EA035991B1 - Новый полисахарид и его применения - Google Patents

Новый полисахарид и его применения Download PDF

Info

Publication number
EA035991B1
EA035991B1 EA201691478A EA201691478A EA035991B1 EA 035991 B1 EA035991 B1 EA 035991B1 EA 201691478 A EA201691478 A EA 201691478A EA 201691478 A EA201691478 A EA 201691478A EA 035991 B1 EA035991 B1 EA 035991B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
coli
antigen
bioconjugate
specific embodiment
host cell
Prior art date
Application number
EA201691478A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691478A1 (ru
EA035991B9 (ru
Inventor
Михель Т. Коварик
Михель Л. Веттер
Стэфан Дж. Кеммлер
Миха А. Хойптле
Вероника Гамбиллара
Мануэла Малли
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байлоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксосмитклайн Байлоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байлоджикалс С.А.
Publication of EA201691478A1 publication Critical patent/EA201691478A1/ru
Publication of EA035991B1 publication Critical patent/EA035991B1/ru
Publication of EA035991B9 publication Critical patent/EA035991B9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложен биоконъюгат для индукции иммунного ответа против E. coli, содержащий антиген O25B E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген O25B E. coli содержит структуру формулы O25B' как она раскрыта в описании изобретения. Также предложены композиции для индукции иммунного ответа против E. coli, содержащие указанный биоконъюгат и возможно дополнительные биоконъюгаты, содержащие другие антигены E. coli. Кроме того, предложены способы вакцинации субъекта против внекишечных патогенных E. coli и способ индукции образования опсонофагоцитирующих антител у субъекта, которые являются специфичными к внекишечным патогенным E. coli, включающие введение биоконъюгата или композиции по изобретению. Также предложены рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин для продуцирования биоконъюгата по изобретению и способ его получения, включающий культивирование указанной клетки.

Description

В данном документе раскрыта структура антигена О25В Е. coli, а также применения О25В, способы получения 025b и биоконъюгаты, содержащие 025b. Заявители идентифицировали кластер генов Е. coli, ответственный за продуцирование О25В, и полностью охарактеризовали структуру антигена О25В. Соответственно, в данном описании изобретения предложены нуклеиновые кислоты, способные продуцировать О25В в клетках-хозяевах. Также в данном описании изобретения предложены клетки-хозяева, например рекомбинантно сконструированные клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, способные продуцировать О25В. Такие клетки-хозяева можно использовать для получения биоконъюгатов, содержащих О25В, связанный с белком-носителем, которые можно использовать, например, в приготовлении лекарственных препаратов (например вакцин). Антиген О25В, описанный в данном документе, также полезен в получении антител, которые можно использовать, например, в терапевтических способах, таких как пассивная иммунизация субъектов. Кроме того, в данном описании изобретения предложены композиции, включающие биоконъюгаты, содержащие О25В, одни или в комбинации с биоконъюгатами, содержащими другие антигены Е. coli (например O1, O2 и O6 и их субсеротипы), для применения в терапевтических способах, например в вакцинации хозяев против инфекции Е. coli (например внекишечными патогенными, такими как уропатогенные, Е. coli).
Предшествующий уровень техники
Внекишечные патогенные Е. coli (ExPEC) вызывают широкий спектр инфекций, которые приводят к существенной заболеваемости, смертности и ежегодным расходам. Инфекции мочевыводящих путей являются одними из наиболее частых заболеваний, вызванных ЕхРЕС у людей. Однако опасные для жизни состояния, такие как менингит и сепсис, также вызваны ЕхРЕС.
Устойчивость бактерий к антибиотикам является серьезной проблемой в борьбе с бактериальной инфекцией, и штаммы Е. coli с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) становятся все более и более распространенными. См. Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; и Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10): 1165-1176. Таким образом, требуется разработка эффективных вакцин против ЕхРЕС.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен биоконъюгат для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащий антиген О25В Е. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген О25В Е. coli содержит структуру формулы О25В':
D-GIc β|θ
D-GIc
α α ;----► L-Rha2Ac л п ► D-GIcNAc
1,3 1,3
L-Rha где n представляет собой целое число от 1 до 30.
Предпочтительно указанный антиген О25В Е. coli ковалентно связан с остатком Asn в указанном белке-носителе.
В одном конкретном воплощении предложен биоконъюгат, в котором белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из Р. aeruginosa (ЕРА) и мальтозосвязывающего белка (МВР).
Предпочтительно указанный белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
В еще одном конкретном воплощении предложен биоконъюгат, в котором остаток Asn белканосителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO:15).
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена композиция для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащая биоконъюгат по изобретению, как он раскрыт выше, и фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения предложена композиция для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащая биоконъюгат по изобретению, как он раскрыт выше, и (1) биоконъюгат О1А, содержащий антиген О1А E. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белканосителя, (2) биоконъюгат O2, содержащий антиген O2 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, и (3) биоконъюгат O6, содержащий антиген O6 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя.
В одном конкретном воплощении предложена указанная композиция, в которой антиген О1А, антиген O6 и антиген O2 представлены следующими формулами, соответственно.
а. Формула О1А'
- 1 035991
б. Формула O6Glc'
в. Формула 02'
В еще одном конкретном воплощении предложена указанная композиция, в которой белокноситель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (ЕРА) и мальтозосвязывающего белка (МВР).
Предпочтительно указанный белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
В еще одном конкретном воплощении предложена указанная композиция, в которой остаток Asn белка-носителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO:15).
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ вакцинации субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по изобретению, как они раскрыты выше.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по изобретению, как они раскрыты выше.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ индукции образования опсонофагоцитирующих антител у субъекта, которые являются специфичными к внекишечным патогенным Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по изобретению, как они раскрыты выше.
В одном конкретном воплощении вышеуказанных способов субъект имеет риск развития инфекции мочевыводящих путей, бактериемии или сепсиса.
В еще одном конкретном воплощении данных способов субъект представляет собой человека.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин для продуцирования биоконъюгата по изобретению, содержащая:
а) нуклеотидную последовательность, кодирующую:
1) dTBP-глюкозо-4,6-дегидратазу;
2) dTBP-6-дезокси-D-глюкозо-3,5-эпимеразу;
3) глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансферазу;
4) dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу;
5) О-антигенфлиппазу;
6) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP в-1,6-гликозилтрансферазу;
8) О-антигенполимеразу;
9) О-ацетилтрансферазу;
10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и
11) dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
б) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу; и
в) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты, за исключением Pro (SEQ ID NO:15).
В одном конкретном воплощении предложена рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по изобретению, где по меньшей мере один из генов waaL, gtrA, gtrB, gtrS или кластера rfb удален или функционально инактивирован в геноме клетки-хозяина.
В еще одном конкретном воплощении предложена рекомбинантно сконструированная клетка- 2 035991 хозяин по изобретению, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (EPA) и мальтозосвязывающего белка (МВР).
В предпочтельном воплощении рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку-хозяина Е. coli.
В еще одном конкретном воплощении предложена рекомбинантно сконструированная клеткахозяин по изобретению, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретению предложен способ получения биоконъюгата антигена 025b Е. coli, ковалентно связанного с белком-носителем, включающий:
а) культивирование клетки-хозяина по изобретению, как она определена выше; и
б) очистку N-гликозилированного белка-носителя, содержащего антиген 025В Е. coli.
Термины и сокращения
OPS: О-полисахарид; О-антиген грамотрицательных бактерий. OPS также упоминается в данном описании изобретения как О-антиген.
Кластер rfb: кластер генов (например кластер генов Е. coli), который кодирует ферментативный механизм, способный синтезировать структуру остова О-антигена. Термин кластер rfb может применяться к любому биосинтетическому кластеру О-антигена, включая кластер бактерий, не принадлежащих к роду Escherichia.
waaL: ген лигазы О-антигена, кодирующий связанный с мембраной фермент с активным сайтом, локализованным в периплазме. Кодируемый фермент переносит ундекаnренилфосфат(UPP)-связанный О-антиген к ядру липида А, образуя липополисахарид.
wecA: первый ген, кодируемый в кластере wec. Кодируемый белок катализирует перенос GlcNAcфосфата от UDP-GlcNAc к UPP с образованием UPP-связанного GlcNAc.
ЕСА: общий энтеробактериальный антиген.
RU: повторяющаяся единица. При использовании в данном описании изобретения RU соответствует биологической повторяющейся единице, BRU. BRU описывает RU О-антигена, как она синтезируется in vivo. UPP: ундекапренилпирофосфат. LLO: липид-связанный олигосахарид. 2АВ: 2-амино-бензамид. MS: масс-спектроскопия.
025В: термин 025В относится к антигену 025В из Е. coli, определенному в настоящем документе (субсеротип серотипа 025 Е. coli). Ссылка на 025В в данном описании изобретения включает формулу 025В и формулу 025В', как они определены выше.
О25А: термин О25А относится к антигену О25А Е. coli (субсеротип серотипа 025 Е. coli). Ссылка на О25А в данном описании изобретения включает формулу О25А и формулу 025А', как они определены выше.
01А: термин 01А относится к антигену 01A is. coli (субсеротип серотипа 01 Е. coli). Ссылка на 01А в данном описании изобретения включает формулу 01А и формулу 01А', как они определены выше.
01В: термин 01В относится к антигену 01В is. coli (субсеротип серотипа 01 Е. coli). Ссылка на 01В в данном описании изобретения включает формулу 01В и формулу 01В', как они определены выше.
01С: термин 01С относится к антигену 01С is. coli (субсеротип серотипа 01 Е. coli). Ссылка на 01С в данном описании изобретения включает формулу 01С и формулу 01С, как они определены выше.
02: термин 02 относится к антигену 02 Е. coli (серотипа 02 Е. coli). Ссылка на 02 в данном описании изобретения включает формулу 02 и формулу 02', как они определены выше.
06: термин 06 относится к антигену 06 Е. coli (серотипа 06 Е. colt). Ссылка на 06 в данном описании изобретения включает формулу 06 и формулу 06', как они определены выше.
Биоконъюгат: термин биоконъюгат относится к конъюгату белка (например белка-носителя) и антигена, например О-антигена (например 025В), полученному в клетке-хозяине, где механизм клеткихозяина связывает антиген с белком (например образует N-связь). Гликоконъюгаты включают биоконъюгаты, а также конъюгаты сахарный антиген (например олиго- и полисахариды)белок, полученные другим образом, например посредством химического связывания белка и сахарного антигена.
Термин примерно, при использовании в сочетании с числом, относится к любому числу в пределах ±1, ±5 или ±10% от указанного числа.
При использовании в данном описании изобретения термин эффективное количество в контексте введения терапевтического средства (например композиции, описанной в данном документе) субъекту, относится к количеству терапевтического средства, которое обеспечивает профилактический и/или терапевтический эффект(ы). В некоторых воплощениях эффективное количество относится к количеству терапевтического средства, которое достаточно для достижения одного, двух, трех, четырех или более следующих эффектов: (1) уменьшение или ослабление тяжести инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (2) уменьшение продолжительности инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (3) предупреждение развития инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (4) индукция регрессии инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (5) предупреждение развития или начала инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (6) предупреждение повторного возникновения инфекции ЕхРЕС
- 3 035991 или симптома, связанного с ним; (7) снижение функциональной недостаточности органов, связанной с инфекцией ЕхРЕС; (8) уменьшения уровня госпитализации субъекта с инфекцией ЕхРЕС; (9) уменьшение продолжительности госпитализации субъекта с инфекцией ЕхРЕС; (10) увеличение выживаемости субъекта с инфекцией ЕхРЕС; (11) ликвидация инфекции ЕхРЕС у субъекта; (12) подавление или снижение репликации ЕхРЕС у субъекта; и/или (13) усиление или улучшение профилактического(их) или терапевтического^) эффекта(ов) другой терапии.
При использовании в данном описании изобретения термин в комбинации в контексте введения двух или более терапевтических средств субъекту, относится к применению более чем одного терапевтического средства. Применение термина в комбинации не ограничивает порядок, в котором терапевтические средства вводят субъекту. Например, первое терапевтическое средство (например композицию, описанную в данном документе) можно вводит до (например за 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 16, 24, 48, 72, 96 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель), одновременно с, или после (например через 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 16, 24, 48, 72, 96 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель) введения второго терапевтического средства субъекту.
При использовании в данном описании изобретения термин субъект относится к животному (например к птицам, рептилиям и млекопитающим). В другом воплощении субъект представляет собой млекопитающее, в том числе не являющееся приматом (например верблюда, осла, зебру, корову, свинью, лошадь, козу, овцу, кошку, собаку, крысу и мышь) и являющееся приматом (например обезьяну, шимпанзе и человека). В некоторых воплощениях субъект представляет собой животное, не являющееся человеком. В некоторых воплощениях субъект представляет собой сельскохозяйственное животное или домашнее животное (например собаку, кошку, лошадь, козу, овцу, свинью, осла или курицу). В другом воплощении субъект представляет собой человека. В другом воплощении субъект представляет собой человеческого младенца. В другом воплощении субъект представляет собой человеческого ребенка. В другом воплощении субъект представляет собой взрослого человека. В другом воплощении субъект представляет собой пожилого человека. В другом воплощении субъект представляет собой недоношенного человеческого младенца. Термины субъект и пациент могут быть использованы в данном описании изобретения взаимозаменяемо.
При использовании в данном описании изобретения термин недоношенный человеческий младенец относится к человеческому младенцу, рожденному ранее 37 недель внутриутробного возраста.
При использовании в данном описании изобретения термин человеческий младенец относится к новорожденному младенцу до 1 года.
При использовании в данном описании изобретения термин человеческий ребенок преддошкольного возраста относится к человеку в возрасте от 1 до 3 лет.
При использовании в данном описании изобретения термин человеческий ребенок относится к человеку в возрасте от 1 года до 18 лет.
При использовании в данном описании изобретения термин взрослый человек относится к человеку в возрасте 18 лет или старше.
При использовании в данном описании изобретения термин пожилой человек относится к человеку в возрасте 65 лет или старше.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - путь биосинтеза 025а. Стрелки указывают отдельные ферментативные превращения, указаны названия ферментов. Нуклеотид-активированные сахара получают в цитоплазме либо посредством ферментов, представленных в кластере О-антигена, либо посредством ферментов домашнего хозяйства (housekeeping) грамотрицательной клетки-хозяина. Гликозилфосфат-трансфераза (WecA) добавляет DGlcNAc-фосфат к ундекапренил-фосфату (UP), образуя GlcNAc-UPP. Затем конкретные гликозилтрансферазы удлиняют молекулу UPP-GlcNAc путем добавления моносахаридов, образуя биологическую повторяющуюся единицу (BRU) олигосахарида (WekABC WbuB). Указанный порядок ферментов не относится к последовательности событий во время синтеза BRU (обозначен как < >). Затем BRU перемещается в периплазматическое пространство с помощью Wzx. Wzy линейно полимеризует периплазматические BRU с образованием О-антигенного полисахарида. Длина полимера контролируется с помощью Wzz. Многие бактериальные олиго-и полисахариды собираются на UPP и затем перемещаются к другим молекулам, то есть UPP является общей платформой построения олиго- и полисахарида в бактериях. В Е. coli и в большинстве других грамотрицательных бактерий О-антиген переносится от UPP к ядру липида А посредством фермента WaaL из Е. coli с образованием липополисахарида (LPS).
Фиг. 2 - кластер rfb, его структура и путь wzx/wzy-зависимого синтеза О-антигена на примере кластере rfb O25A Е. coli и О-антигена. А. Показана структура кластера rfb штамма Е47а Е. coli, локализованного между генами galFand gnd. Гены показаны как стрелки и закрашивание указано в соответствии с функцией генных продуктов: черными являются гены биосинтеза нуклеотид-активированного моносахарида, которые не являются частью репертуара домашнего хозяйства Е. coli (которые закодированы в другом месте генома), черно-белые диагональные полосы представляют гликозилтрансферазы, ответственные за добавление отдельных моносахаридных единиц к BRU, флиппазу wzx и полимеразу wzy. В. Химическая структура BRU О-антигена О25А, как предложено (см. Fundin et al., 2003, Magnetic Reso
- 4 035991 nance in Chemistry 41,4).
Фиг. 3 - А. Структуры BRU O25A, O25B и O16. В. Сравнение кластера биосинтеза О-антигена (кластер rfb) у 025а, 025b и O16. Закрашенные черным гены представляют собой гены, вовлеченные в биосинтез нуклеотид-активированного моносахарида, диагональные полосы представляют собой прогнозируемые гены гликозилтрансфераз, гены, закрашенные серым, указывают на гены процессинга и перемещения BRU, а вертикальные полосы показывают гомологию О-ацетилтрансфераз. Серые прямоугольники указывает величины гомологии между генами выше 25%; указаны точные значения. Тонкие черные и серые стрелки показывают места отжига олигонуклеотидов ПЦР-типирования для wzy (О25А- и О25Вспецифические) и 3'-области 025В (О25В-специфический).
Фиг. 4 - распределение серотипов в эпидемиологическом исследовании. О-антигенные серотипы Е. coli, идентифицированные в образцах внебольничных UTI (инфекции мочеполовых путей) были сгруппированы в соответствии с распространенностью.
Фиг. 5 - окрашивание серебром и анализ посредством вестерн-блоттинга LPS из клинических изолятов с 025-положительным фенотипом агглютинации. Номера штаммов указаны выше гелевых полос. Выращивали отдельные клоны и нормализованную по OD (оптическая плотность) биомассу собирали с помощью центрифугирования. Осадки растворяли в Lammli буфере для SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфат натрием) и обрабатывали протеиназой K, чтобы гидролизовать все белки в образце. Стандартное окрашивание серебром применяли к гелю PAGE, как показано на фиг. 5А, и анализ нитроцеллюлозных мембран, содержащих вещество, перенесенное электрическим током с гелей с одинаковым пробегом, с помощью коммерческой антисыворотки для 025-агглютинации, показан на фиг. 5В.
Фиг. 6 - 2АВ HPLC пики образцов О25А и 025В. Были приготовлены 2АВ-меченные LLO-образцы из штаммов upec138 (пунктирная линия) и upec436 (сплошная линия). Собирали пики и соответствующие структуры BRU, выведенные из картины MS/MS-фрагментации (тандемная масс-спектрометрия), представленной на фиг. 7, показаны стрелками.
Фиг. 7 - серии ионов MS/MS-фрагментации, полученные из пиков, указанных на фиг. 6 со временем элюирования 50' и 62' материнских ионов с m/z (масса/заряд)=1022 (А; из штамма upec138) или m/z=1021 (В; из upec_436). Серии ионов показаны по отношению к изображению предполагаемого BRU.
Фиг. 8 - деацетилирование 2АВ-меченного LLO-образца, полученного из 025В положительного клинического изолята. О25В-специфический пик при времени элюирования 50', полученный от 2АВмеченных LLO клинического изолята с генотипом 025В, собирали и анализировали посредством нормально-фазовой HPLC после обработки (сплошная линия) или без обработки (пунктирная линия) NaOH для гидролиза О-ацетильных групп ND Cal's Special Patent Program.
Фиг. 9 - анализ моносахаридного состава биоконъюгатов О25А и 025В. Биоконъюгаты O25 получали, очищали и обрабатывали для анализа моносахаридного состава. Показаны пики образцов на С18 HPLC. Полученные из О25А (сплошная) и 025В (пунктирная) образцы сравнивали со смесью моносахаридов из торговых источников (Glc, GlcNAc, Rha, FucNAc). Время элюирования моносахаридов показано стрелками.
Фиг. 10. Характеристика биоконъюгатов О25А. Очищенную конечную массу биоконъюгатов 4SEPA-O25A анализировали с помощью SDS PAGE и визуализировали посредством непосредственного окрашивания Кумасси (С) и Вестерн-блоттинга с использованием анти-ЕРА антисыворотки или антиO25 антисыворотки.
Фиг. 11 - характеристика биоконъюгатов 025В. Очищенную конечную массу биоконъюгатов 4SEPA-O25B анализировали посредством SDS PAGE и визуализировали посредством непосредственного окрашивания Кумасси (С) и Вестерн-блоттинга с использованием анти-ЕРА антисыворотки или антиO25 антисыворотки.
Фиг. 12 - генетический биосинтез и химическая структура О-антигена O1. А.
Показан кластер rfb и фланкирующие гены О1А штамма G1632 Е. coli (учетный номер GU299791). Черные, серые и полосатые обозначения являются такими же, как для фиг. 2, описанной выше. В. Показаны химические структуры BRU субсеротипов O1.
Фиг. 13 - анализ LPS из клинических изолятов с фенотипом 01-положительной агглютинации. А. Окрашивание серебром и В. Вестерн-блоттинг с использованием анти-01 антисыворотки.
Фиг. 14 - определение 01А в клинических изолятах O1. 2АВ-меченные LLO-образцы из клинических изолятов O1 анализировали посредством метода идентификационных отпечатков LLO. А. Показаны пики нормально-фазовой HPLC от 60' и далее. Базовый уровень для каждого образца был смещен, чтобы визуализировать совместно мигрирующие пики. Номер upec указывает клинический штамм. В. Серии ионов MS/MS-фрагментации m/z=1849,6 (Na+ аддукт). Изображение определяет картину фрагментации ионов и возможные разрывы гликозидной связи в олигосахариде из 2 BRU из 01А.
Фиг. 15 - биоконъюгаты O1. Мелкомасштабный анализ экспрессии гликопротеина ЕРА-01 клетками Е. coli (W3110 Δι^016::ιΉ301 ΔwaaL), трансформированными экспрессионной плазмидой ЕРА (pGVXN659) и пятью разными экспрессионными плазмидами pglB: A, p114: экспрессия кодоннеоптимизированной, содержащей НА-метку pglB; В, р939: кодон-оптимизированная, содержащая НА
- 5 035991 метку pglB; С, р970: кодон-оптимизированная, с удаленной НА-меткой pglB; D, кодон-оптимизированная, содержащая НА-метку, с удаленным сайтом природного гликозилирования N534Q pglB; и Е, кодон-оптимизированная, с удаленной НА-меткой, с удаленным сайтом природного гликозилирования N534Q pglB. Клетки выращивали и индуцировали арабинозой и IPTG (изопропилтиогалактозид), после ночной инкубации при 37°С клетки собирали и получали экстракты периплазматических белков. Затем экстракты разделяли с помощью SDS PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны посредством электроблоттинга и иммунологически выявляли, используя анти-ЕРА сыворотку.
Фиг. 16 - биоконъюгаты, описанные на фиг. 15, обнаруженные с помощью анти-O1 сыворотки.
Фиг. 17 - генетическая и химическая структура O6. А. Биосинтез О-антигенного кластера (кластер rfb) и фланкирующих генов Е. coli CFT073 (Genbank AE014075.1). Показаны предположительные функции генов согласно BLAST и указаны гены, специфичные для биосинтеза О-антигена О6. В. Химические структуры описанных структур О6 BRU (Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225).
Фиг. 18 - идентификация О6 с разветвленным Glc. 2АВ-меченные образцы LLO из клинических изолятов О6 анализировали посредством метода идентификационных отпечатков LLO. А. Показаны пики нормально-фазовой HPLC от 60' и далее. Экстракты получали из эталонных штаммов CCUG11309 (тонкая сплошная линия) и 11311 (прерывистая), содержащих ветви Glc и GlcNAC. Наложение показывает четкие различия во времени элюирования указанных BRU. В. Экстракты из клинических изолятов, указанных номером upec, сравнивают с эталонными штаммами из А.
Фиг. 19 - генетический биосинтез и химические структуры О-антигена O2. А. Биосинтез кластера (rfb кластер) О-антигена и фланкирующих генов штамма Е. coli G1674 (учетный номер GU299792). Черные, серые и полосатые обозначения являются такими же, как описано в предыдущих фигурах (например фиг. 2). В. Химическая структура BRU антигена O2.
Фиг. 20 - анализ LPS из клинических изолятов с фенотипом О2-положительной агглютинации. А. Окрашивание серебром. В. Вестерн-блоттинг с использованием анти-О2 антисыворотки.
Фиг. 21 - OPS анализ из штамма W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. Показана хроматограмма анализа 2АВ-меченного LLO посредством нормально-фазовой HPLC.
Фиг. 22 - распознавание LPS О25А и 025b посредством анти-О25А and анти-O25В МВР(мальтозосвязывающий белок)антисыворотки в анализе Вестерн-блоттинга. Две нитроцеллюлозные мембраны, которые были получены после электропереноса образцов LPS, полученных из upec436 (O25A) и upec138 (O25B) и разделенных посредством SDS-PAGE. Картина загрузки была одинаковой для обеих мембран, левая дорожка: LPS O25A из upec438, средняя дорожка: LPS O25B из upec 138. МВР биоконъюгаты использовали для иммунизации кроликов. Левая панель: анти О25В-МВР антисыворотка; правая панель: анти О25А-МВР антисыворотка.
Фиг. 23 - MS/MS-спектр BRU OPS O2. MS/MS-спектр Na+ аддукта с m/z=989,4 из пика элюирования при 43,5 мин из 2АВ-меченных LLO-экстрактов штамма CCUG25. Показано изображение BRU O2 и ассоциированные Y-ионные серии, подтверждающие ожидаемую последовательность моносахаридов.
Фиг. 24 - биоконъюгаты ЕРА, содержащие антигены О1А, O2 и O6, используемые в доклиническом исследовании. OPS-гликаны были произведены, очищены и проанализированы посредством SDS PAGE и визуализированы с помощью окрашивания Кумасси.
На фиг. 25 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных О1А-ЕРА (G1), одним белком-носителем(О10), TBS (G11) или тетравалентной композиции, содержащей ЕРА-О1А, O2, O6Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого O1A-LPS, очищенного из штамма upecO32.
На фиг. 26 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных 02-ЕРА (G4), одним белком-носителем (G10), TBS (G11) или тетравалентной композицией, содержащей ЕРА-О1А, O2, O6Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого O2-LPS, очищенного из штаммов CCUG25.
На фиг. 27 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных O6Glc-EPA (G7), одним белком-носителем (G10), TBS (G11) или тетравалентной композицией, содержащей ЕРА-01А, O2, O6Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого O6Glc-LPS, очищенного из штамма CCUG11309.
На фиг. 28 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных О25В-ЕРА (G9), одним белком-носителем (G10), TBS (G11) или тетравалентной композицией, содержащей 01А, O2, O6Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого O25B-LPS, очищенного из штамма upec177.
Фиг. 29 - показатели опсонизации сывороток, полученных от крыс до иммунизации (незакрашенные кружки) по сравнению с 42 сутками после иммунизации (закрашенные квадраты) с одной примирующей дозой и двумя бустерными дозами указанных доз моновалентной вакцины. (А) иммунизация 02-ЕРА; (В) иммунизация 06-ЕРА; (С) иммунизация О25В-ЕРА.
Фиг. 30 - титры ELISA, полученные с сывороткой от людей, вакцинированных тетравалентной вакциной, содержащей антигены Е. coli 01А, O2, O6Glc и 025В. Значительное увеличение титров ELISA
- 6 035991 после (через 30 суток после инъекции) по сравнению с титрами до инъекции (сутки 1) наблюдалось только в вакцинированных группах (*, представляет статистическую значимость).
Фиг. 31 - опсонический индекс (OI), полученный с сывороткой у людей, вакцинированных тетравалентной вакциной, содержащей антигены Е. coli О1А, O2, O6Glc и 025b. Иммунный ответ показан как OI против плацебо и компонентов тетравалентной вакцины (О1А-ЕРА (31А), 02-ЕРА (31В), O6Glc-EPA (31C) и О25В-ЕРА (31D)) до и после инъекции. Момент времени до инъекции, определенный как сутки 1, представлен как V2 (визит 2), и момент времени после инъекции, определенный как сутки 30, представлен как V4 (визит 4). Значительное увеличение OI в промежутке времени между моментом времени после инъекцией и моментом времени до инъекции (обозначенное как *, где несколько * представляет повышенную степень значимости) наблюдали только в вакцинированных группах. NS-нет значимой разницы.
Фиг. 32 - титры ELISA (выраженные как значения ЕС50) сыворотки из вакцинированных субъектов к LPS O25A (черные полоски) и LPS O25B (серые полоски) в сутки 1 (до вакцинации) и через 30 суток (после вакцинации). Статистически значимое увеличение титров ELISA между моментом времени после инъекции (через 30 суток после инъекции) и моментом времени до инъекции (сутки 1) наблюдалось для обоих серотипов: LPS O25A (черные полоски) и LPS O25B (серые полоски).
Фиг. 33 - реакционная способность сыворотки от вакцинированных субъектов в отношении О25А(черные линии) и О25В- (серые линии) экспрессирующих штаммов Е. coli. Пунктирная серая линия: штамм серотипа O75, отрицательный контроль. На фиг. 33 показано, что индуцируемые вакциной сывороточные IgG-антитела из вакцинированных субъектов имеют сильную реакцию на штаммы О25А и 025В.
Подробное описание изобретения
В настоящем документе раскрыта структура антигена 025В Е. coli, а также применения 025В, способы получения 025В, и биоконъюгаты, содержащие 025В. Заявители идентифицировали кластер генов Е. coli, ответственный за продуцирование 025В и полностью охарактеризовали структуру антигена 025В. Соответственно, в данном описании изобретения предложены нуклеиновые кислоты, способные продуцировать 025В в клетках-хозяевах. Также в данном описании изобретения предложены клеткихозяева, например рекомбинантно сконструированные клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, способные продуцировать 025В. Такие клетки-хозяева можно использовать для получения биоконъюгатов, содержащих 025В, связанный с белком-носителем, которые можно использовать, например, в изготовлении лекарственных препаратов (например вакцин). антиген 025В, описанный в данном документе также может быть использован в получении антител, которые можно использовать, например, в терапевтических способах, таких как пассивная иммунизация субъектов. Кроме того, в данном описании изобретения предложены композиции, включающи биоконъюгаты, содержащие 025В, отдельно или в комбинации с биоконъюгатами, содержащими другие антигены Е. coli (например O1, O2 и O6, а также их субсеротипы) для применения в терапевтических способах, например в вакцинации хозяев против инфекции Е. coli (например уропатогенными Е. coli).
5.1. Нуклеиновые кислоты и белки.
В одном аспекте в данном описании изобретения предложены выделенные нуклеиновые кислоты, связанные с продуцированием 025В, например нуклеиновые кислоты, кодирующие один или более белков кластера rfb O25B Е. coli. Специалистам в данной области техники понятно, что из-за вырожденности генетического кода, белок, имеющий определенную последовательность аминокислот, может быть закодирован с помощью нескольких разных нуклеиновых кислот. Таким образом, специалистам в данной области техники понятно, что нуклеиновая кислота, раскрытая в данном описании изобретения, может быть изменена таким образом, что ее последовательность отличается от последовательности, раскрытой в данном описании изобретения, без влияния на аминокислотную последовательность белка, кодируемого этой нуклеиновой кислотой.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер rfb O25B Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов rfb(upec138) E. coli (SEQ ID NO: 12). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов, который примерно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 12. Upec138 является примером штамма-Е. coli. серотипа 025В. Специалисту понятно, что другие штаммы этого серотипа теперь могут быть легко получены из клинических изолятов в соответствии со способами, описанными в данном документе, и примерами таких других штаммов являются upec177 и upec163. Таким образом, везде, где в данном документе упоминаются кластер генов rfb или отдельные гены из такого кластера таких О25В-штаммов, подразумевается включение соответствующих генных кластеров или генов из других О25В-штаммов. Также раскрытые последовательности могут быть найдены посредством секвенирования кластеров генов rfb или, при необходимости, отдельных генов из таких других изолятов и они будут представлять гомологичные последовательности, кодирующие гомологичные белки, такие как кластер генов или ген. В любых воплощениях, где упоминается гомологичный кластер генов или ген со ссылкой на кластер генов или ген с определенным процентом, такая гомологич- 7 035991 ная последовательность предпочтительно кодирует белок(и) с той же функцией, что и относящиеся к эталонному штамму или последовательности.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер rfb O25B Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов rfb(upecl63) E. coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов, который примерно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов rfb (upec163) E. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер rfb O25B Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов rfb(upec177) E. coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов, который примерно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов rfb(upec177) E. coli.
В другом воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая белки кластера rfb O25B Е. coli.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 1, гена rmlB кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025b Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 1.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO:2, гена rmlD кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 2.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 3, гена rmlA кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 3.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 4, гена rmlC кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 4.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 5, гена wzx кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 5.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 6, ген wekA кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 6.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е. coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 7, гена wekB кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 7.
В конкретном воплощении, нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 8, гена wzy кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 8.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 9, гена wbbJ кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 9.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli,
- 8 035991 предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 10, гена wbbK кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или
99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 10.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 11, гена wbbL кластера rfb O25B Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb O25B Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 11.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены белки, кодируемые нуклеиновыми кислотами, предложенными в данном описании изобретения. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена dTDP-глюкозо-4,6-дегидратаза, кодируемая SEQ ID NO: 1. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена dTDP-6-дезокси-D-глюкозо-3,5эпимераза, кодируемая SEQ ID NO: 2. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена глюкозо-1-фосфат-тимидилилтрансфераза, кодируемая SEQ ID NO: 3. В другом конкретном воплощении предложена dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимераза, кодируемая SEQ ID NO: 4. В другом конкретном воплощении предложена О-антиген-флиппаза, кодируемая SEQ ID NO: 5. В другом конкретном воплощении предложена dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID NO: 6. В другом конкретном воплощении предложена UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)GlcNAc-UPP в-1,6-гликозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID NO: 7. В другом конкретном воплощении О-антиген-полимераза, кодируемая SEQ ID NO: 8. В другом конкретном воплощении предложена Oацетилтрансфераза, кодируемая SEQ ID NO: 9. В другом конкретном воплощении предложена UDPGlc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID NO: 10. В другом конкретном воплощении предложена dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID NO: 11.
5.2. О-Антигены Е. coli.
В одном аспекте в данном описании изобретения предложены выделенные антигены Е. coli серотипов O25, O1, O2 и O6.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec138. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec163. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма-Е. coli upec177.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения раскрыт выделенный антиген 025b Е. coli с формулой 025b:
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный антиген О25В Е. coli с формулой О25В':
D-GIc
а а
D-GIc----► L-Rha2Ac л п >» D-GIcNAc
1,3 1,3
L-Rha
В другом аспекте в данном описании изобретения раскрыта группа выделенных макромолекул формулы О25В, представленной ниже:
D-GIc
D-GIc
L-Rha2Ac----► D-GIcNAc
L-Rha где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении n по меньшей мере для 80% макромолекул в этой группе составляет от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от
- 9 035991 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена группа выделенных макромолекул с формулой 025b', представленной ниже:
D-GIc β 6
α
D-GIc--1,3 α
L-Rha2Ac <| β >» D-GIcNAc
L-Rha где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении n по меньшей мере для 80% макромолекул в группе составляет от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
Другие антигены Е. coli, используемые в композициях, описанных в данном документе (например в терапевтических композициях, например в вакцинах; см. Раздел 5.6), включают антигены О25А, а также O1, O2 и О6, и их субсеротипы.
В одном воплощении антиген О25А (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном О25В (или биоконъюгатом, содержащим антиген О25В)). В конкретном воплощении антиген О25А имеет формулу О25А:
D-GIc
D-GIc
L-FucNAc
D-GIcNAc
L-Rha
В другом конкретном воплощении антиген О25А имеет формулу О25А': D-GIc β 6
α
D-GIc —1,3 3 a
L-FucNAc 1 з ► D-GIcNAc
L-Rha
В одном воплощении антиген О1А (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном О25В (или биоконъюгатом, содержащим антиген О25В)). В конкретном воплощении антиген О1А имеет формулу О1А:
В другом конкретном воплощении антиген О1А имеет формулу О1А':
В одном воплощении антиген О1В (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) может быть использован в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном О25В (или биоконъюгатом, содержащим антиген О25В)). В конкретном воплощении антиген О1В имеет формулу О1В:
— L-Rha----► L-Rha---► D-Gal
D-GIcNAc
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении антиген О1В имеет формулу О1В':
- 10 035991
В одном воплощении антиген О1С (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) может быть использован в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном С25В (или биоконъюгатом, содержащим антиген 025b)). В конкретном воплощении антиген О1С имеет формулу О1С:
В другом конкретном воплощении антиген О1С имеет формулу О1С: β а а а — + L-Rha---► L-Rha „ о D-Gal ——► D-GIcNAc з[ А 1,2 1’3 1’3 β 2
D-ManNAc
В одном воплощении антиген О2 (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном О25В (или биоконъюгатом, содержащим О25В антиген)). В конкретном воплощении антиген О2 имеет формулу О2:
В другом конкретном воплощении антиген О2 имеет формулу О2':
В одном воплощении антиген О6 (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном О25В (или биоконъюгатом, содержащим антиген О25В)). В конкретном воплощении антиген О6 имеет формулу О6К2 (также упоминаемую в данном описании изобретения, как O6Glc):
В другом конкретном воплощении антиген О6 имеет формулу О6К2' (также упоминаемую в данном описании изобретения, как O6Glc'):
В другом конкретном воплощении антиген О6 имеет формулу О6К54 (также упоминаемую в данном описании изобретения, как O6GlcNAc):
— D-GalNAc---► D-Man---► D-Man
D-GIcNAc--► n
D-GIcNAc
В другом конкретном воплощении антиген О6 имеет формулу О6К54' (также упоминаемую в данном описании изобретения, как O6GlcNAc'):
- 11 035991
5.3 Клетки-хозяева.
В данном документе предложены клетки-хозяева, например прокариотические клетки-хозяева, способные продуцировать О-антигены Е. coli, и биоконъюгаты, содержащие такие О-антигены Е. coli. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат (например естественным образом или посредством генной инженерии) одну или более нуклеиновых кислот, описанных в данном документе. См. Раздел 5.1. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, продуцируют один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе, и/или продуцируют биоконъюгаты, содержащие один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе. См. Раздел 5.2.
В одном аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать новый полисахарид, раскрытый в данном описании изобретения, 025b Е. coli. В данном документе также предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать другие антигены Е. coli, например О25А, O1, O2 и O6 и их субсеротипы (см. Раздел 5.2). Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут естественно экспрессировать нуклеиновые кислоты, способные продуцировать представляющий интерес О-антиген, или клетки-хозяева могут быть сконструированы, чтобы экспрессировать такие нуклеиновые кислоты, то есть в некоторых воплощениях указанные нуклеиновые кислоты гетерологичны клеткам-хозяевам и введены в клетки-хозяева с использованием генетических подходов, известных в данной области. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие дополнительные ферменты, проявляющие активность в N-гликозилировании белков, например, клетка-хозяин, предложенная в данном описании изобретения, может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую олигосахарилтрансферазу или нуклеиновые кислоты, кодирующие другие гликозилтрансферазы. См., например, Раздел 5.3.3. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-носитель, например белок, к которому могут быть присоединены олиго- и полисахариды с образованием биоконъюгата. См., например, Раздел 5.3.2 для описания белков-носителей и Раздел 5.4 для описания биоконъюгатов. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Upec138 представляет собой штамм Е. coli, определенный в данном описании изобретения, как принадлежащий к серотипу 025В, и кластер rfb генов этого штамма (и штаммов серотипа 025В в целом) был идентифицирован в данном описании изобретения впервые, как содержащий гены, которые продуцируют новый полисахарид 025В Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая кластер генов rfb (upec138) E. coli (SEQ ID NO: 12) или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 12. В конкретном воплощении кластер генов rfb (upec138) E. coli (SEQ ID NO: 12) вводят в клетку-хозяина с помощью генетических манипуляций (например кластер генов экспрессируется на плазмиде или плазмидах или интегрирован в геном клетки-хозяина (см., например международная заявка на патент РСТ/ЕР2013/068737)). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены rfb кластера гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен клетке-хозяину. В конкретном воплощении клеткахозяин представляет собой Е. coli.
Upec163 представляет собой штамм Е. coli, определенный в данном описании изобретения, как принадлежащий к серотипу 025В, а кластер генов rfb штамма (и штаммов серотипа 025В в целом) был идентифицирован в данном описании изобретения впервые, как содержащий гены, которые продуцируют новый полисахарид 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяина, содержащая кластер генов rfb (upec163) Е. coli или кластер генов, которые примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны или гомологичны кластеру генов rfb (upec163) E. coli. В конкретном воплощении кластер генов rfb (upec163) E. coli вводят в клетку-хозяина с помощью генетических манипуляций (например, кластер генов экспрессируется на плазмиде или на плазмидах, или интегрирован в геном клетки-хозяина (см., например, международную заявку на патент РСТ/ЕР2013/068737)). В другом воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу. В еще одном конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно со
- 12 035991 держит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены кластера rfb гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Upec177 представляет собой штамм Е. coli, определенный в данном описании изобретения, как принадлежащий к серотипу 025b, а кластер генов rfb штамма (и штаммов серотипа 025b в целом) идентифицирован в данном описании изобретения впервые, как содержащий гены, которые продуцируют новый полисахарид 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая кластер генов rfb (upec177) E. coli или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов rfb (upec177) Е. coli. В конкретном воплощении кластер генов rfb (upec177) E. coli введен в клетку-хозяина с помощью генетических манипуляций (например кластер генов экспрессируется на плазмиде или плазмидах, или введен в геном клетки-хозяина (см., например, международную заявку на патент РСТ/ЕР2013/068737)). В другом воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены кластера rfb гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белокноситель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK и/или wbbL. Такие клетки-хозяева могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных подходов так, чтобы содержать одну или более плазмид, содержащих гены rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK и/или wbbL. В некоторых воплощениях указанные одна или более плазмид интегрированы в геном клетки-хозяина. В конкретном воплощении указанный rmlB содержит SEQ ID NO: 1 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 1. В конкретном воплощении указанный rmlD содержит SEQ ID NO: 2 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 2. В конкретном воплощении указанный rmlA содержит SEQ ID NO: 3 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 3. В конкретном воплощении указанный rmlC содержит SEQ ID NO: 4 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 4. В конкретном воплощении указанный wzx содержит SEQ ID NO: 5 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 5. В конкретном воплощении указанный wekA содержит SEQ ID NO: 6 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 6. В конкретном воплощении указанный wekB содержит SEQ ID NO: 7 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 7. В конкретном воплощении указанный wzy содержит SEQ ID NO: 8 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 8. В конкретном воплощении указанный wbbJ содержит SEQ ID NO: 9 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99 идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 9. В конкретном воплощении указанный wbbK содержит SEQ ID NO: 10 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 10. В конкретном воплощении указанный wbbL содержит SEQ ID NO: 11 или состоит из нее, или на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99 идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом кон- 13 035991 кретном воплощении некоторые или все гены, rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, и wbbL гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025b, где указанная клетка-хозяин содержит один, два, три, четыре или более, например все, из следующих генов (или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична одному из следующих генов и предпочтительно кодирует белок с такой же функцией): rmlB (SEQ ID NO: 1), rmlD (SEQ ID NO: 2), rmlA (SEQ ID NO: 3), rmlC (SEQ ID NO: 4), wzx (SEQ ID NO: 5), wekA (SEQ ID NO: 6), wekB (SEQ ID NO: 7), wzy (SEQ ID NO: 8), wbbJ (SEQ ID NO: 9), wbbK (SEQ ID NO: 10) и/или wbbL (SEQ ID NO: 11). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клеткахозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность rmlB (SEQ ID NO: 1). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать O25B и/или биоконъюгат O25B (то есть белок-носитель, связанный с O25B антигеном Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует dTDP-глюкозо-4,6-дегидратазу, например dTDP-глюкозо-4,6-дегидратазу, которую кодирует rmlB. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать O25B и/или биоконъюгат O25B (то есть белок-носитель, связанный с антигеном O25B Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-XAsn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать O25B и/или биоконъюгат O25B (то есть белок-носитель, связанный с антигеном O25B Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность rmlD (SEQ ID NO: 2). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать O25B и/или биоконъюгат O25B (то есть белок-носитель, связанный с антигеном O25B Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует dTDP-6-дезокси-D-глюкозо-3,5эпимеразу, например dTDP-6-дезокси-D-глюкозо-3,5-эпимеразу, которую кодирует rmlD. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать O25B и/или биоконъюгат O25B (то есть белок-носитель, связанный с антигеном O25B Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 2. В другом конкретном воплощении, прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, со- 14 035991 держащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025b и/или биоконъюгат 025b (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025b Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность rmlA (SEQ ID NO: 3). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В, и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансферазу, например глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансферазу, которую кодирует rmlA. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 3. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID N0: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность rmlC (SEQ ID NO: 4). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую dTDP-4-дегидрорамнозо3,5-эпимеразу, например dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу, которую кодирует rmlC. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 4. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. colt В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wzx (SEQ ID NO: 5). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую О-антиген-флиппазу, например О-антигенфлиппазу, которую кодирует wzx. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В, и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клеткахозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кисло- 15 035991 ту, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 5. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025b и/или биоконъюгат 025b (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025b Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wekA (SEQ ID NO: 6). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую рамнозилтрансферазу, например dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу, которую кодирует wekA. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или разработан для того, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 6. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wekB (SEQ ID NO: 7). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует wekB-гликозилтрансферазу, например UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP в-1,6-гликозилтрансферазу, которую кодирует wekB. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клеткахозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 7. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клеткахозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wzy (SEQ ID NO: 8). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная
- 16 035991 продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую О-антиген-полимеразу, например Оантиген-полимеразу, которую кодирует wzy. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025b и/или биоконъюгат 025b (то есть белок-носитель, связанный с антигеном O25B Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 8. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-XSer(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wbbJ (SEQ ID NO: 9). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую О-ацетилтрансферазу, например Оацетилтрансферазу, которую кодирует wbbJ. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 9. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-XSer(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wbbK (SEQ ID NO: 10). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую гликозилтрансферазу, например UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу, которую кодирует wbbK. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 10. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID N0: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая
- 17 035991 клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025b и/или биоконъюгат 025b (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025b Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wbbL (SEQ ID NO: 11). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую рамнозилтрансферазу, например dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3- рамнозилтрансферазу, которую кодирует wbbL. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны SEQ ID NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. colt), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать по меньшей мере один, два, три, четыре или более, например все, из следующих: (1) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 1; (2) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 2; (3) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 3; (4) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 4; (5) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 5; (6) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 6; (7) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 7; (8) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 8; (9) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 9; (10) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 10; и/или (11) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100 идентична SEQ ID NO: 11. В конкретном воплощении указанная клетка-хозяин была разработана так, чтобы включать каждую из указанных последовательностей, то есть указанные последовательности являются гетерологичными по отношению к указанной клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит по меньшей мере два из следующих объектов (1) wbbJ (SEQ ID NO: 9) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 9; (2) wbbK (SEQ ID NO: 10) или нук
- 18 035991 леиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 10; и/или (3) wbbL (SEQ ID NO: 11) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-XSer(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025b, где указанная клетка-хозяин содержит каждый из (1) wbbJ (SEQ ID NO: 9) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 9; (2) wbbK (SEQ ID NO: 10) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 10; и (3) wbbL (SEQ ID NO: 11) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белокноситель, содержащую консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит (1) dTDP-глюкозо-4,6-дегидратазу; (2) dTDP6-дезокси-О-глюкозо-3,5-эпимеразу; (3) глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансферазу; (4) dTDP-4дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу; (5) О-антигенфлиппазу; (6) dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3рамнозилтрансферазу; (7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP в-1,6-гликозилтрансферазу; (8) О-антигенполимеразу; (9) О-ацетилтрансферазу; (10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и/или (11) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу. В конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-XAsn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все из (1) dTDP-глюкозо-4,6-дегидратазы; (2) dTDP-6-дезокси-D-глюкозо-3,5-эпимеразы; (3) глюкозо-1-фосфат тимидилилтрансферазы; (4) dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразы; (5) О-антигенфлиппазы; (6) dTDPRha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазы; (7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6гликозилтрансферазы (8) О-антиген-полимеразы; (9) О-ацетилтрансферазы; (10) UDP-Glc:Rha-GlcNAcUPP а-1,3-гликозилтрансферазы и/или (11) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазы являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует О25А Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать О25А Е. coli (см., например фиг. 3). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-XSer(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO
- 19 035991
2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует O1 Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать O1 Е. coli (см., например фиг. 12). В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клеткахозяин, которая продуцирует O1A is. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, которая продуцирует OLE Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, которая продуцирует О1С Е. coli. В другом конкретном воплощении, прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клеткахозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин) которая продуцирует O2 Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать O2 Е. coli (см., например фиг. 19). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-XSer(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белокноситель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует O6 Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать O6 Е. coli (см., например фиг. 17). В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клеткахозяин, которая продуцирует O6 Е. coli, содержащий разветвленный Glc-моносахарид, или O6-антиген, содержащий разветвленный GlcNAc-моносахарид. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-AsnZ-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Кроме того, в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать более одного типа О-антигенов Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, способная продуцировать по меньшей мере два из следующих типов: O25В, O25A, O1 (например О1А, OW, O1C), O2 и O6. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, способная продуцировать O25В и один или более из О25А, O1 (например O1A, (316, O1C), O2 и O6. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
5.3.1 Генетический фон.
Все клетки-хозяева, известные специалисту в данной области, можно использовать для получения О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (например O25В), и биоконъюгатов, содержащих Оантигены Е. coli, описанные в данном документе (например O25В), в том числе археи, прокариотические клетки-хозяева и эукариотические клетки-хозяева. Типичные прокариотические клетки-хозяева для применения в продуцировании О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе, и биоконъюгатов, содержащих О-антигены Е. coli, описанных в данном документе, включают без ограничения ими, виды Escherichia, виды Shigella, виды Klebsiella, виды Xhantomonas, виды Salmonella, виды Yersinia, виды Lac- 20 035991 tococcus, виды Lactobacillus, виды Pseudomonas, виды Corynebacterium, виды Streptomyces, виды Streptococcus, виды Staphylococcus, виды Bacillus и виды Clostridium. В конкретном воплощении клетка-хозяин, используемая для продуцирования О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе, и биоконъюгатов, содержащих О-антигены Е. coli, описанных в данном документе, представляет собой Е. coli.
В некоторых воплощениях клетки-хозяева, используемые для получения О-антигенов Е. coli и биоконъюгатов, описанных в данном документе, сконструированы так, чтобы содержать гетерологичные нуклеиновые кислоты, например гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или более белков-носителей, и/или гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или более белков, например гены, кодирующие один или более белков. В конкретном воплощении гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки, участвующие в путях гликозилирования (например прокариотических и/или эукариотических путях гликозилирования), могут быть введены в клеткихозяева, описанные в данном документе. Такие нуклеиновые кислоты могут кодировать белки, включающие, без ограничения ими, олигосахарил-трансферазы и/или гликозилтрансферазы. Гетерологичные нуклеиновые кислоты (например нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки-носители, и/или нуклеиновые кислоты, которые кодируют другие белки, например белки, вовлеченные в гликозилирование) могут быть введены в клетки-хозяева, описанные в данном документе, с использованием любых методов, известных специалистам в данной области, например электропорации, химической трансформации посредством теплового шока, естественной трансформации, фаговой трансдукции и конъюгации. В конкретных воплощениях гетерологичные нуклеиновые кислоты вводят в клетки-хозяева, описанные в данном документе, используя плазмиду, например гетерологичные нуклеиновые кислоты экспрессируются в клетках-хозяевах с помощью плазмиды (например экспрессионного вектора). В другом конкретном воплощении гетерологичные нуклеиновые кислоты вводят в клетки-хозяева, описанные в данном документе, используя способ введения, описанный в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/068737.
В некоторых воплощениях могут быть введены дополнительные модификации (например с использованием рекомбинантных методов) в клетки-хозяева, описанные в данном документе. Например нуклеиновые кислоты клетки-хозяина (например гены), которые кодируют белки, составляющие часть возможно конкурирующего или интерферирующего пути гликозилирования (например конкурирующие или интерферирующие с одним или более гетерологичным генам, вовлеченным в гликозилирование, которые рекомбинантно введены в клетки-хозяева), могут быть удалены или модифицированы в фоне клеткихозяина (геноме) способом, который делает их неактивными/дисфункциональными (то есть нуклеиновые кислоты клетки-хозяина, которые удалены/модифицированы, не кодируют функциональный белок или не кодируют никакого белка). В некоторых воплощениях, когда нуклеиновые кислоты делетированы из генома клеток-хозяев, предложенных в данном описании изобретения, их замещают нужной последовательностью, например последовательностью, которую можно использовать для получения гликопротеина.
Типичные гены, которые могут быть делетированы в клетках-хозяевах (и в некоторых случаях замещены другими нужными последовательностями нуклеиновых кислот), включают гены клеток-хозяев, вовлеченные в биосинтез гликолипидов, такие как waaL (см., например Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), кластер биосинтеза ядра липида A (waa), кластер галактозы (gal), кластер арабинозы (ara), кластер колановой кислоты (wc), кластер капсульного полисахарида, гены биосинтеза ундекапренола-р (например uppS, uppP), гены рециклинга und-P, метаболические ферменты, вовлеченные в биосинтез нуклеотид-активированного сахара, кластер энтеробактериального общего антигена и кластеры модификации О-антигена профага, такие как кластер gtrABS. В конкретном воплощении клетки-хозяева, описанные в данном документе, модифицированы таким образом, что они не продуцируют никаких Оантигенов, отличных от необходимого О-антигена из ЕхРЕС, например 025b. В конкретном воплощении один или более из кластеров гена waaL, гена gtrA, гена gtrB, гена gtrS или гена rfb делетирован или функционально инактивирован в геноме прокариотической клетки-хозяина, предложенной в данном описании изобретения. В одном воплощении клетка-хозяин, используемая в данном описании изобретения, представляет собой Е. coli, которая продуцирует антиген 025В, где ген waaL, ген gtrA, ген gtrB и ген gtrS делетированы или функционально инактивированы в геноме клетки-хозяина. В другом воплощении клетка-хозяин, используемая в данном описании изобретения, представляет собой Е. coli, которая продуцирует антиген 025В, где ген waaL и ген gtrS делетированы или функционально инактивированы в геноме клетки-хозяина.
В некоторых воплощениях модифицированные клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут быть использованы для гликозилирования белка. Гликозилирование белка может быть предназначено для получения биоконъюгатов для применения в вакцинных композициях, например в вакцинах, которые содержат полисахаридный(е) антиген(ов) Е. coli, например O25 (например 025В), O1, O2 и O6.
5.3.2 Белки-носители.
Любой белок-носитель, подходящий для применения в продуцировании конъюгатных вакцин (например биоконъюгатов для применения в вакцинах), может быть использован в данном описании изобретения, например нуклеиновые кислоты, кодирующие белок-носитель, могут быть введены в хозяина,
- 21 035991 предложенного в данном описании изобретения, для получения биоконъюгата, содержащего белокноситель, связанный с антигеном ЕхРЕС (например 025b). Типичные белки-носители включают, без ограничения ими, детоксифицированный экзотоксин А из P. aeruginosa (EPA; см., например Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, мальтозосвязывающий белок (МВР), дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, детоксифицированный гемолизин А из S. aureus, фактор агглютинации А, фактор агглютинации В, FimH E. coli, FimHC E. coli, термолабильный энтеротоксин Е. coli, детоксифицированные варианты термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицу В холерного токсина (СТВ), холерный токсин, детоксифицированные варианты холерного токсина, белок Sat E. coli, домен-пассажир белка Sat E. coli, пневмолизин Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированные варианты, AcrA С. jejuni и природные гликопротеины С. jejuni. Различные детоксифицированные варианты белка ЕРА описаны в литературе и могут быть использованы в качестве белков-носителей.
В некоторых воплощениях белки-носители, используемые в получении биоконъюгатов, описанных в данном документе, являются модифицированными, например модифицированными таким образом, что белок является менее токсичным и/или более чувствительным к гликозилированию. В конкретном воплощении белки-носители, используемые в получении биоконъюгатов, описанных в данном документе, являются модифицированными так, что число сайтов гликозилирования в белках-носителях максимизировано таким образом, который делает возможным введение более низкой концентрации белка, например в иммуногенной композиции, в его биоконъюгатной форме.
В некоторых воплощениях белки-носители, описанные в данном документе, модифицированы так, чтобы включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сайтов гликозилирования, которые обычно ассоциированы с белком-носителем (например, относительно числа сайтов гликозилирования, ассоциированных с белком-носителем в его нативном/природном состоянии, например в состоянии дикого типа). В конкретных воплощениях введение сайтов гликозилирования осуществляется путем введения консенсусных последовательностей гликозилирования (например Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987)) в любом месте первичной структуры белка. Введение таких сайтов гликозилирования может быть осуществлено посредством, например, добавления новых аминокислот к первичной структуре белка (то есть добавлены сайты гликозилирования, полностью или частично) или посредством мутаций существующих аминокислот в белке так, чтобы образовались сайты гликозилирования (то есть аминокислоты не добавляют к белку, а выбранные аминокислоты белка подвергнуты мутации так, чтобы образовались сайты гликозилирования). Специалистам в данной области техники понятно, что аминокислотная последовательность белка может быть легко модифицирована с использованием подходов, известных в данной области, например рекомбинантных подходов, которые включают модификацию нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок. В конкретных воплощениях консенсусные последовательности гликозилирования вводят в определенные области белка-носителя, например в поверхностные структуры белка, на N- или С-конце белка, и/или в петли, которые стабилизированы дисульфидными мостиками в основе белка. В некоторых воплощениях классическая консенсусная последовательность гликозилирования из 5 аминокислот может быть удлинена с помощью остатков лизина для более эффективного гликозилирования и, таким образом, вставленная консенсусная последовательность может кодировать 5, 6 или 7 аминокислот, которые должны быть вставлены или которые замещают аминокислоты акцепторного белка. В одном конкретном воплощении белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА, содержащий 4 консенсусные последовательности гликозилирования Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO: 15), и имеют аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 13.
В некоторых воплощениях белки-носители, используемые в образовании биоконъюгатов, описанных в данном документе, содержат метку, то есть последовательность аминокислот, которая позволяет выделить и/или идентифицировать белок-носитель. Например, добавление метки к белку-носителю, описанному в данном документе, может быть полезным в очистке такого белка и, следовательно, очистки конъюгатных вакцин, содержащих меченый белок-носитель. Типичные метки, которые можно использовать в данном изобретении, включают, без ограничения ими, гистидиновые (HIS) метки (например гексагистидиновую метку или 6XHis-Tag), FLAG-TAG и НА-метки. В некоторых воплощениях метки, используемые в настоящем документе, являются удаляемыми, например их удаляют с помощью химических агентов или ферментативными средствами, когда они больше не нужны, например, после того как белок был очищен.
В некоторых воплощениях белки-носители, описанные в данном документе, содержат сигнальную последовательность, которая направляет белок-носитель в периплазматическое пространство клеткихозяина, экспрессирующей белок-носитель. В конкретном воплощении сигнальная последовательность происходит из DsbA E. coli, порина А внешней мембраны Е. coli (OmpA), мальтозосвязывающего белка (MalE) Е. coli, пектат-лиазы Erwinia carotovorans (PelB), FlgI, NikA или эндоксиланазы (XynA)Bacillus sp., термолабильного энтеротоксина LTIIb E. coli, эндоксиланазы XynA Bacillus или флагеллина (FlgI) E. coli.
5.3.3 Механизм гликозилирования.
Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат и/или могут быть моди- 22 035991 фицированы так чтобы включать, нуклеиновые кислоты, которые кодируют генетический механизм (например гликозилтрансферазы), способный продуцировать О-антигены из ЕхРЕС, например антигены
O25 (например 025b), O1, O2, и/или O6. См. Раздел 5.1.
Г ликозилтрансферазы.
Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антигены ЕхРЕС, например Оантиген из Е. coli серотипа O25 (например О25А или 025В, см. фиг. 3В), O1 (см. фиг. 12), O2 (см. фиг. 19) и O6 (например серотип О6, продуцирующий О6-антиген, содержащий разветвленный Glcмоносахарид, или 06-антиген, содержащий разветвленный GlcNAc-моносахарид, см. фиг. 17). Типичные нуклеиновые кислоты описаны в Разделе 5.1. В некоторых воплощениях некоторые или все нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген ЕхРЕС, естественно экспрессируются клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения (например нуклеиновые кислоты присутствуют в фоне клетки-хозяина дикого типа). В некоторых воплощениях некоторые или все нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген ЕхРЕС, в естественных условиях не экспрессируются клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения, то есть некоторые или все нуклеиновые кислоты являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. Клетки-хозяева могут быть сконструированы так, чтобы содержать конкретные нуклеиновые кислоты, например нуклеиновые кислоты, описанные в Разделе 5.1, с использованием способов, известных в данной области, например способов, описанных в Разделе 5.3.
В конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать Оантиген Е. coli серотипа О25В, то есть О25В-антиген, описанный в данном документе. В конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты кодируют кластер rfb из upec138 (SEQ ID NO: 12) или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 12.
В конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты кодируют кластер rfb из upec163 или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен кластеру rfb из upec163. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты кодируют кластер rfb из upec177 или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен или гомологичен кластеру rfb из upec177.
В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген серотипа 025В Е. coli, представляют собой гены серотипа О25В, где указанные гены представляют собой rmlB (SEQ ID NO: 1), rmlD (SEQ ID NO: 2) rmlA (SEQ ID NO: 3), rmlC (SEQ ID NO: 4), wzx (SEQ ID NO: 5), wekA (SEQ ID NO: 6), wekB (SEQ ID NO: 7), wzy (SEQ ID NO: 8), wbbJ (SEQ ID NO: 9), wbbK (SEQ ID NO: 10) и wbbL (SEQ ID NO: 11). См. таблицы 3 и 9.
В конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать О-антиген серотипа О25А Е. coli, то есть антиген О25А, описанный в данном документе. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа О25А, представляют собой гены серотипа О25, где указанные гены представляют собой rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wekC, wzy, fnlA, fnlB, fnlC, wbuB, и/или wbuC. См. Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; GenBank GU014554; и табл. 2.
В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать Оантиген Е. coli серотипа О2. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа О2, представляют собой гены серотипа О2, где указанные гены представляют собой rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekP, wekQ, wekR, wzy, fdtA, fdtB, и/или fdtC. См. Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77; Fratamico, et al., 2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316; и табл. 5.
В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать Оантиген Е. coli серотипа О6. См. Welch et al., 2002, PNAS USA 99(26): 17020-17024; Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225 и Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283. В конкретном воплощении указанный серотип О6 содержит разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать Оантиген Е. coli серотипа О1. В конкретном воплощении указанный серотип О1 представляет собой О1А. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа О1 представляют собой гены серотипа О1, где указанные гены представляют собой rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, mnaA, wekM, wzy, wekN и/или we- 23 035991 kO.
Олигосахарил-трансферазы.
Олигосахарил-трансферазы переносят липидсвязанные олигосахариды на остаток аспарагина образующихся полипептидных цепей, которые содержат консенсусный мотив N-гликозилирования, например Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). См., например WO 2003/074687 and WO 2006/119987, описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей их полноте.
В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновую кислоту, которая кодирует олигосахарил-трансферазу. Нуклеиновая кислота, которая кодирует олигосахарил-трансферазу, может быть природной для клетки-хозяина или может быть введена в клетку-хозяина с использованием генетических подходов, как описано выше. Олигосахарилтрансфераза может происходить из любого источника, известного в данной области. В конкретном воплощении олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарил-трансферазу из Campylobacter. В другом конкретном воплощении олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарилтрансферазу из Campylobacter jejuni (то есть pglB; см., например, Wacker et al., 2002, Science 298:17901793; см. также, например, NCBI Gene ID: 3231775, учетный номер. 086154 UniProt). В другом конкретном воплощении олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарил-трансферазу из Campylobacter lari (см., например, NCBI Gene ID: 7410986).
5.4 . Биоконъюгаты.
В некоторых воплощениях клетки-хозяева, описанные в данном документе, могут быть использованы для получения биоконъюгатов, содержащих О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (например O25B; см. Раздел 5.2), связанный с белком-носителем. Способы получения таких биоконъюгатов с использованием клеток-хозяев известны в данной области. См., например WO 2003/074687 и WO 2006/119987.
Альтернативно, гликоконъюгаты могут быть получены посредством химического синтеза, то есть получены вне клеток-хозяев (in vitro). Например, О-антигены Е. coli, описанные в данном документе, например O25B, могут быть конъюгированы с белками-носителями с использованием способов, известных специалистам в данной области, включая использование активации реакционноспособных групп в полисахариде/олигосахариде, а также в белке-носителе. См., например Pawlowski et al., 2000, Вакцина 18:1873-1885; и Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978), описания которых включены в данное описание изобретения посредством ссылки. Такие подходы включают экстракцию антигенных полисахаридов/олигосахаридов из клеток-хозяев, очистку полисахаридов/олигосахаридов, химическую активацию полисахаридов/олигосахаридов и конъюгацию полисахаридов/олигосахаридов с белкомносителем.
Биоконъюгаты, описанные в данном документе, обладают более полезными свойствами по сравнению с гликоконъюгатами, например, для изготовления биоконъюгатов требуется меньше химических веществ, и они являются более совместимыми с точки зрения полученного конечного продукта. Таким образом, биоконъюгаты являются более предпочтительными по сравнению с химически получаемыми гликоконъюгатами.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложены биоконъюгаты, содержащие белок-носитель, связанный с О-антигеном ЕхРЕС, описанным в данном документе. См. Раздел 5.2.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), N-связанный с O25В Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы O25В, представленной ниже:
D-GIc
--►D-GIc----► L-Rha2Ac---► D-GIcNAc--► η
L-Rha где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении белок-носитель N-связан с О-антигеном формулы O25В, то есть O25В связан с остатком Asn белка-носителя, содержащего последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белка-носителя, содержащего консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15).
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, со
- 24 035991 держащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В', представленной ниже:
D-GIc β|θ β ’ а α
--► D-GIc----► L-Rha2Ac . „ ► D-GIcNAc---►
4l A 1.3 1.3 Jn1 a 3
L-Rha где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении, белок-носитель N-связан с О-антигеном формулы 025b'.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном О25А. В конкретном воплощении указанный антиген О25А содержит формулу О25А:
D-GIc
L-Rha
L-FucNAc----► D-GIcNAc-η или 025А':
D-GIc β 6
α
L-FucNAc ► D-GIcNAc Ί ,Ο
L-Rha
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном 01. В конкретном воплощении указанный антиген 01 представляет собой 01А, например указанный антиген имеет формулу 01А:
— ► L-Rha---► L-Rha---►L-Rha---► D-GIcNAc
D-ManNAc или 01А':
или 01В':
В другом конкретном воплощении указанный 01-антиген представляет собой 01В, например указанный антиген имеет формулу 01В:
В другом конкретном воплощении указанный O1-антиген представляет собой 01с, например указанный антиген имеет формулу 01С:
- 25 035991 — L-Rha----► L-Rha---► D-Gal---► D-GIcNAc или О1С':
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном O2. В конкретном воплощении указанный антиген O2 имеет формулу O2:
L-Rha----► L-Rha----► D-GIcNAc--► или O2'
D-Fuc3NAc
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном О6. В конкретном воплощении указанный антиген О6 имеет формулу O6Glc:
O6GlcNAc:
— -► D-Gal NAc----► D-Man---► D-Man---► D-GIcNAc--► или O6G1cNAc':
D-GIcNAc
O6Glc':
Биоконъюгаты, описанные в данном документе, могут быть очищены любым способом очистки белка, известным в данной области техники, например посредством хроматографии (например ионообменной, анионообменной, аффинной и гель-фильтрационной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости или посредством любого другого стандартного метода очистки белков. См., например, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18); см. также способы, описанные в WO 2009/104074. Кроме того, биоконъюгаты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом, известным в данной облас- 26 035991 ти, для облегчения очистки. Фактические условия, используемые для очистки конкретного биоконъюгата, зависят, в частности, от стратегии синтеза (например синтетического получения или рекомбинантного получения), а также от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность и/или гидрофильность биоконъюгата, и понятны специалистам в данной области техники.
5.5 Антитела против О25В.
Антиген 025b, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), и/или биоконъюгаты, содержащие антиген 025В, описанные в данном документе (см. Раздел 5.4), могут быть использованы для индукции нейтрализующих антител против ЕхРЕС. В конкретном воплощении антиген 025В, описанный в данном документе, и/или биоконъюгаты, содержащие антиген 025В, описанные в данном документе, можно вводить субъекту (например человеку, мыши, кролику, крысе, морской свинке и т.д.) для индукции иммунного ответа, который включает продуцирование антител. Такие антитела могут быть выделены с использованием методов, известных специалисту в данной области (например иммуноаффинной хроматографии, центрифугирования, осаждения и т.п.).
Кроме того, антиген 025В, описанный в данном документе, может быть использован для скрининга антител из библиотек антител. Например, выделенный 025В может быть иммобилизован на твердом носителе (например силикагеле, смоле, дериватизированной пластмассовой пленке, стеклянном шарике, хлопке, пластмассовом шарике, шарике из полистирола, геле оксида алюминия или полисахариде, магнитном шарике) и подвергнут скринингу на связывание с антителами. Альтернативно, антитела для скрининга могут быть иммобилизованы на твердом носителе и подвергнуты скринингу на связывание с 025В. Любой скрининговый анализ, такой как пэннинг-анализ, ELISA ((иммуноферментный твердофазный анализ), поверхностный плазмонный резонанс или другой скрининговый анализ антител, известный в данной области техники, может быть использован для скрининга антител, которые связываются с 025В. Библиотека антител для скрининга может быть имеющейся в продаже библиотекой, in vitro полученной библиотекой или библиотекой, полученной посредством идентификации и клонирования выделенных антител из субъекта, инфицированного ЕХРЕС. Библиотеки антител могут быть получены в соответствии со способами, известными в данной области. В конкретном воплощении библиотека антител получена посредством клонирования антител и использования их в библиотеках фагового дисплея или библиотеке фагмидного дисплея.
Антитела, идентифицируемые или индуцируемые с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, могут включать молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, то есть молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с 025В. Иммуноглобулиновые молекулы могут быть любого типа (например IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) или субкласса иммуноглобулиновых молекул. Антитела включают, без ограничения ими, моноклональные антитела, поливалентные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменτы, дисульфид-связанные Fvs (sdFv) и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам, индуцируемым или идентифицируемым с использованием способа, описанного в данном документе) и эпитопсвязывающие фрагменты любого из вышеперечисленных. В конкретном воплощении антитело, индуцируемое или распознаваемое с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело.
Антитела, индуцируемые или идентифицируемые с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, можно использовать для определения эффективности терапии и/или развития заболевания. Любая система иммуноанализа, известная в данной области, может быть использована для этой цели, включая, без ограничения ими, конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием таких способов, как радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), сэндвич-иммуноанализ, реакции преципитации, реакции диффузной преципитации в геле, иммунодиффузные анализы, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммуноанализы с протеином А и иммуноэлектрофоретические анализы.
Антитела, индуцируемые или идентифируемые с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, могут быть использованы для детекции штаммов 025В Е. coli, например из множества штаммов Е. coli, и/или для диагностики инфекции штаммом 025В Е. coli.
5.6. Композиции.
5.6.1. Композиции, содержащие клетки-хозяева.
В одном аспекте в данном описании изобретения предложены композиции, содержащие клеткихозяева, описанные в данном документе. Такие композиции могут быть использованы в способах получения биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4), например композиции можно культивировать в условиях, подходящих для получения белков. Затем биоконъюгаты могут быть выделены из указанных композиций с использованием способов, известных в данной области техники.
Композиции, содержащие клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут содержать дополнительные компоненты, подходящие для поддержания и выживания клеток-хозяев, описанных в данном документе, и могут дополнительно содержать дополнительные компоненты, необходи- 27 035991 мые или полезные для получения белков клетками-хозяевами, например индукторы индуцибельных промоторов, такие как арабиноза, IPTG (изопропилтиогалактозид).
5.6.2 Композиции, содержащие антигены и/или биоконъюгаты.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены композиции (например фармацевтические композиции), содержащие один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2), и композиции (например фармацевтические композиции), содержащие один или более биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4). В конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2). В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит один или более биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4). В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2), и один или более биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4). Композиции, описанные в данном документе, полезны для лечения и предупреждения инфекции субъектов (например людей) внекишечными патогенными Е. coli (ЕхРЕС). См. Раздел 5.7.
В некоторых воплощениях в дополнение к содержащемуся О-антигену Е. coli, описанному в данном документе (см. Раздел 5.2), и/или биоконъюгату, описанному в данном документе (см. Раздел 5.4), композиции (например фармацевтические композиции), описанные в данном документе, содержат фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в данном описании изобретения термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или зарегистрированный в фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях для применения у животных и более конкретно для применения у людей. Термин носитель при использовании в данном описании изобретения в контексте фармацевтически приемлемого носителя, относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят фармацевтическую композицию. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеролмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Phrmaceutical Sciences E.W. Martin.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения раскрыта композиция, содержащая белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2), связанный с антигеном, описанным в данном документе, например с О-антигеном ЕхРЕС, описанный в Разделе 5.2.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 025b Е. coli (см. Раздел 5.2).
В другом конкретном воплощении композиция, раскрытая в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с О25АЕ. coli (см. Раздел 5.2).
В другом конкретном воплощении композиция, раскрытая в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с O1 Е. coli (см. Раздел 5.2). В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой О1А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой О1В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой О1С.
В другом конкретном воплощении композиция, раскрытая в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с O2 Е. coli (см. Раздел 5.2).
В другом конкретном воплощении композиция, раскрытая в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с O6 Е. coli (см. Раздел 5.2). В конкретном воплощении указанная макромолекула O6 представляет собой макромолекулу O6, содержащую разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу O25 (например О25А или 025В), или биоконъюгат, содержащий O25 (например О25А или 025В), и (2) макромолекулу O1 или биоконъюгат, содержащий O1. См. Раздел 5.2. В конкретном воплощении указанная макромолекула O25 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой 01А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой 01С.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу O25 (например О25А или 025В) или биоконъюгат, содержащий O25 (например О25А или 025В), и (2) макромолекулу O2 или биоконъюгат, содержащий O2. См. Разделы 5.2 и 5.4. В конкретном воплощении указанная макромолекула O25
- 28 035991 представляет собой макромолекулу 025В.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу O25 (например О25А или 025b) или биоконъюгат, содержащий O25 (например О25А или O25B), и (2) макромолекулу O6 (например макромолекулу O6, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид), или биоконъюгат, содержащий O6. См. Разделы 5.2 и 5.4. В конкретном воплощении указанная макромолекула O25 представляет собой макромолекулу O25B. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glcмоносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая O25B Е. coli (см. Раздел 5.2), или биоконъюгат, содержащий O25 (см. Раздел 5.4), и по меньшей мере один из следующих: (1) O1 Е. coli или биоконъюгат, содержащий O1 (см. Разделы 5.2 и 5.4); (2) O2 Е. coli или биоконъюгат, содержащий O2 (см. Разделы 5.2 и 5.4); и/или (3) O6 Е. coli или биоконъюгат, содержащий O6 (см. Разделы 5.2 и 5.4). В другом конкретном воплощении указанный 01 представляет собой 01А. В другом конкретном воплощении указанный 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанный 01 представляет собой 01С. В другом конкретном воплощении указанный 06 представляет собой 06, содержащий разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере два из следующих: (1) макромолекулу 025 (например О25А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В); (2) макромолекулу O1 или биоконъюгат, содержащий O1; (3) макромолекулу O2 или биоконъюгат, содержащий 02; и/или (4) макромолекулу 06 (например макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид), или биоконъюгат, содержащий O6. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01С. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glcмоносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 01а Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий O1B Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 01с Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 02 Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 06 Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с O25B Е. coli (см. Раздел 5.2), (2) белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа O1, например O1A (см. Раздел 5.2), (3) белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.1.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа O2 (см. Раздел 5.2) и (4) белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа O6 (см. Раздел 5.2).
В некоторых воплощениях вышеуказанные композиции содержат белок-носитель (например белокноситель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МБР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа, не являющегося O1, O2, O6 или O25. Другие применимые серотипы Е. coli описаны, например, в примере 1 и в табл. 1 ниже.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 025 (например О25А или 025В).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 01 (например 01А, 01В или 01С).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, со- 29 035991 держит макромолекулу O2.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу O6 (например макромолекулу O6, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу O25 (например О25А или 025b), макромолекулу O1, макромолекулу O2 и макромолекулу O6 (например макромолекулу O6, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид). В конкретном воплощении указанная макромолекула O25 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O1 представляет собой 01А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула O6 представляет собой макромолекулу O6, содержащую разветвленный Glc-моносахарид.
Композиции, предложенные в данном описании изобретения, могут быть использованы для индукции иммунного ответа у хозяина, которому вводят композицию, то есть они являются иммуногенными. Таким образом, композиции, описанные в данном документе, можно использовать в качестве вакцин против инфекции ЕхРЕС или можно использовать в лечении инфекции ЕхРЕС и можно, соответственно, приготовить в виде фармацевтических композиций. См. Раздел 5.7.
Композиции, содержащие биоконъюгаты и/или макромолекулы, описанные в данном документе, могут содержать любые дополнительные компоненты, подходящие для применения при фармацевтическом введении. В конкретных воплощениях композиции, описанные в данном документе, являются моновалентными композициями. В других воплощениях композиции, описанные в данном документе, являются мультивалентными композициями, например бивалентными, трехвалентными и тетравалентными композициями. Например, мультивалентная композиция содержит более одного биоконъюгата или Оантигена Е. coli, описанных в данном документе. См. описание О-антигенов Е. coli и биоконъюгатов в разделах 5.2 и 5.4, соответственно. В конкретном воплощении композиция, описанная в данном документе, представляет собой тетравалентную композицию, содержащую макромолекулу или биоконъюгат, где указанные валентности обусловлены О-антигенами Е. coli серотипов/субсеротипов 025В, 01А, O6 и O2.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат консервант, например производное ртути тимеросал. В конкретном воплощении фармацевтические композиции, описанные в данном документе, содержат от 0,001 до 0,01% тимеросала. В других воплощениях фармацевтические композиции, описанные в данном документе, не содержат консервант.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе (например иммуногенные композиции), содержат или вводят в комбинации с адъювантом. Адъювант для введения в комбинации с композицией, описанной в данном документе, можно вводить до введения, одновременно с введением или после введения указанной композиции. В некоторых воплощениях термин адъювант относится к компоненту, который при введении в комбинации с композицией, описанной в данном документе, или как часть этой композиции дополняет, усиливает и/или поддерживает иммунный ответ на биоконъюгат, но при введении одного этого компонента, он не индуцирует иммунный ответ на биоконъюгат. В некоторых воплощениях адъювант вызывает иммунный ответ на полипептид биоконъюгата и не вызывает аллергии или других побочных реакций. Адъюванты могут усилить иммунный ответ посредством нескольких механизмов, включающих, например, рекрутмент лимфоцитов, стимуляцию В- и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов.
Конкретные примеры адъювантов включают, без ограничения ими, соли алюминия (квасцы) (такие как гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия и сульфат алюминия), 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (MPL) (см. патент Великобритании GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), полисорбат 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), имидазопиридиновые соединения (см. международную заявку PCT/US2007/064857, опубликованную как международная публикация WO2007/109812), имидазохиноксалиновые соединения (см. международную заявку PCT/US2007/064858, опубликованную как международная публикация WO2007/109813) и сапонины, такие как QS21 (см. Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); патент US 5057540). В некоторых воплощениях адъювант представляет собой адъювант Фрейнда (полный или неполный). Другие адъюванты представляют собой эмульсии масло-в-воде (такие как сквален или арахисовое масло), возможно в комбинации с иммуностимуляторами, такими как монофосфориллипид А (см. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Другой адъювант представляет собой CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, готовят в виде препарата, подходящего для предполагаемого пути введения субъекту. Например, композиции, описанные в данном документе, могут быть приготовлены в виде препарата, подходящего для подкожного, парентерального, перорального, внутрикожного, трансдермального, колоректального, внутрибрюшинного и ректального введения. В конкретном воплощении фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде препарата для внутривенного, перорального, внутрибрюшинного, интраназального, внутритрахеального, подкожного, внутримышечного, местного, внутрикожного, транскожного или легочного введения.
- 30 035991
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат один или более буферов, например фосфатный буфер и сахарозо-фосфатно-глутаматный буфер. В других воплощениях композиции, описанные в данном документе, не содержат буфер.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат одну или более солей, например хлорид натрия, хлорид кальция, фосфат натрия, мононатрия глутамат, и соли алюминия (например гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, квасцы (алюмосульфат калия) или смесь таких солей алюминия). В других воплощениях композиции, описанные в данном документе, не содержат солей.
Композиции, описанные в данном документе, могут быть включены в контейнер, пакет или дозатор вместе с инструкциями по введению.
Композиции, описанные в данном документе, можно хранить перед использованием, например, композиции можно хранить замороженными (например примерно при -20°С или примерно при -70°С); хранить в охлажденном состоянии (например примерно при 4°С); или хранить при комнатной температуре.
5.7. Профилактические и терапевтические применения.
В данном описании изобретения предложены способы лечения и предупреждения инфекции внекишечной Е. coli (ЕхРЕС) субъекта, включающие введение субъекту О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4) или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). В конкретном воплощении композиции, описанные в данном документе (см. Раздел 5.6.2) используют для предупреждения ЕхРЕС-инфекции субъекта (например людей), то есть композиции, описанные в данном документе, используют для вакцинации субъекта против ЕхРЕС-инфекции. В другом конкретном воплощении композиции, описанные в данном документе (см. Раздел 5.6.2), используют в лечении субъекта, который инфицирован ЕхРЕС.
В данном описании изобретения также предложены способы индукции иммунного ответа у субъекта против ЕхРЕС, включающие введение субъекту О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). В одном воплощении указанный субъект инфицирован ЕхРЕС во время введения. В другом воплощении указанный субъект не инфицирован ЕхРЕС во время введения.
В данном описании изобретения также предложены способы индукции продуцирования опсонофагоцитирующих антител против ЕхРЕС у субъекта, включающие введение субъекту О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). В одном воплощении указанный субъект инфицирован ЕхРЕС во время введения. В другом воплощении указанный субъект не инфицирован ЕхРЕС во время введения.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен способ предупреждения инфекции Е. coli (например ЕхРЕС) субъекта, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, описанной в Разделе 5.6.2. Способы предупреждения инфицирования ЕхРЕС субъекта, предложенные в данном описании изобретения, приводят к индукции иммунного ответа у субъекта, и включают введение субъекту композиции, описанной в Разделе 5.6.2. Специалисту в данной области понятно, что способы индукции иммунного ответа у субъекта, описанного в данном документе, приводят к вакцинации субъекта против инфекции штаммами ЕхРЕС, Оантигены которых присутствуют в композиции(ях).
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен способ лечения инфекции Е. coli (например ЕхРЕС) у субъекта, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, описанной в Разделе 5.6.2.
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции ЕхРЕС, вызванной любым серотипом, субсеротипом или штаммом ЕхРЕС. В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является более эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции ЕхРЕС, чем один серотип ЕхРЕС.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O25. В конкретном воплощении указанный серотип O25 представляет собой 025b. В конкретном воплощении указанный серотип O25 представляет собой О25А.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в
- 31 035991 данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O1. В конкретном воплощении указанный серотип O1 представляет собой О1А. В другом конкретном воплощении, указанный серотип O1 представляет собой 01b. В другом конкретном воплощении, указанный серотип O1 представляет собой 01с.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O2.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа O6.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной двумя или более из следующих серотипов Е. coli: O25 (например 025В и O25 А), O1 (например О1А, О1В и О1С), O2 и/или O6.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной каждым из следующих серотипов Е. coli: O25 (например О25В и О25А), O1 (например О1А, О1В и О1С), O2 и O6.
Для того чтобы лечить субъекта, имеющего ЕхРЕС-инфекцию, или иммунизировать субъекта против ЕхРЕС-инфекции, субъекту можно вводить одну композицию, описанную в данном документе, где указанная композиция содержит один, два, три, четыре или более антигенов Е. coli, описанных в данном документе. См. Раздел 5.2. Альтернативно, чтобы лечить субъекта, имеющего ЕхРЕС-инфекцию или иммунизировать субъекта против ЕхРЕС-инфекции, субъекту можно вводить несколько биоконъюгатов, описанных в данном документе, например субъекту можно вводить два, три, четыре или более биоконъюгатов, описанных в Разделе 5.4. Альтернативно, для лечения субъекта с ЕхРЕС-инфекцией или иммунизации субъекта против ЕхРЕС-инфекции, субъекту можно вводить несколько композиций, описанных в данном документе, например субъекту можно вводить две, три, четыре или более композиций, описанных в Разделе 5.6.2.
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения Оантигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для уменьшения симптомов, вызванных ЕхРЕС-инфекцией. Симптомы ЕхРЕС-инфекции могут варьироваться в зависимости от природы инфекции и могут включать, без ограничения ими: дизурию, повышение частоты мочеиспускания или неотложный позыв, пиурию, гематурию, боль в спине, боль при мочеиспускании, лихорадку, озноб и/или тошноту (например у субъектов с инфекциями мочевых путей, вызванными ЕхРЕС); высокую температуру, головную боль, ригидность затылочных мышц, тошноту, рвоту, судороги, сонливость и/или светочувствительность (например у субъектов с менингитом, вызванным ЕхРЕС); лихорадку, увеличение частоты сердечных сокращений, увеличение частоты дыхания, снижение диуреза, снижение количества тромбоцитов, боль в животе, затруднение дыхания и/или нарушение функции сердца (например у субъектов с сепсисом, вызванным ЕхРЕС).
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения Оантигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для снижения вероятности госпитализации субъекта, страдающего от ЕхРЕС-инфекции. В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцируемый у субъекта после введения О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для сокращения продолжительности госпитализации субъекта, страдающего от ЕхРЕС-инфекции.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы предупреждения и/или лечения ЕхРЕС-инфекции у субъекта, вызванной Е. coli серотипа 025В, путем введения антитела, описанного в данном документе, то есть анти-О25В антитела, описанного в данном документе. В конкретных воплощениях нейтрализующее антитело представляет собой моноклональное антитело.
5.7.1. Комбинированные терапевтические средства.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанная в данном документе (см. Раздел 5.6.2), могут быть введены субъекту в комбинации с одним или более другими терапевтическими средствами (например антибактериальными или иммуномодулирующими терапевтиче- 32 035991 скими средствами). Одно или более других терапевтических средства могут быть полезными в лечении или предупреждении ЕхРЕС-инфекции или могут улучшить симптом или состояние, связанное с ЕхРЕСинфекцией. В некоторых воплощениях один или более других терапевтических средств представляют собой обезболивающие или жаропонижающие терапевтические средства. В некоторых воплощениях терапевтические средства вводят с интервалом менее 5 мин, с интервалом менее 30 мин, с интервалом менее 1 ч, с интервалом примерно 1 ч, с интервалом от примерно 1 до примерно 2 ч, с интервалом от примерно 2 до примерно 3 ч, с интервалом от примерно 3 до примерно 4 ч, с интервалом от примерно 4 до примерно 5 ч, с интервалом от примерно 5 до примерно 6 ч, с интервалом от примерно 6 до примерно 7 ч, с интервалом от примерно 7 до примерно 8 ч, с интервалом от примерно 8 до примерно 9 ч, с интервалом от примерно 9 до примерно 10 ч, с интервалом от примерно 10 до примерно 11 ч, с интервалом от примерно 11 до примерно 12 ч, с интервалом от примерно 12 до 18 ч, с интервалом от 18 до 24 ч, с интервалом от 24 до 36 ч, с интервалом от 36 до 48 ч, с интервалом от 48 до 52 ч, с интервалом от 52 до 60 ч, с интервалом от 60 до 72 ч, с интервалом от 72 до 84 ч, с интервалом от 84 до 96 ч или с интервалом от 96 до 120 ч.
Любые антибактериальные агенты, известные специалистам в данной области, могут быть использованы в комбинации с О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). Неограничивающие примеры антибактериальных агентов включают Амикацин, Амоксициллин, Амоксициллин-клавулановая кислота, Амфотерицин-В, Ампициллин, Ампициллинсульбактам, Апрамицин, Азитромицин, Азтреонам, Бацитрацин, Бензилпенициллин, Каспофунгин, Цефаклор, Цефадроксил, Цефалексин, Цефалотин, Цефазолин, Цефдинир, Цефепим, Цефиксим, Цефменоксим, Цефоперазон, Цефоперазон-сульбактам, Цефотаксим, Цефокситин, Цефпиром, Цефподоксим, Цефподоксим-клавулановая кислота, Цефподоксим-сульбактам, Цефпрозил, Цефкином, Цефтазидим, Цефтибутен, Цефтиофур, Цефтобипрол, Цефтриаксон, Цефуроксим, Хлорамфеникол, Флорфеникол, Ципрофлоксацин, Кларитромицин, Клинафлоксацин, Клиндамицин, Клоксациллин, Колистин, Котримоксазол (Триметоприм/сульфаметоксазол), Далбаванцин, Дальфопристин/Хинупристин, Даптомицин, Дибекацин, Диклоксациллин, Дорипенем, Доксициклин, Энрофлоксацин, Эртапенем, Эритромицин, Флуклоксациллин, Флуконазол, Флуцитозин, Фосфомицин, фусидовая кислота, Гареноксацин, Гатифлоксацин, Гемифлоксацин, Гентамицин, Имипенем, Итраконазол, Канамицин, Кетоконазол, Левофлоксацин, Линкомицин, Линезолид, Лоракарбеф, Мециллинам (амдиноциллин), Меропенем, Метронидазол, Мезлоциллин, Мезлоциллин-сульбактам, Миноциклин, Моксифлоксацин, Мупироцин, Налидиксовая кислота, Неомицин, Нетилмицин, Нитрофурантоин, Норфлоксацин, Офлоксацин, Оксациллин, Пефлоксацин, Пенициллин V, Пиперациллин, Пиперациллин-сульбактам, Пиперациллин-тазобактам, Рифампицин, Рокситромицин, Спарфлоксацин, Спектиномицин, Спирамицин, Стрептомицин, Сульбактам, Сульфаметоксазол, Тейкопланин, Телаванцин, Телитромицин, Темоциллин, Тетрациклин, Тикарциллин, Тикарциллинклавулановая кислота, Тигециклин, Тобрамицин, Триметоприм, Тровафлоксацин, Тилозин, Ванкомицин, Виргиниамицин и Вориконазол.
В некоторых воплощениях комбинированная терапия может включать введение двух или более Оантигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4), и/или композиций, описанных в данном документе (см. Раздел 5.6.2).
5.7.2. Группы пациентов.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят наивному субъекту, то есть субъекту, который не имеет ЕхРЕСинфекции или не имел ранее ЕхРЕС-инфекции. В одном воплощении О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят наивному субъекту, у которого есть риск инфицирования ЕхРЕС.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, у которого диагностирована ЕхРЕС-инфекция. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, инфицированному ЕхРЕС, до появления симптомов или до того, как симптомы становятся серьезными (например до того, как пациенту потребуется госпитализация).
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, у которого диагностирована UPEC-инфекция. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, страдающему от рецидивов инфекции мочевыводящих путей. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в
- 33 035991 данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, страдающему от рецидивов инфекции мочевыводящих путей, но здоровому в момент лечения. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, имеющему бактериемию или сепсис или рискующему их приобрести.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой животное. В некоторых воплощениях животное представляет собой птицу. В некоторых воплощениях животное представляет собой собаку. В некоторых воплощениях животное представляет собой кошку. В некоторых воплощениях животное представляет собой лошадь. В некоторых воплощениях животное представляет собой корову. В некоторых воплощениях животное представляет собой млекопитающее, например лошадь, свинью, мышь или примата. В конкретном воплощении субъект представляет собой человека.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой взрослого человека. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой взрослого человека в возрасте старше 50 лет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой пожилого человека.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой ребенка. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой младенца. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой недоношенного младенца. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят Оантиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой ребенка преддошкольного возраста. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят Оантиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или вводят композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), не является младенцем младше 6 месяцев.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является беременным. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген is. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой женщину, которая родила на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель раньше срока.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой субъекта с повышенным риском ЕхРЕС (например иммунокомпрометированного или иммунодефицитного субъекта). В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой субъекта, находящегося в близком контакте с субъектом, имеющим ЕхРЕС-инфекцию, или с повышенным риском ЕхРЕС-инфекции.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является медицинским работником (например врачом или медсестрой). В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой иммунокомпрометированного (например страдающего от HIV-инфекции) или иммуносупрессированного субъекта.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию,
- 34 035991 описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеет диабет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел
5.6.2), имеет рассеянный склероз.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеют состояние, требующее использования катетера. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеет повреждение спинного мозга.
5.7.3. Доза и частота введения.
Количество О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), био конъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), которое является эффективным для лечения и/или предупреждения ЕхРЕС-инфекции, зависит от природы заболевания и может быть определено стандартными клиническими методами. Введение О-антигена, биоконъюгата и/или композиции может быть выполнено различными путями, известными клиницисту, например подкожно, парентерально, внутривенно, внутримышечно, местно, перорально, внутрикожно, чрескожно, интраназально и т.п. В одном воплощении введение осуществляется посредством внутримышечной инъекции.
Точная доза для использования в композиции также зависит от пути введения и серьезности инфекции и должна быть определена в соответствии с оценкой лечащего врача и состоянием каждого субъекта. Например, эффективные дозы также могут варьироваться в зависимости от средств введения, места введения, физиологического состояния пациента (включая возраст, массу тела, состояние здоровья), независимо от того, является пациент человеком или животным, от других введенных терапевтических средств и от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. Лечебные дозы оптимально титруют для оптимизации безопасности и эффективности.
В некоторых воплощениях используют анализ in vitro, чтобы способствовать определению оптимальных диапазонов доз. См. Раздел 5.8. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных in vitro или на животных модельных аналитических системах.
В некоторых воплощениях типичные дозы вакцин на основе гликоконъюгатов (например композиций, содержащих биоконъюгаты), варьируются примерно от 0,1 мкг до 400 мкг углевода на дозу. В других воплощениях примерные дозы вакцин на основе гликоконъюгатов (например композиций, содержащих биоконъюгаты), варьируются примерно от 0,1 мкг до 4000 мкг белка(ов) на дозу. В некоторых воплощениях типичная доза вакцины на основе гликоконъюгата (например композиции, содержащей биоконъюгаты) содержит 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг углевода(ов) на дозу. В некоторых воплощениях примерная доза вакцины на основе гликоконъюгата (например композиции, содержащей биоконъюгаты) содержит 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мкг белка(ов) на дозу. В некоторых типичных воплощениях доза для введения человеку соответствует 0,5 мл, содержащим примерно 1-10, например примерно 2-6, например примерно 4 мкг полисахарида на каждый включенный гликоконъюгат.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту однократно в виде единичной дозы. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в виде единичной дозы, за которой следует вторая доза через 3-6 недель. В соответствии с этими воплощениями бустерные введения могут быть введены субъекту с интервалами от 6 до 12 месяцев после второго введения. В некоторых воплощениях в бустерных введениях можно использовать разные О-антигены Е. coli, биоконъюгаты или композиции. В некоторых воплощениях введение одного и того же О-антигена Е. coli, биоконъюгата или композиции можно повторять и эти введения могут быть разделены по меньшей мере 1 сутками, 2 сутками, 3 сутками, 5 сутками, 7 сутками, 10 сутками, 15 сутками, 30 сутками, 45 сутками, 2 месяцами, 75 сутками, 3 месяцами или по меньшей мере 6 месяцами. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в виде единичной дозы один раз в год.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в виде 2, 3, 4, 5 или более доз с интервалом 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель или 6 недель. В некоторых воплощениях 2, 3, 4, 5 или более доз О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту с интер- 35 035991 валом 2, 3, 4, 5 или 6 недель в дозе от 0,1 мкг до 0,5 мг, от 0,1 мкг до 0,4 мг, от 0,1 мкг до 0,3 мг, от 0,1 мкг до 0,2 мг или от 0,1 мкг до 0,1 мг углеводного содержимого. В некоторых воплощениях введенные
О-антиген Е. coli, биоконъюгат или композицию каждый раз являются одними и теми же. В некоторых воплощениях введенные О-антиген Е. coli, биоконъюгат или композиция каждый раз являются разными.
Для пассивной иммунизации антителом (например анти-О25В антителом) доза может варьироваться примерно от 0,0001 до 100 мг антитела на кг массы тела или от 0,01 до 5 мг антитела на кг массы тела. Например, доза может составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг или, другими словами, 70 мг или 700 мг или в диапазоне 70-700 мг, соответственно, для пациента с массой тела 70 кг. Типичный режим лечения включает введение один раз каждые две недели, или один раз в месяц, один раз каждые 3-6 месяца в течение одного года или нескольких лет или с интервалами в несколько лет. Интервалы могут быть неодинаковыми и изменяться в зависимости от уровня антитела в крови пациента.
5.8. Анализы.
Анализ для определения способности биоконъюгатов индуцировать иммунный ответ.
Способность биоконъюгатов/композиций, описанных в данном документе, индуцировать иммунный ответ у субъекта, может быть определена с использованием подхода, известного специалисту в данной области или описанного в данном документе. В некоторых воплощениях способность биоконъюгата индуцировать иммунный ответ у субъекта может быть определена путем иммунизации субъекта (например мыши) или группы субъектов биоконъюгатом, описанным в данном документе, и иммунизации дополнительного субъекта (например мыши) или группы субъектов контролем (PBS). Затем этих субъектов или группу субъектов можно провокационно инфицировать ЕхРЕС и определить способность ЕхРЕС вызывать заболевание (например UTI) у этих субъектов или группы субъектов. Специалистам в данной области понятно, что если субъект или группа субъектов, иммунизированных контролем, страдает(ют) от заболевания после провокационного инфицирования ЕхРЕС, а субъект или группа субъектов, иммунизированных биоконъюгатом(ами) или их композицией, описанной в данном документе, страдает в меньшей степени или не страдает от заболевания, тогда биоконъюгат способен индуцировать иммунный ответ у субъекта. Способность биоконъюгата(ов) или их композиции, описанных в данном документе, индуцировать образование антисыворотки, которая перекрестно реагирует с О-антигеном из ЕхРЕС, может быть проанализирована посредством, например, иммунного анализа, такого как ELISA.
Бактериальные анализы in vitro.
Способность биоконъюгатов, описанных в данном документе, индуцировать иммунный ответ у субъекта, можно оценить с использованием сывороточного бактерицидного теста (SBA) или опсонофагоцитарного киллинг-анализа (OPK), который представляет собой общепризнанный и принятый способ, который был использован для получения одобрения вакцин на основе гликоконъюгатов. Такие анализы хорошо известны в данной области техники и, в нескольких словах, включают стадии получения и выделения антител против интересующей мишени (например О- антигена, например 025b, Е. coli), путем введения субъекту (например мыши) соединения, которое вызывает такие антитела. Затем бактерицидную способность антител можно определить посредством, например, культивирования рассматриваемых бактерий (например Е. coli релевантного серотипа) в присутствии указанных антител и комплемента и - в зависимости от анализа - нейтрофилов и анализа способности антител убивать и/или нейтрализовать эти бактерии, например с использованием стандартных микробиологических подходов.
5.9. Наборы.
В данном описании изобретения предложен фармацевтическая упаковка или набор, содержащие один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами композиций, описанных в данном документе (см. Раздел 5.6.2), такими как один или более антигенов Е. coli (см. Раздел 5.2) и/или биоконъюгатов (см. Раздел 5.4), предложенных в данном описании изобретения. С таким контейнером(ами) при необходимости может быть связано уведомление в форме, предписанной правительственным учреждением, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, которое отражает одобрение этим учреждением изготовления, применения или продажи для введения человеку. Наборы, включенные в данное изобретение, могут быть использованы в вышеописанных способах лечения и иммунизации субъектов.
6. Примеры.
Методы.
Агглютинация.
Процесс, в котором клетки или лизированную клеточную массу смешивают с антисывороткой, содержащей антитела, специфичные к полимерной структуре, например к О-антигену. Когда антисыворотка распознает клеточные структуры, образуются видимые, нерастворимые агрегаты. Этот метод обычно используют для идентификации серотипов О, К и Н. См. DebRoy, et al., (2011) Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185.
Получение образца LPS для анализа посредством SDS PAGE.
LPS грамотрицательных клеток состоит из липида А в качестве основы, модифицированного коровым олигосахаридом, обеспечивающим присоединение О-антигена. Для анализа LPS клинических изоля- 36 035991 тов, клетки выращивали в стандартной среде LB (Лурия-Бертани) при 37°С в течение 24 ч и биомассу, соответствующую 1 мл культуры, с OD600 равной 2, собирали и лизировали в 1х буфере Lammli для образцов и инкубировали при 95°С в течение 10 мин. Экстракты затем обрабатывали в течение 1 ч при 65°С для удаления какого-либо сигнала белка с использованием 1 г/л протеиназы K. Обработанные экстракты разделяли с помощью SDS PAGE, и LPS визуализировали посредством окрашивания серебром или Вестерн-блоттинга с использованием подходящей антисыворотки.
LPS препарат для покрытия планшетов ELISA.
LPS получали с использованием способа, описанного у Apicella, (2008) Methods Mol Biol 431, 3-13, и затем очищали, как описано у Perdomo and Montero, (2006) Biotecnologia Aplicada 23: 124-129.
2AB OPS HPLC: 'LLO-метод идентификационных отпечатков'.
Этот метод используют для анализа структуры UPP-связанного OPS.
Для экстракции UPP-связанных гликанов, клетки Е. coli промывали 0,9% NaCl и лиофилизировали. Высушенные клетки экстрагировали органическим растворителем (метанол:вода (M:W = от 17:3 до 19:1, об/об) и/или смесями хлороформ:метанол:вода с оптимизированным соотношением (например Х:М:В = 10:10:3 об/об/об)). Экстракты сушили под потоком N2 и ресуспендировали в C:M:W=3:48:47. Для очистки экстрагированных гликолипидов ресуспендирующую смесь 3:48:47 пропускали через картридж tC18 Sep-PAK. Картридж кондиционировали 10 мл метанола, затем уравновешивали 10 мл 3:48:47 (C:M:W). После нанесения образца картридж промывали 10 мл 3:48:47 (C:M:W) и элюировали 5 мл метанола и 5 мл 10:10:3 (Х:М:В). Объединенные элюаты сушили в атмосфере N2. Образцы гликолипида гидролизовали путем растворения высушенных образцов в 2 мл смеси Н-пропанол:2 М трифторуксусной кислоты (1:1), нагревали до 50°С в течение 15 мин, и затем выпаривали досуха в атмосфере N2 (Glover, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). Высушенные образцы еще раз ресуспендировали в 3:48:47 и пропускали через картридж tC18, и поток сушили в атмосфере N2. Мечение с помощью 2-АВ и очистку гликана проводили, используя метод бумажных дисков, как описано (Bigge, et al., Anal Biochem 230(2): 22938; Merry, et al., Anal Biochem 304(1): 91-9).
2-АВ меченые гликаны разделяли с помощью HPLC с использованием нормально-фазовой колонки GlycoSep-N согласно Royle et al., но модифицированной к системе из трех растворителей (Royle, et al., Anal Biochem 304(1): 70-90). Растворителем А был 10 мМ формиат аммония, рН 4,4, в 80% ацетонитриле. Растворителем В был 30 мМ формиат аммония, рН 4,4, в 40% ацетонитриле. Растворителем С была 0,5% муравьиная кислота. Температура колонки составляла 30°С и 2-АВ-меченые гликаны обнаруживали по флуоресценции (возбуждение λех = 330 нм, испускание λem = 420 нм). Градиентные условия представляли собой линейный градиент от 100% А до 100% В в течение 160 мин при скорости потока 0,4 мл/мин, затем 2 мин от 100% В до 100% С при увеличении скорости потока до 1 мл/мин. Колонку промывали в течение 5 мин 100% С, возвращались к 100% А за 2 мин и пропуская образец в течение 15 мин при 100% А при скорости потока 1 мл/мин, затем возвращая скорость потока до 0,4 мл/мин за 5 мин. Образцы вводили в воде.
Анализ деацетилирования.
Эквивалент 2-АВ меченого гликана сушили при 30°С, ресуспендировали в 50 мкл воды с (образец) или без (имитация) 200 мМ NaOH (рН ~ 14) и инкубировали в течение 25 часов при 37°С. Раствор затем доводили до комнатной температуры и нейтрализовали добавлением раствора 200 мМ HCl (рН~1). После скоростной вакуумной сушки при 30°С образец перемаркировали 2АВ и анализировали с помощью HPLC.
Гидразинолиз посредством HPLC.
Тот же самый метод нормально-фазовой HPLC, описанный выше, использовали для отделения OPS, высвобождаемого из биоконъюгатов после гидразинолиза. Перед гидразинолизом биоконъюгаты, соответствующие 1 мг белка, полностью сушили под потоком N2. Высвобождение полисахарида осуществляли, используя набор Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release kit (Ludger #LL-HYDRAZ-A2) в соответствии с инструкциями изготовителя. В кратком изложении, 450 мкл гидразина добавляли к высушенным образцам под слоем N2 и инкубировали в течение 16 ч при температуре 85°С .Гидразин удаляли выпариванием в атмосфере N2 при 45°С. Повторное N-ацетилирование полисахаридов выполняли посредством инкубации в 471 мкл 4,5% уксусного ангидрида в 1 М бикарбонате натрия в течение двух часов на льду. Затем добавляли 600 мкл 5% раствора TFA (трифторуксусная кислота) и образцы гидролизовали в течение еще одного часа на льду. Очистку проводили на колонке ЕВ20 с использованием соответствующих буферов ЕВ20 А и В.
Высвобожденные и очищенные полисахариды метили с помощью 2-АВ и анализировали посредством НФ-HPLC, как описано для образцов LLO. Интересующие пики собирали и идентифицировали посредством MS/MS.
MS (масс-спектрометрия) и MS/MS (тандемная масс-спектрометрия) пиков HPLC.
Для анализа моносахаридной последовательности интересующей молекулы OPS выполняли массспектрометрический анализ. Высушенные, собранные фракции, соответствующие конкретным пикам HPLC, ресуспендировали в 5 мкл 10% ацетонитрила (ACN), 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) и
- 37 035991 смешивали 1:1 с матричным раствором (40 мг/мл DHB в 50% ACN, 0,1% TFA) на целевом планшете. Данные MS и MS/MS были получены вручную в режиме сканирования положительных ионов на массспектрометре Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany). MS/MS получали с использованием метода LIFT. Стандартную смесь пептидов (Bruker Daltonik GmbH) использовали для внешней калибровки. Спектры экспортировали с использованием программного обеспечения Flex Analysis (Bruker Daltonik GmbH) и анализировали вручную.
Клетки-хозяева.
Биоконъюгаты получали с помощью рекомбинантных клеток Е. coli, экспрессирующих посредством плазмид(ы) белок(и)-носитель(и) и олигосахарил-трансферазу из С. jejuni (PglB), и OPS из космид или мутантов с хромосомными вставками.
Генетически детоксифицированный ЕРА (Экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa, содержащий мутации L552V, АЕ553) использовали в качестве белка-носителя и модифицировали так, чтобы он включал 2 или 4 сайтов гликозилирования (упоминаются в данном описании изобретения как 2S-EPA и 4SEPA, соответственно) и С-концевую HIS-метку, и экспрессировали с использованием полученной на основе pBR322, арабиноза-индуцибельной плазмиды (см. Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61).
MBP (мальтозосвязывающий белок), нативный периплазматический, растворимый белок Е. coli экспрессировали с помощью pGVXN579. pGVXN579 представляет собой модифицированную плазмиду pMAL-p2X (New England Biolabs), кодирующую три бактериальные консенсусные последовательности N-гликозилирования, расположенные в ряд, с последующим тэгом Мус-Tag, слитым на С-конце с ORF (открытая рамка считывания) мальтозосвязывающего белка, кодируемой плазмидой. Такое расположение обеспечивало возможность аффинной очистки MBP биоконъюгата независимо от HIS-метки. Индукция экспрессии контролируется промотором tac и индуцируется IPTG (изопропилтиогалактозид).
Белок PglB, экспрессируемый с помощью плазмиды рЕХТ21 (фрагмент EcoRIIBamHI из pMAFlO (Feldman et al., 2005, PNAS USA 102(8):3016-3021), клонировали в рЕХТ21 с С-терминально слитой НАметкой. Вариантами экспрессионной плазмиды являются оптимизация кодонов (pGVXN939), оптимизация кодонов с делецией сайта гликозилирования (pGVXN948), и удаленной НА-Тметкой (pGVXN970) и оптимизация кодонов и делеция НА-метки (pGVXN971).
Клинические изоляты анализировали на их способность синтезировать некоторые OPS с использованием агглютинации, Вестерн-блоттинга, окрашивания серебром, идентификационных отпечатков LLO, ПЦР-серотипирования или подобных методов, которые позволяют идентифицировать структурные характеристики OPS, и также на их фенотип резистентности к антибиотикам. В некоторых клинических изолятах был удален фрагмент хромосомы для фермента лигазы, WaaL, для увеличения доступности OPS для гликозилирования белка или OPS анализа.
Для дополнительного анализа клинических изолятов, кластер rfb лабораторного штамма W3110 заменяли кластером rfb, клонированным из клинических изолятов, и анализировали биосинтез OPS. Удаляли ген waaL для повышения эффективности получения биоконъюгата.
Обмен кластеров и делеции waaL осуществляли посредством гомологичной рекомбинации, используя оптимизированный метод (см. международную заявку на патент РСТ/ЕР2013/068737) или опубликованные методики (Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645). Для обмена кластера OPS, интересующий кластер rfb из клинического изолята клонировали в плазмиду контрселекции pDOC-C, наряду с кассетой резистентности к антибиотикам, для последующей интеграции в локус rfb штамма W3110 Е. coli (Kuhlman and Cox, 2010, Nucleic acids research 38, e92; Lee et al, 2009, BMC Microbiol 9, 252). Гомологичную рекомбинацию больших интересующих кластеров rfb выполняли, используя фланкирующую ДНК последовательность кодирования кластера rfb из W3110 длиной от 0,5 до 1,5 т.п.н. и линеаризацию in vivo вставки ДНК из плазмиды, несущей rfb. Полученный штамм, содержащий замененный кластер rfb (с кассетой резистентности к антибиотикам и без нее), то есть в кластере rfb из W3110 молекула ДНК между генами gale и gnd была заменена на аналогичный участок, выделенный из клинического изолята Е. coli.
В некоторых экспериментах штаммы W3110, содержащие космиду, кодирующую кластер rfb данного серотипа Е. coli, использовали в качестве штаммов-хозяев.
Для получения рекомбинантно экспрессированных биоконъюгатов в штаммах на основе W3110, удаляли находящиеся в W3110 гены, которые мешают рекомбинантному продуцированию OPS. Например, для получения клеткой-хозяином биоконъюгатов 025b, удаляли из W3110 кластер gtrABS. Для достижения этой цели использовали гомологичную рекомбинацию в соответствии с опубликованным способом (Bloor AE, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4):2520-5.), используя гомологичные фланкирующие последовательности выше гена gtrA и ниже гена gtrS.
Для сборки продуцирующих штаммов, штамм-хозяин трансформировали pglB и плазмидой для экспрессии носителя, посредством трансформации. См. Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793.
Получение биоконъюгата.
Получение биоконъюгата осуществляли путем выращивания клеток-хозяев и очистки биоконъюгатов, продуцируемых в периплазматическом пространстве. Культивирование происходило либо во встряхиваемых колбах, либо в периодическом процессе ферментации с подпиткой промышленного масштаба.
- 38 035991
Культивирование во встряхиваемых колбах выполняли при 37°С, используя среду, состоящую из соответствующих антибиотиков в среде ТВ (terrific broth), иногда с добавлением 5 мМ MgCl2. В среду высевали ночную культуру при значении OD, равном 0,05, из свежетрансформированных продуцирующих клеток, выращенных до середины фазы логарифмического роста, индуцированной 0,2% арабинозой и 1 мМ IPTG, дополнительно культивировали и собирали после 20 ч выращивания.
Периодические ферментации с подпиткой.
Аликвоту из банка продуцирующей клеточной линии использовали для инокуляции встряхиваемой колбы, содержащей соевую LB среду с соответствующими антибиотиками. Встряхиваемую колбу инкубировали при 180 об./мин, 37°С, в течение приблизительно 12 ч. Среды для серии опытов без добавок стерилизовали непосредственно внутри биореактора (33 мин при >121°С), охлаждали и добавляли добавки. 4 М KOH или 25% фосфорную кислоту присоединяли к ферментеру для регулирования рН, и рН доводили до рН 7. Выполняли инокуляцию биореактора и периодической культуры из предварительной культуры с получением исходного значения OD600, равного 0,005. рН стабильно поддерживали путем добавления 4 М KOH или 25% фосфорной кислоты. Поддерживают давление растворенного кислорода (DO). Максимальное давление поддерживали при 600 мбар (60 кПа). Образование продукта индуцировали L-арабинозой (0,1%) и/или IPTG (1 мМ). Немедленно после индукции начинали подпитку путем добавления питательной среды, содержащей 2,5% арабинозы и IPTG. Через 24±2 часа после индукции биореактор охлаждали до 25°С, подпитку прекращали и осуществляли сбор биомассы посредством фильтрации в тангенциальном потоке или центрифугирования.
Биомассу лизировали в 0,5% Triton X-100 посредством разрушения в течение 4 циклов гомогенизации под высоким давлением при 800 бар (80 МПа).
Биоконъюгаты очищали посредством колоночной хроматографии. Различные хроматографические методы были использованы для получения биоконъюгатов, в основном IMAC (аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла), анионообменная хроматография на основе Q-смолы (АЕС) и эксклюзионная хроматография (SEC). Описание таких методов см., например, в Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18) и WO 2009/104074.
Получение биоконъюгата для доклинических экспериментов.
Из предварительной культуры определенное количество было перенесено в биореактор, содержащий обогащенную среду при 35±0,2°С. Поддерживали рН и давление растворенного кислорода. Скорость перемешивания достигала 700 оборотов в минуту.
Когда плотность клеток достигала значения OD600 = 40±5, образование продукта индуцировали Lарабинозой (0,1%) и IPTG (1 мм). Подпитку начинали через 24±2 ч после индукции и биореактор охлаждали. Как только температура достигала 25°С, подпитку прекращали и собирали клетки.
Г омогенизация при высоком давлении.
Биомассу, соответствующую 50 л при сборе, оттаивали в течение 1 суток при 2-8±С. Затем в контейнер добавляли 2,5 л буфера для лизиса и осветления. Добавляли Triton Х-100 до конечной концентрации 0,5%, и полностью оттаявшие клетки разрушали посредством 4 циклов гомогенизации при высоком давлении при 800 бар (80 МПа). Клетки собирали и промывали с использованием стандартных методов.
Анализ моносахаридного состава.
Биоконъюгаты, содержащие приблизительно 8 мкг полисахарида, гидролизовали в течение шести часов в 104 мкл 3 М TFA при 99°С. TFA удаляли путем выпаривания и образцы промывали один раз 500 мкл 2-пропанола. Полученные моносахариды суспендировали в 100 мкл меченной смеси, содержащей 87,1 мг/мл 1-фенил-3-метил-5-пиразолона (РМР), 50% МеОН и 150 мМ NaOH. Мечение выполняли в течение 60 минут при 70°С. Образцы нейтрализовали добавлением 50 мкл 300 мМ HCl и 20 мкл 100 мМ Tris/HCl pH 7,0. РМР-меченные моносахариды очищали посредством экстракции, один раз 1 мл дибутилового эфира и три раза 1 мл CHCl3.
РМР-дериватизированные моносахариды разделяли посредством RP-HPLC (Merck-Hitachi) на колонке С18 Inertsil ODS-3 (GL Sciences), оснащенной предварительной колонкой. Применяли двухступенчатый градиент от 100% буфера А (13% ацетонитрил, 87% Н2О (0,045% KH2PO4, 0,05% триэтиламин, рН 7,0) до 50% буфера А/50% буфера В (21% ацетонитрила, 79% Н2О (0,045% KH2PO4, 0,05% триэтиламина, рН 7,0) в течение 4 мин до 100% буфера В в течение 47 мин при 35°С и скорости потока 1 мл/мин. Объем инъекции составлял 50 мкл и элюирование контролировали посредством онлайн УФ-определения при 250 нм. Отдельные пики идентифицировали путем наложения хроматограмм имеющихся в продаже стандартов моносахаридов D-глюкозы (Sigma-Aldrich #G7528), L-рамнозы (Sigma-Aldrich #R3875), Nацетил-D- глюкозамина (Sigma-Aldrich #A8625) и №ацетил-Ь-фукозамина (Omicron Biochemicals #FUC006).
Пример 1. Эпидемиология.
Для определения распределения серотипов Е. coli, вызывающих инфекцию мочевыводящих путей (UTI), выполняли эпидемиологическое исследование. Более 1800 изолятов Е. coli из образцов мочи человека собирали от субъектов в Швейцарии и О-антигенные серотипы (OPS) из каждого образца анализировали с использованием классических методов агглютинации. См. фиг. 4
- 39 035991
Отдельные образцы человеческой мочи анализировали для опознания патогенов и определения картины их резистентности к антибиотикам. Изоляты Е. coli получали из образцов после анализа. Изоляты Е. coli идентифицировали посредством классических микробиологических стратегий исключения и включения, включающих рост на хроме (CPS3) и на агаре Мак-Конки. Изоляты Е. coli кроме того анализировали с использованием анализа агглютинации для определения их О-антигенного серотипа. См. DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185. Изоляты из тех же О-антигенных серогрупп дополнительно анализировали для определения химической структуры О-цепи каждого изолята. См. табл. 1 А. Было определено, что некоторые выделенные штаммы Е. coli являются резистентными к антибиотикам, включая идентификацию фторхинолон-резистентных штаммов и штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL).
Таблица 1А. Распределение наиболее распространенных UTI-ассоциированных серотипов Е. coli из коллекции 1841 образцов мочи, собранных в Швейцарии в 2012. Показано распределение серотипов образцов из релевантных субпопуляций из 671 субъекта и распределение из всех** образцов
Наиболее распространенные серотипы Е. coli, ассоциированные с UTI
О-серотип Внебольничная UTI в возрасте 18-70 лет (п=671) О-серотип Внебольничная и больничная UTI для всех возрастов** (п=1871)
6 10,75% 2 8,75%
2 9,55% 6 8,47%
25 6,87% 25 8,37%
1 5,52% 75 4,56%
4 5,37% 1 4,29%
75 4,78% 8 3,86%
8 3,43% 18 3,53%
18 3,28% 4 3,26%
15 3,28% 15 2,39%
73 2,24% 73 2,17%
16 2,24% 16 1,85%
7 1,94% 7 1,68%
Серотипы O1, O2, O4, O6, O7, O8, O16, O18, O25, O73 и O75 выделяли из субъектов, независимо от местоположения, времени выделения, симптомов и целевой группы, предполагая, что они являлись преобладающими серотипами уропатогенных Е. coli (UPEC). Соответственно, определение наиболее распространенных О-антигенных серотипов указывает, что О-антиген-специфические вакцины могут быть ограничены подмножеством серотипов, а именно тех, которые в наибольшей степени ассоциированы с заболеванием, как определено в исследовании, описанном в данном примере.
Ретроспективный анализ UTI серотипов в 1323 изолятах за последние три десятилетия в США, полученных из центра регистрации Е. coli (ECRC), обеспечивает возможность тщательного сравнения с литературой и с текущими данными из Швейцарии. Преобладание верхних 20 серотипов было обнаружено независимо от местоположения, времени выделения, симптомов или целевой группы и предлагает преобладающие серотипы, связанные с UPEC (см. табл. 1В).
- 40 035991
Таблица 1B. Преобладание наиболее распространенных ассоциированных с UTI серотипов из выбранных литературных данных за 1987-2011 годы и из ретроспективно проанализированных данных для США за
2000-2011 (ECRC)
ОБОЗНАЧЕНИЕ ОБЩАЯ UTI ЦИСТИТ ПИЕЛОНЕФРИТ США 2000-2010
имеющиеся данные из 1860 изолятов имеющиеся данные из 1089 изолятов имеющиеся данные из 373 изолятов 315 (все образцы UTI кроме фекальных, всех возрастов, Ж+М) Количество нетииируемых было недоступно
Серотип
О1 4,8% 4,1% 5,4% 7,0%
02 7,1% 4,9% 15,3% 14,0%
04 7,8% 6,0% 3,2% 3,2%
Об 16,9 % 16,3 % 7,8% 18,7%
07 3,3% 2,4% 2,4% 1,9%
08 1,7% 3,2% 0,8% 3,5%
015 0,6% 1,5% 0,8% 1,3%
016 4,3% 3,2% 7,2% 1,9%
018 7,0% 7,1% 6,7% 7,0%
021 па па па 1,3%
022 0,6% 0,6% 0,5% 0,0%
025 3,0% 4,8% 0,5% 8,6%
075 7,5% 6,0% 8,6% 3,8%
083 1,9% 0,7% 0,5% 1,3%
020 1,6%
077 2,2%
082 1,9%
другие и нетипируемые/не доступны % 33,3 % 39,2 40,2%
другие О-типы (NT не доступны) 21,0%
Изоляты из описанных серотипов рассчитывали как процент от общего количества изолятов (Andreu et al., 1997, JInfect Dis 176:464-469; Blanco et al., 1996, Eur J Epidemiol 12:191-198; Fathollahi et al., 2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnson et al., 2005, J Clin Microbiol 43:60646072; Molina-Lopez et al., 2011, Journal of infection in developing countries 5:840-849; Sandberg et al., 1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L. 2007, The Journal of infection 55:8-18; Terai et al., 1997, Int J Urol 4:289294.) В некоторых случаях конкретные данные не были доступны; поэтому значения в процентах могут только дать указание на общее распределение серотипов в разных изолятах UTI в описанных исследованиях и должны рассматриваться с осторожностью. Однако другие описанные идентифицированные, но менее распространенные серотипы (O15, О20, O21, O22, O77 и O82) также включены.
Из всей информации, полученной из эпидемиологического анализа, взятой вместе, 10 преобладающих серотипов могут охватывать примерно 60-80% инфекций Е. coli, предполагая охват части нетипируемых штаммов. Кроме того, данные показывают неожиданное значение O25 серотипа в эпидемиологическом исследовании, проведенном в Швейцарии, по сравнению с литературными данными и последними данными из США. См. таблицы 1А и В.
О-антигенные серотипы Е. coli часто состоят из подтипов, которые являются неодинаковыми, но структурно и антигенно похожими. Чтобы идентифицировать неизвестные/незарегистрированные подтипы среди собранных клинических изолятов и идентифицировать наиболее распространенные подтипы О-антигена, химические структуры О-антигенов наиболее распространенных серотипов анализировали более подробно.
Пример 2. О25 Е. coli.
- 41 035991
В последние годы наблюдается повышенное распространение 025-положительных штаммов (см.
George and Manges (2010) Epidemiol Infect 138, 1679- 1690), и об этом свидетельствуют исследование, описанное в Примере 1, где было обнаружено, что серотип O25 является одним из четырех главных серотипов Е. coli с точки зрения распространенности.
О25А.
Структура единицы повтора О-антигена Е. coli серотипа O25 была опубликована ранее (см. Kenne et al., 1983, Carbohydrate Research 122, 249-256; и Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4) и представлена на фиг. 2В. Кластер rfb, относящийся к О-антигену O25 штамма Е47 Е. coli, является общедоступным (GenBank GU014554) и представлен на фиг. 2А. Е. coli E47a используется в качестве эталонного штамма для серотипирования O25. Кроме того, информация о последовательности кластера rfb доступна из последовательности генома штамма, вызывающего бессимптомную бактериурию, Е. coli 83972. (см. Zdziarskiet al., 2010, PLoS Pathog 6, e1001078). Хотя фенотипическая экспрессия O25 не была подтверждена, последовательности кластера rfb E. coli E47a и 83972 являются на 99,49% идентичными, убедительно свидетельствуя о том, что они кодируют один и тот же О-антиген.
О-антиген штаммов 83972 и Е47а Е. coli обозначен в данном описании изобретения как О25А, потому что, как описано ниже, новый О-антиген Е. coli, обозначенный 025b, был идентифицирован на основе анализа клинических изолятов, полученных в эпидемиологическом исследовании, описанном в примере 1 выше.
Были предложены функциональные свойства прогнозируемых генных продуктов штаммов 83972 и E47a E. coli. см. табл. 2; GenBank GU014554; и Szijarto, et al. (2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136.
Таблица 2. Прогнозирования гена О-антигена О25А из кластера rfb, как опубликовано в Wang, et al.
(2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; см. также GenBank GU014554
Название гена Предполагаемая функция Наиболее значимая гомология /Белок[организм], учетный номер, макс, идентичность (BLAST)
rmlB dTDP-Глю козо-4,6- дегидратаза dTDP-Γ лю козо-4,6-дегидратаза (Е. coli IAI39), YP-002406996.1, 98%
rmlD <1ТОР-6-Дезокси-О-глюкоза 3,5-эпимераза <1ТОР-6-Дезокси-Е-маннозодегидрогеназа (Е coli), АСА24825.1, 97%
rmlA Глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансфераза Г люкозо-1 -фосфат- тимидилилтрансфераза (Е. coli IAI39), YP-002406998.1, 99%
rmlC 0ТОР-4-дегидрорамноза-3,5эпимераза RmlC (Е. coli), АСА24796.1, 70%
Wzx О-антиген-флиппаза транспортер О-антигена (Е. coli), WP_000021239.1, 100%
wekA Г ликозилтрансфераза dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3- рамнозилтрансфераза (Е. coli), WP_000639414.1, 99%
wekB Г ликозилтрансфераза WcmS; UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAcUPP β-1,6- гликозилтрансфераза (E coli 0158), ADN43874.1, 40%
Wzy О-антиген-полимераза Wzy (E. coli), ADR74237.1, 30%
wekC Г ликозилтрансфераза WfbF; UDP-Glc:FucNAc-GlcNAc-UPP a-1,3-гликозилтрансфераза (E. coli), ABG81807.1,46%
frilA UDP-N-ацетилглюкозамин- 4,6-дегидратаз а/5-эпимераза иОР-Х-ацетилглюкозамин-4,6дегидратаза/5-эпимераза (E coli), WP_001556096.1, 95%
fnlB 1Л)Р-2-ацетамидо-2,6дидезокси-бета-Ь-талоза-4- дегидрогеназа FnlB (E. coli), AAY28261.1, 97%
- 42 035991
fiilC UDP-N-ацетилглюкозамин2-эпимераза 1Л)Р-Х-ацетилглюкозамин-2-эпимераза (Е. coli) WP_000734424.1, 98%
wbuB Г ликозилтрансфераза UDP-L-FucNAc: GlcNAc-UPP α-1,3 - N - Ацетилфукозаминилтрансфераза (E. соП)РПЪ, 026], YP_006169152.1, 73%
wbuC Усеченная гликозилтрансфераза WbuC (E. coli), AAV74548.1, 72%
Сравнения структуры и кластера генов предполагают, что все функции, необходимые для сборки OPS O25A, кодируются в кластере rfb, расположенным между galE и gnd. Функции различных ферментов генного кластера rfb (см. фиг. 2А) являются следующими.
RmlBDAC кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза dTDP-L-рамнозы, которая является субстратом для добавления ветви L-Rha к единице повтора OPS.
FnlABC кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза UDP-L-FucNAc, который является субстратом-донором для добавления L-FucNAc к повтору O25 OPS.
WekABC и wbuBC представляют собой гликозилтрансферазы согласно анализу гомологии. Однако wbuC оказалась короткой и усеченной и, по-видимому, нефункциональной. Таким образом, скорее всего функциональный комментарий указывает на то, что имеются четыре гликозилтрансферазы, образующие четыре связи для сборки единицы повтора.
Wzx и Wzy необходимы для переноса BRU в периплазматическое пространство и их полимеризации на Und-PP.
Все функции, необходимые для синтеза опубликованной структуры единицы повтора О25А, кодируются кластерами rfb E47a и 83972 Е. coli. Таким образом, был сделан вывод о том, что кластер rfb отвечает за кодирование О25А OPS.
О25В.
В 2009 году клинические изоляты Е. coli из испанского стационара были охарактеризованы для определения клональных групп. См. Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141. Выполняли характеристику а) типа ESBL, б) О-серотипа, в) генов вирулентности, г) мультилокусное типирование последовательности (MLST), и д) типирование с помощью гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE). Результаты показали, что примерно 20% всех изолятов можно отнести к тому же клону: Серотип и MLST O25:H4 ST131, ESBL тип СТХ-М15, филогруппа В2, кодирующая специфический набор генов вирулентности. Анализ компонентов кластера rfb репрезентативных клинических изолятов показал неизвестную 3'-последовательность, при сравнении с последовательностью типированного штамма из штамма Е47а, и также из клинических изолятов, идентифицированных посредством метода аллельспецифического ПЦР-типирования (См. Clermont et al., 2008, J Antimicrob Chemother. 61(5): 1024-8.; Clermont et al., Diagn. Microbiol Infect Dis. 2007, 57(2): 129-36.; и Li, et al., 2010, J Microbiol Methods 82, 71-77. В 2013 году Phan et al. опубликовали последовательность генома клона O25b:H4 ST131, подтверждая, что этот клон представляет собой производное K-12 в соответствии со структурой его кластера генов waa, как сообщалось ранее. См. Phan et al., 2013, PLOS Genetics 9(10): 1-18 (el003834). Все вместе данные свидетельствуют, что появился новый О25-агглютинирующий клон Е. coli, выделенный в больничных условиях и что этот клон имеет специфические ESBL, MLST и PFGE фенотипы и содержит измененный О-антигенный кластер генов.
ПЦР типирование.
Для того, чтобы определить, присутствует ли серотип 025В среди выделенных штаммов Е. coli, идентифицированных в эпидемиологическом исследовании, описанном в примере 1, положительные в отношении О25-агглютинации штаммы анализировали посредством типирующей ПЦР в отношении O25 и 025В. ПЦР выполняли с использованием колоний, собранных с чашек Петри в качестве источника матричной ДНК и разных олигонуклеотидных праймеров. Были использованы О25-специфические праймеры, основанные на амплификации wzy E47a O25 и описанные в Li, et al. (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77. Также были использованы O25B-специфические праймеры, описанные в Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141, которые специфичны к неопределенной 3'-части кластера rfb О25Ь (LNB220). Согласно Phan et al., 2013, эта О25В-специфическая олигонуклеотидная пара отжигается в 3'-части кластера rfb O25B.
Из 24 проанализированных клинических изолятов с положительным фенотипом О25-агглютинации, 20 были отнесены к серотипу 025В посредством ПЦР-типирования, в то время как остальные 4 были положительно идентифицированы, как принадлежащие к серотипу О25А, посредством ПЦР-типирования. Таким образом, неожиданно, штаммы серотипа 025В были определены, как встречающиеся среди анализируемых штаммов чаще, чем штаммы серотипа О25А.
Секвенирование кластера.
Для генетического анализа секвенировали кластер rfb 025В ПЦР-положительного штамма, обозначенного как upec138. Идентифицированные гены и их наиболее близкие релевантные белковые гомологи вместе с предлагаемой номенклатурой приведены в табл. 3 ниже. Гены, специфичные для 025В и
- 43 035991 отсутствующие в О25А, обозначены звездочкой.
Таблица 3. Прогнозы в отношении генов О25В О-антигена из кластера rfb
Название гена Предполагаемая функция Наиболее значимая гомология /Белок[организм], учетный номер, макс, идентичность (BLAST)
rmlB dTDP-Γ лю козо-4,6дегидратаза Продукт гена rffG \Е. coli NA114], YP_006139244, 99%
rmlD <1ТОР-6-Дезокси-О- глюкозо-3,5-эпимераза dTDP-4-дегидрорамнозо-редуктаза \Е. co/zNA114], ΥΡ_006139243, 100%
rmlA Г люкозо-1 -фосфаттимидилилтрансфераза продукт гена rffH2 \Е. coli ΝΑΙ 14], ΥΡ_006139242, 100%
rmlC dTDP-4-дегидрорамнозо- 3,5-эпимераза dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5 -эпимераза \Е. coli NAI 14], YP_006139241, 99%
Wzx Wzx, О-антиген-флиппаза Wzx \Ε. coli штамм Е47а], ADI43260, 99%
we kA Г ликозилтрансфераза (GT) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α1,3- рамнозилтрансфераза \Ε. coli 83972], ΖΡ_04004894, 93%
we кВ Г ликозилтрансфераза (GT) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6- гликозилтрансфераза \Ε. coli 83972], ΥΡ_006106413, 93%
Wzy О-антиген-полимераза мембранный белок \Е. coli 83972],
YP_006106412, 94%
wbbJ* О-ацетилтрансфераза О-ацетилтрансфераза \Е coli 83972], YP 006106411, 95%
wbbK* Г ликозилтрансфераза (GT) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- гликозилтрансфераза \Ε coliK-12], ΑΑΒ88407, 60%
wbbL* Г ликозилтрансфераза (GT) белок липополисахаридного биосинтеза, C-ter фрагмент, усеченный белок \Е. coli DH1], YP 006129367, 62%; dTDP- Rha :GlcNAc-UPP α-1,3- рамнозилтрансфераза
Состав кластера rfb показывает четкие различия с составом кластера O25A. Гены в 5'-части кластера являются близкими гомологами друг друга (rmlD и wzy; E47a и 83972 Е. colt). Это не является неожиданным для генов rml, которые являются гомологичными во многих штаммах Е. coli, синтезирующих Lрамнозу. Гомология генных продуктов О25А и В достигается в гене wekC (O25A), до того как она снижается до уровня ниже 25% идентичности, что указывает на неродственность белковых последовательностей. См. фиг. 3В. Кроме того, было установлено, что гены биосинтеза UDP-N-ацетилглюкозамина О25А отсутствуют в штамме upec138 (O25B), также как и две гликозилтрансферазы ниже fnlABC. См. фиг. 3В. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что штаммы 025b не способны синтезировать UDP-L-FucNAc, за исключением тех случае когда гены биосинтеза L-FucNAc могут быть закодированы вне кластера rfb. Тем не менее, нет ни одного случая сообщения о наличии локуса fnlABC вне кластера rfb, когда L-FucNAc присутствует в BRU О-антигена. Таким образом, маловероятно, что штамм 138 способен синтезировать опубликованную основную повторяющуюся единицу (BRU) O25A.
Гены, идентифицированные в кластере rfb O25B, которые отсутствуют в кластере rfb серотипа О25А, кодируют две гликозилтрансферазы и О-ацетилтрансферазу. Эти три гена имеют одинаковую организацию с генами wbbJKL, обнаруженными и охарактеризованными в штаммах K-12 Е. coli с генотипом кластера rfb О16, и кодируемые белки имеют высокую гомологию. См. фиг. 3В. В соответстии с генетическим сходством между О25В и О16 серотипами номенклатура генов rfb О16, wbbJKL, была применена к гомологичным генам, идентифицированным в кластере rfb О25В.
Структура О16 BRU известна и функции генов wbbJKL были определены. См. Steveneson et al., (1994) J Bacteriol. 176(13):4144-56. WbbJKL отвечают за ацетилирование L-рамнозы, перенос остатка DGlc на L-Rha-D-Glc-UndPP и перенос L-Rha на D-GlcNAc-UPP, который образован с помощью wecA из кластера ЕСА. На основании гомологии с О16 WbbJKL и известных функций О16 WbbJKL был сделан
- 44 035991 вывод, что кластер rfb O25B синтезирует структуру, содержащую частично О16- и частично О25Аэлементы совместно. Предполагалось, что весьма вероятно WbbJKLO25B синтезирует такую же структуру, что и WbbJKLO16, то есть a-D-Glc-1,3-a-L-Rha(2Ac)-1,3-a-D-GlcNAc. Эта трисахаридная структура идентична неразветвленному коровому остову 025а с единственным исключением, что L-Rha(2Ac) заменяет L-FucNAc. Замена является, соответственно, консервативной, так как и D-FucNAc, и L-RhaOAc представляют собой моносахариды с 6-дезокси- и 2-ацетил-функцией. Единственным отличием является конформация, так как фукоза относится к галактозе, а рамноза к маннозе, что приводит к разной ориентации группы ОН в положении 3 и метильной группы в положении 5. Связи между моносахаридами будут идентичными (все α-1,3), указывая на то, что эти структуры будут аналогичными по форме и химическим характеристикам. По аналогии, белки, кодируемые в восходящей части О25А и В кластеров rfb (rmlDCAB и wekAB) разветвляют BRU из О25А или В путем присоединения разветвленного D-Glc и LRha к любому коровому трисахариду-остову. Это означает, что они принимают любой остов (с LFucNAc или L-Rha(2Ac)) в качестве субстрата.
Присутствие L-Rha в качестве второго моносахарида из восстанавливающего конца 025В BRU объясняет, почему биосинтез L-FucNAc может отсутствовать в 025В. UDP-L-FucNAc не требуется, так как он заменен генами биосинтеза dTDP-L-Rha, которые присутствуют на 5'-конце кластера (rmlDBAC).
Phan et al., 2013 проделали подобный генетический анализ на клиническом изоляте 025В, но пришли к другому выводу. Они также секвенировали весь геном, чтобы найти кластер генов биосинтеза UDP-FucNAc; однако они утверждают, что механизм для UDP-L-FucNAc в штамме О25В:Н4 ST131 ЕС958 отсутствует не только в кластере rfb O25B, но и во всем штамме. Однако Phan пришел к выводу, что UDP-L-FucNAc должен синтезироваться другим образом, при условии что О25В:Н4 ST131 ЕС958 создает такую же структуру О-антигена, что и Е47а, то есть O25 А. Вместо этого в данном описании изобретения раскрыто, что наиболее вероятный сценарий заключается в том, что штаммы 025В не могут создавать L-FucNAc, но вместо этого заменяют второй остаток BRU остатком О-ацетилированной Lрамнозы и гены, необходимые для этого изменения, кодируются исключительно в кластере rfb.
Кроме того, присутствие гомолога О-ацетилтрансферазы в кластере 025В позволяет предположить О-ацетилирование в 025В BRU, модификацию, отсутствующую в О25А. Соответственно, было установлено, что структуры антигена O25 из серотипов О25А и 025В должны быть разными.
Структурный анализ 025В.
Для подтверждения гипотезы о другой структуре антигена 025, анализировали химический состав и организацию О-антигенов клинических изолятов 025, описанных в Примере 1. Для более подробной характеристики структур O25 OPS использовали несколько методов.
Прежде всего, структуру О-антигена анализировали посредством SDS PAGE. Липополисахарид (LPS) из клинических изолятов анализировали по разнице в электрофоретической подвижности, используя разные методы окрашивания после SDS PAGE. Для визуализации количеств LPS выполняли окрашивание серебром и проводили анти-О25 специфический Вестерн-блоттинг. См. фиг. 5, где изображены результаты анализа 10 изолятов. Данные показывают, что аналогичные интенсивности сигналов получены при окрашивании серебром разных препаратов LPS. В отличие от этого, анализ со специфической антисывороткой показывает более сильные интенсивности сигналов в 3 из 10 образцов (изоляты upec436, upec767, upec827). Полагают, что разные интенсивности сигналов возникают из-за различий в структуре OPS.
Для подробного прояснения структуры 025В применяли разные аналитические методы. Клинический изолят upec138 был положительным по 025В согласно анализу ПЦР и демонстрировал более слабое распознавание О25-агглютинирующей антисывороткой, чем штаммы O25 А. См. фиг. 5. Кроме того, штамм является ESBL, но чувствителен к FOS, IPM и TZP и устойчив к AM, CXM, NOR и CIP. Другой клинический изолят, штамм upec436 был отрицательным по 025В согласно ПЦР, но положительным по общему O25 (О25А) согласно ПЦР. Также было обнаружено, что штамм upec436 сильнее взаимодействует с 025-агглютинирующей антисывороткой, когда его LPS анализировали посредством Вестернблоттинга. См. фиг. 5. LLO из обоих штаммов экстрагировали, метили с помощью 2АВ и анализировали посредством нормально-фазовой HPLC. См. фиг. 6; LLO из upec138 и upec436, 9,079 и 9,081). Профили элюирования показали четкие различия между двумя экстрактами. MS/MS-анализ штамм-специфических пиков идентифицировал сигналы, совместимые с ожидаемыми структурами BRU.
Сигналы в штамме upec436 (9.081): Пик при времени элюирования 62' анализировали посредством MS и обнаружили, что он содержит в качестве главной массы молекулу с m/z=1021 Да, то есть молекулу, соответствующую ожидаемой массе полной О25А OPS BRU. При MS/MS получали картину фрагментации, совместимую с последовательностью моносахарида О25А (Фиг. 7А; MS/MS m/z=1021).
Сигналы в штамме upec138: Главную массу пика при времени элюирования 50' составляла молекула с m/z 1022 Да, то есть на один дальтон более чем полная единица повтора О25А. MS/MS анализ (Фиг. 7В; MS/MS O25B) показал характер фрагментации, почти идентичный единице повтора О25А, и отнес разницу 1 дальтон ко 2-ому моносахариду от восстанавливающего конца (идентифицированному путем фрагментации иона Y с m/z=551 в MS/MS O25A, и m/z=552 в штамме грес138). Дополнительный пик,
- 45 035991 элюированный при 60', показал аналогичную фрагментацию, но с разницей 42 Да в массе материнского иона (m/z=980), который локализован в том же моносахариде (m/z=510), то есть втором от восстанавливающего конца. Интерпретация этих результатов приведена ниже.
Процедуры экстракции OPS, гидролиза и 2АВ-мечения включают кислотную обработку для удаления Und-PP из OPS. Было показано, что в условиях обработки частично удаляется О-ацетилирование, но не N-ацетилирование. Таким образом, вполне вероятно, что пик при 60' представляет массу деацитилированного BRU, появляющегося при химическом гидролизе вещества в пике 50'. Взятые вместе, эти данные показывают, что в 025b имеется О-ацетилирование в том же моносахаридном положении, что и Nацетилирование в L-FucNAc из О25А.
Для химического подтверждения того, что ацетилирование второго остатка от восстанавливающего конца является О-связанным, выполняли анализ деацетилирования. Собирали О25В-специфический пик из 2АВ LLO HPLC со временем элюирования 50' из 025В ПЦР-положительного штамма и обрабатывали щелочью, как описано в разделе Методы. Повторный анализ посредством HPLC приводил к пику со временем элюирования 60', как идентифицировано в пике 025В из фиг. 6, содержащему основную массу с m/z=979, с MS/MS-картиной фрагментации ионов, сопоставимой с 025В BRU, потерявшей свою Оацетильную группу.Н-ацетильные группы являются стабильными при щелочном воздействии, как показано с помощью оставшейся N-ацетильной группы на восстанавливающем конце D-GlcNAc в той же молекуле.
В заключение было установлено, что типичный 025В штамм upec138 структурно и генетически родственней OPS О25А и O16 (Фиг. 3А и В) из Е. coli. O25B отличается от О25А тем, что имеет структуру единицы повтора, содержащую О-ацетильную группу вместо N-ацетильной группы на втором моносахариде единицы повтора, который представляет собой остаток L-Rha, а не D-FucNAc. Эти изменения, скорее всего, вызваны заменой механизма биосинтеза UDP-FucNAc и трансферазы D-FucNAc участком ДНК, кодирующим две гликозилтрансферазы и О-ацетилтрансферазу. Эти гены относятся к кластеру генов O16 на основании гомологии и анализа функциональности. Конечные структуры отличаются, но похожи, что объясняет перекрестную реактивность, наблюдаемую с 025-агглютинирующей антисывороткой.
Как обсуждалось выше, был сделан вывод и предположение на основании анализа их кластеров rfb, что OPS O25A содержит L-FucNAc, в то время как эта структура отсутствует в 025В. Чтобы исследовать, отсутствует ли FucNAc в 025В, выполняли анализ моносахаридного состава ЕРА-биоконъюгатов, продуцируемых в штаммах О25А и 025В (фиг. 9), используя метод РМР-мечения и метод анализа посредством FIPLC, описанные выше. Для получения биоконъюгатов клинические изоляты Е. coli с фенотипами О25А и 025В были приготовлены и модифицированы с целью оптимального продуцирования биоконъюгатов. Как часть этой модификации, гены waaL из штаммов ирес_436 (025А) и uepc_138 (O25B) были удалены, как описано ранее (см. Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645), исходя из информации, полученной методом определения типа кора (см. Amor, et al., (2000) Infect Immun 68, 1116-1124). Полученные штаммы трансформировали экспрессионными плазмидами для 4S-EPA (pGVXN659) и олигосахарил-трансферазой, PglB (pGVXN939), для продуцирования О25А; и pGVXN114 и pGVXN539 (продуцирующих 2S-EPA) для получения О25В-биоконъюгата. О25Вбиоконъюгаты получали в 2 л встряхиваемой колбе с последующей аффинной очисткой из периплазматических экстрактов посредством IMAC. О25А-конъюгаты получали посредством периодической ферментации с подпиткой и очищали посредством двухстадийного способа очистки, начиная с осветления цельноклеточного гомогената, полученного посредством гомогенизации под высоким давлением, как выше описано в разделе Методы. Анализ моносахаридного состава выполняли, как описано выше.
Результаты подтверждают отсутствие сигнала FucNAc в происходящих от 025В биоконъюгатах, в то время как О25А-содержащие биоконъюгаты показывают пик при ожидаемом времени элюирования, как определено путем воздействия на смесь моносахаридов того же самого процесса обработки, что и в случае контроля. Таким образом было подтверждено, что предполагаемая структура 025В, как и ожидалось на основе анализа кластера rfb, представляет собой L-FucNAc-less.
Полную структуру единицы повтора (RU) О-антигенного полисахарида (0-PS) из О-антигена 025В Escherichia coli определяли с помощью ядерного магнитного резонанса биоконъюгата после частичного ферментативного расщепления группировки белок-носителя ЕРА. Анализ подтверждает, что 025В 0-PS состоит из пентасахаридной RU. Сигналы 1Н и 13С были установлены посредством методов корреляции 2D ЯМР, которые подтвердили, что структура 025В O-PS RU отличается от опубликованной структуры О25А O-PS RU (Kenne, L., et al. 1983. Carbohydr. Res. 122:249-256; Fundin, 1, et al. 2003. Magn. Reson. Chem. 41:202-205) заменой остатка α-3-FucpNAc остатком α-3-Rhap, при этом более чем 90% этого остатка О-ацетилированы по положению С2.
Полная 025В 0-PS RU показана ниже (025В'):
- 46 035991
Rha2Ac f wD-GIcNAc Ί ,ό
L-Rha
Получение и характеристика биоконъюгата.
Для дополнительного анализа полисахаридных антигенов О25А и О25В, получали больше вещества биоконъюгата. Для О25А очищенную партию О25А-ЕРА, полученную выше, использовали для экспериментов по дополнительным характеристикам. Для получения О25В-ЕРА конструировали штамм с геномно интегрированным кластером 025b: W3110 ΔwaaL ΔgtrABS ΔτίΙ)Ο16::ΓίΙ) (upec138), с плазмидами pGVXN1076 и pGVXN970. Этот штамм был сконструирован, начиная с W3110 посредством методов Datsenko и Wanner и способа гомологичной рекомбинации для сайт-направленной интеграции больших вставок в бактериальные хромосомы (см. международную заявку на патент РСТ/ЕР2013/071328).
Полученные О25В-биоконъюгаты были охарактеризованы с использованием стандартных анализов выделения и характеристики. Биоконъюгаты очищали с использованием двух последовательных стадий анионообменной и гель-проникающей хроматографии, с получением 97,2 и 98,1% чистых О25А и О25В препаратов биоконъюгата, соответственно. Количественное определение посредством SDS PAGE использовали для анализа чистоты. См. фиг. 10 (О25А) и фиг. 11 (О25В). Отношение сахара к белку рассчитывали на основе количественного определения посредством антронового анализа (см. Laurentin and Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143-145) и ВСА анализа концентрации белка, что приводило к 40,2 и 26,6% для биоконъюгатов O25 А и О25В. Аналитическая гель-проникающая хроматография показала мономерное состояние частиц в соответствии с ожидаемым гидродинамическим радиусом ЕРА с присоединенными гликановыми цепями.
Применения.
Для определения иммуногенного потенциала структуры О25В, выполняли несколько доклинических экспериментов с использованием биоконъюгатов О25В и О25А. Как показано на фиг. 5, все клинические изоляты, идентифицированные, как О25-положительные в примере 1 (то есть изоляты и О25А, и О25В), были положительными с О25А-антисывороткой, обычно используемой для выявления серотипов O25 (типирующие сыворотки из О25А-штамма Е47а) посредством Вестерн-блоттинга. Таким образом, анти-О25А антисыворотка, по-видимому, перекрестно реагирует с LPS из штаммов О25В. Для подробного анализа антительного ответа и перекрестной реактивности были получены биоконъюгаты O25. Мальтозосвязывающий белок (МВР) использовали в качестве белка-носителя, и этот белок-носитель был связан с О25А или О25В. В табл. 4 показаны штаммы, использованные для получения белка. Использованные штаммы был идентифицированы посредством ПЦР в отношении их генотипа О25А или В. Экспрессию выполняли в среде ТВ и белковый продукт очищали из периплазматических экстрактов.
Таблица 4
Биоконъюгат Штамм Плазмида pglB Плазмиданоситель Процедура очистки
МВР-О25А ирес436 AwaaL: :kanR pGVXN939 pGVXN659 Q,A
МВР-О25В upec350 AwaaL·. :clmR pGVXN939 pGVXN659 Q, A, S
Q: очистка на Resouce Q; А: амилозная смола; s: Гель-проникающая хроматография.
Иммунизации с использованием полученных биоконъюгатов выполняли с использованием стандартных протоколов иммунизации кроликов (28-дневный ускоренный протокол Eurogentech). 50 мкг полисахарида, связанного с МВР, инъецировали в сутки 0, 7, 8 и 18 с патентованным иммуностимулирующим компонентом без адъюванта Фрейнда. Конечную, полученную на 28 сутки после первой иммунизации, антисыворотку из крови тестировали на ее специфичность к LPS О25А или О25В. На фиг. 22 показано сравнение реактивности антисыворотки к соответствующему LPS (О25А или О25В). LPS получали из upec436 и upec138 посредством переваривания протеиназой К цельноклеточных образцов в SDSPAGE Lammli буфере. Одинаковое количество LPS наносили на два геля SDS-PAGE, с последующим электропереносом на нитроцеллюлозные мембраны и определением с использованием О25А- и О25Вантисыворотки. Результаты показывают, что О25А-антисыворотка узнает LPS O25A лучше, чем LPS O25B, в то время как антисыворотка О25В узнает LPS O25B лучше, чем LPS O25A. Этот результат показывает, что аутологичный антиген делает лучший антиген. Таким образом, включение антигена О25В в вакцину обеспечивает лучшую защиту против преобладающих клинических штаммов О25В группы O25, чем антиген О25А.
- 47 035991
Пример 3. Е. coli O1.
Список структурных баз данных разных структур субсеротипа Е. coli O1. В частности, О1А, О1А1, О1В, 01с. 01а и О1А1 являются структурно идентичными и, как полагают, они связаны с заболеванием, хотя и не сообщалось, что 01В и С являются патогенными (см. Gupta, et al., (1992) J Bacteriol 174, 7963-7970) и представляют собой меньшинство среди изолятов O1. Структура O1A/O1Al, O1B и О1С показана на фиг. 12В. Для анализа распределения субсеротипа O1 в эпидемиологическом исследовании UPEC из примера 1 детально анализировали структуры О-антигенов из нескольких клинических изолятов из исследования. Во-первых, структуру LPS 12 штаммов, определенную, как положительная в отношении O1 посредством анализа агглютинации, анализировали посредством SDS PAGE. См. фиг. 13: окрашивание серебром и вестерн-блоттинг O1.
Окрашивание серебром показало типичные LPS сигналы во всех линиях, содержащих экстракты из клинических изолятов O1. Сильное окрашивание электрофоретической подвижности примерно при 1015 кДа соответствует ядру липида А, и лестницеобразные сигналы с более медленными подвижностями, представляют ядро липида A, модифицированное углеводными полимерами, состоящими из разного количества О-антигенных единиц повтора. При сравнении LPS из разных изолятов выявляются различия в распределении модальной длины, электрофоретической подвижности отдельных бэндов и лестницеобразной картины. На основании этих наблюдений могут быть идентифицированы три группы: (1) большинство изолятов (upec002, upec010, upec032, upec140, upec108, upec143, upec276, upec399 и upec425) демонстрируют неразличимую электрофоретическую подвижность отдельных бэндов, отличающуюся только интенсивностью сигнала и средней длиной цепи (распределение модальной длины); (2) два изолята (upec119 и upec256), по-видимому, имеют немного более быструю подвижность каждого бэнда единицы повтора LPS, что предлагает другую структуру, например другую модификацию ядра липида А; и (3) сигналы, полученные из изолята upec1096, появляются в виде мазка, а не лестницы, указывая на другую структуру OPS. См. фиг. 13А.
Анализ с помощью Вестерн-блоттинга и обнаружение с использованием анти-О1 антисыворотки показало, что все LPS, кроме upec1096, определяются при помощи специфических 01-антител, что указывает на перекрестно-реактивные молекулы LPS. Это означает, что 11 из изолятов представляют собой O1 и что upec1096, скорее всего, не является О1-изолятом (то есть он является ложным положительным в анализе агглютинации).
Для подробного анализа структурного сходства 01-антигенов, использовали 2АВ-мечение LLO и метод нормально-фазовой HPLC с высоким разрешением, как описано выше. На фиг. 14А показано наложение хроматограмм, полученных для 5 из 11 клинических изолятов. Область идентификационных отпечатков OPS появилась при времени удерживания от 110 до 150 мин. Профили показывают, что во всех образцах сигналы возникают в то же время удерживания, что указывает на идентичные молекулярные структуры. Наблюдаемыми различиями были распределение интенсивности, то есть время элюирования среднего максимального сигнала, и интенсивности общего сигнала. Остальные 6 экстрактов приводят к пикам в то же время элюирования с различиями в интенсивности. Только образец upec1096 отличается по отношению к картине пиков, что подтверждает структурное отличие, отмеченное выше.
MS/MS-анализ содержания отдельного пика посредством анализа MALDI-TOF/TOF (времяпролётная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы/времяпролётный) использовали для определения последовательности моносахаридов в образцах O1 (См. фиг. 14В). MS-анализ проводили из образцов, извлеченных не из клинических изолятов, а из штамма W3110 ΔwaaL, содержащего космиду с кластером rfb из upec032. Пики, элюированные в 50, 80, 96 и 108 минут времени элюирования, содержали основные массы m/z=1021,4, 1849,6, 2693,9, 3540,4. Серии фрагментационных ионов, полученные после MS/MS, согласовывались с 1, 2, 3 и 4 единицами повтора HexNAc, тремя дезоксигексозами и разветвленным HexNAc. Эти данные могут быть объяснены только структурой субсеротипа О1А. Описанные серии пиков представляют собой O1 OPS, прикрепленные к UPP в клинических изолятах, и каждый последующий пик отличается от предыдущего одной единицей повтора.
Эти данные подтверждают утверждение из литературы, что предложенная структура O1 О-серотипа Е. coli в клинических изолятах UTI из исследования, описанного в примере 1, представляет собой подтип О1А.
Для получения биоконъюгата, несущего полисахарид О1А, штаммы W3110 Е. coli конструировали для экспрессии OPS О1А. Полученными штаммами были W3110 ΔιΛΟ16::ι·φΟ1 ΔwaaL, содержащие кластер rfb положительного клинического изолята О1 (GU299791*, кластер в пределах rmlB-wekO). OPS О1А-экспрессирующие штаммы-хозяева конструировали при помощи гомологичной рекомбинации. Кластер rfb клинического изолята О1А амплифицировали с использованием ПЦР-олигонуклеотидов, которые отжигают с ДНК, фланкирующей кластер rfb. Амплифицированную ДНК затем использовали для замены эндогенного О-антигенного кластера хорошо охарактеризованного лабораторного штамма W3110 посредством гомологичной рекомбинации, описанной в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/071328. Экспрессионные плазмиды для белков-носителей pGVXN659 и для PglB (pGVXN114, 939, 970, 971) были встроены посредством трансформации и экспрессии О1 была подтвер
- 48 035991 ждена (См. фиг. 15 и фиг. 16).
В независимом эксперименте клинический O1 изолят upec032 конструировали для получения биоконъюгатов. При конструировании требовалось учитывать фенотип чувствительного к антибиотику клинического изолята. Upec032 ΔwaaL был сконструирован и трансформирован pGVXN939 и pGVXN579 для получения биоконъюгата с использованием МВР в качестве белка-носителя. Преимущество использования МВР и ЕРА в качестве белков-носителей заключается в возможности индуцировать образование антисыворотки, где они оба приводят к антисывороткам, которые перекрестнореактивны к полисахаридному компоненту, но не к носителю.
Такие антисыворотки являются полезными инструментами для оценки доклинических экспериментов, например в качестве покрывающих агентов для разработки полисахарид-специфических ELISA анализов.
Пример 4. Е. coli О6.
Е. coli серотипа О6 представляет собой наиболее распространенный ЕхРЕС, зарегистрированный на сегодняшни день (George, D. В., and Manges, A. R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690). Не только исследование, описанное в Примере 1, но и данные, взятые из литературы, подтверждают, что серотип О6 является одним из четырех ведущих серотипов во многих проявления, вызванных ЕхРЕС (См. фиг. 4).
Две структуры OPS Об были описаны в литературе (см. Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217225, и Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283). Структуры описанных О6-антигенов показаны на фиг. 17В. Они идентичны за исключением разветвленного моносахарида каждого из них, который представляет собой либо Glc, либо GlcNAc. Однако в литературе не определена преобладающая O6структура в клинических изолятах, вовлеченных в UTI.
Чтобы выбрать наиболее типичную структуру антигена О6 для вакцины, определяли структуры OPS O6-агглютинирующих положительных клинических изолятов Е. coli из исследования Примера 1 с использованием того же подхода, как описано выше для серотипов O1. Окрашивание серебром и Вестерн-блоттинг с использованием анти-О6 антисыворотки идентифицировало один из 12 клинических изолятов, невзаимодействующих с анти-О6 сывороткой, хотя LPS был окрашен серебром во всех образцах (не показано), что указывает на ложный положительный результат агглютинации. Однако, вполне вероятно, что различия Glc или GlcNAc не будут обнаружены по сдвигу электрофоретической подвижности на гелях.
Для подробного анализа структуры использовали идентификационные отпечатки LLO. В качестве эталона для каждой из двух описанных структур, в анализ включали экстракты штаммов с описанными разветвленными Glc (CCUG11309) и GlcNAc (CCUG11311). Сравнения двух кривых HPLC показывает серии пиков, которые элюируются в 70,8, 103,3 и 122,2' для полученных от CCUG11309 образцов и серии 68,8, 100,3 и 118,3 для образцов CCUG11311. См. фиг. 18А. Пики анализировали с помощью MS в отношении основных масс, присутствующих в пиках, и с помощью MS/MS в отношении моносахаридной последовательности этих основных масс. Данные, подтвержденные для серии пиков, полученных от CCUG11311, m/z=1094,4, 2027,6 и 2962 (MSO154), как и ожидалось, соответствуют GlcNAcразветвленным полимерам с 1, 2 и 3 BRU. m/z=1053.4, 1945.7 и 2836.9 с разветвленным Glc были идентифицированы ранее в экстрактах из штамма W3110, экспрессирующего клонированный кластер rfb клинического изолята CFT О6, имеющего такие же значения времени элюирования пика 2АВидентификационных отпечатков, что и CCUG11309 (MSO138). Когда хроматограммы, полученные из 12 клинических изолятов, сравнивали с эталонными штаммами, 11 сигналов содержали серии пиков, указывающие на OPS О6 с разветвленным остатком Glc. Пять из этих 11 хроматограмм показаны на фиг. 18В. Один образец, не генерирующий сигналы при O6-специфических временах элюирования, не являлся O6, то есть он, наиболее вероятно являлся ложноположительным на основании теста агглютинации. Таким образом, OPS O6 с разветвлением Glc (фиг. 17В, верхняя часть) имеет наиболее типичной структурой среди Ο6^ρο™ποβ, выделенных из эпидемиологии, описанной в примере 1.
Для получения биоконъюгата, несущего полисахарид O6Glc, были сконструированы штаммы W3110 Е. coli для экспрессии OPS O6 посредством замены кластера rfb W3110 кластером rfb из штамма CCUG11309. См. табл. 7 и 13. Полученные штаммы представляли собой W3110 ΔrfbO16::rfbCCUG11309 ΔwaaL, содержащие кластер rfb O6-положительного штамма Е. coli с описанным Glc-разветвлением в BRU (см. выше). Штамм-хозяин, экспрессирующий O6Glc OPS, был сконструирован посредством гомологичной рекомбинации. Кластер rfb амплифицировали, используя ПЦР-олигонуклеотиды, которые отжигаются с ДНК, фланкирующей кластер rfb. Амплифицированную ДНК затем использовали для замены эндогенного О-антигенного кластера хорошо охарактеризованного лабораторного штамма W3110 посредством гомологичной рекомбинации, описанной в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/071328. Экспрессионные плазмиды для белков-носителей и для PglB были введены посредством трансформации и экспрессию ожидаемого OPS на ЕРА подтверждали с помощью Вестернблоттинга.
Пример 5. Е. coli O2.
Структура единицы повтора O2-полисахарида была известна с 1987 (Jansson, et al., (1987) Carbohy- 49 035991 drate research 161, 273-279). Это показано на фиг. 19В. Две последовательности генных кластеров Оантигена O2 имеются в общедоступной базе данных (GenBank EU549863 и GU299792). Был сделан сравнительный анализ и предполагались гликозилтрансферазные активности (Табл. 5; Fratamico et al., 2010,
Canadian journal of microbiology 56, 308-316; и Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77).
Таблица 5. Прогнозы генов кластера О-антигена O2, исходя из кластера rfb, опубликованного Li, et al. и Fratamico, et al., как указано в скобках
Название гена Предполагаемая функция Наиболее значимая гомология /Белок[организм], учетный номер, макс, идентичность (BLAST)
rmlB dTDP-Гл ю козо-4,6- дегидратаза dTDP-Глюкозо-4,6-дегидратаза (Е. coli IAI39), YP_002406996.1, 98%
rmlD йТОР-6-Дезокси-О- глюкоза- 3,5-эпимераза dTDP-6-Дезокси-Г-маннозадегидрогеназа (Е. coli), АСА24825.1, 97%
rmlA Глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансфераза Глюкозо-1 -фосфат- тимидилилтрансфераза (Е. coli IAI39), YP_002406998.1, 99%
fdtA ЫОР(нуклеозиддифосфат)- гексоза-изомераза NDP-гексоза-изомераза (Yersinia intermedia ATCC 29909), ZP 04635116.1, 67%
fdtC WxcM-подобный белок Гипотетический белок PROVRETT 01740 (Providencia rettgeri DSM 1131), ZP_03638653.1, 71%
fdtB Аминотрансфераза белок WblQ (Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1), NP_931971.1, 65%
Wzx О-антиген-флиппаза белок биосинтеза полисахаридов (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCI), YP 003016888.1, 50%
wekP (wegQ) Гликозилтрансфераза (GT) Гипотетический белок FIC 01940 (Flavobacteriaceae bacterium 3519-10), YP_003096444.1, 29%
rmlC dTDP-4-дегидрорамнозо- 3,5-эпимераза RmlC (E. coli), ACA24796.1, 70%
Wzy О-антиген-полимераза Гипотетический белок Gura_3055 (Geobacter uraniireducens Rf4), YP-001231799.1, 26%
wekQ (wegR) Гликозилтрансфераза Гликозилтрансфераза, предполагаемая, gt2D (Cellvibrio japonicus Uedal07), ref|YP_001983904.1, 31%
wekR Г ликозилтрансфераза Гликозилтрансфераза, группа 1 (Shewanellafrigidimarina NCIMB 400), YP-751504.1, 57%
wekS (wegW) Сульфатаза Предполагаемый белок трансмембранной сульфатазы (Stenotrophomonas maltophilia K279a), ΥΡ_001970541.1, 39%
Сравнение гомологии структуры и генов указывает на то, что присутствуют все функции для биосинтеза полимера:
rmlBDAC кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза dTDP-L-рамнозы, которая является субстратом для добавления L-Rha к остову с помощью гликозилтрансфераз wekPOR;
fdtABC обеспечивает dTDP-D-Fuc3NAc для разветвленных гликозилтрансфераз;
гомологи wzy и wzx, ответственные за перенос Und-PP-связанной единицы повтора из цитоплазмы в периплазму; и wekPOR представляют собой прогнозируемые гликозилтрансферазы и, по-видимому, образуют гликозидные связи O2 BRU (три L-Rha и одну L-FucNAc).
Ген wekS, обнаруженный в опубликованных последовательностях кластера rfb O2, является прогнозируемой связанной с мембраной сульфатазой и, таким образом, скорее всего, не участвует в образовании BRU. Это означает, что - если принять за правило, что один фермент означает одну связь - тогда один фермент в группе wekPOR должен быть бифункциональным, чтобы обеспечить четырех гликозидные связи.
То, что правило - один фермент соответствует одной связи - не является абсолютным, было показано во многих примерах, где известно гликозилтрансфераз меньше чем связей, например в Shigella flexneri
- 50 035991
Y, S. flexneri 6, С. jejuni и Е. coli О1А. В этих примерах мультифункциональные гликозилтрансферазы отвечают за образование более одной гликозидной связи, то есть они являются би- или мультифункциональные. Всегда это тот же самый моносахарид, который добавляют несколько раз. Повторные остатки рамнозы - как обнаружено в серотипе O2 - часто связаны с такими мультифункциональными ферментами.
Благодаря наличию усеченных элементов транспозона, фланкирующих последовательность wekS, было сделано предположение, что локус wekS был встроен в кластер rfb посредством рекомбинации ДНК (см. Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316). Транспозон-опосредованная вставка локуса wekS предполагает, что биосинтез OPS O2 ранее действительно осуществлялся без присутствия wekS и, соответственно, wekS не требуется для синтеза полимера OPS O2. Для подтверждения этой гипотезы образование OPS O2 было воссоздано в рекомбинантной экспрессионной системе на чистом геномном фоне, содержащем кластер rfb O2, не имеющий гена wekS. Чтобы достичь этого, кластер О-антигена из штамма W3110 был заменен кластером rfb из O2-положительного штамма upec116, не имеющего ДНК wekS. Хромосомная замена была сделана посредством гомологичной рекомбинации, как описано в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/071328. Полученный штамм представлял собой W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. OPS получали и анализировали с помощью 2АВ-мечения и нормально-фазовой HPLC и определения флуоресценции, как это делали для OPS О1А и O6 (см. выше), и анализировали с помощью нормально-фазовой HPLC (Фиг. 21) и сравнивали с сигналами от штамма дикого типа CCUG25. Анализ приводил к серии перекрывающихся пиков от 40 до 140 минут времени элюирования.
MS-анализ серии пиков, зависимой от кластера rfb O2, показал основные массы с такими же различиями между последовательными пиками (то есть единичную RU O2).
MS-анализ молекул, собранных в соответствующих пиках, выполняли, чтобы проанализировать структуру OPS. Пики, полученные при 43,5, 73,1, 81,4 и 90' из штамма дикого типа CCUG25, собирали и анализировали посредством MS и MS/MS. Были найдены массы и серии ионов Y-фрагмента, сопоставимые с ожидаемыми 1, 2 и 3 единицами повтора молекул OPS O2, (m/z=989,4 (фиг. 23), 1817,8, 2646,1, все №+-аддукты).
Для подтверждения OPS O2 из клинических изолятов, в 12 клонах анализировали их структуру OPS, как описано выше для серотипа O1. Во-первых, получали LPS для анализа посредством окрашивания серебром и Вестерн-блоттинга. Результаты изображены на фиг. 20. Все образцы показывали лестницеобразный характер полос с двумя явными разными средними длинами лестниц. Анти-О2 антисыворотка идентифицировала все LPS образцы, указывая на то, что агглютинация правильно идентифицирует все изоляты, как серотипы O2.
Для получения биоконъюгата, несущего полисахарид O2, использовали W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS. Экспрессионные плазмиды для белков-носителей и для PglB вставляли посредством трансформации и экспрессию ожидаемого OPS на ЕРА подтверждали с помощью Вестернблоттинга. См. таблицы 7 и 13 и выше.
Пример 6. Иммунологический анализ разных О-антигенов.
Для оценки иммунологического потенциала биоконъюгатов, содержащих выбранные антигенные полисахариды, выполняли доклиническое исследование. Биоконъюгаты О1А-ЕРА, О2-ЕРА, O6Glc-EPA и О25В-ЕРА были получены, очищены и охарактеризованы, как описано выше и в разделе методов.
Таблица 6. Обзор доклинических исследований на крысах, включая число вакцинных групп, размеры групп, используемые вакцины и качественный показатель вакцинного препарата
Групп а Способ инъекции Число животных Воздействие [0,2 мкг PS] Чистота % Отношение S/P% Продуцирующий штамм/ (Штамм/плазмида/ Плазмида)
1 в/м 8 Ol-EPAtetra'p001 [0,2 мкг PS] 97 22 upec032 \waaL::kanR/рСУХ^939/ pGVXN659
4 в/м 8 02-ЕРА‘е‘га'р001 [0,2 мкг PS] 90 34 W3110 Rrfb::rfb(upecll6){Rwek^ RwaaL::clmR /pGVXN939/ pGVXN659
7 в/м 8 06-ЕР Atetra'p001 [0,2 мкг PS] 84 38 W3110 RwzzE-wecG EwaaL RwbbIJK RgtrS \wzxO16/ pGVXN348/ pGVXNl 14/ pGVXN659
9 в/м 8 O25B-EPAtetra'p001 [0,2 мкг PS] 85 21 upecl63 RwaaL pGVXN112 /pGVXN659
10 в/м 8 EPAtetra W3110 Avi’W. pGVXN659
И в/м 8 TBS
12 в/м 8 01+02 +O25B+O6-EPAtetra [0,2 мкг PS/каждый] 89* 29* Смесь указанных выше партий
*рассчитанные значения
- 51 035991
Очищенные биоконъюгаты использовали для иммунизации самок крыс Sprague Dawley в возрасте 9 недель. 100 мкл растворов такой же дозы вводили внутримышечно (в/м) на 1, 22 и 43 сутки крысам, у которых в заключение на 56 день отбирали кровь и которых умерщвляли.
Разные группы крыс получали разные вакцины: всегда в чистом виде, содержащую биоконъюгаты отдельно или в комбинации, как указано в табл. 6. Планшеты ELISA, покрытые когнатными LPS, продуцируемыми положительным штаммов waaL, использовали для измерения иммуногенности в форме титра ELISA сыворотки крыс во время терминального отбора крови на 56 сутки после первой инъекции (Фиг. 25-28). В целом, статистически значимая иммуногенность наблюдалась во всех вакцинированных группах, при измерении по сравнению с контролями (негликозилированный ЕРА или TBS буфер). Таким образом, биоконъюгаты, выбранные и полученные, представляют собой полезные соединения-кандидаты для вакцин.
Для всех протестированных конъюгатов О-антиген-ЕРА статистически значимую иммуногенность наблюдали для всех вакцинированных групп, при измерении по сравнению с контролями (негликозилированный ЕРА или TBS буфер). Таким образом, биоконъюгаты, выбранные и полученные, представляют собой полезные соединения-кандидаты для индукции О-антиген-специфических антител.
Пример 7. Физико-химическая характеристика биоконъюгатов.
Четыре биоконъюгата, описанные в примерах выше (О-антиген 025b, О1А, O2 и O6, соответственно конъюгированных с ЕРА в качестве белка-носителя) были приготовлены в виде моновалентных партий (активные фармацевтические ингредиенты, API) или объединены в одном препарате в виде поливалентной вакцины против ЕхРЕС. Были получены различные группы: доклинические группы, группы для изучения токсичности и клинические группы. В табл. 7 указаны штаммы-хозяева, используемые для получения конъюгатов.
Таблица 7. Штаммы-хозяева для получения партий для доклинических токсикологических исследований и клинических партий
Продукт Штамм EPA- экспрессионная плазмида PglB- экспрессионная плазмида
ЕРАО1А W3110 Arfb::rfb(upec032) AwaaL pGVXN1076 pGVXN970
ЕРА-О2 W3110 Arfb::rfb(upecl 16) AwaaL pGVXN1076 pGVXN971
ЕРАO6G1C W3110 Arfb::rfb(CCUG11309) AwaaL pGVXN659 pGVXN114
ЕРА- 025В W3110 Arfb::rfb(upecl38) AwaaL AgtrABS pGVXN1076 pGVXN970
Таким образом, четыре моновалентные пре-GMP партии и негликозилированный ЕРА эталон анализировали посредством гель-фильтрационной хроматографии с многоугловым рассеянием лазерного света (SEC-MALS), для того чтобы количественно оценить степень моно- и ди-гликозилирования отдельных биоконъюгатов и для определения молекулярной массы (ММ) белка-носителя и O-PS, присоединенного к нему. Образцы разделяли на колонке TSKgel-G3000 SWxl в фосфатном буфере (рН 7,0; 50 мМ NaCl, 150 мМ фосфата натрия) и контролировали с помощью УФ (214 и 280 нм), показателя преломления (RI) и многоуглового рассеяния лазерного света (MALS).
Для негликозилированного белка-носителя ЕРА была определена ММ, равная 63-67 кДа (теоретическая ММ составляет 70,5 кДа, на основании аминокислотной последовательности). В биоконъюгатах обнаруживали только ЕРА при 280 нм, позволяя выделять его ММ из общей ММ, измеренной с помощью RI и MALS: в биоконъюгатах измеренная ММ группировки ЕРА составляла 65-71 кДа.
Анализ стандартов продукта npe-GMP API показан в табл. 8, он указывает на присутствие моно- и ди-гликозилированных конъюгатов с ММ в диапазоне 75-79 кДа и 87-91 кДа соответственно. Части O-PS имели ММ 16-24 кДа для ди-гликозилированных разновидностей и 8-14 кДа для моногликозилированных разновидностей соответственно. Учитывая MM RU каждого серотипа, было определено среднее число 10-16 RU на полисахаридную цепь, что хорошо согласуется с данными гидразинолиза и MS.
Таблица 8. SEC-MALS анализ моновалентных стандартов продукта пре-GMP API
Моновалентная партия Пик 1 Пик 2
Общая ММ ММ O-PS Общая ММ ММ O-PS
EPA-0 ΙΑ 15% 87 к Да 16 кДа 83% 75 кДа 8 кДа
ЕРА-02 29% 88 к Да 19 кДа 70% 76 кДа 10 кДа
ЕРА-06 47% 88 к Да 21 кДа 50% 78 кДа 12 кДа
ЕРА-О25В 56% 91 к Да 24 кДа 42% 79 кДа 14 к Да
- 52 035991
Пик 1: дигликозилированная форма. Пик 2: моногликозилированная форма.
Анализ методом кругового дихроизма (CD) партии биоконъюгата 025В, приготовленной в триссолевом буфере (TBS), показал, что композиции при рН от 6,8 до 7,4 имеют спектр, аналогичный спектру негликозилированного белка-носителя ЕРА, со смесью альфа-спиральных и бета-складчатых структур, как ожидалось на основе опубликованной кристаллической структуры ЕРА. Таким образом, на основе этих CD-анализов можно предположить, что гликозилирование цепями 025b O-PS не влияет на вторичную структуру белка-носителя ЕРА.
Анализ посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) композиции партии биоконъюгата O25B в TBS при рН от 6,8 до 7,4 и в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) при рН от 7,1 до 7,8, показал кривые плавления, сравнимые с кривыми негликозилированного ЕРА, с температурой плавления приблизительно 52°С. Этот результат показал, что биофизическая характеристика белканосителя ЕРА не меняется при модификации цепями 025В 0-PS.
Пример 8. Стабильность моновалентных нерасфасованных партий и тетравалентных вакцинных препаратов.
Перед крупномасштабным изготовлением состоятельность процесса изготовления оценивали в малом масштабе. Партии для оценки состоятельности оценивали в широкоохватных исследованиях стабильности, которые включали условия ускоренного старения и стрессовые условия хранения для определения путей ухудшения характеристик. Стабильность четырех моновалентных вакцинных компонентов (API) тестировали в течение периода 3 месяца.
Анализ данных по стабильности доклинических API показал стабильность в течение по меньшей мере 3 месяцев при хранении при -75±15°С (нормальные условия хранения). Никаких статистически значимых тенденций не наблюдалось при предполагаемых условиях хранения при статистическом линейном регрессионном анализе. Также при ускоренных (+5±3°С) и стрессовых условиях хранения (+25±5°С) продукт был стабильным в течение по меньшей мере 3 месяцев, о чем свидетельствует низкая изменчивость показателей стабильности. Данные для О1А доклинических API показаны в табл. 9. Три других серотипа (O2, O6, O25B) продемонстрировали аналогичные данные по стабильности.
Таблица 9. Данные по стабильности партии О1А доклинического API
S/P to S/P 3 мес Чистота to Чистота 3 мес
-75 ±15°С 19,3 19,8 98,1% 97,6%
+5 ±3°С 20,9 98,6%
+25 ±5°С 21,3 98,3%
S/P: отношение сахара к белку, определенное с помощью антронового и ВСА анализов соответственно.
Чистота: как определено посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC).
Стабильность тетравалентной вакцинной композиции (биоконъюгаты O25B, О1А, O2 и O6) определяли в течение 3-х месячного периода. Исследования включали условия ускоренного старения и условия стрессового хранения для определения путей ухудшения характеристик. Полученные данные считаются релевантными для первоначального обоснования срока хранения GMP IMP (исследовательский лекарственный продукт, тетравалентная вакцинная композиция ЕхРЕС).
Анализ данных по стабильности доклинической партии тетравалентной вакцины ЕхРЕС указывает на стабильность в течение по меньшей мере 3 месяцев при хранении при +5 ±3°С (нормальные условия хранения), как показано в табл. 10. Никаких статистически значимых тенденций не было обнаружено при предполагаемых условиях хранения посредством статистического линейного регрессионного анализа. Также при ускоренных условиях хранения (+25±5°С) продукт был стабильным, о чем свидетельствует низкая вариабельность показателей стабильности.
Таблица 10. Данные по стабильности партии доклинической тетравалентной вакцины
ММ to ММ 3 мес. Чистота to Чистота 3 мес.
5 ±3°С 302 & 192 294 & 188 98,3% 98,7%
кДа кДа
25 ±5°С 297 & 191 кДа 98,2%
ММ (распределение молекулярного размера): два основных пика продукта (то есть моно- и дигликозилированные разновидности), как определено посредством эксклюзионной высокоэффективной
- 53 035991 жидкостной хроматографии (SE-HPLC).
Чистота: как определено посредством обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC).
Все вместе эти исследования показывают, что API и тетравалентная вакцинная композиция ЕхРЕС были стабильны в течение по меньшей мере трех месяцев и, таким образом, являются подходящими вакцинными композициями в отношении стабильности.
Пример 9. Исследование токсичности тетравалентного вакцинного препарата.
Оценивали токсичность и местную переносимость тетравалентного вакцинного препарата (биоконъюгаты 025b, 01а, O2 и O6) после двух внутримышечных введений (для воздействия была выбрана четырехглавая мышца бедра) крыс Sprague Dawley в 1 и 14 сутки. Обратимость, сохранение или отсроченное возникновение каких-либо изменений оценивали после восстановительного 14-суточного периода на 28 сутки. Вскрытие животных в основных группах (10 самцов и 10 самок и для вакцинированной, и для контрольной группы) производили на 17 сутки и в группах восстановления (5 самцов и 5 самок и для вакцинированной, и для контрольной группы) на 28 сутки (после 14-суточного периода восстановления). Это не было связано с какими-либо эффектами, рассматриваемыми как неблагоприятные, которые могли бы быть приписаны лечению. Вводимую дозу, то есть полную человеческую дозу, равную 4 мкг на Оантиген (16 мкг общего О-антигена для тетравалентной вакцины), вводимую на 1 и 14 сутки, рассматривали как уровень, не вызывающую обнаруживаемого неблагоприятного эффекта (NOAEL) для тетравалентной вакцины ЕхРЕС в условиях этого исследования. Кроме того, иммуногенность тетравалентной вакцины ЕхРЕС была подтверждена и для суток 17 и для суток 28, после оценки образцов сыворотки. Высокие титры анти-О1А, анти-О2, анти-О6 и анти-О25В IgG- антител были индуцированы в вакцинированной группе по сравнению контролями, которые получали только буфер, используемый для приготовления препарата (25 мМ Tris, 130 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,4).
Эти данные подтверждают, что тетравалентная вакцина ЕхРЕС обладает соответствующим профилем токсичности для введения в качестве вакцины и индуцирует антитела по меньшей мере ко всем четырем серотипам О-антигенов Е. coli, присутствующих в вакцине (то есть 025В, О1А, O2 и O6).
Пример 10. Эпидемиология О-серотипов, связанных с бактериемией.
Для определения распределения О-серотипов среди внекишечной Е. coli, вызывающей бактериемию у пожилых людей, было проведено эпидемиологическое исследование на панели изолятов крови Е. coli, собранных у пациентов старше 60 лет. В общей сложности 860 изолятов крови за период 2011-2013 гг собрали у субъектов в США, Великобритании, Германии, Испании и Нидерландах и проанализировали посредством классической О-агглютинации. Как показано в табл. 11, распределение О-серотипов изолятов с бактериемией напоминает распределение О-серотипов, обнаруженное у пациентов, страдающих от инфекции мочевыводящих путей (UTI, см. табл. 1А). Серотип O25 был наиболее распространен в исследованной группе с бактериемией; субтипирование пятидесяти семи изолятов посредством ПЦР показало, что пятьдесят шесть (98%) серотипов O25 представляли собой 025В. В обеих целевых группах (UTI и бактериемия), серотипы O1, O2, O6 и O25 были идентифицированы, как четыре наиболее распространенных серотипа. В целом, эти данные подтверждают, что распределение серотипов среди изолятов, как с инфекцией мочевых путей, так и с бактериемией очень похоже и не зависит от географического расположения, времени выделения и показания.
Таблица 11. Распределение наиболее распространенных ассоциированных с бактериемией О-серотипов Е. coli из коллекции 860 изолятов крови, собранных в США и Европейском союзе за период 2011-2013 гг.
Указано относительное распределение О-серотипов в образцах
О-серотип Бактериемия в возрасте > 60 лет США/ЕС 2011-2013 гг (п=860)
25 19,2
2 8,8
6 8,3
1 7,8
75 3,3
4 2,8
16 2,7
18 2,7
15 2,3
8 2,0
153 1,6
73 1,6
Пример 11. Индукция фунциональных антительных ответов.
Функциональность антител, индуцированных после вакцинации моновалентной и тетравалентной вакцинными композициями, описанными выше, исследовали с помощью опсонофагоцитирующего киллинг-анализа (OPK) in vitro. Этот тип анализа был принят в качестве коррелята защиты для конъюгатной
- 54 035991 вакцины против Streptococcus pneumoniae (Prevenar®). OPK-анализ определяет способность сыворотки содействовать опсонофагоцизу и гибели разных серотипов Е. coli. В 96-луночных планшетах, в каждой лунке, инкубировали определенные разведения образца сыворотки с: бактериями одной из четырех вакцино-специфических серотипов Е. coli, определенным количеством клеток HL60 и комплементом крольчонка. После инкубации часть смеси наносили на триптиказо-соевый агар (TSA) и подсчитывали число бактериальных колоний. Способность антител связываться с бактериальными клетками и активировать отложение комплемента и опосредовать захват и уничтожение бактерий клетками HL60 выражали в виде опсонического титра. Опсонический титр или индекс опсонизации (OI) соответствует разведению сыворотки, уничтожающему 50% бактериальных клеток. Предложены опсониченские индексы для до- и послеиммунной сыворотки. Значимым считается более чем 4-кратное увеличение OI между показателями для до- и послеиммунной сывороткой. Были установлены анализы OPK для трех серотипов O2, O6Glc и 025В.
Функциональность антительных ответов, индуцированных моновалентными вакцинами.
Для оценки функциональной активности индуцированных вакциной антительных ответов на биоконъюгаты 025В, О1А, O2 и O6Glc, сыворотку вакцинированных крыс анализировали, используя анализы опсонофагоцитирующего киллинга (OPK), в которых определяют in vitro комплемент- и антителозависимый фагоцитоз и уничтожение бактерий, например Е. coli. E. coli предварительно опсонизировали разведениями сыворотки вакцинированных крыс, инкубированной с комплементом и фагоцитами (дифференцированные клетки HL60), и определяли колониеобразующие единицы (КОЕ). Далее рассчитывали максимальный % гибели и индексы опсонизации (OI: разведение сыворотки, вызывающее гибель 50% Е. coli). Е. coli, выбранные для OPK-тестирования представляли собой ОС 24453 (серотип O2), ОС 24781 (серотип O6Glc) и ОС 24176 (серотип 025В). Как показано на фиг. 29, наблюдался надежный функциональный иммунный ответ на 02-ЕРА (Фиг. 29А), O6G1C-EPA (Фиг. 29В) и О25В-ЕРА (фиг. 29С).
Полученные данные показывают, что компоненты вакцины, описанные в данном документе, индуцируют антительные ответы против серотипов Е. coli, О-антигены которых включены в вакцину и, что такие антительные ответы участвуют в гибели Е. coli этих серотипов.
Функциональность антительных ответов, индуцированных тетравалентной вакциной.
В табл. 12 показаны общие титры OI для О-антигенов O2, O6Glc и 025В из животных, иммунизированных тетравалентной вакциной либо 0,4, либо 4 мкг на О-антиген. Титры определяли в двух независимых экспериментах. Доза 0,4 мкг индуцировала значительные OI у всех животных в отношении серотипов O2 и O6Glc. В отношении 025В 3/8 животных показали значительное увеличение OI после иммунизации дозой 0,4 мкг. По сравнению с дозой 0,4 мкг, доза 4 мкг индуцировала меньшее увеличение OI в отношении O2 у всех животных. 3/8 животных продемонстрировали увеличения OI, когда сыворотку из группы дозы 4 мкг тестировали на 025В Е. coli. Эти данные подтверждают, что тетравалентная вакцина способна вызвать О-антиген-специфические опсонические антитела против O2, 06Glc и 025В.
Эти данные показывают, что компоненты вакцины, описанные в данном документе, индуцируют антительный ответ против серотипов Е. coli, О-антигены которых включены в вакцину и, что такие антительные ответы участвуют в гибели Е. coli этих серотипов.
Таблица 12. OI против O2, O6 и O25. OI отдельных сывороток до вакцинации и после 3 вакцинаций из двух независимых экспериментов показаны для всех животных
Индексы опсонизации (01) тетравалентной ЕРА крысиной сывороткой
02 Е coli 06 Е. coli 0 25 Е . coli
Животное Доза 0,4 мкг Доза 4 мкг Доза 0,4 мкг Доза 4 мкг Доза 0,4 мкг Доза 4 мкг
№ Ехр.1 Ехр.2 Ехр.1 Ехр.2 Ехр.1 Ехр.2 Ехр.1 Ехр.2 Ехр.1 Ехр.2 Ехр.1 Ехр.2
1:пре-вак 6 7 5 0 17 6 6 16 2'404 2'082 0 0
пост-вак >16384 1'476 293 32 202 226 2'045 2'821 1'847 1'578 9 0
2:пре-вак 21 11 11 20 11 90 0 0 0 0 0 0
пост-вак 11'148 >16384 150 120 436 475 10'262 11'460 0 0 4 0
3: пре-вак 6 6 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0
пост-вак 11'073 >16384 46 19 98 37 7'959 8'597 6 0 355 197
4: пре-вак 5 5 5 6 23 17 0 0 0 0 0 0
пост-вак >16384 63 57 45 108 116 2'189 4'488 0 0 70 26
5: пре-вак 7 0 0 4 30 8 8 7 0 0 0 0
пост-вак 10'413 7'050 105 108 >16,384 12'672 3'107 7'564 0 0 105 69
6: пре-вак 8 0 8 7 299 164 5 0 269 154 0 0
пост-вак 89 34 24 17 1'725 1'475 540 896 0 0 0 0
7: пре-вак 9 9 6 6 18 21 22 5 0 0 0 0
пост-вак >16384 >16384 109 92 1'249 1'863 160 143 1'130 630 9 8
8: пре-вак 4 6 6 5 26 22 0 0 0 0 0 0
пост-вак 5'058 4'201 39 25 6'590 3'826 288 656 3'336 1'986 0 0
пре-вак Αν 8 5 5 6 53 42 5 3 334 280 0 0
пост-вак 10'867 7'747 103 57 3'349 2'586 3'319 4'578 790 524 69 37
- 55 035991
Рассчитаны максимальный % гибели и индексы опсонизации (OI: разведение сыворотки, вызывающее гибель 50% Е. coli). E. coli, выбранные для OPK-анализа, представляли собой ОС 24453 (серотип
O2), ОС 24781 (серотип O6Glc) и ОС 24176 (серотип 025b). Наблюдался сильный функциональный иммунный ответ на 02-ЕРА, O6G1C-EPA и О25В-ЕРА.
Пример 12. Оценка вакцины-кандидата против уропатогенных Escherichia coli у женщин с историей болезни рецидивирующей инфекцией мочевыводящих путей (RUTI).
Биоконъюгатная вакцина Е. coli используется на I фазе клинического исследования. Вакцина содержит четыре биоконъюгата в солевом буферном растворе. Четыре биоконъюгата представляют собой: (1) О1А Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, (2) O2 Е. coli, конъюгированный с белкомносителем ЕРА, (3) O6Glc Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, и (4) 025В Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА.
Исследуемая группа включает 194 здоровых женщин в возрасте более и равном 18-70 лет с историей болезни рецидивирующей инфекцией мочевыводящих путей (RUTI), которая определена как более или ровно 3 независимых эпизода за предыдущие 12 месяцев или более или ровно 2 эпизода за последние 6 месяцев. По меньшей мере один из эпизодов инфекции мочевыводящих путей (UTI) был вызван Е. coli (в качестве единственного патогена или части полимикробной инфекции) и эта причина была подтверждена культивированием и задокументирована. Для исследования UTI определяют по наличию по меньшей мере одного определенного симптома UTI (дизурия, неотложный позыв к мочеиспусканию, частота мочеиспускания, боль в боку, болезненность мочевого пузыря, надлобковая боль, лихорадка, тошнота, рвота) наряду с количеством бактерий (КОЕ) составляющим более или ровно 10 КОЕ/мл уропатогена в средней порции мочи.
Исследование включает две группы: (1) вакцина-кандидат и (2) плацебо. Исследование представляет собой последовательное, рандомизированное, простое слепое, плацебо-контролируемое многоцентровое исследование здоровых женщин с историей RUTI.
Предполагаемый период включения в исследование составляет 4 месяца с последующим наблюдением врача продолжительностью девять месяцев для каждого субъекта.
Цель исследования состоит в оценке безопасности, иммуногенности и эффективности биоконъюгатной вакцины Е. coli.
Дизайн исследования.
За субъектами наблюдали в течение 9 месяцев после инъекции и только за субъектами с инъекциями наблюдали в течение всего периода исследования. Субъекты участвовали в общей сложности в 5 запланированных визитах: скрининговом (первый визит), в сутки 1 (второй визит), в сутки 7, сутки 30 и сутки 270. Субъекты получали 4 телефонных звонка в качестве последующего наблюдения на 2 сутки, 90 сутки, 150 сутки и на 210 сутки.
Любые незапланированные визиты из-за возникновения UTI включали в себя стандартную медицинскую помощь с унифицированными вариантами лечения. Анализы мочи и крови (если это возможно) собирали для диагностики и серотипирования. Спонтанно сообщаемые побочные явления (АЕ) и тяжелые побочные явления (SAE) регистрировали в течение исследования, тогда как запрашиваемые нежелательные АЕ регистрировали в течение 7 суток после инъекции.
В каждый визит субъекту давали новый дневник пациента и обсуждали предыдущий.
Дозирование и введение.
Во время первого визита подходящих субъектов, которые дали информированное согласие, подвергали скринингу и подтверждали их соответствие критериям включения/исключения. Отбирали кровь и собирали мочу.
Во время 2 визита (1 сутки) каждый субъект получал одну внутримышечную инъекцию 0,5 мл раствора (вакцина-кандидат или плацебо) в дельтовидную мышцу. Уменьшенная доза вакцины-кандидата содержит 1 мкг каждого полисахарида (всего 4 мкг полисахарида). Целевая доза вакцины-кандидата содержит 4 мкг каждого полисахарида (всего 16 мкг полисахарида).
Цели.
Основная цель заключается в оценке возникновения, интенсивности, взаимосвязи и длительности запрашиваемых и спонтанно сообщаемых нежелательных явлений (АЕ), а также серьезных побочных явлений (SAE) после инъекции вакцины-кандидата по сравнению с группой плацебо на протяжении всего периода исследования.
Вторичные цели заключаются (1) в сравнении изменения гематологических и биохимических конечных точек безопасности перед инъекцией (в начале скрининга и на 1 сутки) и после инъекции (на 7 и 30 сутки) вакцины-кандидата по сравнению с группой плацебо; (2) в оценке иммунного ответа вакциныкандидата между исходным уровнем (1 сутки) и после инъекции (30 сутки и 270 сутки); (3) в сравнении количества случаев симптоматической инфекции мочевыводящих путей (UTI), вызванных вакциннымисеротипами Е. coli, в двух группах, инъецированных вакциной-кандидатом или плацебо во время всего периода исследования, как наиболее релевантной конечной точки эффективности; (4) в оценке степени появления специфической Е. coli UTI вакцинного серотипа в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо в течение всего исследования; и (5) в оценке интенсивности и продолжительности кли- 56 035991 нических симптомов UTI E. coli серотипов, специфических для вакцины, в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо во время всего исследования.
Целями исследования являлись (1) сравнение интенсивности возникновения UTI, вызванных любым Е. coli серотипом, в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо во время всего исследования; и (2) сравнение интенсивности возникновения UTI, вызванных любым патогенном в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо во время всего исследования.
Критерии включения.
Критериями включения в исследование являются следующие: (1) женщины с историей рецидивирующей UTI, которая определяется как более или ровно 3 независимых эпизодов UTI в предыдущие 12 месяцев или более или ровно 2 эпизода UTI за последние 6 месяцев; по меньшей мере один UTI в течение последних 5 лет был вызван Е. coli (в качестве единственного патогена или части мультимикробной инфекции) и был подтвержден в культуре и задокументирован; (2) Возраст > 18 и < 70 лет; (3) здоровые субъекты без продолжающегося или подозреваемой симптоматической UTI момент скриннингового визита и в сутки инъекции (визит 2); (4) общее хорошее состояния здоровья, без клинически значимой истории болезни, результаты физического осмотра или клинико-лабораторные нарушения по клинической оценке исследователя; и (5) готовность участвовать в исследовании после того, как все аспекты протокола были объяснены и полностью поняты и получена письменная форма информированного согласия.
Критерии исключения.
Критериями исключения из исследования являются следующие: (1) история более чем 10 рецидивирующих случаев UTI в год до скринингового визита; (2) применение любого кратковременного мочевого катетера в пределах 7 суток до скрининга; (3) применение любого постоянного катетера в пределах 30 суток перед скринингом; (4) история любых заболеваний/нарушений мочевыводящих путей, вызывающих диагностические трудности; (5)симптом нарушения иммунной функции; (6) значимые заболевания и/или недостаточность сердечно-сосудистой системы, печени и почек; (7) неконтролируемый сахарный диабет; (8) значительные отклонения в результатах скрининга в отношении гематологии, биохимического анализа сыворотки и анализа мочи; (9) положительный тест на ВИЧ-инфекцию и/или симптом гепатита В или гепатита С; (10) BMI (индекс массы тела) более 34; (11) предшествующая иммуностимулирующая терапии для профилактики UTI (такая как Urovaxom®, Strovac® или Urovac®) в течение последних 3 месяцев или планируемое применение в течение периода исследования; (12) текущее применение любого лекарственного средства, известного как влияющего на иммунную функцию (например кортикостероиды >0,5 мг/кг масса тела/сутки); (13) применение UTI-ассоциированного вагинального эстрогенового лечения, вновь начавшегося менее чем за 6 месяцев до инъекции и продолжающегося во время исследования или планируемого начала в течение активного периода исследования; (14) применение любой антибиотической терапии в пределах 1 недели до инъекции; (15) планируемое применение посткоитальных антибиотиков для профилактики UTI в течение периода исследования; (16) любая вакцинация, планируемая в пределах 30 суток до и 30 суток после инъекции; (17) участие в других клинических исследованиях в течение 60 суток до включения в исследование и на протяжении всего исследования; (18) предшествующая обработка иммуноглобулинами или продуктами крови в течение 3 месяцев до инъекции; (19) известная гиперчувствительность к любому компоненту вакцины; (20) наличие определенного медицинского или психиатрического состояния, которое, по мнению исследователя, исключает участие в исследовании; (21) острое заболевание во время инъекции; (22) женщины детородного возраста, которые либо имеют положительный тест на беременность или отказываются от использования эффективной контрацепции; (23) кормящие женщины в любое время исследования; (24) субъекты с плановым хирургическим вмешательством во время исследования; и (25) любой другой значимый вывод, который, по мнению исследователя, увеличит риск возникновения неблагоприятного исхода при участии в исследовании.
Статистические методы и анализ.
Описательные статистические данные (п, среднее, стандартное отклонение, медиана и диапазоны для непрерывных переменных, частоты и проценты для категориальных переменных) предоставляются по группе лечению и/или визиту, как применимо. Все данные приведены по субъекту, группе лечения и, где применимо, визиту. Все субъекты из группы В, получающие плацебо, объединяют с образованием группы лечения плацебо.
Пример 13. Результаты фазы I клинического исследования.
В этом примере представлены некоторые результаты промежуточного анализа фазы I клинического исследования, описанного в примере 12.
12.1. Безопасность.
Возникновение побочных явлений и тяжелых побочных явлений было сопоставимо в группе плацебо и вакцинированной группе. Было зарегистрировано десять тяжелых побочных явлений и ни одно не было связано с исследуемым лекарственным средством.
12.2: Иммуногенность.
Для оценки иммуногенности компонентов вакцины, получали сыворотку от женщин, участвующих
- 57 035991 в клиническом исследовании, и анализировали ее посредством ELISA для количественного определения
IgG против четырех разных О-антигенов, включенных в тетравалентную вакцину (Е. coli O1, Е. coli O2,
Е. coli O6 и Е. coli O25B).
Сыворотку от вакцинированных женщин инкубировали в планшетах, покрытых О1А, O2, O6Glc и O25B-LPS, а также ЕРА. Затем планшеты инкубировали со вторичными антителами, мечеными HRP (пероксидаза хрена) (против человеческого IgG). Связанные антитела обнаруживали с помощью ТМВсубстрата и измеряли оптическую плотность. Значения ЕС50 вычисляли посредством аппрокисмации к 4-параметрической логистической модели.
Как показано на фиг. 30, повышенный иммунный ответ к О1А-ЕРА, 02-Ера, O6Glc-EPA и О25ВЕРА наблюдался у большинства вакцинированных женщин.
Эти данные демонстрируют иммуногенность каждого компонента тетравалентной вакцины.
12.3. Функциональный антительный ответ.
Анализы OPK, в которых измеряют in vitro комплемент- и антителозависимый фагоцитоз и гибель бактерий Е. coli, использовали для оценки функционального антительного ответа у женщин, участвующих в клиническом исследовании.
У участников исследования собирали сыворотку. Е. coli предварительно опсонизировали разведениями сыворотки от вакцинированных женщин, инкубированной с комплементом и фагоцитами (дифференцированные клетки HL60) и определяли оставшиеся колониеобразующие единицы (КОЕ). Затем рассчитывали максимальный процент гибели и индексы опсонизации (OI: разведение сыворотки, вызывающее гибель 50% Е. coli). E. coli, выбранные для OPK-тестирования, представляли собой ОС 24452 (серотип О1А), ОС 24453 (серотип O2), ОС 24454 (серотип O6Glc) и ОС 24176 (серотип 025В).
Как показано на фиг. 31, наблюдался устойчивый функциональный иммунный ответ на О1А-ЕРА (фиг. 31 А), 02-ЕРА (фиг. 31В), O6Glc-EPA (фиг. 31С) и О25В-ЕРА (фиг. 31D).
Эти данные показывают, что каждый компонент тетравалентной вакцины индуцирует серотипспецифический антительный ответ и, что такие антительные ответы являются функциональными в гибели Е. coli этих серотипов. Таким образом, вакцинные композиции, описанные в данном документе, являются функциональными у людей.
12.4. Иммунизация тетравалентным О-антигенным конъюгатом, содержащим О25В-ЕРА, вызывает образование О25А/О25В-перекрестных IgG-антител у людей.
Для определения уровня перекрёстной реактивности индуцированных вакциной сывороточных IgGантител к двум известным подсеротипам Е. coli O25, О25А и 025В, серийные разведения сыворотки, полученной от вакцинированных субъектов, инкубировали с очищенными LPS O25A, LPS O25B или интактными бактериальными клетками и тестировали с помощью ELISA.
Как показано на фиг. 32, при анализе реакционной способности в отношении LPS O25A (черные полоски) и LPS O25B (серые полоски) через тридцать суток после вакцинации наблюдались аналогичные значения EC50. В целом эти данные свидетельствуют о том, что биоконъюгат 025В работает хорошо и в отношении 025В, и в отношении О25А, но в большинстве случаев/протестированных субъектов 025В работает немного лучше с точки зрения антительного ответа на 025В по сравнению с О25А. Этот результат свидетельствует о том, что при возникновении какой-то естественной изменчивости тетравалентная вакцина индуцирует антитела, которые узнают LPS и О25А, и 025В. Чтобы проверить, распространяется ли это на целые бактериальные клетки и многочисленные штаммы О25А/О25В, проверяли реакционную способность к набору клинических изолятов О25А или 025В, полученных из крови или мочи. В этом случае штамм серотипа O75, не представленного в тетравалентной вакцине, использовали в качестве отрицательного контроля (пунктирная серая линия на фиг. 33). Как показано на фиг. 33, индуцированные вакциной сывороточные IgG-антитела продемонстрировали сильный ответ на каждый из отдельных штаммов O25. Несмотря на очевидные изменения между штаммами, наблюдалась реактивность в отношении штаммов О25А (черные линии) и 025В (серые линии). Эти данные демонстрируют, что компонент 025В тетравалентной вакцины вызывает образование антител, которые узнают очищенные LPS и О25А и 025В, а также штаммы O25 А и 025В Е. coli.
В табл. 13 и 14 ниже представлены подробности для некоторых штаммов и плазмид, соответственно, используемых в вышеуказанных примерах.
- 58 035991
Таблица 13. Штаммы
Наименование Генотип Описание
ирес032 wt клинический изолят 01А из GVXN эпидемиологического исследования
ирес436 wt клинический изолят О25А из GVXN эпидемиологического исследования
ирес138 wt клинический изолят 025В из GVXN эпидемиологического исследования
иресИб wt клинический изолят 02 из GVXN эпидемиологического исследования
ирес163 wt клинический изолят 025В из GVXN эпидемиологического исследования
ирес177 wt клинический изолят 025В из GVXN эпидемиологического исследования
W3110 F-, Г, IN(rrnDrrnE)l, rph-1 Лабораторный штамм К-12, используемый для синтеза продуцирующего штамма, CGSC#: 4474
CCUG25 wt Изолят 02, полученный из коллекции культур, Университет Гетеборга (CCUG), Швеция (см. Jansson, et al., (1987) Carbohydrate research 161, 273-27)
CCUG11309 wt Изолят 06 из CCUG, OPS с разветвлением Glc (cm. Jann, et al., (1994) Carbohydrate research 263, 217-225)
CCUG11311 wt Изолят 06 из CCUG, OPS с разветвлением GlcNAc (cm. Jann, et al., (1994) Carbohydrate research 263,217-225)
- 59 035991
Таблица 14. Плазмиды
Наименование Описание Примечания
pGVXN150 экспрессионная плазмида на основе pBR322 для генетически См. Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9,
детоксифицированного EPA-his6, кодирующая 2 сайта гликозилирования 61
pGVXN659 экспрессионная плазмида на основе pBR322 для генетически детоксифицированного ЕРА, кодирующая 4 сайта гликозилирования pGVXN150 была модифицирована так, чтобы кодировать дополнительные N- и Сконцевые сайты гликозилирования
pGVXN1076 pGVXN659 AampR::kanR
pGVXN579 вектор на основе pMAL-p2X для экспрессии МВР с С-концевым гибким линкером, за которым следуют последовательности трех сайтов гликозилирования и тус эпитоп Позволяет быструю очистку биоконъюгатов без метки his
pGVXN114 экспрессионная плазмида на основе рЕХТ21 для PglB с НА-меткой См. Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61
pGVXN939 экспрессионная плазмида на основе рЕХТ21 для PglB с НА-меткой, кодон-оптимизированная
pGVXN970 экспрессионная плазмида на основе рЕХТ21 для PglB без метки, кодоноптимизированная
pGVXN539 экспрессионная плазмида на основе рАСТЗ для генетически детоксифицированной, кодоноптимизированной, меченной гистидином ЕРА, кодирующая 2 сайта гликозилирования, как Замена устойчивости к хлорамфениколу устойчивостью к канамицину из pGVXN161 (олиго: #1399/#1400)
pGVXN150
pGVXN161 pKD4 См. Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 66406645
pGVXN112 экспрессионная плазмида на основе рАСТЗ для PglB с НА-меткой
- 60 035991
Таблица 15. Последовательности
Описание ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SEQ ID NO.
rmlB (upec138) GTGAAGATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTG GTTCTGCTGTTGTTCGTCACATAATAAATAATACGCAA GATAGTGTTGTTAATGTCGATAAATTAACATACGCCG GAAACCTGGAATCACTTGCAGATGTTTCTGATTCTGA ACGCTATTTCTTTGAACATGCGGATATTTGTGATGCA GCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCG GATGCAGTGATGCACCTGGCAGCTGAAAGCCATGTT GACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAA CCAATATTGTGGGTACTTATGTCCTTTTAGAAGCGGC TCGGAATTATTGGTCTGGTCTGGATGATGAAAAGAAA AAAAACTTCCGTTTTCATCATATTTCTACTGATGAGGT GTATGGTGACTTACCCCATCCGGATGAAGTAAATAGC AATGAAACGTTGCCGCTATTTACGGAAACGACAGCAT ACGCGCCAAGTAGTCCATATTCTGCTTCTAAAGCTTCC AGCGATCATTTGGTTCGCGCATGGAAACGTACTTATG GTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTAT GGTCCTTATCATTTCCCGGAAAAGCTTATTCCACTGG TTATTCTTAATTCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATT TATGGCAAAGGAGATCAGATCCGCGACTGGTTGTAT GTAGAGGATCATGCTCGAGCGTTATATACCGTCGTA ACCGAAGGTAAAGCGGGCGAAACTTATAACATTGGT GGACACAACGAAAAGAAAAACATCGACGTAGTGTTC ACTATTTGTGATTTGTTGGATGAGATAGTCCCGAAAG AGAAATCTTACCGCGAGCAAATTACTTATGTTACCGA TCGTCCGGGACACGATCGCCGTTATGCGATTGATGCT GAGAAGATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCACAG GAAACGTTTGAGAGTGGGATTCGTAAAACGGTGGA ATGGTACCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATG TGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGATTGAACAG 1
AACTATGAGGGCCGCCAGTAA
rmlD (upec138) ATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTA GGTTGGGAACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGT AATTTGATTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTG TGGTGATTTTAGTAATCCTGAAGGTGTAGCTGAAACC GTAAGAAGCATTCGGCCTGATATTATTGTCAACGCA GCCGCTCACACCGCAGTAGACAAAGCAGAATCAGA ACCGAAGTTTGCACAATTACTGAACGCGACGAGTGT CGAAGCGATCGCGAAAGCAGCCAATGAAGTCGGCG CCTGGGTTATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCC GGGGACCGGTGAAATACCATGGCAGGAGGAGGATG CAACCGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGT TAGCGGGAGAAAAAGCATTACAAGAGCATTGTGCG AAGCACCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCA GGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAAACAATGTTGCG TCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTATTAA TGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCAGAGTTACT GGCTGATTGTACGGCACATGCTATTCGTGTGGCACT GAATAAACCGGAAGTCGCAGGCTTGTACCATCTGGT AGCTAGTGGTACCACAACGTGGCACGATTATGCTG CGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATT CCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAAC AACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATA ACTCTCGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAA CTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCG TGAAACGAATGCTTAACGAATTATTTACGACTACA GCAATTTAA 2
rmlA (upec138) ATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTGGCGGGTGG TTCTGGTACTCGTCTTTATCCTGTGACGATGGCCGTC AGTAAACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGAT GATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATGTTAGCGGG TATTCGCGATATTCTGATTATCAGTACACCACAGGA TACTCCTCGTTTTCAACAACTGCTGGGTGACGGGAG CCAGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAGTGCAAC CGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCGTTTATTATCG GTGAAGAGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGG TACTTGGTGATAATATCTTCTACGGCCACGACCTGC CGAAGTTAATGGACGTAGCTGTTAACAAAGAAAGT GGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCT GAACGTTATGGTGTCGTGGAGTTTGATAATAACGG TACTGCAATTAGCCTGGAAGAAAAACCGCTGGAAC CAAAAAGTAACTATGCGGTTACTGGGCTTTATTTCTA TGACAATGACGTTGTGGAAATGGCGAAAAACCTTA AGCCTTCTGCCCGAGGTGAACTGGAAATTACCGATA 3
- 61 035991
TTAACCGTATTTATATGGAACAAGGACGTTTGTCTG TCGCTATGATGGGGCGTGGCTATGCATGGCTGGATA CAGGGACGCATCAAAGTCTTATTGAAGCAAGCAAC TTCATTGCCACCATTGAAGAGCGCCAGGGACTAAAG GTTTCCTGTCCGGAAGAAATTGCTTATCGTAAAGGG TTTATTGATGCTGAGCAGGTAAAAGTATTAGCCGAA CCGTTGAAGAAAAATGCTTATGGTCAGTATCTGCTC AAAATGATTAAAGGTTATTAA
rmlC (upecl38) ATGAACGTAATTAAAACTGAAATTCCTGATGTGCTG ATTTTTGAACCAAAAGTTTTTGGGGATGAACGTGGCT TCTTTTTTGAGAGTTTTAATCAGAGGATTTTTGAAGA AGCAGTAGGTCGTAAGGTTGAGTTTGTTCAGGATAA CCATTCTAAGTCCAGTAAAGGTGTTTTACGTGGTCTT CATTATCAGTTAGAACCTTATGCTCAAGGAAAACTGG TGCGCTGTGTTGTTGGCGAGGTTTTTGATGTTGCGGTT GATATTCGTAAATCGTCACCTACATTTGGGAAATGG GTTGGGGTGAATTTGTCTGCTGAGAATAAGCGTCAG TTGTGGATTCCTGAGGGATTTGCACATGGTTTTTTGG TGCTGAGTGATTTAGCAGAAGTTTTATATAAAACGA ATCAATATTATGCTCCATCACATGAAAAAAATATTAT ATGGAATGACCTCTTGCTTAATATTAAATGGCCGAGC ACAGCACTGATCACTCTGTCTGATAAGGATGCAAA TGGGGAAAGATTTGAACTAAGTGAGTTTTGA 4
wzx (upecl38) ATGTCTCTCTTAAAACATAGTATATGGAATGTTGCGG GCTACTTTATACCAACATTAATTGCAATTCCCGCCTTT GGATTAATTGCGAGGAAAATTGGTGTAGAACTATTTG GTTTGTATACGTTAGCAATGATTTTTATAGGGTATGCA AGTATATTTGATGCTGGGTTAACAAGAGCTGTTGTGCG TGAAATAGCATTACTAAAAAACAGAGTGGACGATTGT AATACGATAATAGTAACTTCTATTATCGCTGTGATATT TTTAGGGTTTATCGGAGGCGGGGGAGTGTTTCTGCTTA AAGGCGATATTATTGAACTGTTAAATATCTCACCAATA TATTACGCCGATTCGATAAAGTCTCTAGTATTATTATCA TCTCTGATACCTGTATTCTTAGTCACGCAAATACTATTA GCAGAGCTTGAGGGTCGGGAATATTTTGGGATTCTAAA TATACAAAAAAGTGTAGGGAATTCTTTAATTGCAGGGT TACCTGCATTATTTGTTTTAATTAATCAAACGCTTTTTTC TGCAATTATTGGTGTAGCGATTGCAAGAGTTATATGCTT GTGGTTAAGCTACATTATGAGCAGGGAAAGAATAACTA TCGATATCTCATTTTTTTCAATAACTGTTTTAAAGCGGTT ATTTAGATATGGCGGGTGGGTAACTATAAGTAACATAA TATCTCCTATATTAGCGAGTATGGATAGATTTATTCTATC CCATATCCAGGGAGCATCAAAAATATCATTCTATACAGT CCCTAATGAGCTGGTAACTAGGCTTGGAATAGTTCCAGG 5
CTCTCTTGGGAAAGCTGTTTTTCCAAAATTAAGT CATGCAAGGAATTTTACAGCGTCATATGCAGAGCAAAA AAAAGCTTATATATTAATGACTGTCATTGTAATGCCTTT GGTTTTATTTGTATATTATTACGCAAAGTTTATTTTAACA TTGTGGATGGGGGCTGAGTATGCAGGGATTTCGGTCGA AATATTACGGATTATGCTTATAGGGTATATTTTTAACTGT TATTCACAAATCTCTTTTGCCAACATACAGGCCTTTGGA AAAGCAAAATACACTGCATACATCCATATGATGGAATT TATTCCTTATTTGATAATGTTATATATAATTTCAAAGGAA TATGGGGTTATTGGTGTTGCGTGGTTATGGACAATTCGA GTAATAATTGATTTTTTGATGCTTTTATATATGAGTTATC GTTGTAATAATCTTATGAAAAAAGGGTAG
wekA (upecl38) ATGATATATATTGTGGTATTAAATTGGAATGGGGCTA TAGATACCATTAATTGTGTTAAAAGTTTAATGGATTT AAATGTTAGCGATTATAAAATTATCATTGTTGATAAC TGTTCTATGGATAACTCATATGATACTATAAAAGAAA ATCTTAATTCATTATATATTGCTGATAAAAGTATCATT GAGGTGAAGTATGAGGATAGAAATAAATATAAAACC TTAGAAAACGATAAAATCATATTAATACAATCTCCGC AAAATAATGGGTACGCAAGTGGTAATAATATTGGCAT AGAGTTCGCTCTTAATCAGGAGAATATGAAATACGTC TGGGTTCTGAATAATGATACTGAAGTGGATAAAGAGG CTTTAACTCATTTAATTAGTAAATGTGATTCAGATAAA AGTATAGGGATTTGCGGTTCTCGTTTAGTCTATTTTGCC GACAGAGAGATGCAGCAAGGACTAGGTGGGGTGCATA ACAAATGGTTATGCACTACAAAAAATTATGAAATGGG AAGATTAGTTTCCAAAAAATATGATGATGAAGTCATTA GTAATGATATAGATTATATAATTGGCGCATCGATGTTTT TCTCTAGAGAATGTTTGGAAACAGTTGGATTGATGAAT GAAGAATATTTTTTATACTATGAAGAGTTAGATATTTGC CTCAGAGCAAAAGCAAAGAACTTTAAATTAGGTATTTG CTCAGAAAGTTTGGTTTATCATAAAATAGGTGCAAGTA CTGATGGGGGAAAGAGCATGATGGCTGATCTTTGCTCA ATAAAAAATAGGCTGGTCATTACAGAAAGGTTTTATCC CCAATATTATTGGACGGTATGGTTGTCACTTTTTGTTGTA GCATTTAACCGTGCTAGAAGAGGTGAGTTTAATAAGAT GAAAAGATGTTTGAATGTTATGTTTAACTTCAAACGAAA CAAAGGTAGCAAATGCCATTAG 6
w e кВ (upecl38) ATGAAAGTGGCTTTTTTATCTGCTTATGATCCACTATCTA CATCCAGTTGGTCTGGCACACCTTATTATATGCTAAAGG CATTATCGAAGAGAAATATTTCCATTGAAATATTAGGAC CGGTAAATAGCTATATGATATACATGTTAAAAGTATATA AATTAATATTAAGGTGTTTCGGAAAAGAATATGATTATA GTCATTCGAAGTTGCTTTCCAGGTATTACGGTAGAATATT 7
- 62 035991
CGGTAGGAAATTAAAAAAAATTGATGGTTTGGATTTTATT ATCGCACCTGCAGGTTCCTCACAAATTGCTTTTTTAAAAA CAACCATACCAATAATATATCTATCGGATACAACATATGA TCAATTAAAAAGCTATTATCCGAATTTAAATAAAAAAAC AATTATAAATGATGAGGATGCAAGTTTAATCGAACGCAA GGCTATTGAAAAAGCAACAGTAGTATCTTTCCCATCTAAA TGGGCAATGGATTTTTGCAGGAATTATTACAGATTAGATT TTGATAAATTAGTTGAAATACCATGGGGGGCTAATTT ATTTGATGATATTCACTTTGCTAATAAAAATATAATTC AAAAGAATAGTTATACTTGTCTTTTCTTGGGAGTTGAT TGGGAAAGAAAAGGTGGGAAAACAGCCTTGAAAGCA ATTGAATATGTAAGGCAGTTATATGGGATCGATGTTAG ACTAAAAATTTGTGGATGTACTCCGAATCAAAAGATTT TACCTACTTGGGTTGAATTAATTGATAAAGTAGATAAA AATAACGTTGACGAATATCAGAAATTCATCGATGTGTT ATCTAACGCTGATATACTTCTTTTACCAACCATTGCTGA ATGTTATGGAATGGTATTTTGTGAAGCTGCTGCTTTTGG ATTGCCTGTTGTCGCTACAGATACAGGTGGAGTCAGTT CTATAGTTATCAACGAAAGGACGGGGATATTAATTAAA GACCCGTTAGACTATAAGCACTTTGGAAATGCAATTCA TAAAATAATTAGTTCCGTAGAGACTTATCAAAACTACTC CCAAAACGCAAGAATTAGATATAATAATATATTGCATTG GGACAATTGGGCTAAAAAGATAATTGAGATTATGTATG AGCATAAGAATAGAAGAATCAAATAG
irzy (upecl38) ATGAGCATAAGAATAGAAGAATCAAATAGCACAAAAAG AATTATATGTTTATTTATACTTTTTCTTGTTTTCCCTGATTT TTTGTTTTATACATTAGGGGTTGATAATTTTAGCATTTCAA CGATAATCTCAATTACATTGCTTTTTGTTTTTTTAAGAGCT AAAAATATTTGCAAAGATAATTTTCTAATAATAGTAGCG TTATTCATATTGTTGTGTTTTAACTGTTTGTTAAGTATGCTA TTTAATATTGAACAGGCTTTAACATTTAAAGTTGTACTTTC AATATATAGCATCTTAATAATGGCATACGTCTCCTCTTGTT ATGCACAGACGTTGTGGTTATGTTCTGAAGAAATACTTAA GAGATCCGTCTTTTATTTGTTCGCATTTCTTTGCCTTATTGG CATTATAAGTATTCTTTTACAGAAGACTGAGATTATACATG ATAAAAGTATGATTCTTTTTCCTGAACCATCAGCATTTGCA TTGGTTTTTATACCTATCTTTTCATTTTGTTTATACTATACAA GAGGGGGGGGGCTACTATTGCTCTATATATTATCTTTGGGT ATTGCGTTAGGTATCCAGAATTTAACAATGTTGGTAGGCAT TGTGATTAGTGTTTTTGTGATGAAAAAAATAACTATAAGGC AAACTATTGTTATACTTTTGGGGGCATGGATTTTTTCCATGA TATTAAGTGATTTAGACATTTCTTACTATACATCGCGGCTTG ATTTTAAAAATACTACGAACCTATCAGTGCTTGTATATCTTT CAGGAATTGAAAGAGCTTTCTTGAATTTTATTACAAGTTATG 8
GTCTTGGTATTGGTTTTCAACAAATGGGAGTGAATGGGGAG ATAGGAATATATCAACAAATTTTAGCTGAACTTGATGCCCC TATGTTAAATATATACGATGGCTCATTTATTTCTTCTAAGTTA ATATCTGAGTTTGGGGTTATTGGTGCATTAATGTGTATT TTCTATTTTTTTTATTTTTCCCGATTTTATCTGCGTTTCAA AAAAAGTAAGAGATATTCACCGCAGTATATTTTAGCAT ATAGCTTCTACATGTGTTTCTTCATCCCTCTTTTTATACG TGGTGCTGGTTATATAAACCCCTATGTGTTTATGTTATTT TCATCAATATTTTTGTGCAAATATCACGCTAAAAATATCT TGATGAAATCTAATGTCCAGATAGCTATATAA
wbbJ (upecl38) ATGTGCATTAAAAAAAAACTTAAGTTAATTAAACGATA TGGCCTTTATGGTGGTCTTAGGCTTCTTAAAGATATATTC TTAACAAAATTTTTATTTTGTTCAAATGTTAGGATTATTA GATTTCCATGTTATATTAGAAAAGATGGAAGTGTTAGTTT TGGAAAAGGTTTTACATCAGGTGTAGGATTACGAGTTGA TGCATTTATGGATGCCGTAGTTTCCATTGGAGAAAATGTT CAAATTAATGACTATGTTCACATCGCGGCTATTAATAATG TCATTATTGGTAGAGATACATTAATAGCAAGTAAAGTATT TATTAGTGATCATAATCATGGTATTTTTTCTAAATCCGATA TCCATAGTTCACCAACTATTATTCCTTCGTCTAGGCCCCTT GAATCTGCACCTGTGTATATTGGAGAGCGTGTGTGGATTG GCGAAAATGTGACAATATTACCAGGTGCGTGTATAGGTAA TGGTGTAGTTATTGGCGCAAACAGTGTTGTTCGTGGTGAG ATTCCTAATAATGTGATCATTGCTGGTGTTCCAGCTAAAA TTGTTAAAAAATATAACTATGAGCGTATGCAATGGGAAA GAATATAG 9
wbbK (upecl38) ATGGGAAAGAATATAGTTGTAATATCGGCTGTTAATTTT ACAACCGGAGGCCCCTTTACCGTACTAAAAAATGTGCT TACAGCAACTAAAGATAGAGCCGAATGTAAATTTATTG CACTGGTTCATAGCTCTGCTGAACTAATGGAATTATTTC CGTGGGTTGAATTTATAGAGTATCCAGAAGTCAAGTCTT CGTGGGTTAAAAGATTATATTTCGAATATATAACTTGCAA TAGATTATCTAAGGTGATTAAGGCAACTCATTGGGTATG CTTACATGATATTACAGCAAATGTTAGTGTACCCTATAG ATTTGTTTATTGCCACAATCCTGCACCGTTCTATAAATAT TTAAGCTATCGAGATATTATAGGAGAACCTAAATTTTAT CTTTTTTATCTTTTTTATGGGCTTTTATACAATATCAATAT AAAAAAGAACACAGCAGTTTTTGTTCAGCAGCAGTGGCT AAAAAAAGAATTCGAAAAAAAATATAAGTTAAAGAATG TTGTTGTTAGTCGCCCTGAAGATATTTGCCCTTTTGAAAG TGATGGTTTGGTAAGAAATAATAATAAAAAGGATGTGAG GATATTTTACCCAGCAGTGCCCCGTATATTTAAAAACTTT GAAGTTATCATACGTGCTGCACAAATATTACAAGATAAA AATATTCATTTTTATCTTACTTTTGATGGTACTGAAAA 10
- 63 035991
TAAGTATGCAAAAAGAATATATAAATTAGCTTCCGA ACTGAAAAATGTACATTTCCTCGGTTACCTTAATGCA ACCGAGATGGTTAACTTTTATCAAGATTCAGATATTA TTTGTTTCCCATCGAAACTAGAAACGTGGGGATTACC ATTATCAGAAGCTAAAACATACAAAAAATGGATATTT GCGGCAGACTTACCTTATGCTCATGAAGTTTTATATAA CTATTCAAAAACTAGATATTTTCCATTTGACGATGAG AAAATACTTGTTCGCTACATATTAGAGTACACAAGTA AAAATATGCATGAAGATATAAAAAATAGTAGGGTGA ATTTTAATAATGATGCATTGACTGGTTTTGAACAGTTTA TTGAATATATCCTCAAGGGGAACTGA
wbbl. (upecl38) ATGATTATGAATAATGATTATTTTCTCTTTCTTAACCCC GATGTATTCATAACCAGTGAAAGTTTGATTAATTATGT TGATTATATAATTAGTAATGATTATAAGTTTAGCACAT TATGTCTTTATCGAGATTTTACTAAAAGCAAACATGAT TATTCAATACGGAGTTTTCCAACTTTATATGATTTTCTTT GTTCTTTTTTATTGGGGGTGAATAAAAGTAAAATTAAG AAGGAAAATATACTTTCTGATACTGTAGTTGATTGGTG TGCTGGCTCATTTATGCTTATTCATGCTTTAAGTTTCTTA AATGTGAATGGTTTTGATCAAAAATATTTTATGTATTGT GAAGATATTGACCTTTGTATGCGTTTAAAATTAAGTGG AGTAGATCTTTACTATACTCCCCATTTTGATGCTATTCA TTATGCGCAGCATGAAAATAGAAGAATATTTACTAAAG CATTTCGATGGCATATAAGGAGTATTACGCGCTACATA TTACGGAAACCAATTCTTTCTTATAAAAACTATAGAAA AATTACATCCGAACTGGTAAAGTGA 11
кластер генов rfb E. coli (upec!38) GTGAAGATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTC TGCTGTTGTTCGTCACATAATAAATAATACGCAAGATAGTG TTGTTAATGTCGATAAATTAACATACGCCGGAAACCTGGAA TCACTTGCAGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATTTCTTTGAA CATGCGGATATTTGTGATGCAGCTGCAATGGCACGGATTTT TGCTCAGCATCAGCCGGATGCAGTGATGCACCTGGCAGCT GAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATT TATTGAAACCAATATTGTGGGTACTTATGTCCTTTTAGAAG CGGCTCGGAATTATTGGTCTGGTCTGGATGATGAAAAGAA AAAAAACTTCCGTTTTCATCATATTTCTACTGATGAGGTGT ATGGTGACTTACCCCATCCGGATGAAGTAAATAGCAATGA AACGTTGCCGCTATTTACGGAAACGACAGCATACGCGCCA AGTAGTCCATATTCTGCTTCTAAAGCTTCCAGCGATCATTT GGTTCGCGCATGGAAACGTACTTATGGTTTACCGACCATTG TGACTAATTGCTCGAACAACTATGGTCCTTATCATTTCCCG GAAAAGCTTATTCCACTGGTTATTCTTAATTCACTGGAAGG TAAGGCATTACCTATTTATGGCAAAGGAGATCAGATCCGC GACTGGTTGTATGTAGAGGATCATGCTCGAGCGTTATATAC 12
CGTCGTAACCGAAGGTAAAGCGGGCGAAACTTATAACATT GGTGGACACAACGAAAAGAAAAACATCGACGTAGTGTTCA CTATTTGTGATTTGTTGGATGAGATAGTCCCGAAAGAGAAA TCTTACCGCGAGCAAATTACTTATGTTACCGATCGTCCGGG ACACGATCGCCGTTATGCGATTGATGCTGAGAAGATTGGTC GCGAATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGTGG GATTCGTAAAACGGTGGAATGGTACCTGTCCAATACAAAA TGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGAT TGAACAGAACTATGAGGGCCGCCAGTAATGAATATCCTCC TTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAGGTTGGGAACTACAGCG TGCTCTGGCACCTCTGGGTAATTTGATTGCTCTTGATGTTCA CTCCACTGATTACTGTGGTGATTTTAGTAATCCTGAAGGTG TAGCTGAAACCGTAAGAAGCATTCGGCCTGATATTATTGTC AACGCAGCCGCTCACACCGCAGTAGACAAAGCAGAATCAG AACCGAAGTTTGCACAATTACTGAACGCGACGAGTGTCGA AGCGATCGCGAAAGCAGCCAATGAAGTCGGCGCCTGGGTT ATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCCGGGGACCGGTGA AATACCATGGCAGGAGGAGGATGCAACCGCACCGCTAAAT GTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCGGGAGAAAAAGCATTAC AAGAGCATTGTGCGAAGCACCTTATTTTCCGGACCAGCTGG GTCTATGCAGGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAAACAATGT TGCGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTATTAA TGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCAGAGTTACTGGCTG ATTGTACGGCACATGCTATTCGTGTGGCACTGAATAAACCG GAAGTCGCAGGCTTGTACCATCTGGTAGCTAGTGGTACCAC AACGTGGCACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGC GCAAAGCAGGCATTCCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACGC AGTACCAACAACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCAC ATAACTCTCGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTT GCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCGTGAAACGAAT GCTTAACGAATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTT TGCATCTTGTTCGTAATGGTGGAGCAAGATGTATTAAAAGG AATGATGAAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTGGCGG GTGGTTCTGGTACTCGTCTTTATCCTGTGACGATGGCCGTC AGTAAACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGATGATCTA TTACCCGCTCTCTACACTGATGTTAGCGGGTATTCGCGATA TTCTGATTATCAGTACACCACAGGATACTCCTCGTTTTCAA CAACTGCTGGGTGACGGGAGCCAGTGGGGCCTGAATCTTC AGTACAAAGTGCAACCGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGC GTTTATTATCGGTGAAGAGTTTATTGGTGGTGATGATTGTG CTTTGGTACTTGGTGATAATATCTTCTACGGCCACGACCTG CCGAAGTTAATGGACGTAGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTG CAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCTGAACGTTAT GGTGTCGTGGAGTTTGATAATAACGGTACTGCAATTAGCCT
- 64 035991
GGAAGAAAAACCGCTGGAACCAAAAAGTAACTATGCGGTT ACTGGGCTTTATTTCTATGACAATGACGTTGTGGAAATGGC GAAAAACCTTAAGCCTTCTGCCCGAGGTGAACTGGAAATT ACCGATATTAACCGTATTTATATGGAACAAGGACGTTTGTC TGTCGCTATGATGGGGCGTGGCTATGCATGGCTGGATACAG GGACGCATCAAAGTCTTATTGAAGCAAGCAACTTCATTGCC ACCATTGAAGAGCGCCAGGGACTAAAGGTTTCCTGTCCGG AAGAAATTGCTTATCGTAAAGGGTTTATTGATGCTGAGCAG GTAAAAGTATTAGCCGAACCGTTGAAGAAAAATGCTTATG GTCAGTATCTGCTCAAAATGATTAAAGGTTATTAATAAGAT GAACGTAATTAAAACTGAAATTCCTGATGTGCTGATTTTTG AACCAAAAGTTTTTGGGGATGAACGTGGCTTCTTTTTTGAG AGTTTTAATCAGAGGATTTTTGAAGAAGCAGTAGGTCGTAA GGTTGAGTTTGTTCAGGATAACCATTCTAAGTCCAGTAAAG GTGTTTTACGTGGTCTTCATTATCAGTTAGAACCTTATGCTC AAGGAAAACTGGTGCGCTGTGTTGTTGGCGAGGTTTTTGAT GTTGCGGTTGATATTCGTAAATCGTCACCTACATTTGGGAA ATGGGTTGGGGTGAATTTGTCTGCTGAGAATAAGCGTCAGT TGTGGATTCCTGAGGGATTTGCACATGGTTTTTTGGTGCTG AGTGATTTAGCAGAAGTTTTATATAAAACGAATCAATATTA TGCTCCATCACATGAAAAAAATATTATATGGAATGACCTCT TGCTTAATATTAAATGGCCGAGCACAGCACTGATCACTCTG TCTGATAAGGATGCAAATGGGGAAAGATTTGAACTAAGTG AGTTTTGAAATGTCTCTCTTAAAACATAGTATATGGAATGT TGCGGGCTACTTTATACCAACATTAATTGCAATTCCCGCCT TTGGATTAATTGCGAGGAAAATTGGTGTAGAACTATTTGGT TTGTATACGTTAGCAATGATTTTTATAGGGTATGCAAGTAT ATTTGATGCTGGGTTAACAAGAGCTGTTGTGCGTGAAATAG CATTACTAAAAAACAGAGTGGACGATTGTAATACGATAAT AGTAACTTCTATTATCGCTGTGATATTTTTAGGGTTTATCGG AGGCGGGGGAGTGTTTCTGCTTAAAGGCGATATTATTGAAC TGTTAAATATCTCACCAATATATTACGCCGATTCGATAAAG TCTCTAGTATTATTATCATCTCTGATACCTGTATTCTTAGTC ACGCAAATACTATTAGCAGAGCTTGAGGGTCGGGAATATT TTGGGATTCTAAATATACAAAAAAGTGTAGGGAATTCTTTA ATTGCAGGGTTACCTGCATTATTTGTTTTAATTAATCAAAC GCTTTTTTCTGCAATTATTGGTGTAGCGATTGCAAGAGTTA TATGCTTGTGGTTAAGCTACATTATGAGCAGGGAAAGAAT AACTATCGATATCTCATTTTTTTCAATAACTGTTTTAAAGCG GTTATTTAGATATGGCGGGTGGGTAACTATAAGTAACATAA TATCTCCTATATTAGCGAGTATGGATAGATTTATTCTATCCC ATATCCAGGGAGCATCAAAAATATCATTCTATACAGTCCCT AATGAGCTGGTAACTAGGCTTGGAATAGTTCCAGGCTCTCT TGGGAAAGCTGTTTTTCCAAAATTAAGTCATGCAAGGAATT
TTACAGCGTCATATGCAGAGCAAAAAAAAGCTTATATATT AATGACTGTCATTGTAATGCCTTTGGTTTTATTTGTATATTA TTACGCAAAGTTTATTTTAACATTGTGGATGGGGGCTGAGT ATGCAGGGATTTCGGTCGAAATATTACGGATTATGCTTATA GGGTATATTTTTAACTGTTATTCACAAATCTCTTTTGCCAAC ATACAGGCCTTTGGAAAAGCAAAATACACTGCATACATCC ATATGATGGAATTTATTCCTTATTTGATAATGTTATATATAA TTTCAAAGGAATATGGGGTTATTGGTGTTGCGTGGTTATGG ACAATTCGAGTAATAATTGATTTTTTGATGCTTTTATATATG AGTTATCGTTGTAATAATCTTATGAAAAAAGGGTAGCCTGA TGATATATATTGTGGTATTAAATTGGAATGGGGCTATAGAT ACCATTAATTGTGTTAAAAGTTTAATGGATTTAAATGTTAG CGATTATAAAATTATCATTGTTGATAACTGTTCTATGGATA ACTCATATGATACTATAAAAGAAAATCTTAATTCATTATAT ATTGCTGATAAAAGTATCATTGAGGTGAAGTATGAGGATA GAAATAAATATAAAACCTTAGAAAACGATAAAATCATATT AATACAATCTCCGCAAAATAATGGGTACGCAAGTGGTAAT AATATTGGCATAGAGTTCGCTCTTAATCAGGAGAATATGAA ATACGTCTGGGTTCTGAATAATGATACTGAAGTGGATAAA GAGGCTTTAACTCATTTAATTAGTAAATGTGATTCAGATAA AAGTATAGGGATTTGCGGTTCTCGTTTAGTCTATTTTGCCG ACAGAGAGATGCAGCAAGGACTAGGTGGGGTGCATAACAA ATGGTTATGCACTACAAAAAATTATGAAATGGGAAGATTA GTTTCCAAAAAATATGATGATGAAGTCATTAGTAATGATAT AGATTATATAATTGGCGCATCGATGTTTTTCTCTAGAGAAT GTTTGGAAACAGTTGGATTGATGAATGAAGAATATTTTTTA TACTATGAAGAGTTAGATATTTGCCTCAGAGCAAAAGCAA AGAACTTTAAATTAGGTATTTGCTCAGAAAGTTTGGTTTAT CATAAAATAGGTGCAAGTACTGATGGGGGAAAGAGCATGA TGGCTGATCTTTGCTCAATAAAAAATAGGCTGGTCATTACA GAAAGGTTTTATCCCCAATATTATTGGACGGTATGGTTGTC ACTTTTTGTTGTAGCATTTAACCGTGCTAGAAGAGGTGAGT TTAATAAGATGAAAAGATGTTTGAATGTTATGTTTAACTTC AAACGAAACAAAGGTAGCAAATGCCATTAGAATATGCACT TAATCATGGTGTTAATAAATCTATAGTTTGATATGTTATTA AAGGGTATTTAATGAAAGTGGCTTTTTTATCTGCTTATGAT CCACTATCTACATCCAGTTGGTCTGGCACACCTTATTATAT GCTAAAGGCATTATCGAAGAGAAATATTTCCATTGAAATAT TAGGACCGGTAAATAGCTATATGATATACATGTTAAAAGT ATATAAATTAATATTAAGGTGTTTCGGAAAAGAATATGATT ATAGTCATTCGAAGTTGCTTTCCAGGTATTACGGTAGAATA TTCGGTAGGAAATTAAAAAAAATTGATGGTTTGGATTTTAT TATCGCACCTGCAGGTTCCTCACAAATTGCTTTTTTAAAAA CAACCATACCAATAATATATCTATCGGATACAACATATGAT
- 65 035991
CAATTAAAAAGCTATTATCCGAATTTAAATAAAAAAACAA TTATAAATGATGAGGATGCAAGTTTAATCGAACGCAAGGC TATTGAAAAAGCAACAGTAGTATCTTTCCCATCTAAATGGG CAATGGATTTTTGCAGGAATTATTACAGATTAGATTTTGAT AAATTAGTTGAAATACCATGGGGGGCTAATTTATTTGATGA TATTCACTTTGCTAATAAAAATATAATTCAAAAGAATAGTT ATACTTGTCTTTTCTTGGGAGTTGATTGGGAAAGAAAAGGT GGGAAAACAGCCTTGAAAGCAATTGAATATGTAAGGCAGT TATATGGGATCGATGTTAGACTAAAAATTTGTGGATGTACT CCGAATCAAAAGATTTTACCTACTTGGGTTGAATTAATTGA TAAAGTAGATAAAAATAACGTTGACGAATATCAGAAATTC ATCGATGTGTTATCTAACGCTGATATACTTCTTTTACCAACC ATTGCTGAATGTTATGGAATGGTATTTTGTGAAGCTGCTGC TTTTGGATTGCCTGTTGTCGCTACAGATACAGGTGGAGTCA GTTCTATAGTTATCAACGAAAGGACGGGGATATTAATTAA AGACCCGTTAGACTATAAGCACTTTGGAAATGCAATTCATA AAATAATTAGTTCCGTAGAGACTTATCAAAACTACTCCCAA AACGCAAGAATTAGATATAATAATATATTGCATTGGGACA ATTGGGCTAAAAAGATAATTGAGATTATGTATGAGCATAA GAATAGAAGAATCAAATAGCACAAAAAGAATTATATGTTT ATTTATACTTTTTCTTGTTTTCCCTGATTTTTTGTTTTATACA TTAGGGGTTGATAATTTTAGCATTTCAACGATAATCTCAAT TACATTGCTTTTTGTTTTTTTAAGAGCTAAAAATATTTGCAA AGATAATTTTCTAATAATAGTAGCGTTATTCATATTGTTGT GTTTTAACTGTTTGTTAAGTATGCTATTTAATATTGAACAG GCTTTAACATTTAAAGTTGTACTTTCAATATATAGCATCTTA ATAATGGCATACGTCTCCTCTTGTTATGCACAGACGTTGTG GTTATGTTCTGAAGAAATACTTAAGAGATCCGTCTTTTATT TGTTCGCATTTCTTTGCCTTATTGGCATTATAAGTATTCTTT TACAGAAGACTGAGATTATACATGATAAAAGTATGATTCTT TTTCCTGAACCATCAGCATTTGCATTGGTTTTTATACCTATC TTTTCATTTTGTTTATACTATACAAGAGGGGGGGGGCTACT ATTGCTCTATATATTATCTTTGGGTATTGCGTTAGGTATCCA GAATTTAACAATGTTGGTAGGCATTGTGATTAGTGTTTTTG TGATGAAAAAAATAACTATAAGGCAAACTATTGTTATACTT TTGGGGGCATGGATTTTTTCCATGATATTAAGTGATTTAGA CATTTCTTACTATACATCGCGGCTTGATTTTAAAAATACTA CGAACCTATCAGTGCTTGTATATCTTTCAGGAATTGAAAGA GCTTTCTTGAATTTTATTACAAGTTATGGTCTTGGTATTGGT TTTCAACAAATGGGAGTGAATGGGGAGATAGGAATATATC AACAAATTTTAGCTGAACTTGATGCCCCTATGTTAAATATA TACGATGGCTCATTTATTTCTTCTAAGTTAATATCTGAGTTT GGGGTTATTGGTGCATTAATGTGTATTTTCTATTTTTTTTAT TTTTCCCGATTTTATCTGCGTTTCAAAAAAAGTAAGAGATA
TTCACCGCAGTATATTTTAGCATATAGCTTCTACATGTGTTT CTTCATCCCTCTTTTTATACGTGGTGCTGGTTATATAAACCC CTATGTGTTTATGTTATTTTCATCAATATTTTTGTGCAAATA TCACGCTAAAAATATCTTGATGAAATCTAATGTCCAGATAG CTATATAATAGTAGATTATATTATCATTATCACGTAAATTA CATATTAATAGCATATATGATAACTAGGACATAAATAATGT GCATTAAAAAAAAACTTAAGTTAATTAAACGATATGGCCTT TATGGTGGTCTTAGGCTTCTTAAAGATATATTCTTAACAAA ATTTTTATTTTGTTCAAATGTTAGGATTATTAGATTTCCATG TTATATTAGAAAAGATGGAAGTGTTAGTTTTGGAAAAGGTT TTACATCAGGTGTAGGATTACGAGTTGATGCATTTATGGAT GCCGTAGTTTCCATTGGAGAAAATGTTCAAATTAATGACTA TGTTCACATCGCGGCTATTAATAATGTCATTATTGGTAGAG ATACATTAATAGCAAGTAAAGTATTTATTAGTGATCATAAT CATGGTATTTTTTCTAAATCCGATATCCATAGTTCACCAACT ATTATTCCTTCGTCTAGGCCCCTTGAATCTGCACCTGTGTAT ATTGGAGAGCGTGTGTGGATTGGCGAAAATGTGACAATAT TACCAGGTGCGTGTATAGGTAATGGTGTAGTTATTGGCGCA AACAGTGTTGTTCGTGGTGAGATTCCTAATAATGTGATCAT TGCTGGTGTTCCAGCTAAAATTGTTAAAAAATATAACTATG AGCGTATGCAATGGGAAAGAATATAGTTGTAATATCGGCT GTTAATTTTACAACCGGAGGCCCCTTTACCGTACTAAAAAA TGTGCTTACAGCAACTAAAGATAGAGCCGAATGTAAATTT ATTGCACTGGTTCATAGCTCTGCTGAACTAATGGAATTATT TCCGTGGGTTGAATTTATAGAGTATCCAGAAGTCAAGTCTT CGTGGGTTAAAAGATTATATTTCGAATATATAACTTGCAAT AGATTATCTAAGGTGATTAAGGCAACTCATTGGGTATGCTT ACATGATATTACAGCAAATGTTAGTGTACCCTATAGATTTG TTTATTGCCACAATCCTGCACCGTTCTATAAATATTTAAGCT ATCGAGATATTATAGGAGAACCTAAATTTTATCTTTTTTAT CTTTTTTATGGGCTTTTATACAATATCAATATAAAAAAGAA CACAGCAGTTTTTGTTCAGCAGCAGTGGCTAAAAAAAGAA TTCGAAAAAAAATATAAGTTAAAGAATGTTGTTGTTAGTCG CCCTGAAGATATTTGCCCTTTTGAAAGTGATGGTTTGGTAA GAAATAATAATAAAAAGGATGTGAGGATATTTTACCCAGC AGTGCCCCGTATATTTAAAAACTTTGAAGTTATCATACGTG CTGCACAAATATTACAAGATAAAAATATTCATTTTTATCTT ACTTTTGATGGTACTGAAAATAAGTATGCAAAAAGAATAT ATAAATTAGCTTCCGAACTGAAAAATGTACATTTCCTCGGT TACCTTAATGCAACCGAGATGGTTAACTTTTATCAAGATTC AGATATTATTTGTTTCCCATCGAAACTAGAAACGTGGGGAT TACCATTATCAGAAGCTAAAACATACAAAAAATGGATATT TGCGGCAGACTTACCTTATGCTCATGAAGTTTTATATAACT ATTCAAAAACTAGATATTTTCCATTTGACGATGAGAAAATA
- 66 035991
CTTGTTCGCTACATATTAGAGTACACAAGTAAAAATATGCA TGAAGATATAAAAAATAGTAGGGTGAATTTTAATAATGAT GCATTGACTGGTTTTGAACAGTTTATTGAATATATCCTCAA GGGGAACTGACGTGGTTTATATTATAATCGTTTCACATGGC CATGATGACTATATAGAAAATCTTTTATTAAATTTAAAGTT GCCCTCTGGAAGATTTAAAATAATAGTTCGTGATAACAAA AGTTCAATGGTTTTAAAAAAAACATGCGAAAAAAATTGCG TAACCTATTTGCATGGAGGGCAATATGGATTTGGACATAAT AATAACATAGCAGTGTCATATATAATTAATAACTTCATGAT TATGAATAATGATTATTTTCTCTTTCTTAACCCCGATGTATT CATAACCAGTGAAAGTTTGATTAATTATGTTGATTATATAA TTAGTAATGATTATAAGTTTAGCACATTATGTCTTTATCGA GATTTTACTAAAAGCAAACATGATTATTCAATACGGAGTTT TCCAACTTTATATGATTTTCTTTGTTCTTTTTTATTGGGGGT GAATAAAAGTAAAATTAAGAAGGAAAATATACTTTCTGAT ACTGTAGTTGATTGGTGTGCTGGCTCATTTATGCTTATTCAT GCTTTAAGTTTCTTAAATGTGAATGGTTTTGATCAAAAATA TTTTATGTATTGTGAAGATATTGACCTTTGTATGCGTTTAAA ATTAAGTGGAGTAGATCTTTACTATACTCCCCATTTTGATG CTATTCATTATGCGCAGCATGAAAATAGAAGAATATTTACT AAAGCATTTCGATGGCATATAAGGAGTATTACGCGCTACAT ATTACGGAAACCAATTCTTTCTTATAAAAACTATAGAAAAA TTACATCCGAACTGGTAAAGTGA
Детоксифицированный EPAбелок, содержащий 4 оптимизированные последовательности Nгликозилирования GSGGGDQNATGSGGGKLAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGV RSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSA1VLEGGNDALKLAIDNALS ITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHE KPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATF FVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWAS GKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPA KHDLDIKDNNNSTPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLE AFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQ VIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQ GTGNDEAGAASADVVSLTCPVAKDQNRTKGECAGPADSGDA LLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLE ERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA GDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYR TGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILG WPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYA SQPGKPPREDLKLGSGGGDQNAT 13
Консенсусная последовательность N- Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой, за исключением Pro 14
гликозилирования
Консенсусная последовательность Nгликозилирования Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты, за исключением Pro 15
Воплощения, описанные в данном документе, являются лишь иллюстративными и специалистам в данной области понятны или они могут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многочисленные эквиваленты конкретных операций, описанных в данном документе. Все такие эквиваленты считаются входящими в объем настоящего изобретения и охвачены следующей формулой изобретения.
Все ссылки (включая патентные заявки, патенты и публикации), указанные в данном описании изобретения, включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, или патент, или патентная заявка патент была конкретно и независимо указана как включенная посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей.
7. Воплощения.
1. Биоконъюгат для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащий антиген С25В Е. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген С25В Е. coli содержит структуру формулы 025В':
D-GIc β|6 β α α 1
4l ί 1.3 1.3 Jn1 α 3
L-Rha
- 67 035991 где n представляет собой целое число от 1 до 30.
2. Биоконъюгат по аспекту 1, где антиген 025b Е. coli ковалентно связан с остатком Asn в белке носителе.
3. Биоконъюгат по любому из аспектов 1-2, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (EPA) и мальтозосвязывающего белка (MBP).
4. Биоконъюгат по любому из аспектов 1-3, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
5. Биоконъюгат по любому из аспектов 2-4, где остаток Asn белка-носителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15).
6. Композиция для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащая биоконъюгат по любому из аспектов 1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Композиция для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащая биоконъюгат по любому из аспектов 1-5 и (1) биоконъюгат О1А, содержащий антиген O1A E. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, (2) биоконъюгат O2, содержащий антиген O2 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, и (3) биоконъюгат O6, содержащий антиген O6 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя.
8. Композиция по аспекту 7, где антиген О1А, антиген O6 и антиген O2 представлены следующими формулами, соответственно:
а. Формула О1А' β
— *» L-Rha
A
1,3
α β + L-Rha л n > L-Rha ——-► D-GIcNAc 1,3 1,4
D-ManNAc
б.
Формула O6Glc’ a
— D-GalNAc
1,4
1,3 р D-Man—— ί 1,4 β
D-Man--1,3
D-GIcNAc
η β| 1,2 D-GIc
Формула 02’
в.
|ha 1.2 L-Rhanj
L-Rha----► D-GIcNAc
1,4
η
D-Fuc3NAc
9. Композиция по любому из аспектов 7 или 8, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (EPA) и мальтозосвязывающего белка (МБР).
10. Композиция по любому из аспектов 7-9, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
11. Композиция по любому из аспектов 7-10, где остаток Asn белка-носителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO:15).
12. Способ вакцинации субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по любому из аспектов 1-11.
13. Способ индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по любому из аспектов 1-11.
14. Способ индукции образования опсонофагоцитирующих антител у субъекта, которые являются специфичными к внекишечным патогенным Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по любому из аспектов 1-11.
15. Способ по любому из аспектов 12-14, где субъект имеет риск развития инфекции мочевыводящих путей, бактериемии или сепсиса.
16. Способ по любому из аспектов 12-15, где субъект представляет собой человека.
17. Рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин для продуцирования биоконъюгата по аспекту 1, содержащая:
а) нуклеотидную последовательность, кодирующую:
1) dTDP-глюкозо-4,6-дегидратазу;
- 68 035991
2) 0Т1)1%?-дезокси-О-гл1Окозо-3,5-Э11имеразу;
3) глюкозо-1 -фосфат-тимидилилтрансферазу;
4) dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу;
5) О-антиген-флиппазу;
6) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP в-1,6-гликозилтрансферазу;
8) О-антиген-полимеразу;
9) О-ацетилтрансферазу;
10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и
11) dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
б) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу и
в) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты, за исключением Pro (SEQ ID NO :15).
18. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по аспекту 17, где по меньшей мере один из генов waaL, gtrA, gtrB, gtrS или кластера rfb удален или функционально инактивирован в геноме клеткихозяина.
19. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по аспекту 17 или 18, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (ЕРА) и мальтозосвязывающего белка (МБР).
20. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по любому из аспектов 17-19, где клеткахозяин представляет собой клетку-хозяина is. coli.
21. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по любому из аспектов 17-20, где белокноситель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
22. Способ получения биоконъюгата антигена 025В Е. coli, ковалентно связанного с белкомносителем, включающий:
а) культивирование клетки-хозяина по любому из аспектов 17-21 и
б) очистку N-гликозилированного белка-носителя, содержащего антиген 025В Е. coli.

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Биоконъюгат для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащий антиген 025В Е. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген 025В Е. coli содержит структуру формулы 025В'
    D-GIc β|θ β α α
    --► D-GIc----► L-Rha2Ac л п ► D-GIcNAc---► 4 А 1,3 1,3 n1 α 3
    L-Rha где n представляет собой целое число от 1 до 30. 2. Биоконъюгат по п.1, где антиген 025В Е. coli ковалентно связан с остатком Asn в белке-носителе. 3. Биоконъюгат по любому из пп.1-2, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (EPA) и мальтозосвязывающего белка (МВР).
    4. Биоконъюгат по любому из пп.1-3, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
    5. Биоконъюгат по любому из пп.2-4, где остаток Asn белка-носителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15).
    6. Композиция для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащая биоконъюгат по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.
    7. Композиция для индукции иммунного ответа против Е. coli, содержащая биоконъюгат по любому из пп.1-5 и (1) биоконъюгат 01А, содержащий антиген 01А Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, (2) биоконъюгат 02, содержащий антиген 02 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, и (3) биоконъюгат 06, содержащий антиген 06 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя.
    8. Композиция по п.7, где антиген 01А, антиген 06 и антиген 02 представлены следующими формулами, соответственно:
    а) формула 01А'
    - 69 035991
    β 2
    GIcNAc
    D-ManNAc
    б) формула O6Glc' α α β — -► D-Gal Ν Ac---► D-Man —►
    1’4[ 1>3 1-4 β 1,2 β
    D-Man--1,3
    D-GIcNAc
    в) формула O2'
    D-GIc
    9. Композиция по любому из пп.7 или 8, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (EPA) и мальтозосвязывающего белка (МБР).
    10. Композиция по любому из пп.7-9, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
    11. Композиция по любому из пп.7-10, где остаток Asn белка-носителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15).
    12. Способ вакцинации субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по любому из пп.1-11.
    13. Способ индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по любому из пп.1-11.
    14. Способ индукции образования опсонофагоцитирующих антител у субъекта, которые являются специфичными к внекишечным патогенным Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества биоконъюгата или композиции по любому из пп.1-11.
    15. Способ по любому из пп.12-14, где субъект имеет риск развития инфекции мочевыводящих путей, бактериемии или сепсиса.
    16. Способ по любому из пп.12-15, где субъект представляет собой человека.
    17. Рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин для продуцирования биоконъюгата по п.1, содержащая:
    а) нуклеотидную последовательность, кодирующую:
    1) dTDP-глюкозо-4,6-дегидратазу;
  2. 2) dTDP-6-дезокси-D-глюкозо-3,5-эпимеразу;
  3. 3) глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансферазу;
  4. 4) dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу;
  5. 5) О-антигенфлиппазу;
  6. 6) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
  7. 7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP в-1,6-гликозилтрансферазу;
  8. 8) О-антигенполимеразу;
  9. 9) О-ацетилтрансферазу;
  10. 10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и
  11. 11) dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
    б) нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарилтрансферазу и
    в) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты, за исключением Pro (SEQ ID NO:15).
    18. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по п.17, где по меньшей мере один из генов waaL, gtrA, gtrB, gtrS или кластера rfb удален или функционально инактивирован в геноме клеткихозяина.
    19. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по п.17 или 18, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из Р. aeruginosa (ЕРА) и мальтозосвязывающего белка (МВР).
    20. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по любому из пп. 17-19, где клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Е. coli.
    - 70 035991
    21. Рекомбинантно сконструированная клетка-хозяин по любому из пп.17-20, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
    22. Способ получения биоконъюгата антигена 025b Е. coli, ковалентно связанного с белкомносителем, включающий:
    а) культивирование клетки-хозяина по любому из пп.17-21 и
    б) очистку N-гликозилированного белка-носителя, содержащего антиген 025В Е. coli.
EA201691478A 2014-02-24 2015-02-23 Новый полисахарид и его применения EA035991B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461943710P 2014-02-24 2014-02-24
PCT/EP2015/053739 WO2015124769A1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 Novel polysaccharide and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201691478A1 EA201691478A1 (ru) 2017-02-28
EA035991B1 true EA035991B1 (ru) 2020-09-10
EA035991B9 EA035991B9 (ru) 2020-10-21

Family

ID=52589386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691478A EA035991B9 (ru) 2014-02-24 2015-02-23 Новый полисахарид и его применения

Country Status (25)

Country Link
US (5) US9700612B2 (ru)
EP (1) EP3110441B1 (ru)
JP (2) JP6276427B2 (ru)
KR (1) KR101855142B1 (ru)
CN (1) CN106535927B (ru)
AR (1) AR100859A1 (ru)
AU (1) AU2015220723C1 (ru)
CA (1) CA2940547C (ru)
CL (1) CL2016002123A1 (ru)
DK (1) DK3110441T3 (ru)
EA (1) EA035991B9 (ru)
FI (1) FI3110441T3 (ru)
HU (1) HUE066507T2 (ru)
IL (1) IL247344B (ru)
LT (1) LT3110441T (ru)
MX (1) MX2016011055A (ru)
NZ (1) NZ723328A (ru)
PH (1) PH12016501671A1 (ru)
PL (1) PL3110441T3 (ru)
PT (1) PT3110441T (ru)
RS (1) RS65631B1 (ru)
SG (1) SG11201606889PA (ru)
SI (1) SI3110441T1 (ru)
TW (1) TWI639439B (ru)
WO (1) WO2015124769A1 (ru)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2945651B1 (en) 2013-01-17 2018-03-07 ARSANIS Biosciences GmbH Mdr e. coli specific antibody
PT3110441T (pt) 2014-02-24 2024-05-03 Glycovaxyn Ag Novo polissacárido e suas utilizações
WO2016183501A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 University Of Washington Compositions and methods for treatment and prevention of uropathogenic e. coli infection
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711637D0 (en) * 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
WO2019175145A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against urinary tract infections
CN108531439B (zh) * 2018-04-16 2020-04-07 南京工业大学 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN113950524A (zh) * 2019-03-18 2022-01-18 杨森制药公司 生产大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物的方法、其组合物及其使用方法
WO2020191082A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
CN110018253A (zh) * 2019-04-15 2019-07-16 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种生物制品中游离蛋白含量的高效液相测定方法
CN111855826B (zh) * 2019-04-24 2022-09-16 岛津企业管理（中国）有限公司 破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法
GB201908528D0 (en) * 2019-06-13 2019-07-31 Univ Dundee Rhamnose-polysaccharides
CA3168108A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutant, compositions therewith and use thereof
MX2022016587A (es) 2020-06-18 2023-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bioconjugado tetravalente de shigella (shigella4v).
CN115996749A (zh) 2020-06-25 2023-04-21 葛兰素史克生物有限公司 经修饰的外毒素a蛋白
JP7481585B2 (ja) * 2020-09-17 2024-05-10 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 多価ワクチン組成物及びその使用
IL301880A (en) * 2020-11-30 2023-06-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Analytical method for glycoconjugation using a capillary-based immunoassay system
CA3207841A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 Janssen Pharmaceuticals, Inc Fimh mutants, compositions therewith and use thereof
WO2022178020A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 Duke University Vaccine compositions and methods for the treatment and prevention of urinary tract infections
JP2024514074A (ja) 2021-04-01 2024-03-28 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド Ｅ．ｃｏｌｉ ｏ１８バイオコンジュゲートの産生
WO2022214620A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Process for bioconjugate production
WO2023118033A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
US12014256B2 (en) * 2022-01-12 2024-06-18 Dell Products L.P Polysaccharide archival storage
CN114150005B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
WO2024123667A1 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugate compositions and process for bioconjugate production
GB202302579D0 (en) 2023-02-23 2023-04-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104074A2 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
WO2013034664A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
WO2014111516A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-24 Arsanis Biosciences Gmbh Mdr e. coli specific antibody

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700612A (en) 1971-06-23 1972-10-24 Tenneco Chem Aqueous surface-coating compositions containing hydroxyalkyl ethers of galactomannan gums as thickeners
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5370872A (en) 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
PT1481057E (pt) 2002-03-07 2006-05-31 Eidgenoess Tech Hochschule Sistema e metodo para a producao de proteinas glicosiladas recombinantes num hospedeiro procariota
AU2006245969B8 (en) 2005-05-11 2011-08-25 Eth Zurich Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells
ATE539079T1 (de) 2006-03-23 2012-01-15 Novartis Ag Imidazochinoxalinverbindungen als immunmodulatoren
ES2388556T3 (es) 2006-03-23 2012-10-16 Novartis Ag Compuestos inmunopotenciadores
WO2009089396A2 (en) 2008-01-08 2009-07-16 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
CN102724997B (zh) 2009-11-19 2016-09-21 格林考瓦因有限公司 在原核细胞中产生免疫原性多糖的生物合成系统
AU2011338723A1 (en) 2010-12-10 2013-05-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel formulations which mitigate agitation-induced aggregation of immunogenic compositions
US9932598B2 (en) 2012-08-02 2018-04-03 The Regents Of The University Of California Metabolic engineering of microbial organisms
JP2015529214A (ja) 2012-09-10 2015-10-05 グリコヴァキシン アーゲー 修飾された抗原を含むバイオコンジュゲート及びその使用
JP6329554B2 (ja) 2012-10-12 2018-05-23 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 宿主細胞改変方法
EP2938363B1 (en) 2012-12-27 2019-08-21 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods and compositions relating to crm197
ES2778074T3 (es) 2013-10-11 2020-08-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de modificación de células hospedadoras
CN106536551B (zh) 2014-02-06 2021-04-16 X4制药(奥地利)有限责任公司 大肠杆菌特异性抗体序列
PT3110441T (pt) 2014-02-24 2024-05-03 Glycovaxyn Ag Novo polissacárido e suas utilizações
WO2016107819A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 Glycovaxyn Ag Compositions and methods for protein glycosylation
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
WO2020191082A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
CN113950524A (zh) 2019-03-18 2022-01-18 杨森制药公司 生产大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物的方法、其组合物及其使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104074A2 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
WO2013034664A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
WO2014111516A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-24 Arsanis Biosciences Gmbh Mdr e. coli specific antibody

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. A. ROGERS, H. E. SIDJABAT, D. L. PATERSON: "Escherichia coli O25b-ST131: a pandemic, multiresistant, community-associated strain", JOURNAL OF ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY, OXFORD UNIVERSITY PRESS, vol. 66, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 1 - 14, XP055056619, ISSN: 03057453, DOI: 10.1093/jac/dkq415 *
ROLAND STENUTZ, ANDREJ WEINTRAUB & GORAN WIDMALM: "The structures ofEscherichia coli O-polysaccharide antigens", FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS, ELSEVIER, AMSTERDAM; NL, vol. 30, 1 January 2006 (2006-01-01), AMSTERDAM; NL, pages 382 - 403, XP007921666, ISSN: 0168-6445, DOI: 10.1111/j.1574-6976.2006.00016.x *
V. SZIJARTO, J. LUKASIEWICZ, T. K. GOZDZIEWICZ, Z. MAGYARICS, E. NAGY, G. NAGY: "Diagnostic Potential of Monoclonal Antibodies Specific to the Unique O-Antigen of Multidrug-Resistant Epidemic Escherichia coli Clone ST131-O25b:H4", CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, vol. 21, no. 7, 1 July 2014 (2014-07-01), pages 930 - 939, XP055179667, ISSN: 15566811, DOI: 10.1128/CVI.00685-13 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK3110441T3 (da) 2024-05-06
NZ723328A (en) 2018-01-26
PL3110441T3 (pl) 2024-08-05
EA201691478A1 (ru) 2017-02-28
JP2017507178A (ja) 2017-03-16
TW201615211A (zh) 2016-05-01
BR112016019341A2 (pt) 2018-01-16
CA2940547A1 (en) 2015-08-27
SI3110441T1 (sl) 2024-07-31
TWI639439B (zh) 2018-11-01
WO2015124769A1 (en) 2015-08-27
AR100859A1 (es) 2016-11-09
EP3110441B1 (en) 2024-04-03
AU2015220723C1 (en) 2018-04-05
EP3110441A1 (en) 2017-01-04
PH12016501671B1 (en) 2016-10-03
US20200129605A1 (en) 2020-04-30
US11738076B2 (en) 2023-08-29
HUE066507T2 (hu) 2024-08-28
JP6276427B2 (ja) 2018-02-07
US20170340718A1 (en) 2017-11-30
MX2016011055A (es) 2017-10-24
CL2016002123A1 (es) 2018-02-16
CN106535927B (zh) 2019-09-20
US20230364214A1 (en) 2023-11-16
US20150238588A1 (en) 2015-08-27
US10940192B2 (en) 2021-03-09
IL247344B (en) 2020-06-30
FI3110441T3 (fi) 2024-05-06
US20210154286A1 (en) 2021-05-27
RS65631B1 (sr) 2024-07-31
AU2015220723A1 (en) 2016-09-22
EA035991B9 (ru) 2020-10-21
PH12016501671A1 (en) 2016-10-03
US9700612B2 (en) 2017-07-11
LT3110441T (lt) 2024-04-25
PT3110441T (pt) 2024-05-03
JP6771499B2 (ja) 2020-10-21
IL247344A0 (en) 2016-11-30
JP2018087197A (ja) 2018-06-07
AU2015220723B2 (en) 2017-12-14
CA2940547C (en) 2021-01-05
US10441647B2 (en) 2019-10-15
KR101855142B1 (ko) 2018-05-08
SG11201606889PA (en) 2016-09-29
CN106535927A (zh) 2017-03-22
KR20160125494A (ko) 2016-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11738076B2 (en) Polysaccharide and uses thereof
JP7370391B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲート、その製造方法およびその使用方法
EP3942028B9 (en) Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof
BR112016023688B1 (pt) Bioconjugado e uso de um bioconjugado
BR112016019341B1 (pt) Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada
EA046206B1 (ru) Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения
EA046636B1 (ru) Способы получения биоконъюгатов полисахаридных о-антигенов e. coli, их композиции и способы их применения

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent