CN117098550A - 生物缀合物生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生产纯化的O‑多糖‑胞外蛋白A(O‑EPA)生物缀合物的方法。特别地，所述方法包括纯化所述生物缀合物，其包括第一阴离子交换色谱法，随后是羟基磷灰石色谱法，随后是疏水相互作用色谱法，以及随后的第二阴离子交换色谱法的步骤。

Description

生物缀合物生产方法
本发明涉及一种用于生产纯化的O-多糖-胞外蛋白A(O-EPA)生物缀合物的方法。特别地，所述方法包括纯化所述生物缀合物，包括以下步骤：第一阴离子交换色谱法，随后是羟基磷灰石色谱法，随后是疏水相互作用色谱法，以及随后的第二阴离子交换色谱法。
监管机构对生物制药商提供高纯度的基于糖缀合物的药物施加的压力越来越大。然而，复杂糖缀合物(诸如包含与载体蛋白共价连接的O-多糖的生物缀合物)的纯化是一项具有挑战性的任务。此类生物缀合物是糖缀合物疫苗组合物的关键组分，所述糖缀合物疫苗组合物诸如目前正在开发的用于预防由“肠外病原性大肠杆菌(ExPEC)”菌株引起的感染性疾病的多价疫苗组合物[Poolman和Wacker,J.Infect.Dis.(2016)v.213(1):6-13]。
此类生物缀合物通常可以通过在原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)中使用例如PglB寡糖基转移酶系统将O-多糖(O-PS)组分酶促缀合至载体蛋白来产生[参见例如WO 2015/124769；WO 2020/191082；Poolman和Wacker,J.Infect.Dis.(2016)v.213(1),第6-13页和其中的参考文献]。在这种方法中，O-PS组分与载体蛋白的偶联在周质空间(即，在革兰氏阴性细菌(诸如大肠杆菌)的细胞质内膜与外膜之间的空间)内发生。
包括纯化此类生物缀合物的生产本身是已知的。然而，可以改进先前描述的方法，特别是相应的纯化步骤(尽管给出可接受的纯度并且适合相对较小的规模)，目的是有效大规模制造此类生物缀合物(例如，在体积为至少100L至20,000L的生物反应器中培养宿主细胞培养物)，这将需要以经济上可行的方式获得用于对大量人进行疫苗接种的足够量的安全产物，即具有可接受的总产率和非常高纯度的最终产物。每个纯化步骤将需要经选择、特异性地组合、并且随后优化以产生适合作为糖缀合物疫苗、特别是多价ExPEC疫苗的组分的生物缀合物。此类生物缀合物必须以高纯度提供并且以商业规模，例如在体积在100L与20,000L之间的生物反应器中制造。鉴于所有可以变化的因素，寻找用于生产针对ExPEC的糖缀合物疫苗的最佳条件受到挑战，并且纯化步骤的选择以及相应步骤的顺序是先验不可预测的，其更加适用于以商业规模以非常高的纯度和良好的产率生产各种不同的糖缀合物的完整方法。
Burckhardt等人[Vaccine(2019),37(38):5762-5769]描述了由全细胞裂解物生产非缀合的EPA载体蛋白的纯化方法。所述纯化方法的目的是与先前对于所述EPA载体蛋白使用的纯化方法相比，降低宿主细胞蛋白(HCP)含量。所述方法包括阴离子交换色谱法步骤(AEX；Capto Q树脂)，随后在两种混合模式树脂(MEP HyperCell和随后的羟基磷灰石树脂)上纯化，而不是先前使用的疏水相互作用色谱法步骤(HIC；苯基琼脂糖凝胶树脂)与第二AEX步骤(AEX2，Q琼脂糖凝胶树脂)和尺寸排阻色谱法组合[SEC；Qian等人,Vaccine(2007),25(20):3923-3933]。然而，纯化方法的底物(即，非缀合的EPA载体蛋白)与EPA缀合物(诸如O-EPA生物缀合物(例如，对于本发明关注的O-EPA缀合物，实际最相关的活性部分是O-抗原多糖，当用于疫苗组合物中时，其旨在产生血清型特异性免疫应答))显著不同。此外，用作所述纯化方法的起始材料的全细胞裂解物不同于周质级分，诸如用于纯化O-EPA生物缀合物的渗透休克级分。因此，这种方法要解决的问题不适用于本文所述的本发明生产方法的目的，因为底物和从中纯化它的基质两者是不同的。
Ravenscroft等人[Glycobiology(2016),26(1):51-62]使用上述PglB缀合系统生产包含EPA载体蛋白和痢疾志贺氏菌1型(Sd1)O-多糖(O-PS)的糖缀合物。分离Sd1 O-EPA缀合物包括通过渗透休克从周质空间中提取和使用AEX和SEC的组合纯化。更详细地：在第一步骤中，在Source 15Q树脂上纯化渗透休克级分，即第一AEX步骤(AEX1)。含Sd1 O-EPA的级分通过SDS PAGE鉴定，汇集，浓缩，并在通过切向流过滤(TFF)进行缓冲液交换后，重新施加在Source 15Q树脂(AEX2)上。作为第三步骤，在Superdex 200柱上通过SEC纯化O-EPA缀合物。然而，尽管所述纯化方法适合于小规模至中等规模生产生物缀合物，即在含有高达50L孵育培养基的生物反应器中孵育宿主细胞培养物，但是它需要以经济上可行的方式进一步改进用于大规模生产，例如在含有至少100L且高达20,000L、例如150L至5000L的孵育培养基的生物反应器中孵育宿主细胞培养物，尤其是如果产品旨在是需要适合作为药物组分的各种糖缀合物的混合物，即可以安全地注射到哺乳动物，特别是人类。
Van den Dobbelsteen等人[Vaccine(2016),34:4152-4160]描述了研究四价大肠杆菌O-抗原生物缀合物疫苗在动物模型中的免疫原性和安全性的研究。通过在10L工作体积生物反应器中孵育宿主细胞培养物来生产用于获得生物缀合物的生物质。为了在兔和小鼠中进行研究，通过渗透休克从周质释放生物缀合物，并且经两个阴离子交换色谱法步骤纯化。
为了在大鼠中进行研究，使用高压均化释放生物缀合物，并且使用在阴离子交换色谱法柱上进行的预纯化步骤、在阴离子交换色谱法柱上进行的捕获步骤、疏水相互作用色谱法步骤、在阴离子交换色谱法柱上进行的精制步骤和在尺寸排阻色谱法柱上进行的最终精制步骤纯化。
WO 2017/067964描述了PcrV作为来自铜绿假单胞菌的新载体蛋白的用途，以及包含与PcrV载体蛋白共价连接的抗原的缀合物。描述了使用金属螯合物亲和色谱法(IMAC)、AEX和SEC纯化EPA-O6生物缀合物。
WO2009/104074描述了O-EPA生物缀合物、特别是志贺氏菌O1-EPA生物缀合物的生产方法。具体地，在2L生物反应器中培养大肠杆菌宿主细胞，所述大肠杆菌宿主细胞包含编码PglB、EPA和用于生物合成志贺氏菌O1多糖的酶的遗传信息。通过渗透休克提取周质蛋白，并从来自100,000OD细胞的周质级分中纯化O1-EPA生物缀合物。通过两个连续的AEX步骤(AEX1和AEX2；Source Q树脂)，随后SEC(Superdex 200Hi Load 26/60树脂)进行纯化。在一个额外的实施方案中，使用AEX和氟磷灰石色谱法的组合纯化志贺氏菌O1-EPA生物缀合物。此外，尽管适用于小规模至中等规模的生产方法(例如，在体积高达50L的生物反应器中)，但是可以改进所述纯化程序以可再现地大规模制造O-EPA生物缀合物，目的是获得用于对大量人进行疫苗接种的安全产品。
WO 2017/035181描述了含有大肠杆菌多糖抗原025B、O1A、02和06A的缀合物的多价疫苗，每种抗原与EPA载体蛋白共价结合，以及所述疫苗提供针对ExPEC感染的免疫保护的用途。使用两个连续的AEX步骤和SEC步骤纯化缀合物。
WO 2014/057109描述了将核酸序列插入宿主细胞中并在生物反应器中以10L规模生产糖缀合物疫苗候选物的方法。使用第一AEX步骤、第二AEX步骤和SEC纯化缀合物。
WO 2015/124769描述了用于开发四价ExPEC疫苗的生物缀合物的生产方法，所述生物缀合物包含具有特别是2或4个糖基化位点的EPA载体蛋白和对应于大肠杆菌O-抗原、特别是O25A或O25B的PS组分。通过两个连续的AEX步骤，随后通过SEC纯化从50L培养基中产生的生物缀合物。在另一个实例中，从2L培养基中获得的生物缀合物通过IMAC纯化。此外，尽管适合从高达50L培养基中纯化生物缀合物，如例如临床前实验所需的，但是所述生产方法需要进一步改进，以大规模制造高纯度的O-EPA生物缀合物，如以商业规模提供多价ExPEC疫苗所需的。
尽管先前描述的方法适合小规模至中等规模生产(例如，在体积高达50L的生物反应器中)，但需要用于生产生物缀合物、特别是大肠杆菌O-抗原-EPA缀合物的改进方法，其适于大规模制造。
因此，本发明的目的是减轻现有技术的这种缺点并提供这种方法。
特别地，本发明的目的是提供一种适合在生物反应器中大规模生产生物缀合物的方法，所述生物反应器诸如体积为100L至20,000L，例如体积在150L与5000L之间的生物反应器。
此外，本发明的目的是提供一种用于生产生物缀合物的方法，其需要最少的纯化步骤以便允许成本有效地生产此类生物缀合物。
此外，本发明的目的是提供一种用于生产生物缀合物的方法，所述生物缀合物可以适合满足不同应用的纯度要求，诸如用于兽医领域中或人类中的应用。
上述目的中的一个或多个通过如权利要求1中定义的用于生产生物缀合物的方法来实现。本发明的其他方面在说明书和独立权利要求中公开，优选的实施方案在说明书和从属权利要求中公开。
下文中将更详细地描述本发明。应当理解，本说明书中提供/公开的各种实施方案、优选和范围可以任意组合。此外，取决于具体的实施方案，所选的定义、实施方案或范围可能不适用。
除非另有说明，否则以下定义将适用于本说明书：
除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则如本文所用，在本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“所述”和类似术语应解释为涵盖单数和复数两者。
如本文所用，术语“包括”、“含有”和“包含”在本文中以其开放的非限制性意义使用。应当理解，各种实施方案、优选和范围可以任意组合。
如本文所用，术语“约”当与数字结合使用时是指在所提及的数字的±1％、±5％或±10％内的任何数字。
贯穿本说明书，使用了许多缩写，包括：
AEX1 第一阴离子交换色谱法
AEX2 第二阴离子交换色谱法
cHA陶瓷羟基磷灰石
CV柱体积
EPA铜绿假单胞菌的胞外蛋白A(也称为外毒素A)
FPF过滤的周质宿主细胞级分
HA羟基磷灰石
HCP宿主细胞蛋白
HIC 疏水相互作用色谱法
HPLC 高效液相色谱法
IMAC 固定金属亲和色谱法
O-EPA与细菌O-抗原多糖共价偶联的EPA载体蛋白的糖缀合物
SEC尺寸排阻色谱法
SE-HPLC尺寸排阻-高效液相色谱法
TFF切向流过滤
WFI注射用水
术语“糖缀合物”是本领域已知的，并且特别描述了与一种或多种多糖共价结合的化学实体。此类糖缀合物可以通过活细胞中的生物缀合获得(“生物缀合物(bioconjugate)”或“生物缀合物(biological conjugate)”)，或者可以通过多糖的化学缀合获得(“化学”或“合成”糖缀合物)。特别合适的化学实体是蛋白质，相应的糖缀合物是糖蛋白。具体地，术语糖缀合物涉及其中多糖(即，聚糖)与载体蛋白共价偶联的缀合产物。
术语糖蛋白包括“传统糖蛋白”和“糖缀合物疫苗”。在传统糖蛋白中，重点是蛋白质部分，例如对于抗体或促红细胞生成素，其中“活性”成分更多地存在于蛋白质部分中，并且聚糖例如在半衰期或限定其他特性中起作用。发现这些传统糖蛋白广泛用于药物应用。在糖缀合物疫苗中，重点是聚糖部分，对其的免疫应答是期望的，因为聚糖是相关抗原，并且蛋白质部分仅充当载体以导致所需的T细胞记忆免疫应答。
术语“多糖”是本领域已知的，并且特别描述了由通过糖苷连接(直链或支链)结合在一起的单糖单元构成的聚合碳水化合物。此类多糖的特征在于它们的重复单元，每个重复单元以其相应单糖组成来描述。所述重复单元包括一种或多种单糖，其也可以经化学修饰(例如，酰胺化、磺化、乙酰化、磷酸化等)。在所述重复单元中典型发现的单糖是含有三至七个碳原子的环状或直链单糖。在糖缀合物疫苗的特定情况下，缀合多糖来源于具有由特定病原体的遗传学定义的所述重复单元的病原物种(例如，大肠杆菌)。因此，重复单元可以是病原体的特定标记物/鉴定子。
术语“多糖组分”因此表示糖缀合物的一个或多个聚糖链。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但典型地含有至少三个糖，并且可以是线性或分支的。聚糖可以包括天然糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、2'-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6'-磺基N-乙酰葡糖胺等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖糖缀合物(例如，糖蛋白、糖肽)的聚糖组分。
如本文所用的术语“O-乙酰化多糖”是指重复单元的一个或多个单糖通过乙酰化而化学修饰的多糖。所述单糖的一个或多个存在的羟基被乙酰化。对于糖缀合物疫苗中使用的病原体源性重复单元，某些单糖的O-乙酰化对于诱导针对所述病原体的免疫应答可能是必需的。病原体源性多糖组分的实例示于表1中。
术语“聚糖”/“聚糖链”是如下定义的“多糖”的同义词。相应地，在本发明的上下文中，“聚糖”和前缀“糖-”也指糖缀合物如糖蛋白的碳水化合物部分。
如本文所用的术语“血清型”是指具有衍生自不同细菌血清型的不同多糖链的糖缀合物。来自许多大肠杆菌血清型的聚糖的实例在下表1中鉴定。
如本文所用的术语“调节负载”是指将过程中间物的负载调节至适合于将所述过程中间物应用于色谱法树脂上以进一步纯化的条件，所述过程中间物例如在第一、第二或第三纯化步骤之后包含O-EPA缀合物的宿主细胞的周质级分或包含O-EPA的级分。除非另有说明或明确与上下文相矛盾，否则“调节负载”是指将负载的电导率调节至适合于以下纯化步骤的目标电导率并将负载的pH调节至适合于以下纯化步骤的目标pH。此外，“调节负载”包括调节过程中间物的浓度，即，减少加工体积，特别是通过TFF。
术语“树脂”和“介质”在本文中同义使用，并且涉及用于从杂质中分离一种或多种目标蛋白(即O-EPA生物缀合物)的色谱法树脂或色谱法介质。
可用于本发明的树脂可以是以不同形式，例如作为珠粒、过滤器(膜)、柱筒等，根据本发明，所有这些都被认为是“树脂”。在某些实施方案中，树脂是以可以用于柱中的珠粒的形式。在某些实施方案中，树脂是以具有官能团的膜的形式。在某些实施方案中，树脂是以可直接使用的柱筒的形式。可以根据本发明使用的树脂可以从供应商(例如Cytiva(以前的GEHealthcare)、Bio-Rad和/或其他)商购获得。
如本文所用的术语“药物物质”是指单独生物缀合物(例如与EPA载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O-抗原多糖，例如与EPA共价偶联的大肠杆菌O25B O-抗原)的散装产物，其浓度高于最终施用于有需要的受试者的产品。药物物质可以在纯化生物缀合物之后产生。例如，药物物质可以以更浓缩的形式储存在合适的制剂缓冲液中(参见例如WO 2018/077853)，例如在冷冻条件下，例如在-70℃下。
如本文所用的术语“药物产品”是指生物缀合物(特别是单独与EPA载体蛋白偶联的大肠杆菌O-抗原多糖)的制剂，其为用于施用于有需要的受试者的最终形式。如本文所用，术语“药物产品”特别涉及多价疫苗组合物，例如包含大肠杆菌O-抗原多糖O25B、O1A、O2和O6A的四价ExPEC糖缀合物疫苗组合物，所述大肠杆菌O-抗原多糖各自单独与EPA载体蛋白偶联。多价糖缀合物疫苗组合物的其他非限制性实例是例如包含大肠杆菌O-抗原多糖O1A、O2、O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B和O75的九价糖缀合物疫苗组合物，和例如包含大肠杆菌O-抗原多糖O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75的十价糖缀合物疫苗组合物，各大肠杆菌O-抗原多糖单独与EPA载体蛋白偶联。药物产品典型地可以通过混合相应糖缀合物的药物物质来制备，并且如果需要的话，通过合适的配制缓冲液稀释(参见例如WO2018/077853)，从而产生目标剂量的疫苗。
将通过参考附图来更好地理解本发明。
图1：AEX1洗脱物的级分通过SDS-PAGE和考马斯染色分析。凝胶从左到右显示：分子量标记物(1)，来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(2)，参考批次的相同过程阶段的负载材料(3)，负载(4)，流过物(5)，洗液(6)，级分1(7)，级分2(8)，级分3(9)，级分4(10)。大部分O-EPA生物缀合物在级分1和2(泳道7和8)中洗脱，而在级分3和4(泳道9和10)中，杂质的相对量增加。
图2：cHA洗脱物的级分通过SDS-PAGE和考马斯染色分析。A)凝胶1从左到右显示：分子量标记物(1)，来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(2)，参考批次的相同过程阶段的负载材料(3)，负载(4)，流过物(5)，洗液(6)，级分1-3(7)，级分4(8)，级分5(9)，级分6(10)。B)凝胶2从左到右显示：来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(11)，分子量标记物(12)，级分7(13)，级分8(14)，级分9(15)，级分10(16)，级分11(17)，级分12-14(18)。从级分7(13)开始，可见O-EPA生物缀合物的洗脱。从级分11开始，O-EPA生物缀合物的量减少，而产物仍然可见，但是量递减，杂质更丰富。
图3：HIC洗脱物的级分通过SDS-PAGE和考马斯染色分析。凝胶从左到右显示：分子量标记物(1)，来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(2)，参考批次的相同过程阶段的负载材料(3)，负载(4)，流过物(5)，洗液(6)，级分1(7)，级分2(8)，级分3(9)，级分4(10)。
图4：AEX2洗脱物的级分通过SDS-PAGE和考马斯染色分析。A)凝胶1从左到右显示：分子量标记物(1)，来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(2)，参考批次的相同过程阶段的负载材料(3)，负载(4)，流过物(5)，洗液(6)，空(7)，级分1(8)，级分2(9)，级分3(10)。B)凝胶2从左到右显示：来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(11)，分子量标记物(12)，级分4(13)，级分5(14)，级分6(15)，级分7(16)，级分8(17)，级分9(18)，级分10(19)，级分11(20)。C)凝胶3从左到右显示：分子量标记物(21)，来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(22)，级分12(23)，级分13(24)，级分14(25)，级分15(26)，级分16(27)，级分17(28)，级分18(29)，分子量标记物(30)。D)凝胶4从左到右显示：来自参考批次的纯化O25B-EPA生物缀合物的标准物(31)，分子量标记物(32)，级分19(33)，级分20(34)，反萃取物(35)，空泳道(36-39)，来自参考批次的纯化O25B-EPO生物缀合物的标准物(40)。在级分1-4中，主要是转醛醇酶(杂质)以递减的量洗脱。从级分5开始，O25B-EPA生物缀合物是可见的，从级分6开始具有高强度。
图5：在整个生产过程中如通过SE-HPLC测量的糖基化EPA的纯度。在捕获AEX(1)、cHA(2)、HIC(3)和精制AEX(4)步骤之后测量的中间体。在本实施例最后的纯度是99.7％。通常，在HIC之后，可以达到在92％-100％之间的纯度，精制AEX之后，可以达到在93％-100％之间的纯度。
更一般地说，在第一方面，本发明涉及一种用于生产纯化的O-多糖-胞外蛋白A载体(O-EPA)缀合物的方法。所述方法包括提供从原核宿主细胞获得的作为生物缀合物的O-EPA缀合物，以及包括几个色谱法步骤(本文描述为步骤b至e)的纯化。这将在下面更详细地解释。
在第一步骤中，O-EPA生物缀合物作为表达所述生物缀合物的原核宿主细胞的周质级分提供(步骤a)。
在第二步骤中，O-EPA生物缀合物通过第一阴离子交换色谱法(AEX1；步骤b)纯化。特别地，AEX1步骤是捕获步骤。在某些实施方案中，AEX1用强阴离子交换树脂进行。在某些实施方案中，所述树脂是陶瓷树脂，例如具有刚性、不可压缩的特性，并且在高流速下具有高动态结合能力。特别适合AEX1步骤的树脂的非限制性实例是Q Ceramic HyperD F树脂。在优选的实施方案中，AEX1-步骤以结合-洗脱模式进行。
在第三步骤中，O-EPA缀合物通过羟基磷灰石(HA)色谱法(步骤c)进一步纯化。在优选的实施方案中，HA包括陶瓷羟基磷灰石(cHA)。陶瓷HA是球形陶瓷形式的结晶羟基磷灰石并且这种形式允许其以高流速用于生产规模的柱中，同时保持其独特的分离特性。HA色谱法有时被描述为混合模式(或多模式)形式的色谱法。在优选的实施方案中，HA(特别是cHA)色谱法以结合-洗脱模式进行。第三步骤在第二步骤之后进行。
在优选的实施方案中，O-EPA缀合物在第四步骤中通过疏水相互作用色谱法(HIC；步骤d)进一步纯化，并且在第五步骤中通过第二阴离子交换色谱法(AEX2；步骤e)进一步纯化。这个实施方案是最优选的，并且在实施例1中概述。这个实施方案与下面指出的其他实施方案相比，用较少的色谱法步骤给出最高纯度的O-EPA缀合物，同时仍然足够有效，因为总产率对于大规模制备生物缀合物的药物制剂的方法是可接受的(例如，自至少150L的生物反应器，总产率至少5％，优选总产率至少10％，例如总产率约5％-30％[相对于存在于过滤的周质级分中的O-EPA缀合物]，纯度为至少95％)。
在某些实施方案中，HIC步骤使用疏水相互作用介质进行。可以用于本发明的HIC的疏水相互作用介质是SartobindPhenyl吸收剂。
在某些实施方案中，AEX2步骤使用强阴离子交换树脂进行。可以用于本发明的AEX2的阴离子交换介质的非限制性实例是Source Q树脂。
优选地，本发明方法不包括SEC步骤。尽管SEC可以方便地用于小规模至中等规模的生产过程(即在含有高达50L孵育培养基的生物反应器中孵育宿主细胞培养物)，但SEC的可扩展性是有限的。因此，不包括SEC步骤的方法具有非常适于经济地大规模制造糖缀合物的优点(即，在含有至少100L且高达20,000L、例如150L至5000L孵育培养基的生物反应器中孵育宿主细胞培养物)。
然而，如其在小规模至中等规模生产方法中的频繁使用所说明的，开发不包括SEC步骤的用于提供高纯度人用糖缀合物的方法是特别具有挑战性的。
优选地，本发明方法不包括额外的色谱法步骤。因此，本发明方法优选包括不超过4个色谱法步骤。尽管增加另外的色谱法步骤是增加所获得产物的纯度的常见策略，但这通常将导致较低的总产率并使方法更费力。此外，增加另外的色谱法步骤通常与溶剂消耗增加相关。因此，出于经济原因和生态原因两者，包括不超过4个色谱法步骤的方法优选用于以商业规模生产糖缀合物。
优选地，本发明方法以大规模进行。因此，本发明方法优选包括在体积在100L与20000L之间、优选体积在150L与5000L之间、例如150L-1000L，诸如200L的生物反应器中孵育原核宿主细胞。
在另一个实施方案中，O-EPA缀合物在第四步骤中通过疏水相互作用色谱法(HIC；步骤d)进一步纯化，并且不应用另外的色谱法步骤。
在另一个实施方案中，O-EPA缀合物在第四步骤中通过第二阴离子交换色谱法(AEX2；步骤e)进一步纯化，并且不应用另外的色谱法步骤。这个实施方案概述于实施例2中。这优于先前的实施方案(即从实际方法的角度，优选省略HIC而不是AEX2，尽管两个实施方案都产生类似纯度的O-EPA生物缀合物)。
在另一个实施方案中，O-EPA缀合物在第四步骤中通过第二阴离子交换色谱法(AEX2；步骤e)进一步纯化，并且在第五步骤中通过疏水相互作用色谱法(HIC；步骤d)进一步纯化。
通常，在离子交换色谱法中，结合是基于静电荷。在AEX的情况下，树脂具有带正电荷的官能团，因此具有带负电荷的官能团的样品组分将与其结合。如本领域技术人员已知的，AEX可以使用弱阴离子交换剂或强阴离子交换剂进行。在本发明的某些实施方案中，强阴离子交换树脂用于AEX步骤(AEX1和AEX2)。适用于AEX树脂的官能团的非限制性实例是季铵基团。此类树脂是可商购的，并且包括例如Q Ceramic HyperD F树脂和Source 15Q树脂。基于本公开和常识，技术人员将知道如何改变用于本发明方法的不同的可用AEX树脂。作为一个非限制性实例，AEX1可以适当地用Q Ceramic HyperD F树脂进行，并且AEX2可以适当地用Source 15Q树脂进行。随着盐浓度递增，洗脱缓冲液中的盐离子竞争与树脂结合的材料的结合，并且结合的材料被置换和洗脱。可替代地，当pH改变时，结合的蛋白质被滴定并最终变成不带电荷的或具有与树脂的官能团相同的电荷，导致结合的蛋白质的排斥和洗脱。
HA(特别是cHA)色谱法可以看作是混合模式(多模式)色谱法步骤。此类树脂是可商购的，例如CHT陶瓷羟基磷灰石1型树脂。在HA(或cHA)中，分离尤其通过离子和金属-亲和相互作用的组合实现。典型地，一种或多种蛋白质经由HA-磷酰基(阳离子交换)或HA-钙相互作用(金属亲和力)与HA结合。小碱性蛋白通常通过磷酰基-阳离子交换与HA结合，并且酸性蛋白典型地主要通过钙亲和力相互作用。然而，大蛋白通常使用两种机制结合[Saraswat等人,2013,BioMed Research International,文章编号312709]。
在HIC期间，一种或多种目标蛋白(例如O-EPA生物缀合物)基于其疏水性与杂质分离。一种或多种含有疏水区和亲水区的目标蛋白典型地在高盐缓冲液中施加到HIC柱上。缓冲液中的盐降低一种或多种目标蛋白的溶剂化。随着溶剂化减少，变得暴露的疏水区被HIC树脂吸附。分子越疏水，促进结合所需的盐越少。通常，使用递减的盐梯度以递增疏水性的顺序从柱洗脱样品。也可以通过将另外的组分(诸如洗涤剂)添加到洗脱缓冲液中辅助样品洗脱。适合进行上述HIC步骤的HIC胶囊的非限制性实例是SartobindPhenyl Jumbo 5L胶囊。基于本公开和各种可商购的HIC树脂，技术人员能够根据本发明改变HIC树脂并使用。
在优选的实施方案中，AEX1以结合-洗脱模式进行。
在优选的实施方案中，HA(cHA)以结合-洗脱模式进行。
在优选的实施方案中，HIC以结合-洗脱模式进行。
在优选的实施方案中，AEX2以结合-洗脱模式进行。
在优选的实施方案中，AEX1、HA(cHA)、HIC和AEX2以结合-洗脱模式进行。
在优选的实施方案中，AEX1步骤是捕获步骤。
在优选的实施方案中，AEX2步骤是精制步骤。
本发明的这个方面(特别是所用的方法步骤和术语)将在下面进一步详细地解释：
生物缀合物：该术语如上所述。具体地，生物缀合物是在宿主细胞中制备的糖缀合物，其中宿主细胞机制产生聚糖和载体蛋白，并且例如经由天冬酰胺或精氨酸的N-连接将聚糖连接至载体蛋白。用于生产生物缀合物的特别优选的宿主细胞是大肠杆菌，优选包含编码以下的核酸的生物缀合物：(i)载体蛋白，(ii)寡糖基转移酶，诸如空肠弯曲菌PglB，其能够经由N-连接的糖基化将O-抗原多糖共价连接至载体蛋白中的糖基化共有序列(Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro之外的任何氨基酸)中的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)编码负责产生所需血清型的O-抗原多糖的酶的rfb基因簇。通过产生具有不同rfb基因座的宿主细胞，可以制备不同的生物缀合物，例如包含来自不同大肠杆菌或志贺氏菌血清型的O-抗原多糖的生物缀合物。培养此类宿主细胞将在宿主细胞的周质内产生包含载体蛋白的生物缀合物，由rfb基因座编码的O-抗原与所述载体蛋白共价连接。在此类宿主细胞中产生生物缀合物的更详细描述可以例如在WO 2009/104074、WO 2015/124769、WO 2017/035181或WO2020/191082中找到。用于产生特异性大肠杆菌O-抗原的生物缀合物的PglB寡糖基转移酶的优化变体已经描述于WO 2020/191088中。本发明涉及纯化从此类宿主细胞产生的生物缀合物的新颖的和改进的方法。用于产生生物缀合物的宿主细胞典型地是原核细胞，优选细菌细胞，优选革兰氏阴性细菌细胞，并且在优选的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。因此，从大肠杆菌宿主细胞蛋白中纯化O-EPA生物缀合物。宿主细胞蛋白的一个实例是转醛醇酶，特别是大肠杆菌转醛醇酶，并且本发明所述的方法能够获得具有非常少量的宿主细胞蛋白(包括非常少量的转醛醇酶)的O-EPA制品，其出人意料地表现为难以从O-EPA生物缀合物中去除的大多数残留宿主细胞蛋白之一。宿主细胞典型地经工程化以在周质中表达生物缀合物，并且因此纯化O-EPA生物缀合物的良好起点来自宿主细胞的周质级分，例如来自革兰氏阴性细菌宿主细胞，例如大肠杆菌宿主细胞。
特别有用的生物缀合物包含一种或多种多糖连接于其上的载体蛋白。例如，将此类生物缀合物用作某些疫苗的活性组分，其目的在于诱导针对生物缀合物的多糖的功能性免疫应答。在本发明的实施方案中，所述生物缀合物包含一种载体蛋白和一种或多种与所述载体蛋白共价结合的多糖，优选1至4种与所述载体蛋白共价结合的多糖。
在本发明的实施方案中，生物缀合物是含有与载体蛋白共价结合的大肠杆菌O-抗原的缀合产物。在本发明的实施方案中，生物缀合物是含有与载体蛋白共价结合的志贺氏菌O-抗原的缀合产物。术语O-抗原是本领域已知的，并且用于其正常的上下文中，其不应与O-连接混淆。在典型的实施方案中，O-抗原N-连接至载体蛋白。术语O-抗原通常是指包含在细菌(诸如大肠杆菌)的LPS内的重复聚糖聚合物。大肠杆菌的O-抗原是免疫原性重复寡糖(典型地，1-40个重复单元，例如5-30个重复单元)的聚合物，并且典型地用于血清分型和糖缀合物疫苗生产。
载体蛋白：在本发明的上下文中，特别合适的载体蛋白是铜绿假单胞菌的解毒外毒素A(EPA)(术语铜绿假单胞菌的外毒素A和胞外蛋白A，或EPA，可以互换使用)。在特定的实施方案中，载体蛋白是铜绿假单胞菌的解毒外毒素A。对于EPA，文献中已经描述了各种解毒的蛋白变体，并且可以将其用作载体蛋白。例如，解毒作用可以通过突变和缺失催化必需残基L552V和ΔE553来实现。
优选地，EPA载体蛋白包含1至20个、优选1至10个、优选2至4个糖基化位点。
在一个特定的实施方案中，EPA包含四个糖基化位点。参见例如WO 2015/124769、WO 2017/035181或WO 2020/191082，描述了大肠杆菌O-抗原多糖与EPA载体蛋白的生物缀合的实例，或例如WO 2009/104074，描述了志贺氏菌O-抗原多糖与EPA载体蛋白的生物缀合的实例。在一个特定的非限制性实施方案中，根据本发明的生物缀合物的载体蛋白包含SEQID NO:1。在某些实施方案中，在宿主细胞中表达期间，载体蛋白包含将载体蛋白靶向周质空间的信号序列。可以使用各种信号序列。在一个非限制性实施方案中，信号序列包含SEQID NO:2。信号序列可以在蛋白质移位到周质后分裂，并且因此可以不再存在于生物缀合物的最终载体蛋白中。
多糖：该术语如上所讨论。合适的多糖包含1至100个，诸如1-50、1-40、1-30、1-20和1-10、3-50、3-40，例如至少5个，诸如5-40、例如7-30、例如7至25、例如5至20、例如10-20个重复单元n。此类重复单元含有(即，包含或由其组成)(i)未修饰的单糖和/或(ii)经修饰的单糖。在非限制性实施方案中，术语“经修饰的单糖”包括单糖的N-乙酰化、O-乙酰化、酰胺化和/或胺化。此类经修饰的单糖可以在同一单糖上包含零个、一个或多个修饰，例如零个、一个、两个或三个上述修饰。
在特定的实施方案中，经修饰的单糖是O-乙酰化和/或N-乙酰化的单糖，特别是包含一个O-乙酰化或N-乙酰化的单糖。
在本发明的实施方案中，合适的重复单元包含选自甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、经修饰的甘露糖、经修饰的鼠李糖、经修饰的葡萄糖、经修饰的岩藻糖和经修饰的半乳糖的单糖。
在本发明的实施方案中，O-多糖对选自埃希氏杆菌属和志贺氏菌属的列表中的革兰氏阴性细菌(优选大肠杆菌)是特异的。
大肠杆菌O-抗原多糖的非限制性和示例性结构示于下表1中。示出了每种大肠杆菌O-抗原多糖的单一重复单元。在这个表中，每个n独立地是1至100的整数，诸如1-50、1-40、1-30、1-20和1-10、3-50、3-40，例如至少5，诸如5-40，例如7-30，例如7至25，例如5至20，例如10-20，但在一些情况下可以是1-2。在根据本发明方法纯化的大肠杆菌O-抗原多糖的生物缀合物组合物的某些优选的实施方案中，n是平均在5-30之间、优选在10-25之间、优选在10-20之间的某值。
表1：大肠杆菌O-抗原多糖结构的实例
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其他大肠杆菌或志贺氏菌或其他来自各种血清型的细菌O-抗原多糖的结构是已知的，并且可以在本领域中找到。
捕获步骤：所述术语是本领域已知的，并且涉及第一色谱法步骤，目的是结合来自粗样品的一种或多种目的蛋白并且将它们与关键污染物(诸如蛋白酶和糖苷酶)分离。将一种或多种目标蛋白(即一种或多种O-EPA生物缀合物)浓缩并转移到缓冲液中，所述缓冲液将保持O-EPA生物缀合物的功能和结构完整性。通过结合条件的仔细优化也可以实现其他关键污染物的去除。
优化捕获步骤的焦点在于能力和速度。因此，为了使第一步骤中的分离的能力和/或速度最大化，对解析率进行折衷是可接受的。
精制步骤：所述术语是本领域已知的，并且涉及作为最终色谱法步骤进行的色谱法步骤，目的是进一步提高目标蛋白(即O-EPA生物缀合物)的纯度。
结合-洗脱模式：所述术语是本领域已知的，并且涉及通过首先将样品组分(特别是目的蛋白/生物缀合物)结合至色谱法树脂而起作用的分离模式。一旦样品成分被结合，就将树脂用缓冲液洗涤，并且因此去除未结合的材料。然后，洗脱结合的材料。这种分离模式与流过模式相反，在流过模式中，样品和缓冲液的pH/离子强度以这样的方式选择，即蛋白质将不结合但将流过柱，留下结合的大多数或特定的杂质。
在本发明的实施方案中，在纯化步骤b)至e)中，首先调节条件以允许O-EPA缀合物与色谱法介质结合，并且随后调节条件以允许O-EPA缀合物从所述介质中洗脱，即色谱法步骤以结合-洗脱模式进行。
混合模式色谱法：所述术语是本领域已知的，并且在本文中与多模式色谱法同义使用。所述术语涉及利用多于一种形式的在固定相与目标蛋白(即生物缀合物)之间的相互作用以便实现与杂质的分离的色谱法方法。混合模式树脂选择性典型地由静电相互作用、疏水相互作用和/或氢键的组合产生，这取决于具体情况。在HA或cHA色谱法的情况下，有时也将其看作是特定形式的混合模式色谱法，分离特定地通过离子和金属亲和相互作用的组合来实现。此类树脂是可商购的，例如CHT陶瓷羟基磷灰石XT resin。
存活和非存活颗粒：存活颗粒是含有一种或多种活微生物(诸如细菌)的颗粒。这些可以影响药物产品的无菌性。
非存活颗粒是不含活微生物但可以作为存活颗粒的运输媒介物的颗粒。
存活和非存活颗粒的大小通常在约0.2μm至30μm、典型地在约0.2μm至5μm的范围内。
当单独观察时，下面概述的单独生产步骤本身是已知的。然而，发现下述步骤a-e的特定组合特别适合于生产各种不同的O-EPA生物缀合物，并且可以进行大规模生产。此外，发现步骤a、b、c和e的组合，因此省略步骤d，已经足以典型地产生纯度在85％-95％之间、诸如在85％-90％之间的O-EPA缀合物。纯度至少为85％的O-EPA缀合物可以例如适合于生产兽医治疗剂，诸如兽医疫苗，或用于其他目的，例如用于研究或诊断。步骤a、b和c的组合，因此省略步骤d和e，典型地产生纯度为约60％-80％的O-EPA缀合物，如通过SE-HPLC所测量。
在优选的实施方案中，O-EPA缀合物在第一步骤(步骤a)中提供为包含O-EPA缀合物的原核宿主细胞的过滤的周质级分，并且在第二步骤(步骤b)[第一色谱法步骤]中，对过滤的周质级分的任选调节负载进行第一阴离子交换色谱法(AEX 1)步骤，以获得第一AEX洗脱物(AEX1)。
在第三步骤(步骤c)[第二色谱法步骤]中，对步骤b)中获得的AEX1洗脱物的调节负载进行羟基磷灰石(HA)色谱法步骤，以获得HA洗脱物。在优选的实施方案中，HA色谱法步骤是陶瓷羟基磷灰石(cHA)色谱法步骤。因此，获得的HA洗脱物优选是cHA洗脱物。
在第四步骤(步骤d)[第三色谱法步骤]中，对步骤c)中获得的HA或cHA洗脱物的调节负载进行疏水相互作用色谱法(HIC)步骤，以获得HIC洗脱物。
在第五步骤(步骤e)[第四色谱法步骤]中，对步骤d)中获得的HIC洗脱物的调节负载进行第二阴离子交换色谱法(AEX2)步骤，以获得作为产物的第二AEX洗脱物。包括AEX2作为第四色谱法步骤是优选的，因为这确保了具有高纯度的O-EPA生物缀合物的可再现生产，所述高纯度的O-EPA生物缀合物适合于施用于有需要的受试者。
此外，在第二、第三、第四和第五步骤的每一个中，即在每个色谱法步骤中，典型地首先调节条件以允许O-EPA缀合物与色谱法介质结合，并且随后调节条件以允许O-EPA缀合物从所述介质中洗脱(“结合-洗脱模式”)。
当遵循上述方案时，在第二、第三、第四和第五步骤的每一个中，即在每个色谱法步骤中，O-EPA缀合物相对于总蛋白的相对量在洗脱物中比在负载中高。
这产生了O-EPA缀合物，其纯度典型地≥93％，例如93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％，如通过SE-HPLC所测量。典型地，O-EPA缀合物的纯度≥98％，例如98％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％，如通过SE-HPLC所测量，尤其是当使用包括如上所述的四个色谱法步骤的方法时。对于旨在施用于人的药物产品的组分，诸如包含多种O-EPA缀合物的多价生物缀合物疫苗，至少95％或更高、例如至少98％的纯度是有利的。
在某些实施方案中，不需要包括AEX2步骤[第四色谱法步骤]或HIC步骤[第三色谱法步骤]来满足某些应用的纯度要求，例如对于兽医应用、研究或诊断。因此，在某些实施方案中，包括AEX2[第四色谱法步骤]是任选的。在某些其他实施方案中，包括HIC步骤[第三色谱法步骤]是任选的。
因此，在一个实施方案中，O-EPA缀合物在第一步骤(步骤a)中提供为包含O-EPA缀合物的原核宿主细胞的过滤的周质级分(FPF)。
在第二步骤(步骤b)中，对过滤的周质级分的任选调节负载进行第一阴离子交换色谱法(AEX 1)步骤，以获得第一AEX洗脱物(AEX1)。
在第三步骤(步骤c)中，对步骤b)中获得的AEX1洗脱物的调节负载进行羟基磷灰石色谱法(HA)步骤，以获得HA洗脱物。HA色谱法步骤优选是陶瓷羟基磷灰石(cHA)色谱法步骤。因此，获得的HA洗脱物优选是cHA洗脱物。
在第四步骤(步骤d)中，对步骤c)中获得的HA或cHA洗脱物的调节负载进行疏水相互作用色谱法(HIC)步骤，以获得作为产物的HIC洗脱物。
在第二、第三和第四步骤的每一个中，即在每个色谱法步骤中，典型地首先调节条件以允许O-EPA缀合物与色谱法介质结合，并且随后调节条件以允许O-EPA缀合物从所述介质中洗脱。这典型地也称为“结合-洗脱模式”。
当遵循上述方案时，在第二、第三和第四步骤的每一个中，即在每个色谱法步骤中，O-EPA缀合物相对于总蛋白的相对量在洗脱物中比在负载中高。
这产生了纯度典型地在85％-95％之间、诸如在85％-90％之间的O-EPA缀合物，如通过SE-HPLC所测量。
在另一个实施方案中，O-EPA缀合物在第一步骤(步骤a)中提供为包含O-EPA缀合物的原核宿主细胞的过滤的周质级分，并且在第二步骤(步骤b)中，对过滤的周质级分的任选调节负载进行第一阴离子交换色谱法(AEX 1)步骤，以获得第一AEX洗脱物(AEX1)。
在第三步骤(步骤c)中，对步骤b)中获得的AEX1洗脱物的调节负载进行羟基磷灰石色谱法(HA)步骤，以获得HA洗脱物。HA色谱法步骤优选是陶瓷羟基磷灰石(cHA)色谱法步骤。因此，获得的HA洗脱物优选是cHA洗脱物。
在第四步骤(步骤e)中，将步骤c)中获得的HA或cHA洗脱物的调节负载进行第二阴离子交换色谱法(AEX2)步骤，以获得作为产物的第二AEX洗脱物。因此，在这个实施方案中，省略步骤d)(HIC)。优点是这种方法较简短，产生比包括步骤d)(HIC)的方法更便宜和更方便的方法；后一种方法(即包括HIC步骤)相对于这种较简短方法的优点在于所述较久的方法以更可再现的方式产生较高纯度的O-EPA产物，这在制备旨在供人类使用的药物制剂时是有利的。
在第二、第三、第四和第五步骤的每一个中，即在每个色谱法步骤中，典型地首先调节条件以允许O-EPA缀合物与色谱法介质结合，并且随后调节条件以允许O-EPA缀合物从所述介质中洗脱，即每个色谱法步骤以结合-洗脱模式进行。
当遵循上述方案时，在第二、第三、第四和第五步骤的每一个中，即在每个色谱法步骤中，O-EPA缀合物相对于总蛋白的相对量在洗脱物中比在负载中高。
这产生了纯度典型地在85％-95％之间、诸如在85％-90％之间的O-EPA缀合物，如通过SE-HPLC所测量。
这个实施方案优于先前的实施方案(即从实际方法的角度，优选省略HIC而不是AEX2，尽管两个实施方案都产生类似纯度的O-EPA生物缀合物)。这个实施方案概述于实施例2中。
在任选的实施方案中，可以在所述方法的某些点增加额外的过滤步骤，诸如切向流过滤、超滤/渗滤(切向流过滤的变体)、死端过滤和/或无菌过滤，以及对于O-EPA的任选的浓缩和/或稀释和/或缓冲液改变步骤，但是优选不包括额外的色谱法步骤，并且因此所述方法优选不包括超过4个色谱法步骤。如上所述，根据本发明的方法优选不包括纯化生物缀合物的尺寸排阻色谱法步骤。当然，可以将另外的纯化步骤(如色谱法步骤)加到本发明的方法中以达到甚至更高的纯度，但这将不可避免地导致较低的总产率，并且因此是不期望的，因为这可能使所述方法对于大规模生产生物药物产品在经济上不可行，而本发明的方法(特别是包括上面已经概述的四个色谱法步骤的最优选的方法)产生适合于施用于人类的药物产品的所需纯度水平，其产率使得本发明的方法在经济上和实践上可行。将可以探索改变方法以使其甚至更有益，但这将需要额外的研究，其结果是不可预测的。
下面更详细地解释上面概述的方法步骤(步骤a-e)。
步骤a：这个步骤用于提供包含O-EPA缀合物的原核宿主细胞的过滤的周质级分以供纯化。提供包含O-EPA缀合物的过滤的周质宿主细胞级分本身是已知的(参见例如WO2009/104074、WO 2015/124769或WO 2020/191082)。
为了通过渗透休克处理获得周质级分，首先将细胞在具有相对高摩尔渗透压浓度(高渗)的缓冲液中孵育，并且然后在具有相对低摩尔渗透压浓度(低渗)的缓冲液中孵育。这种渗透休克处理导致至少部分去除细胞壁并产生球芽(即，细胞，特别是革兰氏阴性细胞，已经从其中至少部分去除了细胞壁)。因此，大部分宿主细胞蛋白保留在球芽中，而周质蛋白被释放到悬浮介质中。
典型地，在生物反应器中培养包含编码PglB、EPA和用于生物合成相应O-抗原多糖的酶的遗传信息的大肠杆菌宿主细胞，所述生物反应器例如具有约100L-20000L、例如150L-5000L、诸如150L-1000L、例如200L的体积，其中所述细胞产生O-EPA。典型地，当细胞处于平稳期时，在将培养物冷却至低于20℃时，经由离心，例如经由连续离心，例如使用碟式离心机来收获细胞。将细胞重悬于合适的液体中，例如0.9％NaCl溶液或Tris缓冲盐水(TBS)，并优选使用在约2-15℃、优选约6-10℃下的溶液进行渗透休克。渗透休克例如可以通过以下进行：将蔗糖溶液(例如60％蔗糖，pH 8，480mM Tris-HCl，24mM EDTA)添加到细胞中以达到约20％-30％、例如25％的蔗糖的目标浓度，在混合的同时在约2-15℃、优选约6-10℃下孵育混合物约15分钟至4小时，例如约1小时。在与蔗糖一起孵育后，在6-10℃下将细胞/蔗糖溶液与低渗透压值的溶液混合，例如通过与约4倍体积的10mM Tris-HCL(pH 8.0)混合。混合例如可以通过静态混合器进行。O-EPA产物从周质空间释放到上清液(称为周质级分，PF)中，并收集PF。然后可以使材料澄清，例如通过在碟式离心机中分离去除PF中的细胞碎片，由此收集上清液(称为离心的周质级分，CPF)。可以将CPF进一步过滤以去除剩余的细胞碎片，例如通过深度和生物负荷减少过滤器(例如孔径为约0.2μm的膜)过滤，并且收集所得材料作为过滤的周质级分(FPF)。随后可以将这种FPF用于如本文所述的本发明的色谱法纯化方法[从步骤b)开始]。
因此，在优选的实施方案中，步骤a)还包括a-1)，在体积在100L与20000L之间、例如150L至5000L、例如150L-1000L、诸如200L的生物反应器中优选在34℃与36℃之间、例如35℃的温度下孵育原核宿主细胞以使其生长直至达到收获前的稳定期；
随后收获原核宿主细胞，其中收获优选包括连续流离心步骤以获得在周质中包含O-EPA缀合物的收获的原核宿主细胞。
因此，在另一个优选的实施方案中，步骤a)还包括a-2)，渗透休克处理宿主细胞以获得包含O-EPA缀合物的原核宿主细胞的周质级分。本领域技术人员清楚，步骤a-2在步骤a-1之后。在某些实施方案中，步骤a-2)中的渗透休克处理包括将优选还包含EDTA的蔗糖溶液添加到细胞中以达到约25％蔗糖的目标浓度，在混合的同时在约6-10℃下孵育混合物约15分钟至2小时，并且随后在约6-10℃下将具有低渗透压浓度的溶液(例如10mM Tris-HClpH 8)添加到细胞/蔗糖溶液中，以使渗透压值降低至少四倍(与包含25％蔗糖的组合物相比)，由此使O-EPA产物从周质释放到上清液中，并且收集上清液(周质级分)，并且随后过滤周质级分，以获得过滤的周质级分。
在优选的实施方案中，O-多糖对选自埃希氏杆菌属和志贺氏菌属的列表中的革兰氏阴性细菌(优选大肠杆菌)是特异的。
在额外优选的实施方案中，从其中获得O-EPA缀合物的原核宿主细胞包含编码O-多糖和重组胞外蛋白A(EPA)的遗传信息，以及用O-多糖对EPA进行N-糖基化的代谢装置，从而在原核宿主细胞的周质中体内产生O-EPA缀合物。这方面的细节在上面和在本领域中，例如在WO 2009/104074和WO 2020/191082中有更详细的描述。
步骤b：这个步骤用于减少加工体积和减少方法相关杂质，所述杂质来源于发酵程序，即宿主细胞的孵育和包含O-EPA缀合物的周质级分的提取。特别地，去除了可以导致O-EPA缀合物降解的杂质，诸如蛋白酶、肽酶和糖苷酶。
对过滤的周质级分的任选调节负载进行第一阴离子交换色谱法(AEX 1)步骤以获得第一AEX洗脱物(AEX1)是本身已知的。在优选的实施方案中，步骤(b)还包括优选按所示顺序的下列步骤(b-1)至(b-2-iii)中的一个或多个：
在一个实施方案中，这包括(b-1)任选地调节适合于结合AEX1介质的过滤的周质级分的负载的电导率。
典型地不需要在AEX1之前调节过滤的周质级分的负载。替代地，对过滤的周质级分典型地直接进行AEX1，除非所述过滤的周质级分的条件(特别是电导率)不适合进行AEX1。合适的AEX1树脂的非限制性实例是例如Q-Ceramic HyperD F树脂。
在一个实施方案中，这包括(b-2-i)使过滤的周质级分的任选调节负载与AEX1介质接触，并且用洗涤缓冲液洗涤包含结合的O-EPA缀合物的所述介质。典型地，所述洗涤缓冲液具有相对低的盐浓度和相对低的电导率。合适的低盐、低电导率洗涤缓冲液的实例是pH 8.5的缓冲液，其包含10mM Tris和50mM NaCl。
在一个实施方案中，这包括(b-2-ii)用典型地包含相对高的盐浓度和相对高的电导率的洗脱缓冲液洗脱O-EPA缀合物。合适的高盐、高电导率缓冲液的实例是pH 8.5的缓冲液，其包含10mM或50mM Tris和1MNaCl。典型地，使用阶梯梯度进行洗脱。
对于这些步骤中的每一个将清楚的是可以改变AEX1树脂、AEX1柱或膜或盒形式的特性、确切的缓冲液组分、pH和/或盐浓度或电导率以及梯度，如本领域技术人员基于本公开所知的。
在一个实施方案中，这包括(b-2-iii)，任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得AEX1洗脱物。典型地，通过进行SDS-PAGE分析或任何合适的分析来鉴定具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以确定所需O-EPA缀合物的量或相对纯度。进行SDS-PAGE分析，从而鉴定包含目标产物(即O-EPA缀合物)的级分，是本领域普通技术人员所熟知的。
步骤c：这个步骤用于进一步减少在步骤b)之后存在的方法相关杂质。典型地，在步骤c)之后，与步骤a中提供的过滤的周质级分相比，超过80％的HCP被耗尽。另外，步骤c)用于与AEX1洗脱物的汇集级分相比降低DNA含量和内毒素含量(如果存在内毒素；进行内毒素分析的合适方法是本领域普通技术人员已知的)。
在优选的实施方案中，步骤c，“对步骤(b)中获得的AEX1洗脱物的调节负载进行羟基磷灰石色谱法(HA)步骤(优选陶瓷羟基磷灰石色谱法(cHA)步骤)，以获得HA或cHA洗脱物”还包括优选按所示顺序的以下步骤(c-3)至(c-5-iii)中的一个或多个。
在一个实施方案中，这包括(c-3)，调节适合于结合HA介质的AEX1洗脱物的负载的pH和电导率。适合于这个步骤的HA(或cHA)介质是可商购的，并且非限制性实例是CHT陶瓷羟基磷灰石1型树脂。在施加在合适的cHA或HA树脂上之前，AEX1洗脱物的负载的合适pH特别是pH＝7.2±0.2。在施加在合适的cHA或HA树脂上之前，AEX1洗脱物的负载的合适电导率为8.25±0.75mS/cm。典型地，在例如使用包含10mM BisTris，pH 7.0的缓冲液调节电导率之前，使用例如包含0.5M BisTris HCl和pH 6.0的缓冲液的合适缓冲液调节负载的pH。
在一个实施方案中，这包括(c-4)，任选地进行颗粒减少过滤1。这个步骤导致存活和非存活颗粒的去除。
在一个实施方案中，这包括(c-5-i)，使调节的AEX1洗脱物与HA介质接触，并且用洗涤缓冲液洗涤所述包含结合的O-EPA缀合物的HA介质，所述洗涤缓冲液典型地具有相对低的电导率。合适的低电导率洗涤缓冲液的实例是包含30mM BisTris、3.975mM磷酸钾、70mM NaCl，pH 7.0的缓冲液。
在一个实施方案中，这包括c-5-ii)，用盐梯度洗脱O-EPA缀合物。合适盐梯度的实例是氯化钠和磷酸钾梯度，例如，2-3、例如2.5柱体积(CV)的在包含30mM BisTris、2.5mM磷酸钾、50mM NaCl，pH 7.0的缓冲液(缓冲液J)中的20％-45％的包含30mM TrisBis、32mM磷酸钾、450mM NaCl，pH 7.0的缓冲液(缓冲液K)的线性梯度，随后是2-3、例如2.5CV的至在缓冲液J中的70％缓冲液K的阶梯梯度。
在一个实施方案中，这包括c-5-iii)，任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得HA或cHA洗脱物。
对于这些步骤中的每一个将清楚的是可以改变HA或cHA树脂、柱形式的特性、确切的缓冲液组分、pH和/或盐浓度或电导率以及梯度，如本领域技术人员基于本公开所知的。
步骤d：HIC步骤用来进一步去除HCP，尤其是非糖基化EPA和各种中等大小的HCP(约40-60kDa)。在优选的实施方案中，步骤d，“对步骤(c)中获得的HA或cHA洗脱物的调节负载进行疏水相互作用色谱法(HIC)步骤以获得HIC洗脱物”还包括优选按所示顺序的以下步骤(d-6)至(d-8-iii)中的一个或多个。
在一个实施方案中，这包括d-6)，调节HA或cHA洗脱物的负载的电导率。使用适合于结合HIC介质的负载缓冲液调节电导率，所述负载缓冲液典型地具有相对高的电导率。合适的负载缓冲液的实例是包含2M磷酸钾，pH 7.0的缓冲液(缓冲液Q)。在这个步骤中合适的目标电导率例如为118±2mS/cm的电导率。用于这个步骤的合适HIC介质是SartobindPhenyl Jumbo 5L胶囊。
在一个实施方案中，这包括d-7)，任选地进行颗粒减少过滤2以去除存活和非存活颗粒。
在一个实施方案中，这包括d-8-i)，使调节的HA或cHA洗脱物与HIC介质接触，并且用合适的缓冲液洗涤所述包含结合的O-EPA缀合物的介质，所述缓冲液典型地是具有相对高电导率的缓冲液，例如包含2M磷酸钾，pH 7.0的缓冲液，并且任选地随后用具有降低的电导率的缓冲液(例如，包含70％的包含2M磷酸钾，pH 7.0的缓冲液和30％WFI水的混合物)进行第二洗涤步骤。
在一个实施方案中，这包括d-8-ii)，使用合适的洗脱缓冲液、典型地具有相对低电导率的洗脱缓冲液洗脱O-EPA缀合物。优选地，用使用合适洗脱缓冲液的阶梯梯度进行洗脱。洗脱O-EPA缀合物的合适缓冲液的实例是含有30％的包含2M磷酸钾，pH 7.0的缓冲液和70％WFI水的混合物。
对于这些步骤中的每一个将清楚的是可以改变HIC树脂、柱或膜或盒形式的特性、确切的缓冲液组分、pH和/或盐浓度或电导率以及梯度，如本领域技术人员基于本公开所知的。
在一个实施方案中，这包括d-8-iii)，任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得HIC洗脱物。
步骤e：在优选的实施方案中，步骤e，“任选地对步骤(d)中获得的HIC洗脱物的调节负载进行第二阴离子交换色谱法(AEX2)步骤以获得作为产物的第二AEX洗脱物”还包括优选按所示顺序的以下步骤(e-9)至(e-12-iii)中的一个或多个。适合于这个AEX2步骤的AEX介质是可商购的，并且非限制性实例是Source Q树脂。
AEX2步骤用于进一步去除方法相关蛋白质杂质，特别是大肠杆菌转醛醇酶(约37kDa)。因此，在一个方面，本发明提供通过阴离子交换色谱法进行的精制步骤用于降低包含O-EPA生物缀合物的制剂中的转醛醇酶的量的用途。在某些实施方案中，O-EPA生物缀合物已经经历了先前的纯化步骤，包括按顺序进行的阴离子交换、羟基磷灰石和疏水相互作用色谱法步骤。
在一个实施方案中，这包括e-9)，对HIC洗脱物的负载进行切向流过滤1，以降低电导率并调整O-EPA缀合物的浓度。在进行AEX2步骤之前O-EPA生物缀合物的合适浓度是例如OD280为1.35±0.15。通过用合适的缓冲液，例如包含10mM BisTris的pH 6.0的缓冲液(缓冲液T)稀释HIC洗脱物，或者通过切向流过滤浓缩HIC洗脱物，可以达到目标浓度。为了通过TFF浓缩HIC洗脱物，通过允许渗透物流动发生来减少流体的体积。因此，小于膜孔径的溶剂、溶质和颗粒穿过膜，而保留并由此浓缩大于孔径的组分(诸如O-EPA生物缀合物)。通过TFF进行的这种浓缩后面是渗滤，直到达到合适的目标电导率。因此，一旦达到目标浓度，就以与渗透物流速相同的速率，即进料穿过膜的速率，将新缓冲液添加到进料中。由此，HIC洗脱物在合适的缓冲液中获得，并且浓缩的HIC洗脱物的体积保持恒定(缓冲液交换)。合适的电导率例如为5-6mS/cm。用于这种缓冲液交换的合适缓冲液是例如包含10mM BisTris的pH6.0的缓冲液(缓冲液T)。
在一个实施方案中，这包括e-10)，调节适合于结合AEX2介质的过滤的HIC洗脱物的负载的pH和电导率。在一些情况下，如上所述通过TFF1进行的缓冲液交换不足以根据需要调节HIC洗脱物的pH。因此，HIC洗脱物的pH可以使用合适的pH调节缓冲液，例如包含0.5MBisTris的pH 6.0的缓冲液(缓冲液Y)，调节到pH典型为6.5±0.2。此外，使用合适的电导率调节缓冲液，例如包含10mM BisTris、200mM NaCl的pH 6的缓冲液(缓冲液V)，将HIC洗脱物的电导率调节到目标电导率典型为8.7±0.3mS/cm。
在一个实施方案中，这包括e-11)，任选地进行颗粒减少过滤3以去除存活和非存活颗粒。
在一个实施方案中，这包括e-12-i)，使过滤的HIC洗脱物的任选调节负载与AEX2介质接触，并且任选用洗涤缓冲液洗涤包含结合的O-EPA缀合物的所述介质至少两次。用于这个步骤的合适洗涤缓冲液典型地具有相对低的盐浓度和低的电导率，并且合适的洗涤缓冲液的非限制性实例是含有10mM BisTris、50mM NaCl，pH 6.0的缓冲液(缓冲液U)。任选地进行第二洗涤步骤，并且合适的第二洗涤步骤例如采用在缓冲液U中的15％-21％的含有10mM BisTris、200mM NaCl，pH 6.0的缓冲液(缓冲液V)的线性梯度。
在一个实施方案中，这包括e-12-ii)，用洗脱缓冲液洗脱O-EPA缀合物。在某些实施方案中，洗脱特别地通过阶梯梯度，随后是递增盐浓度的线性梯度进行。典型地，洗脱缓冲液具有相对高的盐浓度和高的电导率。用于洗脱O-EPA缀合物的合适方法的一个非限制性实例是应用3CV的在缓冲液U中的21％缓冲液V(阶梯梯度)，随后是7-8、例如7.5CV的在缓冲液U中的21％-56％缓冲液V的线性梯度。
在一个实施方案中，这包括e-12-iii)，任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得作为产物的AEX2洗脱物。
在另一个优选的实施方案中，在步骤(e)期间，使O-EPA缀合物与AEX2基质结合，并通过上述阶梯梯度、随后是递增盐浓度的线性梯度洗脱，以获得纯度为至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、或至少99％的O-EPA缀合物。
对于这些步骤中的每一个将清楚的是可以改变AEX2树脂、AEX2柱或膜或盒形式的特性、确切的缓冲液组分、pH和/或盐浓度或电导率以及梯度，如本领域技术人员基于本公开所知的。
在另一个优选的实施方案中，所述生产方法还包括额外的步骤f)，其中将HIC洗脱物或优选AEX2洗脱物的负载调节到药学上可接受的缓冲液和浓度，从而获得作为药学药物物质的纯化的O-EPA缀合物。
在优选的实施方案中，步骤f)还包括优选按所示顺序的下列步骤(f-13)至(f-17)中的一个或多个：
在一个实施方案中，这包括f-13)，任选地调节适合于切向流过滤2(TFF2)的AEX2洗脱物的负载的pH。TFF2的合适pH是例如6.5±0.2，并且合适缓冲液的一个实例是100mMNa2HPO4缓冲液(缓冲液W)。
在一个实施方案中，这包括f-14)，对调节的AEX2洗脱物进行TFF2，以改变为O-EPA缀合物的药学上可接受的缓冲液和浓度。在一个实施方案中，药学上可接受的缓冲液包含6.19mM KH2PO4、3.81mM Na2HPO4、5％(w/w)山梨糖醇、10mM甲硫氨酸、0.02％(w/w)聚山梨醇酯-80，pH 7.0。
在一个实施方案中，这包括f-15)，对纯化的O-EPA缀合物进行生物负荷过滤，以获得纯化的O-EPA缀合物药物物质。这种生物负荷过滤可以例如使用具有截留为0.45+0.2μm的PES膜的过滤器(例如Sartopore 2Capsule Size 9过滤器)进行。
在一个实施方案中，这包括f-16)，将纯化的O-EPA缀合物药物物质分份并冷冻，从而获得药物原料药。
在另一个优选的实施方案中，所述生产方法还包括额外的步骤g)，其中将几种纯化的O-EPA缀合物药物物质合并，从而获得多价药物产品。
在又另一个优选的实施方案中，多价药物产品包含至少四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种纯化的O-EPA缀合物，所述纯化的O-EPA缀合物包含选自包括大肠杆菌O-血清型O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75的列表的O-多糖。在另外的实施方案中，可以添加不同大肠杆菌血清型的缀合物(即O-抗原多糖与载体蛋白共价偶联)，例如以获得包含10-20种缀合物(例如O-EPA缀合物)的多价药物产品。不同大肠杆菌血清型的此类缀合物也可以是生物缀合物，并且也可以已经根据本文所述的方法纯化。
本发明的以下实施例将进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求确定。
实施例1：这是ExPEC O-EPA生物缀合物的生产方法的实例
这是本文称为“DSP0”的4柱纯化方法的实例。
所述方法由以下步骤组成：(i)AEX1(捕获AEX色谱法)；(ii)对于cHA色谱法进行的pH和电导率调节；(iii)颗粒减少过滤1；(iv)cHA色谱法；(v)对于HIC进行的pH和电导率调节；(vi)颗粒减少过滤2；(vii)HIC；(viii)TFF1；(ix)对于AEX2(精制步骤)进行的pH和电导率调节；(x)颗粒减少过滤3；(xi)AEX2(精制色谱法)；(xii)对于TFF2进行的pH调节；(xiii)TFF2；(xiv)生物负荷过滤。
在此实施例中提及的缓冲液(包括其组成)列于下表2中。
步骤a：包含O25B-EPA生物缀合物的过滤的周质级分用作下面概述的纯化方法的起始材料。O-EPA生物缀合物的生产先前已有描述(参见例如WO2009/104074、WO2015/124769和WO2020/191082)，并且以类似于这些方案的方式进行。具体地，如先前所述[WO2020191082]通过在200L生物反应器(发酵罐)中孵育后的渗透休克处理获得包含O25B-EPA生物缀合物的大肠杆菌宿主细胞的周质级分。基本上如下获得过滤的周质级分。在200L生物反应器中的孵育对应于165L收获等同物(HE；LHE)。
更详细地：
a-1：作为收获步骤，在开始通过碟式离心机(DSC)收获之前，使用具有恒定流量(例如，约160L/h)的分离器将165L培养液冷却至低于20℃。收集生物质并丢弃离心液(上清液)。
a-2：下一步是渗透休克，其使用约6-10℃的溶液进行。测定浓缩收获物的细胞湿重(CWW)，并基于CWW，用1/3TBS(pH 7.4)将细胞悬浮液稀释至例如约390g/L的目标CWW，并且测定总体积。将60％蔗糖溶液添加到稀释的收获物中至25％的目标浓度，并在6-10℃下与细胞一起孵育1小时，同时混合溶液。在与蔗糖一起孵育后，在6-10℃下将细胞/蔗糖溶液与4倍体积的10mM Tris-HCL(pH 8.0)在线混合。混合通过静态混合器进行。产物从周质空间释放到上清液(称为周质级分，PF)中，并收集PF。
随后使材料澄清：PF中的细胞碎片通过在碟式离心机中分离而去除。应用恒定流量，并且基于离心液浊度调节流量。收集上清液，并且将其称为离心的周质级分(CPF)。
CPF仍然含有细胞碎片，并且通过深度和生物负荷减少过滤器过滤，并且作为过滤的周质级分(FPF)收集。使用FPF以从AEX1步骤(步骤b)开始进一步纯化O-EPA，如下面进一步描述的。
步骤b：捕获AEX1色谱法
b-1：不需要调节过滤的发酵罐收获物的电导率。
b-2-i：将渗透休克和过滤的发酵罐收获物的周质级分以结合-洗脱模式装载在QCeramic HyperD F树脂上，用于第一阴离子交换色谱法(AEX1；20cm床高，0.34L树脂/L收获等同物)。在用低盐缓冲液A平衡柱之后，将包含O-EPA生物缀合物的过滤的周质级分装载到柱上。然后用3柱体积(CV)的缓冲液A洗涤柱。
b-2-ii：使用缓冲液BV2以阶梯梯度实现洗脱。将洗脱物分成4份0.24CV的级分，其中当UV吸收以大于1.0AU/min的斜率增加时，开始收集洗脱级分。
b-2-iii：通过SDS-PAGE分析单独的级分，并且通过考马斯染色进行染色(图1)。通过混合级分1和2产生“AEX1汇集物”(AEX1洗脱物)。
步骤c：羟基磷灰石色谱法
c-3：将汇集的AEX1级分使用缓冲液Y调节至7.2±0.2的目标pH，并且在随后的步骤中使用缓冲液Z调节至7.5-9mS/cm的目标电导率。
c-4：使用具有0.45+0.2μm截留和0.45m2/165LHE过滤器面积的PES膜(Sartopore)进行颗粒减少过滤。
c-5-i：以结合-洗脱模式进行陶瓷羟基磷灰石色谱法(cHA，20cm床高，0.34L树脂/L收获等同物)。
在用6CV缓冲液N预平衡以调节pH，随后用6CV缓冲液J平衡后，将AEX1洗脱物的调节负载施加到cHA树脂上。使用1CV的由在缓冲液J中的5％缓冲液K组成的低电导率缓冲液洗涤柱。
c-5-ii：使用盐梯度(即氯化钠和磷酸钾梯度)实现产物的选择性洗脱。首先，应用2.5CV的在缓冲液J中的20％-45％缓冲液K的线性梯度，随后2.5CV的至在缓冲液J中的70％缓冲液K的阶梯梯度。在应用1.9CV的线性梯度后，开始收集14份15.565L/165LHE的级分。C-5-c-5-iii：此外，通过SDS-PAGE分析单独的级分(图2)。产生“cHA汇集物”的级分的选择基于对应于O-EPA生物缀合物的带相对于杂质的强度，即选择用于汇集的第一级分含有强产物带以及仅弱至中等强度的杂质带，并且汇集级分的末端通过褪色产物带标记，通常还有递增强度的游离EPA带。然后通过混合所选择的级分产生汇集的cHA洗脱物。在这种情况下，汇集级分7-10(参见图2)。
步骤(d)：HIC色谱法
d-6：向汇集的cHA洗脱物中添加电导率调节缓冲液(缓冲液Q)，直到达到118±2mS/cm的目标电导率。
d-7：使用具有0.45+0.2μm截留和0.45m2/165LHE过滤器面积的PES膜(Sartopore)进行颗粒减少过滤。
d-8-i：HIC以结合-洗脱模式进行。将HIC胶囊(SartobindPhenyl Jumbo 5L，0.8cm床高)用3CV缓冲液Q平衡，并且施加cHA洗脱物的调节负载。然后，将HIC胶囊用1CV缓冲液Q洗涤，随后用4CV含有70％缓冲液Q和30％缓冲液R的缓冲液混合物洗涤。
d-8-ii：通过应用4CV的含有30％缓冲液Q和70％缓冲液R的缓冲液混合物洗脱O-EPA生物缀合物。将洗脱物分成4份0.8CV的级分。当UV吸收以大于0.1AU/min的斜率增加时，开始收集洗脱级分。d-8-iii：通过SDS-PAGE分析单独的级分，并且通过考马斯染色进行染色(图3)。通过混合级分1-3产生“HIC汇集物”。
步骤e：精制AEX2色谱法
e-9：进行切向流过滤(TFF1)以调节用于精制步骤(即AEX2)的HIC洗脱物。HIC洗脱物通过TFF(mPES KrosFlo FilterModule Q，10kDa，1.25m2/165LHE，跨膜压力约0.8巴)用缓冲液T调节(稀释或浓缩)至OD280为1.35±0.15，并且用缓冲液T渗滤以达到5-6mS/cm的目标电导率。
e-10：如果HIC洗脱物的pH在随后的色谱法步骤之前需要额外调节，则使用缓冲液Y将pH降低至6.5±0.2的目标pH。在另外的步骤中，使用缓冲液V将电导率调节至8.7±0.3mS/cm。
e-11：然后使用Sartopore 2Capsule Size 0用具有0.45±0.2μm截留和0.45m2过滤器面积的PES膜过滤调节的HIC洗脱物。
e-12-i：精制AEX色谱法(AEX2)以结合-洗脱模式进行。柱(Source15Q，20cm床高，6.3L/165LHE)使用3CV缓冲液U平衡。将调节的HIC洗脱物施加于柱上，并且洗涤步骤使用1.5CV缓冲液U进行。在第二洗涤中，施加在缓冲液U中的15％-21％缓冲液V的线性梯度。
e-12-ii：首先使用3CV的在缓冲液U中的21％缓冲液V(阶梯梯度)，然后使用7.5CV的在缓冲液U中的21％-56％缓冲液V的线性梯度进行洗脱。在1.25CV洗脱开始后开始分级分离，并且随后收集20个0.4975CV的级分。
e-12-iii：通过SDS-PAGE分析单独的级分，并且通过考马斯染色进行染色(图4)。AEX2洗脱物汇集物通过将OD280至少为0.04AU的第一级分(在级分1-20之间)与随后的级分直到级分20混合而产生。在这种情况下，汇集级分6-20(参见图4)。在本实施例中，获得纯度为99.7％的O25B-EPA生物缀合物，如通过SE-HPLC所测量(图5)。
步骤f：调节至药学上可接受的缓冲液和浓度
f-13：使用缓冲液W将AEX2洗脱物的pH调节至6.5±0.2的目标pH。
f-14：应用第二TFF(mPES KrosFlo Filter Module Q，10kDa，1.25m2/165LHE)，使用包含6.19mM KH2PO4、3.81mM Na2HPO4、5％(w/w)山梨糖醇、10mM甲硫氨酸、0.02％(w/w)聚山梨醇酯-80，pH 7.0的赋形剂缓冲液(缓冲液XV2)，以获得以OD280＝0.5±0.1浓度的O-EPA生物缀合物。然后用赋形剂缓冲液以5-6渗滤体积渗滤调节的AEX2洗脱物，并且然后浓缩至OD280＝1.40±0.15的目标浓度。然后，将聚山梨醇酯-80(吐温-80)以0.02％(w/w)的浓度添加到赋形剂缓冲液中，以获得在药学上可接受的缓冲液(吐温调节的缓冲液XV2)中的O25B-EPA缀合物，所述缓冲液含有6.19mM KH2PO4、3.81mM Na2HPO4、5％(w/w)山梨糖醇、10mM甲硫氨酸、0.02％(w/w)聚山梨醇酯-80，pH 7.0(参见例如WO 2018/077853)。
f-15：使用具有PES膜(0.45+0.2μm截留和0.2m2过滤器面积)的Sartopore2Capsule Size 9施加生物负荷过滤。
f-16：将所得产物(药物物质)装入瓶(药物原料药)中并在初级冷冻器中在-70℃+/-10℃下冷冻。72小时后，将DS瓶从初级冷冻器中移出，并直接放入-70℃±10℃的最终储存冷冻器中，其间不允许DS的任何解冻。
在本实施例中，获得O25B-EPA生物缀合物，纯度为99.7％，并且产率为27mg PS/LHE，对应于约28％的估计总产率(相对于上述步骤a-2的FPF中存在的O-EPA缀合物)。
使用如上所述的相同方法纯化一大系列的生物缀合物。特别地，对于大肠杆菌血清型O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75，纯化O-EPA生物缀合物。这些中的每一种的纯度典型地为至少96％，并且在大多数情况下纯度为98％-100％。所述方法的估计总产率因每个菌株而异，并且尤其取决于起始表达水平，并且在约5％-30％之间变化，平均值为约18％。这表明本发明的DSP0方法广泛适用于各种不同的O-EPA缀合物，并且适合于经济地大规模生产任何O-EPA缀合物至非常高的纯度，这足以将O-EPA缀合物施用于人类。
步骤g：合并纯化的O-EPA生物缀合物药物物质以获得多价药物产品
将来自大肠杆菌O-血清型O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75的O-EPA生物缀合物的纯化药物物质以等量(以每种缀合物的多糖重量计)混合，以获得10价药物产物(参见例如WO2020/191082)，其适用于人类。
实施例2：这是ExPEC O-EPA生物缀合物的3柱生产方法的实例。
在本实施例中，O-EPA生物缀合物如实施例1中所述制备，但是省略步骤d)，即HIC色谱法步骤。在本实施例中，获得纯度为88.3％的O25B-EPA生物缀合物，如通过SE-HPLC所测量。因此，省略HIC色谱法步骤的3-柱方法产生与省略最终AEX2步骤的3-柱方法类似的产率和纯度(参见图5)
表2.缓冲液
/>
SEQ ID NO:1(EPA载体蛋白，其包括4个N-连接的糖基化共有序列)
SEQ ID NO:2(EPA载体蛋白的实例信号序列)
MKKIWLALAG LVLAFSASA

Claims (16)

1.一种用于生产纯化的O-多糖-胞外蛋白A载体(O-EPA)缀合物的方法，
其中所述生产方法包括提供所述O-EPA缀合物作为从原核宿主细胞获得的生物缀合物，
其中所述生产方法包括纯化所述O-EPA缀合物，其包括以下步骤：
·提供表达所述生物缀合物的原核宿主细胞的周质级分，
·对所述周质级分进行第一阴离子交换色谱法(AEX1)，随后
·羟基磷灰石色谱法(HA)，随后
·疏水相互作用色谱法(HIC)，以及随后
·第二阴离子交换色谱法(AEX2)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化不包括尺寸排阻色谱法(SEC)步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述纯化不包括额外的色谱法步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括在体积在100L与20000L之间、优选体积在150L与5000L之间的生物反应器中孵育原核宿主细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生产方法包括以下步骤：
a)提供包含所述O-EPA缀合物的原核宿主细胞的过滤的周质级分，
b)对所述过滤的周质级分的任选调节负载进行第一阴离子交换色谱法(AEX 1)步骤以获得第一AEX洗脱物(AEX1)，以及
c)对步骤(b)中获得的所述AEX1洗脱物的调节负载进行羟基磷灰石色谱法(HA)步骤，以获得HA洗脱物，以及
d)对步骤(c)中获得的所述HA洗脱物的调节负载进行疏水相互作用色谱法(HIC)步骤，以获得HIC洗脱物，以及
e)对步骤(d)中获得的所述HIC洗脱物的调节负载进行第二阴离子交换色谱法(AEX2)步骤，以获得作为产物的第二AEX洗脱物，以及
其中在纯化步骤b)至e)中，首先调节条件以允许所述O-EPA缀合物与色谱法介质结合，并且随后调节所述条件以允许所述O-EPA缀合物从所述介质中洗脱。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述O-多糖对选自埃希氏杆菌属和志贺氏菌属的列表中的革兰氏阴性细菌，优选大肠杆菌是特异的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中从其中获得所述O-EPA缀合物的所述原核宿主细胞包含编码O-多糖和重组胞外蛋白A(EPA)的遗传信息，以及用所述O-多糖对所述EPA进行N-糖基化的代谢装置，从而在所述原核宿主细胞的周质中体内产生所述O-EPA缀合物。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中步骤b)包括以下子步骤：
b-1)任选地调节适合于结合AEX1介质的所述过滤的周质级分的负载的电导率，
b-2-i)使所述过滤的周质级分的任选调节负载与所述AEX1介质接触，
b-2-ii)洗脱所述O-EPA缀合物，
b-2-iii)任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得AEX1洗脱物。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中步骤c)包括以下子步骤：
c-3)调节适合于结合HA介质的所述AEX1洗脱物的负载的pH和电导率，
c-4)任选地进行颗粒减少过滤1，
c-5-i)使所述调节的AEX1洗脱物与所述HA介质接触，
c-5-ii)洗脱所述O-EPA缀合物，
c-5-iii)任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得HA洗脱物。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中步骤d)包括以下子步骤：
d-6)调节所述HA或cHA洗脱物的负载的电导率，
d-7)任选地进行颗粒减少过滤2，
d-8-i)使所述调节的HA或cHA洗脱物与所述HIC介质接触，
d-8-ii)洗脱所述O-EPA缀合物，
d-8-iii)任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得HIC洗脱物。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中步骤e)包括以下子步骤：
e-9)对所述HIC洗脱物的负载进行切向流过滤1，以降低电导率并调整O-EPA缀合物的浓度，
e-10)调节适合于结合AEX2介质的所述过滤的HIC洗脱物的负载的pH和电导率，
e-11)任选地进行颗粒减少过滤2，
e-12-i)使所述过滤的HIC洗脱物的任选调节负载与所述AEX2介质接触，
e-12-ii)洗脱所述O-EPA缀合物，
e-12-iii)任选地汇集具有富集的O-EPA缀合物内含物的级分，以获得作为产物的AEX2洗脱物。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中在额外的步骤f)中，将所述AEX2洗脱物的负载调节到药学上可接受的缓冲液和浓度，从而获得作为药学药物物质的纯化的O-EPA缀合物，
其中任选地步骤f)包括以下子步骤：
f-13)调节适合于切向流过滤2(TFF2)的所述AEX2洗脱物的负载的pH，
f-14)对所述调节的AEX2洗脱物进行TFF2，以改变为所述O-EPA缀合物的药学上可接受的缓冲液和浓度，
f-15)对所述纯化的O-EPA缀合物进行生物负荷过滤，以获得纯化的O-EPA缀合物药物物质，
f-16)将所述纯化的O-EPA缀合物分份并冷冻。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的方法，其中在额外的步骤g)中，将几种纯化的O-EPA缀合物药物物质合并，从而获得多价药物产品，
其中任选地在步骤g)中，所述多价药物产品包含至少四种、优选至少八种选自包括大肠杆菌O-血清型O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75的列表的O-多糖。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中在步骤(e)期间，使所述O-EPA缀合物与AEX2基质结合，并通过阶梯梯度、随后是递增盐浓度的线性梯度洗脱，以获得纯度为至少90％、优选至少95％的O-EPA缀合物。
15.根据权利要求5至14中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括：
a-1)在体积在100L与20000L之间、例如150L至5000L的生物反应器中在34℃与36℃之间的温度下孵育原核宿主细胞以使其生长直至达到收获前的稳定期；
随后收获所述原核宿主细胞，
其中收获包括连续流离心步骤以获得在所述周质中包含O-EPA缀合物的收获的原核宿主细胞。
16.根据权利要求5至15中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括：
a-2)渗透休克处理所述原核宿主细胞，从而获得包含O-EPA缀合物的原核宿主细胞的周质级分。
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