所闡述之組合物。
在某些實施例中,在投與本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)後在個體中誘導之免疫反應有效減少源自ExPEC感染之症狀。ExPEC感染之症狀可端視感染性質而有所變化且可包含但不限於:排尿困難、增加之尿頻或尿急、膿尿、血尿、背痛、尿痛、發燒、寒冷及/或噁心(例如在患有由ExPEC引起之泌尿道感染之個體中)、高燒、頭痛、落枕、噁心、嘔吐、癲癇發作、嗜睡及/或光敏性(例如在患有由ExPEC引起之腦膜炎之個體中)、發燒、增加之心率、增加之呼吸速率、降低之尿輸出、血小板計數、腹部疼痛、呼吸困難及/或異常心臟功能(例如在患有由ExPEC引起之敗血病之個體中)。
在某些實施例中,在投與本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)後在個體中誘導之免疫反應有效減小患有ExPEC感染之個體之住院可能。在一些實施例中,在投與本文所闡述大腸桿菌O抗原 (參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)後在個體中誘導之免疫反應有效減小患有ExPEC感染之個體之住院持續時間。
在另一態樣中,本文提供藉由投與本文所闡述之抗體(亦即本文所闡述之抗O25B抗體)來預防及/或治療個體中由O25B血清型之大腸桿菌引起之ExPEC感染的方法。在特定實施例中,中和抗體係單株抗體。
5.7.1 組合療法
在某些實施例中,向個體投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)與一或多種其他治療劑(例如抗細菌或免疫調變治療劑)的組合。一或多種其他治療劑可有益於治療或預防ExPEC感染或可改善與ExPEC感染有關之症狀或病狀。在一些實施例中,一或多種其他治療劑係疼痛緩解劑或抗發燒醫藥。在某些實施例中,以以下方式投與各治療劑:相隔小於5分鐘、相隔小於30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時或相隔96小時至120小時。
可組合使用熟習此項技術者已知之任一抗細菌劑與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)。抗細菌劑之非限制性實 例包含阿米卡星(Amikacin)、阿莫西林(Amoxicillin)、阿莫西林克拉維酸(Amoxicillin-clavulanic acid)、兩性黴素-B(Amphothericin-B)、胺苄西林(Ampicillin)、胺苄西林-舒巴克坦(Ampicllin-sulbactam)、安普黴素(Apramycin)、阿奇黴素(Azithromycin)、胺曲南(Aztreonam)、桿菌肽(Bacitracin)、苄基青黴素(Benzylpenicillin)、卡泊芬淨(Caspofungin)、頭孢克洛(Cefaclor)、頭孢羥胺苄(Cefadroxil)、頭孢胺苄(Cefalexin)、頭孢噻吩(Cefalothin)、頭孢唑林(Cefazolin)、頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢吡肟(Cefepime)、頭孢克肟(Cefixime)、頭孢甲肟(Cefmenoxime)、頭孢哌酮(Cefoperazone)、頭孢哌酮-舒巴克坦(Cefoperazone-sulbactam)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、頭孢匹羅(Cefpirome)、頭孢泊肟(Cefpodoxime)、頭孢泊肟-克拉維酸(Cefpodoxime-clavulanic acid)、頭孢泊肟-舒巴克坦(Cefpodoxime-sulbactam)、頭孢丙烯(Cefprozil)、頭孢喹肟(Cefquinome)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢布烯(Ceftibutin)、頭孢噻呋(Ceftiofur)、頭孢托羅(Ceftobiprole)、頭孢曲松(Ceftriaxon)、頭孢呋辛(Cefuroxime)、氯黴素(Chloramphenicole)、氟苯尼考(Florfenicole)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、克拉黴素(Clarithromycin)、克林沙星(Clinafloxacin)、克林黴素(Clindamycin)、氯唑西林(Cloxacillin)、黏菌素(Colistin)、磺胺甲基異噁唑(Cotrimoxazol)(甲氧苄啶(Trimthoprim)/磺胺甲噁唑(sulphamethoxazole))、達貝萬星(Dalbavancin)、達福普汀(Dalfopristin)/奎奴普丁(Quinopristin)、達托黴素(Daptomycin)、地貝卡星(Dibekacin)、雙氯西林(Dicloxacillin)、多利培南(Doripenem)、多西環素(Doxycycline)、恩氟沙星(Enrofloxacin)、厄他培南(Ertapenem)、紅黴素(Erythromycin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、氟康唑(Fluconazol)、氟胞嘧啶(Flucytosin)、磷黴素(Fosfomycin)、夫西地酸(Fusidic acid)、加雷沙星(Garenoxacin)、 加替沙星(Gatifloxacin)、吉米沙星(Gemifloxacin)、慶大黴素(Gentamicin)、亞胺培南(Imipenem)、伊曲康唑(Itraconazole)、卡那黴素(Kanamycin)、酮康唑(Ketoconazole)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、林可黴素(Lincomycin)、利奈唑胺(Linezolid)、氯碳頭孢(Loracarbef)、甲亞胺青黴素(Mecillnam)(阿德諾西林(amdinocillin))、美羅培南(Meropenem)、甲硝唑(Metronidazole)、美洛西林(Mezlocillin)、美洛西林-舒巴克坦(Mezlocillin-sulbactam)、米諾環素(Minocycline)、莫西沙星(Moxifloxacin)、莫匹羅星(Mupirocin)、萘啶酸(Nalidixic acid)、新黴素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、諾氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、苯唑西林(Oxacillin)、培氟沙星(Pefloxacin)、青黴素V(Penicillin V)、哌拉西林(Piperacillin)、哌拉西林-舒巴克坦(Piperacillin-sulbactam)、哌拉西林-三唑巴坦(Piperacillin-tazobactam)、利福平(Rifampicin)、羅紅黴素(Roxythromycin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、大觀黴素(Spectinomycin)、螺旋黴素(Spiramycin)、鏈黴素(Streptomycin)、舒巴坦(Sulbactam)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)、替考拉寧(Teicoplanin)、特拉萬星(Telavancin)、泰利黴素(Telithromycin)、替莫西林(Temocillin)、四環素(Tetracyklin)、替卡西林(Ticarcillin)、替卡西林-克拉維酸(Ticarcillin-clavulanic acid)、替吉環素(Tigecycline)、妥布黴素(Tobramycin)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、曲伐沙星(Trovafloxacin)、泰洛星(Tylosin)、萬古黴素(Vancomycin)、維吉黴素(Virginiamycin)及伏立康唑(Voriconazole)。
在某些實施例中,組合療法包括投與兩種或更多種本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)及/或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)。
5.7.2 患者群體
在某些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與未治療個體,亦即並不患有ExPEC感染或先前並未患有ExPEC感染之個體。在一實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與處於獲得ExPEC感染風險下的未治療個體。
在某些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與診斷有ExPEC感染的個體。在一些實施例中,在症狀呈現或症狀變得嚴重前(例如在患者需要住院前),將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與感染ExPEC的個體。
在某些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與診斷有UPEC感染的個體。在一些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與患有復發性泌尿道感染的個體。在一些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與患有復發性泌尿道感染但在治療時健康的個體。在一些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與患有菌血症或敗血病或處於獲得菌血症或敗血病風險下的個體。
在一些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係動物。在某些實施例中,動物係鳥。在某些實施例中,動物係犬。在某些實施例中,動物係貓。在某些實施例中,動物係馬。在某些實施例中,動物係牛。在某些實施例中,動物係哺乳動物,例如馬、豬、小鼠或靈長類動物。在一具體實施例中,個體係人類。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係人類成人。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係50歲以上人類成人。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係老人個體。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係人類兒童。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係人類嬰兒。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係早產人類嬰兒。在一些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係人類幼兒。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分 5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體並非小於6個月齡之嬰兒。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係懷孕個體。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係早生育1、2、3、4、5、6、7或8週之女性。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係處於增加之ExPEC風險下個體(例如免疫妥協或免疫缺陷個體)。在某些實施例中,擬投與本文所闡述大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述組合物(參見部分5.6.2)之個體係與患有ExPEC感染或處於增加之ExPEC感染風險下之個體緊密接觸的個體。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係健康護理工作者(例如醫生或護士)。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體係免疫妥協(例如患有HIV感染)或免疫阻抑。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體患有糖尿病。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體患有多發性 硬化症。
在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體患有需要其使用導管之病狀。在某些實施例中,擬投與本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的個體患有脊柱損傷。
5.7.3 投與之劑量及頻率
有效治療及/或預防ExPEC感染之本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)的量取決於疾病性質,且可藉由標準臨床技術確定。可經由臨床醫師已知之各種途徑來投與O抗原、生物偶聯物及/或組合物,例如皮下、非經腸、靜脈內、肌內、局部、經口、皮內、經皮、鼻內等途徑。在一實施例中,經由肌內注射進行投與。
調配物中所採用之確切劑量亦將取決於投與途徑及感染之嚴重程度,且應根據從業醫師之判斷及各個體之情況來決定。舉例而言,有效劑量亦可端視以下因素而有所變化:投與方式、目標位點、患者之生理學狀態(包含年齡、體重、健康)、患者係人類抑或動物、所投與其他醫藥及治療係預防性抑或治療性。最佳地,逐步增加治療劑量以最佳化安全性及效能。
在某些實施例中,採用活體外分析以幫助鑑別最佳劑量範圍。參見部分5.8。可根據源自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線來外推有效劑量。
在某些實施例中,用於基於糖偶聯物之疫苗(例如包括生物偶聯物之組合物)之實例性劑量介於約0.1μg碳水化合物/劑量至400μg碳水化合物/劑量之間。在其他實施例中,用於基於糖偶聯物之疫苗(例如 包括生物偶聯物之組合物)之實例性劑量介於約0.1μg蛋白質/劑量至4000μg蛋白質/劑量之間。在某些實施例中,用於基於糖偶聯物之疫苗(例如包括生物偶聯物之組合物)之實例性劑量包括0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg碳水化合物/劑量。在某些實施例中,用於基於糖偶聯物之疫苗(例如包括生物偶聯物之組合物)之實例性劑量包括50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg蛋白質/劑量。在某些實例性實施例中,用於投與人類之劑量對應於0.5ml含有約1-10μg(例如約2-6μg,例如約4μg)多糖體者(對應所包含之每一糖偶聯物)。
在某些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)以單一劑量形式投與個體一次。在某些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)以單一劑量形式投與個體,隨後在3至6週後投與第二劑量。根據該等實施例,可在第二接種後以6至12個月間隔向個體投與加強接種。在某些實施例中,加強接種可利用不同之大腸桿菌O抗原、生物偶聯物或組合物。在一些實施例中,可重複投與相同大腸桿菌O抗原、生物偶聯物或組合物且各投與可相隔至少1天、2天、3天、5天、7天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。在某些實施例中,本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、每年一次以單一劑量形式將本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與個體。
在某些實施例中,將本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分 5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)以2、3、4、5或更多個劑量形式投與個體且相隔2週、3週、4週、5週或6週。在一些實施例中,以0.1μg至0.5mg、0.1μg至0.4mg、0.1μg至0.3mg、0.1μg至0.2mg或0.1μg至0.1mg碳水化合物內容物之劑量將2、3、4、5或更多個劑量的本文所闡述之大腸桿菌O抗原(參見部分5.2)、本文所闡述之生物偶聯物(參見部分5.4)或本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)投與個體且相隔2、3、4、5或6週。在某些實施例中,所投與之大腸桿菌O抗原、生物偶聯物或組合物每次相同。在某些實施例中,所投與之大腸桿菌O抗原、生物偶聯物或組合物每次不同。
對於使用抗體(例如抗O25B抗體)之被動免疫而言,劑量可介於約0.0001mg抗體/kg體重至100mg抗體/kg體重或0.01mg抗體/kg體重至5mg抗體/kg體重之間。舉例而言,劑量可為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg範圍內或換言之對於70kg患者而言劑量分別為70mg或700mg或在70-700mg範圍內。一實例性治療方案所得需要在一年或數年之時段中每兩週投與一次或每月投與一次或每3至6個月投與一次,或以數年間隔投與。間隔可不規則且基於患者中抗體之血液濃度予以改變。
5.8 分析 評價生物偶聯物誘導免疫反應之能力之分析
可使用彼等熟習此項技術者已知或本文所闡述之任一方式來評價本文所闡述之生物偶聯物/組合物在個體中生成免疫反應之能力。在一些實施例中,可藉由以下方式來評價生物偶聯物在個體中生成免疫反應之能力:使用本文所闡述之生物偶聯物對個體(例如小鼠)或個體組實施免疫且使用對照(PBS)對其他個體(例如小鼠)或個體組實施免疫。隨後可使用ExPEC激發個體或個體組且可測定ExPEC在個體或 個體組中引起疾病(例如UTI)之能力。彼等熟習此項技術者將認識到,若使用對照免疫之個體或個體組患有隨後使用ExPEC激發之疾病,但使用本文所闡述之生物偶聯物或其組合物免疫之個體或個體組患有較少或並不患有疾病,則生物偶聯物能夠在個體中生成免疫反應。可藉由(例如)免疫分析(例如ELISA)測試本文所闡述之生物偶聯物或其組合物誘導與來自ExPEC之O抗原交叉反應之抗血清的能力。
活體外殺菌分析
可使用血清殺菌分析(SBA)或調理吞噬殺滅分析(OPK)評價本文所闡述之生物偶聯物在個體中生成免疫反應之能力,該等分析代表用於獲得基於糖偶聯物之疫苗之批准之已確立及接受的方法。該等分析在業內已眾所周知且簡言之包括以下步驟:藉由向個體(例如小鼠)投與誘發針對所關注靶(例如大腸桿菌之O抗原,例如O25B)之抗體之化合物來生成該等抗體且分離。隨後,可藉由(例如)以下方式來評價抗體之殺菌能力:在該等抗體及補體及(端視分析)中性細胞存在下培養所論述細菌(例如相關血清型之大腸桿菌)且(例如)使用標準微生物方式分析抗體殺滅及/或中和細菌之能力。
5.9 套組
本文提供一種醫藥包裝或套組,其包括一或多個填充有本文所闡述之組合物(參見部分5.6.2)之一或多種成份(例如本文所提供之一或多種大腸桿菌抗原(參見部分5.2)及/或生物偶聯物(參見部分5.4))之容器。視情況,該等容器可附帶有監管醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告,該公告顯示政府機構已批准用於人類投與之製造、使用或銷售。本文所涵蓋之套組可用於個體之上述治療及免疫方法中。
6. 實例 方法 凝集
在該製程中,使細胞或裂解細胞物質與含有聚合結構(例如O抗原)之特異性抗體之抗血清混合。在抗血清識別細胞結構時,形成可見不溶性聚集物。通常使用此方法來鑑別O、K及H血清型。參見DebRoy等人(2011)Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12,169-185
用於SDS PAGE分析之LPS試樣製備
革蘭氏陰性細胞之LPS係由脂質A基質構成,脂質A基質經核心寡糖改質以提供用於O抗原之附接。為分析臨床分離物之LPS,將細胞在37℃下於標準LB培養基中生長24h,且收集OD600為2之對應於1ml培養物之生物質且在1×Lämmli試樣緩衝液中裂解並在95℃下培育10分鐘。使用1g/l蛋白酶K將提取物進一步在65℃下處理1小時以去除任何蛋白質信號。藉由SDS PAGE分離經處理提取物且藉由銀染色或西方印跡使用適當抗血清觀測LPS。
用於塗覆ELISA板之LPS製備
使用由Apicella,(2008)Methods Mol Biol 431,3-13闡述之方法來製備LPS,且進一步如由Perdomo及Montero,(2006)Biotecnología Aplicada 23:124-129所闡述進行純化。
2AB OPS HPLC:「LLO指紋分析」
使用此方法來分析UPP連接之OPS之結構。
為提取UPP-連接之聚糖,使用0.9% NaCl洗滌大腸桿菌細胞且凍乾。使用有機溶劑(甲醇:水(M:W=17:3至19:1,v/v)及/或最佳化比率之氯仿:甲醇:水混合物(例如C:M:W=10:10:3;v/v/v))提取經乾燥細胞。在N2流下乾燥提取物,且以C:M:W=3:48:47再懸浮。為純化所提取之糖脂,使3:48:47再懸浮液通過tC18 Sep-PAK柱。使用10ml甲醇對柱實施條件化,隨後使用10ml 3:48:47(C:M:W)平衡。在裝載試樣 之後,使用10ml 3:48:47(C:M:W)洗滌柱且使用5ml甲醇及5ml 10:10:3(C:M:W)洗脫。在N2下乾燥合併之洗脫液。藉由以下方式來水解糖脂試樣:將經乾燥試樣溶於2ml正丙醇:2M三氟乙酸(1:1)中,加熱至50℃保持15min,且然後在N2下蒸發至乾燥(Glover等人,Proc Natl Acad Sci USA 102(40):14255-9)。將經乾燥試樣再次再懸浮於3:48:47中且通過tC18柱,且在N2下乾燥穿過流。使用所闡述紙盤方法實施2-AB標記及聚糖淨化(Bigge等人,Anal Biochem 230(2):229-38;Merry等人,Anal Biochem 304(1):91-9)。
藉由HPLC使用GlycoSep-N正相管柱根據Royle等人(但修改為三溶劑系統)來分離2-AB標記之聚糖(Royle等人,Anal Biochem 304(1):70-90)。溶劑A係存於80%乙腈中之10mM pH 4.4甲酸銨。溶劑B係存於40%乙腈中之30mM pH 4.4甲酸銨。溶劑C係0.5%甲酸。管柱溫度為30℃且藉由螢光(激發λex=330nm,發射λem=420nm)檢測2-AB標記之聚糖。梯度條件係如下線性梯度:在0.4ml/min之速率下於160min內為100% A至100% B,隨後為2min 100% B至100% C且將速率增加至1ml/min。使用100% C洗滌管柱5min,經2min返回100% A且在100% A及1ml/min之速率下運行15min,然後返回0.4ml/min速率保持5min。在水中注入試樣。
去乙醯化分析:
在30℃下乾燥一當量之2-AB標記之聚糖,使用(試樣)或不使用(模擬)200mM NaOH(pH14)再懸浮於50μl水中,且在37℃下培育25小時。然後使溶液達到室溫且藉由添加200mM HCl溶液(pH1)中和。在30℃下於速度真空中乾燥之後,使用2AB再標記試樣且藉由HPLC分析。
肼解HPLC
使用上述相同正相HPLC技術來分離在肼解之後自生物偶聯物釋
放之OPS。在肼解之前,在N2流下充分乾燥對應於1mg蛋白質之生物偶聯物。使用Ludger Liberate肼解聚糖釋放套組(Ludger LL-HYDRAZ-A2號)根據製造商說明實施多醣體釋放。簡言之,在N2氣氛下將450μ1肼添加至經乾燥試樣中且在85℃下培育16小時。藉由在N2及45℃下蒸發來去除肼。藉由在冰上於471μl存於1M碳酸氫鈉中之4.5%乙酸酐中培育兩小時來實施多糖體之再-N-乙醯化。然後,添加600μl 5% TFA溶液且將試樣在冰上再水解一小時。在EB20管柱上使用相應緩衝液EB20 A及B實施純化。
使用2-AB標記經釋放及純化之多糖體且藉由NP-HPLC分析,如針對LLO試樣所闡述。收集所關注峰且藉由MS/MS鑑別。
HPLC峰之MS及MS/MS
為分析所關注OPS分子上之單糖序列,實施質譜分析。將對應於特定HPLC峰之經乾燥、收集部分再懸浮於5ul 10%乙腈(ACN)、0.1%三氟乙酸(TFA)中且以1:1與基質溶液(存於50%ACN、0.1% TFA中之40mg/ml DHB)混合於目標板上。以陽離子模式在Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF質譜儀(Bruker Daltonik GmbH,Bremen,Germany)上人工獲取MS及MS/MS數據。使用LIFT方法獲得MS/MS。使用標準肽混合物(Bruker Daltonik GmbH)用於外部校準。使用Flex分析軟體(Bruker Daltonik GmbH)輸出光譜且人工分析。
宿主細胞
藉由重組大腸桿菌細胞表現經由質粒、載體蛋白及來自空腸彎曲桿菌(PglB)之寡糖基轉移酶及來自黏粒或染色體插入突變體之OPS來產生生物偶聯物。
使用基因去毒EPA(來自綠膿桿菌之含有突變L552V、△E553之外毒素A)作為載體蛋白,且進行改質以包括2或4糖基化位點(在本文中分別稱為2S-EPA及4S-EPA)及C末端HIS標籤,且自pBR322源阿拉伯 糖誘導型質粒予以表現(參見Ihssen等人(2010)Microbial cell factories 9,61)。
自pGVXN579表現作為原始周質、可溶性大腸桿菌蛋白之MBP(麥芽糖結合蛋白)。pGVXN579係改質pMAL-p2X(New England Biolabs)質粒,其編碼三個連續細菌N糖基化共有序列,隨後係C末端融合至編碼於質粒上之麥芽糖結合蛋白ORF之Myc-Tag。此設置容許獨立於HIS標籤親和純化MBP生物偶聯物。表現誘導係藉由tac啟動子控制且可使用IPTG誘導。
自質粒pEXT21(來自pMAF10之EcoRI/BamHI片段)表現PglB蛋白質(Feldman等人,2005,PNAS USA 102(8):3016-3021)且選殖至具有C末端融合HA標籤之pEXT21中。表現質粒之變化係密碼子最佳化(pGVXN939)、缺失糖基化位點之密碼子最佳化(pGVXN948)及去除HA-T標籤(pGVXN970)及密碼子最佳化與缺失HA標籤(pGVXN971)。
使用凝集、西方印跡、銀染色、LLO指紋分析、PCR血清分型或容許鑑別OPS結構特性之類似技術分析臨床分離物合成某一OPS之能力,且亦分析其抗生素抗性表型。另外,使某些臨床分離物染色體缺失連接酶WaaL以增強用於蛋白質糖基化或OPS分析之OPS可用性。
為進一步分析臨床分離物,藉由自臨床分離物選殖之rfb簇代替實驗室菌株W3110之rfb簇,且分析OPS生物合成。使waaL基因缺失以增強生物偶聯物產生之效率。
藉由同源重組使用最佳化方法(參見國際專利申請案第PCT/EP2013/068737號)或公開程序(Datsenko及Wanner,(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97,6640-6645)達成簇交換及waaL缺失。對於OPS簇交換而言,將臨床分離物之所關注rfb簇與抗生素抗性序列盒一起選殖至逆選擇質粒pDOC-C中以用於隨後整合至大腸桿菌菌株W3110之rfb基因座中(Kuhlman及Cox,2010,Nucleic acids research 38,e92; Lee等人,2009,BMC Microbiol 9,252)。藉由使用W3110中長度為0.5至1.5千鹼基之rfb簇編碼序列之側翼DNA且活體內自質粒性rfb線性化插入DNA來同源重組所關注大rfb簇。所得菌株含有經代替rfb簇(含有及不含抗生素抗性序列盒),亦即藉由自臨床大腸桿菌分離物分離之類似序列段將W3110之rfb簇代替為gale基因與gnd基因之間之DNA分子。
在某些實驗中,使用含有編碼給定大腸桿菌血清型之rfb簇之黏粒之W3110菌株作為宿主菌株。
為產生基於W3110之菌株中重組表現之生物偶聯物,缺失干擾重組OPS產生之W3110性基因。舉例而言,為產生O25B生物偶聯物之宿主細胞,缺失W3110之gtrABS簇。為達成此情形,根據公開方法(Bloor AE,Cranenburgh RM.Appl Environ Microbiol.2006 Apr;72(4):2520-5.)使用位於gtrA基因上游及gtrS基因下游之側翼同源性序列實施同源重組。
為組合產生菌株,使用pglB及載體表現質粒藉由轉變來轉變宿主菌株。參見Wacker等人,2002,Science 298:1790-1793。
生物偶聯物產生
藉由生長宿主細胞且純化在周質間隙中產生之生物偶聯物來實施生物偶聯物產生。在振盪燒瓶中或在工業規模進料分批發酵製程中實施生長。
在37℃下使用由存於terrific培養液中之適當抗生素構成之培養基(有時補充有5mM MgCl2)實施振盪燒瓶培養。以0.05之OD使用來自新鮮轉變之產生細胞之過夜培養物接種培養基,生長直至對數中期為止,使用0.2%阿拉伯糖及1mM IPTG誘導,進一步生長且在生長20h之後收穫。
進料分批發酵
使用產生細胞系庫之等分試樣接種含有具有適當抗生素之大豆LB培養基之振盪燒瓶。將振盪燒瓶在180rpm及37℃下培育大約12小時。將不含補體之批料培養基在生物反應器內側直接滅菌(33min,在121℃下),冷卻,且添加補體。將4M KOH或25%磷酸添加至發酵器中以用於pH調控且將pH調節至pH7。接種生物反應器及來自預培養之分批培養物以得到0.005之初始OD600。藉由添加4M KOH或25%磷酸來穩定維持pH。維持溶解氧張力(DO)。將頂壓力維持於600毫巴。使用L-阿拉伯糖(0.1%)及/或IPTG(1mM)誘導產物形成。在誘導之後,立即藉由添加含有2.5%阿拉伯糖及IPTG之進料培養基來開始進料。在誘導之後24±2小時,將生物反應器冷卻至25℃,停止進料且藉由切向流過濾或離心實施收穫。
在0.5% Triton X-100中藉由破裂在4個高壓均質化循環期間於800巴下裂解生物質。
藉由管柱層析純化生物偶聯物。使用各種層析技術來製備生物偶聯物,該等技術主要係IMAC、基於Q樹脂之陰離子交換層析(AEC)及尺寸排除層析(SEC)。關於該等方法之闡述,例如參見Saraswat等人,2013,Biomed.Res.Int.312709號(第1-18頁)及WO 2009/104074。
臨床前實驗之生物偶聯物產生
自預培養物,在35±0.2℃下,將界定量轉移至含有豐富培養基之生物反應器中。維持pH及溶解氧張力。攪動速率達到700rpm。
在細胞密度達到OD600=40±5時,使用L-阿拉伯糖(0.1%)及IPTG(1mM)誘導產物形成。在誘導之後24±2小時開始進料且冷卻生物反應器。在溫度達到25℃所,停止進料且收集細胞。
高壓均質化
將所收穫對應於50L之生物質在2℃至8℃下解凍1天。然後向容器中添加2.5L裂解及淨化緩衝液。添加Triton X-100直至最終濃度為 0.5%且藉由4個高壓均質化循環在800巴下破裂完全解凍之細胞。收穫細胞且使用標準技術洗滌。
單糖組成分析:
將含有大約8ug多糖體之生物偶聯物在99℃下於104μl 3M TFA中水解6小時。藉由蒸發去除TFA且使用500μl 2-丙醇將試樣洗滌一次。將所得單糖懸浮於100μl含有87.1mg/ml 1-苯基-3-甲基-5-布他酮(pyrazolone)(PMP)、50% MeOH及150mM NaOH之標記混合物中。在70℃下於60分鐘期間實施標記。藉由添加50μl 300mM HCl及20μl 100mM Tris/HCl(pH 7.0)來中和試樣。藉由使用1ml二丁基醚萃取一次且使用1ml CHCl3萃取三次來純化PMP標記之單糖。
藉由RP-HPLC(Merck-Hitachi)在配備有預置管柱之C18 Inertsil ODS-3管柱(GL Sciences)上來分離PMP源單糖。在35℃及1ml/min之速率下施加以下兩步驟梯度:100%緩衝液A(13%乙腈、87% H2O(0.045% KH2PO4、0.05%三乙胺,pH 7.0)至在4分鐘內50%緩衝液A/50%緩衝液B(21%乙腈、79% H2O(0.045% KH2PO4、0.05%三乙胺,pH 7.0)至在47分鐘內100%緩衝液B。注射體積為50μl且藉由在250nm下進行在線UV檢測來監測洗脫。藉由使用市售單糖標準D-葡萄糖(Sigma-Aldrich G7528號)、L-鼠李糖(Sigma-Aldrich R3875號)、N-乙醯基-D-葡萄糖胺(Sigma-Aldrich A8625號)及N-乙醯基-L-海藻糖胺(Omicron Biochemicals FUC-006號)之層析圖進行疊加來鑑別個別峰。
實例1:流行病學
為測定引起泌尿道感染(UTI)之大腸桿菌之血清型分佈,實施流行病學研究。自瑞士個體收集來自人類尿試樣之1800份大腸桿菌分離物且使用經典凝集技術分析來自每一試樣之O抗原血清型(OPS)。參見圖4
分析所分離人類尿試樣以測定其中之病原體之身份及其抗生素抗性模式。在分析後自試樣獲得大腸桿菌分離物。藉由涉及在鉻(CPS3)及MacConkey瓊脂上生長之經典微生物排除及納入策略來鑑別大腸桿菌分離物。使用凝集分析進一步分析大腸桿菌分離物以測定其O抗原血清型。參見DebRoy等人(2011)Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12,169-185。進一步分析來自相同O抗原血清組之分離物以測定來自每一分離物之O鏈之化學結構。參見表1A。某些所分離大腸桿菌菌株經測定為抗生素抗性,包含鑑別氟喹諾酮(fluoroquinolone)抗性菌株及產生廣譜β-內醯胺酶(ESBL)之菌株。
獨立於位置、分離時間、症狀及目標群體,自個體分離血清型O1、O2、O4、O6、O7、O8、O16、O18、O25、O73及O75,從而表明該等血清型係尿路病原性大腸桿菌(UPEC)之主要血清型。因此,最普遍O抗原血清型之鑑別指示,O抗原特異性疫苗可限於血清型子組,亦即彼等與疾病最有關者,如在此實例中所闡述之研究中所鑑別。
在美國過去三十年自大腸桿菌參考中心(ECRC)獲得之1323份分離物中UTI血清型之回顧性分析使得對文獻及來自瑞士之當前數據進行充分對比。獨立於位置、分離時間、症狀或目標群體發現最主要20種血清型之發病率且表明其係與UPEC有關之主要血清型(參見表1B)。
將來自所闡述血清型之分離物計算為基於分離物總數之百分比(Andreu等人,1997,J Infect Dis 176:464-469;Blanco等人,1996,Eur J Epidemiol 12:191-198;Fathollahi等人,2009,Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81;Johnson等人,2005,J Clin Microbiol 43:6064-6072;Molina-Lopez等人,2011,Journal of infection in developing countries 5:840-849;Sandberg等人,1988,J Clin Microbiol 26:1471-1476;K.L.2007,The Journal of infection 55:8-18;Terai等人,1997,Int J Urol 4:289-294。)在某些情形下,特定數據不可用;因此,百分比數值僅可基於來自所闡述研究中之不同UTI分離物之整體血清型分佈給出適應症且應謹慎考慮。亦包含其他經鑑別較不普遍之所闡述血清型(O15、O20、O21、O22、O77及O82)。
綜合考慮來自流行病學分析之所有資訊,假設涵蓋不可分型菌株之子部分,10種主要血清型可涵蓋所估計60-80%之大腸桿菌感染。另外,在與文獻數據及來自美國之最新數據比較時,數據展示O25血清型在來自瑞士之流行病學研究中之意外重要性。參見表1A及B。
大腸桿菌之O抗原血清型通常係由不同但在結構及抗原性上類似之亞型構成。為鑑別所收集臨床分離物中之未知/未報導亞型且為鑑別最普遍O抗原亞型,更詳細分析來自最普遍血清型之O抗原之化學結構。
實例2:大腸桿菌O25
近年來,觀察到愈加多地出現O25陽性菌株(參見George及Manges(2010)Epidemiol Infect 138,1679-1690)且藉由實例1中所闡述之研究予以證實,其中發現O25血清型係在發病率方面之最主要4種大腸桿菌血清型之一。
O25A
先前已公開大腸桿菌O25血清型之O抗原重複單元結構(參見Kenne等人,1983,Carbohydrate Research 122,249-256;及Fundin等人,2003,Magnetic Resonance in Chemistry 41,4)且呈現於圖2B中。與來自大腸桿菌菌株E47a之O25 O抗原相關之rfb簇可公開獲得(基因庫GU014554)且呈現於圖2A中。使用大腸桿菌E47a作為用於O25血清分型之參考菌株。其他rfb簇序列資訊可自引起無症狀細菌尿大腸桿菌83972之菌株之基因組序列獲得。(參見Zdziarski等人,2010,PLoS Pathog 6,e1001078)。儘管並未證實表型O25表現,但大腸桿菌E47a及83972之rfb簇序列99.49%一致,此高度表明其編碼相同O抗原。
來自大腸桿菌菌株83972及E47a之O抗原在本文中指定為「O25A」,此乃因如下文所闡述新穎大腸桿菌O抗原(指定為 「O25B」)係基於在上文實例1中所闡述之流行病學研究中獲得之臨床分離物之分析來鑑別。
已提出大腸桿菌菌株83972及E47a之預測基因產物之功能性。參見表2;基因庫GU014554;及Szijarto等人(2012)FEMS Microbiol Lett 332,131-136。
結構及基因簇之對比暗示,組合O25A OPS所需之所有功能皆編碼於galEgnd之間之rfb簇內。rfb基因簇(參見圖2A)之各種酶之功能如下:RmlBDAC編碼生物合成dTDP-L-鼠李糖所需之酶,dTDP-L-鼠李糖係將L-Rha支鏈添加至OPS重複單元中之受質。
FnlABC編碼生物合成UDP-L-FucNAc所需之酶,UDP-L-FucNAc係將L-FucNAc添加至O25 OPS重複單元中之供體受質。
WekABC及wbuBC係根據同源性分析之糖基轉移酶。然而,wbuC表現為較短及截短且不太可能具有功能性。因此,最可能功能注釋指示,存在4種生成4種用於組合重複單元之鏈接之糖基轉移酶。
需要Wzx及Wzy以使BRU翻轉至周質間隙中且使其在Und-PP上聚合。
合成公開之O25A重複單元結構所需之所有功能皆由大腸桿菌E47a及83972 rfb簇編碼。因此可推斷出,rfb簇負責編碼O25A OPS。
O25B
在2009年,表徵來自西班牙醫院環境之臨床大腸桿菌分離物以 測定純系組。參見Blanco等人(2009)J Antimicrob Chemother 63,1135-1141。對於係各項進行表徵:a)ESBL類型,b)O血清型,c)毒性基因,d)多基因座序列分型(MLST),及e)脈衝場凝膠電泳分型(PFGE)。 結果指示,約20%之所有分離物可歸於相同純系:血清型及MLST O25:H4 ST131,ESBL類型CTX-M15,Phylogroup B2,其編碼特定組之病毒基因。在與來自E47a菌株亦及來自由等位基因特異性PCR分型方法鑑別之臨床分離物之分型菌株序列比較時,代表性臨床分離物之rfb簇組份之分析展示未知3’序列(參見Clermont等人,2008,J Antimicrob Chemother.61(5):1024-8.;Clermont等人,Diagn.Microbiol Infect Dis.2007,57(2):129-36.;及Li等人,2010,J Microbiol Methods 82,71-77)。在2013年,Phan等人公開純系O25b:H4 ST131之基因組序列,從而證實該純系係與如先前所報導其waa基因簇之結構一致之K-12衍生物。參見Phan等人,2013,PLOS Genetics 9(10):1-18(e1003834)。總而言之,數據表明,新穎O25凝集純系已出現於來自醫院環境之大腸桿菌分離物中,且該純系具有特異性ESBL、MLST及PFGE表型且含有改變之O抗原基因簇。
PCR分型
為測定O25B血清型是否存在於在實例1中所闡述之流行病學研究中鑑別之所分離大腸桿菌菌株中,藉由針對O25及O25B之分型PCR來分析O25凝集陽性菌株。使用挑選自陪替氏培養皿(petri dish)之純系作為模板DNA來源及不同寡核苷酸引物來實施PCR。使用O25特異性引物,其係基於E47a O25 wzy之擴增且闡述於Li等人(2010)J Microbiol Methods 82,71-77中。亦使用闡述於Blanco等人(2009)J Antimicrob Chemother 63,1135-1141中之O25B特異性引物,其對O25b rfb簇(LNB220)之未定義3’部分具有特異性。根據Phan等人,2013,此O25B特異性寡核苷酸對在O25B rfb簇之3’部分中退火。
在24份具有O25凝集陽性表型之所測試臨床分離物中,藉由PCR分型將20份指配為O25B血清型,而剩餘4份藉由PCR分型陽性鑑別為屬O25A血清型。因此,令人吃驚的是,O25B血清型菌株經測定較O25A血清型菌株更常見於所分析菌株中。
簇測序
為以基因方式分析O25B rfb簇,對O25B PCR陽性菌株(指定為「upec138」)之簇進行測序。所鑑別基因及其密切相關蛋白質同系物以及所提出命名列示於下表3中。使用星號指示不存在於O25A中之O25B特異性基因。
簇組合物rfb與O25A簇組合物展示顯著差異。簇之5’部分中之基因彼此係密切同系物(rmlDwzy;大腸桿菌E47a及83972)。此對於rml基因而言並不令人吃驚,rml基因在許多合成L-鼠李糖之大腸桿菌菌株中具有同源性。在降至低於25%一致性之程度之前,O25A及B之基因產物之同源性延伸至wekC(O25A)基因,從而指示蛋白質序列之無關性。參見圖3B。另外發現,O25A之UDP-N-乙醯基海藻糖胺生物合成基因不存在於菌株upec138(O25B)中,如同fnlABC下游之兩種糖基轉移酶。參見圖3B。總而言之,此數據表明,O25B菌株不能合成UDP-L-FucNAc,只是L-FucNAc生物合成基因可編碼於rfb簇外側。然而,在L-FucNAc存在於O抗原之BRU中時,並未報告關於rfb簇外側之fnlABC基因座之單一情形。因此,菌株138不可能能夠合成公開之O25A基本重複單元(BRU)。
在O25B rfb簇中所鑑別不存在於血清型O25A之rfb簇中之基因編碼兩種糖基轉移酶及O-乙醯基轉移酶。該三種基因共用相同組織且所編碼蛋白質與發現且表徵於O16 rfb簇基因型之大腸桿菌K-12菌株中之wbbJKL基因具有高同源性。參見圖3B。根據O25B與O16血清型之間之基因相關性,O16 rfb基因wbbJKL之命名適用於O25B rfb簇中所鑑別之同源基因。
已知O16 BRU之結構且測定wbbJKL之基因功能。參見Steveneson等人(1994)J Bacteriol.176(13):4144-56。WbbJKL負責乙醯化L-鼠李糖,將D-Glc殘基轉移至L-Rha-D-Glc-UndPP中,且將L-Rha轉移至D-GlcNAc-UPP(其係藉由來自ECA簇之wecA形成)中。基於與O16 WbbJKL之同源性及O16 WbbJKL之已知功能,據推斷,O25B rfb簇合成同時含有部分O16及部分O25A元件之結構。其原因在於,WbbJKLO25B極可能與WbbJKLO16合成相同結構,亦即α-D-Glc-1,3-α-L-Rha(2Ac)-1,3-α-D-GlcNAc。此三糖結構與O25A之無支鏈「核心」骨架相同,唯一區別在於L-Rha(2Ac)代替L-FucNAc。該代替由此係保守代替,此乃因D-FucNAc及L-RhaOAc皆係具有6-去氧基及2-乙醯基功能之單糖。唯一差異在於構型,此乃因海藻糖與半乳糖相關,且鼠李糖與甘露糖相關,從而在3位OH基團及5位甲基處得到不同定向。 單糖之間之鏈接相同(皆α-1,3),從而指示該等結構具有類似形狀及化學特性。類似地,編碼於O25A及B rfb簇之上游部分之蛋白質(rmlDCABwekAB)藉由將支鏈D-Glc及L-Rha附接至任一「核心」骨架三糖上而使O25A或B之BRU具有支鏈。此意味著其接受任一骨架(具有L-FucNAc或L-Rha(2Ac))作為受質。
在O25B BRU之還原端存在L-Rha作為第二單糖闡釋了L-FucNAc生物合成為何可不存在於O25B中。無需UDP-L-FucNAc,此乃因其由存在於簇(rmlDBAC)之5’端中之dTDP-L-Rha生物合成基因代替。
Phan等人,2013對O25B臨床分離物進行類似基因分析,但作出不同推斷。其亦對整個基因組進行測序以探索UDP-FucNAc生物合成基因簇;然而,其陳述,用於菌株O25B:H4 ST131 EC958中之UDP-L-FucNAc之機構不僅在O25B rfb簇中缺少,且亦在整個菌株中缺少。然而,Phan推斷出,假設O25B:H4 ST131 EC958與E47a製得相同O抗原結構(亦即O25A),則UDP-L-FucNAc必須以不同方式合成。相反, 本文所示,最可能情形為,O25B菌株不能製得L-FucNAc,但使用O-乙醯化L-鼠李糖殘基代替BRU之第二殘基,且此變化所需之基因排他性地編碼於rfb簇中。
此外,在O25B簇中存在O-乙醯基轉移酶同系物表明在O25BBRU中發生O-乙醯化,其係O25A中所不存在之改質。因此,據測定,來自血清型O25A及O25B之O25抗原之結構必須不同。
O25B結構分析
為證實不同O25抗原結構之假設,分析實例1中所闡述O25臨床分離物之O抗原之化學組成及配置。為更詳細地表徵O25 OPS結構,使用若干方法。
首先,藉由SDS PAGE分析O抗原結構。使用不同染色方法在SDS PAGE之後分析來自臨床分離物之脂多糖(LPS)中電泳移動率之差異。為觀測LPS量,實施銀染色及抗O25特異性西方印跡。參見圖5,其繪示10種分離物之分析結果。數據展示,藉由不同LPS製備之銀染色獲得類似信號強度。與之相反,使用特異性抗血清之探測在10種試樣中之3種(分離物upec436、upec767、upec827)中展示較強信號強度。據推測,因OPS結構差異而出現不同信號強度。
為詳細闡明O25B結構,應用不同分析方法。臨床分離物upec138對O25B呈陽性(藉由PCR發現),且展現其O25凝集抗血清識別弱於O25A菌株。參見圖5。此外,菌株係ESBL,但對FOS、IPM及TZP敏感,且抵抗AM、CXM、NOR及CIP。另一臨床分離物,菌株upec436對O25B呈陰性(藉由PCR發現),但對一般O25(O25A)呈陽性(藉由PCR發現)。亦發現,在藉由西方印跡分析LPS時,upec436與O25凝集抗血清具有強反應性。參見圖5。提取來自兩種菌株之LLO,使用2AB標記且藉由正相HPLC分析。參見圖6;upec138及upec436之LLO,9.079及9.081)。洗脫圖案展示兩種提取物之間具有顯著差異。菌株特 異性峰之MS/MS分析檢測與預期BRU結構一致之信號。
菌株upec436中之信號(9.081):藉由MS分析62’洗脫時間下之峰且發現含有m/z=1021Da之分子作為主要物質,亦即對應於完整O25A OPS BRU之預期物質之分子。MS/MS產生與O25A之單糖序列一致之斷裂圖案(圖7A;m/z=1021之MS/MS)。
菌株upec138中之信號:50’洗脫時間下之峰中之主要物質係m/z 1022Da,亦即大於完整O25A重複單元一個Da。MS/MS分析(圖7B;O25B MS/MS)展示與O25A重複單元幾乎相同之斷裂行為,且1Da差異侷限於來自還原端之第2單糖(藉由O25A MS/MS中之m/z=551之斷裂Y離子鑑別,且在菌株upec138中m/z=552)。60’下之其他洗脫峰展示類似斷裂,但在母體離子物質(m/z=980)中具有42Da差異,其侷限於相同單糖(m/z=510),亦即來自還原端之第二單糖。該等結果之詮釋在下文中給出。
OPS提取、水解及2AB標記程序涉及酸處理以自OPS去除Und-PP。據展示,處理條件部分地去除O-乙醯化,但並不去除N-乙醯化。因此,60’下峰可能代表源自50’峰材料之化學水解之去乙醯化BRU物質。總而言之,此數據指示,在O25B中與O25A之L-FucNAc中存在N-乙醯化之相同單糖位置處存在O-乙醯化。
為以化學方式證實來自還原端之第二殘基處之乙醯化係O-連接,實施去乙醯化分析。自O25B PCR陽性菌株收集在50’洗脫時間下來自2AB LLO HPLC之O25B特異性峰且使用在「方法」下闡述之鹼進行處理。藉由HPLC再分析得到含有m/z=979之主要物質之60’洗脫時間下峰,如在來自圖6之O25B峰中所鑑別,其中MS/MS斷裂離子圖案與失去O-乙醯基之O25B BRU一致。N-乙醯基對鹼處理穩定,如藉由相同分子中還原端D-GlcNAc中之剩餘N-乙醯基所展示。
總而言之,據測定,O25B代表性菌株upec138在結構上及基因上 與來自大腸桿菌之O25A及O16 OPS相關(圖3A及B)。O25B與O25A之不同之處在於在重複單元之第二單糖處具有含有O-乙醯基代替N-乙醯基之重複單元結構,其係L-Rha殘基且並非D-FucNAc。該等變化最可能係由UDP-FucNAc生物合成機構及D-FucNAc轉移酶由編碼兩種糖基轉移酶及O-乙醯基轉移酶之DNA序列段代替引起。基於同源性及功能性分析,該等基因與O16基因簇相關。最終結構有所不同但較為類似,從而闡釋了使用O25凝集抗血清所觀察到之交叉反應性。
如上文所論述,基於rfb簇之分析推斷出且提出,O25A OPS含有L-FucNAc,而該結構不存在於O25B中。為探究FucNAc是否不存在於O25B中,使用上述PMP標記方法及HPLC分析方法對O25A及O25B菌株中所產生之EPA生物偶聯物實施單糖組成分析(圖9)。為產生生物偶聯物,製備具有O25A及O25B表型之臨床大腸桿菌分離物,且改質以達成最佳生物偶聯物產生。作為改質之一部分,使來自菌株upec_436(O25A)及uepc_138(O25B)之waaL基因缺失,如先前所闡述(參見Datsenko及Wanner,(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97,6640-6645)及由核心類型測定方法所獲知(參見Amor等人(2000)Infect Immun 68,1116-1124)。使用用於4S-EPA之表現質粒(pGVXN659)及寡糖基轉移酶PglB(pGVXN939)(用於O25A產生)且使用pGVXN114及pGVXN539(產生2S-EPA)(用於產生O25B生物偶聯物)來轉變所得菌株。在2L振盪燒瓶中產生O25B生物偶聯物,隨後藉由IMAC對周質提取物實施親和純化。藉由進料分批發酵產生O25A偶聯物,且藉由兩步驟純化程序自藉由高壓均質化(如上文方法部分中所闡述)生成之經淨化全細胞均質物開始進行純化。如上文所闡述來實施單糖組成分析。
結果證實不存在針對O25B源生物偶聯物中之FucNAc之信號,而含有O25A之生物偶聯物在預期洗脫時間下展示峰,如藉由對單糖混合混合物實施相同試樣處理程序(作為對照)所測定。由此證實,如基 於rfb簇之分析所預計,O25B之假設結構為L-FucNAc-less。
在EPA載體蛋白部分發生部分酶消化之後,藉由生物偶聯物之核磁共振測定來自大腸桿菌O25B O抗原之O抗原多糖體(O-PS)之重複單元(RU)的完整結構。分析證實,O25B O-PS係由五糖RU構成。藉由2D NMR相關技術指配1H及13C信號,其證實O25B O-PS RU之結構與公開之O25A O-PS RU結構之不同之處在於α-3-FucpNAc殘基經α-3-Rhap殘基取代且90%以上的此殘基在C2位處發生O-乙醯化(Kenne,L.等人,1983.Carbohydr.Res.122:249-256;Fundin,J.等人,2003.Magn.Reson.Chem.41:202-205)。完整O25B O-PS RU展示於下文中(O25B’):
生物偶聯物之產生及表徵
為進一步分析O25A及O25B多糖體抗原,產生額外生物偶聯物材料。對於O25A而言,將來自上文之O25A-EPA之經純化批料用於其他表徵實驗。對於O25B-EPA產生而言,使用質粒pGVXN1076及pGVXN970構築具有基因組整合之O25B簇之菌株:W3110 △waaL △gtrABS △rfbO16::rfb(upec138)。自W3110開始藉由Datsenko及Wanner之方法及用於將較大插入體定向整合至細菌染色體中之同源重組技術來構築此菌株(參見國際專利申請案第PCT/EP2013/071328號)。
使用標準釋放及表徵分析來表徵所得O25B生物偶聯物。使用兩個連續陰離子交換及尺寸排除層析步驟來純化生物偶聯物,從而分別 得到97.2%及98.1%純之O25A及O25B生物偶聯物製劑。使用SDS PAGE量化進行純度分析。參見圖10(O25A)及圖11(O25B)。基於糖量化藉由蒽酮分析(參見Laurentin及Edwards,(2003)Anal Biochem 315,143-145)及針對蛋白質濃度之BCA分析來計算糖/蛋白質比率,從而在O25A及O25B生物偶聯物得到40.2%及26.6%之比率。分析型尺寸排除層析展示與具有附接聚糖鏈之EPA之預期流體動力學半徑一致之顆粒單體狀態。
應用
為論述O25B結構之免疫原性可能,使用O25B及O25A生物偶聯物實施若干臨床前實驗。如圖5中所展示,實例1中所有鑑別為O25陽性之臨床分離物(亦即O25A及O25B分離物)對西方印跡中常用於檢測O25血清型(對來自O25A菌株E47a之血清進行分型)之O25A抗血清呈陽性。因此,抗O25A抗血清似乎對來自O25B菌株之LPS具有交叉反應性。為詳細分析抗體反應及交叉反應性,產生O25生物偶聯物。使用麥芽糖結合蛋白(MBP)作為載體蛋白,且使載體蛋白連接至O25A或O25B。表4繪示用於蛋白質產生之菌株。藉由PCR將所用菌株鑑別為O25A或B基因型。在TB培養基中實施表現且自周質提取物純化蛋白質產物。
Q:Resource Q純化;A:直鏈澱粉樹脂;S:尺寸排除層析
使用所獲得生物偶聯物且使用標準兔免疫方案(eurogentech 28天快速方案)實施免疫。在第0、7、8及18天注射50μg結合至MBP之多糖體以及專屬弗羅因德氏游離免疫刺激性化合物。測試在第一免疫之 後28天獲得之所得最終血液抗血清對O25A或O25B LPS之特異性。圖22展示對各別LPS(O25A或O25B)之抗血清反應性之對比。自upec436及upec138藉由在SDS-PAGE Lämmli緩衝液中蛋白酶K消化全細胞試樣來製備LPS。將相同量之LPS裝載至兩份SDS-PAGE凝膠中,隨後電轉移至硝基纖維素膜中且使用O25A及O25B抗血清進行檢測。結果展示,O25A抗血清較O25B LPS更佳地識別O25A LPS,而O25B抗血清較O25A LPS更佳地識別O25B LPS。此結果指示,自體抗原製得較佳抗原。因此,將O25B抗原納入疫苗中較O25A抗原提供針對O25組之主要O25B臨床菌株之較佳保護。
實例3:大腸桿菌O1
結構數據庫列示大腸桿菌O1之不同亞血清型結構。特定而言,該等結構係O1A、O1A1、O1B、O1C。O1A及O1A1在結構上相同且據信與疾病有關,但並未報導O1B及O1C係病原性(參見Gupta等人(1992)J Bacteriol 174,7963-7970),且代表O1分離物中之少數。O1A/O1A1、O1B及O1C之結構展示於圖12B中。為分析實例1之UPEC流行病學研究中之O1亞血清型分佈,詳細分析來自該研究之若干臨床分離物之O抗原結構。首先,藉由SDS PAGE分析藉由凝集分析測得對O1呈陽性之12種菌株之LPS結構。參見圖13:O1銀染色及西方印跡。
銀染色顯示典型LPS信號於所有含有O1臨床分離物之提取物之泳道中。在約10-15kDa之電泳移動率之強染色顯示脂質A核心,且較緩慢移動率之梯狀信號代表經由不同數量之O抗原重複單元構成之碳水化合物聚合物改質的脂質A核心。當比較來自不同分離物之LPS時,差異出現於模態長度分佈、個別帶之電泳移動率及梯狀圖案。基於該等觀察,可鑑別三個組:(i)大部分分離物(upec002、upec010、upec032、upec140、upec108、upec143、upec276、upec399及 upec425)展現個別帶之不可區分之電泳移動率,不同之處僅在於信號強度及平均鏈長度(模態長度分佈);(ii)兩種分離物(upec119及upec256)顯示在每一重複單元LPS帶中具有略快之移動率,表明不同結構,例如脂質A核心之不同改質;及(iii)自分離物upec1096獲得之信號表現為塗抹狀(smear)而非梯狀,指示不同OPS結構。參見圖13A。
藉由西方印跡分析及使用抗O1抗血清檢測顯示,藉由特異性O1抗體檢測到除upec1096外之所有分離物之LPS,此指示交叉反應性LPS分子。此意味11種分離物係O1,且upec1096最可能非O1分離物(亦即,其藉由凝集分析呈假陽性)。
為詳細分析O1抗原之結構類似性,如上所述使用LLO之2AB標記及高解析度正相HPLC技術。圖14A顯示自11種臨床分離物中之5種獲得之層析圖之重疊圖(overlay)。OPS之指紋分析區出現於110分鐘至150分鐘之滯留時間。該等特徵曲線指示所有試樣皆具有出現於相同滯留時間之信號,從而指示相同分子結構。所觀察差異係強度分佈(亦即平均最大信號之洗脫時間)及一般信號強度。剩餘6種提取物產生在相同洗脫時間具有強度差異之峰。僅試樣upec1096之峰圖案不同,證實上述結構差異。
使用個別峰之MS/MS分析(藉由MALDI-TOF/TOF分析)來鑑別O1試樣中單糖之序列(參見圖14B)。對並非自臨床分離物提取而自含有具有upec032 rfb簇之黏粒之W3110 △waaL菌株提取之試樣實施MS分析。在50、80、96及108分鐘洗脫時間下洗脫之峰含有m/z=1021.4、1849.6、2693.9、3540.4之主要物質。在MS/MS之後獲得之斷裂離子系列與HexNAc、三種去氧己糖及支鏈HexNAc之1、2、3及4個重複單元一致。此數據僅可由O1A亞血清型結構予以闡釋。所闡述峰系列代表臨床分離物中附接至UPP之O1 OPS,且每一連續峰與前一峰具有一 個重複單元之差異。
此數據證實了來自文獻之陳述,亦即來自實例1中所闡述研究之臨床UTI分離物中大腸桿菌之O1 O血清型之代表性結構係亞型O1A。
為產生攜載O1A多糖體之生物偶聯物,對W3110大腸桿菌菌株進行改造以表現O1A OPS。所得菌株係W3110 △rfbO16::rfbO1 △waaL,其含有O1陽性臨床分離物之rfb簇(GU299791*,介於rmlB-wekO之間之簇)。藉由同源重組構築表現O1A OPS之宿主菌株。使用PCR寡核苷酸退火在rfb簇之側翼DNA中擴增O1A臨床分離物之rfb簇。然後藉由國際專利申請案第PCT/EP2013/071328號中所闡述之同源重組使用擴增DNA代替充分表徵之實驗室菌株W3110之內源性O抗原簇。藉由轉變插入用於載體蛋白pGVXN659及PglB(pGVXN114、939、970、971)之表現質粒且證實O1表現(參見圖15及圖16)。
在單獨實驗中,對臨床O1分離物upec032進行改造以產生生物偶聯物。改造需要考慮臨床分離物之抗生素敏感表型。構築upec032 △waaL且使用用於生物偶聯物產生之pGVXN939及pGVXN579使用MBP作為載體蛋白進行轉變。使用MBP及EPA作為載體蛋白之優點在於,可使用二者升高抗血清以得到對多糖體組份而非載體具有交叉反應性之抗血清。該等抗血清係用於評估臨床前實驗之有用工具,例如用作研發多糖體特異性ELISA分析之塗覆劑。
實例4:大腸桿菌O6
大腸桿菌O6血清型係迄今為止之報導之最常見ExPEC(George,D.B.及Manges,A.R.(2010)Epidemiol Infect 138,1679-1690)。不僅實例1中所闡述之研究且亦自文獻獲得之數據皆證實,O6血清型屬許多ExPEC引起之表現中之最主要4種血清型(參見圖4)。
文獻中已報導O6 OPS之兩種結構(參見Jann等人,Carbohydr.Res.263(1994)217-225及Jansson等人,Carbohydr.Res.131(1984) 277-283)。所報導O6抗原之結構展示於圖17B中。其係相同的,只是各自之支鏈單糖係Glc或GlcNAc。然而,文獻尚未鑑別臨床分離物中涉及UTI之主要O6結構。
為選擇用於疫苗目的之O6抗原之最代表性結構,使用與上文針對O1血清型所闡述相同之方式探究來自實例1研究之O6凝集陽性臨床大腸桿菌分離物之OPS結構。使用抗O6抗血清之銀染色及西方印跡鑑別出12種臨床分離物中之一者對抗O6血清並無反應性,但LPS在所有試樣中發生銀染色(未展示),從而表明假陽性凝集結果。然而,Glc或GlcNAc差異可能不能由凝膠上之電泳移動率位移進行檢測。
對於詳述結構分析而言,使用LLO指紋分析。作為用於兩種所報告結構中之任一者之參考,在分析中包含來自具有所報告支鏈Glc(CCUG11309)及GlcNAc(CCUG11311)之菌株之提取物。兩種HPLC跡線之對比展示70.8、103.3及122.2’下所洗脫關於CCUG11309衍生試樣之峰系列及CCUG11311試樣之68.8、100.3及118.3系列。參見圖18A。藉由MS分析存在於峰中之主要物質且藉由MS/MS分析該等主要物質之單糖序列。數據證實CCUG11311提取物衍生峰系列m/z=1094.4、2027.6及2962(MSO154),其如所預計對應於GlcNAc支鏈1、2及3 BRU聚合物。先前在來自表現CFT O6臨床分離物之選殖rfb簇之W3110菌株之提取物中鑑別出具有支鏈Glc的m/z=1053.4、1945.7及2836.9,其與CCUG11309(MSO138)具有相同2AB指紋分析峰洗脫時間。在比較自12臨床分離物獲得之層析圖與參考菌株時,11種信號含有指示具有支鏈Glc殘基之O6 OPS之峰系列。該等11種層析圖中之5中展示於圖18B中。一種在O6特異性洗脫時間下並不生成信號之試樣並非O6,亦即最可能在凝集測試中呈假陽性。因此,具有Glc支鏈之O6 OPS(圖17B,頂圖)係自實例1中所闡述流行病學研究分離之O6血清型中之最代表性結構。
為產生攜載O6Glc多糖體之生物偶聯物,藉由使用來自菌株CCUG11309之rfb簇代替W3110 rfb簇來對W3110大腸桿菌菌株進行改造以表現O6 OPS。參見表7及13。所得菌株係W3110 △rfbO16::rfbCCUG11309 △waaL,其含有在BRU中具有所報告Glc支鏈之O6陽性大腸桿菌菌株之rfb簇(參見上文)。藉由同源重組構築表現O6Glc OPS之宿主菌株。使用PCR寡核苷酸退火在rfb簇之側翼DNA中擴增rfb簇。然後藉由國際專利申請案第PCT/EP2013/071328號中所闡述之同源重組使用擴增DNA代替充分表徵之實驗室菌株W3110之內源性O抗原簇。藉由轉變插入用於載體蛋白及PglB之表現質粒且藉由西方印跡證實預期OPS在EPA上之表現。
實例5:大腸桿菌O2
自1987年已知O2多糖體之重複單元結構(Jansson等人(1987)Carbohydrate research 161,273-279)。其展示於圖19B中。兩種O2 O抗原基因簇序列可自公開數據庫(基因庫EU549863及GU299792)獲得。已進行對比分析且已展示糖基轉移酶活性(表5;Fratamico等人,2010,Canadian journal of microbiology 56,308-316;及Li等人(2010)J Microbiol Methods 82,71-77)。
結構及基因同源性之對比指示,存在用於生物合成聚合物之所 有功能:rmlBDAC編碼生物合成dTDP-L-鼠李糖所需之酶,dTDP-L-鼠李糖係用於藉由糖基轉移酶wekPOR將L-Rha添加至骨架中之受質;fdtABC提供用於支鏈糖基轉移酶之dTDP-D-Fuc3Nac;wzywzx同系物負責將Und-PP結合重複單元自細胞質翻轉至周質中;且wekPOR係預測糖基轉移酶,且預計會形成O2 BRU之糖苷鏈接(三個L-Rha及一個L-FucNAc)。
發現於公開O2 rfb簇序列中之wekS基因係預測膜結合硫酸酯酶,且由此最可能並不涉及BRU形成。此意味著,若假設一種酶、一個鏈接規則,則wekPOR組中之一種酶必須為雙功能性以提供4種糖苷鏈接。
已在多個實例中展示一種酶-一個鏈接規則並非絕對的,在該等實例中已知糖基轉移酶少於鏈接,例如在福氏志賀氏桿菌Y(Shigella flexneri Y)、福氏志賀氏桿菌6(S.flexneri 6)、空腸彎曲桿菌及大腸桿菌O1A中。在該等實例中,多功能糖基轉移酶負責形成一個以上糖苷鏈接,其係「雙功能」或「多功能」。其總是係多次添加之同一單糖。重複鼠李糖殘基(如在血清型O2中所發現)通常與該等多功能酶有關。
因在wekS序列側翼存在截短轉位子元件,故可推測,藉由DNA重組事件將wekS基因座插入rfb簇中(參見Fratamico等人,2010,Canadian journal of microbiology 56,308-316)。wekS基因座之轉位子調介之插入表明,存在O2 OPS生物合成且之前並不存在wekS,且因此無需wekS即合成O2 OPS聚合物。為證實此假設,在重組表現系統(含有缺乏wekS基因之O2 rfb簇之「清潔」基因組背景)中重構O2 OPS形成。為達成此,藉由來自缺乏wekS DNA之O2陽性菌株upec116之rfb簇代替來自菌株W3110之O抗原簇。藉由同源重組進行染色體代替,如國際專利申請案第PCT/EP2013/071328號中所闡述。所得菌株 係W3110 △waaL △rfbW3110::rfbO2 △wekS。製備OPS且藉由2AB標記及正相HPLC以及螢光檢測進行分析,如針對O1A及O6 OPS所進行(參見上文),且藉由正相HPLC進行分析(圖21)並與來自野生型菌株CCUG25之信號進行比較。分析得到一系列位於40分鐘與140分鐘洗脫時間之間之重疊峰。
rfbO2簇獨立峰系列之MS分析展示連續峰之間具有相同差異(亦即單一O2 RU)之主要物質。
實施在各別峰中所收集分子之MS分析以分析OPS之結構。收集自野生型菌株CCUG25所獲得在43.5、73.1、81.4及90’下所獲得之峰且藉由MS及MS/MS進行分析。發現物質及Y片段離子系列與預期1、2及3重複單元O2 OPS分子一致(m/z=989.4(圖23)、1817.8、2646.1,皆Na+加合物)。
為證實來自臨床分離物之O2 OPS,分析12種純系之OPS結構,如上文針對O1血清型所闡述。首先,製備LPS以藉由銀染色及西方印跡進行分析。結果繪示於圖20中。所有試樣皆展示具有兩種表觀不同平均梯長度之梯狀帶圖案。使用抗O2抗血清檢測所有LPS試樣,從而指示凝集準確地將所有分離物鑑別為O2血清型。
為產生攜載O2多糖體之生物偶聯物,使用W3110 △waaL △rfbW3110::rfbO2 △wekS。藉由轉變插入用於載體蛋白及用於PglB之表現質粒且藉由西方印跡證實預期OPS在EPA上之表現。參見表7及13及上文。
實例6:不同O抗原之免疫學分析
為評價含有所選抗原性多糖體之生物偶聯物之免疫學潛力,實施臨床前研究。產生O1A-EPA、O2-EPA、O6Glc-EPA及O25B-EPA生物偶聯物,純化,且如上文及方法部分中所闡述進行表徵。
使用純化生物偶聯物對9週齡雌性斯普拉-道來氏大鼠(Sprague Dawley rat)實施免疫。在第1、22及43天將100μl相同劑量溶液經肌內(i.m.)注射至大鼠中,對大鼠實施末端放血且在第56天處死。
不同組之大鼠接受以下不同疫苗:總是未調配、僅包括生物偶聯物或組合,如表6中所指示。在第一注射之後56天之末端放血時間點下,使用經在waaL陽性菌株中產生之同源LPS塗覆之ELISA板以ELISA效價形式來量測大鼠血清之免疫原性(圖25-28)。總而言之,針對對照(未糖基化EPA或TBS緩衝液)量測之所有接種疫苗組皆觀察到統計學顯著免疫原性。因此,所選擇及產生之生物偶聯物代表有用之疫苗候選化合物。
對於所測試之所有O抗原-EPA偶聯物而言,針對對照(未糖基化EPA或TBS緩衝液)量測之所有接種疫苗組皆觀察到統計學顯著免疫原性。因此,所選擇及產生之生物偶聯物代表用於誘導O抗原特異性抗體之有用疫苗候選化合物。
實例7:生物偶聯物之物理化學表徵
以單價批料形式(活性醫藥成份,API)製備上述實例中所闡述之4種生物偶聯物(分別偶聯至EPA載體蛋白之O25B、O1A、O2及O6之O抗原)或以抵抗ExPEC之多價疫苗形式組合於單一製劑中。產生各種批料:臨床前批料、毒性研究批料及臨床批料。表7指示用於產生偶聯物之宿主菌株。
由此藉由尺寸排除層析使用多角度光散射(SEC-MALS)分析4種單價GMP前批料及未糖基化EPA參考標準以量化個別生物偶聯物之單-及二糖基化程度且測定蛋白質載體及附接至其之O-PS之分子量(MW)。在TSKgel-G3000 SWx1管柱上於磷酸酯緩衝液(pH 7.0;50mM NaCl、150mM磷酸鈉)分離試樣且藉由UV(214及280nm)、折射指數(RI)及多角度光散射(MALS)進行監測。
對於未糖基化EPA載體蛋白而言,經測定MW為63-67kDa(基於胺基酸序列,理論MW為70.5kDa)。在生物偶聯物中,僅在280nm下檢測到EPA,從而容許自藉由RI及MALS量測之總MW提取其MW:在生物偶聯物中,EPA部分之所量測MW為65-71kDa。
GMP前API產物標準之分析顯示於表8中,從而指示存在單-及二糖基化偶聯物,其中MW分別在75-79kDa及87-91kDa之範圍內。O-PS部分之特徵在於MW分別為16-24kDa(對於二糖基化物質而言)及8-14kDa(對於單糖基化物質而言)。考慮每一血清型之RU之MW,測得每一多糖體鏈具有10-16個RU之平均數量,此與肼解及MS數據良好吻合。
峰1:二糖基化形式。
峰2:單糖基化形式。
在Tris緩衝鹽水(TBS)中調配之O25B生物偶聯物批料之圓二色性 (CD)分析展示,調配物在pH 6.8至7.4下具有類似於未糖基化EPA載體蛋白之光譜且具有α螺旋及β片狀結構之混合物,如基於EPA之公開晶體結構所預計。因此,基於該等CD分析,使用O25B O-PS鏈之糖基化似乎並不影響EPA載體蛋白之二級結構。
存於TBS(pH 6.8至7.4)及磷酸酯緩衝鹽水(PBS)(pH 7.1至7.8)中之O25B生物偶聯物批料調配物之差示掃描熱量測定(DSC)分析展示與未糖基化EPA相當之熔解曲線,其中熔點大約為52℃。此結果指示,EPA載體蛋白之生物物理學特性並不隨使用O25B O-PS鏈進行改質而改變。
實例8:單價主體及四價疫苗製劑之穩定性
在大規模產生之前,針對小規模評價製造製程之一致性。在包含加速及應力儲存條件之深度穩定性研究中評估一致性批料以鑑別降解路徑。經3個月時段測試4種單價疫苗組份(API)之穩定性。
臨床前API之穩定性數據之分析指示在儲存於-75±15℃(正常儲存條件)下時經至少3個月之穩定性。在預期儲存條件下藉由統計學線性消退分析觀察到並無統計學顯著趨勢。產物亦在加速(+5±3℃)及應力儲存條件(+25±5℃)下經至少3個月較為穩定,如藉由穩定性指示參數之低變化性所證實。O1A臨床前API之數據展示於表9中。三種其他血清型(O2、O6、O25B)顯示類似穩定性數據。
S/P:糖/蛋白質比率,如分別藉由蒽酮及BCA分析所測定。
純度:如藉由反相高解析度液相層析(RP-HPLC)所測定。
在3個月時段期間測試四價疫苗組合物(O25B、O1A、O2及O6生物偶聯物)之穩定性。研究包含加速及應力儲存條件以鑑別降解路徑。所得數據可視為適用於初始證實GMP IMP(探究性醫學產物,四價ExPEC疫苗組合物)儲架壽命。
四價ExPEC疫苗臨床前批料之穩定性數據分析指示在儲存於+5±3℃(正常儲存條件)下時經至少3個月具有穩定性,如表10中所展示。在預期儲存條件下藉由統計學線性消退分析觀察到並無統計學顯著趨勢。產物亦在加速儲存條件(+25±5℃)下較為穩定,如藉由穩定性指示參數之低變化性所證實。
MW(分子大小分佈):兩種主要產物峰(亦即單-及二糖基化物質),如藉由尺寸排除高解析度液相層析(SE-HPLC)所測定。
純度:如藉由反相高解析度液相層析(RP-HPLC)所測定。
總而言之,該等研究顯示,API及四價ExPEC疫苗組合物在至少三個月中較為穩定,且由此係關於穩定性之適宜疫苗組合物。
實例9:對四價疫苗製劑之毒性研究
評價在第1及14天於斯普拉-道來氏大鼠中進行兩次肌內投與(使用股四頭肌進行治療)後四價疫苗製劑(O25B、O1A、O2及O6生物偶聯物)之毒性及局部耐受性。在14天恢復期之後於第28天評價任一變化之可逆性、持久性或晚發性。在第17天對主要組(對於接種疫苗組 及對照組而言係10隻雄性及10隻雌性)中之動物進行屍檢,且在第28天(在14天恢復期之後)對恢復組(對於接種疫苗組及對照組而言係5隻雄性及隻5雌性)進行屍檢。此與可歸因於治療之任何不良效應並不有關。所投與劑量(亦即等效於4μg/O抗原(對於四價疫苗而言係16μg總O抗原)之全人類劑量,如在第1及14天所投與)可視為在此研究條件下用於四價ExPEC疫苗之未觀察到不良效應值(NOAEL)。此外,在評價血清試樣後,在第17天及第28天證實四價ExPEC疫苗之免疫原性。與僅接受調配物緩衝液(25mM Tris、130mM NaCl、2.7mM KCl,pH 7.4)相比,在接種疫苗組中誘導抗O1A、抗O2、抗O6及抗O25B IgG抗體之較高效價。
該等數據證實,四價ExPEC疫苗具有用於作為疫苗投與之適宜毒性特徵,且將抗體誘導至來自存在於疫苗中之O抗原之至少所有4種大腸桿菌血清型(亦即O25B、O1A、O2及O6)。
實例10:與菌血症有關之O-血清型之流行病學
為測定引起老年人菌血症之腸外大腸桿菌中之O-血清型分佈,對一組自60歲以上患者收集之大腸桿菌血液分離物實施流行病學研究。自美國、英國、德國、西班牙及荷蘭之個體總共收集860份來自時段2011-2013之血液分離物,且藉由經典O凝集進行分析。如表11中所展示,菌血症分離物之O-血清型分佈類似於在患有泌尿道感染(UTI,參見表1A)之患者中發現之O-血清型分佈。血清型O25最常見於菌血症群體研究中;藉由PCR對57種分離物進行亞分型展示,56種(98%)O25血清型可分型為O25B。在兩個目標群體(UTI及菌血症)中,血清型O1、O2、O6及O25可鑑別為4種最普遍血清型。總而言之,該等數據證實,泌尿道感染及菌血症分離物中之血清型分佈高度類似且獨立於地理位置、分離時間及適應症。
實例11:功能抗體反應之誘導
使用活體外調理吞噬殺滅(OPK)分析探究在使用上述單價及四價疫苗調配物接種疫苗之後產生之抗體功能性。此類分析已被接受作為抵抗肺炎鏈球菌之偶聯物疫苗(Prevenar®)之保護相關性。OPK分析量測血清促進不同大腸桿菌血清型之調理吞噬及殺滅之能力。在96孔板中,在每一孔中將試樣血清之所定義稀釋液與以下物質一起培育:來自4種疫苗特異性大腸桿菌血清型中之一者之細菌、定義量之HL60細胞及幼兔補體。在培育之後,將一定比例之混合物點樣於胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)上且對細菌純系之數量進行計數。將抗體結合細菌細胞且活化補體沈積以及藉由HL60細胞調介細菌之攝取及殺滅之能力表示為調理效價。調理效價或調理指數(OI)對應於血清殺滅50%之細菌 細胞之稀釋度。提供免疫前及免疫後血清之調理指數。OI自免疫前至免疫後>4倍之增加可視為顯著。確立三種血清型O2、O6Glc及O25B之OPK分析。
藉由單價疫苗誘導之抗體反應之功能性
為評價O25B、O1A、O2及O6Glc生物偶聯物之疫苗誘導之抗體反應之功能活性,使用調理吞噬殺滅(OPK)分析來分析來自接種疫苗大鼠之血清,該等分析量測細菌(例如大腸桿菌)之活體外補體-及抗體依賴性吞噬及殺滅。使用來自接種疫苗大鼠之血清稀釋液預調理大腸桿菌,與補體及吞噬細胞(分化HL60細胞)一起培育,且測定菌落形成單位(CFU)。隨後,計算最大殺滅%及調理指數(OI:殺滅50%之大腸桿菌之血清稀釋度)。選擇用於OPK測試之大腸桿菌係OC 24453(血清型O2)、OC 24781(血清型O6Glc)及OC 24176(血清型O25B)。如圖29中所展示,觀察到對O2-EPA(圖29A)、O6Glc-EPA(圖29B)及O25B-EPA(圖29C)具有穩固功能免疫反應。
數據顯示,本文所闡述之疫苗組份誘導針對O抗原包含於疫苗中之大腸桿菌血清型之抗體反應,且該等抗體反應可用於殺滅來自該等血清型之大腸桿菌。
藉由四價疫苗誘導之抗體反應之功能性
表12展示來自使用含有0.4或4μg/O抗原之四價疫苗免疫之動物之O抗原O2、O6Glc及O25B的總OI效價。在兩個單獨實驗中測定效價。0.4μg劑量在所有動物中針對O2及O6Glc血清型誘導顯著OI。對於O25B而言,3/8之動物展示OI在使用0.4μg劑量免疫後顯著增加。與0.4μg劑量相比,4μg劑量在所有動物中針對O2誘導較低OI增加。在針對O25B大腸桿菌測試來自4μg劑量組之血清時,3/8之動物展示OI增加。數據證實,四價疫苗能夠誘發抵抗O2、O6Glc及O25BO之抗原特異性調理抗體。
數據顯示,本文所闡述之疫苗組份誘導針對O抗原包含於疫苗中之大腸桿菌血清型之抗體反應,且該等抗體反應可用於殺滅來自該等血清型之大腸桿菌。
計算最大殺滅%及調理指數(OI:殺滅50%之大腸桿菌之血清稀釋度)。選擇用於OPK測試之大腸桿菌係OC 24453(血清型O2)、OC 24781(血清型O6Glc)及OC 24176(血清型O25B)。觀察到對O2-EPA、O6Glc-EPA及O25B-EPA具有穩固功能免疫反應。
實例12:具有復發性泌尿道感染(RUTI)臨床史之女性中候選疫苗針對尿路病原性大腸桿菌之評估
在階段I臨床研究中使用大腸桿菌生物偶聯物疫苗。疫苗包括存於鹽水緩衝液中之4種生物偶聯物。4種生物偶聯物係:(i)偶聯至EPA載體蛋白之大腸桿菌O1A、(ii)偶聯至EPA載體蛋白之大腸桿菌O2、(iii)偶聯至EPA載體蛋白之大腸桿菌O6Glc及(iv)偶聯至EPA載體蛋白之大腸桿菌O25B。
研究群體包含194名健康女性,其年齡18至70歲且具有復發性泌尿道感染(RUTI)史(定義為在先前12個月中3次獨立發作或在最近6個月中2次發作)。至少一次泌尿道感染(UTI)發作係由大腸桿菌(作為單一病原或多種微生物感染之一部分)引起且培養證實病因並記 載。出於研究目的,UTI定義為存在至少一種指定UTI症狀(排尿困難、尿急、尿頻、側腹疼痛、膀胱觸痛、恥骨上疼痛、發燒、噁心、嘔吐)且細菌計數(CFU)103 CFU/ml中段尿中之尿路病原。
該研究包含兩個組:(i)候選疫苗及(ii)安慰劑。該研究係在具有RUTI史之健康女性中之交錯、隨機、單盲、安慰劑對照多中心研究。
用於研究之估計登記時段為4個月,其中每一個體之追蹤持續時間段為9個月。
研究目標係評價大腸桿菌生物偶聯物疫苗之安全性、免疫原性及效能。
研究設計
在注射之後追蹤個體9個月,且在整個研究時段中僅追蹤注射個體。個體參加總共5個排程訪視:篩選(第一訪視)、第1天(第二訪視)、第7天、第30天及第270天。個體在第2天、第90天、第150天及第210天接受4個追蹤電話呼叫。
由發生UTI所致之任何未排程訪視包含使用協調治療選擇進行標準護理。收集尿及血液(若可能)以用於診斷及血清分型目的。隨研究持續時間記錄非誘發不良事件(AE)及嚴重不良事件(SAE),而記錄在注射之後7天之誘發AE。
在每一訪視時,給予個體新日記卡且論述前一日記卡。
投藥及投與
在第一訪視時,篩選已提供知情同意之合格個體且證實對於納入/排程凖則之順從性。汲取血液且收集尿。
在訪視2(第1天)時,每一個體在三角肌中接受一個0.5ml溶液之肌內注射(候選疫苗或安慰劑)。減小劑量之候選疫苗含有1μg每一多糖體(總共4μg多糖體)。候選疫苗之目標劑量含有4μg每一多糖體(總 共16μg多糖體)。
目標
主要目標係評價在注射候選疫苗後在整個研究時段中與安慰劑組相比誘發及非誘發不良事件(AE)及嚴重不良事件(SAE)之發生、強度、關係及持續時間。
二級目標係:(i)比較在注射候選疫苗之前(在初始篩選時及第1天)及在注射後(在第7天及第30天)與安慰劑組相比血液學及生物化學安全性端點之變化;(ii)評估在基線(第1天)與在注射後(第30天及第270天)之間候選疫苗之免疫反應;(iii)比較在兩個注射候選疫苗或安慰劑之組之間在整個研究時段期間由大腸桿菌疫苗-血清型引起之症狀性泌尿道感染(UTI)發作的數量作為最相關效能端點;(iv)評價在疫苗組中與安慰劑組相比隨研究持續時間疫苗-血清型特異性大腸桿菌UTI之發生率;及(v)評價在疫苗組中與安慰劑組相比隨研究持續時間疫苗-血清型特異性大腸桿菌UTI之臨床症狀之強度及持續時間。
探索目標係:(i)比較在疫苗組中與安慰劑組相比在整個研究時段中由任一大腸桿菌血清型引起之UTI發生率;及(ii)比較在疫苗組中與安慰劑組相比在整個研究時段中由任一病原引起之UTI發生率。
納入凖則
用於研究之納入凖則如下:(i)女性個體具有復發性UTI史,其定義為:在先前12個月中3次UTI獨立發作或在最近6個月中2次UTI發作;在最近5年期間之至少一次UTI係由大腸桿菌(作為單一病原或多種微生物感染之一部分)引起且培養證實並記載;(ii)年齡18歲且70歲;(iii)個體在篩選訪視時及在注射之日(訪視2)處於並無進行性或懷疑症狀性UTI之健康狀態;(iv)具有一般良好健康,根據探究者之臨床判斷並無臨床顯著醫學史、身體檢查發現或臨床實驗室異常;及(v)在已闡釋所有方案態樣且完全理解之後願意參與研究,且 獲得書面知情同意形式。
排除凖則
用於研究之排除凖則如下:(i)在篩選訪視前一年具有10次以上復發性UTI史;(ii)在篩選之前7天內使用任何短期尿管;(iii)在篩選之前30天內使用任何永久性導管;(iv)具有任何未解決泌尿道疾病/異常史;(v)具有受損免疫功能之證據;(vi)顯著心血管、肝、腎臟疾病及/或機能不全;(vii)不受控糖尿病;(viii)在血液學、血清化學或尿分析之篩選結果中具有顯著異常;(ix)HIV陽性測試及/或HBV或HCV之證據;(x)BMI>34;(xi)在最近3個月中實施用於UTI預防之先前免疫刺激療法(例如Urovaxom®、Strovac®或Urovac®),或計劃在研究時段期間使用;(xii)當前使用任一已知影響免疫功能之藥劑(例如皮質類固醇0.5mg/kg BW/天);(xiii)在注射之前小於6個月新開始使用UTI相關陰道雌激素治療且在研究期間繼續使用或在積極研究時段期間計劃開始;(xiv)在注射前1週內使用任何抗生素療法;(xv)在研究時段期間計劃使用性交後抗生素用於UTI預防;(xvi)在注射之前30天及在注射之後30天內使用任何接種疫苗計劃;(xvii)在登記前60天及研究持續時間內參與其他臨床試驗;(xviii)先前在注射前3個月內使用免疫球蛋白或血液產物進行治療;(xix)對疫苗之任一組份具有已知超敏性;(xx)存在在探究者看來妨礙參與研究之顯著醫學或精神病學病狀;(xxi)在注射時具有急性病況;(xxii)具有陽性妊娠測試或拒絕使用有效避孕之可能懷孕之女性;(xxiii)在整個研究時段中之任一時間處於哺乳期之女性;(xxiv)計劃在研究時段期間使用可選手術幹預之個體;及(xxv)探究者自參與研究之角度考慮會增加具有不良結果之風險之任何其他顯著發現。
統計學方法及分析
若適應,則由治療組及/或訪視提供闡述性統計學(n、平均值、 標准偏差、連續變量之中值及範圍、類別變量之頻率及百分比)。所有數據皆係根據個體、治療組及(若適應)訪視來列示。組合所有組B之接受安慰劑之個體以形成安慰劑治療組。
實例13:階段I臨床研究結果
此實例呈現實例12中所闡述階段I臨床研究之期中分析之某些結果。
12.1:安全性
不良事件及嚴重不良事件之發生在安慰劑組與接種疫苗組之間相當。報告10個嚴重不良事件,且並不與研究藥物相關。
12.2:免疫原性
為評價疫苗組份之免疫原性,獲得來自參與臨床研究之女性之血清且藉由ELISA進行分析以量化針對四價疫苗中所包含之4種不同O抗原(大腸桿菌O1、大腸桿菌O2、大腸桿菌O6及大腸桿菌O25B)之IgG。
在塗覆有O1A、O2、O6Glc及O25B-LPS及EPA之板中培育來自接種疫苗女性之血清。隨後,將板與HRP標記二級抗體(抗人類IgG)一起培育。使用TMB受質檢測結合抗體且量測吸光度。藉由4PL擬合計算EC50值。
如圖30中所展示,在大部分接種疫苗女性中出現對O1A-EPA、O2-EPA、O6Glc-EPA及O25B-EPA之穩固免疫反應。
該等數據顯示四價疫苗之每一組份之免疫原性。
12.3:功能抗體反應
使用OPK分析(其量測大腸桿菌細菌之活體外補體-及抗體依賴性吞噬及殺滅)來評價參與臨床研究之女性之功能抗體反應。
自研究參與者收集血清。使用來自接種疫苗女性之血清稀釋液預調理大腸桿菌,與補體及吞噬細胞(分化HL60細胞)一起培育,且測 定剩餘菌落形成單位(CFU)。隨後,計算最大殺滅百分比及調理指數(OI:殺滅50%之大腸桿菌之血清稀釋度)。選擇用於OPK測試之大腸桿菌係OC 24452(血清型O1A)、OC 24453(血清型O2)、OC 24454(血清型O6Glc)及OC 24176(血清型O25B)。
如圖31中所展示,觀察到對O1A-EPA(圖31A)、O2-EPA(圖31B)、O6Glc-EPA(圖31C)及O25B-EPA(圖31D)具有穩固功能免疫反應。
該等數據顯示,四價疫苗之每一組份誘導血清型特異性抗體反應,且該等抗體反應可用於殺滅來自該等血清型之大腸桿菌。因此,本文所闡述之疫苗組合物可用於人類中。
12.4:使用包括O25B-EPA之四價O抗原偶聯物在人類中誘發O25A/O25B交叉反應性IgG抗體
為測定疫苗誘導之血清IgG抗體針對兩種已知大腸桿菌O25血清亞型O25A及O25B之交叉反應性程度,將源自接種疫苗個體之血清之連續稀釋液與純化O25A LPS、O25B LPS或完整細菌細胞一起培育,且藉由ELISA進行測試。
如圖32中所展示,在測試接種疫苗後30天針對O25A LPS(黑條)及O25B LPS(灰條)之反應性時,觀察到類似EC50值。總而言之,數據表明,O25B生物偶聯物充分地作用於O25B及O25A,但在大部分情形/測試個體中,O25B在針對O25B之抗體反應方面之作用略優於O25A。此結果顯示,在發生一些天然變化之情形下,四價疫苗誘導識別O25A及O25B LPS之抗體。為測試是否同樣適用於全部細菌細胞及多種O25A/O25B菌株,亦測試針對一組源自血液或尿之臨床O25A或O25B分離物之反應性。在此情形下,使用血清型O75菌株(並非四價疫苗中之代表性血清型)作為陰性對照(圖33中之灰色虛線)。如圖33中所顯示,疫苗誘導之血清IgG抗體針對個別O25菌株中之每一者展 示強反應。儘管菌株-菌株變化較為明顯,但觀察到針對O25A(黑線)及O25B菌株(灰線)之反應性。該等數據顯示,四價疫苗之O25B疫苗組份誘發識別O25A及O25B純化LPS及大腸桿菌O25A及O25B菌株之抗體。
下表13及14分別提供前述實例中所使用之某些菌株及質粒之細節。
本文所闡述之實施例僅意欲具有實例性且彼等熟習此項技術者僅使用常規實驗即可認識到或能夠確定本文所闡述之特定程序之多種等效形式。認為所有該等等效形式皆在本發明範圍內且其係由下文申請專利範圍所涵蓋。
本文所引用之所有參考文獻(包含專利申請案、專利及出版物)之全部內容出於所有目的皆以引用方式併入本文中,其併入程度就如同每一個別出版物或專利或專利申請案皆具體地且個別地指出其全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中一般。
7. 實施例 實施例1:
1.一種原核宿主細胞,其包括:a. rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO:12)、rfb(upec163)基因簇或rfb(upec177)基因簇;b. 編碼寡糖基轉移酶之核苷酸序列;及c. 編碼包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白之核苷酸序列,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14)。
2.一種原核宿主細胞,其包括:a. rmlBrmlDrmlArmlCwzxwekAwekBwzywbbJwbbKwbbL;b. 編碼寡糖基轉移酶之核苷酸序列;c. 編碼包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白之核苷酸序 列,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14)。
3.一種原核宿主細胞,其包括:a. 編碼以下之核苷酸序列:i. dTDP-葡萄糖4,6-去水酶;ii. dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶;iii. 葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶;iv. dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶;v. O抗原翻轉酶;vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶;vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基轉移酶;viii. O抗原聚合酶;ix. O-乙醯基轉移酶;x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶;及xi. dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶;b. 編碼寡糖基轉移酶之核苷酸序列;c. 編碼包括共有序列Asn-X-Ser(Thr)之載體蛋白之核苷酸序列,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14)。
4.如請求項3之宿主細胞,其中:a. 該dTDP-葡萄糖4,6-去水酶包括與由SEQ ID NO:1編碼之dTDP-葡萄糖4,6-去水酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;b. 該dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶包括與由SEQ ID NO:2編碼之dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶至少80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;c. 該葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶包括與由SEQ ID NO:3編碼之葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;d. 該dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶包括與由SEQ ID NO:4編碼之dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;e. 該O抗原翻轉酶包括與由SEQ ID NO:5編碼之O抗原翻轉酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;f. 該鼠李糖基轉移酶(xi)包括與由SEQ ID NO:6編碼之鼠李糖基轉移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;g. 該葡萄糖基轉移酶(xii)包括與由SEQ ID NO:7編碼之葡萄糖基轉移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;h. 該O抗原聚合酶包括與由SEQ ID NO:8編碼之O抗原聚合酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;i. 該O-乙醯基轉移酶包括與由SEQ ID NO:9編碼之O-乙醯基轉移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;j. 該葡萄糖基轉移酶(x)包括與由SEQ ID NO:10編碼之葡萄糖基轉移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列;且k. 該鼠李糖基轉移酶(xi)包括與由SEQ ID NO:11編碼之鼠李糖基轉移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
5.如請求項1至4中任一項之宿主細胞,其中該宿主細胞係大腸桿菌(Escherichia coli)。
6.如請求項5之宿主細胞,其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因及rfb簇中之至少一者自該宿主細胞之基因組缺失或功能不活化。
7.如請求項1至6中任一項之宿主細胞,其中該載體蛋白係選自由以下組成之群:去毒之綠膿桿菌(P.aeruginosa)外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒之金黃色葡萄球菌(S.aureus)溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素之去毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白之承載結 構域、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素及其去毒變體、空腸彎曲桿菌(C.jejuni)AcrA及空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。
8.如請求項1至7中任一項之宿主細胞,其中該載體蛋白包括最佳化N-糖基化共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr),其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)。
9.如請求項1至8中任一項之宿主細胞,其中該載體蛋白包括一或多個以重組方式引入之共有序列。
10. 如請求項1至9中任一項之宿主細胞,其中該載體蛋白包括使載體蛋白靶向該宿主細胞之周質間隙中之信號序列。
11. 如請求項10之宿主細胞,其中該信號序列係選自由來自以下之信號序列組成之群:大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MalE)、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovorans)果膠酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)木聚糖內切酶(XynA)、不耐熱大腸桿菌腸毒素LTIIb、芽孢桿菌木聚糖內切酶XynA或大腸桿菌鞭毛蛋白(FlgI)。
12. 一種製備N-糖基化載體蛋白之方法,該方法包括:a.培養如請求項1至11中任一項之宿主細胞;及b.純化該N-糖基化載體蛋白。
13. 一種N-糖基化載體蛋白,其係藉由如請求項12之方法產生。
14. 如請求項13之N-糖基化載體蛋白,其包括式O25B之化合物:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
15. 如請求項13之N-糖基化載體蛋白,其包括式O25B’之化合物:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
16. 一種分離O抗原,其係來自諸如upec138、upec163或upec177等O25B菌株。
17. 一種載體蛋白,其N-連接至如請求項15之O抗原。
18. 一種分離大分子之群體,其分離大分子包括式O25B結構:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15 至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
19. 一種分離大分子之群體,其分離大分子包括式O25B’結構:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
20. 一種醫藥組合物,其包括含有式O25B結構之大分子:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
21. 一種醫藥組合物,其包括含有式O25B’結構之大分子:
其中n係介於1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15 至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間之整數。
22. 如請求項20之醫藥組合物,其中該式O25B結構共價結合至載體蛋白中之Asn殘基。
23. 如請求項21之醫藥組合物,其中該式O25B’結構共價結合至載體蛋白中之Asn殘基。
24. 如請求項20或21之醫藥組合物,其中該Asn殘基位於共有序列Asn-X-Ser(Thr)中,其中X可為除Pro外之任何胺基酸(SEQ ID NO:14)。
25. 如請求項1至11中任一項之原核宿主細胞,其中該寡糖基轉移酶對該宿主細胞為異源性。
26. 如請求項1至11之原核宿主細胞,其中該寡糖基轉移酶係空腸彎曲桿菌寡糖基轉移酶pglB
27. 如請求項1至11中任一項之原核宿主細胞,其中該載體蛋白對該宿主細胞為異源性。
28. 如請求項1至11、25、26或27中任一項之原核宿主細胞,其中該載體蛋白並非大腸桿菌蛋白。
29. 一種生成包括L-Rha(2Ac)之寡糖之方法,其包括將糖或寡糖與包括SEQ ID NO:11之鼠李糖基轉移酶一起培育,其中該糖或寡糖包括末端D-GlcNAc。
30. 如請求項29之方法,其中該L-Rha(2Ac)及D-GlcNAc係經由α 1,3鏈接連接。
31. 如請求項29之方法,其中該培育發生於活體外。
32. 如請求項29之方法,其中在重組表現包括SEQ ID NO:11之鼠李糖基轉移酶之宿主細胞中生成該寡糖。
實施例2:
1.一種組合物,其包括:(i)O25B生物偶聯物,其包括共價結合至載體蛋白之Asn殘基之大腸桿菌O25B抗原;(ii)O1A生物偶聯物,其包括共價結合至載體蛋白之Asn殘基之大腸桿菌O1A抗原;(iii)O2生物偶聯物,其包括共價結合至載體蛋白之Asn殘基之大腸桿菌O2抗原;及(iv)O6生物偶聯物,其包括共價結合至載體蛋白之Asn殘基之大腸桿菌O6抗原。
2.如請求項1之組合物,其中該O25B抗原、O1A抗原、O6抗原及O2抗原分別包括下列式:
3.如請求項1或2之組合物,其中該載體蛋白係選自由以下組成之群:去毒之綠膿桿菌外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒之金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素之去毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白之承載結構域、肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素及其去毒變體、空腸彎曲桿菌AcrA及空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。
4.如請求項3之組合物,其中該載體蛋白係去毒EPA、CRM197或MBP。
5.如請求項1至4中任一項之組合物,其中該載體蛋白之該Asn殘基位於共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)中,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)。
6.一種治療具有腸外病原性大腸桿菌之個體之感染之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至5中任一項之組合物。
7.一種預防具有腸外病原性大腸桿菌之個體之感染之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至5中任一項之組合物。
8.一種誘導個體之抵抗腸外病原性大腸桿菌之免疫反應之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至5中任一項之組合物。
9.一種誘導在個體中產生特異性針對腸外病原性大腸桿菌之調理吞噬抗體之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至5中任一項之組合物。
10. 如請求項6、8或9之方法,其中該個體已診斷有泌尿道感染。
11. 如請求項7、8或9之方法,其中該個體處於發生泌尿道感染 之風險下。
12. 如請求項6、8或9之方法,其中該個體已診斷有菌血症。
13. 如請求項7、8或9之方法,其中該個體處於發生菌血症之風險下。
14. 如請求項6、8或9之方法,其中該個體已診斷有敗血病。
15. 如請求項7、8或9之方法,其中該個體處於發生敗血病之風險下。
16. 如請求項6至16中任一項之方法,其中該個體係人類。
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<211> 10653
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<220>
<223> 大腸桿菌rfb(upec138)基因簇
<400> 12
<210> 13
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括4個最佳最佳化N-糖基化序列之去毒EPA蛋白
<400> 13
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-糖基化共有序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=任何胺基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Ser或Thr
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-糖基化共有序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Asp或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Ser或Thr
<400> 15

Claims (20)

  1. 一種組合物,其包括大腸桿菌(E.coli)O25B抗原共價偶合至載體蛋白之生物偶聯物(bioconjugate),其中該大腸桿菌O25B抗原包括式O25B結構: 其中n係介於1與30之間之整數。
  2. 如請求項1之組合物,其中該大腸桿菌O25B抗原包括式O25B’結構: 其中n係介於1與30之間之整數。
  3. 如請求項1或2之組合物,其中該大腸桿菌O25B抗原共價結合至該載體蛋白中之Asn殘基。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物,其進一步包括:(i)O1A生物偶聯物,其包括大腸桿菌O1A抗原共價結合至載體蛋白之Asn殘基;(ii)O2生物偶聯物,其包括大腸桿菌O2抗原共價結合至載體蛋白之Asn殘基;及(iii)O6生物偶聯物,其包括大腸桿菌O6抗原共價結合至載體蛋白之Asn殘基。
  5. 如請求項4之組合物,其中該O1A抗原、O6抗原及O2抗原分別包 括下列式:
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物,其中該載體蛋白係選自由以下組成之群:去毒之綠膿桿菌(P.aeruginosa)外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒之金黃色葡萄球菌(S.aureus)溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素之去毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白之承載結構域(passenger domain)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素及其去毒變體、空腸彎曲桿菌(C.jejuni)AcrA及空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。
  7. 如請求項6之組合物,其中該載體蛋白係去毒EPA。
  8. 如請求項3至7中任一項之組合物,其中該載體蛋白之Asn殘基位 於共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)中,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)。
  9. 一種對個體接種疫苗以抵抗腸外病原性大腸桿菌之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至8中任一項之組合物。
  10. 一種誘導個體抵抗腸外病原性大腸桿菌之免疫反應之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至8中任一項之組合物。
  11. 一種誘導個體產生對腸外病原性大腸桿菌特異性之調理吞噬(opsonophagocytic)抗體之方法,其中該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至8中任一項之組合物。
  12. 如請求項9至11中任一項之方法,其中該個體處於發生泌尿道感染之風險。
  13. 如請求項9至11中任一項之方法,其中該個體處於發生菌血症之風險。
  14. 如請求項9至11中任一項之方法,其中該個體處於發生敗血症之風險。
  15. 如請求項9至14中任一項之方法,其中該個體係人類。
  16. 一種原核宿主細胞,其包括:a. 編碼以下之核苷酸序列:i. dTDP-葡萄糖4,6-去水酶;ii. dTDP-6-去氧-D-葡萄糖3,5-差向異構酶;iii. 葡萄糖-1-磷酸胸苷醯轉移酶;iv. dTDP-4-去氫鼠李糖3,5-差向異構酶;v. O抗原翻轉酶;vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉 移酶;vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基轉移酶;viii. O抗原聚合酶;ix. O-乙醯基轉移酶;x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基轉移酶;及xi. dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基轉移酶;b. 編碼寡糖基轉移酶之核苷酸序列;及c. 編碼包括共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)之載體蛋白之核苷酸序列,其中X及Z獨立地選自除Pro外之任何天然胺基酸(SEQ ID NO:15)。
  17. 如請求項16之宿主細胞,其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb簇中之至少一者自該宿主細胞之基因組缺失或功能不活化。
  18. 如請求項16或17之宿主細胞,其中該載體蛋白係選自由以下組成之群:去毒之綠膿桿菌外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結合蛋白(MBP)、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒之金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素之去毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素之去毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白之承載結構域、肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素及其去毒變體、空腸彎曲桿菌AcrA及空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。
  19. 如請求項16至18中任一項之宿主細胞,其中該宿主細胞係大腸桿菌宿主細胞。
  20. 一種製備包括大腸桿菌O25B抗原之N-糖基化載體蛋白之方法, 該方法包括:a. 培養如請求項16至19中任一項之宿主細胞;及b. 純化包括大腸桿菌O25B抗原之N-糖基化載體蛋白。
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