EA046206B1

EA046206B1 - Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения

Info

Publication number: EA046206B1
Application number: EA202192390
Authority: EA
Inventors: Ерун Гёртсен; Ян Тёнис Пулман; Келлен Кристина Фа; Питер Ян Бюргаут; Эвелине Марлен Верденбург; Ион Патрисиа Ибарра; Даррен Роберт Аббанат; Стэфан Йохен Кеммлер; Михель Томас Коварик; Мануэла Малли; Фонк Вероника Гамбиллара; Мартин Эдвард Браун; Сандмейер Мария Паула Карранза
Original assignee: Янссен Фармасьютикалз, Инк.; Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2024-02-15

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 62/819746, поданной 18 марта 2019 г, содержание которой включено в данный документ во всей полноте путем ссылки.

Ссылка на перечень последовательностей, поданный в электронном виде

Данная заявка содержит перечень последовательностей, поданный в электронном виде через EFSWeb в виде перечня последовательностей в формате ASCII в файле под названием 004852_11560_Sequence-Listing, созданного 11 марта 2020, размером 198 кБ. Перечень последовательностей, поданный через EFS-Web, является частью описания и включен в него во всей полноте путем ссылки.

Предшествующий уровень техники

Внекишечные патогенные штаммы Е.соН (ЕхРЕС) обычно являются безвредными обитателями желудочно-кишечного тракта человека, наряду с комменсальными штаммами Е.соН. Изоляты ЕхРЕС трудно отличить от комменсальных изолятов по серотипу, несмотря на преобладание ЕхРЕС во многих клональных линиях, что определяется по серотипам О-антигена, капсулярного и жгутикового антигена (сокращенно О:К:Н, например О25:К1:Н4). В отличие от комменсальных Е.соН, штаммы ЕхРЕС экспрессируют широкий спектр факторов вирулентности, позволяющих им колонизировать желудочно-кишечный тракт, а также вызывать широкий спектр внекишечных инфекций, связанных с существенной нагрузкой на систему здравоохранения из-за госпитализаций и летальных исходов. Новорожденные, пожилые люди и пациенты с ослабленным иммунитетом частично подвержены инфекциям ЕхРЕС, включая инвазивную болезнь ЕхРЕС (IED).

Штаммы ЕхРЕС являются наиболее частой причиной инфекций мочевыводящих путей (ИМП) и вносят важный вклад в инфекции послеоперационной раны и менингит новорожденных. Эти штаммы также связаны с инфекциями брюшной полости и таза и внутрибольничной пневмонией, и порой сопровождают другие внекишечные инфекции, такие как остеомиелит, флегмона и раневые инфекции. Все эти первичные очаги инфекции могут привести к бактериемии ЕхРЕС. ЕхРЕС является наиболее частой причиной внебольничной бактериемии и основным возбудителем внутрибольничной бактериемии и обнаруживается примерно в 17-37% клинически значимых изолятов крови. Пациенты с ЕхРЕСположительным посевом крови обычно страдают септическим синдромом, тяжелым сепсисом или септическим шоком. Наблюдается повышение устойчивости ЕхРЕС к антибиотикам первой линии, включая цефалоспорины, фторхинолоны и триметоприм/сульфаметоксазол. Появление и быстрое массовое распространение ЕхРЕС с типом последовательности 131 (ST131) считается основным фактором, вызывающим повышенную лекарственную устойчивость, включая множественную лекарственную устойчивость. Среди клинических изолятов ЕхРЕС этот клон обнаруживается в 12,5-30%, в основном имеет серотип О25Ь:Н4 и демонстрирует выраженную резистентность к фторхинолонам, которая часто сопровождается устойчивостью к триметоприму/сульфаметоксазолу, и имеет бета-лактамазы расширенного спектра, придающие устойчивость к цефалоспоринам. О-антиген включает иммунодоминантный компонент липополисахарида клеточной стенки (ЛПС) грамотрицательных бактерий, включая Е.соН. В настоящее время идентифицировано более 180 серологически уникальных О-антигенов Е.соН, при этом подавляющее большинство изолятов ЕхРЕС классифицируются по менее чем 20 серотипам О-антигенов. Полноразмерные О-антигены Е.соН обычно состоят из примерно 10-25 повторяющихся сахарных единиц, присоединенных к высококонсервативной центральной структуре LPS, причем каждый компонент синтезируется отдельно ферментами, кодируемыми преимущественно генными кластерами rfb и rfa, соответственно. После полимеризации О-антигена остов полисахаридного О-антигена может быть модифицирован, обычно путем добавления остатков ацетила или глюкозы. Эти модификации эффективно увеличивают разнообразие серотипов за счет создания антигенно различных серотипов, которые имеют общий полисахаридный остов, но различаются боковыми ответвлениями. Гены, кодирующие ферменты, модифицирующие О-антиген, обычно находятся за пределами кластера rfb на хромосоме, и в некоторых случаях эти гены обнаруживаются внутри лизогенных бактериофагов.

Изоляты ЕхРЕС, принадлежащие к серогруппе O4, обычно выявлялись в современных мониторинговых исследованиях изолятов крови в США и ЕС. Структура полисахарида O4 была определена как ->2) α-L-Rha (1->6) α-D-Glc (1->3) α-L-FucNAc (1->3) β-D-GlcNAc (1-> из штамма Е.соН O4:K52 (Jann et al., Carbohydr. Res. (1993) v. 248, pp.241-250). Для штаммов O4:K3, O4:K6 и O4:K12 была определена отдельная форма структуры полисахарида O4, у которых указанная выше структура модифицирована добавлением α-D-Glc (1->3), связанной с остатком рамнозы полисахарида (Jann et al., 1993, см. выше), эта форма полисахарида упоминается ниже в данном документе как гликозилированный O4. Ферменты, ответственные за модификацию О-антигена в штаммах Е.соН O4, не идентифицированы. Усилия по разработке вакцины для предотвращения инфекций ЕхРЕС были сосредоточены на конъюгатах полисахаридного О-антигена. Конъюгированная 12-валентная вакцина с О-антигеном была синтезирована путем выделения и очистки полисахаридного О-антигена и химической конъюгации с обезвреженным экзотоксином A Pseudomonas aeruginosa и протестирована на безопасность и иммуногенность в клиническом

- 1 046206 исследовании 1 фазы (Cross et al., J. Infect. Dis. (1994) v.170, pp.834-40). Эта вакцина-кандидат никогда не была лицензирована для клинического применения. Недавно была разработана система биоконъюгирования в Е.соН. в которой полисахаридный антиген и белок-носитель синтезируются in vivo и впоследствии конъюгируются in vivo за счет активности олигосахарилтрансферазы PglB, фермента Campylobacter jejuni, экспрессируемого в Е.соН (Wacker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2006) v. 103, pp. 7088-93). Эта система гликозилирования N-связанного белка способна переносить различные полисахариды на белокноситель, что позволяет использовать простые способы для очистки конъюгата.

Биоконъюгирование успешно применялось для получения конъюгированного полисахарида для четырехвалентной вакцины-кандидата с О-антигеном Е.соН (Poolman and Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), pp. 6-13). Однако разработка успешной вакцины ЕхРЕС требует охвата преобладающих серотипов, а наличие дополнительных модификаций О-антигена в подмножествах изолятов ЕхРЕС представляет собой дополнительную проблему при охвате изолятов, экспонирующих немодифицированный и модифицированный LPS.

Краткое изложение сущности изобретения

Ввиду увеличения устойчивости изолятов ЕхРЕС к антибиотикам и наличия дополнительных модификаций О-антигена среди преобладающих О-серотипов, существует потребность в улучшении профилактики и терапии этих инфекций.

Изобретение удовлетворяет эту потребность за счет определения генетического состава современных клинических изолятов, включая выявление генов, кодирующих ферменты, модифицирующие Оантиген, тем самым позволяя создавать рекомбинантные клетки-хозяева, способные синтезировать биоконъюгаты О-антигенов, включая биоконъюгаты, содержащие выбранные модификации О-антигена.

В одном аспекте в настоящем документе предложен биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН имеет структуру формулы (O4-Glc +), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, например от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

В конкретном воплощении гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН ковалентно связан с остатком аспарагина (Asn) в сайте гликозилирования в белке-носителе, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях белок-носитель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А Р.aeruginosa (ЕРА), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Sat E.coli, домена-пассажира белка Sat E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P.aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae. В конкретном воплощении белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa (EPA). В таких воплощениях ЕРА предпочтительно содержит от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, предпочтительно от 2 до 4, консенсусных последовательностей гликозилирования, имеющих SEQ ID NO: 1, консенсусные последовательности предпочтительно имеют SEQ ID NO: 2.

В конкретном воплощении белок-носитель содержит четыре консенсусные последовательности гликозилирования (ЕРА-4). В предпочтительном воплощении белок носитель ЕРА содержит SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте предложена композиция или иммуногенная композиция, содержащая биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген, ковалентно связанный с белком-носителем.

В некоторых воплощениях композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген, ковалентно связанный с белком-носителем, где по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген выбран из группы, состоящей из полисахаридного антигена O1A E.coli, полисахаридного антигена O2 E.coli, полисахаридного антигена О6А Е.соН, полисахаридного антигена O8 E.coli, полисахаридного антигена O15 E.coli, полисахаридного антигена O16 E.coli, полисахаридного антигена O18 E.coli, полисахаридного антигена 025b E.coli и полисахаридного антигена O75 E.coli. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген O1A E.coli содержит структуру формулы (О1А), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген O2 Е.соН содержит структуру формулы (O2), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген О6АЕ.соН содержит структуру формулы (О6А), как показано в табл. 1, где n представляет собой

- 2 046206 целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген 08 Е.соН содержит структуру формулы (O8), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген O15 E.coli содержит структуру формулы (O15), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген O16 Е.соН содержит структуру формулы (O16), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген 018 а Е.соН содержит структуру формулы (018 а), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген 025В Е.соН содержит структуру формулы (025В), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. В конкретных воплощениях полисахаридный антиген O75 Е.соН содержит структуру формулы (O75), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

В некоторых воплощениях каждый дополнительный антиген O1 А, O2, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и/или O75 Е.соН ковалентно связан с остатком Asn в сайте гликозилирования, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2, в каждом белке-носителе. В конкретных воплощениях каждый белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa (EPA). Предпочтительно каждый ЕРА содержит 110, предпочтительно 2-4, предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2. В конкретных воплощениях каждый ЕРА содержит SEQ ID NO:3.

В конкретных воплощениях композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере полисахаридные антигены O1 А, O2, гликозилированный O4, О6А и 025В E.coli, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем. В конкретных воплощениях композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный O4, О6А, O8, O15, O16, 025В и O75 E.coli, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем. В конкретных воплощениях композиция или иммуногенная композиция содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75 E.coli, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем.

В конкретном аспекте предложена композиция или иммуногенная композиция, которая содержит:

(1) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем обезвреженным экзотоксином AR.aeruginosa (ЕРА-4), содержащим SEQ ID NO: 3, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+);

(2) биоконъюгат полисахаридного антигена O1A E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O1A Е.соН содержит структуру формулы (O1A);

(3) биоконъюгат полисахаридного антигена O2 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O2 Е.соН содержит структуру формулы (O2);

(4) биоконъюгат полисахаридного антигена O6A E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O6A Е.соН содержит структуру формулы (O6A);

(5) биоконъюгат полисахаридного антигена O8 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O8 Е.соН содержит структуру формулы (O8);

(6) биоконъюгат полисахаридного антигена O15 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O15 Е.соН содержит структуру формулы (O15);

(7) биоконъюгат полисахаридного антигена O16 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O16 Е.соН содержит структуру формулы (O16);

(8) биоконъюгат полисахаридного антигена 025В E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген 025В Е.соН содержит структуру формулы (025В); и (9) биоконъюгат полисахаридного антигена O75 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O75 Е.соН содержит структуру формулы (O75), где структура каждой из формул (O4-Glc+), (O1A), (O2), (O6A), (O8), (O15), (O16), (O18A), (025В) и (O75) показана в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, например от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

В некоторых воплощениях такая композиция или иммуногенная композиция дополнительно содержит:

(10) биоконъюгат полисахаридного антигена O18A Е.соН, ковалентно связанный с белкомносителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O18A Е.соН содержит структуру формулы (O18A), где структура формулы (O18A) показана в табл. 1, и n в данной структуре представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, например от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, на

- 3 046206 пример от 10 до 20.

В некоторых воплощениях биоконъюгат полисахаридного антигена 025В E.coli присутствует в композиции, описанной в данном документе, в концентрации, которая приблизительно в 1,5-6 раз, например, в 2-4 раза выше, чем концентрация любого другого биоконъюгата в композиции.

В некоторых воплощениях композиция, описанная в данном документе, содержит биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, O2, гликозилированного O4, О6А, O8, O15, O16, 025b и O75 Е.соН, причем биоконъюгаты О1А:О2:гликозилированного О4:О6А:О8:О15:О16:О25В:О75 присутствуют в массовом соотношении полисахаридов 1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:4:1.

В некоторых воплощениях композиция, описанная в данном документе, содержит биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, O2, гликозилированного O4, О6А, O8, O15, O16, 018а, O25B и O75 Е.соН, причем биоконъюгаты О1А:О2:гликозилированного О4:О6А:О8:О15:О16:О18А:О25В:О75 присутствуют в массовом соотношении полисахаридов 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:1:4:1.

В некоторых воплощениях концентрация биоконъюгата полисахаридного антигена 025В E.coli в композиции, описанной в данном документе, составляет от 2 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 8 до 40 мкг/мл, например, от 16 до 32 мкг/мл.

В другом аспекте предложен способ индукции у субъекта антител против гликозилированного антигена O4 E.coli, включающий введение субъекту биоконъюгата гликозилированного антигена O4 E.coli, описанного в настоящем документе, или композиции или иммуногенной композиции, описанных в данном документе.

В конкретном воплощении антитела обладают опсонофагоцитарной активностью.

В другом аспекте предложен способ вакцинации субъекта против внекишечной патогенной E.coli, включающий введение субъекту биоконъюгата гликозилированного антигена 04 E.coli, описанного в настоящем документе, или композиции или иммуногенной композиции, описанных в данном документе. В некоторых аспектах предложен биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, описанный в данном документе, или композиция или иммуногенная композиция, описанные в данном документе, для применения в индукции антител против гликозилированного антигена 04 E.coli. В некоторых аспектах предложен биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена 04 E.coli, описанный в данном документе, или композиция или иммуногенная композиция, описанные в данном документе, для применения в вакцинации против внекишечногй патогенной E.coli (ЕхРЕС). В некоторых аспектах предложено применение биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена 04 E.coli, описанного в данном документе, или композиции или иммуногенной композиции, описанных в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для индукции у субъекта антител против гликозилированного антигена 04 E.coli. В некоторых аспектах предложено применение биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, описанного в данном документе, или композиции или иммуногенной композиции, описанных в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для вакцинации субъекта против внекишечной патогенной E.coli (ЕхРЕС). В другом аспекте в настоящем документе предложена рекомбинантная клетка-хозяин для получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигенаа O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, например от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20, клетка-хозяин содержит:

(1) нуклеотидную последовательность генного кластера rfb для полисахаридного антигена O4 Е.соН;

(2) нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4, где глюкозилтрансфераза способна модифицировать полисахаридный антиген O4 Е.соН с получением гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН;

(3) нуклеотидные последовательности, кодирующие транслоказу и гликозилтрансферазу, последовательности которых по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, где транслоказа способна транслоцировать бактопренол-связанную глюкозу, а гликозилтрансфераза способна глюкзилировать бактопренол;

(4) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель; и (5) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил трансферазу, способную ковалентно связывать полисахаридный антиген O4 Е.соН с белком-носителем с получением биоконъюгата.

В конкретном воплощении рекомбинантная клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу, которая способна модифицировать полисахаридный антиген O4 Е.соН для получения гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН и имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях глюкозилтрансфераза содержит SEQ ID N0: 4.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую транслоказу, которая способна транслоцировать бактопренол-связанную глюкозу и

- 4 046206 имеет последовательность, которая по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых воплощениях транслоказа содержит SEQ ID NO: 7.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую гликозилтрансферазу, которая способна гликозилировать бактопренол и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых воплощениях гликозилтрансфераза содержит SEQ ID NO: 8. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует олигосахарилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В предпочтительных воплощениях олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, имеющую мутацию N311V, более предпочтительно SEQ ID NO: 6, имеющую обе мутации Y77H и N311V. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок-носитель, содержащий по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях кластер генов rfb для полисахаридного антигена O4 Е.соН содержит последовательность, которая кодирует ферменты, которые создают полисахаридный антиген O4 Е.соН (формула (O4-Glc-) в табл. 1), и которая по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO: 9. В некоторых воплощениях кластер генов rfb содержит SEQ ID NO: 9.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А P.aeruginosa (EPA), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Satis E.coli, домена-пассажира белка Satis E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P. aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae.

В конкретном воплощении рекомбинантная клетка-хозяин кодирует белок-носитель обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), предпочтительно ЕРА, содержащий 1-10, предпочтительно 2-4, предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2. В предпочтительном воплощении ЕРА, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно, рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой Е.соН, например, штамм Е.соН K-12, такой как штамм W3110.

В другом аспекте предложен способ получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахар идный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, например от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20, способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по изобретению в условиях для продуцирования биоконъюгата. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает выделение биоконъюгата из рекомбинантной клетки-хозяина. В другом аспекте предложен биоконъюгат, полученный описанным способом. В другом аспекте предложена композиция, содержащая биоконъюгат, полученный описанным способом.

В другом аспекте предложен способ получения рекомбинантной клетки-хозяина для получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, например от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20, способ включает введение одной или более чем одной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку для продуцирования рекомбинантной клетки-хозяина, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит:

(3) нуклеотидные последовательности, кодирующие транслоказу и гликозилтрансферазу, последовательности которых по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, где транс

- 5 046206 локаза способна транслоцировать бактопренол-связанную глюкозу, а гликозилтрансфераза способна глюкзилировать бактопренол;

(4) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель; и (5) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу, способную ковалентно связывать гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН с белком-носителем с получением биоконъюгата.

В конкретном воплощении глюкозилтрансфераза, которая способна модифицировать полисахаридный антиген O4 Е.соН для получения гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях глюкозилтрансфераза содержит SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую аминокислотную мутацию N311V. В некоторых воплощениях олигосахарилтрансфераза содержит SEQ ID NO: 6, имеющую аминокислотные мутации Y77H и N311V.

В некоторых воплощениях транслоказа способна транслоцировать связанную с бактопренолом глюкозу и имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 7. В некоторых воплощениях транслоказа содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых воплощениях гликозилтрансфераза способна гликозилировать бактопренол и имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 8. В некоторых воплощениях гликозилтрансфераза содержит SEQ ID NO: 8. В некоторых воплощениях белок-носитель содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях белок-носитель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А Р.aeruginosa (ЕРА), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Sat E.coli, домена-пассажира белка Sat E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P. aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae. В конкретном воплощении белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), предпочтительно ЕРА, содержащий 1-10, предпочтительно 2-4, предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2. В конкретных воплощениях белок-носитель представляет собой ЕРА с четырьмя консенсусными последовательностями гликозилирования (ЕРА-4), предпочтительно белокноситель содержит SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку Е.соН, например, из штамма Е.соН K12, такого как штамм W3110. В другом аспекте предложен способ получения биоконъюгата полисахаридного антигена О_х, ковалентно связанного с белком-носителем, способ включает стадии:

(1) получения рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей:

а. нуклеотидную последовательность кластера генов rfb для полисахаридного антигена О_х;

б. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2, и

в. нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу PglB_y; и (2) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина в условиях для продуцирования биоконъюгата, где:

ког да антиген О_х представляет собой полисахаридный антиген O1A, PglBy содержит аминокислотные мутации N311V, K482R, D483H и A669V;

когда антиген Ох представляет собой гликозилированный полисахаридный антиген O4, PglBy содержит аминокислотную мутацию N311V или аминокислотные мутации Y77H и N311V, а рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно содержит последовательность, кодирующую GtrS, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4, и нуклеотидную последовательность, кодирующую GtrA и GtrB, последовательность которых по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 7 и

- 6 046206

8, соответственно;

когда антиген О_х представляет собой полисахаридный антиген О6А, PglB_y содержит аминокислотные мутации N311V, K482R, D483H и A669V;

когда антиген О_х представляет собой полисахаридный антиген O8, PglBy не содержит аминокислотные мутации в положениях 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 и 669;

когда антиген О_х представляет собой полисахаридный антиген O15, PglBy содержит аминокислотные мутации N311V, K482R, D483H и A669V;

когда антиген О_х представляет собой полисахаридный антиген O16, PglB_y содержит аминокислотные мутации Y77H, S80R, Q287P, K289R и N311V;

когда антиген Ох представляет собой полисахаридный антиген О18А, PglBy не содержит аминокислотные мутации в положениях 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 и 669; и когда антиген О_х представляет собой полисахаридный антиген O75, PglBy содержит аминокислотную мутацию N311V, где в каждом случае аминокислотные мутации относятся к PglBy дикого типа, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В некоторых воплощениях белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa (EPA). Предпочтительно белок-носитель ЕРА содержит 1-10, предпочтительно 2-4, предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2. В конкретном воплощении белок носитель ЕРА содержит SEQ ID NO: 3. В другом аспекте предложен биоконъюгат, полученный способом получения биоконъюгата полисахаридного антигена О_х, ковалентно связанного с белком-носителем, как описано в данном документе. В другом аспекте предложена композиция, содержащая такой биоконъюгат. В таких воплощениях композиция содержит по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 5, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 таких биоконъюгатов.

Краткое описание графических материалов

Приведенное ниже краткое описание, а также подробное описание изобретения будет более понятным при прочтении в привязке к графическим материалам. Следует понимать, что изобретение не ограничено конкретными воплощениями, приведенными в графических материалах.

В графических материалах:

на фиг. 1А-В показаны измеренные в ELISA титры IgG против немодифицированного (GLC-) или глюкозо-модифицированного (GLC+) O4 LPS в сыворотке от двух кроликов, иммунизированных биоконъюгатом Glc-модифицированного полисахарида O4, как описано в примере 4; титры определяли методом ELISA в четырех повторностях;

на фиг. 2 показаны титры IgG в ELISA с цельными клетками и объединенной сывороткой кроликов, иммунизированных биоконъюгатом Glc-модифицированного O4 против изолятов Е.соН O4 с охарактеризованным статусом gtrS, как описано в примере 4; следующие изоляты были gtrS-отрицательными: А2625, stGVXN4988, OC24784, ОС24787 и ОС24788; следующие изоляты были gtrS-положительными: Y1382, Е551, ОС24334, stGVXN4983, stGVXN4994 и ОС24794; также был включен штамм ОС9487 (АТСС 35383; серотип O75), служивший отрицательным контролем; На фиг. 3А-В показаны вестернблоты LPS, экстрагированного из gtrS-положительных и отрицательных изолятов O4, где для детекции использовали объединенную сыворотку кроликов, иммунизированных модифицированным полисахаридом O4;

на фиг. 4А и 4В показаны гуморальные ответы, индуцированные гликозилированными биоконъюгатами O4 (O4-Glc+)-EPA; на фиг. 4А показаны уровни антител в сыворотке, измеренные методом ELISA на 0, 14 и 42 дни после иммунизации; показаны индивидуальные титры (log10 EC50) и GMT ± 95% ДИ; серая пунктирная линия указывает порог, выше которого кривые разведения образцов описываются 4параметрической логистической регрессионной моделью; на фиг. 4В показаны результаты опсонофагоцитарного анализа (OPK) для определения функциональности антител в образцах сыворотки, полученных на 42 день после иммунизации биоконъюгатом гликозилированного O4 (O4-Glc+)- EPA (4,0 мкг); критерий суммы рангов Вилкоксона и поправка Бонферрони; * Р<0,05, *** Р<0,0001;

на фиг. 5 показан бустерный эффект гликозилированного биоконъюгата O4 (O4 Glc+) у крыс СпрегДоули (Sprague Dawley), иммунизированных 3 различными дозами, как описано в примере 4; уровни антител в сыворотке измеряли с помощью ELISA на 0, 14 и 42 день после иммунизации; индивидуальные титры (log 10 ЕС50) показаны для каждого животного; линии между точками данных соединяют титры IgG для каждого животного во времени; серая пунктирная линия указывает порог, выше которого кривые разведения образцов описываются 4-параметрической логистической регрессионной моделью; статистический анализ проводили с помощью знакового рангового критерия Вилкоксона и поправки Бонферрони для множественных сравнений (день 14 против дня 0, Р = 0,012 для 4,0 мкг/доза; день 42 против дня 0, Р = 0,006 для всех доз; день 42 против дня 14, Р = 0,006 для всех доз);

на фиг. 6 показана функциональность антител, индуцированная биоконъюгатом O4-Glc+-EPA; крыс Спрег-Доули (Sprague Dawley) иммунизировали 3 раза внутримышечно буфером для приготовления композиции или биоконъюгатом O4 (Glc+)-EPA в дозе 4,00 мкг/доза; функциональность антител опреде

- 7 046206 ляли путем исследования опсонофагоцитарной активности (OPKA) с использованием штаммов O4(Glc+) и O4(Glc-) E.coli; показаны индивидуальные опсонические титры (O1) и GMT ± 95% ДИ;

на фиг. 7А-В показаны электрофореграммы, по виду напоминающие блот, полученные при скрининге PglB при помощи капиллярного электрофореза с использованием моноклональных антител для детекции биоконъюгата O4-Glc+ в периплазматической фракции, позволяющие визуализировать продуцирование биоконъюгата O4-Glc+ для каждого тестируемого штамма. Моногликозилированный продукт примерно 180 кДа, дигликозилированный продукт примерно 320 кДа и тригликозилированный продукт примерно 450 кДа. А) Первый цикл скрининга PglB дикого типа на дорожке 3, N311V-PglB на дорожках 2 и 4, пустой контрольный штамм на дорожке 1 и другие варианты PglB на дорожках 5 и 6. Б) Второй цикл скрининга N311V PglB на дорожке 3, N311V+Y77H PglB на дорожке 9, пустой контрольный штамм на дорожках 1 и 2, другие варианты PglB на остальных дорожках;

на фиг. 8А-К показан гуморальный ответ, индуцированный вакциной ExPEC10V у новозеландских белых кроликов. Животные получали 3 внутримышечные инъекции ExPEC10V или физиологического раствора, которые вводили с интервалом 2 недели. Вакцину ExPEC10V вводили в 3 различных концентрациях (группа 1: высокая доза, группа 2: средняя доза и группа 3: низкая доза, табл. 11) и контрольная группа получала только физ. раствор (группа 4, 0,9% (мас./об.) раствор хлорида натрия). Уровни антител измеряли с помощью ELISA в день 0 (до вакцинации) и на 14, 27 и 42 дни (после вакцинации). Показаны индивидуальные титры (значения ЕС50) и средние геометрические титры (GMT) ± 95% ДИ. Критерий суммы рангов Уилкоксона с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Вакцинированных ExPEC10V животных (группа 1, 2 и 3) сравнивали с контролем, получившим физ. раствор (группа 4). *р<0,05, **р<0,01; ***р<0,001; ****р<0,0001. LOD: предел обнаружения;

на фиг. 9А-К показан гуморальный ответ, индуцированный ExPEC10V. Новозеландские белые кролики получали 3 внутримышечных иммунизации ExPEC10V (суммарно 105,6 мкг полисахарида) или 0,9% масс/об, раствор хлорида натрия (контроль). Титры IgG определяли при помощи ELISA в день 1 (до иммунизации, n= 20/группу), день 31 (после иммунизации, п=20/группу) и день 50 (после иммунизации, п=10/группу). На графиках показаны индивидуальные титры и среднее геометрическое значение ± 95% доверительный интервал для каждой группы. Различия в титрах IgG между групапми, получавшими ExPEC10V, и контрольной группой анализировали при помощи модели Tobit с критерием отношения правдоподобия. Значения р<0,05 считали значимыми. *Р<0,05, ****Р<0,0001;

на фиг. 10А-В показана общая схема клинического исследования 1/2а фазы с вакциной ExPEC10V у человека. На фиг. 10А показана общая схема исследования для когорты 1, а на фиг. 10В показана общая схема исследования для когорты 2. Подробности описаны в примере 11.

Подробное описание изобретения

Все публикации, статьи и патенты, которые процитированы или описаны в разделе Предшествующий уровень техники или в других разделах описания, включены во всей полноте путем ссылки. Обсуждение документов, действий, материалов, устройств, изделий и т.п., которые включены в данное описание, служит для раскрытия контекста изобретения. Такое обсуждение не является допущением, что какой-либо из указанных объектов или все из них являются частью уровня техники по отношению к любому из изложенных или заявленных изобретений. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют обычное значение, известное специалистам в области, к которой относится данное изобретение. В противоположном случае, некоторые упомянутые термины имеют значение, указанное в описании.

Следует отметить, что в описании и формуле изобретения все термины в единственном числе охватывают указанные объекты во множественном числе, за исключением случаев, когда из контекста явным образом не следует противоположное. Если не указано иное, термин по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в ряду.

Специалисты в данной области поймут или смогут обнаружить, проведя рутинные эксперименты, множество эквивалентов конкретных воплощений изобретения, описанных в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем данного изобретения.

Во всем этом описании и в приведенной далее формуле изобретения, если из контекста не следует иное, слово содержать и такие варианты, как содержит и содержащий, подразумевают включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий. При использовании в данном документе термин содержащий может быть заменен термином имеющий в своем составе или включающий, а иногда при использовании в данном документе термином имеющий. Состоящий из при использовании в данном документе исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанный в элементе формулы изобретения. Термин по существу состоящий из не исключает материалы или стадии, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики пункта формулы изобретения. Любой из вышеупомянутых терминов содержащий, имеющий в своем составе, включающий и имеющий всякий раз, когда они используются в данном документе в контексте аспекта или воплощения изобретения, может быть заменен термином состоящий из или по существу со

- 8 046206 стоящий из для изменения объема раскрытия.

В контексте настоящего описания союз и/или между множеством перечисленных элементов следует понимать как охватывающий как отдельные, так и комбинированные варианты. Например, если два элемента соединены и/или, первый вариант относится к применимости первого элемента без второго. Второй вариант относится к применимости второго элемента без первого. Третий вариант относится к применимости первого и второго элементов вместе. Подразумевается, что любой из этих вариантов подпадает под значение и, следовательно, удовлетворяет требованию термина и/или, используемого в данном документе. Подразумевается, что одновременное применение более чем одного из вариантов подпадает под это значение и, следовательно, удовлетворяет требованию термина и/или.

Выявление структурной модификации О-антигена, а именно ответвления глюкозы, в серотипе O4 Е.соН (Jann et al., 1993) представляет собой проблему для открытия и разработки гликоконъюгированной вакцины, нацеленной на бактериальные изоляты в этом серотипе. Доля современных клинических изолятов O4, экспрессирующих немодифицированные (не имеющие боковых ответвлений глюкозы) и модифицированные (имеющие боковые ответвления глюкозы) формы O4 О-антигена, неизвестны. Получение информации об этой характеристике имеет решающее значение для выбора соответствующей антигенной структуры. Кроме того, не определена степень, в которой индуцированные вакциной антитела против одной формы полисахарида O4, будут перекрестно реагировать с другой формой. Очистка Оантигена, свободного от липида А, и последующая химическая конъюгация с белком-носителем является длительным и трудоемким процессом. Кроме того, процессы очистки, обезвреживания липида А и химической конъюгации могут привести к потере эпитопов, гетерогенности антигена и снижению иммуногенности конъюгированного полисахарида. Синтез гликоконъюгатов путем биоконъюгирования может преодолеть эти ограничения классической очистки и химической конъюгации, но синтез in vivo Оантигена O4 с ответвлением глюкозы требует активности фермента, обеспечивающего ветвление полисахарида, который находится за пределами кластера генов rfb. На сегодняшний день модифицирующий О-антиген фермент, ответственный за ответвление глюкозы в штаммах O4 Е.соН, не идентифицирован. Клонирование генного кластера rfb O4 в биоконъюгирующий штамм Е.соН, экспрессирующий PglB, будет недостаточным для синтеза гликоконъюгата O4 с ответвлением глюкозы, а скорее приведет к образованию только биоконъюгатов O4 без ответвлений глюкозы (структура их гликана показана в формуле (O4) в табл. 1). Используемые в данном описании термины гликозилированный O4, O4 с ответвлением глюкозы, O4 Glc+ и Glc+ O4 О-антиген относятся к О-антигену O4 с боковым ответвлением глюкозы, и его структура показана в формуле (O4-Glc+) в табл. 1.

В настоящем документе раскрывается ген, кодирующий фермент, модифицирующий О-антиген, ответственный за ответвление глюкозы полисахаридного антигена O4 Е.соН. Также описаны клеткихозяева, например, генно-модифицированные клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую ферменты, способные продуцировать биоконъюгаты, содержащие гликозилированный полисахаридный антиген O4, ковалентно связанный с белком-носителем in vivo. Такие клетки-хозяева можно использовать для создания биоконъюгатов, содержащих гликозилированный антиген O4, связанный с белком-носителем, которые можно примененять, например, в составе терапевтических и/или профилактических композиций (например, вакцин). Кроме того, в настоящем документе предложены композиции, содержащие биоконъюгаты гликозилированного полисахаридного антигена O4, отдельно или в комбинации с другими антигенами Е.соН (например, полисахаридными антигенами O1, O2, O6, O8, O15, O16, O18, O25 и/или O75 и их подсеротипами). Композиции можно примененять в способах профилактики и/или терапии, например, вакцинации хозяев против инфекции Е.соН, и они могут найти применение в получении антител, которые можно применять, например, в способах терапии, таких как иммунизация субъектов.

Используемые в данном документе термины О-антиген, полисахаридный О-антиген, сахаридный О-антиген и OPS относятся к О-антигену грамотрицательных бактерий. Обычно О-антиген представляет собой полимер иммуногенных повторяющихся полисахаридных единиц. В конкретном воплощении термины О-антиген, полисахаридный О-антиген и OPS относятся к О-антигену Escherichia coli. Различные серотипы Е.соН экспрессируют разные О-антигены. В Е.соН продукты генов, участвующие в биогенезе О-антигена, кодируются генным кластером rfb. Используемые в данном документе термины кластер rfb и генный кластер rfb относятся к генному кластеру, кодирующему ферментный аппарат, способный синтезировать структуру, являющуюся остовом О-антигена. Термин кластер rfb может применяться к любому кластеру биосинтеза О-антигена и предпочтительно относится к кластеру генов из рода Escherichia, в частности, Е.соН.

Используемый в данном документе термин О1А относится к О1А антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O1). Термин O2 относится к O2 антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O2). Термин 06а относится к 06А антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O6). Термин O8 относится к O8 антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O8). Термин O15 относится к O15 антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O15). Термин 016 относится к O16 антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O16). Термин О18А относится к О18А антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O18). Термин 025В относится к 025В антигену Е.соН (подсеротипу Е.соН серотипа O25). Термин O75 от- 9 046206 носится к O75 антигену E.coli (подсеротипу E.coli серотипа O75).

Структуры полисахаридных О-антигенов E.coli, упоминаемые в данной заявке, показаны ниже в табл. 1. Показана одна повторяющаяся единица для каждого полисахаридного О-антигена Е.соН.

Таблица 1. Структуры полисахаридных О-антигенов Е.соН

Полисахарид- ные О- антигены Е. coli	Структура повторяющейся единицы¹
Негликозилированный полисахаридный антиген 04 (O4-G1C-)	[—2)-a-L-Rhap-(1 ->6)-a-D-Glcp-(1 ->3)-a-L-FucpNAc-( 1 ->3)-p-D-GlcpNAc-( 1 ->]„
Гликозилированный полисахаридный антиген 04 (O4-G1C+)	a-D-GIcp 1 3 [->2)-a-L-Rhap-(1 ->6)-a-D-Glcp-(1 -^3)-a-L-FucpNAc-(1 -^3>p-D-GlcpNAc-(1^]_n
Полисахаридный антиген О1А(О1А)	[—3)-a-L-Rhap-(1 —3>a-L-Rhap-(1 ->3> P-L-Rhap-(1 ->4)^-D-GlcpNAc-(1 -»]„ 2 t 1 β-D-ManpNAc
Полисахаридный антиген 02 (02)	[->3)-a-L-Rhap-(1 ->2)-a-L-Rhap-(1 -3)-p-L-Rhap-(1 ->4)-p-D-GlcpNAc-(1 -*]_n2 t 1 a-D-Fucp3NAc
Полисахаридный антиген О6А (Об)	[-4)-a-D-GalpNAc-(1 -»3)-p-D-Manp-(1 -»4)-fJ-D-Manp-(1 ->3)-a-D-GlcpNAc-(1 -]_n2 t 1 β-D-Glcp
Полисахаридный антиген 08 (08)	a-D-Manp3Me-(1 ->[3)-β-0-Μ3ηρ-(1 -2)-a-D-Manp-(1 ->2)-a-D-Manp-(1 -]_n
Полисахаридный антиген 015 (015)	[^2)-p-D-Galp-(1 ^3)-oc-i_-FucpNAc-(1 ->3)-p-D-GlcpNAc-(1 ->]_n
Полисахаридный антиген 016(016)	[->2)^-D-Galf-(1 ->6)-a-D-Glcp-(1 ->3)-a-L-Rhap-(1 -*3)-a-D-GlcpNAc-(1 -]_n2 f Ac

- 10 046206

Полисахаридный антиген О18А (О18А)	[-»2)-a-l_-Rhap-(1 ^6)^a-o-Glcp-(1 -4)-a-D-Galp-(1 -3)-a-D-GlcpNAc-(1 -]_n3 t 1 β-D-GlcpNAc
Полисахаридный антиген 025В (025В)	β-D-Glcp 1 I 6 [-*4)-a-D-Glcp-(1 -»3)-a-L-Rhap-(1 -»3)^-D-GlcpNAc-(1 ->]_n3 2 t t 1 Ac a-L-Rhap
Полисахаридный антиген 075 (075)	β-D-Manp 1 Φ 4 [^•3)-a-D-Galp-(1 -4-4)-a-L-Rhap-(1 -4-3)-3-D-GlcpNAc-(1 -э]_п

Каждый n независимо представляет собой целое число от 1 до 100, такое как 1-50, 1-40, 1-30, 1-20 и 1-10, 3-50, 3-40, например по меньшей мере 5, такое как 5-40, например 7-30, например от 7 до 25, например от 10 до 20, но в некоторых случаях может быть 1-2.

Все описанные в данном документе моносахариды имеют общее значение, известное в данной области. Моносахариды могут иметь конфигурацию D или L. Если D или L не указаны, считается, что сахар имеет D-конфигурацию. Моносахариды обычно обозначают аббревиатурами, широко известными и используемыми в данной области техники. Например, Glc относится к глюкозе, D-Glc относится к Dглюкозе, a L-Glc относится к L-глюкозе. Другие общепринятые аббревиатуры для моносахаридов включают: Rha, рамноза; GlcNAc, N-ацетилглюкозамин; GalNAc, N-ацетилгалактозамин; Fuc, фукоза; Man, манноза; Man3Me, 3-О-метил-манноза; Gal, галактоза; FucNAc, N-ацетилфукозамин и Rib, рибоза. Суффикс f' относится к фуранозе, а суффикс р относится к пиранозе.

Термины RU, единица повтора и повторяющаяся единица, используемые в отношении Оантигена, относятся к биологической повторяющейся единице (BRU) О-антигена, поскольку он синтезируется in vivo клеточными механизмами (например, гликозилтрансферазами). Количество RU О-антигена может варьировать в зависимости от серотипа, и в воплощениях изобретения обычно варьирует от примерно 1 до 100 RU, предпочтительно от примерно 1 до 50 RU, например, 1-50 RU, 1-40 RU, 1-30 RU, 1-20 RU и 1-10 RU, и более предпочтительно по меньшей мере 3 RU, по меньшей мере 4 RU, по меньшей мере 5 RU, например 3-50 RU, предпочтительно 5-40 RU, например 7-25 RU, например 10-20 RU. Однако в некоторых случаях количество RU О-антигена может составлять 1-2. Структура каждого О-антигена, который конкретно описан в данном документе, показана содержащей одну RU с переменной n, обозначающей количество RU. В каждом полисахаридном О-антигене в составе биоконъюгата по изобретению n независимо равно целому числу от 1 до 100, такому как 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 5, например, 3-50, предпочтительно 5-40 (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40), но в некоторых случаях может быть 1-2. В некоторых воплощениях п независимо представляет собой целое число от 7 до 25, например, приблизительно 10-20. Значения могут варьировать между отдельными полисахаридными О-антигенами в составе композиции и представлены здесь как средние значения, т.е. если биоконъюгат описан здесь как имеющий n, которое независимо равно целому числу 5-40, большая часть полисахаридных О-антигенов, содержащихся в композиции, имеет 5-40 повторяющихся единиц, но также могут содержаться некоторые полисахаридные О-антигены, имеющие менее 5 повторяющихся единиц или более 40 повторяющихся единиц. Термин гликоконъюгат относится к конъюгату сахарного или сахаридного антигена (например, олиго- и полисахаридного) с белком, связанному с другим химическим веществом, включая, без ограничения, белки, пептиды, липиды и т.д. Гликоконъюгаты можно получить химически, например, путем химического (синтетического) связывания белка и сахарного или сахаридного антигена. Термин гликоконъюгат также включает биоконъюгаты.

Термин биоконъюгат относится к конъюгату между белком (например, белком-носителем) и сахарным или сахаридным антигеном (например, олиго- и полисахаридным), полученным в клеткехозяине, предпочтительно бактериальной клетке-хозяине, например, клетке-хозяине Е.соН, где аппарат клетки-хозяина связывает антиген с белком (например, связывает с N). Предпочтительно, термин биоконъюгат относится к конъюгату между белком (например, белком-носителем) и О-антигеном, пред

- 11 046206 почтительно О-антигеном E.coli (например, О1А, O2, гликозилированным O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В, O75 и т.д.), полученным в клетке-хозяине, где аппарат клетки-хозяина связывает антиген с белком (например, связывает с N). Поскольку биоконъюгаты получают в клетках-хозяевах благодаря аппарату клетки-хозяина, антиген и белок ковалентно связаны в составе биоконъюгата через гликозидную связь. Биоконъюгаты могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах, генетически модифицированных для экспрессии клеточного аппарата, необходимого для синтеза О-антигена и/или связывания Оантигена с целевым белком. Биоконъюгаты, которые описаны в данном документе, обладают преимуществами по сравнению с химически полученными гликоконъюгатами, в которых гликаны выделены из клеточной стенки бактерий и впоследствии химически связаны с белком-носителем, например, биоконъюгаты требуют меньшего количества химических веществ при производстве и являются более однородными с точки зрения получаемого конечного продукта и содержат меньше или совсем не содержат свободного (т.е. не связанного с белком-носителем) гликана. Таким образом, в типичных воплощениях биоконъюгаты предпочтительны по сравнению с гликоконъюгатами, полученными химическим путем. Термин приблизительно, когда он используется вместе с числом, относится к любому числу в пределах ±1, ±5 или ±10% от указанного числа.

Термин процент (%) идентичности последовательностей или % идентичности описывает количество соответствий (совпадений) идентичных аминокислот двух или более выровненных аминокислотных последовательностей по сравнению с количеством аминокислотных остатков, составляющих общую длину аминокислотных последовательностей. Другими словами, используя выравнивание, можно установить процент одинаковых аминокислотных остатков для двух или более последовательностей (например, 90, 95, 97 или 98% идентичности), когда последовательности сравниваются и выравниваются для максимального соответствия, определенного с использованием алгоритма сравнения последовательностей, известного в данной области техники, или при выравнивании вручную и визуальной проверке. Последовательности, которые сравнивают для определения идентичности последовательностей, могут, таким образом, отличаться заменой(ами), добавлением(ями) или делецией(ями) аминокислот. Программы, подходящие для выравнивания белковых последовательностей, известны специалистам в области техники. Процент идентичности белковых последовательностей можно определить, например, с использованием таких программ как CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA или BLAST, например, используя алгоритм NCBI BLAST (Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).

Например, для аминокислотных последовательностей идентичность и/или сходство последовательностей можно установить с помощью стандартных методик, известных в области техники, включая, без ограничения, алгоритм определения локальной идентичности последовательностей Смита и Ватермана, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритм выравнивания идентичных областей Нидлмана и Вунша, 1970, J. Mol. Biol. 48:443), способ поиска сходства Пирсона и Липмана, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, с помощью компьютеризированной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), программы Best Fit для последовательностей, описанной Devereux et al, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, предпочтительно с применением настроек по умолчанию, или путем проверки. В некоторых воплощениях процент идентичности рассчитывают с помощью FastDB на основании следующих параметров: штраф за несовпадение 1; штраф за открытие гэпа 1; штраф за длину гэпа 0,33; и штраф за объединение 30, Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Другим примером полезного алгоритма является алгоритм BLAST, описанный: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; и Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Особенно полезной программой BLAST является программа WUBLAST-2, которая была получена от Altschul et al, 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WUBLAST-2 использует несколько параметров поиска, большинство из которых имеют значения по умолчанию. Дополнительным полезным алгоритмом является gapped BLAST, опубликованный Altschul et al, 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Термин инвазивное заболевание, вызываемое внекишечными патогенными Escherichia coli (ExPEC) (IED) определяется здесь как острое заболевание с системной бактериальной инфекцией, которое микробиологически подтверждается либо выделением и идентификацией Е.соН из крови или других обычно стерильных участков тела, либо выделением и идентификацией is. coli из мочи пациента с наличием признаков и симптомов инвазивного заболевания (синдром системной воспалительной реакции (SIRS), сепсис или септический шок) и отсутствие других идентифицируемых источников инфекции.

Биоконъюгаты гликозилированного полисахаридного антигена О4 Е.соН.

В одном аспекте предложен биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем. В данном описании термин O4 относится к O4 антигену Е.соН (E.coli серотипа O4). Известно, что у Е.соН серотипа O4 существует структурная модификация Оантигена. В частности, некоторые серотипы O4 экспрессируют модифицированный О-антиген, имеющий ответвленную глюкозную единицу. Используемые здесь термины гликозилированный антиген O4, гликозилированный полисахаридный антиген O4, полисахаридный антиген O4-Glc+ и антиген O4

- 12 046206

Glc+ относятся к антигену O4 (например, антигену O4 E.coli), имеющему ответвление глюкозы, в котором D-глюкоза связана с L-рамнозой в повторяющейся единице L-Rha^D-Glc^L-FucNAc^D-GlcNAc. В конкретном воплощении гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+), как показано в табл. 1, где n является целым числом от 1 до 100. В предпочтительных воплощениях п представляет собой целое число от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

Штаммы Е.соН O4 независимо от статуса ответвления глюкозы, несут по существу идентичный кластер генов rfb, кодирующих гены, ответственные за продукцию полисахаридного антигена O4. Однако, синтез in vivo модифицированного антигена O4, имеющего ответвление глюкозы, требует активности фермента, обеспечивающего ветвление полисахарида, который находится за пределами кластера генов rfb. Насколько известно авторам изобретения, до настоящего времени фермента, обеспечивающего ветвление полисахарида, ответственного за модификацию антигена O4 глюкозой, не известно. Авторы изобретения обнаружили последовательность фермента, обеспечивающего ветвление полисахарида, ответственного за модификацию антигена O4 глюкозой. Обнаружение этого фермента позволяет получать биоконъюгаты модифицированного полисахаридного антигена O4, имеющего ответвление глюкозы. Модифицированная глюкозой форма полисахаридного антигена O4 присутствует в преобладающих серотипах и, таким образом, может применяться для обеспечения улучшенного иммунного ответа, например, для профилактического или терапевтического применения.

В частности, в настоящем документе представлена последовательность гена gtrS, кодирующего фермент глюкозилтрансферазу, специфичную для серотипа O4 E.coli, который гликозилирует антиген O4. Как правило, гены gtrA, gtrB и gtrS кодируют ферменты, ответственные за гликозилирование Оантигена. В то время как гены gtrA и gtrB в разных серотипах высоко гомологичны и взаимозаменяемы, ген gtrS кодирует специфичную для серотипа О-антиген глюкозилтрансферазу. Ген gtrS серотипа O4 E.coli кодирует фермент GtrS, который модифицирует антиген O4 путем введения ответвления глюкозы. Характеристика современных клинических изолятов Е.соН серотипа O4 выявила присутствие gtrS у 78% протестированных изолятов, что указывает на то, что полисахаридный антиген O4 Е.соН, модифицированный добавлением остатка глюкозы, преобладает у современных инфекционных изолятов.

В одном воплощении предложена нуклеиновая кислота гена gtrS из E.coli серотипа O4, кодирующая глюкозилтрансферазу GtrS, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В другом воплощении нуклеиновая кислота gtrS кодирует белок GtrS из Е.соН серотипа O4, который приблизительно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, предпочтительно на 98, 99 или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. Белок GtrS, который по меньшей мере на 80% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, способен специфически гликозилировать полисахаридный антиген O4 Е.соН для получения гликозилированного антигена O4, имеющего структуру формулы (O4-Glc+), как показано в табл. 1. Специалист в области техники сможет создать мутированные формы белка GtrS SEQ ID NO: 4, идентичные по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO: 4, и протестировать такие последовательности на активность гликозилирования антигена O4 Е.соН с учетом изложенного в данном документе изобретения. Рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген глюкозилтрансферазы gtrS E.coli серотипа O4, и применение рекомбинантных клеток-хозяев для получения полисахаридных антигенов O4, модифицированных глюкозой, и их биоконъюгатов описаны более подробно ниже.

Последовательности для белков, кодируемых gtrA и gtrB, которые функционируют как транслоказа глюкозы, связанной с бактопренолом (GtrA, перетаскивает глюкозу, связанную с бактопренолом, через внутреннюю мембрану в периплазму) и бактопренол глюкозилтрансферазы (GtrB, связывает глюкозу с бактопренолом), соответственно, могут содержать аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80% идентичны SEQ ID NO: 7 и 8 соответственно. В некоторых воплощениях последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки GtrA и GtrB, которые по меньшей мере приблизительно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, и обладающие активностью транслоказы глюкозы, связанной с бактопренолом, и бактопренол глюкозилтрансферазы, соответственно, также присутствуют в клетках-хозяевах по изобретению, которые дополнительно содержат O4-специфический локус rfb, последовательность, кодирующую O4-специфический GtrS, описанную выше, олигосахарилтрансферазу, описанную выше и последовательность, кодирующую белок-носитель, имеющий одну или более чем одну консенсусную последовательность гликозилирования, описанную в данном документе, для получения биоконъюгатов гликозилированного O4 E.coli (содержащих гликановую структуру формулы (O4-Glc+) по табл. 1).

Биоконъюгаты гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, предложенные в данном документе, ковалентно связаны с белком-носителем, предпочтительно гликозидной связью. Можно применять любой подходящий с учетом данного описания белок-носитель, известный специалистам в области техники.

Подходящие носители включают обезвреженный экзотоксин А P.aeruginosa (EPA), флагеллин Е.соН (FHC), CRM 197, мальтозосвязывающий белок (МВР), дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин,

- 13 046206 обезвреженный гемолизин A S.aureus, агглютинирующий фактор А, агглютинирующий фактор В, термолабильный энтеротоксин Е.соН, обезвреженные варианты термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицу В холерного токсина (СТВ), холерный токсин, обезвреженные варианты холерного токсина, белок Sat E.coli, пассажирский домен белка Sat E.coli, пневмолизин Streptococcus pneumoniae, гемоцианин Megathura crenulata (KLH), PcrV P.aeruginosa, белок внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белок D из нетипируемого Haemophilus influenzae, но не ограничиваются перечисленным. Описано биоконъюгирование с различными белками-носителями, содержащими требуемую консенсусную последовательность гликозилирования, демонстрируя, что с помощью этой технологии можно гликозилировать широкий спектр белков (см., например, WO 06/119987, WO 2015/124769, WO 2015/158403, WO 2015/82571, WO 2017/216286 и WO 2017/67964, вместе демонстрирующие широкий спектр белковносителей, которые успешно применялись в биоконъюгации).

В некоторых воплощениях белкок-носитель модифицирован таким образом, чтобы белок был менее токсичным и/или более восприимчивым к гликозилированию. В конкретном воплощении белки носители, использованные в данном изобретении, модифицированы таким образом, что количество сайтов гликозилирования в белках носителях максимизировано таким образом, что позволяет вводить белки в более низких концентрациях, например, в иммуногенной композиции, особенно в форме их биоконъюгатов.

Так, в некоторых воплощениях белки носители, описанные в данном документе, модифицированы, чтобы включать на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сайтов гликозилирования больше, чем обычно связано с белком-носителем (например, по сравнению с количеством сайтов гликозилирования, связанных с белком-носителем в его нативном/естественном состоянии, т.е. у дикого типа). Введение сайтов гликозилирования в белок-носитель может быть выполнено путем вставки консенсусной последовательности гликозилирования в любом месте первичной структуры белка, например, путем добавления новых аминокислот к первичной структуре белка, так что сайт гликозилирования добавляется полностью или частично, или путем мутации существующих аминокислот в белке для создания сайта гликозилирования. Обычный специалист в данной области техники поймет, что аминокислотная последовательность белка может быть легко модифицирована с использованием подходов, известных в данной области техники, например, рекомбинантных подходов, которые включают модификацию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок. В конкретных воплощениях консенсусные последовательности гликозилирования вводят в определенные области белка-носителя, например, в поверхностные структуры белка, на N- или С-концах белка и/или в петли, которые стабилизируются дисульфидными мостиками в основании белка. В некоторых воплощениях консенсусная последовательность гликозилирования может быть продлена путем добавления остатков лизина для более эффективного гликозилирования.

Приведенные в качестве иллюстрации примеры консенсусных последовательностей гликозилирования, которые могут быть встроены или созданы в белке-носителе, включают Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой кроме Pro (SEQ ID NO: 1); и Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты кроме Pro (SEQ ID NO: 2).

В некоторых воплощениях гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН ковалентно связан с остатком аспарагина (Asn) в сайте гликозилирования (например, связан с N), где остаток Asn присутствует в составе сайта гликозилирования, содержащего консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, более предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2. Как правило, белок-носитель содержит 1-10 сайтов гликозилирования, предпочтительно от 2 до 4 сайтов гликозилирования, наиболее предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и наиболее предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В конкретных воплощениях белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин А P. aeruginosa (EPA). В литературе описаны различные обезвреженные варианты ЕРА, и они могут применяться в качестве белков носителей. Например, обезвреживание может быть достигнуто за счет мутации и делеции важных для каталитической активности остатков, таких как L552V и ΔΕ553 согласно Lukac et al., 1988, Infect Immun, 56: 3095-3098, и Ho et al., 2006, Hum Vaccin, 2:89-98. В данном описании ЕРА относится к обезвреженному экзотоксину А из P.aeruginosa. В тех воплощениях, где белок-носитель представляет собой ЕРА, гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН может быть ковалентно связан с остатком Asn в сайте гликозилирования, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, и предпочтительно ковалентно связан с остатком Asn в сайте гликозилирования, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, белок-носитель ЕРА содержит 1-10 сайтов гликозилирования, предпочтительно от 2 до 4 сайтов гликозилирования, наиболее предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и, наиболее предпочтительно, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях белок-носитель ЕРА содержит четыре сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, например, сайт гликозили

- 14 046206 рования содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2. Используемые в данном документе термины белок-носитель ЕРА-4 и ЕРА-4 относятся к белкуносителю, представляющему собой обезвреженный экзотоксин А из P.aeruginosa, содержащему четыре сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусные последовательности гликозилирования, имеющие SEQ ID NO: 2. Предпочтительным примером белка-носителя является белок-носитель ЕРА, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Композиции.

В другом аспекте предложена композиция, содержащая биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем. Композиции, предложенные в данном документе, могут включать любой биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанный с белком-носителем (например, ЕРА), описанный в настоящем документе.

В некоторых воплощениях композиция представляет собой иммуногенную композицию. Используемый в данном документе термин иммуногенная композиция относится к композиции, которая может вызывать иммунный ответ у хозяина или субъекта, которому вводится композиция. Иммуногенные композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях композиция представляет собой фармацевтическую композицию, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Термин фармацевтически приемлемый носитель, используемый в данном документе, относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или несущей среде, с которыми вводят композицию и которые являются нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Например, в качестве жидких носителей, в частности для инъекционных растворов, могут применяться солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Другие примеры подходящих фармацевтически приемлемых носителей описаны в издании Remington's Pharmaceutical Sciences под редакцией E.W. Martin.

В одном воплощении композиция по изобретению содержит биоконъюгаты по изобретению в Трисбуферном солевом растворе (TBS) рН 7,4 (например, содержащем Tris, NaCl и KCl, например, 25 мМ, 137 мМ и 2,7 мМ, соответственно). В других воплощениях композиции по изобретению содержат биоконъюгаты по изобретению в буфере KH₂PO₄/Na₂HPO₄ с концентрацией приблизительно 10 мМ и рН приблизительно 7,0, содержащем приблизительно 5% (мас./об.) сорбита, приблизительно 10 мМ метионина и приблизительно 0,02% (мас./об.) полисорбата 80. В других воплощениях композиции по изобретению содержат биоконъюгаты по изобретению в буфере KH₂PO₄/Na₂HPO₄ с концентрацией приблизительно 10 мМ и рН приблизительно 7,0, содержащем приблизительно 8% (мас./об.) сахарозы, приблизительно 1 мМ ЭДТА и приблизительно 0,02% (мас./об.) полисорбата 80 (см., например, WO 2018/077853 о подходящих буферах для биоконъюгатов О-антигенов E.coli, ковалентно связанных с белком-носителем ЕРА).

В некоторых воплощениях описанные композиции представляют собой одновалентные составы и содержат один полисахаридный О-антиген Е.соН, например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата, такой как гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН. Также предложены композиции (например, фармацевтические и/или иммуногенные композиции), которые являются поливалентными композициями, например, двухвалентными, трехвалентными, четырехвалентными и т.д. композициями. Например, поливалентная композиция содержит более чем один антиген, такой как О-антиген Е.соН, его гликоконъюгат или биоконъюгат. В конкретных воплощениях предложенная поливалентная композиция содержит биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН и по меньшей мере один дополнительный антиген.

В одном воплощении композиция (например, фармацевтическая композиция и/или иммуногенная композиция) представляет собой одновалентную композицию, содержащую биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, как описано в настоящем документе. В одном воплощении композиция (например, фармацевтическая композиция и/или иммуногенная композиция) представляет собой поливалентную композицию, содержащую гликозилированный полисахаридный антиген O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, как описано в настоящем документе, и по меньшей мере один дополнительный антиген.

В некоторых воплощениях дополнительный антиген представляет собой сахаридный или полисахаридный антиген, более предпочтительно полисахаридный О-антиген Е.соН, такой как О-антигены Е.соН одного или нескольких серотипов из O1, O2, O6, O8, O15, O16, O18, O25 и O75 и их подсеротипов. В некоторых воплощениях каждый из дополнительных полисахаридных О-антигенов Е.соН представляет собой гликоконъюгат, что означает, что полисахаридный О-антиген Е.соН ковалентно связан с другим химическим веществом, например, белком, пептидом, липидом и т.д., наиболее предпочтительно, белком-носителем, например, химическим или ферментативным способом. В предпочтительных воплощениях каждый из дополнительных полисахаридных О-антигенов Е.соН представляет собой биоконъюгат, в котором полисахаридный О-антиген ковалентно связан, например, с белком-носителем посредством гли

- 15 046206 козидной связи ферментативно посредством аппарата клетки-хозяина. В некоторых воплощениях композиции, предложенные в данном документе, могут содержать 1-20 дополнительных гликоконъюгатов, более предпочтительно биоконъюгатов полисахаридных О-антигенов Е.соН, таких как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дополнительных гликоконъюгатов или предпочтительно биоконъюгатов полисахаридных О-антигенов Е.соН. В композиции, предложенные в данном документе, могут быть включены другие антигены, такие как пептидные, белковые или липидные антигены и т. д.

В некоторых воплощениях композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная композиция) содержит биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli и по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген, выбранный из группы, состоящей из полисахаридного антигена O1A E.coli, полисахаридного антигена O2 E.coli, полисахаридного антигена 06а Е.соН, полисахаридного антигена O8 E.coli, полисахаридного антигена O15 E.coli, полисахаридного антигена O16 E.coli, полисахаридного антигена O18 E.coli, полисахаридного антигена 025В E.coli и полисахаридного антигена O75 E.coli. Предпочтительно каждый из дополнительных полисахаридных О-антигенов ковалентно связан с белком-носителем и более предпочтительно является биоконъюгатом. В одном воплощении полисахаридный антиген О1А (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным О-антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген О1А содержит структуру формулы (О1А), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген О1А является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген O2 (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген O2 содержит структуру формулы (O2), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген O2 является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген О6А (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген О6А содержит структуру формулы (О6А), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген О6А является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген O8 (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген O8 содержит структуру формулы (O8), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген O8 является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген O15 (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген O15 содержит структуру формулы (015), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген O15 является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген O16 (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген O16 содержит структуру формулы (O16), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген O16 является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген О18А (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген О18А содержит структуру формулы (О18А), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген О18А является частью био

- 16 046206 конъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген 025b (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген 025В содержит структуру формулы (025В), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген 025В является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В одном воплощении полисахаридный антиген O75 (например, в выделенной форме или в составе гликоконъюгата или биоконъюгата) используется в предложенной композиции (например, в комбинации с гликозилированным полисахаридным антигеном O4 или его биоконъюгатом). В конкретном воплощении полисахаридный антиген O75 содержит структуру формулы (O75), как показано в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20. Предпочтительно полисахаридный антиген O75 является частью биоконъюгата и ковалентно связан с белком-носителем, например ЕРА.

В другом воплощении композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная композиция) содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный O4, О6А и 025В E.coli, предпочтительно биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, O2, гликозилированного O4, О6А и 025В, ковалентно связанных с белком-носителем (например, пятивалентная композиция). В предпочтительнм воплощении композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная композиция) содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный O4, О6А, O8, O15, O16, 025В и O75 E.coli, предпочтительно биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, O2, гликозилированного O4, О6А, O8, O15, O16, 025В и O75, ковалентно связанных с белком-носителем (например, 9-валентная композиция).

В другом предпочтительнм воплощении композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная композиция) содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75 E.coli, предпочтительно биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, O2, гликозилированного O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75, ковалентно связанных с белком-носителем (например, 10-валентная композиция).

В настоящем документе также рассматриваются композиции, которые возможно дополнительно содержат дополнительные О-антигены (например, в выделенной форме или являющиеся частью гликоконъюгата или биоконъюгата) Е.соН других серотипов.

В некоторых воплощениях каждый дополнительный полисахаридный антиген О1А, O2, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и/или O75 Е.соН ковалентно связан с белком-носителем. Полисахаридный Оантиген может быть связан с белком-носителем химическими или другими способами синтеза, или полисахаридный О-антиген может быть частью биоконъюгата и предпочтительно является частью биоконъюгата. Можно применять любой подходящий с учетом данного описания белок-носитель, известный специалистам в области техники. Подходящие носители включают обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa (ЕРА), флагеллин Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающий белок (МВР), дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, обезвреженный гемолизин A S.aureus, агглютинирующий фактор А, агглютинирующий фактор В, термолабильный энтеротоксин Е.соН, обезвреженные варианты термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицу В холерного токсина (СТВ), холерный токсин, обезвреженные варианты холерного токсина, белок Sat E.coli, пассажирский домен белка Sat E.coli, пневмолизин Streptococcus pneumoniae, гемоцианин Megathura crenulata (KLH), PcrV P.aeruginosa, белок внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белок D из нетипируемого Haemophilus influenzae, но не ограничиваются перечисленным. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой ЕРА.

В некоторых воплощениях каждый из дополнительных полисахаридных антигенов Е.соН О1А, O2, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и/или O75, особенно когда он является частью биоконъюгата, ковалентно связан с остатком аспарагина (Asn) в белке-носителе, где остаток Asn присутствует в сайте гликозилирования, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования Asn-X-Ser (Thr), где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro (SEQ ID NO: 1), предпочтительно где остаток Asn присутствует в сайте гликозилирования, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования Asp (Glu)-X-Asn-Z-Ser (Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты, кроме Pro (SEQ ID NO: 2). Белок-носитель может содержать 1-10 сайтов гликозилирования, предпочтительно от 2 до 4 сайтов гликозилирования, наиболее предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования. В конкретном воплощении белок-носитель представляет собой белок-носитель ЕРА-4, например белок-носитель ЕРА-4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

В конкретном воплощении предложена композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная композиция), содержащая: (1) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем обезвреженным экзотоксином А P. aeruginosa, содержащим SEQ ID NO: 3 (белок-носитель ЕРА-4), где гликозилированный полисахаридный антиген O4

- 17 046206

E.coli содержит структуру Формулы (O4-Glc+); (2) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена О1А Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген 01а Е.соН содержит структуру Формулы (О1А); (3) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O2 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O2 Е.соН содержит структуру Формулы (O2); (4) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена О6А Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген О6А Е.соН содержит структуру Формулы (О6А); (5) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O8 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O8 Е.соН содержит структуру Формулы (O8); (6) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O15 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O15 Е.соН содержит структуру Формулы (O15); (7) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O16 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O16 Е.соН содержит структуру Формулы (O16); (8) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена 025В Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген 025В Е.соН содержит структуру Формулы (025В) и (9) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O75 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O75 Е.соН содержит структуру Формулы (О75), где каждая из Формул приведена в табл. 1, и независимо для каждой из формул п представляет собой целое число от 1 до 100, например, от 1 до 50, предпочтительно от 3 до 50, например, от 5 до 40. В конкретном воплощении указанная композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная композиция) дополнительно содержит: (10) биоконъюгат полисахаридного антигена О18А Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген О18А Е.соН содержит структуру формулы (О18А), приведенную в табл. 1, где n в данной структуре представляет собой целое число от 1 до 100, например, от 1 до 50, предпочтительно от 3 до 50, например, от 5 до 40.

В некоторых воплощениях предложенная композиция содержит биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli и по меньшей мере биоконъюгат полисахаридного антигена 025В E.coli, где биоконъюгат антигена 025В E.coli присутствует в композиции в концентрации, которая приблизительно в 1,5-6 раз, например, в 2-4 раза выше, например, в 1,5, 2, 3, 4, 5 или 6 раз выше, чем концентрация любого другого биоконъюгата, присутствующего в композиции.

В конкретных воплощениях композиция содержит биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, 02, гликозилированного 04, О6А, 08, 015, 016, 025В и O75 Е.соН, причем биоконъюгаты O1A:O2: гликозилированного О4:О6А:О8:О15:О16:О25В:О75 присутствуют в соотношении (по массе полисахаридов О-антигенов) 1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:4:1.

В конкретных воплощениях композиция содержит биоконъюгаты полисахаридных антигенов О1А, 02, гликозилированного 04, О6А, 08, 015, 016, О18А, 025В и O75 Е.соН, причем биоконъюгаты O1A:O2: гликозилированного О4:О6А:О8:О15:О16:О18А:О25В:О75 присутствуют в соотношении (по массе полисахаридов О-антигенов) 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:1:4:1. В некоторых воплощениях предложенная композиция содержит биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена 04 E.coli и по меньшей мере биоконъюгат полисахаридного антигена О25В E.coli, где биоконъюгат антигена О25В E.coli присутствует в композиции в концентрации от 2 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 8 до 40 мкг/мл, более предпочтительно от 16 до 32 мкг/мл, такой как 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 мкг/мл. В таких воплощениях концентрация биоконъюгата полисахаридного антигена О25В E.coli предпочтительно приблизительно в 1,5-6 раз, например, в 2-4 раза выше, например, в 1,5, 2, 3, 4, 5 или 6 раз выше, чем концентрация любого другого биоконъюгата, присутствующего в композиции.

В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе (например, фармацевтические и/или иммуногенные композиции) содержат или вводятся в комбинации с адъювантом. Адъювант для введения в комбинации с композицией, описанной в данном документе, может вводиться до (например, за 72, 48, 24, 12, 6, 2, 1 ч, 10 мин), одновременно или после (например, через 72, 48, 24, 12, 6, 2, 1 ч, 10 мин) введения указанной композиции. В данном документе термин адъювант относится к соединению, которое при введении в сочетании или в составе композиции, описанной в данном документе, усиливает и/или повышает иммунный ответ на полисахаридный О-антиген Е.соН в составе биоконъюгата, однако, когда вводят только адъювантное соединение, иммунный ответ на полисахаридный О-антиген Е.соН в составе биоконъюгата не вырабатывается. В некоторых воплощениях адъювант усиливает иммунный ответ на полисахаридный О-антиген Е.соН в составе его биоконъюгата и не вызывает аллергии или иной нежелательной реакции. Усиление иммунного ответа адъювантами может быть опосредовано несколькими механизмами, включая, например, рекрутирование лимфоцитов, стимулирование В и/или Т клеток или стимулирование макрофагов. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия (квасцы) (такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и оксид алюминия, включая наночастицы, содержащие квасцы или составы с наноалюминием), фосфат кальция, монофосфориллипид A (MPL) или 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (см., например, патент Великобритании GB 2220211, ЕР 0971739, ЕР 1194166, US 6491919), AS01, AS02, AS03 и AS04 (все GlaxoSmithKline; см., например, ЕР 1126876, US 7357936 для AS04, ЕР 0671948, ЕР 0761231, US 5750110

- 18 046206 для AS02), MF59 (Novartis), имидазопиридиновые соединения (см. WO 2007/109812), соединения имидазохиноксалина (см. WO 2007/109813), дельта-инулин, STING-активирующие синтетические циклические динуклеотиды (например, US20150056224), комбинации лецитина и гомополимеров карбомера (например, US 6676958) и сапонины, такие как QuilA и QS21 (см., например, Zhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113), Matrix M, Iscoms, Iscomatrix ит.д., возможно, в комбинации в QS7 (см. Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); патент US № 5057540), но не ограничиваются перечисленным. В некоторых воплощениях адъювант представляет собой адъювант Фрейнда (полный или неполный). Другие адъюванты представляют собой эмульсии масло-в-воде (такие как сквален или арахисовое масло), возможно в комбинации с иммуностимуляторами, такими как монофосфорил липид А (см. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Другим адъювантом является CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998). Другими примерами адъювантов являются липосомы, содержащие иммуностимуляторы, такие как MPL и QS21, такие как AS01E и AS01B (например, US 2011/0206758). Другими примерами адъювантов являются CpG (Bioworld Today, 15 ноября 1998 г.) и имидазохинолины (такие как имиквимод и R848). См., например, Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608. В некоторых воплощениях адъювант содержит агонист толл-подобного рецептора 4 (TLR4). Агонисты TLR4 хорошо известны в данной области техники, см., например, Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807. В некоторых воплощениях адъювант содержит агонист TLR4, содержащий липид А или его аналог или производное, такие как MPL, 3D-MPL, RC529 (например, ЕР1385541), РЕТ-липид A, GLA (адъювант гликопиранозил липид, синтетический дисахаридный гликолипид; например, US 20100310602, US 8722064), SLA (например, Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: el08 (doi: 10.1038/cti.2016.63), где описан структурнофункциональный подход для оптимизации лигандов TLR4 для человеческих вакцин), PHAD (фосфорилированный гексаацил-дисахарид), 3D-PHAD (структура которого является такой же, как у GLA), 3D-(6ацил)-PHAD (3D(6A)-PHAD) (PHAD, 3D-PHAD и 3D(6A)PHAD являются синтетическими вариантами липида А, см., например, avantilipids.com/divisions/adjuvants, где также приведены структуры этих молекул), Е6020 (номер CAS 287180-63-6), ONO4007, ОМ-174 и тому подобное. В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе не содержат адъювант и не вводятся в комбинации с адъювантом.

В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, составлены, чтобы быть подходящими для предполагаемого способа введения субъекту. Например, композиции (например, фармацевтические и/или иммуногенные), описанные в данном документе, могут быть составлены для подкожного, парентерального, перорального, подъязычного, буккального, внутрикожного, чрескожного, колоректального, внутрибрюшинного, ректального введения, внутривенного, интраназального, интратрахеального, внутримышечного, местного, трансдермального или интрадермального введения. В конкретном воплощении предложенная композиция (например, фармацевтическая и/или иммуногенная) составлена для внутримышечной инъекции.

Способы применения.

Биоконъюгаты и композиции, предложенные в данном документе, могут применяться для индукции у субъекта антител против гликозилированного антигена O4 Е.соН и для вакцинации субъекта против Е.соН, в частности, внекишечной патогенной Е.соН (ExPEC). В данном описании субъект означает любого животного, предпочтительно, млекопитающего, которому будет или был введен биоконъюгат ии композиция, предложенные в данном документе. Термин млекопитающее, используемый в данном документе, охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, приматов, не являющихся людьми, таких как обезьяны, или человекообразных обезьян, людей и т.д. В некоторых воплощениях субъектом является человек. Человек может быть любого возраста. В некоторых воплощениях субъектом является человек в возрасте от примерно двух месяцев до примерно 18 лет, например от 1 года до 18 лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек в возрасте по меньшей мере 18 лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек в возрасте от 15 до 50 лет, например от 18 до 40 лет, например от 20 до 45 лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек мужского пола. В некоторых воплощениях субъектом является человек женского пола. В некоторых воплощениях у субъекта ослаблен иммунитет. В некоторых воплощениях субъектом является человек в возрасте по меньшей мере 50 лет, по меньшей мере 55 лет, по меньшей мере 60 лет, по меньшей мере 65 лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек не старше 100 лет, не старше 95 лет, не старше 90 лет, не старше 85 лет, не старше 80 лет или не старше 75 лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек в возрасте по меньшей мере 60 лет и не старше 85 лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек в стабильном состоянии здоровья. В некоторых воплощениях субъектом является человек в стабильном состоянии здоровья в возрасте по меньшей мере 60 лет и не старше 85 лет. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека, у которого в анамнезе была инфекция мочевыводящих путей (ИМП, т.е. бактериальная инфекция в уретре, мочевом пузыре, мочеточниках и/или почках), то есть имевший по меньшей мере один эпизод ИМП в его или ее жизни. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека, имевшего в анамнезе ИМП в течение последних двадцати, пятнадцати,

- 19 046206 двенадцати, десяти, девяти, восьми, семи, шести, пяти, четырех, трех, двух лет или одного года. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека, имевшего в анамнезе ИМП в течение последних двух лет. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека, имевшего в анамнезе рецидивирующие ИМП, т.е. перенес по меньшей мере две ИМП в течение шести месяцев или по меньшей мере три ИМП в течение года. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека, имевшего в анамнезе ИМП в течение последних двух лет. В некоторых воплощениях субъектом является человек в стабильном состоянии здоровья в возрасте 60 лет или старше. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека в возрасте 60 лет или старше, имевшего в анамнезе ИМП в течение последних двух лет. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека в возрасте 60 лет и младше 75 лет, имевшего в анамнезе ИМП в течение последних двух лет. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека в возрасте 75 лет или старше, имевшего в анамнезе ИМП в течение последних двух лет. В некоторых воплощениях субъект представляет собой пациента, которому запланированы плановые урогенитальные и/или абдоминальные процедуры или операции, например, трансректальная пункционная биопсия предстательной железы под контролем УЗИ (TRUS-PNB).

В одном аспекте предложен способ индукции у субъекта антител против гликозилированного антигена O4 Е.соН, включающий введение субъекту любого из биоконъюгатов гликозилированного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, описанным в настоящем документе, или композиции, содержащей биоконъюгат гликозилированного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанный с белком, отдельно или в комбинации с другими полисахаридными О-антигенами Е.соН или их гликоконъюгатами или биоконъюгатами.

В некоторых воплощениях антитела индуцированные, вызванные или выявленные против гликозилированного антигена O4 Е.соН, обладают опсонофагоцитарной активностью. В конкретных воплощениях индуцированные, вызванные или выявленные антитела представляют собой перекрестнореагирующие антитела, способные опосредовать опсонофагоцитарное уничтожение штаммов E.coli как с гликозилированным, так и с негликозилированным O4.

В некоторых воплощениях антитела индуцированные, вызванные или выявленные против гликозилированного антигена O4 Е.соН специфически распознают немодифицированный и модифицированный глюкозой полисахаридный антиген O4. В некоторых воплощениях антитела индуцированные, вызванные или выявленные против гликозилированного антигена O4 Е.соН, специфически распознают Е.соН серотипа O4. В некоторых воплощениях антитела индуцированные, вызванные или выявленные против гликозилированного антигена O4 Е.соН, предпочтительно связываются с гликозилированным антигеном O4 по сравнению с негликозилированным антигеном O4. Антитела, индуцированные биоконъюгатами и композициями, описанными в данном документе, могут включать молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, то есть молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с полисахаридным О-антигеном E.coli, например гликозилированным полисахаридным антигеном O4. Антитела, индуцированные, вызванные или выявленные с применением биоконъюгатов или композиций, предложенных в настоящем документе, можно применять для мониторинга эффективности терапии и/или прогрессирования заболевания. Для этой цели можно использовать любую систему иммуноанализа, известную в данной области, включая конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием таких методов, как радиоиммуноанализ, ELISA (иммуноферментный анализ), иммуноанализы на основе электрохемилюминесценции (ECL), иммуноанализы типа сэндвич, реакции преципитации, реакции преципитации с диффузией в геле, иммунодиффузионные тесты, иммунорадиометрические тесты, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с белком А и иммуноэлектрофоретические тесты, но не ограничиваясь перечисленным. Некоторые из этих анализов, например, иммуноанализы на основе ECL можно проводить в мультиплексном формате, и обычно мультиплексные форматы анализа предпочтительны.

Антитела, индуцированные, вызванные или выявленные с применением биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, могут применяться для обнаружения штаммов Е.соН O4, в частности, штаммов с гликозилированным 04, например, среди множества штаммов Е.соН и/или для диагностики инфекции, вызванной штаммом Е.соН с O4 или гликозилированным O4.

В другом аспекте в настоящем документе предложен способ вакцинации субъекта против Е.соН (например, внекишечной патогенной Е.соН, ЕхРЕС), включающий введение субъекту любого из биоконъюгатов гликозилированного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, описанный в данном документе, или композиция, содержащая биоконъюгат гликозилированного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанный с белком-носителем, отдельно или в комбинации с другими О-антигенами Е.соН или их гликоконъюгатами или биоконъюгатами. Специалист в данной области поймет, что субъект будет вакцинирован против штаммов E.coli, чьи О-антигены или их гликоконъюгаты или биоконъюгаты присутствуют в вводимой композиции. Например, введение композиции, содержащей полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный O4, 06а и 025b, можно использовать для вакцинации субъекта против Е.соН серотипов О1А, O2, O4, О6А и 025В. В некоторых воплощениях вакцинация предназначена для предотвращения инвазивного заболевания ЕхРЕС (IED), например, уросепсиса, бактериемии, сепсиса и т. д. В некоторых воплощениях вакцинация предназначена для предотвращения или уменьшения

- 20 046206 возникновения или тяжести инфекций мочевыводящих путей. В некоторых вариантах реализации IED может быть приобретено в больнице, например, у пациентов, которым проводят урогенитальные и/или абдоминальные процедуры или операции. В некоторых воплощениях IED может быть связано с медицинской помощью, например, у пациентов, получающих медицинскую помощь при другом заболевании, например, через центральные катетеры и т. д., например, в больнице, амбулаторном хирургическом центре, отделении терминальной стадии почечной недостаточности, учреждении длительного ухода и т. д. В некоторых вариантах реализации IED может быть внебольничного происхождения, например, у пациента, который в последнее время не подвергался рискам для здоровья.

В другом аспекте предложен способ индукции у субъекта иммунного ответа против E.coli (например, ЕхРЕС), включающий введение субъекту любого из биоконъюгатов гликозилированного антигена O4 E.coli. ковалентно связанных с белком-носителем, описанных в данном документе, или композиции, содержащей биоконъюгат гликозилированного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белкомносителем, отдельно или в комбинации с другими О-антигенами E.coli или их гликоконъюгатами или биоконъюгатами. В одном воплощении во время введения у субъекта имеется инфекция, вызванная E.coli (например, ЕхРЕС). В предпочтительном воплощении во время введения у субъекта отсутствует инфекция, вызванная E.coli (например, ЕхРЕС).

В некоторых воплощениях описанные композиции и биоконъюгаты можно вводить субъекту для индукции иммунного ответа, который включает выработку антител, предпочтительно антител, обладающих опсонофагоцитарной активностью. Такие антитела можно выделять способами, известными специалисту в данной области техники (например, иммуноаффинной хроматографией, центрифугированием, преципитацией и т. д.).

Способность биоконъюгатов и композиций, описанных в данном документе, вызывать иммунный ответ у субъекта можно оценивать с применением любого подхода, известного специалистам в области техники или описанного в данном документе. В некоторых воплощениях способность биоконъюгата вызывать иммунный ответ у субъекта можно оценивать посредством иммунизации субъекта (например, мыши, крысы, кролика или обезьяны) или ряда субъектов биоконъюгатом, описанным в данном документе, а также иммунизации дополнительного субъекта (например, мыши, крысы, кролика или обезьяны) или ряда субъектов контролем (PBS). Субъекта или ряд субъектов можно впоследствии инфицировать ЕхРЕС и определять способность ЕхРЕС вызывать заболевание (например, ИМП, бактериемию или другое заболевание) у субъекта или ряда субъектов. Специалистам в области техники понятно, что, если субъект или ряд субъектов, иммунизированных контролем, страдают от заболевания после инфицирования ЕхРЕС, а субъект или ряд субъектов, иммунизированных биоконъюгатом(ами) или его композицией, описанными в данном документе, страдают меньше или не страдают заболеванием, биоконъюгат способен вызывать у субъекта иммунный ответ. Способность биоконъюгата(ов) или его (их) композиции, описанных в данном документе, вызывать образование антисыворотки, перекрестно реагирующей с Оантигеном ЕхРЕС, можно исследовать, например, при помощи иммунологического анализа, такого как ELISA (см., например, Van den Dobbelsteen et al, 2016, Vaccine 34: 4152-4160) или иммуноанализа на основе ECL (электрохемилюминесценции). Например, способность биоконъюгатов, описанных в данном документе, вызывать иммунный ответ у субъекта можно оценивать с применением сывороточного бактерицидного теста (SBA) или опсонофагоцитарного теста (OPK или OPKA), который представляет собой зарекомендовавший себя и общепринятый способ, используемый для получения разрешения на применение вакцин на основе гликоконъюгатов. Такие тесты хорошо известны в области техники и, вкратце, включают стадии выработки и выделения антител против мишени, представляющей интерес (например, полисахаридного О-антигена E.coli, например, гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli), посредством введения субъекту (например, мыши, крысе, кролику или обезьяне) соединения, вызывающего выработку таких антител. Впоследствии можно оценивать бактерицидную способность антител, например, посредством культивирования бактерий, о которых идет речь (например, E.coli соответствующего серотипа), в присутствии указанных антител и комплемента и, в зависимости от теста, нейтрофилов и оценивать способность антител опосредовать гибель и/или нейтрализацию бактерий, например, используя стандартные микробиологические подходы. Пример анализа OPK для биоконъюгированных вакцин против E.coli приведен, например, Abbanat et al, 2017, Clin. Vaccine Immunol. 24: e00123-17. Анализ OPK можно проводить в моноплексном или мультиплексном формате, из которых обычно предпочтительнее мультиплексный формат (например, тестирование нескольких серотипов одновременно). Мультиплексный анализ OPK в данном документе иногда обозначают МОРА.

В некоторых воплощениях описанные способы включают введение эффективного количества биоконъюгатов гликозилированного антигена O4 E.coli, ковалентно связанных с белком-носителем, описанных в данном документе, или композиции, содержащей биоконъюгат гликозилированного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, отдельно или в комбинации с другими О-антигенами E.coli или их гликоконъюгатами или биоконъюгатами. В одном воплощении эффективное количество представляет собой количество, которое вакцинирует субъекта против E.coli (например, ЕхРЕС). В другом воплощении эффективное количество представляет собой количество, которое вызывает у субъекта иммунный ответ против E.coli (например, ЕхРЕС), такой как иммунный ответ, включающий выработ

- 21 046206 ку антител, предпочтительно антител, обладающих опсонофагоцитарной активностью.

В конкретных воплощениях, где предложенная композиция содержит биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli и по меньшей мере биоконъюгат полисахаридного антигена 025b E.coli, эффективное количество полисахаридного антигена 025b E.coli приблизительно в 1,5-6 раз, например, приблизительно в 2-4 раза выше, например, в 1,5, 2, 3, 4, 5 или 6 раз выше, чем концентрация любого другого биоконъюгата, присутствующего в композиции. В таких воплощениях эффективное количество полисахаридного антигена 025В Е.соН составляет, например, примерно от 5 до 18 мкг на введение, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 мкг на введение.

В некоторых воплощениях биоконъюгат или композицию по изобретению вводят субъекту однократно. В некоторых воплощениях биоконъюгат или композицию по изобретению вводят субъекту более одного раза, например, в режиме прайм-буст. В некоторых воплощениях время между двумя введениями составляет по меньшей мере две недели, по меньшей мере один месяц, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере десять лет или по меньшей мере пятнадцать лет. У людей желаемый иммунный ответ обычно может быть вызван однократным введением биоконъюгата или композиции по изобретению. В некоторых воплощениях предусмотрено повторное введение, например, через десять лет.

Клетки-хозяева.

В настоящем документе предложены клетки-хозяева, например прокариотические клетки-хозяева, способные продуцировать О-антигены Е.соН и биоконъюгаты, содержащие такие О-антигены Е.соН. Предложенные клетки-хозяева предпочтительно модифицированы таким образом (например, посредством генной инженерии), чтобы содержать одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих аппарат клетки-хозяина (например, гликозилтрансферазы), используемые для получения полисахаридных Оантигенов Е.соН и/или их биоконъюгатов.

Для получения полисахаридных О-антигенов Е.соН, описанных в данном документе (например, гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН) и биоконъюгатов, содержащих полисахаридные О-антигены Е.соН, описанных в данном документе (например, биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН) могут применяться любые клетки-хозяева, известные специалистам в данной области, включая архебактерии, прокариотические клетки-хозяева и эукариотические клеткихозяева. В предпочтительном воплощени клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клеткухозяина. Примеры прокариотических клеток-хозяев для применения в продукции полисахаридных Оантигенов Е.соН, описанных в данном документе, и биоконъюгатов, содержащих описанные здесь полисахаридные О-антигены Е.соН, включают виды Escherichia, виды Shigella, виды Klebsiella, виды Xhantomonas, виды Salmonella, виды Yersinia, виды Lactococcus, виды Lactobacillus, виды Pseudomonas, виды Corynebacterium, виды Streptomyces, виды Streptococcus, виды Staphylococcus, виды Bacillus и виды Clostridium, но не ограничиваются ими. В конкретном воплощении клетка-хозяин, используемая для продуцирования полисахаридных О-антигенов E.coli, описанных в данном документе, и биоконъюгатов, содержащих описанные здесь полисахаридные О-антигены Е.соН, является прокариотической клеткойхозяином и предпочтительно представляет собой Е.соН. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, используемые для получения полисахаридных О-антигенов Е.соН и биоконъюгатов, описанных в настоящем документе, сконструированы таким образом, чтобы они содержали гетерологичные нуклеиновые кислоты, например, гетерологичные нуклеиновые кислоты, содержащие генные кластеры rfb желаемого серотипа О-антигена, гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или несколько белков-носителей и/или гликозилтрансфераз. В конкретном воплощении в клетки-хозяева, описанные в данном документе, могут быть введены гетерологичные гены rfb и/или гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки, участвующие в путях гликозилирования (например, в путях прокариотического и/или эукариотического гликозилирования). Такие нуклеиновые кислоты могут кодировать белки, включающие олигосахарилтрансферазы и/или гликозилтрансферазы, но не ограничивающиеся ими. В данном документе описаны последовательности различных генов и генных кластеров, кодирующих гликозилтрансферазы, которые могут найти применение в получении рекомбинантных клетокхозяев, которые могут, например, использоваться для получения полисахаридных О-антигенов Е.соН и их биоконъюгатов. Специалистам в данной области понятно, что из-за вырожденности генетического кода белок, имеющий конкретную аминокислотную последовательность, может кодироваться множеством различных нуклеиновых кислот. Таким образом, специалистам в данной области понятно, что нуклеиновая кислота, предложенная в данном документе, может быть изменена таким образом, что ее последовательность будет отличаться от последовательности, представленной в настоящем документе, без влияния на аминокислотную последовательность белка, кодируемого нуклеиновой кислотой. В настоящем документе предложены клетки-хозяева (например, рекомбинантные клетки-хозяева) для продуцирования биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, полисахаридного антигена О1А, полисахаридного антигена O2, полисахаридного антигена О6А, полисахаридного антигена O8, полисахаридного антигена O15, полисахаридного антигена O16, полисахаридного антигена О18А, полисахаридного антигена 025В или полисахаридного антигена O75. Предложенные клетки-хозяева содер

- 22 046206 жат нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например, гликозилтрансферазы), способные продуцировать полисахаридный О-антиген Е.соН. Клетки-хозяева, предложенные в данном документе, могут естественным образом экспрессировать нуклеиновые кислоты, которые способны продуцировать интересующий О-антиген, или можно сделать клетки-хозяева, экспрессирующие такие нуклеиновые кислоты. В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты являются гетерологичными для клеток-хозяев и вводятся в клетки-хозяева с использованием генетических подходов, известных в данной области. Например, нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку-хозяина путем генетической манипуляции (например, генный кластер экспрессируется на плазмиде или плазмидах или интегрирован в геном клеткихозяина (см., например, опубликованные международные заявки на патент WO 2014/037585, WO 2014/057109, WO 2015/052344). В одном воплощении предложена клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин) способная продуцировать биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем. Такая клетка-хозяин содержит, предпочтительно в результате инженерии клетки-предшественника, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген gtrS, который, насколько известно авторам изобретения, впервые идентифицирован ими как кодирующий фермент, обеспечивающий ветвление полисахаридов, способный переносить глюкозу на антиген O4 Е.соН (т.е. глюкозилтрансферазу, специфичную к полисахаридиому антигену O4 Е.соН), и, в частности, к L-Rha посредством а-1,3-гликозидной связи. Пример аминокислотной последовательности такого фермента, обеспечивающего ветвление, представлен в SEQ ID NO: 4. Другие примеры содержат аминокислотные последовательности, которые идентичны ей по меньшей мере на 80%. Приведенные в качестве иллюстрации примеры нуклеиновых кислот, кодирующих гены gtrS, специфичные к полисахаридному антигену O4 Е.соН, включают SEQ ID NO: 5 или вырожденные по отношению к ней последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют SEQ ID NO: 4, или последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют функциональные специфичные к O4 ферменты GtrS, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 4, но не ограничиваются ими.

В конкретном воплощении клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 4, например, приблизительно на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 4. Принимая во внимание избыточность генетического кода, специалист в данной области может создать варианты нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотные последовательности глюкозилтрансфераз, например, используя последовательности с оптимизированными кодонами, при желании.

В некоторых воплощениях клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу (GtrS), идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 4, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую транслоказу глюкозы, связанной с бактопренолом (GtrA), идентичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO: 7, и нуклеотидную последовательность, кодирующую бактопренол-глюкозилтрансферазу (GtrB), идентичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых воплощениях указанные последовательности нуклеиновых кислот кодируют белки GtrA и GtrB, которые по меньшей мере приблизительно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, и обладают активностью транслоказы глюкозы, связанной с бактопренолом (SEQ ID NO: 7) и бактопренол-глюкозилтрансферазы (SEQ ID NO: 8), соответственно. Принимая во внимание избыточность генетического кода, специалист в данной области может создать варианты нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотные последовательности транлоказ глюкозы, связанной с бактопренолом и бактопренол-глюкозилтрансфераз, например, используя последовательности с оптимизированными кодонами, при желании.

Предложенная клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин) способная продуцировать биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанного с белкомносителем, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность генного кластера rfb для полисахаридного антигена O4 E.coli. Пример генного кластера генов rfb, который может найти применение для продукции полисахаридного антигена O4 Е.соН, представлен в данном документе как SEQ ID NO: 9. Другим примером является локус AY568960, который можно найти в GenBank. Также могут применяться вырожденные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие те же ферменты, которые кодируются этой последовательностью, или последовательности, кодирующие ферменты, которые идентичны по меньшей мере на 80%, предпочтительно идентичны по меньшей мере на 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%.

В конкретном воплощении в настоящем документе представлена клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин, предпочтительно рекомбинантная прокариотическая клетка-хозяин, предпочтительно рекомбинантная клетка-хозяин Е.соН), которая продуцирует гликозилированный полисахаридный антиген O4, при этом клетка-хозяин содержит gtrS, генный кластер rfb полисахаридного антигена O4 Е.соН и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-носитель. Такие клетки-хозяева могут быть скон

- 23 046206 струированы с использованием рекомбинантных подходов, чтобы они содержали одну или несколько плазмид, содержащих ген gtrS, генный кластер rfb и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую белокноситель, или содержали некоторые или все соответствующие гены, такие как gtrS, кластер rfb и/или нуклеиновая кислота, кодирующая белок-носитель, интегрированные в геном клетки-хозяина. В некоторых воплощениях гены или генные кластеры интегрированы в геном клетки-хозяина с использованием гомологичной рекомбинации. Преимуществом интеграции генов в геном клетки-хозяина является стабильность в отсутствие отбора с использованием антибиотиков.

В другом конкретном воплощении в настоящем документе предложена клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин, предпочтительно рекомбинантная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует гликозилированный полисахаридный антиген O4, при этом клетка-хозяин содержит GtrS (глюкозилтрансферазу), а также ферменты, кодируемые генным кластером rfb. В некоторых воплощениях некоторые или все из вышеуказанных ферментов являются гетерологичными для клеткихозяина.

В других конкретных воплощениях в настоящем документе предложена клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин, предпочтительно рекомбинантная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН, при этом клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель. В одном конкретном воплощении олигосахарилтрансфераза является гетерологичной для клетки-хозяина. В другом конкретном воплощении белок-носитель является гетерологичным для клетки-хозяина. Предпочтительно, клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4. В предпочтительных воплощениях гены rfb кластера O4 являются гетерологичными для клетки-хозяина. Предпочтительно последовательность, кодирующая фермент, который способен вводить ответвленную боковую цепь глюкозы в антиген O4, т.е. ген gtrS (кодирующий глюкозилтрансферазу, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности с SEQ ID NO: 4), является гетерологичной для клетки-хозяина. Нуклеиновая кислота является гетерологичной по отношению к клетке-хозяину, если в природе такая же последовательность отсутствует в указанной клетке-хозяине. Гетерологичная нуклеиновая кислота может быть, например, введена в родительскую клетку с помощью генной инженерии, например, путем трансформации (например, химической трансформации или электропорации) и/или рекомбинации. В некоторых воплощениях гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как желаемый локус rfb, кодирующая последовательность gtrS, последовательность, кодирующая белок-носитель, и/или последовательность, кодирующая гликозилтрансферазу, интегрированы в геном клетки-хозяина, предпочтительно бактериальной клеткихозяина, предпочтительно клетки-хозяина Е.соН. В предпочтительных воплощениях эндогенный локус rfb и, если применимо, кодирующая последовательность gtrS были инактивированы, предпочтительно посредством делеции из генома рекомбинантной клетки-хозяина по сравнению с ее предшественником, и предпочтительно они заменены желаемым гетерологичным локусом rfb, и, если применимо, желаемой кодирующей последовательностью gtrS, соответственно. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой Е.соН K-12 (в качестве неограничивающего примера, штаммом K-12 является штамм Е.соН W3110), или штамм В Е.соН (в качестве неограничивающего примера, штаммом В является штамм Е.соН BL21), или любой другой четко определенный штамм Е.соН, например, лабораторные штаммы или производственные штаммы, в отличие от первичных изолятов дикого типа. В предпочтительных воплощениях клетка-хозяин получена от Е.соН, которая не экспрессирует антиген O4 или гликозилированный антиген O4, путем введения в такую E.coli локуса rfb O4 и гена gtrS, кодирующего глюкозилтрансферазу, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO: 4. Преимуществами использования хорошо охарактеризованных штаммов, таких как Е.соН K-12 или Е.соН В, в качестве предшественников для клеток-хозяев является возможность использовать аналогичный процесс производства для различных биоконъюгатов О-антигена, поскольку характеристики штамма-продуцента четко определены. Несмотря на то, что биоконъюгаты разных О-антигенов будут вести себя по-разному и процессы экспрессии могут быть оптимизированы для каждого производственного штамма, по крайней мере, основной процесс получения биоконъюгатов О-антигена с использованием таких четко определенных штаммов-предшественников будет более предсказуемым, чем когда в качестве предшественников для получения штаммов-хозяев используются неизвестные штаммы, такие как изоляты дикого типа. Таким образом, опыт получения ранее описанных биоконъюгатов О-антигена Е.соН, таких как биоконъюгаты О1А, O2, 06а и 025b, как описано, например, в WO 2015/124769 и WO 2017/035181, может быть использован в качестве основы для разработки производства других биоконъюгатов О-антигена Е.соН. В отличие от gtrS, гены gtrA и gtrB не являются серотип-специфичными, и в некоторых воплощениях они гомологичны клетке-хозяину (например, штамм E.coli K12 W3110 включает гены gtrA и gtrB, которые способны функционировать вместе со специфическим для серотипа O4 рекомбинантно введенным геном gtrS, кодирующим глюкозилтрансферазу SEQ ID NO: 4 или глюкозилтрансферазу, которая идентична ему по меньшей мере на 80%, заменяющим эндогенный ген gtrS). В других воплощениях один или оба гена gtrA и gtrB (кодирующие белки GtrA и GtrB, которые по меньшей мере примерно на 80% идентичны SEQ ID

- 24 046206

NO: 7 и 8, соответственно, и обладают активностью транслоказы бактопренол-связанной глюкозы и бактопренол-глюкозилтрансферазы соответственно, также рекомбинантно вводятся в клетку-хозяин, например, в случае, если клетка-хозяин не имеет эндогенных генов gtrA и/или gtrB.

В данном документе также предложены клетки-хозяева (например, рекомбинантные клеткихозяева) способные продуцировать биоконъюгат полисахаридного антигена О1А, O2, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025b или O75 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем. Такие клетки-хозяева (например, рекомбинантные клетки-хозяева) содержат нуклеотидную последовательность генного кластера rfb, специфичного для полисахаридного О-антигена. Генные кластеры rfb можно выделить из штаммов E.coli дикого типа и объединить с нуклеиновыми кислотами, кодирующими олигосахарилтрансферазу (например, PglB) и белок-носитель (например, ЕРА) в одной клетке-хозяине, чтобы получить рекомбинантную клетку-хозяина, которая продуцирует представляющий интерес О-антиген Е.соН или его биоконъюгат. Например, такие клетки-хозяева могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных подходов, чтобы они содержали одну или несколько плазмид, содержащих генный кластер rfb, олигосахарилтрансферазу (например, PglB) и белок-носитель (например, ЕРА), с использованием технологии биоконъюгирования, такой как описанная в WO 2014/037585, w0 2009/104074 и WO 2009/089396. Предпочтительно клетки-хозяева содержат генные кластеры rfb, интегрированные в их геном. В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты, кодирующие олигосахарилтрансферазу, белок-носитель и, где это применимо, ген gtrS, также интегрированы в геном клетки-хозяина. В некоторых воплощениях гетерологичные или гомологичные гены gtrA и gtrB также интегрированы в геном клетки-хозяина. Получение биоконъюгатов для антигенов О1А, O2, О6А и 025В подробно описано в WO 2015/124769 и WO 2017/035181. Примеры генных кластеров для каждого О-антигена Е.соН (локусы rfb) описаны Iguchi A, et al, DNA Research, 2014, 1-7 (doi: 10.1093/dnares/dsu043) и DebRoy C, et al, PLoS One. 2016, 11(1):e0147434 (doi: 10.1371/journal.pone.0147434; исправления в: Plos One. 2016, 11(4):e0154551, doi:

10.1371/journal.pone.0154551). Последовательности нуклеиновых кислот для кластеров rfb и аминокислотные последовательности для белков, кодируемых в них, также можно найти в общедоступных базах данных, таких как GenBank. Примеры последовательности кластеров rfb, которые можно использовать в штаммах-продуцентах для биоконъюгатов с полисахаридными антигенами серотипов, раскрытых в данном документе, также представлены в SEQ ID NO: 9 и 11-19. Таким образом, для каждого из желаемых биоконъюгатов, упомянутых выше, соответствующий кластер rfb может быть введен в клетку-хозяина, чтобы получить клетки-хозяева содержащие специфический кластер rfb для желаемого О-антигена, а также содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую олигосахарилтрансферазу и белок-носитель. По причинам, указанным выше, предпочтительно, чтобы клетки-хозяева были рекомбинантными клеткамихозяевами и предпочтительно происходили из штаммов с относительно хорошо известными характеристиками, таких как лабораторные или производственные штаммы Е.соН, например Е.соН K12 или Е.соН BL21 и т.д. Предпочтительно кластеры rfb гетерологичны клетке-хозяину, например, введены в клеткупредшественницу клетки-хозяина и предпочтительно интегрированы в ее геном. Предпочтительно исходный генный кластер rfb, если таковой присутствовал в клетке-предшественнике, заменен в клеткехозяине кластером генов rfb для интересующего О-антигена, чтобы обеспечить продукцию биоконъюгата интересующего О-антигена. Предпочтительно олигосахарилтрансфераза гетерологична для клеткихозяина, и в некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая такую олигосахарилтрансферазу, интегрирована в геном клетки-хозяина.

Любая из клеток-хозяев, предложенных в настоящем документе (например, рекомбинантные клетки-хозяева, предпочтительно рекомбинантные прокариотические клетки-хозяева), содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие дополнительные ферменты, активные в N-гликозилировании белков, например, предложенная клетка-хозяин может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую олигосахарилтрансферазу, или нуклеиновые кислоты, кодирующие другие гликозилтрансферазы.

Предложенные в данном документе клетки-хозяева содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую олигосахарилтрансферазу. Олигосахарилтрансферазы переносят связанные с липидом олигосахариды на аспарагиновые остатки образующихся полипептидных цепей, которые содержат консенсусный мотив Nгликозилирования. Нуклеиновая кислота, кодирующая олигосахарилтрансферазу, может быть нативной для клетки-хозяина или может быть введена в клетку-хозяин с использованием генетических подходов. В предпочтительных воплощениях олигосахарилтрансфераза является гетерологичной для клетки-хозяина. Е.соН в природе не содержит олигосахарилтрансферазу, и, следовательно, если Е.соН используется в качестве клетки-хозяина для продукции биоконъюгатов, в такой клетке-хозяине содержится гетерологичная олигосахарилтрансфераза, например, введенная посредством генной инженерии. Олигосахарилтрансфераза может происходить из любого источника, известного в данной области техники с учетом настоящего раскрытия. В некоторых воплощениях в качестве альтернативы олигосахарилтрансферазе с N-гликозилтрансферазной активностью, такой как О-гликозилтрансфераза, в качестве неограничивающего примера можно использовать, например, PglL в сочетании с ее собственной, иной консенсусной последовательностью гликозилирования в белке-носителе, как, например, описано в WO 2016/82597. Таким образом, согласно изобретению, в качестве олигосахарилтрансферазы также можно использовать другие гликозилтрансферазы, такие как О-гликозилтрансферазы.

- 25 046206

В некоторых предпочтительных воплощениях олигосахарилтрансфераза представляет собой олигосахарилтрансферазу из Campylobacter. Например, в одном воплощении олигосахарилтрансфераза представляет собой олигосахарилтрансферазу из Campylobacter jejuni (т-.e. pglB; см., например, Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; см. также, например, NCBI Gene ID: 3231775, номер доступа Uniprot 086154). В другом воплощении олигосахарилтрансфераза представляет собой олигосахарилтрансферазу из Campylobacter lari (см., например, NCBI Gene ID: 7410986).

В конкретных воплощениях олигосахарилтрансфераза представляет собой олигосахарилтрансферазу PglB из Campylobacter jejuni, включая природный белок (дикого типа) или любой его вариант, например, описанный в опубликованных международных заявках на патент WO 2016/107818 и WO 2016/107819. PglB может переносить связанные с липидом олигосахариды на остатки аспарагина в консенсусных последовательностях SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В конкретных воплощениях олигосахарилтрансфераза PglB содержит SEQ ID NO: 6 или ее вариант. В некоторых воплощениях одна или несколько эндогенных консенсусных последовательностей гликозилирования в PglB дикого типа были мутированы, чтобы избежать аутогликозилирования PglB, например SEQ ID NO: 6, содержащая мутацию N534Q. Примеры вариантов олигосахарилтрансфераз PglB, подходящих для применения в рекомбинантных клетках-хозяевах, предложенных в настоящем документе, включают олигосахарилтрансферазу PglB с SEQ ID NO: 6, содержащую по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из N311V, K482R, D483H, A669V, Y77H, S80R, Q287P и K289R. В одном конкретном воплощении вариант олигосахарилтрансферазы PglB имеет SEQ ID NO: 6, содержащую мутацию N311V. В другом конкретном воплощении вариант олигосахарилтрансферазы PglB имеет SEQ ID NO: 6, содержащую мутации Y77H и N311V. В другом конкретном воплощении вариант олигосахарилтрансферазы PglB имеет SEQ ГО NO: 6, содержащую мутации N311V, K482R, D483H и A669V. В другом конкретном воплощении вариант олигосахарилтрансферазы PglB имеет SEQ ГО NO: 6, содержащую мутации Y77H, S80R, Q287P, K289R и N311V. Обнаружено и описано в настоящем документе, что некоторые варианты олигосахарилтрансферазы PglB неожиданно обеспечивают улучшенный выход при продукции биоконъюгатов Оантигена Е.соН определенных серотипов. Улучшенный или оптимальный вариант PglB для заданного Оантигена Е.соН предсказать невозможно. Таким образом, в некоторых аспектах изобретения также преложены способы получения биоконъюгатов специфических О-антигенов Е.соН с использованием в качестве олигосахарилтрансферазы специфических вариантов PglB. Дополнительные варианты PglB, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичны SEQ ID NO: 6 и все еще обладают олигосахарилтрансферазной активностью, предпочтительно имея в комбинации одну или несколько конкретных аминокислот в указанных положениях, изложенных в данном документе (например, 77Y, 80S, 287Q, 289K, 311N, 482K, 483D, 669А; или 311V; или 311V, 482R, 483Н, 669V; или 77Н, 80R, 287Р, 289R, 311V; или 77Н, 311V; и т.д.) также можно использовать для производства биоконъюгатов.

В конкретном воплощении клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу PglB Campylobacter jejuni, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую мутацию N311V, или более предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую мутации Y77H и N311V. В других конкретных воплощениях клеткахозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат полисахаридного антигена О1А, 06а или O15 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу PglB Campylobacter jejuni, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую мутации N311V, K482R, D483H и A669V.

В конкретном воплощении клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат полисахаридного антигена O16 E.coli, ковалентно связанный с белкомносителем, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу PglB Campylobacter jejuni, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую мутации Y77H, S80R, Q287P, K289R и N311V.

В конкретном воплощении клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат полисахаридного антигена O75 E.coli, ковалентно связанный с белкомносителем, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу PglB Campylobacter jejuni, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую мутацию N311V.

В конкретном воплощении клетка-хозяин (например, рекомбинантная клетка-хозяин), способная продуцировать биоконъюгат полисахаридного антигена O8, О18А, 025В или O2 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу PglB Campylobacter jejuni, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, предпочтительно где SEQ ID NO: 6 не содержит аминокислотные мутации в положениях 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 и 669.

В некоторых воплощениях любые из клеток-хозяев, предложенных в данном документе, содержат

- 26 046206 нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-носитель, например, белок, к которому может (могут) быть присоединен(ы) полисахаридный(ые) О-антиген(ы), продуцируемый(ые) аппаратом гликозилирования клетки-хозяина, с образованием биоконъюгата. Клетка-хозяин может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую любой белок-носитель, известный специалистам в области техникис учетом данного изобретения, включая обезвреженный экзотоксин А P.aeruginosa (EPA), флагеллин Е.соН (FHC), CRM 197, мальтозосвязывающий белок (МВР), дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, обезвреженный гемолизин A S.aureus, агглютинирующий фактор А, агглютинирующий фактор В, термолабильный энтеротоксин Е.соН, обезвреженные варианты термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицу В холерного токсина (СТВ), холерный токсин, обезвреженные варианты холерного токсина, белок Sat E.coli, домен-пассажир белка Sat E.coli, пневмолизин Streptococcus pneumoniae, гемоцианин Megathura crenulata (KLH), PcrV P.aeruginosa, белок внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белок D из нетипируемого Haemophilus influenzae, но не ограничиваясь перечисленным.

В предпочтительных воплощениях клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa (EPA). Предпочтительно, белок-носитель ЕРА содержит 1-10 сайтов гликозилирования, предпочтительно от 2 до 4 сайтов гликозилирования, наиболее предпочтительно 4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и, наиболее предпочтительно, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В конкретном воплощении клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-носитель ЕРА-4, содержащую SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях белки-носители, используемые при создании биоконъюгатов клетками-хозяевами, описанными в настоящем документе, содержат метку, то есть последовательность аминокислот, которая позволяет выделять и/или идентифицировать белокноситель. Например, добавление метки к белку-носителю может быть полезно для очистки этого белка и, следовательно, очистки конъюгированных вакцин, содержащих меченый белок-носитель. Примеры меток, которые могут быть использованы в данном документе, включают, без ограничения, гистидиновые (HIS) метки (например, гексагистидиновые метки или 6XHis-Tag), метки FLAG-TAG и НА (гемагглютининовые). В некоторых воплощениях используемые здесь метки являются удаляемыми, например, удаляются химическими агентами или ферментативными способами, когда они больше не нужны, например, после очистки белка. В других воплощениях белок-носитель не содержит метку.

В некоторых воплощениях белок носитель, описанный в данном документе, содержит сигнальную последовательность, которая направляет белок носитель в периплазматическое пространство клеткихозяина, экспрессирующей белок носитель. В конкретном воплощении сигнальная последовательность происходит из Е.соН DsbA, порина А внешней мембраны Е.соН (OmpA), мальтозосвязывающего белка Е.соН (MalE), пектатлиазы Erwinia carotovorans (PelB), Flgl, NikA или эндоксиланазы (XynA) Bacillus, sp., термолабильного энтеротоксина LTIIb E.coli, эндоксиланазы XynA Bacillus или флагеллина (Flgl) E.coli.B одном воплощении сигнальная последовательность содержит SEQ ID NO: 10. Сигнальная последовательность может быть отщеплена после транслокации белка в периплазму и, таким образом, может больше не присутствовать в конечном белке-носителе биоконъюгата.

В некоторых воплощениях в клетки-хозяева могут быть введены дополнительные модификации (например, с использованием рекомбинантных методов), описанные в настоящем документе. Например, в фоновом генотипе (геноме) клетки-хозяина может быть осуществлена делеция или модификация нуклеиновых кислот клетки-хозяина (например, генов), которые кодируют белки, которые образуют часть возможного конкурирующего или мешающего пути гликозилирования (например, конкурируют или мешают одному или нескольким гетерологичным генам, участвующим в гликозилировании, которые рекомбинантно вводятся в клетку-хозяина), таким образом, чтобы инактивировать их/сделать их дисфункциональными (т.е. нуклеиновые кислоты клетки-хозяина, которые подвергнуты делеции/модификации, не кодируют функциональный белок). В некоторых воплощениях, когда осуществлена делеция нуклеиновых кислот из генома клеток-хозяев, предложенных в данном документе, они заменены желаемой последовательностью, например, последовательностью, которая полезна для продукции полисахаридного О-антигена или его биоконъюгата. Примеры генов или генных кластеров, которые могут быть подвергнуты делеции в клетках-хозяевах (и, в некоторых случаях, заменены другими желательными последовательностями нуклеиновых кислот), включают гены или генные кластеры клеток-хозяев, участвующих в биосинтезе гликолипидов, такие как waaL (см., например, Feldman et al. al., 2005, PNAS USA 102: 30163021), кластер биосинтеза ядра липида А (wad), кластер галактозы (gal), кластер арабинозы (ara), кластер колановой кислоты (wc), кластер капсульного полисахарида, гены биосинтеза ундекапренола-р (например, uppS, uppP), гены рециркуляции und-P, метаболические ферменты, участвующие в биосинтезе сахаров, активированных нуклеотидами, общий кластер антигенов энтеробактерий (еса) и кластеры модификации О-антигена профагов, такие как кластер gtrABS или его области. В конкретном воплощении описанные в данном документе клетки-хозяева модифицированы таким образом, что они не продуцируют какого-либо полисахаридного О-антигена, кроме желаемого полисахаридного О-антигена, например, гликозилированного полисахаридного антигена O4.

В конкретном воплощении ген waaL удален из генома клетки-хозяина (например, рекомбинантной

- 27 046206 клетки-хозяина), предложенной в данном документе, или функционально инактивирован. Термины waaL и ген waaL относятся к гену О-антиген-лигазы, кодирующему связанный с мембраной фермент с активным сайтом, расположенным в периплазме. Кодируемый фермент переносит О-антиген, связанный с ундекапренилфосфатом (UPP), в ядро липида А, образуя липополисахарид. Делеция или разрушение эндогенного гена waaL (например, у штаммов AwaaL) нарушает перенос О-антигена на липид А и вместо этого может усиливать перенос О-антигена на другую биомолекулу, такую как белок-носитель.

В другом конкретном воплощении в исходном геноме прокариотической клетки-хозяина, представленной в настоящем документе, осуществлена делеция или функциональная инактивация одного или более чем одного из: гена waaL, гена gtrA, гена gtrB, гена gtrS и генного кластера rfb.

В одном воплощении используемая клетка-хозяин представляет собой Е.соН, которая продуцирует биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4, при этом в геноме клетки-хозяина осуществлена делеция или функциональная инактивация гена waaL и вставка гена gtrS, специфичного для полисахаридного антигена O4 Е.соН. В некоторых воплощениях для штаммов-продуцентов биоконъюгатов гликозилированного О-антигена O4 ген gtrS, кодирующий глюкозилтрансферазу, идентичную по меньшей мере на 80% последовательности с SEQ ID NO: 4, вставляют вместо гена gtrS родительского штамма, чтобы заменить ген gtrS в этом родительском штамме на ген, который отвечает за гликозилирование антигена O4. Примером такого родительского штамма является штамм W3110 E.coli K-12. Г ены gtrA и gtrB могут быть гомологичными для родительского штамма, или, в альтернативном варианте, один или оба этих гена могут быть гетерологичными для родительского штамма. Как правило, в отличие от гена gtrS, эти гены gtrA и gtrB неспецифичны для структуры О-антигена. В данном документе также предложены способы создания рекомбинантных клеток-хозяев. Рекомбинантные клетки-хозяева, полученные способами, описанными в данном документе, могут применяться для получения биоконъюгатов О-антигенов Е.соН. Способы включают введение одной или более чем одной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку для получения рекомбинантной клетки-хозяина. Как правило, молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот являются гетерологичными. Для внедрения молекул рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина можно применять любой подходящий с учетом данного описания способ, известный в области техники. Рекомбинантные нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетки-хозяева, описанные в данном документе, с помощью любых способов, известных специалистам в данной области, например, электропорации, химической трансформации, теплового шока, естественной трансформации, фаговой трансдукции и конъюгации. В конкретных воплощениях рекомбинантные нуклеиновые кислоты вводят в клетки-хозяева, описанные в данном документе, с использованием плазмиды. Например, гетерологичные нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться в клетках-хозяевах с помощью плазмиды (например, вектора экспрессии). В другом конкретном воплощении гетерологичные нуклеиновые кислоты вводят в клетки-хозяева, описанные в настоящем документе, с использованием метода вставки в геном, как например, описано в опубликованных международных заявках на патент WO 2014/037585, WO 2014/057109 или WO 2015/052344.

В одном воплощении способ получения рекомбинантной клетки-хозяина для получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белкомносителем, включает введение в клетку, предпочтительно клетку Е.соН, молекул одной или нескольких рекомбинантных нуклеиновых кислот, чтобы получить рекомбинантную клетку-хозяина. В таких воплощениях молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, введенные в клетку, включают (1) нуклеотидную последовательность генного кластера rfb для полисахаридного антигена O4 Е.соН; (2) нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4, где глюкозилтрансфераза способна модифицировать полисахаридный антиген O4 Е.соН с образованием гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН; (3) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель; и (4) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил трансферазу, способную ковалентно связывать гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН с белком-носителем для получения биоконъюгата. В предпочтительных воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая глюкозилтрансферазу, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4, заменяет эндогенный ген gtrS. Делеция эндогенного gtrS имеет то преимущество, что оно не мешает образованию полисахаридной структуры гликозилированного антигена O4. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность генного кластера rfb для полисахаридного антигена O4 Е.соН замещает эндогенный кластер генов rfb родительского штамма, который используется для создания рекомбинантной клетки-хозяина. Если клетка еще не кодирует гены gtrA и/или gtrB, в клетку можно внедрить нуклеотидные последовательности, кодирующие транслоказу (gtrA) и глюкозилтрансферазу (gtrB), последовательность которых по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно. Если клетка уже кодирует гены gtrA и gtrB (как, например, в случае штамма W3110 Е.соН K-12), нет необходимости вводить или изменять эти гены.

В конкретном воплощении глюкозилтрансфераза (gtrS, специфичная для добавления глюкозной ветви к антигену O4) имеет SEQ ID NO: 4.

В конкретном воплощении олигосахарилтрансфераза представляет собой PglB из ^jejuni. В одном таком воплощении олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID

- 28 046206

NO: 6. В другом таком воплощении олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, содержащую мутацию N311V. В другом таком воплощении олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, содержащую мутации Y77H и N311V.

В другом конкретном воплощении белок-носитель содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно SEQ ID NO: 2. В другом конкретном воплощении белок-носитель представляет собой ЕРА, предпочтительно ЕРА-4, такой как ЕРА-4, содержащий SEQ ID NO: 3.

Штаммы Е.соН, которые обычно используются в молекулярной биологии как инструмент и как модельный организм, могут, например, использоваться в качестве родительских клеток для клеток-хозяев в некоторых воплощениях изобретения. Неисчерпывающие примеры включают штаммы Е.соН K12 (например, такие как W1485, W2637, W3110, MG1655, DH1, DH5a, DH10 и т.д.), В штаммы (например, BL21, REL606 и т.д.), С штаммы или W штаммы. В одном конкретном воплощении штамм-хозяин происходит из родительского штамма W3110. Этот штамм можно, например, получить из музея культур Е.соН в Йельском университете. Для получения дополнительной информации о Е.соН см., например, Ecoliwiki.net.

Способы получения конъюгатов и биоконъюгатов.

Также предложены способы получения гликоконъюгатов полисахаридных О-антигенов Е.соН, описанных в данном документе. Гликоконъюгаты, включая биоконъюгаты, могут быть получены in vitro или in vivo, например, с использованием для получения рекомбинантных клеток-хозяев, описанных в данном документе. В некоторых воплощениях гликоконъюгаты могут быть получены путем химического синтеза, т.е. получены вне клеток-хозяев (in vitro). Например, полисахаридный О-антиген Е.соН может быть конъюгирован с белками-носителями, с применением способов, известных специалистам в области техники, включая способы с применением активации реакционноспособных групп полисахарида/олигосахарида, а также белка носителя. См., например, Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; и Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978), содержание которых включено во всей полноте путем ссылки. Такие подходы включают экстрагирование антигенных полисахаридов/олигосахаридов из клеток-хозяев, очистку полисахаридов/олигосахаридов, химическую активацию полисахаридов/олигосахаридов и конъюгирование полисахаридов/олигосахаридов с белком носителем. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, описанные в данном документе, могут применяться для получения биоконъюгатов, содержащих полисахаридный О-антиген Е.соН, ковалентно связанный с белком-носителем. Способы получения таких биоконъюгатов известны в области техники. См., например, WO 2003/074687 и WO 2006/119987. Такие способы включают культивирование любой рекомбинантной клетки-хозяина, описанной в данном документе, в условиях для продуцирования биоконъюгата. Биоконъюгаты могут быть выделены, отделены и/или очищены из рекомбинантных клеток-хозяев с использованием любого способа, известного в данной области с учетом настоящего раскрытия. Например, биоконъюгаты могут быть очищены любым способом очистки белка, известным в области техники, например, посредством хроматографии (например, ионообменной, анионообменной, аффинной и колоночной хроматографии с разделением по размерам), центрифугирования, по различиям в растворимости или любым другим стандартным способом очистки белков. См., например, способы, описанные в WO 2009/104074. Кроме того, для облегчения очистки биоконъюгаты могут быть слиты с последовательностями гетерологичных полипептидов. Фактические условия, используемые для очистки конкретного биоконъюгата, будут частично зависеть от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность и/или гидрофильность биоконъюгата, и будут очевидны специалистам в области техники. Получение биоконъюгатов для О1А, O2, 06 а и 025b, а также содержащих их вакцинных композиций, например, было описано в WO 2015/124769 и WO 2017/035181. Также представлены биоконъюгаты, полученные описанными здесь способами, то есть с использованием рекомбинантных клеток-хозяев, описанных в данном документе.

В некоторых воплощениях способ получения биоконъюгата полисахаридного О-антигена Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, включает: (1) получение рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей (а) нуклеотидную последовательность генного кластера rfb для полисахаридного О-антигена; (б) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, предпочтительно ЕРА, содержащий по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно SEQ ID NO: 2, и более предпочтительно содержащий четыре сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2; и (в) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу, например, олигосахарилтрансферазу PglB или ее вариант. В некоторых воплощениях полисахаридные О-антигены Е.соН, полученные с использованием рекомбинантных клеток-хозяев, описанных в данном документе, ковалентно связаны с белком-носителем при определенном массовом соотношении полисахарида к белку (масс/масс). Это массовое соотношение количества полисахаридного О-антигена, ковалентно связанного с белком-носителем, называется соотношением гликан/белок, или соотношением полисахарид/белок, или соотношением PS/белок. В некоторых воплощениях полисахаридный О-антиген ковалентно связан с белком-носителем при соотношении полиса

- 29 046206 харида и белка (мас./мас.) примерно от 1:20 до 20:1, предпочтительно от 1:10 до 10:1, более предпочтительно от 1:3 до 3:1. В некоторых неограничивающих воплощениях биоконъюгатов, описанных в данном документе, соотношение гликан/белок составляет примерно от 0,1 до 0,5, например, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 или 0,5. В таких воплощениях массовое соотношение полисахаридный Оантиген:белок составляет примерно от 1:10 до 1:2, например, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 или 1:2, в зависимости от конкретного серотипа О-антигена. В некоторых воплощениях соотношение гликан/белок составляет от примерно 0,15 до примерно 0,45. В общем, более высокое соотношение гликан/белок полисахаридного О-антигена к белку-носителю является предпочтительным, поскольку в некоторых случаях высокое количество белка-носителя может привести к иммунологическому взаимовлиянию. Кроме того, более высокое соотношение гликан/белок поможет получить достаточное количество полисахаридного О-антигена, дозированного в форме биоконъюгата, при сохранении относительно низкого количества белка-носителя, что особенно полезно для поливалентных композиций, в которых композиция должна охватывать несколько серотипов, например, композиций, содержащих биоконъюгаты по меньшей мере 4 различных О-антигенов, по меньшей мере 5 различных О-антигенов, по меньшей мере 6 различных О-антигенов, по меньшей мере 7 различных О-антигенов, по меньшей мере 8 различных Оантигенов, по меньшей мере 9 различных О-антигенов, по меньшей мере 10 различных О-антигенов и т. д.

Соотношение гликан/белок в конъюгате согласно изобретению может быть определено путем определения количества белка и количества гликана. Количество белка можно определить путем измерения поглощения УФ излучения при 280 нм (А280). Количество гликанов может быть определено на основе ионной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (IC-PAD) сахара в повторяющейся единице (например, Man для O8 из табл. 1 и GlcNAc для других гликанов из табл. 1), после чего структурная информация о повторяющейся единице может использоваться для расчета общего количества гликанов (например, повторяющаяся единица О1А имеет молярную массу 845 Да, а один моль такой повторяющейся единицы содержит один моль GlcNAc, что позволяет рассчитать общее количество гликанов, когда количество GlcNAc было определено IC-PAD).

В некоторых воплощениях биоконъюгат полисахаридного антигена 025b Е.соН, ковалентно связанный с белком-носителем, полученным с использованием рекомбинантной клетки-хозяина в соответствии с клетками и способами, описанными в настоящем документе, имеет определенную степень ацетилирования в положении 2 сахара L-Rh. Степень О-ацетилирования полисахаридного антигена 025В в биоконъюгате составляет предпочтительно, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100%.

Аналогично, степень О-ацетилирования полисахаридного антигена O16 Е.соН в биоконъюгате составляет предпочтительно, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100%.

В конкретных воплощениях способ получения биоконъюгата полисахаридного О-антигена включает получение рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую конкретный фермент олигосахарилтрансферазу, в частности олигосахарилтрансферазу PglB или ее вариант, в зависимости от биоконъюгата полисахаридного О-антигена, который требуется получить. Конкретный вариант фермента олигосахарилтрансферазы может влиять на выход биоконъюгата, продуцируемого клеткой-хозяином. Обычно более высокий выход является предпочтительным, поскольку выход будет влиять на затраты на получение конкретного биоконъюгата, что особенно важно для поливалентных композиций, содержащих несколько различных биоконъюгатов.

В одном конкретном воплощении, когда О-антиген представляет собой полисахаридный антиген О1А, О6А или O15, олигосахарилтрансфераза PglB содержит аминокислотные мутации N311V, K482R, D483H и A669V, где аминокислотные мутации относятся к PglB дикого типа, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В другом конкретном воплощении, когда О-антиген представляет собой полисахаридный антиген O4, олигосахарилтрансфераза PglB содержит аминокислотную мутацию N311V или аминокислотные мутации Y77H и N311V, где аминокислотные мутации относятся к PglB дикого типа, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В другом конкретном воплощении, когда О-антиген представляет собой полисахаридный антиген O16, олигосахарилтрансфераза PglB содержит аминокислотные мутации Y77H, S80R, Q287P, K289R и N311V, где аминокислотные мутации относятся к PglB дикого типа, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В другом конкретном воплощении, когда О-антиген представляет собой полисахаридный антиген O75, олигосахарилтрансфераза PglB содержит аминокислотную мутацию N311V, где аминокислотные мутации относятся к PglB дикого типа, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В другом конкретном воплощении, когда О-антиген представляет собой полисахаридный антиген O8, О18А, 025В или O2, олигосахарилтрансфераза PglB содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, где SEQ ID NO: 6 не содержит аминокислотные мутации в положениях 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 и 669. В некоторых воплощениях олигосахарилтрансфераза PglB содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

- 30 046206

В некоторых воплощениях биоконъюгаты полисахаридных О-антигенов, продуцируемые рекомбинантными клетками-хозяевами, кодирующими ферменты олигосахарилтрансферазы из пар Оантиген/олигосахарилтрансфераза PglB, указанных выше, предпочтительно имеют одну или несколько предпочтительных характеристик, описанных в данном документе, например соотношение гликан/белок и/или процент мультигликозилированного белка-носителя.

Воплощения

Воплощение 1 представляет собой биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанный с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-GlC+) a-D-GIcp

I з [->2)-a-L-Rhap-(1 ->6)-a-D-Glcp-( 1 ->3)-a-L-FucpNAc-(1 ->3)-p-D-GlcpNAc-( 1 ->] _n где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

Воплощение 1 представляет собой биоконъюгат по воплощению 1, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН ковалентно связан с остатком Asn в сайте гликозилирования в белкеносителе, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 3 представляет собой биоконъюгат по воплощению 1 или воплощению 2, где белокноситель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А Р.aeruginosa (ЕРА), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Sat E.coli, домена-пассажира белка Sat E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P. aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae.

Воплощение 4 представляет собой биоконъюгат по воплощению 3, где белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa (EPA), предпочтительно содержащий от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, предпочтительно от 2 до 4, консенсусных последовательностей гликозилирования, имеющих SEQ ID NO: 1, консенсусные последовательности предпочтительно имеют SEQ ID NO: 2.

Воплощение 5 представляет собой биоконъюгат по воплощению 4, где белок-носитель содержит четыре консенсусных последовательности гликозилирования (ЕРА-4), предпочтительно где белокноситель содержит SEQ ID NO: 3.

Воплощение 6 представляет собой композицию, содержащую биоконъюгат по любому из воплощений 1-5.

Воплощение 7 представляет собой иммуногенную композицию, содержащую биоконъюгат по любому из воплощений 1-5.

Воплощение 8 представляет собой композицию по воплощению 6 или иммуногенную композицию по воплощению 7, содержащую по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген, ковалентно связанный с белком-носителем. Воплощение 9 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 8, где по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген выбран из группы, состоящей из полисахаридного антигена O1A E.coli, полисахаридного антигена O2 E.coli, полисахаридного антигена 06 а Е.соН, полисахаридного антигена O8 E.coli, полисахаридного антигена O15 E.coli, полисахаридного антигена O16 E.coli, полисахаридного антигена О18А E.coli, полисахаридного антигена 025В E.coli и полисахаридного антигена O75 E.coli. Воплощение 10 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 9, где (1) полисахаридный антиген O1A E.coli содержит структуру формулы (О1А)

[—3)-a-L-Rhap-(1 —3)-a-L-Rhap-(1 ->3)-₽-L-Rhap-(1 -*4)-p-D-GlcpNAc-(1 ->]_n2 t 1 β-D-ManpNAc (2) полисахаридный антиген O2 Е.соН содержит структуру формулы (O2) [-*3)-a-L-Rhap-(1 ^2)-a-L-Rhap-(1 ->3)-p-L-Rhap-(1 -»4)-p-D-GlcpNAc-(1 -]_n2 t 1 a-D-Fucp3NAc (3) полисахаридный антиген О6АВ.соН содержит структуру формулы (О6А)

- 31 046206

[->4)-a-D-GalpNAc-(1 ->3)-β-0-Μ3ηρ-(1 -4)-p-D-Manp-(1 ->3)-a-D-GlcpNAc-(1 -*]_n2 t 1 β-D-Glcp (4) полисахаридный антиген O8 E.coli содержит структуру формулы (O8) a-D-Manp3Me-(1 -*[3)-p-D-Manp-(1 ->2)-a-D-Manp-(1 ->2)-a-D-Manp-(1 -»]_n (5) полисахаридный антиген O15 E.coli содержит структуру формулы (O15) [^2)-p-D-Galp-(1^3)-a-L-FucpNAc-(1^3)-p-D-GlcpNAc-(1^]_n (6) полисахаридный антиген O16 Е.соН содержит структуру формулы (O16)

[“►2)-p-D-Galf-(1-*6)4x-D-Glcp-(1-*3)4x-L-Rhap-(1-*3)-a-D-GlcpNAc-(1-*]_n t Ac (7) полисахаридный антиген 018а E.coli содержит структуру формулы (О18А) [^2)-a-L-Rhap-(1->6)-a-D-Glcp-(1-4)-a-D-Galp-(1^3)-a-D-GlcpNAc-(1^]_n t 1 β-D-GlcpNAc (8) полисахаридный антиген 025В Е.соН содержит структуру формулы (025В) β-D-Glcp !

[-*4)-a-D-Glcp-(1 -»3)-a-L-Rhap-(1 -^3)^-D-GlcpNAc-(1 -^]_n3 t 1 a-L-Rhap ,.

;

(9) полисахаридный антиген O75 Е.соН содержит структуру формулы (O75) β-D-Manp г 4

[^3)-a-D-Galp-(1 ->4)-a-L-Rhap-(1 ->3)-3-D-GlcpNAc-(1 где каждый n независимо представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

Воплощение 11 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 10, где каждый из дополнительных полисахаридных антигенов О1А, O2, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и/или O75 Е.соН ковалентно связан с остатком Asn в сайте гликозилирования в каждом белкеносителе, содержащем консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 12 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 11, где каждый белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA).

Воплощение 13 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 12, где каждый ЕРА содержит 1-10, предпочтительно 2-4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 14 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 12, где каждый ЕРА содержит четыре сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 15 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по воплощению 12, где каждый ЕРА содержит SEQ ID NO: 3.

Воплощение 16 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по любому из воплощений 9-15, которая содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный О4, О6А и О25В E.coli, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем.

Воплощение 17 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по любому из воплощений 9-15, которая содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированный О4, О6А, О8, О15, О16, О25В и О75 E.coli, каждый из которых ковалентно связан с белком носителем.

Воплощение 18 представляет собой композицию или иммуногенную композицию по любому из воплощений 9-15, которая содержит по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, О2, гликозилированный О4, О6А, О8, О15, О16, О18А, О25В и О75 E.coli, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем.

Воплощение 19 представляет собой композицию, содержащую:

- 32 046206

1. биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанного с обезвреженным экзотоксином А Р.aeruginosa (белком-носителем ЕРА-4), содержащим SEQ ID NO: 3, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+);

2. биоконъюгат полисахаридного антигена O1A E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O1A E.coli содержит структуру формулы (О1А);

3. биоконъюгат полисахаридного антигена O2 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O2 Е.соН содержит структуру формулы (O2);

4. биоконъюгат полисахаридного антигена 06а E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген О6А Е.соН содержит структуру формулы (О6А);

5. биоконъюгат полисахаридного антигена O8 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O8 Е.соН содержит структуру формулы (O8);

6. биоконъюгат полисахаридного антигена O15 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O15 Е.соН содержит структуру формулы (O15);

7. биоконъюгат полисахаридного антигена O16 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O16 Е.соН содержит структуру формулы (O16);

8. биоконъюгат полисахаридного антигена 025В E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген 025В Е.соН содержит структуру формулы (025В); и

9. биоконъюгат полисахаридного антигена O75 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген O75 Е.соН содержит структуру формулы (O75);

где каждая из структур формул (O4-Glc+), (01А), (O2), (06А), (O8), (O15), (O16), (025В) и (O75) показана в табл. 1, и каждый n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

Воплощение 20 представляет собой композицию по воплощению 19, дополнительно содержащую:

(10) биоконъюгат полисахаридного антигена О18А Е.соН, ковалентно связанного с белкомносителем ЕРА-4, где полисахаридный антиген О18А Е.соН содержит структуру формулы (О18А), показанную в табл. 1, и n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

Воплощение 21 представляет собой способ индукции у субъекта антител против гликозилированного антигена O4 E.coli, включающий введение субъекту биоконъюгата по любому из воплощений 1-5 или композиции или иммуногенной композиции по любому из воплощений 6-20.

Воплощение 22 представляет собой способ по воплощению 21, где антитела обладают опсонофагоцитарной активностью.

Воплощение 23 представляет собой способ вакцинации субъекта против E.coli, в частности внекишечной патогенной Е.соН (ExPEC), включающий введение субъекту биоконъюгата по любому из воплощений 1-5 или композиции или иммуногенной композиции по любому из воплощений 6-20.

Воплощение 24 представляет собой биоконъюгат по любому из воплощений 1-5 или композицию или иммуногенную композицию по любому из воплощений 6-20 для применения в индукции антител против гликозилированного антигена O4 Е.соН.

Воплощение 25 представляет собой биоконъюгат по любому из воплощений 1-5 или композицию или иммуногенную композицию по любому из воплощений 6-20 для применения в вакцинации против внекишечной патогенной Е.соН (ЕхРЕС).

Воплощение 26 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина для получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 содержит структуру формулы (O4-Glc+), показанную в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, клетка-хозяин содержит:

(1) нуклеотидную последовательность генного кластера rfb для полисахаридного антигена O4 Е.соН (2) нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкозилтрансферазу, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4, где глюкозилтрансфераза способна модифицировать полисахаридный антиген O4 Е.соН с получением гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН;

(3) нуклеотидные последовательности, кодирующие транслоказу и гликозилтрансферазу, последовательности которых по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, где транслоказа способна транслоцировать бактопренол-связанную глюкозу, а гликозилтрансфераза способна гликозилировать бактопренол;

Воплощение 27 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина по воплощению 26, где: глюкозилтрансфераза имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, предпочтительно SEQ ID NO: 6, содер

- 33 046206 жащую аминокислотную мутацию N311V, более предпочтительно SEQ ID NO:6, содержащую аминокислотные мутации Y77H и N311V; и белок-носитель содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 28 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина по воплощению 26 или воплощению 27, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А P. aeruginosa (ЕРА), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Sat E.coli, домена-пассажира белка Sat E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P. aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae.

Воплощение 29 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина по любому из воплощений 2628, где белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA).

Воплощение 30 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина по воплощению 29, где ЕРА содержит 1-10, предпочтительно 2-4 сайта гликозилирования, содержащих консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 31 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина по воплощению 30, где белокноситель представляет собой ЕРА с четырьмя консенсусными последовательностями гликозилирования (ЕРА-4), предпочтительно где белок-носитель содержит SEQ ID NO: 3.

Воплощение 32 представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина по любому из воплощений 2631, которая представляет собой клетку Е.соН, например, штамм Е.соН K-12, такой как штамм W3110.

Воплощение 33 представляет собой способ получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+), показанную в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например, от 5 до 40, способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по любому из пп. 26-32 в условиях для продуцирования биоконъюгата.

Воплощение 34 представляет собой способ по воплощению 33, дополнительно включающий выделение биоконъюгата из рекомбинантной клетки-хозяина.

Воплощение 35 представляет собой биоконъюгат, полученный способом по воплощению 33 или 34.

Воплощение 36 представляет собой композицию, содержащую биоконъюгат по воплощению 35.

Воплощение 37 представляет собой способ получения рекомбинантной клетки-хозяина для получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 содержит структуру формулы (O4-Glc+), показанную в табл. 1, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например, от 5 до 40, способ включает введение одной или более чем одной молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку для получения рекомбинантной клетки-хозяина, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит:

Воплощение 38 представляет собой способ по воплощению 37, где глюкозилтрансфераза имеет SEQ ID NO: 4; олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую аминокислотную мутацию N311V, и белок-носитель содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 39 представляет собой способ по воплощению 37 или воплощению 38, где белокноситель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А P.aeruginosa (ЕРА), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного

- 34 046206 анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Sat E.coli, домена-пассажира белка Sat E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P. aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae.

Воплощение 40 представляет собой способ по любому из воплощений 37-39, где белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA).

Воплощение 41 представляет собой способ по воплощению 40, где ЕРА содержит 1-10, предпочтительно 2-4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2.

Воплощение 42 представляет собой способ по воплощению 41, где белок-носитель представляет собой ЕРА с четырьмя консенсусными последовательностями гликозилирования (ЕРА-4), предпочтительно где белок-носитель содержит SEQ ID NO:

Воплощение 43 представляет собой способ по любому из воплощений 37-42, где клетка представляет собой клетку Е.соН, например, штамма-Е.соН K12, такого как штамм W3110.

Воплощение 44 представляет собой композицию по воплощению 19 или воплощению 20, где биоконъюгат полисахаридного антигена 025b присутствует в композиции в концентрации, которая приблизительно в 1,5-6 раз, например, приблизительно в 2-4 раза выше, чем концентрация любого из других биоконъюгатов.

Воплощение 45 представляет собой композицию по воплощению 44, где биоконъюгаты О1А:О2:гликозилированного О4:О6А:О8:О15:О16:О25В:О75 присутствуют в массовом соотношении полисахаридов 1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:4:1.

Воплощение 46 представляет собой композицию по воплощению 44, где биоконъюгаты О1А:О2:гликозилированного О4:О6А:О8:О15:О16:О18А:О25В:О75 присутствуют в массовом соотношении полисахаридов 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:1:4:1.

Воплощение 47 представляет собой композицию по любому из воплощений 44-46, где концентрация биоконъюгата полисахаридного антигена 025В составляет от 2 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 8 до 40 мкг/мл, например, от 16 до 32 мкг/мл.

Описание примеров осуществления изобретения

Следующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации сущности изобретения. Следует понимать, что приведенные ниже примеры не ограничивают объем изобретения и что объем изобретения определяется приведенной ниже формулой изобретения.

Пример 1. Эпидемиологические данные по инфекциям E.coli.

Чтобы определить распределение О-серотипов Е.соН, вызывающих бактериемию, проводили глобальные мониторинговые исследования. В период с 2011 по 2017 год было собрано более 3200 изолятов кишечной палочки из крови пациентов 60 лет и старше, госпитализированных в странах Северной Америки, Европы, Азиатско-Тихоокеанского региона и Южной Америки. У каждого штамма анализировали серотип О-антигена с использованием классических методов агглютинации и проводили генотипирование О-антигена по последовательности. См. табл. 2. Изоляты из образцов крови человека проанализировали для определения патогенов в них и их паттернов устойчивости к антибиотикам. Изоляты Е.соН были получены из образцов после анализа. Идентификацию Е.соН подтверждали с помощью MALDI-TOF MS. Дальнейший анализ изолятов Е.соН выполняли с использованием анализа агглютинации на основе антисыворотки для определения серотипа их О-антигена (DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185). Изоляты, не типируемые методом агглютинации, дополнительно анализировали путем полногеномного секвенирования с последующим генотипированием О-антигена на основе последовательностей генов wzy и wzx, специфичных для серотипов О-антигена.

Таблица 2. Распределение наиболее распространенных О-серотипов Е.соН, ассоциированных с бактериемией, из коллекции 3217 изолятов из образцов крови, собранных во всем мире в период с 2011 по 2017 год, на основе О-серотипирования посредством агглютинации и О-генотипирование изолятов, не типируемых агглютинацией. Субъекты были госпитализированы в следующих странах: США, Канада, Аргентина, Бразилия, Великобритания, Германия, Испания, Италия, Нидерланды, Франция, Япония, Таиланд,

Южная Корея и Австралия

О-Серотип	Распространение η (%)
025	737 (22,9%)
02	268 (8,3%)
Об	261 (8,1%)
01	255 (7,9%)

- 35 046206

075	145 (4,5%)
015	110(3,4%)
08	104 (3,2%)
016	103 (3,2%)
04	96 (3,0%)
018	91 (2,8%)

Стратификация по географическому местоположению ассоциированной с бактериемией E.coli в мировом масштабе показала преобладание 10 основных О-серотипов независимо от местоположения, что позволяет предположить, что они являются преобладающими в мире О-серотипами, связанными с вызывающей бактериемию Е.соН.

В мировом масштабе распространенность 10 основных О-серотипов среди изолятов ассоциированных с бактериемией Е.соН с множественной лекарственной устойчивостью (n=345), то есть тех штаммов, которые устойчивы как минимум к трем классам клинически значимых противомикробных препаратов, составляет 75,4%. По совокупности данных эпидемиологического анализа, преобладающие 10 Осеротипов могут охватывать 60-80% бактериальных инфекций, ассоциированных с Е.соН, с учетом охвата части нетипируемых штаммов.

Поливалентная вакцина, охватывающая значительную часть серотипов Е.соН, вызывающих бактериемию, была бы очень полезной. Таким образом, О-серотипы из табл. 2 могут быть хорошими кандидатами для поливалентной вакцины на основе О-антигена. Такую вакцину можно с успехом получить с использованием технологии биоконъюгации.

Одним из серотипов среди 10 основных (табл. 2) является O4. Таким образом, было бы полезно получить биоконъюгатную вакцину, которая включает полисахаридный О-антиген E.coli серотипа O4, связанный с белком-носителем.

Пример 2. Характеризация современных клинических изолятов О4 по генам, кодирующим ферменты, модифицирующие О-антиген.

Описаны два варианта полисахаридного антигена O4 Е.соН (см., например, Jann В, et al., 1993, Carbohydr. Res. 248: 241-250), один из которых имеет неразветвленную структуру (структура показана в табл. 1 как (O4-Glc-)), а другой вариант замещен дополнительной боковой ветвью глюкозы (структура показана в табл. 1 как (O4-Glc+)). Доля этих двух вариантов, встречающихся среди современных клинических изолятах, была неизвестна. Хотя оба варианта реагируют с антисывороткой O4, также не было известно, существуют ли иммунологические различия между этими вариантами. Более того, фермент, ответственный за присоединение боковой ветви глюкозы для образования полисахаридного антигена (O4-Glc+), до сих пор не был идентифицирован, и его предполагаемая кодирующая последовательность, вероятно, находится за пределами генного кластера rfb O4.

Набор из 32 подтвержденных методом агглютинации клинических изолятов Е.соН O4, исходно выделенных в период 2011-2012 гг. от субъектов в Соединенных Штатах и Европейском Союзе, проанализировали методом полногеномного секвенирования. Выделенные последовательности генного кластера rfb 32 отсеквенированных изолятов O4 выравнивали с последовательностями эталонного штамма и сравнивали на уровне нуклеотидов. За исключением некоторых встречающихся в природе однонуклеотидных полиморфизмов, все охарактеризованные изоляты имели кластер rfb, который был идентичен эталонному штамму O4, что указывает на то, что штаммы Е.соН O4, независимо от их статуса ветвления Glc, несут идентичный кластер генов rfb. Таким образом, для создания полисахаридного антигена O4-Glc+ E.coli, вероятно, необходим ген с неизвестной последовательностью, который кодирует специфичный для Е.соН O4 фермент ветвления и который должен находиться где-то за пределами кластера генов rfb Е.соН O4. Последовательность этого неизвестного гена необходимо идентифицировать и использовать, если кто-то хочет получить биоконъюгаты с полисахаридными антигенами O4-Glc+ E.coli в штамме, который в противном случае будет продуцировать только биоконъюгаты с полисахаридными антигенами O4-Glc- E.coli. Затем данные полногеномного секвенирования анализировали на наличие генов вне кластера генов rfb, которые могут кодировать ферменты, модифицирующие О-антиген. Гомологи gtrAB у Shigella flexneri впервые были идентифицированы у Е.соН O4. Открытая рамка считывания по ходу транскрипции от gtrAB в Е.соН была предположительно идентифицирована как специфичный для Е.соН O4 ген gtrS, который может кодировать предполагаемый обеспечивающий ветвление фермент GtrS, специфический для Е.соН O4, ответственный за добавление глюкозной ветви к антигену O4 Е.соН.

Аминокислотная последовательность фермента GtrS, специфичного для Е.соН O4, представлена как SEQ ID NO: 4. Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей данный белок, приведен как SEQ ID NO: 5.

Было обнаружено, что из охарактеризованных изолятов Е.соН O4 примерно 80% несут идентифицированный здесь ген gtrS (26 из 32). Распространенность последовательности gtrS, специфичной для Е.соН O4, также определяли с помощью ПЦР с использованием специфичных для последовательности

- 36 046206 праймеров, в независимом наборе из 20 подтвержденных методом агглютинации клинических изолятов E.coli O4, выделенных в период 2014-2016 гг. от субъектов в Соединенных Штатах и Европейском Союзе. Этот анализ показал, что 17 из 20 изолятов несли последовательность gtrS O4, что соответствует распространенности 85%.

Пример 3. Клонирование gtrS O4 в E.coli W3110, получение и подтверждение структуры биоконъюгатов О4, модифицированных Glc.

Чтобы проверить, могут ли быть получены биоконъюгаты, содержащие полисахаридный антиген O4, модифицированный ответвляющейся глюкозой, сконструировали штаммы E.coli с предполагаемым ферментом, обеспечивающим ветвление, продуцирующие биоконъюгат антигена O4 и ЕРА. Для этого эндогенный ген gtrS O16 заменяли предполагаемым геном gtrS O4 (SEQ ID NO: 5, см. пример 2), а кластер rfb O16 в штамме E.coli W3110 ΔwzzE-wecG ΔwaaL ΔwbbI-J-K заменяли кластером rfb O4 путем гомологичной рекомбинации. В альтернативном варианте в некоторых штаммах кластер rfb O4 кодировался плазмидой.

Затем в эти штаммы вводили плазмиды, кодирующие белок-носитель обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA) (вариант, имеющий 2 или 4 консенсусных сайта гликозилирования, обозначаемый как ЕРА-2 и ЕРА-4, соответственно), и олигосахарилтрансферазу PglB. Биоконъюгаты 04-Ера, модифицированные Glc, получали путем культивирования штаммов-продуцентов E.coli в биореакторах и индукции экспрессии PglB и ЕРА с помощью IPTG и арабинозы, соответственно. Биоконъюгаты 04-ЕРА выделяли из периплазматического экстракта биомассы.

Для подтверждения подробного полисахаридного состава и связывания биоконъюгатов 04-ЕРА проводили несколько экспериментов ЯМР на биоконъюгатах, имеющих белок-носитель ЕРА-4 (данные не показаны). Отнесения сигналов согласовались с опубликованными в литературе (Jansson, P.E., et al., 1984, Carbohydr. Res. 134(2): 283-291; Jann В, et al., 1993, Carbohydr. Res. 248: 241-250). В спектре 1D, записанном при 313К, наблюдался интенсивный сигнал HOD и малоинтенсивные острые сигналы от пентасахаридных повторяющихся единиц (RU) O4 с пятью аномерными, двумя NAc и двумя Н6 сигналами (Rha и FucNAc).

Отнесение сигналов протонов в одномерном эксперименте подтверждали с помощью двумерной протон-протонной корреляционной и протон-углеродной корреляционной спектроскопии ЯМР. Вопервых, двумерные эксперименты TOCSY (полная корреляционная спектроскопия) (120 мс) продемонстрировали ожидаемые кросс-пики у H1 и Н6 (для Rha и FucNAc) пентасахаридной RU O4 и небольшие пики от концевой RU и ЕРА. В области метила в спектре TOCSY наблюдались кросс-пики у Н6 с H1 для α-Rha и у Н6 с Н5 для α-FucNAc для RU O4. Другие наблюдавшиеся пики принадлежали аминокислотам ЕРА и концевой Rha (tRha). Во-вторых, углеродный ЯМР-спектр содержал хорошо рассредоточенные и обеспечивающие идентификацию одиночные пики для RU O4. Углероды были идентифицированы косвенно через присоединенные протоны с помощью эксперимента HSQC (гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия). Эксперимент HSQC-DEPT дал инвертированные пики для групп CH2. В эксперименте HSQC наблюдались кросс-пики для пентасахаридной RU O4 [5 аномерных, кольцевых, две N-ацетильных и две метальных (Rha и FucNAc)] группы, а также аминокислот ЕРА в характерных областях. Каждую из пар протон/углерод для O4 оказалось возможным найти на основании отнесений сигналов протонов и данных литературы.

Таким образом, эксперименты по определению структурных характеристик подтвердили, что с применением предполагаемого гена gtrS E.coli O4, идентифицированного в примере 2, могут быть получены биоконъюгаты O4 с ответвлениями Glc (содержащие полисахаридные антигенные структуры, показанные в формуле (O4-Glc+) в табл. 1).

Пример 4. Иммуногенность биоконъюгата О4 с ответвлением Glc у кроликов.

Биоконъюгаты O4, модифицированного Glc (т.е. имеющие гликаны со структурой формулы (O4Glc+), как показано в табл. 1) использовали для иммунизации кроликов с применением протокола speedy-rabbit (Eurogentec). Сыворотку иммунизированных кроликов анализировали методом ELISA на титры анти-О4 IgG против очищенного липополисахарида O4 (LPS) с (Glc+; т.е. содержащего гликозилированный полисахарид O4) или без ответвления Glc (Glc-; т.е. содержащего негликозилированный полисахарид O4). В результате иммунизации биоконъюгатом у обоих кроликов наблюдались высокие титры IgG (фиг. 1). В обоих случаях титры антител против Glc+ LPS, индуцированные биоконъюгатом O4, были выше, чем против Glc-LPS.

Также, объединяли сыворотки и использовали в исследованиях ELISA с цельными клетками и исследуемыми наборами изолятов E.coli O4 с охарактеризованным статусом gtrS. Протестировали пять gtrS-отрицательных (без ответвления Glc) и шесть gtrS-положительных (с ответвлением Glc) изолятов E.coli O4 и штамм, служивший отрицательным контролем. Объединенные сыворотки кроликов, иммунизированных биоконъюгатом O4, модифицированным Glc, содержали высокие титры IgG, специфически распознающих исследуемые изоляты O4 (фиг. 2). В соответствии с ELISA на LPS, все протестированные изоляты O4 распознавались антисыворотками. У gtrS-положительных изолятов в целом наблюдалось более интенсивное связывание, чем у gtrS-отрицательных изолятов (фиг. 2). В частности, следующие

- 37 046206 изоляты были gtrS-положительными: Y1382, Е551, ОС24334, stGVXN4983, stGVXN4994 и ОС24794, а следующие изоляты были gtrS-отрицательными: А2625, stGVXN4988, OC24784, ОС24787 и ОС24788. Антисыворотки не связывались со штаммом E.coli OC9487 неродственного О-серотипа (АТСС 35383), служившим отрицательным контролем.

Профили LPS, выделенного из исследуемого набора gtrS-положительных и отрицательных изолятов в окрашенных серебром полиакриламидных гелях, не позволили выявить заметных различий между изолятами, экспрессирующими немодифицированные и модифицированные формы антигена O4, подтверждая, что наблюдаемые различия не объясняются количественными различиями в уровнях экспрессии LPS (данные не показаны).

Вестерн-блоты экстрагированного LPS с использованием объединенной антисыворотки использовали для оценки распознавания О-антигена O4 иммуноглобулинами G, которые вырабатывались в ответ на иммунизацию биоконъюгатом O4, модифицированного Glc. Наблюдалось связывание как модифицированного, так и немодифицированного O4 LPS иммуноглобулинами G от кроликов, иммунизированных модифицированным O4, и включало специфическое распознавание полос LPS большого диапазона размеров, включая полосы LPS с высокой молекулярной массой (фиг. 3).

Если специально не указано иное, в дальнейших экспериментах, описанных ниже, когда упоминается биоконъюгат O4 или штаммы-продуценты или ЕсоО4, подразумевается биоконъюгат или продуцирующий штамм O4 с ответвлениями Glc (имеющий структуру гликана (O4-Glc+) в табл. 1), (таким образом, в этих экспериментах термины O4 и O4-Glc+, используются взаимозаменяемо для биоконъюгатов или продуцирующих штаммов).

Пример 5. Иммуногенность биоконъюгата О4 с ответвлением Glc у крыс.

Крыс Спрег-Доули (Sprague Dawley) иммунизировали 3 раза внутримышечно буфером для приготовления композиции или биоконъюгатом (O4-Glc+)-EPA (т.е. биоконъюгатом гликозилированного полисахаридного антигена O4, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА; белком-носителем был ЕРА-2, как описано в примере 3 выше) в 3 различных дозах (0,04, 0,40 или 4,0 мкг). Уровни антител в сыворотке измеряли с помощью ELISA на 0, 14 и 42 день после иммунизации. Иммунизация 0,04 мкг, 0,40 мкг и 4,00 мкг биоконъюгата (O4-Glc+)-EPA вызвала значительное повышение уровней антител IgG на 42 день после иммунизации по сравнению с буфером для композиции (фиг. 4А). Антитела, индуцированные (O4-Glc+)-конъюгатом, были функциональными, то есть способны опосредовать уничтожение штамма (O4-Glc+) E.coli (фиг. 4В).

Уровни антител, индуцированные 0,04, 0,40 и 4,0 мкг биоконъюгата (O4-Glc+)-EPA, значительно повышались на 42-й день по сравнению с исходным уровнем (42-й день по сравнению с 0-м днем, Р=0,006 для всех доз) и на 14-й день после иммунизации (42-й день по сравнению с 14-м днем, Р=0,006 для всех доз) (фиг. 5). В группе, получавшей 4,0 мкг биоконъюгата, титры также значительно повышались на 14-й день по сравнению с 0-м днем, что указывает на то, что однократная доза 4,0 мкг биоконъюгата (O4-Glc+)-EPA вызывает значительное увеличение титров IgG (14-й день по сравнению с 0-м днем, Р=0,012). Значительное увеличение титров IgG, наблюдаемое между 14 и 42 днями, для всех трех протестированных концентраций биоконъюгата, показало, что третья доза биоконъюгата (O4-Glc+)-EPA способна усиливать гуморальные ответы (фиг. 5).

Функциональность антител, индуцированных конъюгатом O4-Glc+-EPA у крыс, иммунизированных внутримышечно 3 раза буфером для приготовления композиции или биоконъюгатом в дозе 4,00 мкг, определяли по опсонофагоцитарной активности (OPKA) с использованием штаммов E.coli O4(Glu+) и O4(Glu-). Антитела, индуцированные биоконъюгатом (O4-Glc+)-EPA, были функциональными, т.е. способными опосредовать уничтожение штамма E.coli (O4-Glc+) (фиг. 4В, Фиг. 6). Примечательно, что антитела, индуцированные биоконъюгатом (O4-Glc+)-EPA, были способны опосредовать уничтожение как (O4-Glc+), так и (O4-Glc-), то есть штаммов E.coli, имеющих гликаны со структурой формулы (O4-Glc-) в табл. 1, т.е. O4 без ответвления Glc) (фиг. 6).

В заключение, антитела, индуцированные биоконъюгатом O4-Glc+-EPA, обладают перекрестной реактивностью и способны опосредовать гибель штаммов E.coli O4 с ответвлением глюкозы и без него.

Пример 6. Штаммы-продуценты биоконъюгатов О-антигена E.coli и полученные продукты биоконъюгатов.

Помимо биоконъюгатов (O4-Glc+)-EPA, полученных, как описано выше, были получены девять (9) других биоконъюгатов. В частности, дополнительно полученные биоконъюгаты включали биоконъюгат E.coli O1A-EPA, биоконъюгат 02-Ера, биоконъюгат О6А-ЕРА, биоконъюгат 08-Ера, биоконъюгат 015-Ера, биоконъюгат 016-ЕРА, биоконъюгат О18А-ЕРА, биоконъюгат О25В-ЕРА и биоконъюгат O75ЕРА. Химические структуры гликанов этих конъюгатов можно увидеть в соответствующих формулах в табл. 1. Композиция, содержащая 10 биоконъюгатов, в данном документе обозначена как ExPEC10V. Композиция, содержащая биоконъюгаты О1А-ЕРА, 02-ЕРА, О6А-ЕРА и О25В-ЕРА, в данном документе обозначена как ExPEC4V (и ранее была описана, например, в WO 2015/124769 и WO 2017/035181).

Родительский штамм Escherichia coli W3110.

Непатогенный штамм E.coli K12 W3110 использовали в качестве родительского штамма для создания всех десяти штаммов-продуцентов. Штамм E.coli K12 W3110 был получен из музея культур E.coli

- 38 046206 (Yale University, New Haven (CT), USA, номер продукта CGSC#4474). Соответствующий генотип был описан ранее (Е.соН W3110, F-, lambda-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1), а его геномная последовательность была опубликована ранее (Hayashi K, et al., 2006, Mol. Syst. Biol. 2006.0007 (doi:10.1038/msb4100049). Штамм Е.соН W3110 был генетически модифицирован для обеспечения продукции каждого из биоконъюгатов О-антигена-Е.соИ (табл. 3).

Штаммы-продуценты биоконъюгатов.

Композиции ExPEC4V и ExPEC10V содержат биоконъюгаты 02-Ера и О25В-ЕРА из одних и тех же продуцирующих штаммов. Композиция ExPEC4V содержит биоконъюгат О1А-ЕРА из продуцирующих штаммов stGVXN4411 или stLMTB10217, тогда как композиция ExPEC10V содержит биоконъюгат О1А-ЕРА из продуцирующего штамма stLMTB10217. Композиция ExPEC4V содержит биоконъюгат О6А-ЕРА из продуцирующего штамма stGVXN4112, тогда как композиция ExPEC10V содержит биоконъюгат О6А-ЕРА из продуцирующего штамма stLMTB10923. Кроме того, композиция ExPEC10V содержит биоконъюгаты О4-ЕРА (т.е. (O4-Glc+)-EPA), О8-ЕРА, О15-ЕРА, О16-ЕРА, О18АЕРА и 075-ЕРА из продуцирующих штаммов, которые не используются для ExPEC4V. Различные продуцирующие штаммы могут варьироваться в плазмидах для экспрессии белка-носителя ЕРА и/или олигосахарилтрансферазы PglB, как указано ниже. Обзор нескольких продуцирующих штаммов приведен в табл. 3 ниже.

Таблица 3. Сводные данные по генной инженерии штаммов-продуцентов Е.соН для биоконъюгатов О-антигена для вакцинных композиций ExPEC4V и ExPEC10V

Серотип	Название штамма	Генные мутации	Плазмиды
Генный кластер rfb	waaL	gtrABS	PglB	epa
О1А (ExPEC4V)	stGVXN4411	Arfb::01А rfb upecGVXN_032	AwaaL	-	pGVXN970	pGVXN1076
О1А (ExPEC4V; ExPEC 10 V)	stLMTB 10217	Arfb::01Arfb upecGVXN_032	AwaaL	-	pGVXN122 1	pGVXN1076
02	stGVXN4906	Arfb::02 rfb upecGVXN_116	AwaaL	-	pGVXN971	pGVXN1076
04	BVEC-L- 00684	Ar/b::04 rfb CCUG11450	AwaaL	\gtrS::gtrS 04	pGVXN121 7	pGVXN1076
O6A (ExPEC4V)	stGVXN4112	Arfb::O6A rfb CCUG11309	AwaaL	-	pGVXN114	pGVXN659
O6A (ExPEC 10V)	stLMTB 10923	Arfb::06A rfb CCUG11309	AwaaL	-	pGVXN122 1	pGVXN1076
08	stLMTB 11734	Ar/&::08 r/& E2420	AwaaL	AgtrABS	pGVXN970	pGVXN1076
015	stLMTB 1173 8	Ar/&::015 rfb OC24891	AwaaL	AgtrABS	pGVXN122 1	pGVXN1076
016	stLMTB 11739	Ar/&::016 rfb OC24208	AwaaL	AgtrABS	pGVXN238 1	pGVXN1076
O18A	BVEC-L- 00559	Ar/&::O18A rfb OC24255	AwaaL	AgtrABS	pGVXN970	pGVXN1076
O25B	stGVXN4459	Ar#::O25B rfb upecGVXN_138	AwaaL	AgtrABS	pGVXN970	pGVXN1076
075	stLMTB 11737	Arfb:: 075 rfb CCUG31	AwaaL	AgtrABS	pGVXN121 7	pGVXN1076

Кластер генов биосинтеза О-антигена (rfb).

Во всех штаммах Е.соН, продуцирующих О-антиген, природный геномный кластер генов биосинтеза O16::IS5 (rfb) E.coli W3110 заменяли выбранными кластерами генов специфического биосинтеза Оантигена из штаммов Е.соН выбранного серотипа, кодирующих специфичные для серотипа структуры Оантигена (см. табл. 1 для этих структур О-антигена). после полногеномного анализа изолятов крови Е.соН отобрали или подтвердили десять донорских кластеров rfb. Замена генного кластера rfb O16::IS5 W3110,

- 39 046206 который является дефектным по биосинтезу О-антигена, достигалась благодаря единственному акту гомологичной рекомбинации. В случае генных кластеров rfb O16 и 018а донорскую ДНК рекомбинировали через фланкирующие гены gnd и rmlCA, тогда как генный кластер rfb для других штаммов рекомбинировали через фланкирующие гены gnd и galF. Последовательности кластеров rfb в штаммахпродуцентах представлены в SEQ ID NO: 9 и 11-19.

Ген лигазы О-антигена (waaL).

Все штаммы E.coli, продуцирующие О-антиген, несут искусственно введенную делецию лигазы геномного О-антигена E.coli W3110, кодируемой геном waaL. В штаммах AwaaL нарушается перенос Оантигена на липид А, а вместо этого осуществляется перенос О-антигена на белок-носитель для увеличения выхода продукта.

Гены гликозилирования О-антигена fgtrABS).

В геномах штаммов-продуцентов E.coli O8, O15, O16, О18А, 025В и O75 осуществляли делецию генов gtrABS E.coli W3110, которые отвечают за гликозилирование О-антигена O16. В то время как гены gtrA и gtrB в разных серотипах высоко гомологичны и взаимозаменяемы, ген gtrS кодирует специфичную для серотипа О-антигена гликозилтрансферазу. В E.coli W3110 GtrS может переносить остаток глюкозы (Glc) на сахар GlcNAc в мотиве a-L-Rha-(1 ^3)-D-GlcNAc О-антигена O16 E.coli. В штаммахпродуцентах E.coli О1А, O2 и О6А делеция или замена гена gtrABS отсутствует. В этих О-антигенах отсутствует мотив a-L-Rha-(1^3)-D-GlcNAc, который является естественным субстратом для gtrS E.coli O16. В продуцирующем штамме E.coli O4 ген gtrS W3110 был заменен геном gtrS E.coli O4 для обеспечения правильного гликозилирования О-антигена O4 Е.соИ.

Олигосахарилтрансфераза pglB.

Все штаммы, продуцирующие О-антиген Е.соИ, экспрессировали вариант гликозилтрансферазы PglB С. jejuni, которая может переносить О-антиген на консенсусную аминокислотную последовательность на белке-носителе путем N-гликозилирования. PglB распознает широкий спектр субстратов, но изза низкого выхода продукта были получены несколько продуцирующих штаммов, экспрессирующих вариант PglB, имеющий измененную субстратную специфичность, что привело к улучшенному выходу продукта (см., например, WO 2016/107818, WO 2016/107819). Ген pglB размещали на плазмиде после промотора, индуцируемого изопропил-в-О-тиогалактопиранозидом (IPTG). В табл. 4 ниже перечислены варианты PglB, кодируемые плазмидами, которые использовали для получения штаммов, продуцирующих О-антиген E.coli, для биоконъюгатов для композиций ExPEC4V и ExPEC10V, описанных выше. Другие плазмиды с вариациями скелета вектора, маркера устойчивости к антибиотикам и/или альтернативных вариантов PglB также были успешно протестированы на предмет продукции биоконъюгатов.

Таблица 4. Плазмиды PglB и ЕРА, использованные в штаммах-продуцентах О-антигена E.coli

Название плазмиды	Ген	Описание¹
pGVXN114	PglB	Использование кодонов C. jejuni., SpR
pGVXN970	pglB	Использование кодонов оптимизировано для Е. coli\ SpR
pGVXN971	_Ж//А⁵³⁴°	Использование кодонов оптимизировано для Е. coli\ природный сайт гликозилирования PglB инактивирован; SpR
pGVXN1217	pglB™™	Использование кодонов оптимизировано для Е. coli\ PglB с оптимизацией по субстрату; SpR
pGVXN1221	/?g/B^N311v,K482R’^D483H’^A669V	Использование кодонов оптимизировано для Е. coli\ PglB с оптимизацией по субстрату; SpR
pGVXN2381	/?g/B^Y77H’^S80R’^Q287P’^K289R’^N311v	Использование кодонов оптимизировано для Е. coli\ PglB с оптимизацией по субстрату; SpR
pGVXN659	EPA-4	ЕРА с четырьмя сайтами биоконъюгации; AmpR
pGVXN1076	EPA-4	ЕРА с четырьмя сайтами биоконъюгации; KanR

- 40 046206

SpR - устойчивость к спектиномицину; AmpR - устойчивость к ампициллину; KanR - устойчивость к канамицину.

Белок носитель (ЕРА).

Все штаммы, продуцирующие О-антиген E.coli, экспрессировали в качестве белка-носителя для Оантигена генетически обезвреженный анатоксин АДФ-рибозилтрансферазу (ЕРА) P. aeruginosa. Анатоксин ЕРА отличается от токсина ЕРА дикого типа двумя остатками: Leu552 заменен на Val и осуществлена делеция Glu553 (в каталитическом домене). Сообщалось, что делеции Glu553 значительно снижают токсичность. В дополнение к мутации, устраняющей токсичность, были введены четыре консенсусных мотива сайта N-гликозилирования (ЕРА-4). Ген ера размещался на плазмиде после индуцибельного промотора L-арабинозы (Ara) (табл. 4). Табл. 4 ограничена плазмидами, использованными в штаммахпродуцентах биоконъюгатов, используемых в композициях ExPEC4V и ExPECIOV, описанных выше. Плазмиды с вариациями остова вектора, маркера устойчивости к антибиотикам и/или вариантов ЕРА, например, различающиеся по количеству консенсусных мотивов сайта N-гликозилирования (например, имеющие два таких мотива, ЕРА-2), также были успешно протестированы на предмет продукции биоконъюгатов.

Пример 7. Оптимизация олигосахарилтрансферазы для создания биоконъюгатов с гликозилированным антигеном О4 (O4-Glc+).

Продукция биоконъюгата может быть оптимизирована путем модификации олигосахарилтрансферазы PglB Cjejuni, что может привести к более эффективному или более выраженному Nгликозилированию интересующего О-антигена с белком-носителем ЕРА. В штамме Е.соИ для продукции биоконъюгата с гликозилированным полисахаридным О-антигеном O4 (O4-Glc+) была применена такая стратегия оптимизации, которая позволила получить оптимизированный (O4-Glc+)-специфический вариант PglB, улучшив выход биоконъюгата.

В этом подходе штамм-продуцент полисахаридного О-антигена O4-Glc+, содержащий плазмиду, экспрессирующую ЕРА, трансформировали рядом различных плазмид, экспрессирующих PglB, каждая из которых содержала разные аминокислотные замены в белке PglB, изменяющих субстратную специфичность. Уровень продукции биоконъюгата и профиль каждого штамма оценивали на уровне встряхиваемых колб в экспериментах с осмотическим шоком, иммунологический анализ периплазматических экстрактов проводили методом капиллярного электрофореза с использованием для детекции О4-О1с+специфических моноклональных антител.

Обнаружили, что один из исследуемых вариантов PglB, содержащий аминокислотную замену N311V, значительно улучшал выход гликозилированных биоконъюгатов O4 (фиг. 7А).

При дальнейшем усовершенствовании, когда вариант N311V PglB модифицировали дополнительно, аминокислотная замена Y77H дополнительно увеличивала О4-О1с+-специфичный выход продукта и повышала уровень ди- и тригликозилированного продукта по сравнению с вариантом N311V PglB, когда другие модификации оказывались нейтральными или оказывали отрицательное влияние на выход продукта (фиг. 7В). Плазмида pLMTB4008 (SpR) кодирует вариант PglB с оптимизированной для E.coli частотой использования кодонов, оптимизированный по субстрату (O4-Glc+), содержащий мутации Y77H и N311V.

Обнаружили, что вариант PglB с оптимизированной субстратной специфичностью к полисахаридному О-антигену O4-Glc+, содержащий аминокислотные замены N311V и Y77H по сравнению с гликозилтрансферазой С. jejuni дикого типа PglB (wt), удваивает выход биоконъюгата по сравнению с вариантом PglB-N311V, оптимизированным в первом цикле.

Аналогичным образом с помощью скрининга также определили наиболее оптимальные по продуктивности варианты PglB для продукции биоконъюгата О-антигена Е.соН других девяти серотипов в композиции ExPECIOV. Обнаружили, что PglB с аминокислотными мутациями N311V, K482R, D483H и A669V дает самый высокий выход биоконъюгатов, содержащих полисахаридный антиген О1А, 06 а или O15.

Обнаружили, что PglB дикого типа (т.е. не имеющий аминокислотных мутаций в положениях 77, 80, 287, 289, 311, 482, 483 и 669) дает самый высокий выход биоконъюгатов, содержащих полисахаридный антиген O2, O8, О18А или 025В. Обнаружили, что PglB с аминокислотными мутациями Y77H, S80R, Q287P, K289R и N311V дает самый высокий выход биоконъюгатов, содержащих полисахаридный антиген 016.

Обнаружили, что PglB с аминокислотной мутацией N311V дает самый высокий выход биоконъюгатов, содержащих полисахаридный антиген O75. Эти результаты свидетельствуют, что оптимальный вариант PglB различается для разных О-антигенов, и что невозможно предсказать оптимальный вариант PglB для получения биоконъюгата с заданным полисахаридным О-антигеном.

Пример 8. Биоконъюгаты О-антигенов из 10 серотипов E.coli и их качественные характеристики.

О-гликановые остатки О-антигенов-мишеней структурно разнообразны и имеют различные повторяющиеся единицы. Специфичность и аффинность гликозилтрансферазы PglB связана со структурой гликана. Таким образом, создание биоконъюгата с желаемыми качественными характеристиками, например, чистотой, соотношением гликан/белок и т.д., является сложной и непростой задачей. Правиль

- 41 046206 ная комбинация PglB и белка-носителя ЕРА определяет выход и может влиять на эффективность гликозилирования. Благодаря оптимизации PglB и белков-носителей получили биоконъюгаты, имеющие желаемые качественные характеристики. Также может быть важно поддерживать более низкое пороговое значение общего белка-носителя, особенно когда один или несколько биоконъюгатов О-антигена объединяют вместе и вводят в составе одной композиции или вакцины, поскольку очень большое количество белка-носителя может привести к иммунологическому взаимовлиянию. Чтобы избежать такого явления, предпочтительны конъюгаты с более высоким соотношением гликан/белок. Следовательно, для вакцины ExPEC10V были разработаны биоконъюгаты, по меньшей мере, с сопоставимой (с ранее описанной вакциной ExPEC4V, которая была предметом клинических испытаний) степенью гликозилирования. Каждый биоконъюгат получали путем культивирования соответствующих клеток-хозяев (пример 6, табл. 3) в биореакторах (объемом 10 и/или 200 л) и экспрессии биоконъюгатов, согласно ранее описанным способам. Каждое лекарственное вещество производили периодически путем бактериальной периодической ферментации с подпиткой для получения биомассы, содержащей экспрессированные биоконъюгаты полисахаридов соответствующего серотипа. Клетки культивировали и индуцировали IPTG (изопропилтиогалактозид) и арабинозой. Биоконъюгаты выделяли из периплазмы клеток в культурах биореактора путем осмотического шока с последующей хроматографической очисткой. Данный процесс осуществляли для каждого из 10 биоконъюгатов.

Полученные таким образом биоконъюгаты О-антигена Е.соН, которые представляют собой лекарственные субстанции (ЛС) для ExPEC10V и ExPEC4V, показали сопоставимые основные показатели качества: (1) чистота, связанная с технологическим процессом (измеренная с помощью RP-HPLC), была выше 95%, (2) соотношение полисахарид/белок варьировало от 0,1 до 0,5, в основном от 0,15 до 0,45, (3) бактериальный эндотоксин (Европейская Фармакопея 2.2.3) составлял менее 0,5 ЕЭ/мкг полисахарида. Средняя длина отдельных полисахаридных цепей обычно составляла примерно 10-20 повторяющихся единиц (измерено с использованием SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия) высокого разрешения).

Было подтверждено, что структуры повторяющихся полисахаридных единиц (посредством ЯМР и тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) интактных или расщепленных трипсином конъюгатов) соответствуют приведенным в Формулах для соответствующих серотипов в табл. 1, для всех десяти биоконъюгатов, которые являются ЛС для композиции ExPEC10V, описанной выше.

Среди десяти серотипов, биоконъюгаты которых были получены для композиции ExPEC10V, самый низкий выход биоконъюгата наблюдался у серотипа O18.

Лекарственный продукт (DP) ExPEC10V содержит смесь десяти моновалентных ЛС, описанных выше.

Пример 9. Токсикология вакцины ExPEC10V.

Пилотное исследование токсичности и местной переносимости однократной дозы ExPEC10V (не соответствующее требованиям GLP) проводили на самках кроликов NZW (новозеландские белые кролики). Одна группа (n=2) получала внутримышечную (в/м) инъекцию (в день 0) контроля (физиологический раствор), а вторая группа (n=4) получала внутримышечную инъекцию ExPEC10V в количестве 105,6 мкг общего полисахарида ^)/дозу (9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 19,2: 9,6 мкг PS на дозу, для О-серотипов О1А, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025b и O75, соответственно), вводимый объем составлял 0,6 мл (176 мкг PS/мл). Некропсию производили на 2-й день. Смертности не наблюдалось. Кроме того, не отмечалось никаких связанных с вакциной явлений, регистрируемых для клинического наблюдения (включая явления в месте инъекции по шкале Дрейза), массы тела, потребления пищи и температуры тела. При гистологическом исследовании не наблюдалось связанных с вакциной патологических изменений в месте введения или дренирующем (подвздошном) лимфатическом узле. У одного из четырех животных, получавших воздействие (день 2) наблюдалось незначительное увеличение образования герминативных центров в селезенке, которое сочли нормальным иммунологическим ответом на введенную вакцину. В целом, введение однократной в/м дозы ExPEC10V самкам кроликов переносилось хорошо.

Пример 10. Иммуногенность смешанной композиции ExPEC10V у кроликов.

Ранее было показано, что вакцина ExPEC4V (содержащая биоконъюгаты Е.соН серотипов О1А, O2, О6А и 025В) является иммуногенной для этих четырех серотипов у крыс, кроликов и людей (см., например, WO 2015/124769; WO 2017/035181; Huttner et al, 2017, Lancet Infect Dis, http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30108-1; RW Frenck Jr., et al., abstract 5587, ASM Microbe 2018). В примерах 4 и 5 выше была показана иммуногенность новых биоконъюгатов по изобретению, имеющих серотип гликозилированного O4 Е.соН. Иммуногенность биоконъюгатов Е.соН серотипов O8, O15, O16, О18А и O75 (все из которых в данном эксперименте содержат ЕРА-2 в качестве белка-носителя) при отдельном введении (моновалентном) крысам подтвердила, что каждый из этих биоконъюгатов также был иммуногенным, поскольку данные ELISA показали, что на каждый из этих биоконъюгатов могут в большом количестве вырабатываться антитела, специфичные к О-антигену Е.соН (не показано). Также, исследовали иммуногенность 10-валентной вакцины, которая содержала смесь 10 биоконъюгатов, описанных выше. Новозеландские белые (NZW) кролики (самки в возрасте 12-16 недель) получали 3 внут

- 42 046206 римышечные иммунизации ExPEC10V или физиологический раствор, которые вводили с интервалом 2 недели (Табл. 5; введение в дни 0, 14 и 27). 10 полисахаридов, которые являются частью вакцины ExPEC10V, использованной в этих экспериментах, были конъюгированы с белком-носителем ЕРА, содержащим 4 сайта гликозилирования (ЕРА-4). Вакцину составляли в 3 различных дозах: Группа 1 (высокая доза): 8 мкг/дозу О1А, O2, О6А, O4, O8, O15, O16, O18 и O75 и 16 мкг/дозу 025В; Группа 2 (средняя доза): 4 мкг/дозу O2, O4, O8, O15, O16, O18 и O75, 8 мкг/дозу О1А и 06а и 16 мкг/дозу 025b; Группа 3 (низкая доза): 0,4 мкг/дозу O2, O4, O8, O15, O16, O18 и O75, 0,8 мкг/дозу О1А и О6А и 1,6 мкг/дозу 025В. Животные из контрольной группы (Группа 4) получали только физиологический раствор (0,9% (мас./об.) раствор хлорида натрия) (табл. 5). Уровни антител оценивали в день 0 (до иммунизации) и на 14, 27 и 42 дни (после иммунизации). Уровни сывороточных антител, индуцированные каждым из биоконъюгатов, включенным в вакцину, и белком-носителем ЕРА, измеряли с помощью ELISA (общий IgG) с использованием типоспецифичного LPS в качестве иммобилизуемого вещества. Титры антител представляли в виде значений ЕС50, которые соответствуют полумаксимальной эффективной концентрации, рассчитанной по кривым титрования, построенным по 12 разведениям в дубликатах с использованием четырехпараметрической логистической нелинейной регрессионной модели. Функциональную активность определяли по OPK.

Таблица 5. Описание экспериментальных групп

Экспериментальные группы	Введение (мкг/PS) О1А:О2:О6А:О25В:О4:О8:О15:О16:О18А:О75	Размер выборки
Группа 1 (высокая доза)	8:8:8:16:8:8:8:8:8:8	7
Группа 2 (средняя доза)	8:4:8:16:4:4:4:4:4:4	7
Группа 3	0,8:0,4:0,8:1,6:0,4:0,4:0,4:0,4:0,4:0,4	7
(низкая доза)
Группа 4 (контроль)	0,9% (мас./об.) раствор хлорида натрия	7

Результаты показаны на фиг. 8 и обобщены в табл. 6.

Таблица 6. Сводные показатели выработки антител, специфических к О-антигену Е.соН, у кроликов NZW в ответ на ExPEC10V

Темно-серыми прямоугольниками показаны серотип-специфические гуморальные ответы, для которых значения р были статистически значимыми. Светло-серыми прямоугольниками показаны серотипспецифические гуморальные ответы, для которых значения р не были статистически значимыми (ns). Критерий суммы рангов Уилкоксона с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Сравнение животных, вакцинированных ExPEC10V (группы 1, 2 и 3), с контрольной группой, получавшей физиологический раствор (группа 4). *р < 0,05, **р < 0,01. * Значения Р были статистически значимыми после исключения из контрольной группы выпадавших показателей одного животного (анализ чувствительности).

ExPEC10V в высокой дозе (группа 1) индуцировала значительно более высокие уровни антител IgG во все исследованные моменты времени (14, 27 и 42 дни после иммунизации) по сравнению с физиологическим раствором, служившим контролем, для О1А, O2, O4, О6А, O16, О18А и 025В (фиг. 8, табл. 6). Значительно более высокие титры антител, индуцированные конъюгатами O8 и O75, по сравнению с физиологическим раствором, служившим контролем, наблюдались на 27 и 42 дни после иммунизации (фиг. 8, табл. 6).

ExPEC10V в средней дозе (группа 2) и низкой дозе (группа 3) индуцировала значительно более вы

- 43 046206 сокие уровни антител IgG во все исследованные моменты времени (14, 27 и 42 дни после иммунизации) по сравнению с физиологическим раствором, служившим контролем, для О1А, O2, O4, 06а, O16 и 025b (фиг. 8, табл. 6). Значительно более высокие титры антител, индуцированные конъюгатами O8, О18А и O75, по сравнению с физиологическим раствором, служившим контролем, наблюдались на 27 и 42 дни после иммунизации, что позволяло предположить, что бустерная доза у кроликов усиливает ответ на эти О-серотипы (фиг. 8, табл. 6).

В случае конъюгатов O15, анализ чувствительности с исключением выпадающих показателей одного животного из контрольной группы показал, что все три дозы вакцины ExPEC10V вызывали существенное усиление гуморального ответа по сравнению с физиологическим раствором, служившим контролем, на 14, 27 и 42 дни после иммунизации (фиг. 8, табл. 6).

Антитела, индуцированные белком-носителем ЕРА, были значительно выше, чем титры антител ЕРА в группе, получавшей физиологический раствор (контрольной), для трех исследованных доз ЕхPECIOV (высокой, средней и низкой) во все исследуемые моменты времени (дни 14, 27 и 42) (фиг. 8).

Сравнение дозировок между собой (не показано) продемонстрировало, что на 14 день после вакцинации высокая доза ExPEC10V вызвала значительно более высокие гуморальные ответы по сравнению с низкой дозой для большинства протестированных конъюгатов (О1А, O2, O4, О6А, O15, O16, О18А и О25В). Средняя доза ExPEC10V также вызвала значительно более высокие гуморальные ответы по сравнению с низкой дозой для О1А, O2, O4, О18А, 025В и O75. Для конъюгата O8 все три композиции ExPEC10V индуцировали аналогичные уровни антител на 14 день после вакцинации.

Низкая доза ExPEC10V вызвала значительное усиление гуморального ответа на 42 день после вакцинации (после первичной и двух бустерных доз) по сравнению с высокой и средней дозами ExPEC10V для конъюгатов О1А, O2, O4, O16, 025В и O75.

Эти результаты согласуются с другим опытом с конъюгированными вакцинами, где, например, не наблюдалось четкой зависимости между дозой и величиной гуморального ответа на первичную вакцинацию у младенцев, вакцинированных пневмококковой конъюгированной вакциной (Poolman JT, et al. Expert Rev Vaccines. 2013, 12(12): 1379-94).

Для конъюгатов O6A, O8 и O15 на 42 день после вакцинации значимых различий между тремя исследованными дозами ExPEC10V не наблюдалось. Для конъюгата О18А высокая доза ExPEC10V вызвала значительно более выраженный гуморальный ответ по сравнению со средней дозой на 42 день после вакцинации.

Для белка-носителя (ЕРА) высокая и средняя доза ExPEC10V вызвала значительно более выраженный гуморальный ответ по сравнению со низкой дозой на 14 день после вакцинации. Высокая доза вакцины также вызвала значительно более выраженный гуморальный ответ по сравнению со низкой дозой на 42 день после вакцинации.

В заключение следует отметить, что три композиции ExPEC10V (высокая, средняя и низкая дозировки), вводимые посредством внутримышечной инъекции на 0, 14, 27 дни, являются иммуногенными для кроликов.

До сих пор функциональные антитела, способные уничтожать штаммы E.coli, индуцированные этой вакциной у кроликов, были показаны для серотипов О1А, O2, O4, О6А, O15, O16 и 025В.

В дополнительном эксперименте получали партию вакцины ExPEC10V, соответствующую требованиям GMP (производство см. в примере 8 выше), и вводили кроликам NZW в рамках токсикологического исследования (табл. 7). В этом исследовании кролики NZW (самцы и самки) получали 3 внутримышечные инъекции (0,6 мл) вакцины ExPEC10V (1, 15 и 29 день), а контрольная группа получала 0,9% (мас./об.) раствор хлорида натрия (физиологический раствор). Каждая доза вакцины содержала 9,6 мкг полисахарида (PS) для серотипов О1А, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, О18А и O75 и 19,2 мкг PS для серотипов 025В, что соответствует 105,6 мкг общего PS (176 мкг общего PS/мл) и 382,8 мкг общего ЕРА (638 мкг ЕРА/мл). Титры IgG против О-антигенов и белка-носителя (ЕРА) определяли в образцах, собранных в период до воздействия (день 1), а также на 31 и 50 дни после иммунизации.

Значительное усиление гуморального ответа против всех О-антигенов и белка-носителя ЕРА наблюдалось на 31 и 50 день после вакцинации в группе, получавшей ExPEC10V, по сравнению с контрольной группой, получавшей только физиологический раствор (фиг. 9, табл. 8). Для серотипа О1А значительно более выраженный гуморальный ответ наблюдался также в день 1 (исходный уровень), когда вакцинированных животных сравнивали с контрольными животными. Эти результаты позволяют предположить, что некоторые животные предварительно подвергались воздействию E.coli или имеют антитела, перекрестно реагирующие с O1A-LPS.

- 44 046206

Таблица 7. Экспериментальные группы и доза ExPEC10V, использованная у кроликов NZW

Г руппы	Воздействие	Доза	Дни введения	Основн. (31 день) (самцы/самки)	Восстановление (50 день) (самцы/самки)
1	контроль	0	1, 15,29	10	10
2	ExPEClOV	105,6 мкг PS*	1, 15,29	10	10

*Каждая доза (вводимый объем 0,6 мл) содержит 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 9,6: 19,2: 9,6 мкг полисахарида (PS) для серотипов Θ1Ά, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025b, O75, соответственно (176 мкг общего PS/мл). Каждая доза содержит 382,8 мкг белка ЕРА (638 мкг ЕРА/мл).

Таблица 8. Иммуногенность ExPEC10V у кроликов NZW в рамках токсикологического исследования

BoMciici вис Гуморальные ответы на 31 лень после вак'пннапнн

ExPEClOV О1А лень **** лень ****

О6А 025В **** **** **** **** **** ****

08 015 **** **** **** **** **** ****

016 018А 075 **** **** **** **** **** ****

Гуморальные ответы, индуцированные ExPEClOV. Светло-серыми прямоугольниками показаны се ротипы, для которых наблюдалось значительное усиление гуморальных ответов в вакцинированной группе по сравнению с контролем. Тобит-модель с критерием отношения правдоподобия ****р<0,0001.

Пример 11. Исследование 1/2а фазы вакцины ExPEC10V у людей.

В настоящее время вакцин для предотвращения IED не существует. Серотипы, составляющие вакцину ExPEC10V (О1А, O2, O4, О6А, O8, Θ15, Θ16, О18А, 025В и O75), отбирали для решения проблемы инвазивных заболеваний, вызываемых большинством клинически значимых штаммов ЕхРЕС, которые также представляют большинство изолятов ЕхРЕС, вызывающих устойчивые к противомикробным препаратам IED, в том числе ST131. Выбранные серотипы являются репрезентативными для десяти преобладающих О-серотипов ЕхРЕС, вызывающих инфекции циркулирующей крови у пожилого населения и отвечающих примерно за 70% инфекций циркулирующей крови, вызываемых ЕхРЕС.

Поскольку не ожидается, что при профилактике инвазивных заболеваний механизм действия конъюгированных вакцин будет зависеть от механизмов устойчивости к антибиотикам, считается, что вакцина ExPEC10V обеспечивает защиту от IED, вызванных лекарственно-устойчивыми и чувствительными к лекарственным средствам серотипами О1А, O2, O4, О6А, O8, Θ15, Θ16, О18А, 025В и O75. Имеется предшествующий клинический опыт с ExPEC4V, более ранней вакциной-кандидатом, которая содержала набор из четырех конъюгатов О-антигена E.coli (01А, O2, 06А и 025В), также присутствующих в ExPEC10V. Основываясь на результатах четырех клинических исследований (два завершенных исследования фазы 1, одно завершенное исследование фазы 2 и текущее исследование фазы 2), ExPEC4V хорошо переносилась участниками исследования, и при дозах до 16 мкг полисахарида (PS) на серотип (01А, O2, 06А и 025В) никаких связанных с вакциной настораживающих сигналов по безопасности не отмечалось. Большинство нежелательных явлений (НЯ) относились к 1 и 2 степени, сообщалось об очень небольшом количестве НЯ 3 степени. Полученные по запросу отсроченные местные НЯ (НЯ, которые начинаются после 5-го дня после вакцинации) наблюдались в основном при более высоких дозах ExPEC4V. В каждом исследовании было показано, что вакцина ExPEC4V является иммуногенной, демонстрируя дозозависимый иммунный ответ на вакцину, а титр иммуноглобулинов G (IgG), специфичных к О-антигену, возрастает, о чем свидетельствуют результаты иммуноферментного анализа (ELISA). Анализ опсонофагоцитарной активности (OPKA), оптимизированный для ExPEC4V, продемонстрировал функциональную активность антител. Совместный анализ результатов ELISA и OPKA показал корреляцию между результатами этих тестов (коэффициенты корреляции Пирсона >0,61 и >0,48 для дня 30 и дня 360, соответственно, в клиническом исследовании фазы 2 [исследование 4V-BAC2001]), обосновывая использование ELISA в качестве первичного измерения титров антител к ExPEC4V и для прогнозирования функциональной активности антител. Анализ данных по иммуногенности продемонстрировал стойкость иммунного ответа на протяжении трех лет после вакцинации ExPEC4V. На данный момент также показано, что сыворотки людей, вакцинированных ExPEC4V и имевших высокие титры серотип-специфичных опсонофагоцитарных антител, при пассивном переносе мышам, которых впоследствии внутрибрюшинно заражали штаммами E.coli серотипа 025В или O2, были способны обеспечивать защиту in vivo (не показано). Следовательно, EхРEС4V-специфические опсонофагоцитарные человеческие антитела опосредуют уничтожение бактерий in vivo, что согласуется с данными по другим конъюгированным вакцинам, у которых предложенный механизм защиты заключается в индукции опсонофагоцитарных антител, которые опосредуют уничтожение бактерий.

EхРEС10V включает в общей сложности десять серотипов и увеличивает охват с примерно 50% (ExPEC4V) до примерно 70% инфекций циркулирующей крови, вызываемых ЕхРЕС, у взрослых в возрасте 60 лет и старше. На основании клинического опыта с ExPEC4V и доклинических данных для Ех

- 45 046206

PEC10V, обсуждавшихся в Примерах выше, ожидается, что введение ExPEClOV будет также вызывать иммунные ответы на Е.соН серотипов О1А, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025b и O75 у людей. Рандомизированное слепое исследование фазы 1/2а, впервые проводящееся у человека для оценки безопасности, реактогенности и иммуногенности трех различных доз вакцины ExPECIOV проводится на людях в возрасте от 60 до 85 лет в стабильном состоянии здоровья (исследование 10V-BAC1001). Схема исследования включает 2 когорты: всего в исследование включены 1004 участника, 404 участника (100 участников/дозу ExPEC10V) в возрасте от 60 (включительно) до 85 (включительно) лет в стабильном состоянии здоровья в когорте 1 и дополнительно 600 участников в возрасте 60 лет и старше в стабильном состоянии здоровья с ИМП в анамнезе за последние 5 лет в когорте 2.

ExPEC10V представляет собой разрабатываемую 10-валентную вакцину-кандидат для профилактики инвазивных заболеваний, вызываемых внекишечной патогенной Escherichia coli (ExPEC) (IED) у взрослых в возрасте 60 лет и старше. ExPEC10V состоит из полисахаридных (PS) О-антигенов серотипов ЕхРЕС О1А, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75, биоконъюгированных по отдельности с белком-носителем, генетически обезвреженной формой экзотоксина А (ЕРА), полученного из Pseudomonas aeruginosa, и его получение было описано выше. PS O4 представляет собой гликозилированную форму, имеющую структуру формулы (O4-Glc+) в табл. 1.

Задачи и конечные точки.

Когорта 1 - Фаза 1/2а, период с маскированием данных для исследователя с открытым периодом долгосрочного наблюдения (N=404)

Задачи	Конечные точки
Основные
• Оценка безопасности и реактогенности различных доз ExPECIOV у участников в возрасте >60 и <85 лет	• Полученные по запросу местные и системные нежелательные явления (НЯ), регистрируемые в течение 14 дней после вакцинации (с 1 дня до 15 дня) • Сообщенные спонтанно НЯ, регистрируемые с момента введения исследуемой вакцины до 29 дня после вакцинации (с 1 дня до 30 дня) • Серьезные нежелательные явления (НЯ), регистрируемые с момента введения исследуемой вакцины до 181 дня
• Оценка дозозависимой иммуногенности ExPECIOV на 15 день у участников в возрасте >60 и <85 лет	• Титры антител к ExPECIOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе электрохемилюминесции (ECL) и мультиплексном анализе опсонофагоцитарной активности (МОРА) на 15 день
Второстепенные
• Оценка корреляции между сывороточными титрами, полученными в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL (общие антитела) и МОРА (функциональные антитела) на 15 день	• Титры антител к ExPECIOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL и МОРА на 15 день
• Оценка дозозависимой иммуногенности ExPECIOV на 30 и 181 день у участников в возрасте >60 и <85 лет	• Титры антител к ExPECIOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL и МОРА на 30 и 181 день

- 46 046206

•	Оценка в периоде долгосрочного	• Серьезные НЯ, связанные с
	наблюдения (ДН) безопасности дозы ExPEClOV, выбранной для дальнейших клинических разработок на основе первичного анализа на 30 день у участников в возрасте >60 и <85 лет	исследуемой вакциной или предусмотренными исследованием процедурами, от 182 дня и до конца исследования
•	Оценка в периоде ДН иммуногенности дозы ExPEClOV, выбранной для дальнейших клинических разработок на основе первичного анализа на 30 день	• Титры антител к ExPEClOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL и МОРА через 1 год (366 день), 2 года (731 день) и 3 года (1096 день)

Когорта 2 - двойной слепой период с двойным слепым долгосрочным периодом наблюдения (N=600)

Задачи	Конечные точки
Основные
• Оценка безопасности и реактогенности выбранной дозы ExPEClOV у участников в возрасте >60 лет с ИМП в анамнезе за последние 5 лет	• Полученные по запросу местные и системные НЯ, регистрируемые в течение 14 дней после вакцинации (с 1 дня до 15 дня) • Сообщенные спонтанно НЯ, регистрируемые с момента введения исследуемой вакцины до 29 дня после вакцинации (с 1 дня до 30 дня) • Серьезные НЯ, регистрируемые с момента введения исследуемой вакцины до 181 дня
• Оценка иммуногенности выбранной дозы ExPEClOV на 30 день у участников в возрасте >60 лет с ИМП в анамнезе за последние 5 лет	• Титры антител к ExPEClOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL и МОРА на 30 день
Второстепенные

- 47 046206

•	Оценка корреляции между сывороточными титрами, полученными в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL (общие антитела) и МОРА (функциональные антитела) на 30 день у участников в возрасте >60 лет с ИМП в анамнезе за последние 5 лет	• Титры антител измеренные в иммуноанализе на ос на 30 день	к ExPEClOV, мультиплексном :новс ECL и МОРА
•	Оценка иммуногенности выбранной дозы ExPEClOV на 15 и 181 день у участников в возрасте >60 лет с ИМП в анамнезе за последние 5 лет	• Титры антител к ExPEClOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL и МОРА на 15 и 181 день

Задачи	Конечные точки
•	Оценка в периоде ДН безопасности выбранной дозы ExPEClOV у участников в возрасте >60 лет с ИМП в анамнезе за последние 5 лет	• Серьезные НЯ, связанные с исследуемой вакциной или предусмотренными исследованием процедурами, от 182 дня и до конца исследования
•	Оценка в периоде ДН иммуногенности выбранной дозы ExPEClOV у участников в возрасте >60 лет с ИМП в анамнезе за последние 5 лет	• Титры антител к ExPEClOV, измеренные в мультиплексном иммуноанализе на основе ECL и МОРА через 1 год (366 день), 2 года (731 день) и 3 года (1096 день)
Поисковые
•	Оценка влияния ExPEClOV на кишечный микробном (стул) по результатам метагеномного анализа	• Метагеномный анализ образцов стула у отобранной подгруппы участников для оценки влияния ExPEClOV на: - Распространенность патогенов (например, Clostridium difficile') в кишечной флоре - Распространенность серотипов ExPEClOV в кишечной флоре

Общая схема исследования

Это рандомизированное многоцентровое интервенционное исследование, включающее две когорты.

Для когорты 1 исследование проводится с использованием активного препарата в качестве контроля, с маскированием данных для исследователя и включает в общей сложности 404 взрослых участника в возрасте от 60 и старше и до 85 лет включительно в стабильном состоянии здоровья с или без ИМП в анамнезе. Схема исследования для когорты 1 включает три периода: максимум 28-дневный период скрининга, 181-дневный период последующего наблюдения с маскированием данных для исследователя с вакцинацией в 1-й день и открытый период ДН, который длится со 182-го дня до 3 лет (1096 день) после вакцинации (фиг. 10А). Только участники из группы, получавшей выбранную дозу ExPEC10V (приблизительно 100 участников) и участники из группы Prevnar 13 переходят в период ДН. Окончание исследования для когорты 1 - это последний визит участника через 3 года (день 1096). Для когорты 2 исследование проводится с использованием плацебо в качестве контроля, с маскированием данных для исследователя и участников и включает в общей сложности 600 взрослых участников в возрасте 60 лет и старше в стабильном состоянии здоровья с ИМП в анамнезе за последние 5 лет. Набор начинается после завершения первичного анализа фазы 1/2а и выбора дозы ExPEC10V на когорте 1. Схема исследования для когорты 2 включает три периода: максимум 28-дневный период скрининга, двойной слепой 181-дневный период последующего наблюдения с вакцинацией в 1-й день и двойной слепой период ДН, который длится со 182-го дня до 3 лет (1096 день) после вакцинации (фиг. 10В). Все участники когорты 2 переходят в период ДН. Окончание исследования - это последний визит участника из когорты 2 через 3 года (день 1096).

Когорта 1. Фаза 1.

В фазе 1 всего к 84 участникам из когорты 1 применяли поэтапный подход с пошаговым увеличением дозы, проводя оценку безопасности перед переходом от одного этапа к другому. Внутреннему комитету по контролю данных (DRC) поручили провести это исследование, чтобы проанализировать дан

- 48 046206 ные объективного осмотра (исходные и целевые), исходные демографические данные и данные по безопасности на 14 день после вакцинации (включая полученные по запросу местные и системные НЯ, сообщаемые спонтанно НЯ, серьезные НЯ, данные клинических лабораторных исследований и показатели жизненно важных функций) этих 84 участников Фазы 1. На этом этапе исследования участников отбирали и рандомизировали в шесть этапов:

Этап 1. Отбирали и рандомизировали первую четверку участников; двоих участников в группу низкой дозы ExPEC10V (табл. 11) и по одному участнику в группы ExPEC4V и Prevnar 13.

Этап 2. Отбирали и рандомизировали 24 участника; 18 участников в группу низкой дозы ExPEC10V (табл. 11) и по три участника в группы ExPEC4V и Prevnar 13.

Этап 3. Отбирали и рандомизировали первую четверку участников; двоих участников в группу средней дозы ExPEC10V (табл. 11) и по одному участнику в группы ExPEC4V и Prevnar 13.

Этап 4. Отбирали и рандомизировали 24 участника; 18 участников в группу средней дозы ExPEC10V (табл. 11) и по три участника в группы ExPEC4V и Prevnar 13.

Этап 5. Отбирали и рандомизировали первую четверку участников; двоих участников в группу высокой дозы ЕхРЕС 10V (табл. 11) и по одному участнику в группы ExPEC4V и Prevnar 13.

Этап 6. Отбирали и рандомизировали 24 участника; 18 участников в группу высокой дозы ExPEC10V (табл. 11) и по три участника в группы ExPEC4V и Prevnar 13.

В 1 день все участники получали однократную внутримышечную (в/м) инъекцию либо ExPEC10V (1 из 3 доз), либо ExPEC4V, либо Prevnar 13 в соответствии с группой вакцинации, в состав которой их включили в рамках исследования. С первой четверкой участников на каждом из этапов 1, 3 и 5 связывались по телефону через 24 ч после вакцинации для сбора информации о безопасности. Замаскированные данные о безопасности через 24 ч после вакцинации для первой четверки участников в каждой группе изучались главным исследователем (PI), ответственным врачом (SRP) и ведущим медицинским специалистом спонсора (SML). Рандомизация дополнительных участников для следующего этапа приостанавливалась до завершения оценки безопасности на 2 день в первых четверках участников.

В отсутствие каких-либо клинически значимых отклонений включали еще 24 участника (для этапов 2, 4 и 6) и рандомизировали в одну из трех исследуемых групп вакцинации (табл. 11) для получения одной в/м инъекции либо ExPEC10V (1 из 3 доз), ExPEC4V или Prevnar 13 в 1 день.

После вакцинации дополнительных 24 участников для каждой величины дозы (низкая доза на этапе 2, средняя доза на этапе 4 и высокая доза на этапе 6), DRC анализировал данные по безопасности на 14 день после вакцинации у всех 28 (4+24) участников для каждой величины дозы перед переходом к следующей величине дозы или к Фазе 2а.

Когорта 1. Фаза 2а.

На основании приемлемой безопасности и реактогенности (при отсутствии каких-либо проблем с безопасностью или каких-либо событий, соответствующих определенным правилам приостановки исследования), установленных DRC после анализа данных по безопасности на 14 день после вакцинации для первых 84 участников, рандомизировали оставшихся 320 участников из когорты 1 были и осуществляли введение в рамках фазы 2а исследования. Эти дополнительные 320 участников включали в исследование и рандомизировали параллельно в соотношении 2:2:2:1:1 в одну из пяти исследуемых групп вакцинации для получения в день 1 однократной внутримышечной инъекции либо ExPEC10V (1 из 3 доз), либо ExPEC4V или Prevnar 13 (табл. 11). Помимо анализа безопасности на 14 день у первых 84 участников DRC также оценивает данные по безопасности в когорте 1 в ходе исследования и рассматривает любые события, которые соответствуют определенному правилу приостановки исследуемой вакцинации или любые другие проблемы с безопасностью, которые могут возникнуть.

Для когорты 1 первичный анализ проводится, когда все участники совершили визит на 30-й день (4 визит) или прервали участие в исследовании раньше. Окончательный анализ проводится, когда все участники совершили визит на 181-й день или прервали участие в исследовании раньше. Для участников, переходящих к открытому периоду долгосрочного наблюдения (ДН) (группа с выбранной дозой ExPEC10V и группа Prevnar 13), ежегодные контрольные анализы включают данные по безопасности и иммуногенности (мультиплексный иммуноанализ на основе ECL и МОРА) во время посещения через 1 год (366 день), 2 года (731 день) и 3 года (1096 день) после вакцинации.

Когорта 2.

В когорте 2 безопасность, реактогенность и иммуногенность выбранной дозы ExPEC10V (на основе результатов первичного анализа когорты 1) оценивали у участников в возрасте 60 лет и старше со стабильным состоянием здоровья и ИМП в анамнезе за последние 5 лет Для когорты 2 исследование проводится с использованием плацебо в качестве контроля, с маскированием данных для исследователя и участников и включает в общей сложности 600 участников, рандомизированных параллельно в соотношении 2:1 (400 участников в группе ExPEC10V и 200 в группе плацебо).

В 1 день все участники получают однократную в/м инъекцию либо выбранной дозы ExPECIOV, либо плацебо в соответствии с группой вакцинации, в состав которой их включили в рамках исследования (табл. 12).

Для когорты 2 первичный анализ включает данные по безопасности и иммуногенности и проводит

- 49 046206 ся, когда все участники совершили визит на 30-й день (4 визит) или прервали участие в исследовании раньше. Окончательный анализ проводится, когда все участники совершили визит на 181-й день или прервали участие в исследовании раньше. Для участников ежегодные контрольные анализы включают данные по безопасности и иммуногенности (мультиплексный иммуноанализ на основе ECL и МОРА) во время посещения через 1 год (366 день), 2 года (731 день) и 3 года (1096 день) после вакцинации.

Исследование образцов стула проводится у отобранной подгруппы участников для оценки влияния ExPEC10V на распространенность патогенов (например, Clostridium difficile) и серотипов ExPEC10V в кишечной флоре с применением метагеномного анализа.

Количество участников.

Всего в исследовании приняли участие 1004 участника; 404 участника в когорте 1 и 600 участников в когорте 2.

Группы воздействия.

Описание воздействия.

ExPEC10V. Биоконъюгированная вакцина Е.соН в фосфатном буферном растворе, содержащая PS О-антиген серотипов ЕхРЕС О1А, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, 018а, 025b и O75, биоконъюгированных по-отдельности с белком-носителем ЕРА.

Однократная в/м (в дельтовидную мышцу) инъекция 0,5 мл одной из трех доз ExPEC10V в день 1.

ExPEC4V. Биоконъюгированная вакцина Е.соН в физиологическом буферном растворе, содержащая PS О-антиген серотипов ЕхРЕС О1А, O2, О6А, 025В (4:4:4:8 мкг PS/серотипы ЕхРЕС), биоконъюгированных по-отдельности с белком-носителем ЕРА.

Однократная в/м (в дельтовидную мышцу) инъекция 0,5 мл ExPEC4V в день 1.

Prevnar 13. Стерильная суспензия сахаридов капсульных антигенов Streptococcuspneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, по-отдельности связанных с нетоксичным дифтерийным белком CRM197. Однократная в/м (в дельтовидную мышцу) инъекция 0,5 мл, поставляемая в предварительно заполненном шприце, содержащем одну дозу.

Плацебо: физиологический раствор. Однократная в/м (в дельтовидную мышцу) инъекция 0,5 мл плацебо в день 1.

Материалы исследования ЕхРЕС описаны в табл. 9.

Таблица 9. Исследуемые вакцины BAC1001MV (ExPEC4V)

Группа воздейст- вия	О1А (мкг)	02 (мкг)	04 (мкг)	О6А (мкг)	08 (мкг)	015 (мкг)	016 (мкг)	О18А (мкг)	О25В (мкг)	075 (мкг)	ЕРА (мкг)	PS (сумма -рно) (мкг)
Низкая доза ExPEClOV	4	4	4	4	4	4	4	4	8	4	160	44
Средняя доза ExPEClOV	8	4	4	8	4	4	4	4	16	4	221	60
Высокая доза ExPEClOV	8	8	8	8	8	8	8	8	16	8	320	88
ExPEC4V	4	4	-	4	-	-	-	-	8	-	72	20

ЕРА - генетически обезвреженная форма экзотоксина А, полученная из Pseudomonas aeruginosa; PSполисахарид;

ExPEC4V состоит из полисахаридных (PS) О-антигенов серотипов ЕхРЕС О1А, O2, О6А и 025В, по-отдельности биоконъюгированных с белком-носителем ЕРА;

ExPEC10V состоит из полисахаридных (PS) О-антигенов серотипов ЕхРЕС О1А, O2, O4, О6А, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75, по-отдельности биоконъюгированных с белком-носителем ЕРА. Доза определяется только PS. ЕРА (мкг) - измеренные значения;

ExPEC10V состоит из 10 одновалентных лекарственных субстанций (ЛС). Для этого клинического исследования производятся 2 различные концентрации (средняя и высокая) лекарственного препарата (DP) (табл. 10). Третью (низкую) концентрацию получают в клинике путем разбавления высокой концентрации 1:1 буфером для разведения, который совпадает с буфером для приготовления композиции. Каждый DP готовят в натрий-калиевом фосфатном буфере с рН 7,0 (0,02% [мас./мас.] Полисорбата 80, 5% [мас./мас.] сорбита, 10 мМ метионина).

- 50 046206

Таблица 10. Состав вакцины ExPEClOV для клинического исследования фазы 1/2а

Ингредиент	Количество (мкг/мл)³
Активный³	Низкая концентрация ^ь	Средняя концентрация Высокая концентрация
Полисахаридный	О-
антиген
EcoOlA	8	16	16
ЕсоО2	8	8	16
ЕсоО4	8	8	16
ЕсоОбА	8	16	16
ЕсоО8	8	8	16
ЕсоО15	8	8	16
ЕсоО16	8	8	16
Есо018А	8	8	16
ЕсоО25В	16	32	32
ЕсоО75	8	8	16
Белок-носитель
ЕРА	320	441	640
Эксципиенты
КН₂РО₄ Na₂HPO₄Сорбит Метионин Полисорбат 80		6,19 мМ 3,81 мМ 5% (масс./масс.) 10 мМ 0,02% (масс./масс.)

ЕРА - генетически обезвреженный экзотоксин А Р.aeruginosa, используемый в качестве белканосителя;

а активный ингредиент представляет собой биологически синтезированный конъюгат, состоящий из PS антигена и белка-носителя (ЕРА); доза рассчитывается только по PS группировке;

^b низкую концентрацию получают в клинике путем разбавления высокой концентрации 1:1 буфером для разведения.

Оценка безопасности

Ключевые оценки безопасности включают полученные по запросу местные и системные НЯ, сообщаемые спонтанно НЯ, серьезные НЯ, данные объективного осмотра, показатели жизненно важных функций и клинических лабораторных исследований.

Оценка иммуногенности

Ключевые оценки иммуногенности собранных сывороток включают оценку уровней общих антител IgG, специфичных для серотипов ExPEC10V и ExPEC4V, вызванных вакциной, при измерении с помощью мультиплексного иммуноанализа на основе ECL, и функциональных антител, специфичных для серотипов ExPEC10V и ExPEC4V, при измерении с помощью анализа опсонофагоцитарной активности (OPKA) в мультиплексном формате (МОРА). Оценка иммуногенности титров антител к пневмококку, вызванных Prevnar 13, не производится.

Уровни сывороточных антител, индуцированных ExPEC10V, измеряют с помощью мультиплексного иммуноанализа на основе электрохемилюминесценции (ECL). Этот анализ выполняют в 96-луночных микропланшетах, где в каждой лунке находятся угольные электроды с высоким связыванием, на поверхности которых в виде отдельных пятен иммобилизованы различные антигены O-LPS E.coli или белокноситель ЕРА. Уровни антиген-специфических антител, присутствующих в образцах сыворотки, определяют с помощью вторичного антитела (против IgG человека), меченного SULFO-TAG. При электрической стимуляции SULFO-TAG излучает свет, интенсивность которого возрастает пропорционально количеству связанных антител IgG. Данный анализ отвечает требованиям, указанным в рекомендациях Международной конференции по гармонизации (ICH).

Уровни функциональных антител, индуцированных ExPEC10V, измеряют с помощью мультиплексного анализа опсонофагоцитарной активности (МОРА). Вкратце, готовят серию разведений инактивированных нагреванием образцов сыворотки и инкубируют с различными штаммами Е.соН, которые специфически устойчивы к различным типам антибиотиков. После этого в реакцию добавляют человеческий комплемент и фагоцитарные клетки (HL60) и после второго периода инкубации переносят аликвоту реакционной смеси в различные фильтровальные планшеты с гидрофильной мембраной PVDF, содер

- 51 046206 жащие среду, в которую добавлен определенный антибиотик, который избирательно способствует росту штамма, устойчивого к данному антибиотику. После выращивания в течение ночи подсчитывают колониеобразующие единицы (КОЕ), чтобы определить количество выживших бактерий. Данный анализ отвечает требованиям, указанным в рекомендациях ICH.

Для антител к серотипам ExPEC10V, измеренным с помощью мультиплексного иммуноанализа на основе ECL и МОРА, а также к ЕРА, измеренным только с помощью мультиплексного иммуноанализа на основе ECL, оценивают следующие показатели иммуногенности и заносят в таблицы по исследуемым группам вакцинации для всех моментов времени, в которых определяют иммуногенность:

доля участников с >2-кратным и >4-кратным увеличением титров сывороточных антител с 1-го дня (до вакцинации);

средний геометрический титр (GMT);

GMR: кратность изменения от базового уровня, рассчитанное по отношению значений после базового уровня к значениям базового уровня.

Для периода ДН для каждого серотипа представляют обобщенный описательный анализ иммуногенности.

При выборе дозы для более поздних фаз учитывают совокупность данных, имеющихся на момент первичного анализа когорты 1 (результаты 30-го дня).

Таблица 11. Когорта 1: схема вакцинации

		Фаза 1	Фаза 2а	Сум мар но
		Этап 1	Этап 2	Этап 3	Этап 4	Этап 5	Этап 6	Этап 7
Иссл едуе мая труп па вакц ина ции	Вак цп нация в 1-й день	Первые участники (низкая доза)	Дополнит ельные участник и (низкая доза)	Первые участники (средняя доза)	Дополните льные участники (средняя доза)	Первые участник и (высокая доза)	Дополните льные участники (высокая доза)	Дополнител ьные участники фазы 2а
G1	Низкая доза ЕхРЕС 10V*	2	18					80	100
G2	Средн яя доза ЕхРЕС 10V*			2	18			80	100
G3	Высок ая доза ЕхРЕС 10V*					2	18	80	100
G4	ЕхРЕС 4V**	1	3	1	3	1	3	40	52
G5	Prevna г 13***	1	3	1	3	1	3	40	52

Сумм арно		4	24	4	24	4	24	320	404

* ExPEC10V состоит из полисахаридных (PS) О-антигенов серотипов ЕхРЕС О1А, O2, O4, 06а, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75, биоконъюгированных по-отдельности с белком-носителем, генетически обезвреженной формой экзотоксина А (ЕРА), полученного из Pseudomonas aeruginosa.

** ExPEC4V состоит из полисахаридных (PS) О-антигенов серотипов ЕхРЕС О1А, O2, О6А и 025В, биоконъюгированных по-отдельности с белком-носителем, генетически обезвреженной формой экзотоксина А (ЕРА), полученного из Pseudomonas aeruginosa.

*** Prevnar 13, пневмококковая 13-валентная конъюгированная вакцина (дифтерийный белок CRM197) представляет собой стерильную суспензию сахаридов капсульных антигенов Streptococcuspneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, по-отдельности связанных с нетоксичным дифтерийным белком CRM197.

- 52 046206

Таблица 12. Когорта 2: схема вакцинации

Исследуемая группа вакцинации	Вакцинация в 1-й день	Суммарно
G6	ExPEC10V^a	400
G7	Плацебо	200
Суммарно		600

* ExPEC10V состоит из полисахаридных (PS) О-антигенов серотипов ЕхРЕС О1А, O2, O4, 06 а, O8, O15, O16, О18А, 025В и O75, биоконъюгированных по-отдельности с белком-носителем, генетически обезвреженной формой экзотоксина А (ЕРА), полученного из Pseudomonas aeruginosa.

Участников, включенных в когорту 2 исследования, рандомизировали в соотношении 2:1 (ExPEC10V:плацебо). Доза ExPEC10V, используемая в когорте 2, основана на результатах первичного анализа (день 30) когорты 1.

Статус.

Набор и вакцинация когорты 1 описанного выше исследования завершены.

Исследование проводится с маскированием данных. На основании текущего анализа данных о безопасности серьезных проблем с безопасностью выявлено не было, и вакцина ExPEC10V имеет приемлемый профиль безопасности.

Анализ иммуногенности клинических образцов когорты 1 проводится с маскированием данных. Данные ECL на 100% прошли проверку на соответствие приемлемому уровню качества (AQL) и были загружены для обработки данных. Анализ образцов МОРА продолжается. Демаскирование данных и статистический анализ выполняются с привлечением организации по клиническим исследованиям (CRO). Вакцинация Когорты 2 начинается после определения дозы ExPEC10V для этой Когорты на основании окончательного первичного анализа результатов 30-го дня для Когорты 1.

Специалистам в данной области техники понятно, что воплощения, описанные выше, могут быть модифицированы без изменения сущности изобретения. Поэтому понятно, что это изобретение не ограничивается конкретными раскрытыми воплощениями, но также охватывает модификации, которые соответствуют сущности данного изобретения, изложенного в данном описании, и входят в объем данного изобретения.

- 53 046206

Последовательности

SEQ ID NO: 1 (Консенсусная последовательность гликозилирования)

Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой, за исключением Pro

SEQ ID NO: 2 (оптимизированная консенсусная последовательность гликозилирования) Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты, за исключением Pro

SEQ ID NO: 3 (белок-носитель ЕРА, содержащий 4 консенсусные последовательности гликозилирования (ЕРА-4))

G SGGGDQNATG SGGGKLAEEA FDLWNECAKA CVLDLKDGVR SSRMSVDPAI ADTNGQGVLH YSMVLEGGND ALKLAIDNAL SITSDGLTIR LEGGVEPNKP VRYSYTRQAR GSWSLNWLVP IGHEKPSNIK VFIHELNAGN QLSHMSPIYT IEMGDELLAK LARDATFFVR AHESNEMQPT LAISHAGVSV VMAQAQPRRE KRWSEWASGK VLCLLDPLDG VYNYLAQQRC NLDDTWEGKI YRVLAGNPAK HDLDIKDNNN STPTVISHRL HFPEGGSLAA LTAHQACHLP LEAFTRHRQP RGWEQLEQCG YPVQRLVALY LAARLSWNQV DQVIRNALAS PGSGGDLGEA IREQPEQARL ALTLAAAESE RFVRQGTGND EAGAASADW SLTCPVAKDQ NRTKGECAGP ADSGDALLER NYPTGAEFLG DGGDVSFSTR GTQNWTVERL LQAHRQLEER GYVFVGYHGT FLEAAQSIVF GGVRARSQDL DAIWRGFYIA GDPALAYGYA QDQEPDARGR IRNGALLRVY VPRWSLPGFY RTGLTLAAPE AAGEVERLIG HPLPLRLDAI TGPEEEGGRV TILGWPLAER TWIPSAIPT DPRNVGGDLD PSSIPDKEQA ISALPDYASQ PGKPPREDLK LGSGGGDQNA Т

SEQ ID NO: 4 (аминокислотная последовательность GtrS 04)

MNNLIMNNWCKLSIFIIAFILLWLRRPDILTNAQFWAEDSVFWYKDAYENGFLSSLTTPRNGYFQTVSTFIVGLT ALLNPDYAPFVSNFFGIMIRSVIIWFLFTERFNFLTLTTRIFLSIYFLCMPGLDEVHANITNAHWYLSLYVSMIL IARNPSSKSWRFHDIFFILLSGLSGPFIIFILAASCFKFINNCKDHISVRSFINFYLRQPYALMIVCALIQGTSI ILTFNGTRSSAPLGFSFDVISSIISSNIFLFTFVPWDIAKAGWDNLLLSYFLSVSILSCAAFVFVKGTWRMKVFA TLPLLIIIFSMAKPQLTDSAPQLPTLINGQGSRYFVNIHIAIFSLLCVYLLECVRGKVATLFSKIYLTILLFVMG CLNFVITPLPNMNWREGATLINNAKTGDVISIQVLPPGLTLELRKK

SEQ ID NO: 5 (Пример нуклеотидной последовательности gtrS 04)

ATGAATAATTTAATTATGAATAACTGGTGTAAATTATCTATATTTATTATTGCATTTATTTTGCTATGGCTTAGA AGGCCGGATATACTCACAAACGCACAATTTTGGGCAGAAGATTCCGTTTTCTGGTATAAGGACGCCTATGAGAAC GGATTCTTAAGTTCACTAACAACGCCTAGGAATGGGTATTTCCAGACTGTTTCTACATTTATAGTTGGTCTGACT GCTTTATTAAATCCAGATTATGCACCTTTTGTTTCTAATTTTTTTGGCATAATGATTCGCTCAGTAATTATATGG TTTTTATTTACAGAAAGATTCAACTTCCTCACATTGACTACTAGGATTTTCTTATCTATTTATTTTCTATGCATG CCTGGATTGGATGAAGTTCATGCAAATATAACAAATGCACATTGGTATTTGTCATTATATGTATCAATGATCCTG ATAGCTCGCAATCCAAGTTCAAAATCATGGAGGTTTCATGATATATTCTTTATCTTGCTATCCGGGCTCAGTGGC CCATTTATAATTTTCATTTTAGCAGCTTCATGCTTTAAATTTATAAATAATTGTAAAGATCATATTAGTGTAAGA TCTTTCATAAATTTCTACTTGCGTCAGCCATACGCATTAATGATTGTTTGCGCTTTAATTCAAGGAACTTCTATA ATTCTAACTTTCAATGGCACACGTTCCTCAGCACCGCTAGGATTCAGTTTTGATGTGATTTCGTCTATTATATCA TCGAATATTTTTTTATTTACATTTGTCCCATGGGATATTGCAAAGGCTGGGTGGGATAATTTACTGTTATCTTAT TTTTTGTCTGTTTCGATTTTGTCGTGTGCGGCCTTTGTTTTTGTTAAAGGTACGTGGCGAATGAAAGTATTTGCA ACTTTACCATTGCTAATTATAATATTTTCAATGGCAAAACCACAATTGACAGACTCGGCACCTCAATTGCCAACA

- 54 046206

CTTATTAATGGGCAAGGTTCAAGATACTTCGTAAATATACATATTGCGATATTCTCTTTGCTATGTGTTTACTTA CTTGAGTGCGTCAGGGGGAAAGTGGCAACTTTATTTTCCAAAATATACTTAACAATTTTGCTATTCGTGATGGGA TGTTTGAATTTTGTTATCACCCCACTCCCAAACATGAACTGGAGGGAAGGTGCTACTTTGATTAATAATGCAAAA ACTGGTGATGTCATTTCGATTCAAGTGCTACCACCTGGCCTAACACTTGAACTAAGGAAAAAATAA

SEQ ID NO: 6 (Пример последовательности PglB («дикого типа»))

MLKKEYLKNPYLVLFAMIILAYVFSVFCRFYWVWWASEFNEYFFNNQLMIISNDGYAFAEGARDMIAGFHQPNDL SYYGSSLSALTYWLYKITPFSFESIILYMSTFLSSLWIPTILLANEYKRPLMGFVAALLASIANSYYNRTMSGY YDTDMLVIVLPMFILFFMVRMILKKDFFSLIALPLFIGIYLWWYPSSYTLNVALIGLFLIYTLIFHRKEKIFYIA VILSSLTLSNIAWFYQSAIIVILFALFALEQKRLNFMIIGILGSATLIFLILSGGVDPILYQLKFYIFRSDESAN LTQGFMYFNVNQTIQEVENVDLSEFMRRISGSEIVFLFSLFGFVWLLRKHKSMIMALPILVLGFLALKGGLRFTI YSVPVMALGFGFLLSEFKAIMVKKYSQLTSNVCIVFATILTLAPVFIHIYNYKAPTVFSQNEASLLNQLKNIANR EDYWTWWDYGYPVRYYSDVKTLVDGGKHLGKDNFFPSFALSKDEQAAANMARLSVEYTEKSFYAPQNDILKTDI LQAMMKDYNQSNVDLFLASLSKPDFKIDTPKTRDIYLYMPARMSLIFSTVASFSFINLDTGVLDKPFTFSTAYPL DVKNGEIYLSNGWLSDDFRSFKIGDNWSVNSIVEINSIKQGEYKITPIDDKAQFYIFYLKDSAIPYAQFILMD KTMFNSAYVQMFFLGNYDKNLFDLVINSRDAKVFKLKI

SEQ ID NO: 7 (пример аминокислотной последовательности gtrA; E. coli W3110 yfdG, GenBank: ВЛЛ16209.1)

MLKLFAKYTSIGVLNTLIHWWFGVCIYVAHTNQALANFAGFWAVSFSFFANAKFTFKASTTTMRYMLYVGFMG T L SATVGWAAD RCAL P PMIT LVT FSAIS LVCGFVYS КFIVFRDAK

SEQ ID NO: 8 (пример аминокислотной последовательности gtrB-E. coli W3110 yfdH, GenBank: BAA16210.1)

MKISLWPVFNEEEAIPIFYKTVREFEELKSYEVEIVFINDGSKDATESIINALAVSDPLWPLSFTRNFGKEPA LFAGLDHATGDAIIPIDVDLQDPIEVIPHLIEKWQAGADMVLAKRSDRSTDGRLKRKTAEWFYKLHNKISNPKIE ENVGDFRLMSRDWENIKLMPERNLFMKGILSWVGGKTDIVEYVRAERIAGDTKFNGWKLWNLALEGITSFSTFP LRIWTYIGLWASVAFIYGAWMILDTIIFGNAVRGYPSLLVSILFLGGIQMIGIGVLGEYIGRTYIETKKRPKYI IKRVKK

SEQ ID NO: 9 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 04 - штаммпродуцент 04-ЕРА BVEC-L-00684f)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC

- 55 046206

GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGTGAAAATA CTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCAGCTGTAGTTCGTCACATTATAAATAATACGCAGGATAGTGTT GTTAATGTCGATAAATTAACGTACGCCGGAAACCGGGAATCACTTGCTGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATGTT TTTGAACATGCGGATATTTGCGATGCACCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGCAGTGATG CACCTGGCTGCTGAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATATTGTTGGT ACTTATGTCCTTTTGGAAGCCGCTCGCAATTACTGGTCTGCTCTTGATAGCGACAAGAAAAATAGCTTCCGTTTT CATCATATTTCTACTGACGAAGTATATGGTGATTTGCCTCATCCTGACGAGGTAAATAATACAGAAGAATTACCC TTATTTACTGAGACAACAGCTTACGCGCCAAGCAGCCCTTATTCCGCATCCAAAGCATCCAGCGATCATTTAGTC CGCGCGTGGAAACGTACCTATGGTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCTAACAATTATGGTCCTTATCATTTC CCGGAAAAATTGATTCCATTGGTTATTCTCAATGCTCTGGAAGGTAAAGCATTACCTATTTATGGTAAAGGGGAT CAAATTCGCGACTGGCTGTATGTTGAAGATCATGCGCGTGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAAAGCGGGT GAAACTTATAACATTGGTGGGCACAACGAAAAGAAAAACATAGATGTAGTGCTCACTATTTGTGATTTGCTGGAT GAGATTGTACCGAAAGAGAAATCTTATCGTGAGCAAATCACTTATGTTGCCGATCGTCCGGGACACGATCGCCGT TATGCGATTGATGCTGAGAATATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGCGGGATTCGG AAGACAGTGGAATGGTATCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGATT GAAGAGAACTATGAGGGCCGCCAGTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAGGTTGGGAACTAC AGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGTAACTTGATTGCTCTTGATGTTCATTCCACTGATTATTGTGGCGATTTCAGTA ACCCCGAAGGTGTGGCTGAAACCGTCAAAAAAATTCGCCCAGATGTTATTGTTAATGCTGCTGCTCATACCGCGG TAGATAAGGCTGAGTCAGAACCAGAATTTGCACAATTACTCAATGCGACCAGCGTTGAAGCAATTGCAAAAGCGG CTAATGAAGTTGGGGCTTGGGTAATTCATTACTCAACTGACTACGTCTTCCCTGGAAATGGCGACATGCCATGGC TCGAGACTGATGTAACCGCTCCGCTCAATGTTTATGGCAAAACCAAATTGGCTGGAGAAAGAGCATTACAAGAAC ATTGCGCAAAGCATCTTATTTTCCGTACCAGCTGGGTATATGCAGGTAAAGGAAATAACTTTGCCAAAACAATGT TACGTCTGGCAAAAGAGCGCGAAGAACTGGCTGTGATAAACGATCAGTTTGGCGCACCAACAGGTGCTGAATTGC TGGCTGATTGCACCGCTCATGCCATTCGCGTGGCATTAAAAAAACCAGAAGTTGCTGGCTTGTACCATCTGGTAG CAAATGGCACAACAACCTGGCACGATTACGCCGCGCTAGTATTCGAAGAAGCCCGTAAAGCAGGGATTGACCTTG CACTTAACAAACTCAACGCCGTACCAACAACGGCTTATCCTACTCCAGCCCGCCGTCCTCATAATTCTCGCCTCA ATACCGAAAAGTTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTGGGCGTGAAACGTATGCTCAACG AATTATTTACGACTACGGCAATTTAACAAATTTTTGCATCTCGCTCATGATGCCAGAGCGGGATGAATTAAAAGG AATGGTGAAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTCTGGCTGGTGGTTCCGGCACTCGTCTTTATCCTGTGACGATG GCAGTGAGTAAACAACTGCTGCCGATTTATGATAAGCCGATGATTTATTATCCGCTTTCAACGCTTATGTTAGCG GGTATTCGCGATATTCTTATTATCAGTACGCCACAGGATACACCGCGTTTCCAACAATTGTTGGGGGACGGGAGT CAGTGGGGGCTTAATCTACAGTATAAAGTACAACCGAGTCCGGATGGCCTGGCGCAAGCGTTTATTATTGGTGAA GACTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCACTCGTACTTGGCGATAATATCTTCTATGGACACGACTTGCCGAAATTA ATGGAAGCTGCTGTTAACAAAGAAATCGGTGCAACGGTATTTGCTTATCACGTCAATGATCCTGAACGTTATGGT

- 56 046206

GTCGTGGAGTTTGATAATAACGGTACTGCAATTAGCCTGGAAGAAAAACCGCTGGAACCAAAAAGTAACTATGCG GTTACTGGGCTTTATTTCTATGACAATGATGTTGTAGAAATGGCGAAAAACCTTAAGCCTTCTGCCCGTGGCGAA CTGGAAATTACCGATATTAACCGTATTTATATGGAGCAGGGACGTTTGTCTGTCGCTATGATGGGGCGTGGTTAT GCCTGGTTGGATACTGGTACACATCAAAGTCTTATTGAAGCAAGTAACTTCATTGCCACCATTGAAGAGCGTCAG GGATTAAAGGTATCTTGCCCGGAAGAGATTGCTTACCGTAAAGGGTTTATTGATGCTGAGCAGGTGAAAGTATTA GCCGAACCGCTGAAGAAAAATGATTATGGTCAGTATCTGCTAAAAATGATTAAAGGTTATTAATAAAATGAACGT AATTAAAACTGAAATTCCTGATGTGCTGATTTTTGAACCAAAAGTTTTTGGTGATGAACGTGGCTTCTTTTTTGA GAGTTTTAACCAGAAAGTATTTGAAGAAGCTGTAGGACGGAAGGTTGAATTTGTTCAGGATAACCATTCTAAGTC TAAAATAAATGTATTGCGTGGGATGCATTATCAAACACAAAATACTCAAGGAAAACTGGTTCGGGTAATTTCTGG TTCAGTATATGATGTTGCCGTAGATTTAAGAGAAAAATCAAAGACATTTGGCAAATGGGTGGGTGTAGAATTATC TGGGAATAATAAAAGACAATTGTGGATCCCCGAAGGTTTTGCCCATGGTTTTTATGTGTTGGAGGAGAATACCGA ATTTGTTTATAAATGTACCGATACTTATAACCCTGCTCATGAACACACATTGCTATGGAATGATCCAACTATCAA TATAAGTTGGCCAATCATACAAAACTGCAAGCCAATTATTTCTGAAAAAGATGCTAATGGACATCTTTTTTCACA TAAAACCTATTTCTGAAATGCAATATTATGAGTTTAATTAGAAACAGTTTCTATAATATTGCTGGTTTTGCTGTG CCGACATTAGTTGCAGTCCCTGCTTTGGGGATTCTTGCCAGGCTGCTTGGACCGGAGAATTTTGGACTTTTCACA CTAGCATTCGCTTTGATAGGATATGCAAGTATTTTCGACGCCGGGATTAGTCGAGCTGTAATCAGAGAAATCGCT CTTTATCGAGAAAGTGAAAAAGAGCAAATACAAATTATTTCGACAGCAAGTGTAATCGTACTATTCTTAGGGGTG GTTGCAGCTTTGTTACTTTATTTTAGTAGTAATAAAGTTGTTGAGTTATTGAATGTTAGTTCCGTTTATATTGAA ACAGCAGTGCGTGCATTCTCTGTTATTTCATTTATAATACCTGTGTATCTGATTAACCAGATTTGGCTTGGTTAT CTGGAAGGGCTAGAAAAATTTGCAAATATAAATGTTCAGAGAATGATTTCTAGCACAAGCTTGGCTATATTACCA GTGATATTTTGTTATTACAATCCCTCGTTGCTTTATGCTATGTATGGGTTGGTGGTTGGGCGTGTGATTTCATTT TTGATTAGCGCAATAATTTGTCGAGATATTATTCTTAAAAGTAAACTTTACTTTAATGTGGCAACTTGCAATCGT CTTATCTCTTTTGGTGGATGGATAACAGTTAGTAATATCATAAGCCCAATCATGGCATATTTCGACCGCTTTATC ATCTCTCATATTATGGGGGCTTCGAGAATTGCATTTTATACAGCGCCCTCAGAGGGTGTATCAAGGTTAATTAAT ATCCCATATGCTTTGGCAAGAGCTCTATTTCCTAAATTGGCATATAGCAATAATGATGATGAACGAAAAAAATTA CAACTACAGAGCTACGCAATTATAAGCATTGTATGTCTACCCATAGTTGTTATTGGTGTCATTTTTGCCTCATTC ATAATGACAACATGGATGGGACCTGATTATGCCTTAGAAGCAGCAACTATCATGAAAATACTTCTTGCTGGTTTT TTCTTTAACTCTTTAGCGCAAATACCTTATGCATACTTGCAATCTATCGGAAAGTCAAAAATTACCGCATTTGTG CATCTCATAGAACTTGCGCCATACTTATTATTATTGTATTACTTCACAATGCATTTCGGCATAATTGGCACGGCA ATCGCTTGGTCACTTAGAACATTTTGTGATTTTGTTATACTACTTTCGATATCGAGAAGAAAATGATTGCGGTTG ATATTGCGCTTGCAACCTACAATGGTGCTAATTTTATTCGGCAACAGATTGAATCTATCCAGAAACAAACTTATA GAAATTGGCGTCTTATAATAAGTGATGATAACTCGAGTGATGATACTGTTGATATTATTAAGGATATGATGTCTA ACGACAGTCGTATCTATTTGGTAGGAAATAAAAGACAAGGAGGGGTTATTCAGAACTTTAATTATGCTCTTTCAC AAACTACATCTGAAATTGTGTTACTATGTGACCAGGATGACATTTGGCCGGAGGAGCGTCTGGAAATTCTTATAG ATAAATTTAAGGCCTTGCAGCGTAATGATTTTGTTCCGGCAATGATGTTTACTGATTTGAAATTAGTAGACGAAA ATAAT T GT T T GAT T G CAGAAAGT T T T TAT C GAAC GAATAATAT TAAT С CACAAGATAAT С T GAAAAATAATAAT C TTCTCTGGCGTTCAACGGTATATGGCTGTACTTGCATCATGAATAAGAAACTTGTTGATATTGCATTGCCTATAC CTACATATGCACATATGCATGATCAATGGTTGGCATTATTAGCGAAGCAATATGGTAACATTTTTTATTTCGACT ATGCGTCTGTTCGTTATAGGCAACATTCTACAAATGTTGTTGGTGGTAGAAATAAAACGCCATTTCAAAAATTTA ATTCCATACAAAAAAACCTAAAAAGGATTAATTTGCTAGTGGATAGAACTGTTGCTTTAATTAAATCAAATAACG

- 57 046206

ATTTCTATCCAGGGAATAAAATGGAAAATAAAATTGATTACTTAAAATTTGGAGTGAATGAAGTATTACCTTATC T T T T Τ AAAGGAAACAAGAAAGT Τ Τ Τ Τ Τ CACT Τ Τ GT GT AT Τ ΑΑΤ Τ AGT Τ Τ GG CAT Τ ACAAAAAT GAT AT AT Τ TAT Τ ATTTTTTTTTGCACTGTTTATGATCTGTACGTTTTTAACACACAGGCGACAGGCATTATATGTTGTATCTGCGTT AGTATTTCTTTTTTTGGCTTTAACCTATCCATCAGGAGGGGACTGGATAGGTTATTTTCTCCATTATGACTGCAT GGTTAATGAGCAGTGTAATAATGGTTTTATAATGTTTGAACCTGGATATGAATTAATTGTTTCCTTATTTGGATA TTTGGGATTTCAGACAATTATTATTTTTATAGCCGCTGTAAATGTAATTCTAATATTAAATTTTGCAAAGCATTT TGAAAACGGAAGTTTTGTTATTGTTGCGATAATGTGCATGTTCCTTTGGAGTGTTTATGTTGAGGCGATTAGACA GGCTCTGGCCTTATCTATAGTTATATTTGGGATTCATTCTCTTTTTTTGGGTAGAAAAAGGAAATTTATAACATT AGTATTATTTGCGTCAACTTTCCATATAACTGCTTTGATTTGTTTTCTTCTAATGACTCCTCTATTTTCAAAGAA ATTAAGCAAGATAATAAGTTATAGCCTATTAATTTTCAGTAGCTTCTTTTTCGCTTTTTCTGAAACCATATTAAG TGCACTCCTTGCAATTTTGCCAGAAGGATCCATTGCCAGTGAAAAATTAAGTTTTTACTTAGCAACCGAGCAATA CAGGCCACAGTTATCTATTGGGAGTGGCACTATTCTTGACATTATACTTATTTTTCTGATATGTGTAAGTTTTAA ACGAATAAAGAAATATATGCTCGCTAATTATAATGCTGCAAATGAGATATTGCTTATTGGTTGCTGTCTTTATAT TTCTTTCGGTATTTTTATCGGGAAAATGATGCCAGTTATGACTCGCATTGGTTGGTATGGTTTTCCATTTGTTAT AGTACTTCTTTATATTAACTTGGGTTATTCAGAATATTTTAAGAGGTATATAAATAAAAGAGGGTGTGGGTATAG CAAATTATTAATTGCTTTTTATTTTTTGCTACAAATTTTGCGACCATTAACATATGATTATAGCTATTATAATAT AATGCACCAGGATACTTTGCTGAATAGGTTTGATGCATTAGATGATGCATCATTAAGACAATCAGCGAAGAGAAA ATGTTTCGATTTGGGAAAGATAGGATATGGTTTCTTATGTAGTATATAATATCCTGCATTCATTCGGATAATTTC CTATGGAAGTGTCCTTTGCTCTGTCTGTCCTCATTTGTTGAAATTTTATGTTAATAAGAAGCTTTAGATAACCAC TTAGGAACTGTATGTTTGATCTGTCCAAAAATTATATTATTGTAAGTGCGACGGCGCTGGCTTCCGGAGGTGCAT TAACTATATTAAAGCAATTTATAAAACATGCATCACAAAATTCAAATGACTATATTATGTTTGTATCTGCGGGAT TGGAGTTGCCGGTCTGTGATAACATCATTTACATAGAAAACACACCAAAAGGATGGTTGAAAAGAATATATTGGG ATTGGTTCGGTTGTCGGAAGTTTATCTCGGAACATAAGATTAACGTTAAGAAAGTAATTTCTCTACAAAATTCCA GTTTGAATGTTCCTTACGAACAGATTATTTACTTGCACCAGCCAATTCCTTTTAGTAAAGTTGATTCTTTTTTAA AAAATAT CACAT С C GATAAC GTAAAG C Τ Τ Τ Τ Τ Τ TATATAAAAAGT TTTATTCCTATTTTATATT ΤAAATAT GT GA ATGCCAATACAACCATCGTAGTGCAAACGAATTGGATGAAAAAAGGAGTGCTGGAGCAATGTGATAAAATTAGTA CCGAAAGGGTCCTTGTTATAAAACCTGATATCAAAGCATTTAATAATACTAATTTTGATGTAGATATGGATGTAT CTGCAAAAACACTCTTATATCCAGCGACACCACTTACCTATAAAAATCATTTGGTCATTCTGAAGGCGTTGGTTA Τ Τ Τ TAAAGAAAAAGTAT Τ Τ TATAGAT GAT С T GAAAT T С CAAGT GAC Τ Τ Τ T GAAAAGAATAG GTACAAAAAT Τ Τ T G ATAAGTTTGTGCAATTAAATAACTTAAGCAAAAACGTTGATTATCTCGGCGTTCTTTCATACTCGAACTTGCAAA AAAAATATATGGCGGCATCTTTAATCGTTTTTCCTAGCTATATCGAATCATATGGGTTACCACTCATCGAAGCTG CTAGTTTAGGAAAAAAAATCATTAGTAGTGATCTTCCTTATGCCCGGGATGTTTTAAAGGATTATAGCGGCGTAG ATTTTGTAATTTACAATAATGAAGATGGCTGGGCTAAGGCGTTGTTTAATGTTTTAAATGGCAATTCGAAGCTCA ATTTTAGGCCTTATGAAAAAGATAGTCGTTCATCTTGGCCACAGTTCTTCTCTATTTTGAAATAAGGTGTATTAT GTTTAATGGTAAAATATTGTTAATTACTGGTGGTACGGGGTCTTTCGGTAATGCTGTTCTAAGACGTTTTCTTGA CACT GAT AT C AAAGAAAT AC GTATTTTTTCCCGG GAT GAAAAAAAAC AAGAT GAC AT GAG GAAAAAAT AT ΑΑΤ AA TCCGAAACTTAAGTTCTATATAGGTGATGTTCGCGACTATTCGAGTATCCTCAATGCTTCTCGAGGTGTTGATTT TATTTATCATGCTGCAGCTCTGAAGCAAGTACCTTCCTGCGAATTCCACCCAATGGAAGCTGTAAAAACGAATGT TTTAGGTACGGAAAACGTACTGGAAGCGGCAATAGCTAATGGAGTTAGGCGAATTGTATGTTTGAGTACAGATAA AGCTGTATATCCTATCAATGCAATGGGTATTTCCAAAGCGATGATGGAAAAAGTAATGGTAGCAAAATCGCGCAA

- 58 046206

TGTTGACTGCTCTAAAACGGTTATTTGCGGTACACGTTATGGCAATGTAATGGCATCTCGTGGTTCAGTTATCCC AT TAT T T GT C GAT CT GAT TAAAT CAGGTAGAC CAAT GAC GATAACAGAC С С TAATAT GACT C GT TT CAT GAT GAC TCTCGAAGACGCTGTTGATTTGGTTCTTTACGCATTTGAACATGGCAATAATGGTGATATTTTTGTCCAAAAGGC ACCTGCGGCTACCATCGAAACGTTGGCTATTGCACTCAAAGAATTACTTAATGTAAACCAACACCCTGTAAATAT AATCGGCACCCGACACGGGGAAAAACTGTACGAAGCGTTATTGAGCCGAGAGGAAATGATTGCAGCGGAGGATAT GGGTGATTATTATCGTGTTCCACCAGATCTCCGCGATTTGAACTATGGAAAATATGTGGAACATGGTGACCGTCG TAT CT CGGAAGT GGAAGATTATAACT CT CATAATACT GATAGGTTAGAT GT T GAGGGAAT GAAAAAATTACT GCT AAAACTTCCTTTTATCCGGGCACTTCGGTCTGGTGAAGATTATGAGTTGGATTCATAATATGAAAATTTTAGTTA CTGGCGCTGCAGGGTTTATCGGTCGAAATTTGGTATTCCGGCTTAAGGAAGCTGGATATAACGAACTCATTACGA TAGATCGTAACTCTTCTTTGGCGGATTTAGAGCAGGGACTTAAGCAGGCAGATTTTATTTTTCACCTTGCTGGGG TAAATCGTCCCGTGAAGGAGTGTGAATTTGAAGAGGGAAATAGTAATCTAACTCAACAGATTGTTGATATCCTGA AAAAAAACAATAAAAATACTCCTATCATGCTGAGTTCTTCCATCCAGGCTGAATGTGATAACGCTTATGGAAAGA GTAAAGCAGCTGCGGAAAAAATCATTCAGCAGTATGGGGAAACGACAAACGCTAAATATTATATTTATCGCTTGC CGAATGTATTCGGTAAGTGGTGTCGACCAAATTATAACTCCTTTATAGCAACTTTCTGCCATCGCATTGCAAATG ATGAAGCTATTACAATTAATGATCCTTCAGCAGTTGTAAATCTGGTGTATATAGATGACTTTTGTTCTGACATAT TAAAGCTATTAGAAGGAGCGAACGAAACTGGTTACAGGACATTTGGTCCAATTTATTCTGTTACTGTTGGTGAAG TGGCACAATTAATTTACCGGTTTAAAGAAAGTCGCCAAACATTAATCACCGAAGATGTAGGTAATGGATTTACAC GTGCATTGTACTCAACATGGTTAAGTTACCTGTCTCCTGAACAGTTTGCGTATACGGTTCCTTCTTATAGTGATG ACAGAGGGGTATTCTGTGAAGTATTGAAAACGAAAAACGCGGGCCAGTTTTCGTTCTTTACTGCGCATCCAGGAA TTACTCGGGGTGGTCATTATCATCATTCCAAAAATGAGAAATTTATTGTCATCCGAGGAAGTGCTTGTTTCAAAT T T GAAAATAT T GT CAC GAGT GAAC GATAT GAACT TAAT GT T T C CT CT GAT GAT T T TAAAAT T GT T GAAACAGT T C CGGGATGGACGCATAACATTACTAATAATGGCTCGGATGAGCTAGTTGTTATGCTTTGGGCAAATGAAATATTTA ATCGTTCTGAACCAGATACTATAGCGAGAGTTTTATCGTGAAAAAATTGAAAGTCATGTCGGTTGTTGGGACTCG TCCAGAAATTATTCGACTCTCGCGTGTCCTTGCAAAATTAGATGAATATTGTGACCACCTTATTGTTCATACCGG GCAAAACTACGATTATGAACTGAATGAAGTTTTTTTCAAAGATTTGGGTGTTCGCAAACCTGATTATTTTCTTAA TGCCGCAGGTAAAAATGCAGCAGAGACTATTGGACAAGTTATCATTAAAGTTGATGAGGTCCTTGAACAGGAAAA ACCAGAAGCCATGTTAGTACTTGGCGATACTAACTCCTGTATTTCAGCAATACCAGCAAAGCGTCGAAGAATTCC GATCTTCCATATGGAGGCTGGGAATCGTTGTTTTGACCAACGCGTACCGGAAGAAACTAACAGAAAAATAGTTGA TCATACCGCTGATATCAATATGACATATAGTGATATCGCGCGTGAATATCTTCTGGCTGAAGGTGTACCAGCCGA TAGAATTATTAAAACCGGTAGCCCAATGTTTGAAGTACTCACTCATTATATGCCGCAGATTGATGGTTCCGATGT ACTTTCTCGCCTGAATTTAACACCTGGGAATTTCTTTGTGGTAAGTGCCCACAGAGAAGAAAATGTTGATACCCC TAAACAACTTGTGAAACTGGCGAATATACTTAATACCGTGGCTGAAAAATATGATGTCCCGGTAGTTGTTTCTAC TCATCCTCGCACTCGTAACCGCATCAACGAAAACGGTATTCAATTCCATAAAAATATCTTGCTTCTTAAGCCATT AGGATTTCACGATTACAACCATCTGCAAAAAAATGCACGTGCTGTTTTATCGGATAGTGGGACTATTACAGAAGA GTCCTCCATTATGAACTTCCCTGCACTCAATATACGAGAAGCGCACGAACGCCCGGAAGGCTTCGAAGAAGGGGC AGTAATGATGGTCGGTCTTGAATCTGATCGCGTTTTACAGGCATTAGAAATTATTGCAACACAGCCTCGTGGAGA AGTACGCTTACTTCGTCAGGTTAGTGACTATAGCATGCCAAATGTTTCAGATAAAGTTCTGCGTATTATCCATTC ATATACTGACTACGTTAAACGGGTTGTCTGGAAGCAATACTAATGAAACTTGCATTAATCATTGATGATTATTTG CCCCATAGCACACGCGTTGGGGCTAAAATGTTTCATGAGTTAGGCCTTGAATTACTGAGCAGAGGCCATGATGTA ACTGTAATTACGCCTGACATCTCATTACAAGCAATTTATTCTATTAGTATGATTGATGGTATAAAGGTTTGGCGT

- 59 046206

TTCAAAAGTGGACCTTTAAAGGATGTAGGTAAGGCTAAACGTGCCATAAATGAAACTCTTTTATCTTTTCGCGCA TGGCGCGCATTTAAGCACCTCATTCAACATGATACATTTGATGGTATCGTTTATTATTCCCCCTCTATTTTTTGG GGCGACTTGGTTAAAAAAATAAAACAACGATGCCAGTGCCCAAGCTATCTGATCCTAAGGGATATGTTTCCACAG TGGGTCATTGATGCAGGTATGTTGAAAGCCGGTTCACCAATTGAAAAATATTTTAGGTATTTTGAAAAAAAGTCA TATCAGCAGGCTGGCCGGATAGGGGTAATGTCTGATAAGAATCTTGAGATATTTCGCCAGACCAATAAAGGTTAT CCGTGTGAAGTTTTACGTAATTGGGCCTCAATGACTCCTGTGTCTGCCAGCGATGATTATCATTCACTTCGTCAA AAATACGATCTAAAAGATAAAGTCATTTTTTTCTATGGCGGTAATATTGGGCATGCTCAGGATATGGCAAACTTA ATGCGCCTTGCGCGTAATATGATGCGTTATCATGATGCTCATTTCCTGTTTATAGGGCAGGGTGATGAAGTTGAG CTGATAAAATCTCTTGCTGCAGAATGGAATTTAACTAATTTCACTCATCTACCTTCAGTGAACCAGGAAGAGTTT AAATTAATTTTATCTGAAGTTGATGTCGGCCTGTTCTCCCTTTCATCTCGCCATTCTTCACATAATTTCCCCGGA AAATTACTAGGGTATATGGTTCAATCAATCCCGATCCTTGGGAGTGTGAATGGCGGCAATGATTTAATGGATGTA ATTAATAAGCACAGAGCCGGTTTCATTCATGTTAATGGTGAAGATGATAAACTGTTTGAATCTGCACAATTGCTT CTTAGTGATTCAGTTTTAAGAAAACAGCTAGGTCAGAACGCTAATGTGTTGTTAAAGTCTCAATTTTCGGTTGAA TCGGCGGCACATACTATCGAAGTCCGACTGGAGGCTGGAGAATGCGTTTAGTTGATGACAATATTCTGGATGAAC TTTTTCGCACTGCAGCAAATTCTGAACGTTTGCGCGCTCATTATTTATTGCACGCATCTCATCAGGAGAAGGTTC AACGTTTACTTATTGCATTTGTACGCGACAGCTATGTTGAACCCCATTGGCATGAGTTACCGCATCAGTGGGAAA TGTTTGTCGT CAT GCAAGGGCAAT TAGAAGT T T GT T T GTAT GAGCAAAAT G GT GAGAT C CAAAAACAGT T T GT T G TTGGAGACGGTACGGGAATAAGCGTCGTGGAATTTTCCCCAGGAGATATACATAGTGTCAAATGCCTGTCACCAA AAGCCCTTATGTTGGAGATAAAGGAGGGGCCATTTGACCCACTCAAAGCTAAGGCTTTTTCTAAGTGGTTATAGG GCGATACACCACCGTTTATTCTTCTATCTTATTCTATACATGCTGGGTTACCATCTTAGCTTCTTCAAGCCGCGC AACCCCGCGGTGACCACCCCTGACAGGAGTAGCTAGCATTTGACCACCCCTGACAGGATTAGCTAGCATATGAGC TCGAGGATATCTACTGTGGGTACCCGGGATCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGA ATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATAT

SEQ ID NO: 10 (пример сигнальной последовательности белка-носителя ЕРЛ) MKKIWLALAG LVLAFSASA

SEQ ID NO: 11 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb О1Л - штаммпродуцент О1Л-ЕРЛ stGVXN4411 и stLMTB10217)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA

- 60 046206

TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA

TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA

GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA

ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC

CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGCTAGCGTG

AAGATACTTGTTACTAGGGGCGCAGGATTTATTGGTTCTGCTGTAGTTCGTCACATTATAAATAATACGCAGGAT

AGTGTTGTTAATGTCGATAAATTAACGTACGCCGGAAACCTGGAATCACTTGCTGATGTTTCTGACTCTGAACGC

TATGTTTTTGAACATGCGGATATTTGCGATGCTGCTGCAATGGCGCGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGCA

GTGATGCACCTGGCTGCTGAAAGCCATGTGGATCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATATT

GTTGGTACTTATGTCCTTTTGGAAGCGGCTCGCAATTACTGGTCTGCTCTTGATGGCGACAAGAAAAATAGCTTC

CGTTTTCATCATATTTCTACTGACGAAGTCTATGGTGATTTGCCTCATCCTGACGAAGTAAATAATAAAGAACAA

TTACCCCTCTTTACTGAGACGACAGCTTACGCGCCTAGTAGTCCTTATTCCGCATCAAAAGCATCCAGCGATCAT

TTAGTCCGCGCGTGGAAACGTACCTATGGTTTACCGACTATTGTGACTAACTGTTCGAATAACTACGGTCCTTAT

CACTTTCCGGAAAAATTGATTCCACTAGTAATTCTTAATGCTCTGGAAGGTAAGGCATTACCTATTTATGGCAAA

GGGGATCAAATTCGTGACTGGCTGTATGTTGAAGATCATGCGCGTGCGTTATATACCGTAGTTACTGAAGGTCAA

GCGGGTGAAACCTATAACATTGGCGGACACAACGAAAAGAAAAACATCGATGTTGTGCTGACTATTTGTGATTTG

TTGGACGAGATAGTCCCGAAAGAGAAATCTTATCGTGAGCAAATTACTTATGTTGCTGATCGCCCAGGGCATGAT

CGCCGTTATGCGATTGATGCTGAGAAGATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGTGGG

ATTCGTAAAACGGTGGAATGGTATTTGGCTAATGCAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATCG

TGGATTGAACAGAACTATGAGGGCCGCCAGTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAGGTTGGG

AACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGTAATTTGATTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTGTGGTGATT

TTAGTAACCCTGAAGGTGTGGCTGAAACAGTCAAAAGAATTCGACCTGATGTTATTGTTAATGCTGCGGCTCACA

CCGCAGTAGATAAGGCTGAGTCAGAACCCGAATTTGCACAATTACTCAATGCGACTAGCGTTGAATCAATTGCAA

AAGCGGCAAATGAAGTTGGGGCTTGGGTAATTCATTACTCAACTGACTACGTATTCCCTGGAAATGGCGACACGC

CATGGCTGGAGATGGATGCAACCGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCTGGAGAAAAAGCATTAC

AAGAGCATTGTGCGAAGCACCTAATTTTCCGTACCAGCTGGGTCTATGCAGGTAAAGGAAATAATTTCGCCAAAA

CGATGTTGCGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAACTAGCCGTTATTAATGATCAGTTTGGTGCGCCAACAGGTGCTG

AACTGCTGGCTGATTGTACGGCACATGCCATTCGTGTCGCACTGAATAAACCGGATGTCGCAGGCTTGTACCATT

TGGTAGCCAGTGGTACCACAACCTGGTACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAATGCAGGCATTC

CTCTTGCACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAACAACTGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATAACTCTC

GCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAATTTTGCGCTTGTATTGCCTGACTGGCAGGTTGGTGTGAAACGCATGC

TCAACGAATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGCATCTTGTTCGTGATGGTGGAGCAAGATGAATTA

AAAGGAATGATGAAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTAGCGGGTGGTTCTGGTACTCGTCTTTATCCTGTGA

CTATGGTCGTCAGTAAACAGCTATTACCTATATATGATAAACCGATGATCTATTATCCGCTTTCTACACTGATGT

TAGCGGGTATTCGCGATATTCTGATTATTAGTACGCCACAGGATACTCCTCGTTTTCAACAACTGCTGGGTGACG

GTAGCCAGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAGTGCAACCGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCATTTATTATCG

GTGAAGAGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTACTTGGTGATAATATCTTCTACGGTCACGACCTGCCTA

AGTTAATGGATGCCGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCTGAACGCT

ATGGTGTCGTTGAGTTTGATAAAAACGGTACGGCGATCAGCCTGGAAGAAAAACCGCTACAACCAAAAAGTAATT

ATGCGGTAACCGGGCTTTATTTTTATGATAACGACGTTGTCGAAATGGCGAAAAATCTTAAGCCTTCTGCCCGCG

- 61 046206

GTGAACTGGAAATTACCGATATTAACCGTATCTATATGGAACAAGGGCGTTTATCTGTTGCCATGATGGGGCGTG GTTATGCGTGGTTAGACACGGGGACACATCAGAGCCTGATTGAGGCAAGCAACTTTATTGCAACAATTGAAGAGC GTCAGGGGCTGAAAGTTTCCTGCCCGGAAGAAATTGCTTACCGTAAAGGGTTTGTTGATGCTGAGCAGGTGAAAG TATTAGCTGAACCTCTGAAAAAAAATGCTTATGGTCAGTATCTGCTGAAAATGATTAAAGGTTATTAATAAAATG AACGTAATTAAAACAGAAATTCCTGATGTACTGATTTTTGAACCGAAAGTTTTTGGTGATGAGCGTGGTTTCTTT TTTGAGAGCTTTAACCAGAAGGTTTTTGAGGAAGCTGTAGGCCGCAAAGTTGAATTTGTTCAGGATAACCATTCG AAGTCTAGTAAAGGTGTTTTACGCGGGCTGCATTATCAGTTGGAACCTTATGCACAAGGAAAATTGGTGCGTTGC GTTGTCGGTGAAGTTTTTGACGTAGCTGTTGATATTCGTAAATCGTCATCGACTTTTGGCAAATGGGTTGGGGTG AATTTATCTGCTGAGAATAAGCGGCAATTGTGGATTCCTGAGGGATTTGCACATGGTTTTTTAGTGCTGAGTGAG ACGGCGGAGTTTTTGTATAAGACGACAAATTATTATCATCCTCAGAGTGATAGAGGAATAAAATGGGATGATCCA AGCATCAATATTTCATGGCCAGTCGATTCACAAGTGCTGCTATCAGCTAAAGATAATAAGCATCCTCCATTAACA AAGATTGAAATGTATAGTTAAGATCACGATAAATCTTGGAAGGGTTGCAAAATTGAATAAAATAGTGAGCAAAAG TGAAATAAGGAACGTAATCCACAATGCTGGCTATATGATGATTACTCAGATAGCTTTATATGTTGCACCATTATT TATACTGAGTTATCTGTTAAAAACACTGGGGGTTGCACAGTTTGGTAATTATGCCTTAATACTATCAATCGTTGC ATATTTACAGATTATAACGGATTATGGTTTTTCTTTTAGTGCAAGTCGTGCGATCTCACAGAATAGAGAGGACAA AGAATATATATCAAAAATTTATCTGTCAACTATGACTATCAAGTTGGCGATATGCGCTTTCTTATTCTTATTGCT CATGCTATTTTTAAATCTTTTGCCTGTGCAAGCTGAATTAAAACAAGGAATATTATATGGATATCTTCTTGTAAT AGGAAATACTTTCCAACCACAATGGTTTTTCCAAGGTATCGAAAAATTAAAAATCATAGCCCTTTCTAATGTTAT ATCAAGATGCGCCGCGTGTTTACTTGTATTTATCTATGTGAGGAATAGCGAGGATTTACAAAAAGCACTTTTAGT ACAGTCACTTCCATTAGTAATTTCTGCGATTGGATTAAATATATTTATATTGAAATATATCAATATTATTTTTCC GGAAAAAAAATTATTTAAGGTAATTTTAAAAGAAGGTAAGGATTTTTTTCTTGCATCACTTTATTCTGTTATTCT CAATAATAGTGGCATTTTTCTATTAGGGATTTTTACTAATCCTGTTATTGTTGGTGTATATGCCGCCGCTGAAAA GATAGTCAAGGCCGTATTGTCGCTATTTACACCACTGACGCAAGCTATATATCCTTATAATTGTCGTAAGTTTTC ACTATCCGTATTTGACGGCATTGAGGCAGCAAAAAAAACTGGTATACCAATTATAATTTTAGCATTTATAGCTGC TGTTATCGTTGCAATTACCTTACCTGTTGCAATCGACTATCTTAATTTTCCAAAAGAAACAATTTTTGTAGGTCA AATATTAAGTGCATGGATCTTTTTTGGTGTTCTTAATAATGTATTCGGCATTCAGATATTGAGTGCATCAGGAAG AAGTAAAATATATAGTAGGATGGTATTCGTATCAGCGCTTATAACATTACTTTTGATTACTCTATTATTGCAGTT TTGTAACGCCACTGGAGTGGCATGTGCAATATTATTGGGTGAAATGTTCTTATCAATATTGTTACTTAAGCGATA TAAAAAAATAATTTAAGGAATAGTTATGAAGAAGTTATTATTAGTGTTCGGTACTAGGCCTGAAGCAATAAAGAT GGCCTCTATCATTGAATTATTAAAAAAAGATTGTAGATTCGAATATAAAATATGTGTGACAGGCCAACATAAAGA GATGCTTGATCAAGTTATGCAAGTATTTGATGTTAAACCTGATTATAATTTACGGATTATGCAGCCTGGGCAAAC ATTAGTATCTATAGCAACAAATATACTCTCACGGTTAAGTGAAGTTTTAATTATAGAAAAGCCAGATATTATACT TGTGCATGGGGATACAACGACTACCCTTGCTGCTACTTTAGCTGGGTATTACCACCAAATAAAAGTTTGTCATGT GGAAGCAGGATTAAGAACAGGGGATATTTACTCTCCTTGGCCTGAAGAGGGCAATCGTAAAGTTACAGGGGCATT AGCATGTATTCATTTCGCCCCAACAGAGAGATCAAAAGATAATCTCCTGAGGGAGGGGGTCAAAGTAAATAATAT ATTTGTAACGGGTAATACCGTCATCGACTCTTTATTTATTGCAAAAGATATCATAGATAATGACCCTAATATAAA GAACGCTTTACATAATAAATTTAATTTTCTTGATAAAAGCCGACGAGTAGTACTTATAACAGGTCATCGAAGAGA AAATTTCGGGAAAGGTTTTGAAGATATATGCTTTGCAATAAAGGAATTAGCTTTCATTTATCCTAATGTAGATTT TAT T TAT С C GGT GCAT CT TAAT С С CAAT GTAAT GGAAC CAGTACAT C GTATAT TAGATAATATAT GTAATAT T TA CCTTATTGAGCCCTTGGATTATTTGCCTTTTGTTTATTTAATGAATGAGTCATATTTAATATTGACTGATTCAGG

- 62 046206

GGGGATACAAGAAGAAGCGCCTTCGTTAGGTAAACCGGTTTTGGTTATGCGTGATACTACTGAACGCCCTGAGGC GGTTGAGGCTGGTACTGTTGTATTAGTGGGGACTTCTAAGATAAAAATAGTAAATAAAGTAACGGAGCTATTAAA CAATGCTGATATCTACAATGCTATGTCTCTGTTACATAATCCATATGGCGATGGAACAGCTGCTCAAAAAATTCT TAATGTGCTCGCCCAAGAGCTAATTTAATTTAAGCTAAAAATATGTTATTAATTATTGCTGATTATCCAAACGAA ATGAATATGCGCGAGGGAGCTATGCAACGAATAGATGCGATAGACTCTCTCATTCGAGATCGCAAGCGAGTGTAT TTGAATATTTCATTCAAAAAGCATCTAGTTCGCTCAAATAGTTCCTTTAATAATGTTATAGTTGAAAATCTAAAT GCAAT TAT T CACAGAAACAT CATAAAACAGTACAT GCAAAAAT CAACAACTATATAT GT T CAT T CT GT T TATAAT TTATTAAAGGTTATAACGCTCATTGATCTAAAAAAAACAATTCTTGATATACATGGTGTTGTACCGGAAGAACTT TTGGCAGATAATAAAAAATTACTTAGTAAAGTATATAACATGGTGGAAAAAAAAGGTGTCCTTGGATGCAAAAAA TTAATACACGT CAGTACAGAAAT GCAAAAACACTAT GAAGCAAAATAT GGAGTAAACTT GGCT GAAAGGT CAATA GTGCTCCCGATTTTTGAATATAAAAATATAACCCAATCGCAAAACAAATGGACAGAAAATAAAATACGAAGTATC TATCTTGGAGGATTACAAACATGGCAAAATATTGATAAAATGATTCAAGTTTGTGATGACACAGTGATAAACAAT GAAGCAGGTAAGTATGAATTCAACTTTTTCATCCCACAGAGTAACTTGGAAGGGTTTATAGATAAATATTCGTTA AAATTACATAATATCAATGCTAATGCATCTACGCTATCACGTGATGAAGTAATTCCCTTTCTAAAAGAATGTCAT ATTGGTTTTGTATTGCGCGATGATATAATAGTAAACAGAGTTGCGTGCCCTACAAAATTGGTTGAATATTTAGAG TGTGGTGTCGTTCCAGTTGTGCTCTCCCCACTTATAGGTGATTTTTATTCGATGGGATATCAATACATTACTACA GAGGAAATGGCTAACAGAAGTATAAGTTTGTTGGATCTTGAAAAAATGGCTGCACATAATTTACAAATTTTGACT TCTTATCAGAAGAGAACCTACAAGGCACAGAAAGAACTTATTGCTCAACTGTGCTGAATTTTTTACATATATAAA ATTATGTAAGCATATCGCGGGTCAGGTAATTGTATGCGTATCAAATATAAAGATAACGGTTATATATTATGTTTT CTATTATGTTTCATTTTGAGCTACTTAGTTTTACTCAAATCTGACTACTTTCCTGCTGATTTTCTGCCATATACA GAAATATACGATGGGACATACGGAGAAATCAATAATATTGAGCCTGCCTTTTTATATTTAACACGGTTGTTTCAT TATTTAAATTTCCCCTATATATTTTTTGCAATGTTAGTTTGTGCCTTATGTTTAAGTTGGAAAATAAAATATGCA AGAAAAATAAT TAAAGATAGT TATATATAT TTGTTCTT GTAT GTATAT GTAT CAT T T TAT GT GT TT T T GCAT GAA ATGACTCAATTGCGCATAGCAATTGCAGTCACTATGTGCTATGTGTCGGTTTATTATTACTTTTATAAAAATTGT ATTAAACATGCACTGCCATGGATGGTGTTGGCTATTTTGTTTCATTACAGCGCCTTGCTTTTATTTATGTCATTA TTTATATACAGTTATAGGAGGTTATTAATAGTAATTATAGGGTTTGTAATATGTATGAGCTTTTTAAACGTGTAT G CAGATACAAT T G САС TATAT T T G С СAAAT GAAAAAATAGTAAAT TATTTATATAGTATTT CAT CAT CAT TAGAC AATAGAAATGATTTGGCAATATTCAACCTGAATAATATAATATTTTTATCAATATTTATTTTGATCTTTTATCTT AGCCGATATATAAAATTAAATGATAATGAGGCGAAGTTTATTAAGTATGTGCAATGTTCAGGAATATTAGCCTTT TGTATTTTCTTTCTGGCTAGTGGAGTCCCGGTCATTGCTTATCGAACTGCAGAGTTGCTGCGAATATTTTATCCG ATGGCTTTAGTATTAATCCTTTCGCATATAAAAAATAATAATATGCGTTATTTTATTGCAGTCATTATAGTTATC CTTTCAGGCTTAATGTTGTTTATAACACTAAGGGCTGTATCAATAGTTGGTCAAGGATTATAAAATGAATGTTGC TATTTTGTTGTCTACGTATAATGGCGAAAAATATTTAGAGGAACAACTGGATTCATTGCTGCTTCAAAGTTATCA GGAT T T T GTAGT GTATAT С C GT GAT GAC GGAT CAT CT GATAGAACT GTAAATATAATAAAC CAATAC GTAAT GAA AGATAACAGATTTATTAACGTGGGTAATTCAGAAAATCTTGGTTGTGCTGCTTCGTTTATTAATTTATTAAGAAA TGCTTCAGCCGATATTTATATGTTTTGTGACCAAGATGATTATTGGCTTCCGAATAAATTACAGCGTGCTGTGGA TTATTTTTCGGCTATTGATCCTTTACAACCTACCTTGTATCATTGCGATCTAAGCGTTGTTGATGAAAAACTTAA TAT TATACAAAAT T CAT T T T T G CAG CAT CAGAAAAT GT CAG C GTAT GAT T CAAT GAGAAAAAATAAT С T T T T CAT ACAAAATTTTGTTGTTGGTTGTTCATGTGCTGTTAATGCTTCACTTGCGGAATTTGTTCTTTCGCGAATTGGAGA GCAGCATGTAAAAATGATAGCTATGCATGACTGGTGGTTAGCCGTGACTGCAAAACTTTTTGGTCGAATCCATTT

- 63 046206

TGATAATACTCAAACGATTCTTTATCGACAACATCAGGGCAATGTATTAGGTGCAAAATCATCAGGTATGATGCG TTTTATTCGATTAGGATTAAATGGGCAAGGGATTTCGCGAGTAGTATCTTTTAGAAAAAAAGTTTGTGCGCAAAA TAAGCTTCTTTTAGATGTCTATGATAAAGATTTAAATCTTGAGCAAAAAAAATCTATCAGGCTTGTAATTGAGGG CCTTAAAGAGAACTCTTCAATTGCTGACCTTTTAAAATGTTTCTATCATGGTAGCTATATGCAAGGTTTTAAACG TAATCTTGCCTTAATATATTCAGTTCTTTACACAAAAAAAAGAAGATAGTGTATCCTTATGAAAAAAATTGCTAT TATCGGTACTGTTGGCATACCAGCATCATATGGCGGATTTGAAACATTAGTTGAAAATTTAACAAGATACAATTC CTCGGGAGTTGAATATAATGTTTTTTGTTCATCGTTTCACTACAAATCCCACCAAAAAAAACATAATGGGGCCCG TTTAATTTATATTCCGCTTAAAGCCAATGGATGGCAGAGCATTGCGTATGACATAATTTCGTTAGCATATTCTAT _{TTTTTTGAAGCCTGATGTGATTCTGATTTTAGGGGTTTCTGGTTGTTCATTTTTGCCTTTCTTCAAACTCTTAAC}ACGCGCTAAGTTTATTACTAATATTGATGGCCTGGAATGGCGAAGAGATAAATGGAATTCAAAAGTGAAACGTTT CTTAAAATTTTCAGAAAAAATCGCAGTTCAATATTCGGATGTCGTTATTACGGATAATGAGGCAATTTCTGAGTA CGTTTTTAACGAGTATAATAAAGATAGCCGAGTTATTGCCTATGGAGGGGATCATGCATGGTTAAATACTGAGGA TGTATTTACAACAAGAAATTATAAAAGCGATTACTACCTTTCTGTATGTCGTATCGAACCCGAAAACAATGTAGA ATTAATTTTAAAAACATTTTCAAAGCTAAAATATAAAATAAAATTTATTGGAAATTGGAATGGCAGCGAGTTTGG AAAGAAACTTAGGCTGCATTATTCTAACTATCCAAATATTGAAATGATTGATCCGATTTATGATCTTCAACAATT ATTTCACTTACGAAATAATTGCATAGGATATATACATGGTCATTCGGCTGGAGGAACAAACCCTTCTTTAGTCGA GGCAATGCATTTTAGTAAACCTATATTTGCATATGATTGTAAGTTTAATAGGTACACTACTGAAAATGAAGCATG TTATTTTTCTAATGAATCTGACCTCGCAGAGAAAATCATAATGCATTGTGAGCTATCATTAGGTGTCTCTGGCAC GAAAATGAAAGAAATTGCTAACCAGAAATACACTTGGAGACGAATAGCAGAAATGTATGAGGATTGCTATTAACT CTGTTAAACTTCAAATCTTTTACAATATATGGCATGACTATAAGCGCATTAATTGTTTTTCAAGCCGCTCTCGCG GTGACCACCCCCTGACAGGGGATCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAA CTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGATAAAGCCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATA CTTTAATAAGTACTTTGTATACTTATTTGCGAACATTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGAC AGGAGTATGTAATGTCCAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACA TCGAAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATC CAGGCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTTGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGT TAATGGTGAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCA TCATTGATGGTGGTAACACCTTCTTCCAGGACACTATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACT TCATCGGTACCGGTGTTTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCTGAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAG AAGCCTATGAATTGGTAGCACCGATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCT ATATTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGA TTGCTGAAGCCTATTCTCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCTCACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGT GGAATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGACATCACCAAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTA ACTACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCGGCTAACAAAGGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGG ATCTCGGCGAACCGCTGTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTTTGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTG TTGCCGCATCTAAAGTTCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTC GTCGTGCGCTGTATCTGGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGT ACAACTGGGATCTGAACTACGGCGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGC AGAAAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCACAGATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTG CCGATGACTACCAGCAGGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCT

- 64 046206

CCGCAGCGGTTGCCTATTACGACAGCTACCGTGCTGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACT ATTTTGGTGCGCATACTTATAAGCGTATCGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 12 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 02 - штаммпродуцент 02-ЕРА stGVXN4906)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGTGAAAATA CTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCAGCTGTAGTTCGTCACATTATAAATAATACGCAGGATAGTGTT GTTAATGTCGATAAATTAACGTACGCCGGAAACCGGGAATCACTTGCTGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATGTT TTTGAACATGCGGATATTTGCGATGCACCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGCAGTGATG CACCTGGCTGCTGAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATATTGTTGGT ACTTATGTCCTTTTGGAAGCCGCTCGCAATTACTGGTCTGCTCTTGATAGCGACAAGAAAAATAGCTTCCGTTTT CATCATATTTCTACTGACGAAGTCTATGGTGATTTGCCTCATCCAGATGAAGTAAATAATACAGAAGAATTACCC TTATTTACTGAGACGACAGCTTACGCGCCAAGCAGCCCTTATTCCGCATCCAAAGCATCCAGCGATCATTTAGTC CGCGCATGGAAACGTACGTATGGTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTATGGTCCGTATCACTTC CCGGAAAAGCTTATTCCATTGGTTATTCTTAATGCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATTTATGGCAAAGGGGAT CAAATTCGCGACTGGTTGTATGTAGAGGATCATGCTCGTGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAAAGCGGGT GAAACTTATAACATTGGCGGACACAACGAAAAGAAAAACATCGATGTTGTGCTGACTATTTGTGATTTGTTGGAT GAGATTGTACCGAAAGAGAAATCTTATCGTGAGCAAATTACTTATGTTGCTGATCGCCCAGGGCATGATCGCCGT TATGCAATTGATGCCGATAAAATTAGCCGCGAATTGGGCTGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGCGGGATTCGC AAAACGGTGGAATGGTATCTGGCTAATACAAATTGGGTTGAGAATGTGAAAAGCGGTGCTTATCAGTCATGGATC GAACAAAACTATGAGGGCCGTCAGTAATGAATATCCTGCTTTTCGGCAAAACAGGGCAGGTGGGTTGGGAACTGC AGCGTGCTCTGGCGCCGCTGGGTAATCTGATCGCTCTTGATGTTCACTCCACTAATTATTGTGGAGATTTCAGCA ACCCCGAAGGTGTGGCAGAAACCGTCAAAAAAATTCGTCCTGACGTTATTGTTAATGCTGCTGCTCACACTGCAG TAGATAAAGCAGAATCAGAACCGGATTTCGCACAATTACTTAACGCGACAAGCGTCGAAGCGATTGCAAAAGCTG CTAATGAAGTCGGGGCCTGGGTTATACACTACTCTACTGATTATGTTTTCCCAGGCAGTGGTGACGCGCCATGGC

- 65 046206

TGGAAACGGATGCAACAGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACAAAATTAGCTGGGGAAAAGGCATTACAAGAAC ATTGCGCAAAGCATCTTATTTTCCGTACCAGCTGGGTATACGCTGGTAAAGGAAATAACTTTGCTAAAACGATGT TGCGTTTGGCAAAAGAACGCGAAGAACTGGCTGTGATAAACGATCAGTTTGGCGCACCAACAGGTGCTGAATTGC TGGCTGATTGCACCGCTCATGCCATTCGCGTGGCATTAAAAAAACCAGAAGTCGCTGGCTTGTACCATCTGGTAG CAAGTGGCACAACAACCTGGCACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGGATTAATCTTG CACTTAACAAACTTAACGCCGTGCCAACAACGGCCTATCCCACACCAGCCCGTCGACCCCATAACTCTCGCCTCA ATACAGAAAAGTTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTGGGCGTGAAACGTATGCTCAACG AATTATTTACGACTACGGCAATTTAACAAATTTTTGCATCTCGCTCATGATGCCAGAGCGGGATGAATTAAAAGG AATGGTGAAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTCTGGCTGGTGGTTCCGGCACTCGTCTTTATCCTGTGACGATG GCAGTGAGTAAACAATTGCTGCCGATTTATGATAAGCCGATGATTTATTATCCGCTTTCAACGCTTATGTTAGCG GGTATTCGCGATATTCTTATTATTAGTACGCCACAGGATACACCGCGTTTCCAACAATTATTGGGGGACGGGAGC CAGTGGGGTCTTAATCTACAGTATAAAGTACAACCGAGTCCGGATGGCCTGGCGCAAGCGTTTATTATTGGCGAA GACTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCACTCGTACTTGGCGATAATATCTTCTATGGACACGACTTGCCGAAATTG ATGGAAGCTGCTGTTAACAAAGAAAGCGGTGCAACGGTATTTGCTTATCACGTTAATGATCCTGAACGCTATGGT GTCGTGGAGTTTGATAATAACGGTACGGCAATTAGCCTGGAAGAAAAACCGCTGGAGCCAAAAAGCAACTATGCG GTTACTGGGCTTTATTTCTATGACAATGACGTTGTGGAAATGGCTAAAAACCTTAAGCCTTCTGCCCGTGGCGAA CTGGAAATTACCGATATTAACCGTATTTATATGGAACAAGGACGTTTGTCTGTAGCCATGATGGGGCGTGGCTAT GCATGGTTGGATACAGGGACGCATCAAAGCCTTATTGAAGCAAGTAACTTCATTGCAACAATTGAAGAGCGTCAG GGATTAAAGGTATCTTGCCCGGAAGAGATTGCTTACCGTAAAGGGTTTATTGATGCCGAGCAGGTGAAAGTATTA GCCGAACCGCTTATCAAGAATCAATATGGTCAATATTTGCTGAAAATGATCAGCGAATAGTATATGGGAACTCAA TGATGGATATTAAATTAATCTCTTTGCAAAAACATGGGGATGAGCGCGGTGCATTAATTGCTCTTGAAGAGCAAC GAAATATACCTTTCGAAGTCAAAAGAATATATTACATACTTGAGACTCTTAATGGAGTAAGACGCGGATTTCATG CGCACAAGGTTACTCGTCAGTTAGCTATTGTAGTCAAGGGAGCTTGTAAATTTCATCTGGATAATGGTAAAGAAA CAAAGCAGGTGGAACTTAATGATCCAACAATTGCGTTGCTGATAGAACCCTATATATGGCATGAAATGTATGATT TTAGTGATGATTGTGTGCTGCTTGTAATTGCGGATGATTTCTATAAAGAGTCTGATTATATCCGCAATTATGATG ATTTTATTAGAAGAGTAAATTCAATTGAGAATTCATAAGCTAAGTGACGTCCAGACAACATCAATTGGTGATGGA ACAACTATCTGGCAGTTTGTTGTGATACTAAAAGGTGCTGTAATTGGTAATAATTGCAACATCTGTGCAAATACC TTAATTGAAAATAACGTTGTAATTGGTAACAATGTCACAGTCAAAAGCGGTGTGTATATTTGGGATGGCGTTAAA ATAGAGGATAATGTTTTTATTGGTCCTTGTGTAGCATTTACAAATGATAAGTATCCTCGCTCTAAAGTCTATCCT GATGAATTTTTGCAAACAATAATACGCAAAGGAGCATCAATAGGTGCTAACGCAACCATCCTGCCAGGAATTGAA ATTGGTGAAAAAGCAATCGTTGGTGCGGGGAGTGTTGTAACCAAAAATGTACCGCCATGCGCAATAGTAGTAGGT AATCCAGCTCGATTTATTAAATGGGTAGAGGATAATGAATAAAATTGATTTTTTAGATCTTTTTGCAATTAACCA GCGACAGCACAAAGAATTAGTCTCTGCGTTTAGTAGGGTGCTAGATTCTGGTTGGTATATCATGGGCGAAGAACT TGAGCAGTTCGAGAAAGAGTTCGCAGAATACTGTGGAGTTAAGTATTGCATTGGTGTAGCAAATGGCCTTGATGC GTTGATACTAGTATTGAGGGCATGGAAAGAACTTGGCTATCTTGAAGACGGTGACGAGGTATTAGTACCGGCAAA TACATATATTGCTTCTATTCTTGCTATAACAGAGAACAAACTTGTTCCTGTTCTTGTTGAACCAGATATAGAAAC TTATAATATTAATCCTGCTTTAATTGAAAATTACATTACGGAAAAAACTAAAGCAATATTACCGGTTCACTTATA TGGTCTATTGTGCAATATGCCAGAAATTAGTGCAATCGCCAGAAAATATAATCTGTTGATTCTTGAAGATTGTGC ACAAGCACATGGTGCAATACGTGATGGTCGCAAAGCTGGAGCTTGGGGGGATGCTGCAGGATTTAGTTTTTATCC AGGAAAAAACCTTGGAGCTTTGGGGGATGCGGGAGCTGTTACTACAAATAATGCAGAATTATCCTCAACTATAAA

- 66 046206

AGCTTTGCGAAATTATGGGTCACATAAGAAATATGAAAATATTTATCAGGGATTGAATAGTCGATTGGATGAACT GCAAGCAGCCTTATTGCGTGTAAAAATCCATACATTACCGGAAGATACTGCGATTCGGCAAAGGATTGCTGAAAA ATATATTCGTGAAATAAAAAACCCTGCGATTACGTTACCAGTGTACGAAGGCCAAGGTGCGCATGTTTGGCATTT ATTTGTAGTAAGAATCGCTAATCGTGAAAAATTCCAGTCATACTTATTAGAGAAGGGTATCAAAACCTTAATTCA CTATCCATTACCACCCCATAAGCAGCAAGCATATCAAAATATGTCTAGCCTTAGCCTTCCAATTACTGAGCAAAT T CAT GAT GAAGT CAT T T CT T TAC CTATAAGT С C GGTAAT GAGT GAAGAT GAT GT CAAT TAT GTAAT CAAAAT GGT CAATGATTACAAGTAATGAAAAAATTTCTTCAGGTAACTATATTATCCGCTATCTATACATTCATTAAAATGATT GCGGGTTTTATCATCGGTAAGGTAGTAGCAATTTATACAGGGCCATCAGGGGTAGCAATGCTTGGCCAAGTGCAA AGTTTAATCACAATAGTTGCAGGTACTACCTCTGCACCTGTAAGCACAGGCCTTGTTCGATATACTGCGGAAAAT TGGCAAGAAGGACAAGAAGCATGCGCGCCATGGTGGCGCGCATGCTTAAGGGTTACTCTGTTTTTATTCTTGCTT ATTATTCCCGTTGTTATTATATTGTCGAAAAATATTAGTGAGTTACTTTTTAGCGATGGACAATACACATGGTTA ATCATTTTCGCATGTTGTATATTGCCATTCTCCATTATAAATACATTGATCGCTTCAGTTTTAAATGGTCAACAA TTTTATAAGCAATATATATTGGTTGGGATGTTTTCTGTATTCATTTCTACTATGTTTATGATTTTGTTGATTGTA GCTTATAATCTTAAAGGTGCATTGATTGCCACAGCTATAAATAGTGCTATTGCTGGTCTTGTATTGGTTTTATTT TGTCTCAATAAATCTTGGTTTAGATTTAAATATTGGTGGGGTAAAACGGATAAAGACAAAATTATAAAAATTATT CATTATACTCTGATGGCTCTGGTTTCTGTTATCTCCATGCCTACAGCATTGATGTGTATTAGAAAAATATTGATT GCTAAAACTGGTTGGGAGGATGCAGGGCAATGGCAGGCCGTATGGAAGATATCTGAGGTTTATCTTGGTGTTGTG AC AAT TGCTTTGT CAACATAT T T С T TAC CAAGAT T GACAAT TATAAAAACAAGT T T С С T TATAAAAAAAGAAGTA AATAGTACTATATTATACATAATATCTATTACTTCATTCATGGCGTTGAGTATCTATTTATTCCGCGATTTGGTA ATAACAGTTTTATTTACTGAACAGTTTCGCTCAGCTCGTGAATTATTTTTATTACAACTTATAGGGGATGTAATA AAAATTGCTGGGTTTCTTTATGCATACCCTCTTCAAAGTCAGGGGCATACTAAACTATTCATCAGTTCAGAAGTG ATTTTTTCTATGCTCTTTATCATTACCACCTATATTTTTGTTGTAAATTATGGAGTACATGGTGCTAACATAAGT TAT GT CAT T ACAT AT AGT T TAT AT TTTGTGTT T GCAT T T GT GT T TACT AAT T T TAT T AAT GT T AGAAGAAAT AAT TAAAAACAGAGGTTGAATTTTGAAAATAATTATACCTGTCTTAGGATTTGGCAGGGCTGGTGGTGAAAGAGTTCT TTCTAAGCTGGCAACTGAATTGATGAATTATGGACATGATGTAAGTTTTGTTGTTCCAGATAATAGAACTAATCC ATATTATGCTACCACAGCAAAAATTGTCACGAGTAAATCTAGTCAAAACCGTGTAAAAATATTGAGAATCATTAA AAATTACTATAATCTGTGGCGTAAATGCATAGAGTTAAATCCTGATGCTGTAGTTGCTAGTTTTCATTTGACTGC CTATCTTGTCGCATTATTACCAATCACCCGTCGTAAGAAATATTATTATATTCAGGCGTATGAAGTTAATTTTTT TGATAATATAATATGGAAATTAATAGCGGGTTTAACATATTATTTACCGCTTAAAAAAATACTAAATAGTCCTAA TTTGCTTCCTCATAAACATGATGATTTTATAGGAGTAGTTCCTGCAGGAGTAGATTTAAACGTTTTCTATCCGAA ACCATCAAATAGGTTATTAAATGGTCACACATCAATAGGGATTATTGGTAGAAAAGAGAAGCACAAAGGAACTAG CGAAATTATTTCAGTATTGTGTTCACTGGAAAATAAAGCTGGAATTATAATCAATATTGCGATCTATCTTGAAGA AGTTGATAAGCAGCGTTTAATCGCTGCCGGGTTTCAGGTTAATTTTTTTCCGATTACTTCTGATTTAGAATTGGC ATCCTTTTATCGAAGCAATGACATCATGATTGCTGTTGGGTTAATTGAAGATGGCGCTTTCCATTATCCTTGTGC TGAATCAATGGCTTGTGGTTGTCTTGTTATTTCAAATTATGCGCCACTTACTGAAACTAACAGTGTACTTAAATT AGTCAAGTTTGATGCTTGCAAACTTGGTGAAGCAATTAATCTTTGTCTCAATCTTGACCTAGAAGAAAAAAGCAA AGAAATCCAATCTAATATTTCTGTGTTGAATAAATATGACTGGAAAATTGTTGGTGAAACTTTCAATAGTTTATT GTTAGATGCAAATAAATAGTATACGTTGATGGGGAAAATATGAATATTGTTAAAACTGATATTCCAGATCTGATC GTTCTTGAACCAAAAGTGTTTAGTGATGAACGCGGCTTTTTTATGGAGAGTTATAATCAGATTGAATTTGAGAAG GCAATAGGAAGGCACGTAAATTTTGTTCAGGATAATCATTCAAAATCTAGTAAAGGCGTACTACGTGGGTTGCAT

- 67 046206

TATCAATTAGCACCGTATGCACAGGCTAAATTAGTTCGATGTGTTGTAGGTCAGGTATTTGATGTTGCTGTTGAT CTTAGAAAAAATTCACCAACGTTCAAAAAATGGTTTGGAATAACCCTTTCCGCAGAAAATAAACGACAATTATGG ATACCCGAAGGATTTGCTCATGGTTTCTTGGTGACCAGTGATGAAGCTGAGTTCATTTATAAGACAACTAACTAC TATGCTCCTGGTCATCAGCAAGCAATTATTTACAATGATCCTATTTTAAACATCGATTGGCCTTTCTGCAGTAGT GCTCTGTCATTATCACAAAAAGATCAAGAAGCAAAATTATTTTCAGAATTATTGGACAGTGAACTGTTCTAATAA AGTGTGCCACCTTATCCGTCTGAAGGATAGGTGGTTGCTTATATTTTTTTGAGTATGTTTGTATAATGACAGAAA ATAGTCCGAAATATAAACACGATAAAAGCTTAATAAGTTTTATCTACTTATTTTTTATATTTACACTTATTGTAG GCTTTATTATCGCAAATACCCAGTTTTTGGGGCGAAGTAGAGACTATGATAATTATATACAGATCTTTTCTGGTA AAGAAGGGGAGGGGGTTCTTGAATTATTTTATCGCGGATTGATGTTAATAACGACCAGCTATGAAACTATCATTT TTATAATTTTAACATGTTCTTTTTTTATAAAGGCAAGGTTTCTCGCTAACTATTCGCGTAATTTTTCAGGCTTGA CCTTATTCTTTATTTATTATGCAAGCGTTGCACTTTGGGTTTTAGATTATACTCAATTCAGAAATGGTCTATGTA TTTCCATTTTAATGTTTTCCGTATACTATTTATTTATAAATAAACCGACTTATTTTTATTTCTCGGTATTATGTG CAATTGCAACTCATTGGTCTGCTTTGCCTTTTTTGCTTTTATATCCTTTTGTCTATTCAACAAAAATAAGACGCC TTGGTTATTTTTGTTTCAGTATTCTTGTTTTGATTGCGATCTCAGGAGAAGGAAAAGAGATCATATCTTTTATAA GAAATTTTGGAGTGGGACAAAAAATAGGAAATGAAGCTGGTGTAAATTTAATAAATTCATTATCCCTTACCGCTA TTTCCTGGTTTATTATTAGTTACATATCAAGCATTGGAAATGAAAGGAGAAATTTAAGGCTTTTCTTTTGTTATG GTGTCATGCAATACGTGACTTTTAGCCTTTTCTCTCTACCTGTTATGGCTTTCCGTATTTTGGAAATGTATTTTT TCCTTATGCTAACCATTGGGGTGTTTATTAAGCAAAAAAAGAATTATTATTTTATTTTTTGCAAAGTGTTAATTT TATTGTATCTAACATACTATTATCATATGGTCTTTGGAGTGATTAATGTGTAAGGCTAAGGTGTTGGCTATAATT GTTACTTACAACCCGGAAATTATTCGATTGACGGAATGTATTAACTCTTTAGCCCCACAAGTTGAGAGAATAATT CTTGTAGATAATGGCTCAAATAATAGTGATTTGATAAAAAATATCAGTATTAATAACCTTGAAATTATTTTACTT TCGGAAAACAAAGGCATTGCATTTGCTCAGAACCATGGTGTTAAGAAGGGCCTGGAAGCAAAAGAGTTTGACTAT TTATTTTTCTCAGATCAGGATACTTGCTTTCCTAGCGATGTTATTGAAAAACTTAAGAGTACATTTACGAAAAAT AATAAAAAAGGTAAAAATGTTGCTTGTGCTTCTCCTTTTTTTAAAGACCATCGTTCAAATTATATGCATCCGTCA GTCAGCCTAAATATTTTTACGAGTACAAAAGTTATATGTAGTGAAGTAGACGATGATCTTTATCCCTCGCATGTT ATTGCTTCTGGGATGTTAATGTCTCGTGAAGCATGGCGCGTCGTCGGACCATTTTGTGAAAAACTCTTTATAGAC TGGGTTGATACAGAATGGTGTTGGCGTGCATTAGCTAATAATATGATTATTGTTCAGACACCATCAGTCATCATT TCTCATGAACTTGGGTATGGGCAGAAAATTTTTGCTGGTCGATCTGTTACAATACATAATTCTTTCAGAAATTTT TATAAAATACGCAATGCAATATACTTAATGCTGCATTCAAATTATAGCTTCAAGTATCGTTATCATGCTTTTTTT CAT GC GACAAAGAAT GT T GTAT T T GAAAT T T TATAT T C GAAAGAAAAAT TAAAT T CACT GAAGGT T T GT T T TAAA GCTGTACGTGATGGTATGTTCAATAATTTTTAATACGAAAATAGTTAGGCTCAAGGTGTTTAAATGGAAGAAAAT AATATGAAGACGGTCGCTGTAGTTGGCACAGTGGGTGTTCCTGCTTGTTATGGTGGGTTCGAATCACTTGTTCAG AATCTAATTGATTATCAATCTGATGGTATACAATATCAGATATTTTGCTCTTCAAAAAAATATGATAAAAAATTT AAAAATTATAAAAATGCAGAATTAATCTATTTGCCGATAAATGCCAATGGCGTCTCTAGCATAATTTATGATATT ATGTGTTTAATTATTTGTTTATTCAAAAGGCCAGATGTTGTTTTAATATTGGGGGTGTCTGGTTGTTTATTTCTA CCAATTTATAAACTATTTTCAAAATCAAAGATTATTGTCAATATTGATGGGCTTGAATGGCGTAGAAATAAATGG GGAACGTTTGCTAAGAAATTTCTTAAAATATCTGAGGCGATATCTATTAGAATAGCTGATATTATCATTTCAGAT AAT CAAGCAATAGCT GATTAT GT GGAAAATAAGTACAAGAAAAAAAGT GTAGTTATAGCTTAT GGCGGAGAT CAT GCCACTAATCTTAGTACACCGATAGACAATGATCAAAAAAAAGAAGGTTATTATTTGGGGCTTTGTAGGATAGAG CCTGAGAATAATATAGAAATGATTCTGAATGCCTTCATTAATACAGATAAAAAAATTAAATTTATGGGTAATTGG

- 68 046206

GATAACAGCGAGTATGGACGCCAGCTAAAAAAATATTATTCAAACTATCCAAATATCACCCTACTAGAACCTAAC TATAATATTGAAGAGCTTTATAAACTAAGAAAAAATTGTCTTGCATACATTCATGGACACTCGGCTGGTGGAACA AACCCTTCTTTAGTTGAAGCGATGCATTTTAATATTCCTATTTTTGCTTTCGATTGTGACTTTAATCGTTACACA ACTAACAATTTAGCTCATTACTTTAATGATTCTGAACAACTTAGCTTATTAGCAGAAAGTTTGTCTTTTGGAAAT CTTAAATGTCGAGTATTAGATTTAAAAAATTATGCTGAAGATATGTATAACTGGAGGCATATAGCTGCTATGTAT GAATCTATTTATTAAACGCATTAACAATAATATAATTGACCTTATATAGCAGGGAAAGATCACGTAACGCTGCGG CGCGCCGATCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTT CGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGATAAAGCCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATACTT TAATAAGTACTTTGTATACTTATTTGCGAACATTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGG AGTATGTAATGTCCAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCG AAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAG GCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTTGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAA TGGTGAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCA TTGATGGTGGTAACACCTTCTTCCAGGACACTATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCA TCGGTACCGGTGTTTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCTGAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAG CCTATGAATTGGTAGCACCGATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATA TTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTG CTGAAGCCTATTCTCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCTCACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGA ATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGACATCACCAAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACT ACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCGGCTAACAAAGGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATC TCGGCGAACCGCTGTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTTTGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTG CCGCATCTAAAGTTCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTC GTGCGCTGTATCTGGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACA ACTGGGATCTGAACTACGGCGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGA AAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCACAGATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCG ATGACTACCAGCAGGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCG CAGCGGTTGCCTATTACGACAGCTACCGTGCTGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATT TTGGTGCGCATACTTATAAGCGTATCGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 13 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb О6Л - штаммпродуцент ОбЛ-ЕРЛ stGVXN4112 и stLMTB 10923)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATTTGCCCGCCGGGCGTGACAATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTGGGCCACTCCATTTTATGTGCACGACCTGCCATTGGTGACAATCCA TTTGTCGTGGTGCTGCCAGACGTTGTGATCGACGACGCCAGCGCCGACCCGCTGCGCTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCGCGCTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCT GTCATCCAGACCAAAGAGCCGCTGGACCGCGAAGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTCATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTTGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTT GAACGCACTCAGCCTGGTGCATGGGGGCGTATTCAGCTGACTGATGCCATTGCCGAACTGGCGAAAAAACAGTCC

- 69 046206

GTTGATGCCATGCTGATGACCGGCGACAGCTACGACTGCGGTAAAAAAATGGGTTATATGCAAGCGTTCGTGAAG TATGGACTACGCAACCTCAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGGATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAGATTAGCGGCGAAAGTAATTTGTTGCGAA TTTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACAATCAGAATAACAACGACTTAGCAATAGGATTTTCGTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCATTTGAATTTTACGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCGTAGACATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCTGAAATTA TAAAGTCATTCTTATAGAACATCGCATTTCAATAATATAATTACACCTAAATGAATAGGATACAACGTGTGCACA ATTATTTAAGGCTTAAAGATAAAATAAAAAACGTATTTTTAGGGTTGTATATATTGCAGTTATTTAATTATATCG CGCCATTGGTAATTATCCCTATCCTGATAAAATATATTGGGTTGGGGGAATATGGGGAATTGGTCTATATTACAT CTATTTATCAAATAGTGGCTTTGATTATTGATTTTGGCTTTACTTACACAGGACCTGTGGTTGCTGCGAGACATA GATGTGAGACCCAAAATTTACAGCGCTATTACTCAATAGTTGTTCTTTTAAAATCATTGCTTTTTATAATTGCAT TAACATGTGTATTTTTATTGTGCAGATTAAATATAGTCCACTTGTCATTTTTTGGGTTTTTGTCAATTTTTCTAT GCACTATTGGTAATATATTATCGCCCAATTGGTTTTTGCAGGGGATTGGTGATTTTAAAAAACTTTCATACTCAC AAGTAATAGTGAGAATAACATTGTTTATCATACTTCTTGTTTATGTCTGTAGTGGCGGAGATAATGTTTTTATCC TAAGTTTTTTGCAAAATGCAACATTACTCATATGCTGTATATACTTATGGCCAAATATTCATATTAGCCATGTTG TTCATCTTAAACCTAATGAATGCATTGTGGAATTTAAGAAGGCAGGAAATGTTTTTATTGGCGTAATAGGTACGA TTGGTTACAATGGTCTAATTCCTGTGTTAATTGGAAACCTTTGCGGTAATACGAGTCTTGGTGTTTTTTCAATCG T T CAAAAAAT GACAACAGCAT GT CAAAGT CTAAT TAAT С CAATAT CACAGTATAT GT TAT CT CAAGT T T CAGAAA TTAAACCTCAAGATAAACTGTTTTATTATAGAATTAAAAAAAGTTTTTTTGTGCATTTAACAATTAGCATAATTG CATGTTTATGTTATATGGGGTTAGGGCAATATGTGGCGACTTTTATAGGTAAAGTTGACGTTTCATTTGTTATTA TTTTATTTGCGTCAATAATTACCATTTTTTCATСTTTAAATAATGTССTTGGTATACAGTTTСTTATACCGACAG ATAATGTAAAAATACTACGAAGTATAAATGTTATGGCGGGAATTATTGTTGTTAGTTTGTCCTGGCTGTTAATAT CACGCTTTGACATTCTGGGGGGGGTTTTATTAAACCTAATTGGTGAGTTTCTTGTATTCAGTATGCTAGCTTTTA TTGCCCATCGAAAGTGGGGAGCGAGAGTATAATGAAAGTGAAGGCGGTTCCTGCTATTACATTCTATTTAAGTTT AATGCTGACAATTTTAGTGTTACTGTTTGGTAATGAACCAAATAAATCACAATATATCCTTGTTATAGCAACGAT AACAGTTTTTTATATCGCATATATCACTAATAAAATAACTTCTCCGGCCAGCCTTCTCGTTATATCATCTTTTGT GTTTTTAGGTTGTCGCCCTTTATTATCTTTGTTTGCAAACTATGATTATAGGATTGCCGATTGGTTTATTGAAGG ATATATGGATGACGATGTGATTTTGGCTAACTATGCTATAACACTAATGTATTATGGTTATACATTGGGACTAAT TCTATGCAAAAATACTGAAAAATTTTATCCGCATGGTCCTTATCCTGAAAAACAATTGCTAAAAATAAAGTTTCT TTTGACTTTATTTTTTCTGGGTTCGATAGGTATGGTTGTAAAAGGGATATTCTTTTTTAACTTTATAGAATCTAA TAGTTATGTTGATATTTATCAATCAAATATAACAACGCCAATAGGTTATGATTTTCTATCTTATTTATTTTATTG TTCTTTTTTCCTTATATGTGCGTTTCATATACAGTTCAGAACAAATAAAAAATTTCTTTTTATTGCGATATGCAT TGCTGCATTTAGCACCTTGAAGGGTAGTCGTAGTGAAGCTATAACGTTTCTTTTAACGGTTACATGTATATATTT TAATGAAGTAAAGACAAGAAACTTACGTCTGCTGATTACAATGATTTTTGTTTTTAGCGTCATTTTTGTGATTAG TGAATTTATCTCAATGTGGCGCACTGGAGGGAGTTTTTTTCAATTAATGCAGGGTAATAATCCTGTTATAAACTT TGTATACGGCATGGGAGTATCATATCTTTCCATTTATCAATCAGTAAAACTACAACTATTGTCAGGGGGATATAA TGTTACCTATCTATTCAGCCAGTTAATAATAACTTGCTCGTCAATATTTAATGTCAAATTGAGCTTGCCGGAAAT AAGCTATAGCCATTTGGCCTCATACACAGCAAACCCAGAACTATATAATCTTGGGTTCGGACTTGGGGGGAGTTA TTTAGCAGAATCGTTTTTAGCATTTGGTCTGATTGGATGTTTCATTATACCCTTTTTACTTTTACTTAATTTAAA T GTAT T GGAAAAATATACAAAAAACAAAC CAAT TATATAT T T T GT T TAT TATAGT GT GT T GC CACCTATAT TAT T

- 70 046206

CACACCAAGAGAGACTTTGTTCTATTTCTTCCCCTATCTTGTCAAAAGTATATTTGTTGCTTTTTTAGTTACATT ATACAT C CAGTATAAAAAGGAT T GAC CAAAAT GT CAGAAAAAAAT GT CAGCATAATAAT С C CAAGT TATAACAGG GCTCATATTCTTAAGGAGGTCATACCAAGTTATTTTCAGGATGAGACTTTAGAGGTTATAGTTATCAATGATGGA TCAACAGATAATACAAATAGTGTATTAGCTGAACTGAAGGAAAAATATTCTCAGTTAGTTATTTTAGAAAATGAA ACGAATAAAAAACAGATGTATTCTAAAAACCGAGGGATTGAAATAGCCAAAGGGAAATATATTTTTTTTGGTGAT GATGACTCTTACCTCTTACCCGGTGTTATATCTCGGTTATTGGCTACAAAATATGAGACAGGCGCTGATGTAATC GGCGCAAGAATACTTTATATGAATAATAACGAGAAAACAATTGAAGATTGCATAAATCGACATAAAAAAGAGGGG CGTTTTGT TAGT GAT CTAAATAGAT T GGAT T T TAGT TATACAT GT GAT T T G GAC CAT С C GAT T GAAT GT T T T TAT GCACAGCCTTTTGTTCTAGCTGAAAGGGAACTAATATCGAAATATCGATTTGATATATCTTATACGGGAAACTGC TATCGTGAGGAAACTGATTTCATGCTATCTCTATTTATTAAAAATAAAAAATTTATATATGATTCAAAGGCTTTG TTAATAAATTTACCTCCAAGAAAAGCGACGGGAGGGGCAAGAACAGCTAATCGATTAAAATATCATTACGAAAGT TGCATAAATAATTATAGATTTTTAAAAAAATATAATGATAATTTGAATCTTCTTTCAGGACAAAAGCATGCTATA TTTTACCGACAGTGTCAATTCGTTCTGCTAAAAATGAAGTCGTTTATCGGGAAGTTTTTAAAATGATTATATATA TCGCCGCGTATAATGGTTCAGGAGGGCAAGGTGGGGTGGAAAGGGTTGTTGCCCAACAATGTAACATTCTTAAAA ATTTGGGGGTTAAAGTCATTATACTTGATAAAACATACTTCAAAATTTCTAACAAAATTCGTAACAAAAAAATAC AAGTAGCACTTTATCCAATATTAGTTTCTCTTTATTTAACCTTACAAAAATTACGTGGCGTGACGTTTAAAGTTA TTGCACATGGCTATTGTTCTCCTTTTTATAGGAATGACATCTTAATAGCTCATGGCAATATGAAATGTTATTTTC AAACAGTCATGAATAAAAAACCTAATCGGTTGTCTGGCAGTGGTCTTTTATCTTTCTATGAGCGTTGGGCTGGAG CATTTTCAAAAAATATCTGGGCTGTTTCAAATAAGGTTAAAAGTGAATGGAATGAGCTTTACAATATTAATTCAC ATAAAAT CAAAGT T GT T C GAAAT T T TATAAAT С T T G CACAAT T T GAT ТАСAC T GAT GT TAAT GAAG CAGAATAT G TGACATTTGTCGGGCGATTGGAAAAAGGAAAAGGAATAGATGATCTGTATTACATATGTAAAAATCTGCCAGATA CTTCCTTCCATTTAGTTTCAAGTATTCCCGCCCCACAAAATTTTGCTTCGCTAAATAATGTTCTGACCAGCATTG CTGTCCCCTATGCGAAAATGCCAGAAATATTTAAGAAATCCAGAGTACTTATTTTACCGTCCTATTATGAAGGAT ATGAGCTGGTTACTATTGAAGCGCTATGCTGTGGTTGCCCTGTGATAGGCTATAATGTTGGTGCAATTAGAGAGT TGTATGCAGAAAGTTTTCCTGGCGTATTTATTGCCAATAATAAAGAAGATTTAGCACAAGTAGCCTACAAATTAA TTAGTCTTGATAATGAAAAATATTATCATTTGAGACAAACTATTTATAGCAAGCGTGAGCTTTTTTCTGAAGAGA GATATGCGGAAATTTTAACGGCGGCATTTAATGAAAAAAAATAAGAAACTCTGTCTCATTTCAATTAACTCATAT AATGAACTTACCGGAGGAGGAGTATATTTACGTACGCTTGTTAGTTTTCTACAAAAACAGAATGTTAATTTAACA CTTATTGATAAAAAATCCTCAGGTAAACTATTCGAAGACAATACTTTTCAACATATATCATTTATTAAAGGTAAA CGTCAGGATATAATATCCAGGCTTTTTTTTATACCATCATTTTATGTCCCTTATATTTTCTCAATAATTAAAATT TTACGGAAGCAAGATATTCTTGCTTTTCACAACTCTCGGCTTGGATTGTTATGTCTGCTTTTTAGAATACTCATG С С С CACAAAAAGAT CATAT TGTTTACG GATAAC T T C GAATAT GAC T TAATAAGACAAAAAGATAAAAACATAAC T ACTTTTATTGAAAAATTAATTGTTTATCTCAATGAATTTATCGGGCTTAAGAATTCAGATTTAGTTAGCTATATT ACCCGGCAAGATAAAAATGCAATGGATAAATTTTATGGGATTAAAAAAAGCAGAAATTTAATTCTCCCTGTGATA TTTAGTAGAGAAAAACCAACTGATGTATTGTCAGCTCACTTTATTAATGAGTATAATCGATTGAATAATGATAAT AGGAAAAAAGTAGTATTTACTGCATCTTTTGATTTTTTTCCAAATATAGATGCTGCCAACTATGTTTTAAATGCA GCAAAGTCTAATAATGATTATTGCTATATTTTGGCAGGTAGGAAAAGTACTACTTTGAATCTTCCTGATTTGGAT AATTTATTTTTTTTCGATAATCTATCTAATAGTGAAATGTCATATTTATTATCTGCTTGTGATGTTTTTTATTCT CCTATAGTTTTAGGAAGTGGAATGAAAACAAAAATTGCAGAAGCACTATCATATGGATTATATATTTATGCGACA GAGCATTCCTTAATCGGCTATGATGAAATTATACACAATAAGGAGTGTGTTAAAAAAATCTCACATTTGGATGAG

- 71 046206

GAATTTCCTAAAGATTTCAAGATGAAAAGTATCAATAAACAGCTAATAATGTCTTATCAGCAAAAATATTATTCA CATTATCGGTTTAATGGCCATGAACTTGATATAATAAATTTTGACGATTAGTTAGTGGAGATATAATATGAACAT ATTAGTAACTGGTGGTGCTGGATATATCGGATCTCATACGGCTATTGAATTACTGAATGCAGGTCATGAGATTAT CGTTCTGGACAATTTCAGTAATGCTTCATACAAGTGTATCGAAAAAATAAAAGAAATTACTCGACGTGATTTTAT AACAATTACTGGAGATGCTGGGTGTAGGAAGACACTCTCCGCTATTTTCGAGAAACACGCCATAGATATAGTTAT TCATTTTGCTGGCTTTAAATCTGTTTCAGAGTCTAAAAGTGAACCCTTAAAGTATTACCAGAATAATGTTGGAGT GACCATTACTTTATTACAGGTAATGGAAGAGTACAGAATTAAAAAATTTATCTTTAGTTCATCTGCGACAGTCTA TGGTGAACCAGAGATAATTCCAATTCCAGAAACAGCTAAAATTGGAGGAACTACGAATCCATATGGCACATCGAA GTATTTTGTTGAAAAAATTCTAGAGGATGTTAGTTCCACGGGAAAACTGGATATAATTTGCTTGAGATATTTTAA TCCTGTCGGTGCTCATTCTAGTGGTAAAATAGGTGAGGCTCCATCTGGTATCCCTAATAATCTTGTTCCTTATTT ATTGGATGTTGCGAGTGGTAAACGTGATAAATTATTTATTTATGGCAATGATTACCCTACTAATGATGGAACAGG TGTAAGGGATTTTATTCATGTTGTTGACTTAGCGAAAGGTCATTTGGCTGCAATGAATTATTTAAGTATCAATTC GGGATATAATATCTTTAATCTTGGTACAGGAAAAGGTTATTCGGTACTTGAATTAATCACTACATTTGAAAAATT AACAAACATTAAGGTCAATAAATCTTTTATAGAGAGAAGGGCAGGGGATGTTGCGTCTTGTTGGGCTGATGCAGA TAAAGCTAATTCTTTATTGGACTGGCAAGCCGAACAAACTCTAGAACAGATGTTATTGGACTCGTGGCGTTGGAA AAAAAATTAT СCAGACGGATT СT GAATATAAAAGGTTTCAGTTTTAT GAAT СAAT CAGAGCAGAGAAAAAAAATA CTGGTTCTTACACCTCGCTTTCCCTACCCTGTCATTGGAGGGGATAGATTAAGAGTCTATATGTTATGTAAAGAA CTTTCCAAAAAATATGATCTTATTCTTCTGAGCTTATGTGATCAACCACTAGAACTTGAAATAAATATAAATGAC TCGGTCTTCAAAGAAATTCATCGTGTCTATCTACCAAAATATAAATCATATTATAATGTATTAAAAGCTTTGGTT ACGCAAAAACCGTTGCAAATTGCTTATTATCAATCGGACACATTTAAGAATAAATACAATAAATTAATTAAACAA TGCGATGCAGTATTTTGTCATCTGATAAGAGTTGCTGATTATGTTAAGGATACAGACAAGTTCAAAATTCTTGAT ATGACAGATGCAATATCTTTGAATTACAGTCGCGTTAAAAAATTAGCAAGTAAAAAAAGTTTGCGTGCAATTATT TATTCTCTGGAACAAAAAAGATTAGAATCATATGAACGTTCTGTGGCGAATCTTTTTGATTTGACCACTTTTATT TCATCCGTAGACCGTGACTATCTCTACCCTAATCTGGGCAGTAATATCCATATAGTCAATAATGGGGTTGATACA TCAGCCTTGAGATATATAAAAAGAGAAATAAAAATCGATAAGCCTGTGGAACTTATATTTATCGGAAATATGTAT TCTTTACAAAATATGGATGCTGCAAAACATTTTGCTAAGAATATTTTACCTTGCTTGTATGATGAGTTTAATATT ATTTTTAAAGTGATTGGTAAGATCTCAGAAACTAATAAAAATATATTAAATTCATTTAAAAATACAATTGCTTTA GGTACTGTTGATGATATCAATTCTTCCGCTTCTACAGGGCATATAGGTATATGTCCTGTTCGTCTTGGAGCAGGC GTACAAAATAAAATTCTTGAATACATGGCTTTAGGTTTACCATGTATTACATCTAGCATTGGTTATGAAGGTATT AATGCAAAATCAGGTAGCGAAATTTTTGTTGCAGATACAGTAGAGCAATATAAAAACGTACTAAGAGAAATAATT TACGATTATAATCGTTATACTGAAGTGGCTGAAAATGCCCGTAGTTTTGTAGAAAATAATTTTTCTTGGGAATCA AAAGT TGC CΑΑΤ Τ TAAT GAATACAT TAGAT GAGAAAT TATAT GAACΑΑΤΑΑΤAAAAT TAT ТАСAC C TAT CAT TAT GGCTGGTGGTTCAGGCAGTCGGTTGTGGCCACTATCAAGAATTCTCTATCCGAAACAATTTCTTAGCCTAATCGG TAGTCATACCATGCTTCAAACAACGGCTAATCGTCTGGATGGTTTGGATTGTACCAACCCTTATGTCATTTGTAA TGAACAATACCGCTTTATAGTTGCTGAACAGCTTAGAAAAATCGATAGATTGACTTCAAAGAATATCATCCTTGA GCCTGTTGGGCGTAACACTGCCCCTGCAATTGCATTAGCGGCGTTGCTGATGTCTAAGTCTGATAAAAGTGCAGA TGATCTTATGCTCGTACTGGCTGCAGATCACGTTATACACGATGAAGAAAAATTTTGTAACGCTGTTAGATCGGC AATTCCATACGCTGCTGATGGGAAATTGGTAACATTTGGTATAATTCCAGACAAAGCAGAAACTGGTTATGGTTA TATACATCGAGGACAATATATTAATCAGGAAGATTCGGATGCATTTATAGTGTCATCATTTGTTGAAAAGCCAAA TCATGAGACAGCCACTAAATATCTTGCTTCCGGTGAGTATTATTGGAATAGCGGTATGTTTTTGTTTAGTGCAAA

- 72 046206

TCGTTATATAGAGGAACTTAAACAATTTCGGCCTGATATTTTATCCGCTTGTGAAAAAGCAATTGCTTCAGCGAA CTTTGACCTTGATTTTGTGCGTTTAGATGAAAGTTCTTTCTCTAAGTGCCCTGAAGAATCAATTGATTACGCTGT AATGGAAAAAACAAAAGACGCAATTGTTATTCCAATGGATGCTGGCTGGAGTGATGTCGGTTCATGGTCTTCTCT TTGGGAAATTAATGATAAAGACTCAGACGGCAACGTAATAGTTGGGGATATTTTCTCTCATGAAACAAAGAATTC TTTCATATATGCCGAATCGGGAATTGTTGCTACAGTTGGAGTGGAAAATTTAGTTGTTGTCCAAACAAAGGATGC T GT T CT T GT CT CAGAGAGAAATAAAGT T CAGGAT GTAAAGAAAATAGTAGAACAAAT TAAAAAT T CAGGT C GTAG CGAGCATTATGTTCATCGCGAAGTATATCGTCCTTGGGGTAAATATGATTCCATTGACACAGGGGAGCGTTATCA GGTCAAACGTATAACAGTAAATCCTGGTGAAGGACTTTCTTTACAAATGCACCATCATAGGGCAGAACATTGGAT CATAGTTTCTGGAACTGCAAGGGTGACTATAGGTTCTGAAACTAAGATTCTTAGCGAAAATGAATCTGTTTACAT ACCTCTTGGTGTAATACACTGCTTGGAAAATCCAGGGAAAATTCCTCTTGATTTAATTGAAGTTCGTTCTGGATC T TAT T TAGAAGAAGAC GAT GT TAT С C GT T T T CAGGAC C GATAT GGT C GTAG CTAAAT T T T T GATAAT GTAAC GTT AGTAGAAGAGCGCTAATATTTTTAGTTAATCTGTAATAAGTATTATTTGTTTAAGGTATATCATGTCGAGTTTAC CCTGCTTTAAAGCCTATGATATTCGCGGGAAATTAGGCGAAGAACTGAATGAAGATATTGCCTGGCGCATTGGTC GCGCTTATGGCGAATTTCTCAAACCGAAAACCATTGTGTTAGGCGGTGACGTCCGACTCACCAGCGAAACCTTAA AACTGGCGCTGGCGAAGGGGTTACAGGATGCGGGCGTCGATGTGCTGGATATTGGCATGTCCGGCACCGAAGAGA TCTATTTCGCCACGTTCCATCTCGGCGTGGATGGCGGCATCGAAGTTACCGCCAGCCATAACCCGATGGATTACA ACGGCATGAAACTGGTGCGCGAAGGGGCTCGCCCGATCAGCGGTGATACCGGACTGCGCGACATCCAGCGTCTGG CAGAAGCCAACGACTTTCCTCCCGTTGATGAAACCAAACGCGGTCGCTATCAGCAAATCAATCTGCGTGACGCTT ACGTTGATCACCTGTTCGGTTATATCAACGTCAAAAACCTCACGCCGCTCAAGCTGGTGATTAACTCCGGGAACG GCGCGGCGGGTCCGGTGGTGGACGCCATTGAAGCCCGCTTTAAAGCCCTCGGCGCACCCGTGGAATTAATCAAAG TGCACAACACGCCGGACGGCAATTTCCCCAACGGTATTCCTAACCCGCTACTGCCGGAATGTCGCGACGACACCC GCAATGCGGTCATCAAACACGGCGCGGATATGGGCATTGCCTTTGATGGCGATTTTGACCGCTGTTTCCTGTTTG ACGAAAAAGGGCAGTTTATTGAGGGCTACTACATTGTCGGCCTGCTGGCAGAAGCGTTCCTCGAAAAAAATCCCG GCGCGAAGATCATCCACGATCCACGTCTCTCCTGGAACACCGTTGATGTGGTGACTGCCGCAGGCGGCACCCCGG TAATGTCGAAAACCGGACACGCCTTTATTAAAGAACGTATGCGCAAGGAAGACGCTATCTACGGTGGCGAAATGA GCGCCCACCATTACTTCCGTGATTTCGCTTACTGCGACAGCGGCATGATCCCGTGGCTGCTGGTCGCCGAACTGG TGTGCCTGAAAGGAAAAACGCTGGGCGAACTGGTGCGCGACCGGATGGCAGCGTTTCCGGCAAGCGGTGAGATCA ACAGCAAACTGGCACACCCCGTTGAGGCGATTAACCGCGTGGAACAGCACTTTAGCCGCGAGGCGCTGGCGGTGG ATCGCACCGATGGCATCAGCATGACCTTTGCCGACTGGCGCTTTAACCTGCGCTCCTCTAACACCGAACCGGTGG TGCGGTTGAATGTGGAATCGCGCGGCGATGTACCGCTGATGGAAGAAAAGACAAAACTTATCCTTGAGTTACTGA ACAAGTAATTCAGTAATTTCATATAAATGGGTTTTAAAAAACGGAAAAGATGAGATATCCGGTGTGGTATATCCA AGGTAATGCTATTCAGTATCTCTATGAGTGAGTTAACATCTATACCACATTTAAGCCGCACACTTCGGGATCCCC ATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACT AAGGAGGATATTCATATGGATAAAGCCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATACTTTAATAAGTACTTT GTATACTTATTTGCGAACATTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATGTC CAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTA TACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGT TCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTTGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCAGG TGCAGGCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGTAA CACCTTCTTCCAGGACACTATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACCGGTGT

- 73 046206

TTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCTGAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTGGT AGCACCGATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGG CGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTATTC TCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCTCACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACT GAGCAGTTACCTGATCGACATCACCAAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGATGT GATCCTGGATGAAGCGGCTAACAAAGGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCGCT GTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTTTGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAAGT TCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTATCT GGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAA CTACGGCGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGAAAATCACCGATGC TTATGCCGAAAATCCACAGATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCA GGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCCTA TTACGACAGCTACCGTGCTGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCATAC TTATAAGCGTATCGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 14 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 08 - штаммпродуцент 08-ЕРА stLMTB11734)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGCTAGCGAT CGCTTAAGATCTAGGATTTCATTATGTTACTTCCTGTAATTATGGCTGGTGGTACCGGCAGTCGTCTCTGGCCGA TGTCACGCGAGCTTTATCCGAAACAGTTCCTCCGCCTGTTCGGGCAGAACTCCATGCTGCAGGAAACCATCACCC GACTCTCGGGCCTTGAAATCCATGAACCGATGGTCATCTGTAACGAAGAGCACCGCTTCCTGGTGGCTGAACAGC TACGCCAGCTCAATAAGCTGTCGAATAATATTATTCTTGAGCCGGTCGGGCGCAACACCGCCCCGGCCATCGCCC TGGCAGCCCTTCAGGCCACCCGCGACGGCGACGACCCGCTGATGCTGGTTCTCGCCGCTGACCATATCATCAATA ACCAGTCGGCCTTCCACGACGCCATCCGGGTCGCCGAGCAGTATGCTGATGAAGGTCATCTGGTCACCTTCGGTA TCGTGCCGAATGCCCCGGAAACTGGCTACGGTTACATTCAGCGCGGCGTGGCGCTCACCGATAGTGCCCATTCCG

- 74 046206

CGTACCAGGTGGCCCGCTTTGTGGAGAAGCCGGATCGCGAGCGCGCCGAGGCTTACCTCGCCTCCGGGGAGTACT ACTGGAACAGCGGCATGTTTATGTTCCGCGCCAAGAAATACCTCATCGAGCTGGCCAAATACCGTCCGGATATCC TGGAAGCCTGCCAGGCTGCGGTGAATGCCGCCGATAATGGCAGCGATTTCATCAATATCCCGCATGATATTTTCT GCGAGTGCCCGGATGAGTCCGTGGACTATGCCGTTATGGAGAAAACCGCCGATGCGGTGGTGGTCGGTCTCGATG CTGACTGGAGCGACGTCGGCTCCTGGTCCGCACTATGGGAGGTCAGCCCGAAAGACGAGCAGGGCAATGTCCTCA GCGGTGACGCGTGGGTACACAACAGCGAAAACTGCTACATCAACAGCGACGAGAAGCTAGTGGCGGCCATTGGCG TAGAGAATCTGGTGATTGTCAGCACTAAGGACGCCGTGCTGGTGATGAATCGCGAGCGTTCCCAGGACGTGAAGA AGGCGGTCGAGTTCCTCAAGCAGAACCAGCGCAGCGAGTACAAGCGCCACCGTGAGATTTACCGCCCCTGGGGCC GTTGCGACGTAGTGGTCCAGACCCCGCGCTTCAACGTCAACCGCATCACGGTGAAACCAGGCGGTGCCTTCTCGA TGCAGATGCACCACCATCGCGCCGAGCATTGGGTTATTCTCGCCGGCACCGGTCAGGTGACTGTCAACGGTAAGC AGTTCCTGTTGTCCGAGAACCAGTCCACCTTTATTCCGATTGGCGCCGAGCACTGCCTGGAAAACCCTGGCTGTA TTCCGCTGGAAGTGCTGGAGATCCAGTCGGGGGCGTACCTTGGCGAGGACGACATTATTCGTATTAAAGACCAGT ATGGTCGTTGCTAATTATTTTCGGGACAAGACGCAGAATGACACAGTTAACTTGTTTTAAAGCTTATGACATCCG TGGTGAACTGGGTGAGGAACTGAACGAGGACATCGCCTACCGTATCGGTCGCGCCTACGGCGAATTTCTGAAACC CGGGAAGATAGTGGTGGGGGGCGATGTGCGCCTCACAAGCGAGTCGCTGAAGCTGGCGCTGGCCCGCGGGTTAAT GGACGCCGGTACCGACGTGCTGGACATCGGCCTGAGCGGTACCGAAGAGATTTACTTTGCCACCTTCCACCTTGG GGTAGATGGTGGCATCGAGGTGACCGCGAGCCACAATCCTATGAACTACAACGGCATGAAGCTGGTGCGCGAGAA TGCGAAGCCCATCAGCGGCGACACCGGCCTGCGGGATATCCAGCGCCTGGCGGAGGAAAACCAGTTCCCGCCAGT GGACCCGGCGCGTCGCGGGACCCTGAGCAAGATATCGGTACTGAAGGAGTATGTTGACCATCTGATGAGCTACGT GGACTTCTCGAACTTCACCCGTCCACTGAAGTTGGTGGTGAACTCCGGAAACGGGGCTGCGGGGCACGTGATTGA TGAGGTGGAGAAACGCTTCGCGGCGGCTGGGGTGCCGGTAACCTTTATCAAGGTGCATCACCAGCCGGATGGCCA TTTCCCTAACGGTATCCCGAATCCGCTGCTGCCGGAGTGCCGCCAGGATACCGCCGACGCGGTGCGCGAGCATCA GGCCGACATGGGGATTGCCTTTGACGGCGACTTCGATCGCTGCTTCCTGTTCGATGACGAAGCTTCGTTTATCGA GGGGTATTACATTGTCGGCCTGCTGGCTGAGGCGTTCCTGCAGAAGCAGCCGGGAGCGAAAATCATTCACGACCC GCGCTTGACGTGGAACACGGTAGACATCGTGACCCGCAACGGCGGCCAGCCGGTGATGTCGAAGACGGGGCATGC GTTCATCAAGGAGCGGATGCGTCAGGAAGACGCTATCTACGGCGGGGAGATGAGTGCGCACCATTACTTCCGCGA TTTCGCCTACTGCGATAGCGGGATGATCCCGTGGCTGCTGGTGGCGGAGCTGCTGTGTCTGAAGAACAGCTCGCT GAAATCGCTGGTGGCGGACCGCCAGAAGGCGTTCCCTGCGTCGGGAGAGATCAACCGCAAGCTAAGTAATGCTGC TGAGGCGATCGCCCGCATCCGGGCGCAGTATGAGCCGGCGGCTGCACACATCGACACAACGGACGGGATCAGTAT TGAATACCCTGAATGGCGCTTTAACCTGCGCACGTCTAACACCGAGCCGGTGGTGCGTCTGAACGTTGAGTCCAG AGCTGATGTGGCGCTTATGAATGAAAAAACGACCGAGCTGTTACACCTGTTAAGCGGGGAATAAGGTGAGAGATT TACTAACGACGATTTATCGTTATCGGGGATTTATCTGGAGCAGTGTTAAACGTGATTTTCAGGCACGCTATCAAA CTAGTATGCTGGGCGCACTATGGCTCGTTTTACAACCGCTCTCTATGATTCTGGTCTATACCCTGGTTTTTTCCG AGGTGATGAAGGCAAGAATGCCCGATAATACCGGGTCGTTTGCCTATAGTATTTATCTCTGTTCCGGGGTACTGA CCTGGGGATTATTTACTGAGATGCTGGATAAAGGTCAGAGCGTATTTATTAACAATGCTAATCTGATCAAGAAAC TCAGTTTTCCGAAAATCTGTCTGCCGATCATCGTGACGTTATCGGCGGTGCTAAATTTCGCGATTATTTTCAGTC TGTTTCTAATTTTTATCATTGTCACCGGTAACTTCCCCGGCTGGCTCTTTCTCTCGGTGATACCGGTCCTGCTTT TGCAGATCCTGTTTGCCGGTGGGCTGGGGATGATCCTTGGTGTCATGAACGTCTTTTTCAGGGATGTGGGGCAAC TGGTTGGCGTTGCGCTGCAATTCTGGTTTTGGTTCACACCCATTGTTTATGTACTGAATTCATTACCTGCATGGG CAAAAAATCTGATGATGTATAACCCGATGACTCGGATCATGCAATCTTATCAGTCCATCTTCGCCTATCATCTGG

- 75 046206

CCCCCAACTGGTATTCGCTATGGCCAGTATTGGCTCTCGCCATTATTTTCTGCGTCATCGGTTTCAGGATGTTCC GCAAGCATGCGGCGGATATGGTGGATGAATTATAATGAGTTATATCAGAGTAAATAATGTCGGTAAGGCGTATCG CCAGTATCACTCAAAGACCGGGAGACTGATCGAATGGTTATCCCCTCTGAATACCAAACGCCATAATTTGAAATG GATCCTCCGCGATATTAATTTCGAAGTCGCTCCGGGCGAGGCTGTCGGTATTATCGGTATCAACGGTGCAGGCAA GAGTACCCTGCTTAAACTCATAACCGGGACGTCCAGGCCGACGACTGGAGAAATTGAAATCTCCGGACGTGTCGC TGCATTACTCGAATTGGGGATGGGGTTTCATTCTGATTTCACTGGTCGGCAGAATGTTTATATGTCTGGGCAACT GTTGGGGTTATCGTCAGAGAAAATAACTGAACTGATGCCGCAAATTGAAGAGTTTGCTGAGATTGGGGACTATAT CGATCAACCTGTGCGCGTCTACTCCAGTGGGATGCAAGTTCGATTAGCTTTTAGTGTAGCGACGGCTATCCGTCC TGATGTGCTAATTATCGATGAGGCATTATCTGTTGGGGATGCATATTTCCAGCATAAAAGCTTTGAGCGTATTCG AAAATTTCGTCAGGAAGGGACCACGCTGTTGCTGGTATCCCATGATAAACAAGCGATCCAAAGCATTTGCGACCG GGCCATTTTATTGAATAAAGGCCAAATTGAAATGGAAGGTGAACCTGAAGCAGTGATGGATTATTACAATGCTCT TCTGGCCGATAAACAAAATCAGTCCATTAAACAAGTTGAGCATAATGGTAAAACGCAAACTGTTTCAGGCACTGG TGAGGTGACTATCTCTGAGGTTCATCTTCTCGATGAACAGGGCAATGTGACTGAATTTGTTTCGGTAGGGCATCG TGTCAGCTTGCAGGTCAACGTTGAGGTCAAGGACGATATTCCTGAGCTTGTTGTCGGATATATGATTAAGGATCG ACTTGGGCAGCCGATTTTCGGGACCAATACGTACCATCTCAATCAGACACTCACCTCCCTGAAAAAAGGAGAAAA GCGTTCGTTCTTATTTTCTTTCGATGCGAGATTGGGGGTTGGCTCCTATTCTGTCGCTGTCGCGTTGCATACTTC CAGTACGCACCTCGGCAAAAACTATGAATGGCGCGATCTGGCCGTGGTATTCAACGTCGTTAACACGGAACAACA AGAGTTTGTCGGCGTGTCCTGGTTGCCGCCTGAACTGGAGATTTCTTAATGGGTTCGTCGTTTTATCGTTCATTT GAAGAACGACACAGAGGTTCGGTTGAAGAAATCAAGCGCCGCTTGAGTTTTTATTTACCTTTTCTTGCAGGTCTG AAGGACATTTATCCTGATGGCGTGATTGCGGATATTGGTTGCGGACGTGGCGAATGGTTGGAGATCCTGACTGAA AATGGCATTGCGAACATCGGCGTCGATCTCGATGATGGCATGCTGGCGCGCGCCAGGGAGGCCGGACTGAATGTG CAGAAAATGGATTGTCTGCAGTTTTTGCAAAGTCAGGCGGATCAGAGCCTGATAGCGTTGACCGGTTTTCATATT GCTGAGCATTTGCCGTTTGAGGTCCTGCAGCAACTCGCCATGCATACCCTACGGGTGCTGAAACCAGGTGGTTTG CTGATCCTCGAAACGCCGAACCCGGAGAATGTAAGCGTCGGCACCTGTTCATTTTATATGGATCCAACGCATAAT CATCCTCTGCCACCGCCACTGCTTGAGTTTTTACCTATTCATTATGGTTTTACCCGAGCAATTACCGTTCGTCTG CAGGAAAAAGAGGTTCTTCAATCTCCGGATGCAGCCGTTAATTTGGTCGATGTACTCAAAGGGGTGAGCCCCGAC TACAGCATCATTGCTCAGAAAGCAGCGCCAACAGATATTCTTGAACGCTTTGACACCCTGTTTACCCAGCAGTAC GGTCTGACGCTGGATGCTCTGAGCAACCGTTACGATGCGATTTTGCGCCAACAGTTTTCGTCCGTTGTCTCACGG CTGGAGACGTTGAACCAAACCTATATGCAACAGATAAGCCAAATGTCAGAGACTATTCAGACGTTGCAAGGTGAG GTTGACGATCTGAGTCATGTCATCGATCAGAACCATCAGCTTCATCAGCAAATGGCGGATTTACATAACAGTCGT TCATGGCGTATTACTCAACCACTACGCTGGTTGTCTTTGCAACGTCAATTATTACGTCAGGAAGGGGCTAAAGTG CGAGCCCGTAGGGCTGGGAAAAAAATATTGCGCAAAGGGATGGCGCTCTCGCTGGTCTTTTTCCATCGTTACCCT AAGTCTAAGGTTTATCTGTTTAAGGTTCTGAGAAAAACTGGCTGCTATACATTGCTACAACGTTTGTTCCAACGC GTAAT GCT GGT GCAAT CT GACACGAT GAT GATGCAGT CCAGAAGATAT GAT GT GGGTACT GAAGAAAT GACAAGT CGCGCGATGAGTATTTATAACGAATTAAAAAATAAAAATACGGAGAAATAACGATGCGTATTGTCATAGATTTAC AAGGCGCACAGACGGAAAGCCGCTTTCGTGGCATCGGTCGTTATAGTATCGCAATCGCCAGAGGCATAATCAGAA ATAACAGCCGGCATGAGATTTTCATCGCGCTATCCGCCATGCTGGATGAGTCGATTGCAAATATTAAGGCGCAAT TTGCCGATCTCCTGCCGGCAGAAAATATAGTCGTATGGCATGCCGTAGGCCCTGTTCGTGCGATGGACCAAGGTA ATGAATGGCGTCGGGAGAGCGCAGAACTGATTCGGGAAGCGTTTCTTGAATCATTGTGTCCAGATGTCGTTTTCA TTACGAGTTTGTTTGAAGGTCATGTCGACGATGCGGCTACATCGGTACACAAATTTAGTCGTCAGTATAAAGTAG

- 76 046206

CCGTACTGCACCACGATCTTATCCCCCTCGTGCAGGCGGAAACCTATCTGCAGGACGATGTATACAAACCCTACT ATTTACAGAAAGTTGAGTGGTTAAAAAACGCTGACCTTTTGTTGACTAACTCTGCTTATACCGCACAGGAAGCGA TCGAGCATCTGCATTTACAGGGCGATCATGTGCAGAATATTGCAGCCGCAGTCGATTCTCAGTTTTGTATGGCGG AGGTGGCAGCGAGCGAAAAAGAGACCGTCCTTGGCCATTACGGTATTCAGCGCGAGTTCATGTTGTATGCGCCCG GAGGATTTGACTCAAGGAAAAACTTTAAACGGTTGATTGAGGCCTATGCCGGGCTCAGTGATGCCTTACGTCGCA GTCATCAACTGGTCATCGTCAGTAAGCTTTCCATCGGTGATCGTCAGTATCTGGAATCCCTTGCGTCAGGTAATG GTTTACAGCAGGGCGAACTGGTACTCACTGGTTATGTGCCGGAAGATGAGCTGATCCAGCTCTATCGCCTATGTA AGCTGTTCATCTTTGCTTCACTACATGAAGGTTTTGGGTTGCCGGTTCTGGAAGCAATGTCGTGCGGTGCGCCGG TGATTGGCTCAAATGTCACCAGTATTCCTGAAGTCATCGGTAATCCTGAGGCATTATTCGACCCGTATTCTGTCT CTTCCATGAGGGATAAGATCGCGCAATGTTTGACTGATGATACCTTCCTCGCGCGTCTGAAAGAAATGGCGCAGC AGCAAGCGCGTAATTTCTCTTGGGATAAAGCTGCGGTGACTGCTCTGGAAGCTTTCGAAAAGATCGCGGTAGAAG ACACCGGTACTGCGCAGGTTTTGCCTGAAGCTTTGATTCAGAAGATCCTTGCTATCTCACAAGGGCAGCCAGATG ACCGCGATCTGCGCTTGTGCGCAACGGCCATTGATTACAATCTGAAAACGGCAGAACTTTATCAAATCGACGATA AATCGCTGAACTGGCGTGTGGAAGGCCCATTCGATAGCTCATATAGTCTGGCGTTGGTCAACCGCGAATTTGCCC GGGCACTCTCAGCCGATGGTGTAGAGGTTTTATTGCATTCCACTGAAGGACCAGGTGATTTTGCCCCAGATGCCT CGTTTATGGCACAGTCGGAAAATAGTGATCTTCTGGCATTTTATAATCAATGTCAGACCCGCAAGAGTAACGAAA AGATAGATATTATTAGCAGAAATATCTATCCACCGCGGGTTACCAAAATGGATGCCAAAGTAAAATTCCTTCATT GTTATGCTTGGGAAGAAACGGGCTTTCCGCAACCGTGGATCAATGAATTTAATCGGGAACTTGACGGAGTGCTGT GTACTTCGGAACATGTTCGTAAAATACTGATTGATAACGGACTGAATGTGCCCGCATTTGTTGTTGGCAATGGCT GTGACCATTGGCTCAATATCCCAGCCGAGACGACAAAAGATGTGGATCACGGAACATTCCGTTTCCTGCACGTCT CTTCTTGTTTCCCACGCAAAGGGATACAGGCAATGCTTCAGGCTTGGGGGAAGGCGTTCACTCGTCGTGACAATG TTATCTTAATCATTAAGACTTTTAACAATCCGCACAATGAAATTGACGCATGGCTGGCTCAGGCCCAGGCTCAAT TCATAGACTATCCCAAAGTTGAAGTGATCAAAGAGGATATGTCAGCCACCGAGCTTAAAGGGCTTTATGAAAGCT GTGATGTTTTGGTTGCTCCAGGTTGCGCTGAAGGCTTTGGTTTACCTATTGCTGAAGCAATGCTGAGTGGGCTAC CGGCTATCGTCACCAATTGGAGCGGGCAACTTGATTTTGTTAATTCACAAAATTCATGGCTGGTTGACTATCAGT TCACTCGGGTAAAAACGCACTTTGGTCTGTTTTCCTCAGCCTGGGCCAGTGTGGATATTGACAACTTAACAGATG CATTAAAAGCGGCAGCCTCAACCGATAAATCAGTGCTGCGTGACATGGCCAATGCTGGTCGCGAGCTTCTTCTGC AGCAGTTTACCTGGAAAGCGGTGGCTGATCGTTCTTGCCAGGCGGTCAAGACTCTGCGTGCGCATATTGATATTG CACAGCATCGGGCGCGCATTGGCTGGGTGACGACCTGGAACACGAAATGTGGGATCGCAACCTATTCCCAGCATC TGGTGGAAAGCGCACCTCATGGCGCGGATGTTGTTTTTGCTCCCCAGGTCAGCGCTGGCGATCTTGTGTGTGCAG ACGAAGAGTTTGTACTTCGCAACTGGATTGTAGGTAAAGAGAGCAACTATCTGGAAAACCTCCAGCCACACATTG ATGCTCTGAGACTCGATGTCATTGTGATCCAATTCAACTATGGATTCTTTAATCATCGAGAACTGTCGGCGTTTA TTCGTCGCCAGCATGACGCCGGTCGTTCAGTTGTTATGACGATGCACTCAACTGTGGATCCGCTGGAAAAAGAGC CGAGCTGGAATTTCCGTCTTGCTGAAATGAAAGAGGCGCTGGCACTTTGCGACCGGTTGTTGGTGCATTCGATTG CCGATATGAACCGCCTTAAAGATTTAGGCTTAACTGCGAATGTTGCTTTATTCCCGCACGGTGTTATCAACTACT CCGCAGCGAGCGTCACACGTCAACAGCAGTCTTTACCGCTAATTGCGAGCTATGGCTTCTGCTTACCGCATAAGG GCCTGATGGAACTAGTAGAATCCGTCCATAGACTCAAGCAAGCCGGTAAACCGGTTCGTTTACGACTGGTGAACG CAGAGTATCCTGTTGGGGAGTCACGCGATCTGGTGGCAGAGCTTAAAGCTGCTGCTCAGCGGTTAGGTGTTACCG ATCTGATTGAGATGCATAATGATTTCCTACCTGATGCGGAGAGTCTGCGGTTGCTTTCAGAAGCCGATCTTCTGA TTTTTGCTTATCAGAATACTGGGGAGTCTGCTAGCGGGGCGGTACGTTATGGTATGGCGACTCAAAAACCTGTTG

- 77 046206

CGGTAACGCCCCTGGCGATATTTGATGATTTGGACGATGCCGTCTTTAAATTTGATGGATGCAGCGTCGATGATA TCAGTCAGGGGATTGACCGGATCCTGAATTCCATCCGTGAACAGAACTCTTGGGCAACCAGGACTCAACAACGTG CCGATGCATGGCGGGAACAACATGATTATCAAGCTGTTTCACGCCGTCTGGTTAATATGTGTCAAGGCTTAGCTA AAGCTAAATATTTTAAATAAAAATATCTCTCTTGTATTTTTTGCCTTTGAATACAAGAGGGGTTAGATAATGTGT CATTTATTATGAAAATTATTTTTGCTACTGAGCCAATTAAATACCCATTAACGGGCATCGGTCGGTATTCCCTGG AGCTGGTTAAGCGGCTGGCGGTCGCCCGCGAAATTGAAGAATTAAAGCTATTTCACGGTGCGTCGTTTATAGAAC AGATCCCTTTGGTGGAGAATAAAAGCGATACCAAAGCCAGCAATCATGGTCGTCTGTCGGCGTTTCTACGCCGAC AGACGCTGTTGATTGAGGCTTATCGCTTGCTGCATCCGCGGCGCCAGGCGTGGGCATTGCGCGACTATAAGGATT ATATCTACCATGGCCCCAATTTTTATCTGCCGCATAAACTGGAACGCGCCGTGACCACGTTTCATGACATATCCA TTTTTACCTGCCCGGAATATCATCCAAAAGATCGGGTTCGCTATATGGAGAAGTCCCTGCATGAGAGTCTGGATT CGGCAAAGCTGATCCTGACCGTTTCTGATTTCTCGCGCAGTGAAATTATCCGCTTGTTCAACTATCCGGCGGAGC GGATCGTAACCACCAAGCTAGCCTGCAGCAGTGACTATATCCCACGCAGCCCGGCAGAGTGTCTGCCGGTACTGC AGAAATATCAGCTGGCGTGGCAGGCCTACGCGCTATATATCGGCACTATGGAGCCACGTAAAAATATCCGAGGCC TGCTGCATGCCTATCAGCTGCTACCGATGGAGATCCGCATGCGCTATCCGCTAATCCTTAGCGGCTATCGCGGCT GGGAAGACGATGTGCTGTGGCAGTTAGTCGAGCGCGGTACTCGGGAAGGCTGGATCCGTTACCTCGGATATGTTC CGGATGAAGACCTGCCGTATCTGTACGCAGCGGCCAGAGTCTTTGTTTATCCCTCCTTCTACGAGGGATTCGGTT TACCTATTCTTGAAGCGATGTCTTGCGGTGTGCCGGTAGTATGCTCCAATGTCACCTCTTTGCCTGAGGTTGTTG GCGATGCCGGCCTCGTTGCCGATCCTAATGATATAGACGCGATTAGCGCGCAAATTTTGCAGAGCCTGCAAGATG ATAGCTGGCGGGAAATCGCCACCGCGCGCGGTCTTGCTCAGGCGAAACAGTTTTCGTGGGAGAACTGTGCGACAC AGACCATTAACGCCTATAAATTACTCTAAGGGTGTCAGTTGAGAGTTCTACACGTCTATAAGACTTACTATCCCG ATACCTACGGCGGTATTGAGCAGGTCATTTATCAGCTAAGTCAGGGCTGCGCCCGCCGGGGAATCGCAGCCGATG TTTTCACTTTTAGCCCGGACAAAGATACAGGTCCTGTCGCTTACGAAGATCATCGGGTCATTTATAATAAACAGC TTTTTGAAATTGCCTCCACGCCGTTTTCGCTGAAAGCGTTAAAGCGTTTTAAGCTGATTAAAGATGACTACGATA TCATCAACTACCATTTTCCGTTTCCCTTTATGGATATGCTGCATCTTTCGGCGCGGCCTGACGCCAGGACTGTGG TGACCTATCACTCTGATATAGTGAAACAAAAACGGTTAATGAAGCTGTACCAGCCGCTGCAGGAGCGATTTCTCA GCGGCGTAGATTGCATCGTTGCCTCGTCGCCCAATTACGTGGCTTCCAGCCAGACCCTGAAAAAATATCTGGATA AAACGGTGGTGATCCCGTTTGGTCTGGAGCAGCAGGACGTGCAGCACGATCCGCAGAGGGTCGCGCACTGGCGGG AAACTGTCGGCGATAAGTTCTTTCTCTTCGTCGGCACTTTCCGCTACTACAAAGGGCTGCATATTCTGATGGATG CCGCTGAGCGTAGCCGACTGCCAGTGGTGGTTGTAGGGGGCGGGCCGCTGGAATCGGAAGTGCGGCGTGAAGCGC AGCAGCGCGGGCTGAGCAATGTGATGTTTACCGGCATGCTCAACGACGAAGATAAGTACATTCTCTTCCAGCTCT GCCGGGGCGTGGTATTCCCCTCGCATCTGCGCTCTGAGGCGTTTGGCATTACGTTATTGGAAGGCGCACGCTTTG CAAGGCCGCTGATCTCTTGCGAGATCGGTACAGGTACCTCTTTCATTAACCAGGACAAAGTGAGTGGTTGCGTGA TTCCGCCGAATGATAGCCAGGCGCTGGTGGAGGCGATGAATGAGCTCTGGAATAACGAGGAAACCTCCAACCGCT ATGGCGAAAACTCGCGTCGTCGTTTTGAAGAGATGTTTACTGCCGACCATATGATTGACGCCTATGTCAATCTCT ACACTACATTGCTGGAAAGCAAATCCTGAGCGGCCGCGAGCTCGTCGACTCGAGGATCCGTGTAGGCTGGAGCTG CTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGATAAAG CCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATACTTTAATAAGTACTTTGTATACTTATTTGCGAACATTCCAG GCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATGTCCAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGGT ATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCC CGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTT

- 78 046206

GTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGAT TCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGTAACACCTTCTTCCAGGACACTATTCGT CGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACCGGTGTTTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCTG AAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTGGTAGCACCGATCCTGACCAAAATCGCC GCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTT CACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTATTCTCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCTC ACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGACATCACC AAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCGGCTAACAAA GGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCGCTGTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTTT GCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAAGTTCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCCA GCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTATCTGGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCAG GGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAACTACGGCGAAATCGCGAAGATTTTC CGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGAAAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCACAGATCGCT AACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCAGGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTAT GCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCCTATTACGACAGCTACCGTGCTGCTGTT CTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCATACTTATAAGCGTATTGATAAAGAAGGT GTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 15 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 015 - штаммпродуцент 015-ЕРА stLMTB11738)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGCTAGCATG AGCAAAACTAAACTAAATGTTCTTTACCTTGCAATAAGTCAGGGTGCCAATTACCTACTGCCATTATTAATTTTT CCTTATCTTGTTAGAGTCATTGGTGTATCGAATTTTGGTGATCTGAGTTTTTCATTGATAACTATACAAGTGTTG TTAATGGTTGTTGAATATGGTTTTGGATATAGTGGGACAAGAGAAATAGCACTAAATAACGATAAAAAATACCAT TCTGAATTTTTTTGCGGTGTGGTGCTTGCTCGTTTTATATTAATGCTAATTGCAGCTATAATACTCATAATACTC

- 79 046206

TGTTTTTTTTATGTTTTTAACGACGTTAAGTCTTTGTTATGTGTTGGTTTTCTGTCCGTAATTGCAGGTGTTTTC AATCCAAATTGGTTTTTGCAAGGTAAGGAAATGATGAGTGTGATGGCTGTGCTGTCACTATTTTCACGAGGCATA GCAGTCGTTGCAGTTTATCTAATTATAAAACCCGCAACGCCGATGTACATCAGTGCCTTATTATTGAGCATGCCA TATATTTTGTATTCATTCTGTGGCGTTGCCTACTTACTTATTATCAAGGAGATTTTTTTATGTAGGCCACCGATA AAGAAAATTCAAGTAATTTTAAAAAATGGATTTCATTTTTTTTGTTCAACACTTGCGACTAGTGCATACACAATG TTGACCCCTCTTGTATTGGGTGGCGTATCTGGAAAGTTTGATGTAGGCATCTTTAACTCAGCTAACATGATCAAA CAAGGTTTGGCTGGACTTGCATCACCATTAGTCCAAGCTTTTTATCCAAGAATTAACATTTTGCAAAGAGAGAAT CCATATATTGCAAACTTAAAATCTAGAATGATTCTTAAATACTTGCTTGTTTTTTACATGGCTTTAGCAATACCA TTTTTACTTTTTGCCAACCAATTATCATTATTAATATTCGGCATGAAAGGTGAAGTAATTGCAGGTGCAATGCAA TTAATGACATTGCTTCCTATATTCATAGGTTTTAATACAGTTGTCGGGTTACTTGTATTAGTACCTAATGGGATG CAAAAACAGTATTTCAAATCTATTTTCCTAGGAACTATTACTTGTTTAAGCATAGTTTATCCAGCATGTAAATAT TATGGAGCAACGGGTGCGATTGTGAGTCTTATTGTAGCTGAAATTTTCGTTGGCATGGGAATGCTTAAACAATTC ATTAAAGTAAATAAAACCGTATGTAGGCCTCATAAATTATGAATATCTCGGTAATAATATCTGTTTGGAAACGCC CAGTTCAATTAGAATTGATTCTCTCTGAGCTCGATTCTCAGGCTAAAGACAATAGTCTACACCTAGAAGTAATTG T T T С C GATAGT CATAGT GGTAAAGAAAT T GAT GAT GTAGT T GCT GATAATAT T CATAAAAAGAAAAATAT TAATA TTATCCATCAACATACTAAAAATATACTCTCCGCTAAGCGCAATTTCGGAGCATCCCTAGCCCATGGGGATTATT TAATATTTCTTGATGATGATTGTATACCCGCAAGTGGATATATATCATCGTTGCTGAACTATTTAAAAAAAATGA ATAGTAAAAGCGTTTTATGTGGGGAAGTTAGATTCGAAAATGAACTCATTGAGACCAGCAATTACTATCGCTACA GGAACTCTTTACACCCTAAGTTTAGTGATAGTCCTGATATCTCTATGAATGCCTGGACTTTTGTCGCAATGAATT GTGTTCTTGATAGAAAGGCATTTTCATCAGGTATAGTTTCATATAATGAAAATTTTATTGGTTATGGTTGTGAAG ATCATGAGTTTGGGTGGCAACTTGAAAAAAATGACTTCAAAATTATTTTTGCTGATTTTAAAATATTACATCACG AATACAGTGGCGATATAGAAGGATATACAAAAAAAATTCGTGCTACAGCACGTGATGGTATGAATGTATTAAGCA AAGTAAGGCCTGAAATGTTTTCTACTAATAAAAAATTATTCCTAGTTGAGAAAATATTTAGTAAACACAAAACGT T TAGTAAAATAT G С CAAT CAATAT T T T T CAATAAAT T TAT T T T TAAAAAAATAATACAAT T T T TAAAAAAAACAG ATGCAAATAAAAAACTCTATTTCCCAATTCTTTACAGATATGTGTTGATTTCGGCATATATACATGGTATTGGAG AGCGTGGCACCTCAAAAACAGATGATTTGCTTAAGAACTGGTATATATAGATGATGCTATCTTCATTTATTAAGA CATTTGTATGGAAGGTAAAAAACAATGAAGTATAATGCATTGATGGCTTTTTTATTATTTTTTGTTGTTTTTTTT AGATTGTCGCTGATAATACCTTTCTTATATTTGGCATTTATTCCTGCATTTTTTGGTATTATGTATTTAGTGCGT AATTTTATGATTACTATGGGCAATGGATTGGTATCTATAGATCGTAAAAATTTGTTGCTGTTATCTATATTCATA ATTATTTTTTTATTTTGTTTGGTTTTCGATTTGTTTCAAAAAAGCCATTCTTTTCAAAGTTATTTTACCGTTAGA TTATTTATGTTGTTTTTATTTTCATTTGTTCCTGCGTATTATTTAGTAAATAGATTCATAAAGGGTGACTTGAAA TTAATGGAGCGAATATTAGTGTATTCTCTCTGGGTTCAAATAGTTATTTTTTTTGGTATGTATATAAGTCCAGAG TTAAAAAGATTGTTATATACTTTCTTTGGTATGTCTGACTCTGTTAATCTTTGGGAACAAAATGCTAAAGTAAGA GGATTTGGGTTGTCGGGTGAAATAAATTTCATGACACCATTTTTGATGATCTATATGTCATTTTTTATGATGAAA AGGCGTTATGCTTTAATTACTTTAATTTGTCTGACTCAAATCGTAAATTCTAACATGGCTGTGATTGCAGCCATT ATTGGTATCGGTTGCTCTAGACTTAATATTAATATAAAAATTGCAACAGTATTGATTTTGGGAGTTTTAGTTTAT AGCTTAGGAGCGGTGTTCTTTCCTCGATTTTATGATGAGTTCGTTTCTGGAGATGGCACAAGAACTCTGGATATC T TAT TACAGCAACAT GTGTTTGTT GTAGGTAAT T TAGAT T T T T TTAATATTATATTT GGATTACAGCAAAACATA TCTTCATCAATCCCCGATATTAAACAAAGTTCGGATATGGGCTGGGTTATACTGTTTAATTACGGTGGGTTAACA TTTATTACACTCTTTTTATTTTTAATCTTTACTATTTCTATTGCGACATTTGGAATGACATATCAAGCAATTATA

- 80 046206

TGGATGTTAATTGGGATAATTTTCAATACCAAAGGTTTAGTTTTAGGATCTAACGGCTATTTCTTTCTATCTTTT ATATATAT GT T T T T GAATAGAGTAACACT TAGT GGACAGAGT T CAAT TACTAATAAGT TAGGT CAAGTAAGTAAA TAGCTTCCAGAGTATATTTGTCAATGATTTGAGGTTCGGTTATTATGTTTTCATCTAAAACACTGTTAATTACTG GTGGTACTGGCTCTTTCGGGAATGCTGTATTAAATAGATTTCTTGATACAGATATTGCAGAAATCCGTATATTTA GT CGT GAT GAAAAAAAACAAGAT GATAT GCGGAAAAAATACAATAAT CAAAAAT TAAAGTT CTATATT GGT GAT G TCAGAGATTACCGTAGTATTTTGAATGCGACTCGCGGTGTTGATTTTATATATCATGCAGCGGCACTTAAGCAAG TTCCATCATGTGAATTTCATCCTATGGAAGCCGTTAAAACTAATATCCTTGGTACGGAAAATGTTCTTGAAGCAG CTATAGCGAATGAAGTGAAGAGGGTTGTATGCCTAAGTACTGATAAAGCTGTATACCCGATTAACGCAATGGGTA TTTCAAAAGCTATGATGGAAAAGGTCATGGTCGCGAAATCCCGTAATGTTGATCGCAATAAAACAGTAATATGTG GTACCCGTTATGGGAATGTTATGGCATCTCGCGGTTCAGTTATTCCATTATTTGTTGATCTTATTAGAGCGGGCA AGCCACTCACAATAACTGATCCTAATATGACCCGCTTTATGATGACTCTTGAGGATGCGGTAGATTTAGTTCTTT ATGCGTTTGAACATGGTAATAATGGTGATATCTTTGTGCAAAAAGCACCTGCAGCAACTATTGACACATTAGCTA TTGCTTTAAAGGAATTACTAAATGTTCCTGACCATCCGGTAAATGTCATTGGAACGCGTCATGGCGAGAAATTAT ATGAAGCTCTACTTAGTCGTGAGGAAATGATCGCTGCTATAGATATGGGCGATTATTACCGTGTCCCGCCAGATC TTCGTGACCTTAATTATGGCAAATATGTTGAGCAAGGTGATAGCCGAATATCTGAAATAGAAGATTATAACTCTC ATAATACTCAACGGTTAGATGTTGAAGGCATGAAAGAGCTCTTGCTAAAATTAGCCTTTATTCGAGCAATTCGTG CTGGTGAAAAATATAATCTGGATTCATGATATGAAAATATTAGTTACTGGTGCAAATGGTTTTATTGGTCGTAAT TTATGTTTGAGGCTTGAGGAACTTGGTTATAAAGATCTTATTAGAATTGATCGAGAATCAACGAAGCAAGATCTT GAACAAGGCTTACAGGATGCCGATTTTATTTATCACTTAGCTGGTATCAATAGACCTAAGACTGATGATGAGTTT ATTTCTGGAAACAGTGATTTAACAAAGCATATAGTTGAGTATCTCCTTTCTATTGGTAAGAATACACCAATTATG CTAAGTTCTTCGATACAAGCTGAACTTAATAATGCTTATGGGGTTAGCAAAGCTGTAGCTGAAAGCTATGTCGAA AAATATGCTGCTGCTAGTGGTTCTTCGTATTATATTTTCAGATATCCAAACGTTTTTGGTAAATGGTGTAAGCCA AACTATAATTCTTTTATAGCAACTTTTTGCTACAATATTTCCAATGATATTGAGATTACTATCAATGATGCAGCA GCGCCAGTCAATCTGGTCTATATTGATGATGTTTGTACTGATGCTATAGCTCTTCTCTCTGGGACGGTTGAAAGT GGATATAAAGTTGTTGCACCAATTTATTCAACAACAGTTGGTGAAGTTGCAGAATTAATTTATAGCTTCAAAAAT AGCCGTTCCACCCTGATCACAGAGGCTGTCGGGGCGGGATTTACCCGTGCATTGTATTCTACATGGCTGAGTTAT TTACCAGCAGAGAAGTTTGCGTACAAGGTACCTTTTTATGGGGATGCCCGCGGAGTCTTTTGTGAGATGTTGAAA ACGCCTTCAGCGGGGCAGTTTTCATTTTTTACTGCTCACCCTGGTATTACGCGTGGCGGACATTACCATCACAGT AAAAATGAGAAGTTTTTGGTCATTCGAGGTCAGGCATGCTTTAAATTTGAACATGTGATTACCGGTGAGCGATAT GAACTGAAAGTTTCATCGGGTGAGTTTAAGATTGTTGAAACAGTTCCTGGTTGGACACATGACATTACAAATATT GGAACTGATGAATTAATAGTCATGCTCTGGGCAAATGAAATTTTCAACCGTGATGAGCCCGATACTATTGCGAGA CCTCTATAATGAAAAAATTAAAAGTTATGTCTGTTGTTGGAACCCGTCCTGAGATTATCCGTTTGTCGAGGGTTC TTGCTAAGTTTGATGAATACTGCGAGCATATTATTGTCCATACTGGTCAAAATTATGATTACGAATTAAATGAAG TGTTCTTCAATGACTTGGGTGTTCGAAAACCTGATTATTTTTTAAATGCAGCGGGTAAAAATGCGGCGGAAACCA TTGGTCAGGTTATTATTAAGGTAGATGAAGTATTAGAAATCGAAAAACCTGAAGCAATACTGGTATTGGGCGATA CGAATTCATGTATTTCTGCCATTCCGGCCAAACGCCGTAAAGTGCCTATATTTCATATGGAAGCAGGTAACCGTT GTTTCGATCAACGCGTGCCTGAAGAAACCAACAGACGTATTGTTGACCATACGGCTGATATCAATATGACCTACA GTGATATTGCTCGTGAATATCTCTTGGCTGAAGGTATCCCAGCTGATCGGATCATAAAAACTGGTAGCCCTATGT TTGAGGTTCTTTCATATTATATGCCCCAAATTGATGGTTCAGATGTGCTATCGCGTTTGAATCTACAGTCTGGTG AGTTTTTTGTAGTAAGTGCGCATCGTGAAGAGAATGTTGATTCTCCAAAACAGCTCGTAAAGCTTGCGAACATTC

- 81 046206

TAAATACTGTTGCTGAAAAATATAATCTTCCAGTTATTGTCTCCACACACCCAAGGACACGTAACCGAATCCGTG AGCAAGGAATTGAATTTCATTCAAATATAAATCTACTGAAACCATTGGGTTTCCATGATTATAACCACTTGCAGA AGAACTCACGAGCTGTGCTTTCAGATAGCGGTACTATCACTGAAGAGTCATCCATCATGAATTTCCCAGCGGTAA ACATCCGGGAAGCGCATGAGCGTCCGGAAGGCTTTGAGGAAGCATCCGTCATGATGGTGGGGTTAGAGTGTGAAC GCGTATTACAAGCGCTGGATATTCTGGCAACACAACCGCGAGGTGAAGTCCGTCTTTTACGTCAGGTTAGTGATT ACAGCATGCCAAATGTGTCGGATAAAGTTGTCAGAATTGTTCACTCTTACACAGATTATGTTAAGAGAGTCGTCT GGAAAGAATATTGATGAAACTTGCTTTAATCATAGATGATTACCTGCCCAACAGTACTCGTGTTGGTGCAAAAAT GTTTCATGAACTTGCTCAAGAATTTATCCAGCGTGGGCACGATGTTACGGTAATTACTCCTGGTACGGGCATGCA AGAAGAGATTTCTTTTGATACCTTTCAGGGGGTAAAAACATGGCGTTTTAAAAGCGGGCCGCTCAAGGATGTAAG TAAAATTCAGCGAGCGGTCAATGAAACGCTTTTGTCCTATCGGGCGTGGAAAGCCATCAAAAAATGGGTAAAAAA AGAGACCTTTGAGGGGGTGATTTATTATTCACCTTCCATATTCTGGGGGCCTTTAGTTAAAAAAATTAAAGCTCG TTGCCAATGTCCTGCTTATCTTATTTTAAGAGATATGTTTCCACAATGGGTAATTGATGCAGGAATGCTTAATGC TGGTTCCCCAATAGAACGCTACTTTCGTCTTTTTGAAAAAATATCTTATCGTCAGGCAAATCGTATTGGACTTAT GTCTGATAAGAATCTTGATGTTTTTCGGAAAGATAATAAAGGCTATCCGTGCGAAGTTTTGCGTAATTGGGCATC CCTAACACCAACGATCATACCCAAGGATTATATACCACTACGTAAGCGACTTGGCCTAGAGGATAAAACCATTTT CTTCTATGGTGGAAACATAGGTCATGCACAGGACATGACAAACTTGATGCGACTTGTGAGAAACATGGCAGCATA TCCTCAAGCTCATTTCCTATTTATTGGCCAGGGGGATGAAGTTGAATTAATTAATTCATTAGCATCTGAGTGGGC ATTGACGAATTTCACCTATTTGCCCTCGGTTAACCAAGATGAATTTAAGTTCATTTTGTCGGAAATGGATATCGG CTTGTTTTCTCTTTCCGCTAGACACTCTTCCCATAATTTTCCTGGTAAGTTATTAGGCTATATGGTTCAGTCGCT ACCTATTTTAGGTAGCGTAAATGCCGGAAATGATTTGCTCGACATTGTCAATCAAAATAATGCGGGATTAATCCA TGTCAATGGTGAGGACGATAAATTATGTCAATCTGCGCTATTAATGTTGCATGATATTGATGTGCGCCGGCAACT TGGTTCGGGGGCGAATATATTGTTGAAAGAACAATTCTCCGTTGAGTCTGCGGCACAGACGATAGAAATGAGGTT GGAGGCATGCAATGCGATTAATTGATAATGACCAACTCGACGAATTATATGATCAAGCCGGGCAATCGGAACGTT TACGTTCCCACCTTATGATGCACGGCTCGCATCAAGAAAAGGTACAGCGTTTACTTATTGCATTAGTAAAGGGCA GCTATGTTGAACCGCATTATCACGAACTTCCTCATCAGTGGGAAATGTTCATTGTTATGGAGGGGCAACTTCAGG TTTGTTTGTATGGTAGAAATGGTGAGGTTATAAAGCAATTTATAGCAGGAGATAATACTGGAATGAGCATTGTGG AGTTTTCTCCGGGCGATATACACAGTGTCGAATGCCTATCTCCGCGTGCTCTTATGGTGGAAGTTAAGGAGGGGC CATTTGACCCTTCTTTTGCAAAATCGTTCGTGTGAGCGGCCGCGAGCTCGTCGACTCGAGGATCCGTGTAGGCTG GAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGG ATAAAGCCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATACTTTAATAAGTACTTTGTATACTTATTTGCGAACA TTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATGTCCAAGCAACAGATCGGCGTA GTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAAC CGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAA GAGTTTGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCT ATTGATTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGTAACACCTTCTTCCAGGACACT ATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACCGGTGTTTCTGGCGGTGAAGAGGGG GCGCTGAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTGGTAGCACCGATCCTGACCAAA ATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAG ATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTATTCTCTGCTTAAAGGTGGCCTG AACCTCACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGAC

- 82 046206

ATCACCAAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCGGCT AACAAAGGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCGCTGTCGCTGATTACCGAGTCT GTGTTTGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAAGTTCTCTCTGGTCCGCAAGCA CAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTATCTGGGCAAAATCGTTTCTTAC GCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAACTACGGCGAAATCGCGAAG ATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGAAAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCACAG ATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCAGGCGCTGCGTGATGTCGTT GCTTATGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCCTATTACGACAGCTACCGTGCT GCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCATACTTATAAGCGTATTGATAAA GAAGGTGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 16 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 016 - штаммпродуцент 016-ЕРА stLMTB11739)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGTGAAAATA CTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCAGCTGTAGTTCGTCACATTATAAATAATACGCAGGATAGTGTT GTTAATGTCGATAAATTAACGTACGCCGGAAACCGGGAATCACTTGCTGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATGTT TTTGAACATGCGGATATTTGCGATGCACCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGCAGTGATG CACCTGGCTGCTGAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATATTGTTGGT ACTTATGTCCTTTTGGAAGCCGCTCGCAATTACTGGTCTGCTCTTGATAGCGACAAGAAAAATAGCTTCCGTTTT CATCATATTTCTACTGACGAAGTCTATGGTGATTTGCCTCATCCAGATGAAGTAAATAATACAGAAGAATTACCC TTATTTACTGAGACGACAGCTTACGCGCCAAGCAGCCCTTATTCCGCATCCAAAGCATCCAGCGATCATTTAGTC CGCGCGTGGAAACGTACATATGGTTTACCGACAATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTATGGTCCTTATCATTTC CCGGAAAAGCTTATTCCACTGGTTATTCTTAATGCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATTTATGGCAAAGGAGAT CAGATCCGCGACTGGTTGTATGTTGAAGATCATGCGCGTGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAAAGCGGGT GAAACTTATAACATTGGTGGGCACAACGAAAAGAAAAACATCGATGTAGTGCTCACTATTTGTGATTTGCTGGAT

- 83 046206

GAGATTGTACCGAAAGAGAAATCTTATCGTGAGCAAATCACTTATGTTGCTGATCGTCCGGGACACGATCGCCGC TATGCTATTGATGCTGAGAAGATTGGTCGCGCATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGCGGGATTCGT AAAACGGTGGAATGGTACCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGATT GAACAGAACTATGAGGGCCGCCAGTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAGGTTGGGAACTAC AGCGTGCTCTGGCACCTTTGGGTAATTTGATTGCTTTTGATGTTCACTCTACTGATTATTGCGGTGATTTTAGTA ATCCTGAAGGTGTAGCTGAAACCGTAAGAAGCATTCGGCCGGATATTATTGTCAATGCAGCCGCTCACACCGCAG TAGACAAAGCAGAATCAGAACCGGAGTTTGCACAATTAATTAACGCAACAAGTGTCGAAGCGATTGCGAAAGCAG CAAATGAAGTTGGAGCCTGGGTTATCCATTACTCGACTGATTACGTCTTCCCTGGAAATGGCGATATGCCATGGC TGGAGACGGATGCAACCGCACCACTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCCGGAGAAAAAGCGTTACAGGAAT ATTGCGCGAAGCATCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCAGGAAAAGGAAATAACTTCGCCAAAACGATGT TACGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCGGTTATTAACGATCAGTTTGGTGCGCCAACAGGTGCTGAACTGC TGGCTGATTGTACAGCACATGCCATTCGTGTCGCACTGAATAAACCGGATGTCGCAGGCTTGTACCATTTGGTAG CCAGTGGTACCACAACCTGGTACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATTCCCCTTG CACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAACAACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATAACTCTCGCCTTA ATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCGTGAAACGAATGCTCAATG AATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGCATCTTGTTCGTGATGGTGGAGCAAGATGAATTAAAAGGA ATGATGAAATGAAAATGCGTAAAGGTATTATTTTAGCGGGTGGTTCTGGTACACGTCTTTATCCTGTGACTATGG CTGTCAGTAAACAGCTATTACCTATTTATGATAAACCGATGATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATGTTGGCGG GTATTCGCGATATTTTGATTATCAGTACACCTCAGGATACTCCTCGTTTTCAACAATTGCTGGGTGACGGTAGCC AGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAGTGCAACCTAGCCCAGATGGCCTCGCGCAGGCATTTATCATCGGTGAAG AGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTTCTTGGTGATAATATCTTTTACGGTCACGATCTGCCGAAGCTAA TGGAGGCCGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCAGAACGCTATGGTG TCGTTGAGTTTGATAAAAACGGTACGGCAATCAGTCTGGAAGAAAAACCGTTAGAACCAAAGAGTAATTACGCCG TTACAGGTCTGTACTTTTATGATAACGACGTGGTTCAGATGGCGAAAAACTTGAAGCCGTCTGCACGTGGTGAGT TAGAAATTACAGATATTAACCGTATTTATCTTGAGCAGGGACGTCTGTCTGTCGCGATGATGGGGCGTGGCTACG CGTGGCTGGACACGGGGACTCATCAGAGTCTGATAGAAGCAAGTAATTTTATTGCGACAATTGAAGAGCGCCAGG GATTGAAGGTTTCCTGTCCTGAAGAGATTGCATTTCGTAAAGGTTTTATTGATGTTGAGCAAGTAAGAAAATTAG CTGTACCACTAATAAAGAATAATTATGGGCAGTATCTTTATAAAATGACGAAGGATTCAAATTAATGAATGTGAT TAGAACTGAAATTGAAGATGTGCTAATTCTGGAGCCAAGAGTATTTGGTGATGATAGAGGTTTCTTTTATGAGAG CTTTAATCAATCAGCATTTGAACATATTCTAGGCTATCCGGTCAGCTTTGTTCAAGACAATCACTCACGTTCATC AAAAAATGTACTCAGAGGCCTTCACTTTCAACGCGGCGAGTACGCACAAGATAAACTTGTACGCTGCACTCATGG AGCAGTTTTTGATGTTGCTGTTGATATTCGACCCAATTCGGTATCCTTTGGTAAATGGGTTGGTGTTCTGCTTTC AGCTGATAATAAGCAGCAGTTGTGGATACCAAAAGGGTTTGCTCATGGCTTTTTGGTTCTGTCTGATATCGCTGA ATTTCAATATAAAACTACAAACTATTATCATCCTGAAAGCGATTGTGGAATATGTTGGAATGATGAACGCATTGC AATTGATTGGCCCCAAACATCAGGGTTAATCCTTTCGCCAAAAGATGAAAGGCTCTTTACGTTAGATGAGCTTAT CAGATTAAAATTAATTGCATGAATACGAATAAATTATCTTTAAGAAGAAACGTTATATATCTGGCTGTCGTTCAA GGTAGCAATTATCTTTTACCATTGCTTACATTTCCATATCTTGTAAGAACACTTGGTCCTGAAAATTTCGGTATA TTCGGTTTTTGCCAAGCGACTATGCTATATATGATAATGTTTGTTGAATATGGTTTCAATCTCACAGCAACTCAG AGTATTGCCAAAGCAGCAGATAGTAAAGATAAAGTAACGTCTATTTTTTGGGCGGTGATATTTTCAAAAATAGTT CTTATCGTCATTACATTGATTTTCTTAACGTCGATGACCTTGCTTGTTCCTGAATATAACAAGCATGCCGTAATT

- 84 046206

ATATGGTCGTTTGTTCCTGCATTAGTCGGGAATTTAATCTACCCTATCTGGCTGTTTCAGGGAAAAGAAAAAATG AAATGGCTGACTTTAAGTAGTATTTTATCCCGCTTGGCTATTATCCCTCTAACATTTATTTTTGTGAACACAAAG TCAGATATAGCAATTGCCGGTTTTATTCAGTCAAGTGCAAATCTGGTTGCTGGAATTATTGCACTAGCTATCGTT GTTCATGAAGGTTGGATTGGTAAAGTTACGCTATCATTACATAATGTGCGTCGATCTTTAGCAGACGGTTTTCAT _{GTTTTTATTTCCACATCTGCTATTAGTTTATATTCTACGGGAATAGTTATTATCCTGGGATTTATATCTGGACCA}ACGTCCGTAGGGAATTTTAATGCGGCCAATACTATAAGAAACGCGCTTCAAGGGCTATTAAATCCTATCACCCAA GCAATATACCCAAGAATATCAAGTACGCTTGTTCTTAATCGTGTGAAGGGTGTGATTTTAATTAAAAAATCATTG ACCTGCTTGAGTTTGATTGGTGGTGCTTTTTCATTAATTCTGCTCTTGGGTGCATCTATACTAGTAAAAATAAGT ATAGGGCCGGGATATGATAATGCAGTGATTGTGCTAATGATTATATCGCCTCTGCCTTTTCTTATTTCATTAAGT AATGTCTATGGCATTCAAGTTATGCTGACCCATAATTATAAGAAAGAATTCAGTAAGATTTTAATCGCTGCGGGT TTGTTGAGTTTGTTGTTGATTTTTCCGCTAACAACTCTTTTTAAAGAGATTGGTGCAGCAATAACATTGCTTGCA ACAGAGTGCTTAGTTACGTCACTCATGCTGATGTTCGTAAGAAATAATAAATTACTGGTTTGCTGAGGATTTTAT GTACGATTATATCATTGTTGGTTCTGGTTTGTTTGGTGCCGTTTGTGCGAATGAGTTAAAAAAGCTAAACAAAAA AGTTTTAGTGATTGAGAAAAGAAATCATATCGGTGGAAATGCGTACACAGAGGACTGTGAGGGTATCCAGATTCA TAAATAT G GT G СACATAT T T T T CATAC CAAT GATAAATATATAT G G GAT TAG GT TAAT GAT T TAGTAGAAT T TAA TCGTTTTACTAATTCTCCACTGGCGATTTATAAAGACAAATTATTCAACCTTCCTTTTAATATGAATACTTTCCA CCAAATGTGGGGAGTTAAAGATCCTCAAGAAGCTCAAAATATCATTAATGCTCAGAAAAAAAAGTATGGTGACAA GGTACCTGAAAATTTGGAGGAGCAGGCGATTTCATTAGTTGGGGAGGACTTATACCAAGCATTGATAAAGGGTTA TACGGAGAAGCAGTGGGGAAGAAGTGCAAAAGAATTGCCTGCATTTATTATTAAGCGAATCCCAGTGAGATTTAC GTTTGATAACAATTATTTTTCCGATCGCTATCAAGGTATTCCGGTGGGAGGCTACACTAAGCTTATTGAAAAAAT GCTTGAAGGTGTGGACGTAAAATTAGGCATTGATTTTTTGAAAGACAAAGATTCTCTAGCGAGTAAAGCCCATAG AATCATCTACACTGGACCCATTGATCAGTACTTCGACTATAGGTTTGGAGCGTTAGAATATCGCTCTTTAAAATT TGAGACGGAACGCCATGAATTTCCAAACTTCCAAGGGAATGCAGTAATAAATTTCACTGATGCTAATGTACCATA ТАС CAGAATAAT T GAG CATAAACAT TTTGACTATGTT GAGACAAAG CATAC G GT T GT TACAAAAGAATAT C CAT T AGAGTGGAAAGTTGGCGACGAACCCTACTATCCAGTTAATGATAATAAAAACATGGAGCTTTTTAAGAAATATAG AGAGTTAGCTAGCAGAGAAGACAAGGTTATATTTGGCGGGCGTTTGGCCGAGTATAAATATTATGATATGCATCA AGTGATATCTGCCGCTCTTTATCAAGTGAAAAATATAATGAGTACGGATTAATGATCTATCTTGTAATTAGTGTC TTTCTCATTACAGCATTTATCTGTTTATATCTTAAGAAGGATATATTTTATCCAGCCGTATGCGTTAATATCATC TTCGCACTGGTCTTATTGGGATATGAAATAACGTCAGATATATATGCTTTTCAGTTAAATGACGCTACGTTGATT TTTCTACTTTGCAATGTTTTGACATTTACCCTGTCATGTTTATTGACGGAAAGTGTATTAGATCTAAATATCAGA AAAGTCAATAATGCTATTTATAGCATACCATCGAAGAAAGTGCATAATGTAGGCTTGTTAGTTATTTCTTTTTCG ATGATATATATATGCATGAGGTTAAGTAACTACCAGTTCGGGACTAGCTTACTTAGCTATATGAATTTGATAAGA GATGCTGATGTTGAAGACACATCAAGAAATTTCTCAGCATACATGCAGCCAATCATTCTAACTACTTTTGCTTTA TTTATTTGGTCTAAAAAATTTACTAATACAAAGGTAAGTAAAACATTTACTTTACTTGTTTTTATTGTATTCATC TTTGCAATTATACTGAATACTGGTAAGCAAATTGTCTTTATGGTTATCATCTCTTATGCATTCATCGTAGGTGTT AATAGAGTAAAACATTATGTTTATCTTATTACAGCTGTAGGTGTTCTATTCTCCTTGTATATGCTCTTTTTACGT GGACTGCCTGGGGGGATGGCATATTATCTATCCATGTATTTGGTCAGCCCTATAATCGCGTTTCAGGAGTTTTAT TTTCAGCAAGTATCTAACTCTGCCAGTTCTCATGTCTTTTGGTTTTTTGAAAGGCTGATGGGGCTATTAACAGGT GGAGTCTCTATGTCGTTGCATAAAGAATTTGTGTGGGTGGGTTTGCCAACAAATGTTTATACTGCTTTTTCGGAT TATGTTTATATTTCCGCGGAGCTAAGCTATTTGATGATGGTTATTCATGGCTGTATTTCAGGTGTTTTATGGAGA

- 85 046206

TTGTCTCGAAATTACATATCTGTGAAAATATTTTATTCATATTTTATTTATACCTTTTCTTTCATTTTTTATCAT GAAAGCTTCATGACTAATATTAGCAGTTGGATACAAATAACTCTTTGTATCATAGTATTCTCTCAATTTCTTAAG GCCCAGAAAATAAAGTGAAAATGTATTTTTTGAATGATTTAAATTTCTCTAGACGCGATGCTGGATTTAAAGCAA GAAAAGATGCACTGGACATTGCTTCAGATTATGAAAACATTTCTGTTGTTAACATTCCTCTATGGGGTGGAGTAG TCCAGAGAATTATTAGTTCTGTTAAGCTTAGTACATTTCTCTGCGGTCTTGAAAATAAAGATGTTTTAATTTTCA ATTTCCCGATGGCCAAACCATTTTGGCATATATTGTCATTCTTTCACCGCCTTCTAAAATTTAGAATAGTACCTC TGATTCATGATATTGATGAATTAAGAGGAGGAGGGGGTAGTGATTCTGTGCGGCTTGCTACCTGTGATATGGTCA TAAGT CACAAT С CACAAAT GACAAAGTAC С T TAGTAAATATAT GT CT CAGGATAAAAT CAAAGACATAAAAATAT TTGATTACCTCGTCTCATCTGATGTGGAGCATCGAGATGTTACGGATAAGCAACGAGGGGTCATATATGCTGGCA ACCTTTCTAGGCATAAATGTTCTTTCATATATACTGAAGGATGCGATTTTACTCTCTTTGGTGTCAACTATGAAA ATAAAGATAATCCTAAATATCTTGGAAGTTTTGATGCTCAATCTCCGGAAAAGATTAACCTCCCAGGCATGCAAT TTGGACTCATTTGGGATGGAGATTCTGTCGAAACCTGTAGTGGTGCCTTTGGCGACTATTTAAAGTTTAATAACC CTCATAAGACATCTCTTTATCTTTCAATGGAACTTCCAGTATTTATATGGGATAAAGCCGCCCTTGCGGATTTCA T T GTAGATAATAGAATAG GATAT G CAGT G G GAT СAAT CAAAGAAAT G CAAGAGAT TGTTGACTC CAT GACAATAG AAACTTATAAGCAAATTAGTGAGAATACAAAAATTATTTCTCAGAAAATTCGAACAGGAAGTTACTTCAGGGATG TTCTTGAAGAGGTGATCGATGATCTTAAAACTCGCTAAACGATATGGTCTCTGTGGTTTTATTCGGCTTGTTAGA GATGTCTTATTGACTCGTGTATTTTACCGGAACTGTAGAATTATTCGATTTCCCTGCTATATTCGCAATGATGGT AGCATTAATTTTGGTGAAAATTTCACAAGTGGAGTCGGTCTCAGGCTGGATGCATTTGGACGTGGCGTGATTTTT TTTTCCGATAATGTGCAAGTTAACGACTATGTTCATATCGCCTCAATTGAGAGCGTTACGATAGGTCGGGATACG CTTATTGCAAGTAAAGTATTTATTACCGATCATAATCACGGTTCCTTTAAGCACTCTGATCCAATGAGTTCGCCA AATATACCTCCAGACATGCGCACGTTGGAATCTTCAGCTGTTGTAATTGGCCAGAGGGTTTGGTTGGGTGAGAAT GTGACGGTTTTGCCTGGAACAATTATTGGTAATGGAGTCGTAGTCGGCGCCAATTCTGTTGTTAGAGGTTCTATT CCCGAAAATACTGTCATTGCGGGAGTACCAGCAAAAATCATAAAGAAATACAATCATGAGACCAAATTATGGGAA AAAGCATAGTCGTTGTTTCTGCGGTCAATTTTACCACTGGCGGTCCATTTACCATTTTGAAAAAATTTTTGGCAG CAACTAATAATAAAGAAAATGTCAGTTTTATCGCATTAGTCCATTCTGCTAAAGAGTTAAAAGAAAGTTATCCAT GGGTTAAATTCATTGAGTTTCCTGAGGTTAAAGGGTCGTGGCTAAAACGTTTGCACTTTGAATATGTAGTTTGTA AAAAACTTTCAAAAGAGCTGAATGCTACGCATTGGATTTGTCTGCATGATATTACGGCCAATGTCGTCACTAAAA AAAGATATGTGTATTGTCATAACCCTGCCCCTTTTTATAAAGGAATTTTATTCCGTGAAATTCTTATGGAGCCTA GCTTTTTCTTATTTAAAATGCTATACGGGCTGATATATAAAATAAACATTAAAAAAAATACTGCAGTGTTTGTTC AACAAT T С T G GAT GAAAGAAAAAT T TAT CAAGAAATAT T C TATAAATAACAT CAT TGTCAGTCGGC CAGAAAT TA AATTATCTGATAAAAGCCAACTTACTGATGATGATTCTCAATTTAAGAATAACCCTTCTGAGTTGACAATATTTT ACCCTGCTGTTCCACGAGTATTTAAAAATTACGAGCTTATTATTAGTGCAGCAAGGAAATTGAAAGAACAATCCA ATATTAAATTTCTGCTTACTATCAGTGGTACAGAAAATGCGTATGCAAAATATATTATCAGTCTTGCAGAAGGAC TGGATAATGTTCATTTCCTCGGGTACTTGGATAAAGAAAAAATCGATCATTGTTATAATATTTCAGATATAGTTT GTTTTCCCTCTAGGTTAGAAACATGGGGATTGCCGTTGTCTGAGGCTAAAGAGCGAGGTAAGTGGGTATTAGCAT CAGATTTCCCATTTACTAGAGAAACTCTTGGTAGTTATGAAAAGAAAGCTTTTTTTGATTCTAATAACGATGACA TGTTAGTTAAACTTATTATTGACTTCAAAAAAGGTAACCTCAAAAAAGATATCTCTGATGCAAATTTCATTTATC GTAATGAAAATGTATTAGTTGGGTTTGATGAACTAGTTAATTTTATTACTGAAGAACATTGAAATGGTATATATA ATAATCGTTTCCCACGGACATGAAGACTACATCAAAAAATTACTCGAAAATCTTAATGCTGACGATGAGCACTAC AAGATTATCGTACGCGACAACAAAGACTCTCTATTATTGAAACAAATATGCCAGCATTATGCAGGCCTGGACTAT

- 86 046206

ATTAGTGGAGGTGTATACGGCTTTGGTCATAATAATAATATTGCGGTGGCGTATGTAAAGGAAAAATATAGACCC G CAGAT GAT GAT TAGAT TTTGTTTTT GAAT CCC GATAT CAT CAT GAAG CAT GAT GAT T T G С T GACATATAT TAAA TATGTCGAAAGTAAGCGTTATGCTTTTAGTACATTATGCCTGTTCCGAGATGAAGCGAAATCTTTACATGATTAT TCCGTAAGAAAATTTCCTGTGCTTTCTGATTTTATTGTGTCATTTATGTTAGGGATTAATAAAACAAAAATTCCT AAAGAAAGTATCTATTCTGATACGGTTGTTGATTGGTGCGCAGGATCATTTATGCTGGTACGTTTTTCAGATTTT GTGCGTGTAAATGGCTTCGATCAAGGTTACTTTATGTACTGTGAAGATATTGACCTGTGCTTGAGGCTTAGCCTG GCTGGTGTCAGACTTCATTATGTTCCCGCTTTTCATGCGATACATTATGCTCATCATGACAATCGAAGTTTTTTT TCAAAAGCCTTCAGATGGCACTTAAAAAGTACTTTTAGATATTTAGCCAGAAAACGTATTTTATCAAATCGCAAC TTTGATCGAATTTCATCAGTTTTTCACCCGTAAGAGCTCGGTACCCGGGCCTAGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATCCGTCGACGGCG GCCGCCCTGCAGGCATGCAAGCTTGATCCATATGGATCGCTAGCTTAATTAAATAAAGCCGTAAGCATATAAGCA TGGATAAGCTATTTATACTTTAATAAGTACTTTGTATACTTATTTGCGAACATTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCG CGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATGTCCAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTGATGGGACG CAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGA AGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTTGTCGAATCTCTGGAAAC GCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTCAAACCATATCT CGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGTAACACCTTCTTCCAGGACACTATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTC AGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACGGGTGTTTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCTGAAAGGTCCTTCTATTAT GCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTGGTAGCACCGATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGG TGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATA CGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTATTCTCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCTCACCAACGAAGAACTGGC GCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGACATCACCAAAGATATCTTCACCAA AAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCGGCTAACAAAGGTACGGGTAAATGGAC CAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCGCTGTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTTTGCACGTTATATCTCTTC TCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAAGTTCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGA GTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTATCTGGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCG TGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAACTACGGCGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCAT CCGTGCGCAGTTCCTGCAAAAAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCACAGATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCC GTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCAGGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTAT TCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCCTATTACGACAGCTACCGTGCTGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGAT CCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCATACTTATAAGCGTATTGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACCGAATG GCTGGATTAA

SEQ ID NO: 17 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb О18Л - штаммпродуцент О18Л-ЕРЛ BVEC-L-00559)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG

- 87 046206

ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGTGAAAATA CTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCAGCTGTAGTTCGTCACATTATAAATAATACGCAGGATAGTGTT GTTAATGTCGATAAATTAACGTACGCCGGAAACCGGGAATCACTTGCTGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATGTT TTTGAACATGCGGATATTTGCGATGCACCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGCAGTGATG CACCTGGCTGCTGAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATATTGTTGGT ACTTATGTCCTTTTGGAAGCCGCTCGCAATTACTGGTCTGCTCTTGATAGCGACAAGAAAAATAGCTTCCGTTTT CATCATATTTCTACTGACGAAGTCTATGGTGATTTGCCTCATCCAGATGAAGTAAATAATACAGAAGAATTACCC TTATTTACTGAGACGACAGCTTACGCGCCAAGCAGCCCTTATTCCGCATCCAAAGCATCCAGCGATCATTTAGTC CGCGCGTGGAAACGTACATATGGTTTACCGACAATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTATGGTCCTTATCATTTC CCGGAAAAGCTTATTCCACTGGTTATTCTTAATGCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATTTATGGCAAAGGAGAT CAGATCCGCGACTGGTTGTATGTTGAAGATCATGCGCGTGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAAAGCGGGT GAAACTTATAACATTGGTGGGCACAACGAAAAGAAAAACATCGATGTAGTGCTCACTATTTGTGATTTGCTGGAT GAGATTGTACCGAAAGAGAAATCTTATCGTGAGCAAATCACTTATGTTGCTGATCGTCCGGGACACGATCGCCGC TATGCTATTGATGCTGAGAAGATTGGTCGCGCATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGCGGGATTCGT AAAACGGTGGAATGGTACCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGATT GAACAGAACTATGAGGGCCGCCAGTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAGGTTGGGAACTAC AGCGTGCTCTGGCACCTTTGGGTAATTTGATTGCTTTTGATGTTCACTCTACTGATTATTGCGGTGATTTTAGTA ATCCTGAAGGTGTAGCTGAAACCGTAAGAAGCATTCGGCCGGATATTATTGTCAATGCAGCCGCTCACACCGCAG TAGACAAAGCAGAATCAGAACCGGAGTTTGCACAATTAATTAACGCAACAAGTGTCGAAGCGATTGCGAAAGCAG CAAATGAAGTTGGAGCCTGGGTTATCCATTACTCGACTGATTACGTCTTCCCTGGAAATGGCGATATGCCATGGC TGGAGACGGATGCAACCGCACCACTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCCGGAGAAAAAGCGTTACAGGAAT ATTGCGCGAAGCATCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCAGGAAAAGGAAATAACTTCGCCAAAACGATGT TACGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCGGTTATTAACGATCAGTTTGGTGCGCCAACAGGTGCTGAACTGC TGGCTGATTGTACAGCACATGCCATTCGTGTCGCACTGAATAAACCGGATGTCGCAGGCTTGTACCATTTGGTAG CCAGTGGTACCACAACCTGGTACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATTCCCCTTG CACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAACAACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATAACTCTCGCCTTA ATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCGTGAAACGAATGCTCAATG AATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGCATCTTGTTCGTGATGGTGGAGCAAGATGAATTAAAAGGA ATGATGAAATGAAAATGCGTAAAGGTATTATTTTAGCGGGTGGTTCTGGTACACGTCTTTATCCTGTGACTATGG CTGTCAGTAAACAGCTATTACCTATTTATGATAAACCGATGATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATGTTGGCGG

- 88 046206

GTATTCGCGATATTTTGATTATCAGTACACCTCAGGATACTCCTCGTTTTCAACAATTGCTGGGTGACGGTAGCC AGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAGTGCAACCTAGCCCAGATGGCCTCGCGCAGGCATTTATCATCGGTGAAG AGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTTCTTGGTGATAATATCTTTTACGGTCACGATCTGCCGAAGCTAA TGGAGGCCGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCAGAACGCTATGGTG TCGTTGAGTTTGATAAAAACGGTACGGCAATCAGTCTGGAAGAAAAACCGTTAGAACCAAAGAGTAATTACGCCG TTACAGGTCTGTACTTTTATGATAACGACGTGGTTCAGATGGCGAAAAACTTGAAGCCGTCTGCACGTGGTGAGT TAGAAATTACAGATATTAACCGTATTTATCTTGAGCAGGGACGTCTGTCTGTCGCGATGATGGGGCGTGGCTACG CGTGGCTGGACACGGGGACTCATCAGAGTCTGATAGAAGCAAGTAATTTTATTGCGACAATTGAAGAGCGCCAGG GATTGAAGGTTTCCTGTCCTGAAGAGATTGCATTTCGTAAAGGTTTTATTGATGTTGAGCAAGTAAGAAAATTAG CTGTACCACTAATAAAGAATAATTATGGGCAGTATCTTTATAAAATGACGAAGGATTCAAATTAATGAATGTGAT TAGAACTGAAATTGAAGATGTGCTAATTCTGGAGCCAAGAGTATTTGGTGATGATAGAGGTTTCTTTTATGAGAG CTTTAATCAATCAGCATTTGAACATATTCTAGGCTATCCGGTCAGCTTTGTTCAAGACAATCACTCACGTTCATC AAAAAATGTACTCAGAGGCCTTCACTTTCAACGCGGCGAGTACGCACAAGATAAACTTGTACGCTGCACTCATGG AGCAGTTTTTGATGTTGCTGTTGATATTCGACCCAATTCGGTATCCTTTGGTAAATGGGTTGGTGTTCTGCTTTC AGCTGATAATAAGCAGCAGTTGTGGATACCAAAAGGGTTTGCTCATGGCTTTTTGGTTCTGTCTGATATCGCTGA ATTTCAATATAAAACTACAAACTATTATCATCCTGAAAGCGATTGTGGAATATGTTGGAATGATGAACGCATTGC AATTGATTGGCCCCAAACATCAGGGTTAATCCTTTCGCCAAAAGATGAAAGGCTCTTTACGTTAGATGAGCTTAT CAGATTAAAATTAATTGCATGAGGCCGGCCTTAAGGAGGACTAGTCCCGGCGCGCCATGAGTTTAATCAAAAACA _{GTTTTTGGAACCTTTGCGGGTATGTACTTCCAGCTATTGTGACACTACCAGCTTTGGGTATTATGGGGCGAAAAT}TAGGCCCAGAATTATTTGGTGTATTCACTTTGGCATTAGCTGTTGTGGGTTATGCAAGCATTTTTGATGCAGGCC TTACTCGCGCAGTGATACGAGAAGTCGCAATTGAAAAAGATAATGAAGAAAATAAGTTGAAAATTATTTCTTCAG CGACAGTTGTAATTATTTATTTGAGTTTGGCCGCCTCACTCTTATTATTTTTTTTTAGTGGTCATATCGCATTGC TACTGAACATTAGTGAGACTTTTTTTCATAATGTAAGTGTCTCGCTTAAAATTCTCGCAGCATCCATACCATTAT T T T T GAT ТАС T CAAATAT GGT T GT CAAT T T TAGAAGGT GAAGAAAGAT T T G GT T TACT TAATAT CTACAAAT CAA TTACGGGAGTGATATTAGCAATCTCACCGGCATTATTTATACTTATTAAACCCTCTTTGATGTATGCGATAATAG GCTTAGTTCTAGCAAGGTTTTTATGTTTTATTTTGGCTTTTATAATTTGTCACGATAAAGTGCTTAAAGCTAAAC TAACAAT C GATATAC CAACAAT TAAAAGAT T GT T TAT GTTCGGTGGT T GGAT TACAGTAAGTAATAT CAT CAGC C CTGTGCTATCATATTTTGATAGGTTTATTGTTTCAAATCAACTTGGGGCTGCTAATGTTGCTTTTTATACTGCAC CATCAGAAATTATTTCTCGGCTTAGTATAATTCCAGGTGCGTTTTCAAGAGCCTTATTTCCAAGATTAGCTAATG CAAAT AAT T С C G С T GAAAGAT AT AAAAC GAAAAGAT T AAT TAG AAT T T С AC T T T T AAT AAT CAT CACCCCTATTT TTTGTATTGGCGTGTTATTTTCAGAGAAGATAATGGTTTTATGGATGGGGGCATCATTTTTTGGTGAGCCTGGTT TGGTATTATCAATATTACTGATTGGCTTTATTTTTAATGGATTGGCACAAGTACCATTTGCCAGTATTCAATCCC GAGGTCATGCTAAGATAACTGCATTTGTTCATCTCTTAGAGTTGTTTCCTTATTTATTACTTTTATTTTACCTCA TAAAAGCACATGGGGTTGTTGGCGCGGGTATTGCGTGGTCAGTGAGGATGATAGTAGATTATATAGCATTAAGTC TTTTGGACGGTAAGTATATTAATAAATAAAATTCAAAATGCAAGTTAATAACTCATGGCTTTATTTGGGTAGGTG ACAATTTATAATGATATATATATTAACTTTAACTCTTCTTCTAGTTATAGCCATAATGTTTTCTCTTCTCGGCAC AAAAAGTAGGATCACATCTCCATTACCTTTGCATTTTTTACCATGGTTACTAACTTTAATTGTCGGGATAAGTAA TTACGATCAATTTTACGAGTTTAATGAAAGAAGCTTTTACTCTTTGTTGATTTGGTTTACAGTTATTTTTATATT TTATTTCATAGGGGAACTGGTTAATTATAAACGTGAAAATATAAATGTTTATTATGGTCTTTCACATATTAAATA T GAAT GTAAAAAATAT T GGAT CAT T GT CAT С C CAAT T T CAT TATATAC CAT T T T C GAAATATATAT GGT T GGTAT

- 89 046206

GGGGGGAGCAGATGGATTCTTTCTCAATTTACGTCTTGCAAATACATTGGAGGGCTATACGGGTAAAAAATTTAT CTTAATGCCTGCTGTATATCCTCTAATGATGGCTATGTTCGCAATTGTTTGTCTAACAAAAACTTCCAAATTAAA TAAATACTCCATTTATTTCTGGATGTTTTTGTATTGTATTGGCACAATGGGAAAATTTTCAATATTAACGCCAAT AT T GACATAT Τ TAAT TAT T TAT GACT T CAAACATAGAT TAAAAGTAAAAAAAACAATAAAGT Τ TACAT T GT T GAT AATTATATTAGCTTTAACTTTGCATTTTACACGTATGGCTGAGAATGACCACTCAACATTTTTATCTATTTTAGG GCTCTATATTTATTCACCAATAATTGCTTTAGGCCAGTTGAATGAAGTAAATAGTAGTCATTTTGGTGAGTATAC GTTTAGATTCATATATGCTATAACTAATAAAATTGGCCTTATTAAAGAATTGCCAGTAAATACTATTCTTGACTA TTCATACGTTCCTGTACCAACAAATGTATATACTGCACTTCAACCATTTTACCAGGATTTTGGTTATACTGGCAT CATATTTGGAGCAGTATTATACGGACTAATATATGTGAGTTTATACACGGCCGGTGTTCGTGGAAATAATACACA GGCATTACTGATTTACGCATTGTTTTCAGTTAGCAGTGCAACGGCTTTCTTCGCTGAAACGCTAGTAACGAATTT AGCTGGAAATGTGATGTTAGTATTATGTACCATCTTACTATGGCGATTTACAGTAATATGCAAACCAGTACAGTA ACCATTCTAATGGCCACCTACAATGGCGAGGCCTTCATCAAAAATCAGATTTTGTCACTACAACAACAAACATTT TCTAACTGGCGGTTATTTATTCAGGATGATGGGTCTACAGACAATACTATATCTATAATAAAAAACTTCCAAAAA TCTGACTCCAGAATTCGGCTAGTTGATGATAATTTGAAAGGTCAAGGTGCAGGAAAAAATTTTTTATCGCTGATA AAGTACAG C GAGACAGAT TATACAAT T TAT T GT GAC CAAGAT GATAT Τ T G G Τ TAGAAAACAAAATAT Τ T GAAT TA GTAAAGTATGCAAATGAAATTAAATTGAATGTATCAGATGCGCCTTCGCTAGTTTATGCTGATGGCTATGCTTAT ATGGATGGTGAGGGTACAATCGATTTTTCTGGGATATCTAACAATCATGCTGATCAATTAAAGGATTTTCTTTTT TTTAATGGTGGATACCAAGGATGTTCTATTATGTTCAATCGTGCAATGACCAAATTTCTTCTGAATTATCGAGGA TTTGTATATCTACATGACGATATCACAACATTAGCTGCATACGCTCTTGGTAAAGTTTATTTTCTCCCGAAATAC CTTATGTTATATAGACAGCACACGAATGCGGTAACTGGTATCAAAACATTCCGCAATGGATTGACTTCTAAATTT AAATCACCAGTAAACTATCTTTTATCACGAAAACATTATCAGGTAAAAAAATCTTTTTTTGAATGTAACAGCTCT AT C Τ TAT CAGAGAC GAATAAAAAAGT Τ Τ Τ Τ Τ T G GAT Τ Τ TAT Τ T CAT Τ Τ T GT GAAT СAAATAATAAAT T TAGAGAT TTTTTTAAGTTATGGCGAGGTGGGTTTAGATTAAATAACAGTAGAACTAAATTATTATTAAAATTCTTAATACGG AGAAAATTTAGCGAATGATTTCAATACTTACACCTACTTTTAATCGGCAACATACTTTATCAAGGCTATTCAATT CTCTTATATTACAAACTGATAAAGATTTTGAGTGGATAATAATTGATGATGGTAGTATAGATGCAACAGCGGTAC TTGTAGAAGATTTTAGAAAAAAATGTGATTTTGACTTGATTTATTGCTATCAGGAAAATAATGGTAAGCCCATGG CTTTAAACGCTGGTGTTAAAGCTTGTAGAGGCGATTATATCTTTATTGTTGACAGTGATGATGCACTAACTCCCG ATGCCATAAAATTAATTAAAGAATCAATACATGATTGCTTATCTGAGAAGGAAAGTTTCAGCGGAGTCGGTTTTA GAAAAGCATATATAAAAGGGGGGATTATTGGTAATGATTTAAATAATTCTTCAGAACATATATACTATTTAAATG CGACTGAGATTAGCAATTTAATAAATGGTGATGTTGCATATTGTTTTAAAAAAGAAAGTTTGGTAAAAAATCCAT T С С С С C GTATAGAAGAT GAAAAAT Τ T GT T С CAGAAT TATATAT Τ T G GAATAAAATAAC T GACAAGG C GAAGAT T C GATTTAACATAAGCAAAGTTATATATCTTTGTGAGTATCTTGATGATGGTCTTTCTAAAAATTTCCATAACCAGC Τ ΤAAAAAATAC С CAAAG G G GT Τ TAAGAT Τ TAT TACAAAGAT CAAAGAAAAC GAGAGAAAAC Τ TATATAAAAAAAA CAAAGATGCTAATTAGATATTTGCAATGTTGTTATTATGAGAAAATAAAATGAAAATACTATTTGTCATTACAGG TTTAGGCCTTGGAGGTGCTGAGAAGCAGGTTTGTCTTTTAGCTGATAAATTAAGTTTAAGCGGGCACCATGTAAA GATTATTTCACTTGGACATATGTCTAATAATAAAGTCTTTCCTAGCGAAAATAATGTTAATGTCATTAATGTAAA TATGTCAAAAAACATTTCTGGAGTTATAAAAGGTTGTGTCAGAATTAGAGATGTTATAGCTAATTTCAAACCAGA CATTGTACACAGTCATATGTTTCATGCAAACATTATCACTAGATTGTCTGTAATTGGAATCAAAAACAGACCTGG TATTATATCAACTGCACATAATAAAAATGAAGGTGGGTATTTCAGAATGCTCACATATAGAATAACCGATTGTTT AAGTGATTGTTGTACAAATGTTAGCAAAGAAGCAGTGGATGAGTTTTTACGGATAAAAGCCTTTAATCCCGCTAA

- 90 046206

AGCAATTACTATGTATAATGGGATAGATACCAATAAATTTAAATTTGATTTATTGGCAAGGAGGGAAATTCGAGA CGGTATTAATATAAAAAATGATGATATATTATTACTTGCTGCAGGTCGTTTAACGTTAGCTAAAGATTATCCTAA TTTATTGAATGCAATGACTCTGCTTCCTGAACACTTTAAACTTATTATTATTGGTGATGGTGAATTGCGTGACGA AATTAATATGCTTATAAAAAAATTGCAATTATCTAATAGGGTGTCCTTGTTGGGAGTTAAAAAAAATATTGCTCC CTATTTTTCTGCATGTGATATTTTTGTTCTCTCTTCTCGTTGGGAAGGATTTGGATTAGTCGTGGCAGAAGCTAT GTCATGTGAGCGAATTGTTGTTGGCACGGATTCAGGGGGAGTAAGAGAAGTTATTGGTGACGATGATTTTCTTGT ACCCATATCTGATTCAACACAACTTGCAAGCAAAATTGAAAAATTGTCTTTGAGCCAGATACGTGATCACATTGG TTTTCGGAATCGTGAGCGTATTTTAAAAAATTTCTCAATAGATACTATTATTATGCAGTGGCAAGAACTCTATGG AACTATAATTTGCTCAAAACATGAAAGGTAGATTTATATTTGGAACGTGTCTTTTGTTTGAATTTAATTCAATCT CAATTGAGATTTTTGTATTTCAAAAATACCATCATAGCTAACGATGATTGGTATTTATTTTAAGATGCTTTCTAT AAATATATTGACGTTTTTAATGCGCCGAAACGATTGGGCTGGGAACAGAGAAGTAAAACTGTTTTGAGAATGAAG AGT T T T T GAGAT GTT TAT GGATAT TAAAAAT T GAT C CAGT GAAT TAAT TAT T TATAATAAAT CAAGAT T TAAT GT TAATAAATGATAATCTTTTCTGACACTCATATTAATTATGAGTGGTACGTTTGGTAAACGGTAAACTATTATATG ACAGCTAGAACAACTAAAGTTTTGCACTTACAATTACTCCCACTCTTAAGTGGCGTTCAAAGGGTAACATTAAAC GAAATTAGTGCGTTATATACTGATTATGATTATACACTAGTTTGCTCAAAAAAAGGTCCACTAACAAAAGCATTG CT GGAATAT GAT GT C GAT T GT CAT T GTAT С С С C GAACT TAC GAGAGAAAT TAC C GTAAAGAAT GAT T T TAAAGCA TTGTTCAAGCTTTATAAGTTCATAAAAAAAGAAAAATTTGACATTGTGCATACACATTCTTCAAAAACAGGTATT TTGGGGCGAGTTGCTGCCAAATTAGCACGTGTTGGAAAGGTGATCCACACTGTACATGGTTTTTCTTTTCCAGCC GCATCTAGTAAAAAAAGTTATTACCTTTATTTTTTCATGGAATGGATAGCAAAGTTCTTTACGGATAAGTTAATC GTCTTGAATGTAGATGATGAATATATAGCAATAAACAAATTAAAATTCAAGCGGGATAAAGTTTTTTTAATTCCT AATGGAGTAGACACTGATAAGTTTTCTCCTTTAGAAAATAAAATTTATAGTAGCACCTTGAATCTAGTAATGGTT GGTAGATTATCCAAGCAAAAAGATCCTGAGACATTATTGCTTGCTGTTGAAAAACTGCTGAATGAAAATGTTAAT GTTAAGCTGACACTTGTAGGAGATGGTGAACTAAAAGAACAGTTAGAAAGCAGGTTCAAACGGCAAGATGGACGT ATAATTTTTCATGGATGGTCAGATAACATTGTTAATATTTTAAAAGTTAATGATCTTTTTATATTACCTTCTCTT TGGGAGGGTATGCCATTAGCAATTTTAGAAGCATTGAGCTGTGGACTTCCATGTATAGTCACTAATATTCCAGGT AATAATAGCTTAATAGAAGATGGCTATAATGGTTGTTTGTTTGAAATTAGAGATTGTCAGTTATTATCTCAAAAA ATCATGTCATATGTTGGTAAGCCAGAACTGATTGCACAGCAATCTACCAATGCACGATCATTTATTCTGAAAAAT TATGGATTAGTTAAAAGAAATAATAAGGTCAGACAGCTATATGATAATTAAGAGCTCGGTACCCGGGCCTAGGGT GTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATAT TCATATCCGTCGACGGCGGCCGCCCTGCAGGCATGCAAGCTTGATCCATATGGATCGCTAGCTTAATTAAATAAA GCCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATACTTTAATAAGTACTTTGTATACTTATTTGCGAACATTCCA GGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATGTCCAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGG TATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTC CCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTT TGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGA TTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGTAACACCTTCTTCCAGGACACTATTCG TCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACCGGTGTTTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCT GAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTGGTAGCACCGATCCTGACCAAAATCGC CGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGT TCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTATTCTCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCT

- 91 046206

CACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGACATCAC CAAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCGGCTAACAA AGGTACGGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCGCTGTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTT TGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAAGTTCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCC AGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTATCTGGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCA GGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAACTACGGCGAAATCGCGAAGATTTT CCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAAAAAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCACAGATCGC TAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCAGGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTA TGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCCTATTACGACAGCTACCGTGCTGCTGT TCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCATACTTATAAGCGTATTGATAAAGAAGG TGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 18 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 025В - штаммпродуцент О25В-ЕРЛ stGVXN4459)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGCTAGCAGT GAAGATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCTGCTGTTGTTCGTCACATAATAAATAATACGCAAGA TAGTGTTGTTAATGTCGATAAATTAACATACGCCGGAAACCTGGAATCACTTGCAGATGTTTCTGATTCTGAACG CTATTTCTTTGAACATGCGGATATTTGTGATGCAGCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGC AGTGATGCACCTGGCAGCTGAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATAT TGTGGGTACTTATGTCCTTTTAGAAGCGGCTCGGAATTATTGGTCTGGTCTGGATGATGAAAAGAAAAAAAACTT CCGTTTTCATCATATTTCTACTGATGAGGTGTATGGTGACTTACCCCATCCGGATGAAGTAAATAGCAATGAAAC GTTGCCGCTATTTACGGAAACGACAGCATACGCGCCAAGTAGTCCATATTCTGCTTCTAAAGCTTCCAGCGATCA TTTGGTTCGCGCATGGAAACGTACTTATGGTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTATGGTCCTTA TCATTTCCCGGAAAAGCTTATTCCACTGGTTATTCTTAATTCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATTTATGGCAA AGGAGATCAGATCCGCGACTGGTTGTATGTAGAGGATCATGCTCGAGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAA

- 92 046206

AGCGGGCGAAACTTATAACATTGGTGGACACAACGAAAAGAAAAACATCGACGTAGTGTTCACTATTTGTGATTT GTTGGATGAGATAGTCCCGAAAGAGAAATCTTACCGCGAGCAAATTACTTATGTTACCGATCGTCCGGGACACGA TCGCCGTTATGCGATTGATGCTGAGAAGATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGTGG GATTCGTAAAACGGTGGAATGGTACCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATC GTGGATTGAACAGAACTATGAGGGCCGCCAGTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAGGTTGG GAACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGTAATTTGATTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTGTGGTGAT TTTAGTAATCCTGAAGGTGTAGCTGAAACCGTAAGAAGCATTCGGCCTGATATTATTGTCAACGCAGCCGCTCAC ACCGCAGTAGACAAAGCAGAATCAGAACCGAAGTTTGCACAATTACTGAACGCGACGAGTGTCGAAGCGATCGCG AAAGCAGCCAATGAAGTCGGCGCCTGGGTTATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCCGGGGACCGGTGAAATA CCATGGCAGGAGGAGGATGCAACCGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCGGGAGAAAAAGCATTA CAAGAGCATTGTGCGAAGCACCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCAGGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAA ACAATGTTGCGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTATTAATGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCA GAGTTACTGGCTGATTGTACGGCACATGCTATTCGTGTGGCACTGAATAAACCGGAAGTCGCAGGCTTGTACCAT CTGGTAGCTAGTGGTACCACAACGTGGCACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATT CCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAACAACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATAACTCT CGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCGTGAAACGAATG CTTAACGAATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGCATCTTGTTCGTAATGGTGGAGCAAGATGTATT AAAAGGAATGATGAAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTGGCGGGTGGTTCTGGTACTCGTCTTTATCCTGTG ACGATGGCCGTCAGTAAACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGATGATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATG TTAGCGGGTATTCGCGATATTCTGATTATCAGTACACCACAGGATACTCCTCGTTTTCAACAACTGCTGGGTGAC GGGAGCCAGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAGTGCAACCGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCGTTTATTATC GGTGAAGAGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTACTTGGTGATAATATCTTCTACGGCCACGACCTGCCG AAGTTAATGGACGTAGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCTGAACGT TATGGTGTCGTGGAGTTTGATAATAACGGTACTGCAATTAGCCTGGAAGAAAAACCGCTGGAACCAAAAAGTAAC TATGCGGTTACTGGGCTTTATTTCTATGACAATGACGTTGTGGAAATGGCGAAAAACCTTAAGCCTTCTGCCCGA GGTGAACTGGAAATTACCGATATTAACCGTATTTATATGGAACAAGGACGTTTGTCTGTCGCTATGATGGGGCGT GGCTATGCATGGCTGGATACAGGGACGCATCAAAGTCTTATTGAAGCAAGCAACTTCATTGCCACCATTGAAGAG CGCCAGGGACTAAAGGTTTCCTGTCCGGAAGAAATTGCTTATCGTAAAGGGTTTATTGATGCTGAGCAGGTAAAA GTATTAGCCGAACCGTTGAAGAAAAATGCTTATGGTCAGTATCTGCTCAAAATGATTAAAGGTTATTAATAAGAT GAACGTAATTAAAACTGAAATTCCTGATGTGCTGATTTTTGAACCAAAAGTTTTTGGGGATGAACGTGGCTTCTT TTTTGAGAGTTTTAATCAGAGGATTTTTGAAGAAGCAGTAGGTCGTAAGGTTGAGTTTGTTCAGGATAACCATTC TAAGTCCAGTAAAGGTGTTTTACGTGGTCTTCATTATCAGTTAGAACCTTATGCTCAAGGAAAACTGGTGCGCTG TGTTGTTGGCGAGGTTTTTGATGTTGCGGTTGATATTCGTAAATCGTCACCTACATTTGGGAAATGGGTTGGGGT GAATTTGTCTGCTGAGAATAAGCGTCAGTTGTGGATTCCTGAGGGATTTGCACATGGTTTTTTGGTGCTGAGTGA TTTAGCAGAAGTTTTATATAAAACGAATCAATATTATGCTCCATCACATGAAAAAAATATTATATGGAATGACCT CTTGCTTAATATTAAATGGCCGAGCACAGCACTGATCACTCTGTCTGATAAGGATGCAAATGGGGAAAGATTTGA ACTAAGTGAGTTTTGAAATGTCTCTCTTAAAACATAGTATATGGAATGTTGCGGGCTACTTTATACCAACATTAA TTGCAATTCCCGCCTTTGGATTAATTGCGAGGAAAATTGGTGTAGAACTATTTGGTTTGTATACGTTAGCAATGA TTTTTATAGGGTATGCAAGTATATTTGATGCTGGGTTAACAAGAGCTGTTGTGCGTGAAATAGCATTACTAAAAA ACAGAGTGGACGATTGTAATACGATAATAGTAACTTCTATTATCGCTGTGATATTTTTAGGGTTTATCGGAGGCG

- 93 046206

GGGGAGTGTTTCTGCTTAAAGGCGATATTATTGAACTGTTAAATATCTCACCAATATATTACGCCGATTCGATAA AGTCTCTAGTATTATTATCATCTCTGATACCTGTATTCTTAGTCACGCAAATACTATTAGCAGAGCTTGAGGGTC GGGAATATTTTGGGATTCTAAATATACAAAAAAGTGTAGGGAATTCTTTAATTGCAGGGTTACCTGCATTATTTG TTTTAATTAATCAAACGCTTTTTTCTGCAATTATTGGTGTAGCGATTGCAAGAGTTATATGCTTGTGGTTAAGCT ACATTATGAGCAGGGAAAGAATAACTATCGATATCTCATTTTTTTCAATAACTGTTTTAAAGCGGTTATTTAGAT ATGGCGGGTGGGTAACTATAAGTAACATAATATCTCCTATATTAGCGAGTATGGATAGATTTATTCTATCCCATA TCCAGGGAGCATCAAAAATATCATTCTATACAGTCCCTAATGAGCTGGTAACTAGGCTTGGAATAGTTCCAGGCT CTCTTGGGAAAGCTGTTTTTCCAAAATTAAGTCATGCAAGGAATTTTACAGCGTCATATGCAGAGCAAAAAAAAG CTTATATATTAATGACTGTCATTGTAATGCCTTTGGTTTTATTTGTATATTATTACGCAAAGTTTATTTTAACAT TGTGGATGGGGGCTGAGTATGCAGGGATTTCGGTCGAAATATTACGGATTATGCTTATAGGGTATATTTTTAACT GTTATTCACAAATCTCTTTTGCCAACATACAGGCCTTTGGAAAAGCAAAATACACTGCATACATCCATATGATGG AATTTATTCCTTATTTGATAATGTTATATATAATTTCAAAGGAATATGGGGTTATTGGTGTTGCGTGGTTATGGA CAATTCGAGTAATAATTGATTTTTTGATGCTTTTATATATGAGTTATCGTTGTAATAATCTTATGAAAAAAGGGT AGCCTGATGATATATATTGTGGTATTAAATTGGAATGGGGCTATAGATACCATTAATTGTGTTAAAAGTTTAATG GAT T TAAAT GT TAGC GAT TATAAAAT TAT CAT T GT T GATAACT GT T CTAT G GATAACT CATAT GATACTATAAAA GAAAATCTTAATTCATTATATATTGCTGATAAAAGTATCATTGAGGTGAAGTATGAGGATAGAAATAAATATAAA ACCTTAGAAAACGATAAAATCATATTAATACAATCTCCGCAAAATAATGGGTACGCAAGTGGTAATAATATTGGC ATAGAGTTCGCTCTTAATCAGGAGAATATGAAATACGTCTGGGTTCTGAATAATGATACTGAAGTGGATAAAGAG GCTTTAACTCATTTAATTAGTAAATGTGATTCAGATAAAAGTATAGGGATTTGCGGTTCTCGTTTAGTCTATTTT GCCGACAGAGAGATGCAGCAAGGACTAGGTGGGGTGCATAACAAATGGTTATGCACTACAAAAAATTATGAAATG GGAAGAT TAGT T T CCAAAAAATAT GAT GAT GAAGT CAT TAGTAAT GATATAGAT TATATAAT T GGC GCAT C GAT G TTTTTCTCTAGAGAATGTTTGGAAACAGTTGGATTGATGAATGAAGAATATTTTTTATACTATGAAGAGTTAGAT ATTTGCCTCAGAGCAAAAGCAAAGAACTTTAAATTAGGTATTTGCTCAGAAAGTTTGGTTTATCATAAAATAGGT GCAAGTACTGATGGGGGAAAGAGCATGATGGCTGATCTTTGCTCAATAAAAAATAGGCTGGTCATTACAGAAAGG TTTTATCCCCAATATTATTGGACGGTATGGTTGTCACTTTTTGTTGTAGCATTTAACCGTGCTAGAAGAGGTGAG T T T AAT AAGAT GAAAAGAT GT T T GAAT GTTATGTTTAACTT С AAAC GAAAC AAAG GT AG C AAAT G C CAT T AGAAT ATGCACTTAATCATGGTGTTAATAAATCTATAGTTTGATATGTTATTAAAGGGTATTTAATGAAAGTGGCTTTTT TATCTGCTTATGATCCACTATCTACATCCAGTTGGTCTGGCACACCTTATTATATGCTAAAGGCATTATCGAAGA GAAATAT T T C CAT T GAAATAT TAGGAC C GGTAAATAGCTATAT GATATACAT GT TAAAAGTATATAAAT TAATAT TAAGGTGTTTCGGAAAAGAATATGATTATAGTCATTCGAAGTTGCTTTCCAGGTATTACGGTAGAATATTCGGTA GGAAATTAAAAAAAATTGATGGTTTGGATTTTATTATCGCACCTGCAGGTTCCTCACAAATTGCTTTTTTAAAAA CAACCATACCAATAATATATCTATCGGATACAACATATGATCAATTAAAAAGCTATTATCCGAATTTAAATAAAA AAACAATTATAAATGATGAGGATGCAAGTTTAATCGAACGCAAGGCTATTGAAAAAGCAACAGTAGTATCTTTCC CATCTAAATGGGCAATGGATTTTTGCAGGAATTATTACAGATTAGATTTTGATAAATTAGTTGAAATACCATGGG GGGCTAATTTATTTGATGATATTCACTTTGCTAATAAAAATATAATTCAAAAGAATAGTTATACTTGTCTTTTCT TGGGAGTTGATTGGGAAAGAAAAGGTGGGAAAACAGCCTTGAAAGCAATTGAATATGTAAGGCAGTTATATGGGA TCGATGTTAGACTAAAAATTTGTGGATGTACTCCGAATCAAAAGATTTTACCTACTTGGGTTGAATTAATTGATA AAGTAGATAAAAATAACGTTGACGAATATCAGAAATTCATCGATGTGTTATCTAACGCTGATATACTTCTTTTAC CAACCATTGCTGAATGTTATGGAATGGTATTTTGTGAAGCTGCTGCTTTTGGATTGCCTGTTGTCGCTACAGATA CAGGTGGAGTCAGTTCTATAGTTATCAACGAAAGGACGGGGATATTAATTAAAGACCCGTTAGACTATAAGCACT

- 94 046206

TTGGAAATGCAATTCATAAAATAATTAGTTCCGTAGAGACTTATCAAAACTACTCCCAAAACGCAAGAATTAGAT ATAATAATATATTGCATTGGGACAATTGGGCTAAAAAGATAATTGAGATTATGTATGAGCATAAGAATAGAAGAA TСAAATAGCACAAAAAGAATTATATGTTTATTTATACTTTTTСTTGTTTTСССTGATTTTTTGTTTTATACATTA GGGGTTGATAATTTTAGCATTTCAACGATAATCTCAATTACATTGCTTTTTGTTTTTTTAAGAGCTAAAAATATT TGCAAAGATAATTTTCTAATAATAGTAGCGTTATTCATATTGTTGTGTTTTAACTGTTTGTTAAGTATGCTATTT AATATTGAACAGGCTTTAACATTTAAAGTTGTACTTTCAATATATAGCATCTTAATAATGGCATACGTCTCCTCT TGTTATGCACAGACGTTGTGGTTATGTTCTGAAGAAATACTTAAGAGATCCGTCTTTTATTTGTTCGCATTTCTT TGCCTTATTGGCATTATAAGTATTCTTTTACAGAAGACTGAGATTATACATGATAAAAGTATGATTCTTTTTCCT GAACCATCAGCATTTGCATTGGTTTTTATACCTATCTTTTCATTTTGTTTATACTATACAAGAGGGGGGGGGCTA CTATTGCTCTATATATTATCTTTGGGTATTGCGTTAGGTATCCAGAATTTAACAATGTTGGTAGGCATTGTGATT AGTGTTTTTGTGATGAAAAAAATAACTATAAGGCAAACTATTGTTATACTTTTGGGGGCATGGATTTTTTCCATG ATATTAAGTGATTTAGACATTTCTTACTATACATCGCGGCTTGATTTTAAAAATACTACGAACCTATCAGTGCTT GTATATCTTTCAGGAATTGAAAGAGCTTTCTTGAATTTTATTACAAGTTATGGTCTTGGTATTGGTTTTCAACAA ATGGGAGTGAATGGGGAGATAGGAATATATCAACAAATTTTAGCTGAACTTGATGCCCCTATGTTAAATATATAC GATGGCTCATTTATTTCTTCTAAGTTAATATCTGAGTTTGGGGTTATTGGTGCATTAATGTGTATTTTCTATTTT TTTTATTTTTCCCGATTTTATCTGCGTTTCAAAAAAAGTAAGAGATATTCACCGCAGTATATTTTAGCATATAGC TTCTACATGTGTTTCTTCATCCCTCTTTTTATACGTGGTGCTGGTTATATAAACCCCTATGTGTTTATGTTATTT TCATCAATATTTTTGTGCAAATATCACGCTAAAAATATCTTGATGAAATCTAATGTCCAGATAGCTATATAATAG TAGAT TATAT TAT CAT TAT CAC GTAAAT TAGATAT TAATAG CATATAT GATAAC TAG GACATAAATAAT GT G CAT TAAAAAAAAACTTAAGTTAATTAAACGATATGGCCTTTATGGTGGTCTTAGGCTTCTTAAAGATATATTCTTAAC AAAATTTTTATTTTGTT CAAAT GTTAGGATTAT TAGATTT CCAT GTTATAT TAGAAAAGAT GGAAGT GTTAGTTT TGGAAAAGGTTTTACATCAGGTGTAGGATTACGAGTTGATGCATTTATGGATGCCGTAGTTTCCATTGGAGAAAA TGTTCAAATTAATGACTATGTTCACATCGCGGCTATTAATAATGTCATTATTGGTAGAGATACATTAATAGCAAG TAAAGTAT T TAT TAGT GAT CATAAT CAT GGTAT T T T T T CTAAAT С C GATAT C CATAGT T САС CAACTAT TAT T С C TTCGTCTAGGCCCCTTGAATCTGCACCTGTGTATATTGGAGAGCGTGTGTGGATTGGCGAAAATGTGACAATATT ACCAGGTGCGTGTATAGGTAATGGTGTAGTTATTGGCGCAAACAGTGTTGTTCGTGGTGAGATTCCTAATAATGT GATCATTGCTGGTGTTCCAGCTAAAATTGTTAAAAAATATAACTATGAGCGTATGCAATGGGAAAGAATATAGTT GTAATATCGGCTGTTAATTTTACAACCGGAGGCCCCTTTACCGTACTAAAAAATGTGCTTACAGCAACTAAAGAT AGAGCCGAATGTAAATTTATTGCACTGGTTCATAGCTCTGCTGAACTAATGGAATTATTTCCGTGGGTTGAATTT ATAGAGTATCCAGAAGTCAAGTCTTCGTGGGTTAAAAGATTATATTTCGAATATATAACTTGCAATAGATTATCT AAGGTGATTAAGGCAACTCATTGGGTATGCTTACATGATATTACAGCAAATGTTAGTGTACCCTATAGATTTGTT TATTGCCACAATCCTGCACCGTTCTATAAATATTTAAGCTATCGAGATATTATAGGAGAACCTAAATTTTATCTT TTTTATCTTTTTTATGGGCTTTTATACAATATCAATATAAAAAAGAACACAGCAGTTTTTGTTCAGCAGCAGTGG CTAAAAAAAGAATTCGAAAAAAAATATAAGTTAAAGAATGTTGTTGTTAGTCGCCCTGAAGATATTTGCCCTTTT GAAAGTGATGGTTTGGTAAGAAATAATAATAAAAAGGATGTGAGGATATTTTACCCAGCAGTGCCCCGTATATTT AAAAACTTTGAAGTTATCATACGTGCTGCACAAATATTACAAGATAAAAATATTCATTTTTATCTTACTTTTGAT GGTACTGAAAATAAGTATGCAAAAAGAATATATAAATTAGCTTCCGAACTGAAAAATGTACATTTCCTCGGTTAC CTTAATGCAACCGAGATGGTTAACTTTTATCAAGATTCAGATATTATTTGTTTCCCATCGAAACTAGAAACGTGG GGATTACCATTATCAGAAGCTAAAACATACAAAAAATGGATATTTGCGGCAGACTTACCTTATGCTCATGAAGTT TTATATAACTATTCAAAAACTAGATATTTTCCATTTGACGATGAGAAAATACTTGTTCGCTACATATTAGAGTAC

- 95 046206

ACAAGTAAAAATATGCATGAAGATATAAAAAATAGTAGGGTGAATTTTAATAATGATGCATTGACTGGTTTTGAA CAGTTTATTGAATATATCCTCAAGGGGAACTGACGTGGTTTATATTATAATCGTTTCACATGGCCATGATGACTA TATAGAAAATCTTTTATTAAATTTAAAGTTGCCCTCTGGAAGATTTAAAATAATAGTTCGTGATAACAAAAGTTC AATGGTTTTAAAAAAAACATGCGAAAAAAATTGCGTAACCTATTTGCATGGAGGGCAATATGGATTTGGACATAA TAATAACATAGCAGTGTCATATATAATTAATAACTTCATGATTATGAATAATGATTATTTTCTCTTTCTTAACCC C GAT GTAT T CATAAC CAGT GAAAGT T T GAT TAAT TAT GTT GAT TATATAAT TAGTAAT GAT TATAAGT T TAGCAC ATTATGTCTTTATCGAGATTTTACTAAAAGCAAACATGATTATTCAATACGGAGTTTTCCAACTTTATATGATTT TCTTTGTTCTTTTTTATTGGGGGTGAATAAAAGTAAAATTAAGAAGGAAAATATACTTTCTGATACTGTAGTTGA TTGGTGTGCTGGCTCATTTATGCTTATTCATGCTTTAAGTTTCTTAAATGTGAATGGTTTTGATCAAAAATATTT TATGTATTGTGAAGATATTGACCTTTGTATGCGTTTAAAATTAAGTGGAGTAGATCTTTACTATACTCCCCATTT TGATGCTATTCATTATGCGCAGCATGAAAATAGAAGAATATTTACTAAAGCATTTCGATGGCATATAAGGAGTAT TACGCGCTACATATTACGGAAACCAATTCTTTCTTATAAAAACTATAGAAAAATTACATCCGAACTGGTAAAGTG ATTAAGGATCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAA CTAAGGAGGATATTCATATGGATAAAGCCGTAAGCATATAAGCATGGATAAGCTATTTATACTTTAATAAGTACT TTGTATACTTATTTGCGAACATTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATG TCCAAGCAACAGATCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGT TATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTG GTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTTGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCA GGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGT AACACCTTCTTCCAGGACACTATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACCGGT GTTTCTGGCGGTGAAGAGGGGGCGCTGAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTG GTAGCACCGATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGAT GGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTAT TCTCTGCTTAAAGGTGGCCTGAACCTCACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAA CTGAGCAGTTACCTGATCGACATCACCAAAGATATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGAT GTGATCCTGGATGAAGCGGCTAACAAAGGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCG CTGTCGCTGATTACCGAGTCTGTGTTTGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAA GTTCTCTCTGGTCCGCAAGCACAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTAT CTGGGCAAAATCGTTTCTTACGCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTG AACTACGGCGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGAAAATCACCGAT GCTTATGCCGAAAATCCACAGATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAG CAGGCGCTGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCC TATTACGACAGCTACCGTGCTGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCAT ACTTATAAGCGTATTGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

SEQ ID NO: 19 (пример нуклеотидной последовательности локуса rfb 075 - штаммпродуцент 075-ЕРА stLMTBLl 737)

ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTCGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATACCC AAAGAGATGCTACCAATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATTGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAA GAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAGTTAGAATCA CTCCTTGAGCAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATCTGTCCGCCGGGCGTGACCATTATG

- 96 046206

AACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTAGGCCACTCCATTTTGTGTGCGCGACCTGCCATTGGTGACAACCCA TTTGTCGTGGTACTGCCAGACGTTGTGATCGACGATGCCAGCGCCGACCCGCTACGTTACAACCTTGCTGCCATG ATTGCACGTTTCAACGAAACGGGCCGCAGCCAGGTGCTGGCAAAACGTATGCCGGGTGACCTCTCTGAATACTCC GTCATCCAGACTAAAGAGCCGCTGGACCGTGAGGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGAT CAGCCGCAGACGCTGGACTCAGACATCATGGCCGTAGGTCGCTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCGGAACTG GAACGTACTCAGCCTGGTGCATGGGGACGTATTCAGCTGACTGATGCTATTGCCGAGCTGGCGAAAAAACAATCC GTTGATGCAATGCTGATGACCGGCGACAGTTACGACTGCGGCAAAAAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAAG TATGGCCTACGCAACCTGAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGTATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAA TCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAAATTCGCAGCAAAAGTAATTTGTTGCGAA TCTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACCATCAGAATAACAACGAGTTAGCAGTAGGGTTTTATTCAAAGTTTTCCA GGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCGTTTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTA ACGCTCGTCACATCATAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATAC CTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGCTAGCAGT GAAGATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCTGCTGTTGTTCGTCACATAATAAATAATACGCAAGA TAGTGTTGTTAATGTCGATAAATTAACATACGCCGGAAACCTGGAATCGCTCGCTGAAATTTCTGATTCTGAACG TTATTCATTTGAGCATGCAGATATCTGCGATGCCGAAGCGATGGCTCGTATTTTCGCACAGCACCAGCCAGACGC GGTGATGCACCTGGCAGCAGAGAGCCACGTTGACCGCTCAATAACTGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATAT TGTGGGTACTTATGTTCTTTTAGAAGCGGCGCGCAATTATTGGTCTGGTCTGGATGATGAAAAGAAAAAAAACTT CCGCTTTCATCATATTTCTACTGATGAGGTGTATGGTGACTTACCCCATCCGGATGAAGTAAATAGCAATGAAAC GTTGCCGCTATTTACGGAAATGACAGCATACGCGCCAAGTAGTCCATATTCTGCTTCTAAAGCTTCCAGCGATCA TTTGGTTCGCGCATGGAAACGTACTTATGGTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTATGGTCCTTA TCATTTCCCGGAAAAGCTTATTCCACTGGTTATTCTTAATGCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATTTATGGCAA AGGAGATCAGATCCGCGACTGGTTGTATGTAGAGGATCATGCTCGAGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAA AGCGGGCGAAACTTATAACATTGGTGGACACAACGAAAAGAAAAACATCGACGTAGTGTTCACTATTTGTGATTT GTTGGATGAGATAGTCCCGAAAGAGAAATCTTATCGTGAGCAAATTACCTATGTTGCTGATCGCCCAGGGCATGA TCGCCGTTATGCAATTGATGCCGATAAAATTAGCCGCGAATTGGGCTGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGCGG GATTCGTAAAACTGTGGAATGGTATCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATC GTGGATTGAACAGAACTATGGGGGCCGCCACTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTTGGTTGG GAACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGTAATTTGATTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTGTGGTGAT TTTAGTAACCCTGAAGGTGTGGCTGAAACCGTTAGAAGCATTCGGCCTGATATTATTGTCAACGCAGCCGCTCAC ACCGCAGTAGACAAAGCAGAATCAGAACCGGAGTTTGCACAATTACTGAACGCGACGAGTGTCGAAGCGATCGCG AAAGCAGCCAATGAAGTCGGCGCTTGGGTTATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCCGGGGACCGGTGAAATA CCATGGCAGGAGGAGGATGCAACCGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCAGGAGAAAAAGCATTA CAAGAGCATTGTGCGAAGCACCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCAGGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAA ACGATGTTGCGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTATTAATGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCA GAGTTGCTGGCTGATTGTACGGCACATGCCATTCGTGTGGCACTGAATAAACCGGAAGTCGCAGGTTTGTACCAT CTGGTAGCCAGTGGTACCACAACCTGGCACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATT CCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAACAACAGTCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATAACTCT CGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGTGTGAAACGCATG CTCAACGAATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGCATCTTGTTCGTGATGGTGGAACAAGATGAATT

- 97 046206

AAAAGGAATGATGGAATGAATACGCGTAAAGGTATTATTTTAGCGGGTGGTTCTGGTACACGTCTTTATCCTGTG

ACTATGGCTGTCAGTAAACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGATGATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATG

TTGGCGGGTATTCGCGATATTTTGATTATCAGCACGCCACAGGATACTCCTCGTTTTCAACAACTGCTGGGTGAT

GGGAGCCAGTGGGGGCTAAATCTTCACTACAAAGTGCAACCGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCATTTATCATC

GGTGAAGAGTTTATCGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTACTTGGTGATAATATCTTCTACGGTCACGACCTGCCT

AAGTTAATGGATGCCGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCTGAACGC

TATGGTGTCGTTGAGTTTGATAAAAACGGTACTGCAATCAGCCTGGAAGAAAAACCGTTACAACCAAAAAGTAAT

TATGCGGTAACCGGGCTTTATTTCTATGATAACTACGTTGTGGAAATGGCGAAAAATCTTAAGCCTTCTGCCCGC

GGTGAACTGGAAATTACCGATATTAACCGTATCTATATGGAACAGGGGCATTTATCTGTTGCCATGATGGGACGT

GGATATGCCTGGCTGGACACGGGGACACATCAAAGTCTTATTGAAGCAAGCAACTTCATTGCCACCATTGAAGAG

CGCCAGGGCTTGAAAGTTTCCTGCCCGGAAGAAATTGCTTACCGTAAAGGGTTTATTGATGCTGAGCAGGTGAAA

GTATTAGCTAAACCGCTGAAAAAAAATGCTTATGGTCAGTATCTGCTAAAAATGATTAAAGGTTATTAATAAAAT

GAATGTTATTAAAACAGAAATTCCAGATGTACTGATTTTTGAACCGAAAGTTTTTGGTGATGAGCGTGGTTTCTT

TATGGAAAGCTTTAATCAGAAAGTTTTCGAAGAGGCTGTAGGGCGGAAGGTTGAATTTGTTCAGGATAATCATTC TAAATCGTGTAAAGGTGTACTTAGAGGTTTACACTTTCAGCTTCCTCCCTTTGAGCAGGCAAAATTAGTAAGGTG TATAGTTGGCGAGGTATTTGATGTTGCAGTAGACATTAGACCTAATTCTGAAACATTTGGTTCATGGGTTGGAGT AACTCTTTCGTCAGAAAATAAAAGGCAGCTATGGATTCCAGAAGGATTCGCCCATGGTTTTTTAACTTTAAGTGA TATTGCAGAGTTTGTTTATAAAACTAACAACTATTATTCTTTAAATCATGAAAGGGGAGTCATTTGGAACGATGA GGAAATTAACATTGCCTGGCCCTCTCAATCAGAGAAGATTCTGTCACAGAAAGATATTAATTTACCATCATTTAG

ATTTGTTCAAATGTTTAGCAAGTAGTGTTATCTTTACACTGCACATAGTCATCATTTTTTATGCTTTAAGTAAAT TATATTGCACATCTATAACACAAAGCGCAATAATATTTCGACCTGATGAAGGTTTGTGGTTATTTATCTTTCTAG GCGTTTTTTATGACTAAAATAGTTGTGGTTTCTACAGCTCCAATATTCCCGACAAATAATGGGTACAAAAGTTCT GTATTAGGAAGAATTGATGAGTTATTAAATGAGGATAATGAGGTCGTTTTGATTGAAATAAACCTTGAAAATGTT AC G GAAAAGAAAGAT GAAT TAATAC СAACAAGAT T TAATAATAT T CAAAGATAT GAAGTAAAAAAAATAT С TAGA TCATTTATTGCCGAGTTACAAATATTATTTGATATCAGAACTCGGTATGAACAATTATTTTCTTCTGCTGACATT AGAGATAACATAAAAAAGATAATTGATTTAGAAAAACCTTCTATTATTATTGCTGAGTCTATATGGGCGTTGCAA GCATTGCCTATTGAAATTAGTGCGAGAATACACTGTGTTATTCATGATGTGGCAACTGATTTCTTTAAAGAAATG T T T GTAT CT CATAAT GAGGT T GTAC GAAAAAT TTTGTTTTT TAAT GAT TAC CTAAAGT T GAAAAT TACT GAAGAA AATAT TAT СAAAC GT T T GAGAGT T GAG CAAT TTATCTTTCT GACAGAAGAAGATAAAT GT T G GTATAAAACAAGA TACAATATTGATGAGGGTTGTTGTTCCTTAGCGAGCAATCATCTTTATGTAGAAAAGATTAAGAGAACTATCAAT TTCCAAACCCCTTTCCTGCTTATTCCCGGTAGCATTGAATTTTCACAAAATTTTTACGGCTTAAATTGGTTTATA AAAAATATATATCCTGGATTAAATAGGAAAATAAGAATAGTTGTAACAGGAAAGGCATCAGATAAAAAAATAAAG

ATGTTAAACTGTGGAGAGGAAATTACCTTTACGGGAGAGCTTGACTTTTCCACATATAATAAACTTAGCTCAACA

TGCTTGTGTGTTATTGCACCGATTACAACGGGCACTGGAATTAAAATAAAAATATTAGAAGCTGTACAAAAAGGT

ATTCCTGTACTTACAACAAAATTTGCTTCAAAAGGAATATGTTCCGATTTATGTTTTTATTGCGAGGAGGATACT

GACACAAACTTTGTCAATTTAATTAACAGTTTTCTTGAAACGACATTAAGAGTCCAAGAATGAATTTATTGCTTT

TTTCAGTCCTTGCGTTTGGTTTAATATTGGCTTTGGCCCATAATAATAAAAGTGGAGATATTAACGCATACTTAA

TGTTTTTTCTCGTGGTCCTAATGGTATTAATATCAGGGCTGCGTATGAATGATAGTGATTATATCGAATACAGGA

AAATGTATAATGAAGTGCCTATTTTATGTGACTTTAGTCTCGCATCTATAAGAGATATACATGGGGAGGTAGGCT

ATCTATTCTTATCATCAATCTTTAAAACTTTATGCTTGCCATTTCAATTATTTCTTTTTTTTATTGCTTTTTTAT

- 98 046206

CACTCCTGCTTACATATTTTTCATTCAGAAAAATAAGTTTAATACCGATACTATCGTTAGTTTTTTATTTAAGCC ATGCTTTTATAGTTAGAGATTTGATTCAAATTAGGGCAGGATTAGCTGTTAGCATATCATTATATTCAATAATTA AATTTAAAGGAAATAAAAGTATAATTACAGGAGTTTTATTTGCTTCTTTGATTCATTCTGGGGCGCTTATTATTG CTCTTTGTTATСCTTTTTTCAAAAAAAAATACATAACATTAAAAATGATGTTGTTTTTATTTTTAGTGTCAATTA TTTTTTCTTATTTGAATGGGCTTAATTTATCGATACAACTCTTATCTCAATATAGTTTGCTTCCAACTGCAATTT CGAATTATGTTGGTTGGGAAGAATATGATTATCGGGTGAGTATATTTACTAATCCGGTTTTTATTAAAGGTGTTT TTTTAATTGTCTTAATGCACAAATATGTACTTTCAGATATTAAAAATGAGAAAATTATAGTGCTTTATAACTTAT ATGTTTTAGGTGTATTAGCTATGGTTGCATTGAGTGGGATGGCTATTCTTTCAGGCCGTCTTTCATCCTTTCTGA CACTAGGTGAAAGCATTTTAATTGTATATGCTCTGTTCTACAAAAGAAATACACCTCTGGCGTTTCTAATTTTTT CTTTTTTAACAATTGTGCAATTAGGATATGATCTATTTATTTCTAATGTGCATCCTGAGCTTACTCTGATTATAT TT GGGT GAAT CTAAGT GAAAAATAATAAAATAGGCATACTTAT CT CTAAAATACAAAAT CTT GGACCT GT GAAT G TAGTACGAGGATTGATAAAAGAAAATAAAAAATATGCTTTTACTGTTTTTTGTTTAACAAATAGCGTAGATAAAA ATATATATGATGAGTTATGCTGTTTAGGAGCCAAGGTTATATTAATACCAGATGGTACTTGGTTCAGCAAAATTT TATTTGTGAGAAGTTTTTTAAAGGAACATCCACATAATATCTTACATTCACATGGGATCACGGCCGATATGTTTT CTTACTTTCTGAATGGCGTGAAAATATCTACTATTCACAATAGACTAGATGAGGATTATATCCCATTATTTGGCG CGGTTAAAGGGAATGCTATATATTATCTTCATCGTTTTATATTACGAAGATTTAATCATATCGTTGCTTGCTCAG CAGCGGTCCAATCAAAACTGAAACAATCGAAAGTAAAAACTAAAATAACCACCATCCAGAATGGGATTGATATAA CTAGGTTTAAGACACTTGAGTCTGATAAAAAAAAATTATTGAGGGAAAAACACGGATTTGATAGTGAAAAAAGAA TATTTATATATTGTGGCTCGTTATCATTAAGGAAAAATATTGCTTACCTCTTGGAACACTTAGCCATCGAAGAAA ATGATATATTTTTAATTCTAGGTGATGGTGAACTTTTTAGATATTGTAAGGATAAATATTCTAAAGATTTACGGT ATATATTTATGGGGAAAGTTGAATGCCCTCTTGAATATTATCAATTATCAGATATTTTTGTTTCCGCTTCTTTAT CGGAAGGGCTCCCCTTGGCACTATTAGAAGCTGCCTCTACTGGGTGCTATTTATATGTTAGCGATATAGAGCCCC ATAGAGAAATTGCATCTCTATTAGGAGAGGAAAATATTTCTATGTTTAAAATTAAGGATGGATCATATAATTATT TGCAACCTAAAATAAAAAAAGCTGACTATAACGCTCTTTCTGACGATAAACTTTACAATATATCCGATAAAAAAA TGTCAAATCTTTATGACAAACTTTTTGTTTCTTTATTAGAGCAGAGGCACTAATATAATGATTTATGTTTCGGTA ATTTCTCATGGTCATTTCAAAACTCTTAAGGAATTAGGAGCAGTATCAAAATTAAATAATCACAGCAGAATTAAA GTTATCATCAAAGATAATTTAGGAGAGAGCGAGCTTTTGGATTTTTGTCAGGAAAACAAAATAACTTATTTAAGG TCTAAAGAGAAAAAAGGATTTGGAGAGAATAATAATGAAGTTTTTTCCTCTATATCCTCCTTAATTACTAAGGAA GATTTTTTTGTGGTTATGAATCCTGATATATATATTGAGTGCTCTGATCTATTAGATGTCGTAGATGAGTGTGGT TCAGCGAATGTTAATCTAGCAACGATAAATTTATACAGGGATTTTGATAAAAAAACATATGATAACTCAGTAAGG AAATTTСССTCGGCAATTGATTTTTTTATGTCATTTTTATTTAAGAAAAATGACTGTGTAGTAAATAAGAACAAA ATAACGAAACCAACATATGTTGATTGGGCTGCAGGTTCTTTTCTAATATTTAATGCCTTCTTTTATTCAAAACTC AACGGATTCAACGAAAAGTATTTTATGTATTGCGAAGATATTGATATATGTTGGCGAGCTAAAAAACACTTCAAT ACTTCAGTTTTATACTATCCATGCTATGCAGCAATTCATTTGGCACAATTTAACAATCGTAGGATTTTTAGTAGA CATTTCATTTGGCATATAAAAAGTATTATCCTTTTTTTATTATATAAAAATGGTATGCTGCGTTCTAGTAAGTTG CTTTAATGCTAATATTCTTTTAAGAGGTGAGAATGATACCTGTTATTTTGGCTGGTGGTTCGGGAAGTCGCTTGT GGCCACTTTCACGAGAAAAGTTCCCCAAGCAGTTTTTAAAGTTGACTGGCAGTTTGACAATGTTGCAGTCAACAT TGTCACGTCTTAATAATTTAAATGCTGATGATTCAATAGTTATATGCAACGAAGAGCATAGATTTATTGTTGCAG AACAATTAAGAGAGTTAGGCAAACTTTCAAATAACATTATTCTTGAACCCAAAGGTCGTAATACAGCCCCTGCTA TAACACTCGCAGCATTAGCAGCAAAAAGAAAATTCGCTGATGAAGATCCATTGATTCTTATTTTAGCTGCAGATC

- 99 046206

ACAACATCCAAGACGAACATGTTTTCTGTGAGGCAATTAATAAGGCGTCATCTTTAGCTAGTTATGGAAAACTAG TGACTTTTGGTATCGTTCCATTCAAACCTGAAACTGGGTATGGCTATATTCGTCGCGGTGATGAAGTGCCTGTAG ATGAGCAGCATGCGGTGGCCTTTGAAGTGGCGCAGTTTGTCGAAAAACCGAATCTGGAAACCGCGCAGGCCTATG TGGCAAGCGGCGAATATTACTGGAACAGCGGTATGTTCCTGTTCCGTGCCGGACGCTATCTCGAAGAACTGAAAA AGTATCGTCCGGATATTCTCGATGCCTGTGAAAAAGCGATGAGCGCCGTCGATCCGGATCTCGATTTTATTCGTG TGGATGAAGAGGCGTTTCTCGCTTGTCCGGAAGAGTCGGTGGATTACGCGGTCATGGAATGCACGGCAGATGCCG TTGTGGTGCCGATGGATGCGGGCTGGAGCGATGTCGGTTCCTGGTCTTCATTATGGGAGATCAGCGCCCACACCG CCGAGGGCAACGTTTGCCACGGCGATGTGATTAATCACAAAACTGAAAACAGCTATGTGTACGCCGAATCTGGCC TGGTCACCACCGTCGGGGTGAAAGATTTGGTGGTAGTGCAGACCAAAGATGCAGTGCTGATTGCCGACCGTAATG CGGTGCAGGATGTGAAGAAAGTGGTCGAGCAGATCAAAGCTGATGGTCGCCATGAGCATCGGGTGCATCGCGAAG TGTATCGTCCGTGGGGCAAATATGACTCTATCGACGCGGGCGACCGCTACCAGGTGAAACGCATCACCGTGAAAC CGGGCGAAGGTTTGTCGGTACAGATGCATTATCATCGCGCGGAACACTGGGTGGTTGTCGCGGGAACGGCAAAAG TCACTATCAACGGTGATATCAAACTGCTTGGTGAAAACGAGTCCATTTATATTCCGCTGGGGGCGATGCACTGCC TGGAAAACCCGGGGAAAATAGATTTAGAATTAATTGAAGTTCGCTCTGGTGCATATCTTGAAGAAGATGATGTTA T TAGAT GT TAT GAT C GCTAT GGAC GAAAGTAATATATAATAAT TAT T T CAGAAT TAGAAAT GATAAT TATAAGT T TTCGTCTGGATAAACAATAGATAGTATGGGTTGGAAAATATGAGTTCTTTAACTTGTTTTAAAGCTTACGACATT CGCGGGAAATTAGGTGAAGAACTGAATGAAGATATCGCCTGGCGCATTGGTCGCGCCTATGGCGAATTTCTCAAA CCGAAAACCATTGTGTTAGGCGGTGATGTCCGTCTCACCAGCGAAACCTTAAAACTGGCGCTGGCAAAAGGTTTA CAGGATGCGGGCGTCGATGTGCTGGATATTGGCATGTCCGGCACCGAAGAGATTTATTTCGCCACGTTCCATCTC GGCGTGGATGGCGGCATTGAAGTTACCGCCAGCCATAATCCGATGGATTACAACGGCATGAAGCTGGTGCGCGAA GGGGCTCGCCCGATCAGCGGTGATACCGGACTGCGCGACGTCCAGCGTCTGGCAGAAGCTAACGACTTTCCTCCC GTCGATGAAACCAAACGCGGTCGCTATCAGCAAATCAATCTGCGTGACGCTTACGTTGATCACCTGTTCGGTTAT ATCAATGTCAAAAACCTTACGCCGCTCAAGCTGGTGATCAACTCCGGGAATGGCGCAGCGGGTCCGGTGGTGGAC GCTATCGAAGCCCGCTTTAAAGCCCTCGGCGCACCGGTGGAGTTAATCAAAGTGCATAACACGCCGGACGGCAAT TTCCCCAACGGTATTCCTAACCCGTTGCTGCCGGAATGTCGCGACGACACCCGCAATGCGGTCATCAAACACGGC GCGGATATGGGCATTGCCTTTGATGGCGATTTTGACCGCTGTTTCCTGTTTGACGAAAAAGGGCAGTTTATTGAG GGCTACTACATTGTCGGCCTGCTGGCAGAAGCGTTCCTCGAAAAAAATCCCGGCGCGAAGATCATCCACGATCCA CGTCTCTCCTGGAACACCATTGATGTGGTGACGGCCGCGGGCGGCACGCCGGTGATGTCGAAAACAGGACACGCC TTTATTAAAGAACGTATGCGCAAGGAAGACGCCATCTACGGTGGCGAAATGAGCGCTCACCATTACTTCCGCGAT TTCGCTTACTGTGACAGCGGCATGATCCCGTGGCTGCTGGTCGCCGAACTGGTGTGCCTGAAAGGAAAAACGCTG GGCGAACTGGTGCGCGACCGGATGGCGGCGTTTCCGGCAAGCGGTGAGATCAACAGAAAACTGGCGCACCCTGTT GAGGCGATTAACCGCGTGGAACAGCATTTTAGCCGTGAGGTGCTGGCGGTGGATCGCACCGATGGCATCAGCATG ACCTTTGCCGACTGGCGCTTTAACCTGCGCTCTTCCAACACCGAACCGGTGGTGCGCCTGAATGTGGAATCTCGC GGTGATGTTCAGGTTATGGTAATCCATACTCAAGAAATATTATCAATTTTGACGTCATAAAGAATAAGCCCTGAC AAGTTAGGGCTTAATTAATATATATTTTTTTTGAATTGGGGATTTGTGGTAAGATTTTTAATATGTTATTTAATG TGGTTGAATTAATGTTGACTGGAAAATAATAATGAGAACGAAAAAAGCATTACACAACTTTAAAGTTGATTTATT AATTACTTTTTTATTGGTTTTGCTAGGGTTTTATATTCGAACTGTTTTTGTTTCAAAAATGGGAAGTGATATTAC TGGAGTGATGTTACTATTCACACAGTTGACAGCATATCTCAATTTGGCAGAATTAGGTATTGGAATTGCAGCTGC CAGCGTATTATATAAACCGCTCAGCGAGAATGAATACAATAAAATAACTTACATAATATCTTTGCTCTCAGTCAT ATACAAATATATATTTGTGTTTGTTTTGATTCTTGGCGTTGTTATAGGTATCTGTATTTATTACTTTATTGATTC

- 100 046206

TGTAAAGGTTGTAAATGGCGTTTTTTTATATTGGGCTTTGTTCGTTTTTAATACATCGTTGACATATAGTTATGC TAAATACTCCACATTATTAACTGCTAATCAGCGGTACTCAGCAGTAAGAAAAATTCAAGGTGGCGGAAAAGTTAT AATAATTGTATTTCAGATATTAATTTTGTGCTTTACGCAAAGTTTCATACTTTATTTGTTAGTTGAGACTTTAGG TATTTTTTCTCAATATTTGATTTTTAAAAAAATAATTGGGAACGGAAATCAATATCTCAGTAATGAGGTTTTACT TATTGAAAGCGATAAACTTTTGATAAAAAAAGAATTAAAAATAAGAATAAAAAATATGTTCTTCCATAAAATAGG TGCTGTGCTTGTCCTTAATACAGACTACCTGCTTGTATCAAAGTTTCTGACATTAAGTTATGTGACAATTTTTGG CAGCTATATGATGGTATTTCAGATAGTAACTGTTTTGATGTCAAGTTTTGTTAATGCTATTACTGCAGGAATGGG TAATTACTTAATTAATAAAAGTAATTTAGAAATTAAGGAAATTACACGTCAATTTTATGTGATATTTATCGCCTT TGCAACATTCATATCACTAAATATGTTTTTTCTTGTTAATGATTTTATCGCAAAATGGATAGGTGTTAATTATAC ATTAAGTAACACCCTAGTTGCATTAATGATTGTTAACGTATTCATTAGTGTTGTCAGGGTACCTTCTGATATATT AAAAAAC G C AAGT G GAG AT T T T G GT GAT AT T TAT TAT C CAT TAT T AGAAG G T GT G С T GAAT AT TAG GAT AT C CAT CATTTTGGCTATCATTATTGGATTACCTGGCATTATTATAGGGACAATAGTATCTAACTTAATAGTAATAATGCT TGCGAAACCATTATATCTTTACTCTAAGTTATTTAATCTTAGAAATCCGACGAGGGTTTATTTTGAATTTATTTC TCGGCCTATGTTATATTCATTATGTGTGATTGGGGTGAGCTATTTATTGCGCGATGAAATATATTCATTTAAAGT AAGTACATGGTTGGATTTTATTAACAAGCTACTCTTAGTCTCTACTCCTAGCATATTGGTAATATGTGCTATTTT CT CT AC G GAT AGT GACT T T AGAT TAT T T T T CAGAAAAAT TAT AT AT GT GAT TAT GAAGAAAT AAAAAT T T C GAAA ATGTATTAATCGAAATTATGCAACGAGCTTTATTTTTATAAATGATATGTGATCTTTTCGCGAATAGGAGTAAGG ATCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGA GGAT AT T CATAT GGATAAAGC C GT AAGCATATAAGCAT GGATAAGCTAT TT AT ACT T TAATAAGTACT T T GT ATA CTTATTTGCGAACATTCCAGGCCGCGAGCATTCAGCGCGGTGATCACACCTGACAGGAGTATGTAATGTCCAAGC AACAGATCGGCGTAGTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTTGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTATACCG TCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAGAAGACGGAAGAAGTGATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGTTCCTT ACTATACGGTGAAAGAGTTTGTCGAATCTCTGGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTGAAAGCAGGTGCAG GCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTCAAACCATATCTCGATAAAGGAGACATCATCATTGATGGTGGTAACACCT TCTTCCAGGACACTATTCGTCGTAATCGTGAGCTTTCAGCAGAGGGCTTTAACTTCATCGGTACCGGTGTTTCTG GCGGTGAAGAGGGGGCGCTGAAAGGTCCTTCTATTATGCCTGGTGGCCAGAAAGAAGCCTATGAATTGGTAGCAC CGATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTAGCTGAAGACGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGGCGCAG GTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGCGATATGCAGCTGATTGCTGAAGCCTATTCTCTGC TTAAAGGTGGCCTGAACCTCACCAACGAAGAACTGGCGCAGACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACTGAGCA GT ТАС С T GAT C GACAT CAC CAAAGAT AT С T T С AC C AAAAAAGAT GAAGAC G GT AACT AC С T G GT T GAT GT GAT С C TGGATGAAGCGGCTAACAAAGGTACCGGTAAATGGACCAGCCAGAGCGCGCTGGATCTCGGCGAACCGCTGTCGC TGATTACCGAGTCTGTGTTTGCACGTTATATCTCTTCTCTGAAAGATCAGCGTGTTGCCGCATCTAAAGTTCTCT CTGGTCCGCAAGCACAGCCAGCAGGCGACAAGGCTGAGTTCATCGAAAAAGTTCGTCGTGCGCTGTATCTGGGCA AAATCGTTTCTTACGCCCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAACTACG GCGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGAAAATCACCGATGCTTATG CCGAAAATCCACAGATCGCTAACCTGTTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCAGGCGC TGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTATTCCGGTTCCGACCTTCTCCGCAGCGGTTGCCTATTACG ACAGCTACCGTGCTGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTTGGTGCGCATACTTATA AGCGTATTGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACCGAATGGCTGGATTAA

Claims

(1) нуклеотидную последовательность генного кластера rfb для полисахаридного антигена O4 Е.соН;

1 β-D-GlcpNAc и n представляет собой целое число от 5 до 40.

(1) биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с обезвреженным экзотоксином А P.aeruginosa (белком-носителем ЕРА-4), содержащим SEQ ID NO: 3, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+) a-D-GIcp

I

(1) полисахаридный антиген O1A E.coli содержит структуру формулы (01А)

1. Биоконъюгат гликозилированного полисахаридного антигена O4 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+) a-D-GIcp

J
[^»2)-a-L-Rhap-(1->6)-a-D-Glcp-(1^»3)-a-L-FucpNAc-(1-»3)-p-D-GlcpNAc-(1->]_n где n представляет собой целое число от 1 до 100, способ включает культивирование рекомбинантной прокариотической клетки-хозяина по любому из пп.15-17 в условиях для продуцирования биоконъюгата.

(2) нуклеотидную последовательность, кодирующую гликозилтрансферазу, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4, где гликозилтрансфераза способна модифицировать полисахаридный антиген O4 Е.соН с получением гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН;

[ >2)-a-L-Rhap-(1 >6)-a-D-Glcp-(1 >3)-<x-L-FucpNAc-(1 >3)-|3-D-GlcpNAc-(1 >]_n где n представляет собой целое число от 1 до 100, где клетка-хозяин содержит:

[—»2)-a-L-Rhap-(1 —»6)-«-D-Glcp-(1—*4)-a-D-Galp-(1—»3)-a-D-GlcpNAc-(1—*]_п t

2 t Ac (8) биоконъюгат полисахаридного антигена O25B E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген 025b Е.соН содержит структуру формулы (025b) β-D-Glcp

I

L >4)-d-D-Glcp-(1 >3)-a-L-Rhap-(1 >3H5-D-GlcpNAc-(1 >]_п tI

1Ac cc-L-Rhap; и (9) биоконъюгат полисахаридного антигена O75 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген O75 Е.соН содержит структуру формулы (O75) β-D-Manp

Ф

[^2)-p-D-Galf-(1 ->6)-a-D-Glcp-(1 ->3)-a-L-Rhap-(1 -3)-a-D-GlcpNAc-(1 ->]„

[^2)-p-D-Galp-(1 ^3)-oc-L-FucpNAc-(1 ^3)-p-D-GlcpNAc-(1 ^]_п (7) биоконъюгат полисахаридного антигена O16 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген O16 Е.соН содержит структуру формулы (O16)

- 103 046206

2 ΐ 1 β-D-ManpNAc (3) биоконъюгат полисахаридного антигена O2 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген O2 Е.соН содержит структуру формулы (O2)

[^2)-ot-L-Rhap-(1^6)-a-D-Glcp-(1^3)-a-L-FucpNAc-(1^3)-p-D-GlcpNAc-(1^]_n (2) биоконъюгат полисахаридного антигена O1A E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген О1А Е.соН содержит структуру формулы (O1 А)

L >3)-a-L-Rhap-(1 >3)-a-L-Rhap-(1 >3)-p-L-Rhap-(1 >4)-[3-D-GlcpNAc-(1 >]_n

2 ΐ Ac (7) полисахаридный антиген 018А E.coli содержит структуру формулы (018А) [->2)-a-l_-Rhap-(1 ->6)-«-D-Glcp-(1 ->4)-ct-D-Galp-(1 ->3)-a-D-GlcpNAc-(1 ->]_n3 t 1 β-D-GlcpNAc (8) полисахаридный антиген 025В Е.соН содержит структуру формулы (025В)

- 102 046206 β-D-Glcp

I

[^2)-p-D-Galf-(1 —*6)-a-D-Glcp-(1 —»3)-a-L-Rhap-(1 —3)-a-D-GlcpNAc-(1 ->]_л

2 t 1 a-D-Fucp3NAc (3) полисахаридный антиген 06А Е.соН содержит структуру формулы (06А)

2 ΐ 1 β-D-ManpNAc (2) полисахаридный антиген 02 Е.соН содержит структуру формулы (02)

2. Биоконъюгат по п.1, где n представляет собой целое число от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

[->2)-a-L-Rhap-(1 ->6)-a-D-Glcp-(1 -3)-«-L-FucpNAc-(1^3)-p-D-GlcpNAc-(1 ->]_n где n представляет собой целое число от 1 до 100.
(3) нуклеотидные последовательности, кодирующие транслоказу и гликозилтрансферазу, последовательность которых по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, где транслоказа способна транслоцировать бактопренол-связанную глюкозу, а гликозилтрансфераза способна гликозилировать бактопренол;

[->3)-a-D-Galp-(1 ->4)-a-L-Rhap-(1 ->3)-p-D-GlcpNAc-(1 ->]_n где каждый n независимо представляет собой целое число от 5 до 40.

[->3)-a-L-Rhap-(1 ->2)-a-L-Rhap-(1 ^3)-p-L-Rhap-(1 ->4)-p-D-GlcpNAc-(1 -]_n2 t 1 a-D-Fucp3NAc (4) биоконъюгат полисахаридного антигена O6A Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген О6А Е.соН содержит структуру формулы (О6А)

[->3)-a-D-Galp-(1 ->4)-a-L-Rhap-(1 ->3)-3-D-GlcpNAc-(1 ->]_n где каждый n независимо представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно от 3 до 50, например от 5 до 40, например от 7 до 25, например от 10 до 20.

[->3)-cc-L-Rhap-(1 ->2)-a-L-Rhap-(1 ^3)-p-L-Rhap-(1 -M)-p-D-GlcpNAc-(1 ^]_п

[ >3)-cr-L-Rhap-(1 >3)-a-L-Rhap-(1 >3)-(%L-Rhap-(1 >4)-(5-D-GlcpNAc-(1 >]_n

3. Биоконъюгат по п.1 или 2, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 E.coli ковалентно связан с остатком Asn в сайте гликозилирования, содержащем консенсусную последовательность глико

- 101 046206 зилирования Asn-X-Ser(Thr), где X может представлять собой любую аминокислоту, кроме Pro (SEQ ID NO: 1), предпочтительно консенсусную последовательность гликозилирования Asp(Glu)-X-Asn-ZSer(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой аминокислоты, кроме Pro (SEQ ID NO: 2), в белкеносителе.
(4) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель; и (5) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу, способную ковалентно связывать гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН с белком-носителем с получением биоконъюгата.

[-»4)-a-D-GalpNAc-(1 -»3)-p-D-Manp-(1 -^4)-p-D-Manp-(1->3)-a-D-GlcpNAc-(1 -»]_n

I 1 β-D-Glcp (5) биоконъюгат полисахаридного антигена O8 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген O8 Е.соН содержит структуру формулы (O8) a-D-МапрЗМ е-( 1 -· [3)-p-D-Manp-( 1 ->2)-a-D-M anp-( 1 ->2)-a-D-Manp-( 1 -*]_л (6) биоконъюгат полисахаридного антигена O15 E.coli, ковалентно связанного с белком-носителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген O15 Е.соН содержит структуру формулы (O15)

[->4)-a-D-Glcp-(1 ->3)-a-L-Rhap-( 1 ->3)-0-D-GlcpNAc-(1

Tt

1Ac ct-L-Rhap; и (9) полисахаридный антиген O75 E.coli содержит структуру формулы (O75) β-D-Manp

Ф

[-»4)-a-D-GalpNAc-(1-»3)-p-D-Manp-(1-»4)-p-D-Manp-(1-»3)-a-D-GlcpNAc-(1-*]_n

I 1 β-ο-Glcp (4) полисахаридный антиген 08 Е.соН содержит структуру формулы (08) a-D-Manp3Me-(1 -^[3)-p-D-Manp-(1 -»2)-ot-D-Manp-(1 -^2)-a-D-Manp-(1 -^]_n (5) полисахаридный антиген 015 E.coli содержит структуру формулы (015) [^2)-p-D-Galp-(1 -^3)-a-l_-FucpNAc-(1 -H>3)-p-D-GlcpNAc-(1 -н>]_п (6) полисахаридный антиген 016 Е.соН содержит структуру формулы (016)

4. Биоконъюгат по любому из пп.1-3, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из обезвреженного экзотоксина А P.aeruginosa (EPA), флагеллина Е.соН (FliC), CRM 197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, обезвреженного гемолизина A S.aureus, агглютинирующего фактора А, агглютинирующего фактора В, термолабильного энтеротоксина Е.соН, обезвреженных вариантов термолабильного энтеротоксина Е.соН, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, обезвреженных вариантов холерного токсина, белка Sat E.coli, доменапассажира белка Sat E.coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae, гемоцианина Megathura crenulata (KLH), PcrV P.aeruginosa, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis (OMPC) и белка D из нетипируемого Haemophilus influenzae, предпочтительно где белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (EPA), предпочтительно содержащий от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, предпочтительно от 2 до 4 консенсусных последовательностей гликозилирования, имеющих SEQ ID NO: 1, предпочтительно консенсусные последовательности имеют SEQ ID NO: 2, более предпочтительно где белок-носитель содержит четыре консенсусных последовательности гликозилирования (ЕРА-4), более предпочтительно где белок-носитель содержит SEQ ID NO: 3.
5. Фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат по любому из пп.1-4.
6. Фармацевтическая композиция по п.5, содержащая по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген, ковалентно связанный с белком-носителем.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, где по меньшей мере один дополнительный полисахаридный антиген выбран из группы, состоящей из полисахаридного антигена О1А Е.соН, полисахаридного антигена O2 Е.соН, полисахаридного антигена О6А Е.соН, полисахаридного антигена O8 Е.соН, полисахаридного антигена O15 Е.соН, полисахаридного антигена O16 Е.соН, полисахаридного антигена О18А Е.соН, полисахаридного антигена 025В Е.соН и полисахаридного антигена O75 Е.соН, предпочтительно где:
8. Фармацевтическая композиция по п.7, где каждый белок-носитель представляет собой ЕРА, содержащий SEQ ID NO: 3.
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.7 или 8, содержащая по меньшей мере полисахаридные антигены О1А, O2, гликозилированные полисахаридные антигены O4, 06а, O8, O15, O16, 018а, О25В и O75 Е.соН, каждый из которых ковалентно связан с белком-носителем.
(10) биоконъюгат полисахаридного антигена О18А Е.соН, ковалентно связанного с белкомносителем ЕРА-4, содержащим SEQ ID NO: 3, где полисахаридный антиген О18А Е.соН содержит структуру формулы (О18А)

10. Фармацевтическая композиция, содержащая:
11. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая:
12. Способ индукции у субъекта антител против гликозилированного антигена O4 Е.соН, включающий введение субъекту биоконъюгата по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по любому из пп. 5-11.
13. Способ вакцинации субъекта против Е.соН, включающий введение субъекту биоконъюгата по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по любому из пп.5-11.
14. Способ вакцинации по п.13, где указанная Е.соН представляет собой внекишечную патогенную Е.соН (ExPEC).
15. Рекомбинантная прокариотическая клетка-хозяин для получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 содержит структуру формулы (O4-Glc+) a-D-GIcp

I
16. Рекомбинантная прокариотическая клетка-хозяин по п.15, где гликозилтрансфераза имеет SEQ ID NO: 4;

- 104 046206 олигосахарилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 6, содержащую аминокислотную мутацию N311V, более предпочтительно SEQ ID NO: 6, содержащую аминокислотные мутации Y77H и N311V; и белок-носитель содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования, содержащий консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 1, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 2, предпочтительно где белок-носитель представляет собой обезвреженный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (ЕРА), более предпочтительно где ЕРА содержит 1-10, предпочтительно 2-4 сайта гликозилирования, каждый из которых содержит консенсусную последовательность гликозилирования, имеющую SEQ ID NO: 2, более предпочтительно где белок-носитель представляет собой ЕРА с четырьмя консенсусными последовательностями гликозилирования (ЕРА-4), более предпочтительно где белокноситель содержит SEQ ID NO: 3.
17. Рекомбинантная прокариотическая клетка-хозяин по любому из пп.15 или 16, которая представляет собой клетку Е.соН, например штамм Е.соН K-12, такой как штамм W3110.
18. Способ получения биоконъюгата гликозилированного полисахаридного антигена O4 Е.соН, ковалентно связанного с белком-носителем, где гликозилированный полисахаридный антиген O4 Е.соН содержит структуру формулы (O4-Glc+) a-D-GIcp

I
19. Композиция по любому из пп.10 или 11, где биоконъюгат полисахаридного антигена 025b присутствует в композиции в концентрации, которая приблизительно в 1,5-6 раз, например в 2-4 раза, выше, чем концентрация любого другого биоконъюгата, предпочтительно, где биоконъюгаты О1А:О2:гликозилированный О4:О6А:О8:О15:О16:О18А:О25В:О75 присутствуют в массовом соотношении полисахаридов 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1 или 2:1:1:2:1:1:1:1:4:1 и предпочтительно где концентрация биоконъюгата полисахаридного антигена 025В составляет от 2 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 8 до 40 мкг/мл, например от 16 до 32 мкг/мл.