FI97058C - Menetelmä soluissa tuotettavan HIV:n glykoproteiinin GP 160 eristämiseksi ja puhdistamiseksi - Google Patents

Description

97058

Menetelmä soluissa tuotettavan HIV:n glykoproteiinin GP 160 eristämiseksi ja puhdistamiseksi

Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta 885629 5 Keksintö koskee menetelmää soluissa tuotettavan HIV:n glykoproteiinin eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Kaikki fysiologisesti aktiiviset solut tuottavat proteiineja, joita ne tarvitsevat kulloistenkin elintoimintojensa ylläpitämiseksi. Syntetisoiduilla proteiineilla 10 on erilaisia tehtäviä. Jotkut toimivat entsyymeinä, ts. ne katalysoivat solussa aineenvaihduntareaktioita. Joidenkin tehtävänä on organismin, johon solu kuuluu, elintoimintojen yhteenvirittäminen, ja jotkut muodostavat solun rakenteen. Proteiinit, joita tuotetaan näissä soluissa, voivat 15 kuitenkin vaikuttaa antigeenisesti muihin organismeihin, ts. ne indusoivat näissä organismeissa immuunireaktioita. Myös virukset ovat eliöitä, jotka sisältävät esimerkiksi vaipassaan proteiineja, jotka voivat toimia antigeeneinä.

Proteiinisynteesin "ohjeet" ovat solujen geeneissä, 20 joita voidaan pitää perinnöllisen aineksen toiminallisina yksikköinä. Nykvään hallitaan hyvin menetelmä solun, esimerkiksi bakteerin, genomin muuttamiseksi, jolloin siirretään geeni esimerkiksi eläin- tai ihmissolusta toiseen soluun, joka usein on bakteerisolu. Bakteeri tuottaa sit-25 ten myös proteiinia, jota vastaavan informaation vieras lisätty geeni sisältää. Eräs tunnetuimmista esimerkeistä on ihmisen haiman tuottama insuliini, jota vastaava geneettinen informaatio on siirretty Escherichia coli -bakteeriin.

30 Sekä luonnostaan että myös solujen geeniteknisen käsittelyn kautta tuotetut proteiinit joko erittyvät kasvualustaan tai kerääntyvät soluihin, ja ne eristetään sitten tunnetuin menetelmin solujen rikkomisen jälkeen ja liuotetaan mahdollisesti. Näissä menetelmissä käytetään 35 yleensä tiettyjen fraktiointi- ja puhdistusesivaiheiden 2 97058 jälkeen pinta-aktiivisia aineita, joiden täytyy olla sangen spesifisesti sopivia kulloinkin eristettäville ja puhdistettaville proteiineille. Ongelmana on edelleenkin oikeiden pinta-aktiivisten aineiden löytäminen haluttujen 5 proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

Tämän keksinnön päämääränä oli siten saada aikaan aineita ja menetelmiä, joiden avulla voidaan eristää ja puhdistaa fysiologisesti aktiivisten solujen tuottamia proteiineja ja säilyttää samalla proteiinien biologinen 10 aktiivisuus tai parantaa sitä.

Tähän päämäärään päästään tarjoamalla käyttöön proteiineja, jotka ovat pinta-aktiivisten aineiden poissa ollessa ensimmäisessä, suunnilleen pallomaisessa, mahdollisesti elektronioptisesti nähtävissä olevassa, aggregoi-15 tuneessa, elektroforeesissa liikkumattomassa muodossa I ja ensimmäisen, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen läsnä ollessa toisessa, löyhemmässä, elektronioptisesti mahdollisesti havaittavissa olevassa, aggregoituneessa, elektroforeesissa liikkumattomassa muodossa II ja toisen, ei-de-20 naturoivan pinta-aktiivisen aineen läsnä ollessa elektroforeesissa liikkuvassa muodossa III, joka ei ole nähtävissä elektronioptisesti, jolloin mainitut muodot I, II ja III ovat muutettavissa reversiibelisti toisikseen mainittujen pinta-aktiivisten aineiden läsnä- tai poissaolosta 25 riippuvalla tavalla.

Proteiinien eristysmenettelyjen yhteydessä on osoittautunut yllättävästi, että käytettäessä ei-denatu-roivia pinta-aktiivisia aineita amfifiiliset proteiinit eivät ole monomeerisessa muodossaan vaan aggregoituneissa 30 muodoissa, joilla on aivan yllättävän edullisia ominai suuksia. Ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen poissa ollessa on aggregoituneilla muodoilla tiivis rakenne, josta käytetään tässä nimitystä aggregoitunut muoto I. Tässä muodossa ollessaan hiukkaset soveltuvat parhaiten näiden 35 hiukkasten pinnoilla olevien epäpuhtauksien poistamiseen.

Il 3 97058

Hiukkasen tiivis muoto varmistaa tällöin tietyn suojan aktiivisten keskusten denaturoitumista vastaan, olivatpa nämä sitten entsymaattisesti aktiivisia keskuksia tai epi-tooppeja, jotka herättävät immuunireaktioita. Myös aggre-5 goituneessa muodossa I olevat tiiviit hiukkaset ovat kuitenkin biologisesti aktiivisia, joskin elektroforeettises-ti liikkumattomia.

Ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen läsnä ollessa voidaan aggregoituneiden proteiinien tiivis, pallo-10 mainen muoto I muuttaa enemmän tai vähemmän löyhentyneeksi muodoksi, jolla on eristys- ja puhdistusmenettelyjen edetessä se etu, että voidaan poistaa epäpuhtaudet, jotka tulevat helpommin saataville muodon I muuttuessa muodoksi II. Lisäksi proteiinien biologiset vaikutukset voimistuvat 15 yllättävästi aggregoituneiden proteiinien muodossa II. On esimerkiksi osoittautunut, että eristettyjen proteiinien immunogeenisyys kasvaa, jos eristetyn proteiinin biologinen ominaisuus on proteiinin immunisoiva antigeenisyys. Biologisesti aktiiviset proteiinit tai mahdollisesti myös 20 näiden proteiinien osat, jotka ovat biologisesti aktiivisia, ovat siten aktiivisia erityisesti laajennetussa muodossa ja soveltuvat tässä suunnilleen "pilvimäisessä" muodossa mainituista syistä erityisen hyvin proteiinien puhdistamiseen aineosista, jotka ovat aggregoituneissa muo-25 doissa sisälle suljettuja.

Aggregoituneessa muodossa II olevat proteiinit eivät myöskään liiku elektroforeesissa.

Erityisen yllättävää keksinnön mukaisten, hiukkas-maisten, aggregoituneiden proteiinien yhteydessä on se, 30 että aggregoituneet muodot I ja II ovat muutettavissa re-versiibelisti toisikseen ensimmäisen, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen poissa- ja läsnäolosta riippuvalla tavalla. Kuvattujen, hiukkasmaisten aggregoituneiden proteiinien myötä saadaan siten käytettäväksi aina tarkoituk-35 senmukainen kompleksi, jolla on näiden aggregaattien eri- 4 97058 laisten muotojen I ja II reversiibelin toisikseen muuttumisen ansiosta valtavia etuja helpottuneen puhdistusmenet-telyn, parantuneen säilyvyyden sekä eristettyjen proteiinien kohonneen biologisen tehon suhteen.

5 Kun käytetään toista, ei-denaturoivaa pinta-aktii vista ainetta, voidaan proteiinit muuttaa aggregoituneesta muodosta II proteiinien monomeeriseen muotoon III, jolloin myös tämä tila on täysin yllättävästi reversiibeli, kun toinen, ei-denaturoiva proteiini poistetaan.

10 Ei-denaturoivien pinta-aktiivisten aineiden poissa- tai läsnä olosta riippuvalla tavalla voidaan fysiologisesti aktiivisista soluista eristettävät proteiinit siten muuttaa tarkoituksellisesti ja säädeltävissä olevalla tavalla reversiibelisti kuhunkin haluttuun ja kulloinkin 15 päämääränä olevaan käsittelyvaiheen tai käyttötarkoituksen kannalta optimaaliseen muotoon.

Säilytyksen tai eristetyn proteiinin säädellyn, mahdollisesti toivotun vähentyneen biologisen aktiivisuuden kannalta on rakenteeltaan suunnilleen pallomainen agg-20 regoitunut muoto I edullinen. Pallomainen muoto suojaa lisäksi puhdistusvaiheissa mahdollisesti herkkiä aktiivisia keskuksia mahdollisesti denaturoivilta käsittelyiltä.

Aggregoituneella muodolla II on käsittelyn kestosta ja ei-denaturoivan entsyymin konsentraatiosta riippuen 25 suunnilleen pilvimäinen rakenne. Rakenteen avautumisas- teesta riippuvalla tavalla on jatkopuhdistusvaiheissa käsiteltävissä sellaisia proteiinien epäpuhtauksia, jotka voivat olla peräisin esimerkiksi proteiinien tuotantoon käytettävistä isäntäsoluista tai vektorijärjestelmistä. 30 Proteiinien biologinen aktiivisuus voimistuu.

Sekä pallomainen, aggregoitunut muoto I että suunnilleen pilvimäinen, aggregoitunut muoto II voidaan tehdä elektronioptisesti nähtävissä olevaksi, jos tuotettavan yksittäisen proteiinin molekyylimassa on vähintään 10 000 35 daltonia. Jos geenimanipuloinnin avulla tuotetaan kuiten- ti 5 97058 kin esimerkiksi vain tiettyjä antigeenideterminantteja, jotka ovat vain muutaman aminohapon sisältäviä proteiineja, saattavat myös aggregoituneet, useampia proteiineja sisältävät muodot I ja II olla elektronioptisen havaitta-5 vuusrajan alapuolella.

Muodoissa I ja II aggregoituneiden, elektroforeesissa liikkumattomien proteiinien puhtausaste on 80 %, edullisesti 98 %, ts. aggregoituneet muodot I ja II sisältävät haluttuja proteiineja suhteellisen homogeenisena 10 koostumuksena.

Proteiinien aggregoituminen tapahtuu solujen sisällä edullisesti silloin, kun proteiinit ovat geeniteknisesti käsiteltyjen solujen ilmentymistuotteita, erityisesti silloin, kun tuotteita tuotetaan tunnetuin menetelmin yli-15 määrin näissä soluissa. Ylituotanto voidaan saada aikaan joko sitä kautta, että läsnä on useampia vektoreita, jotka sisältävät haluttua proteiinia koodattavan geenin, tai siten että vastaavan geenin eteen kytketään erityisen voimakkaita promoottoreja. Jos tuotettujen proteiinien koh-20 dalla on kyse proteiineista, jotka ovat soluissa liuke nevia, ne aggregoituvat kuvatuiksi pallomaisiksi hiukkasiksi .

Geneettisesti käsiteltyjen isäntäsolujen tuottamat proteiinit toimivat edullisesti antigeenisesti. Nämä pro-25 teiinit ovat edullisia geeniteknisesti aikaansaatuja proteiinituotteita, jos on määrä saada aikaan eläviä rokotteita tai tarkoituksena on antigeeneillä aikaansaatava vastaava aktiivinen immunisointi. Tällöin on kyse erityisesti patogeenisten virusten vaippaproteiineista, jolloin 30 virukset voivat olla joko ihmisille tai eläimille patogeenisiä.

Eristetyt proteiinit ovat edullisesti glykoproteii-neja, esimerkiksi HIV:n glykoproteiini GP 160- tai hepatiitti B -viruksen pinta-angigeeni. Kyseessä olevia pro-35 teiineja vastaavat geenit voidaan saattaa ilmentymään ni- 6 97058 säkässolujärjestelmässä esimerkiksi lehmärokkovirusvekto-rin kautta. Mackett et ai. [J. Virol. 49 (1984) 857 - 846] kuvaavat menetelmää, jolla spesifisiä geenejä insertoidaan lehmärokkovirusvektoreihin. Vieras geeni insertoidaan en-5 sin sinänsä tunnetulla tavalla plasmidivektoriin lehmärok-koviruksen transskriptiota säätelevän elementin (7,5 K -promoottorin) jälkeen. Tätä kimeeristä geeniä reunustavat yhdistelmäplasmidissa lehmärokkovirussekvenssit, jotka koodittavat viruksen tymidiinikinaasigeeniä (TK). Plasmidi 10 viedään sitten soluihin, jotka on ennalta infektoitu villin tyypin lehmärokkoviruksella (kanta WR). Yhdistyminen tapahtuu tällöin TK-alueella, joka on homologinen sekä virus-DNA:lie että plasmidille ja mahdollistaa kimeerisen geenin insertion lehmärokkovirusgenomiin. Tällä tavalla 15 aikaansaadulla yhdistelmäviruksella on fenotyyppi TK", eikä se siten pysty enää tuottamaan tymidiinikinaasia, ja se kasvaa selektiivisessä alustassa, joka sisältää 5-bromide-oksiuridiinia. Tällä tavalla voidaan valmistaa yhdistelmä-lehmärokkoviruksia, jotka sisältävät kulloinkin geenejä, 20 jotka saavat aikaan proteiinien tuotannon, mahdollisesti ylimäärin, jotka sitten nisäkässoluissa kerääntyvät yhteen suojatuiksi, lukuisia yksittäisiä proteiineja sisältäviksi aggregoituneiksi muodoiksi. Muiden antigeenisten proteiinien yhteydessä tunnetaan samankaltaisia ilmentymisjärjes-. 25 telmiä. On esimerkiksi konstruoitu joitakin lehmärokkovi- rusyhdistelmiä, jotka koodittavat hepatiitti B -viruksen pinta-antigeenejä. Tämän aikaansaamiseksi tuotettiin hepatiitti B -viruksen pinta-antigeenejä lehmärokkoviruksen säätelymekanismien ohjauksessa, jolloin käytettiin joukkoa 30 lehmärokkovirusspesifisiä promoottoreja päämääränä vieraan geenin ilmentymistason kohottaminen. Lisäksi on valmistettu lehmärokkovirusyhdistelmiä, jotka sisältävät useamman kuin yhden hepatiitti B -virusgeenin.

Haluttujen proteiinien geenitekniseen tuottamiseen 35 tarkoitettujen yhdistelmäilmentymisjärjestelmien valmis- 7 97058 tuksen suhteen viitataan tässä yhteydessä yleisesti teokseen Winnacker, E. L., Gene und Klone, eine EinfUhrung in die Gentechnologie, VCH-Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim 1984.

5 Mainituissa soluissa tuotettujen proteiinien, jotka voivat olla aggregoituneissa, useita proteiineja sisältävissä muodoissa, biologinen tehtävä voi edullisesti olla entsymaattinen toiminta. Erityisesti aggregoituneessa muodossa II havaitaan voimistunut entsymaattinen toiminta, 10 joka voi liittyä siihen, että entsymaattisesti aktiiviset keskukset ovat avautuneessa aggregoituneessa muodossa II vapaina ja kaikki entsymaattisesti aktiiviset proteiinit ovat kuitenkin kolmiulotteisesti yhteydessä keskenään, niin että mainittujen proteiinien entsyymiaktiivisuuden 15 kautta reagoivien proteiinien ja entsymaattisesti aktiivisten alueiden kohtaamistodennäköisyys kasvaa.

Entsymaattinen proteiini on edullisesti veren hyytymistekijä Vili. Alan kirjallisuudessa on kuvattu useaan kertaan F VIII:n geeniteknistä valmistusta. Hiukkasmaiseen 20 muotoon kerääntyneet proteiinit voidaan edullisesti sitoa toiseen aineeseen, erityisesti suurimolekyyliseen proteiiniin, konjugaation kautta, jolloin saadaan aikaan proteiinien stabiiliuden, aktiivisuuden, in vivo -talteenoton ja biologisen puoliintumisajan paraneminen. Eräs esimerkki 25 tällaisesta haluttujen proteiinien konjugoinnista muiden « suurimolekyylisten aineiden kanssa on veren hyytymistekijän VIII kytkeminen von Willebrans -tekijään.

Hiukkasmaiset aggregoituneet proteiinit ovat edullisesti eukaryoottisoluissa, erityisesti eläin- tai ihmis- 30 soluissa.

Haluttuja proteiineja tuotetaan tällöin erityisen edullisesti primaarisissa soluviljelmissä tai solulinjois-ta talteenotetuissa verosoluissa, CHO-soluissa tai primaarisissa kananalkiofibroblastisoluissa. Mainitut isäntäso-35 lut ovat edullisia ilmentymisjärjestelminä, koska niissä „ 97058 translaatiota seuraavat muuntamiset tapahtuvat käytettävien lopputuotteiden kannalta toivottavalla tavalla, kuten esimerkiksi ilmentymistuoteproteiinien glykosylaatio. Nämä glykosyloituneet proteiinit kerääntyvät sitten yhteen 5 hiukkasmaiseen muotoon, jotka muodot voivat olla kuvattuja pallomaisia muotoja I tai pilvimäisiä muotoja II ensimmäisellä, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella aineella tehdyn käsittelyn jälkeen ja muuttua toisella, ei-denaturoidulla pinta-aktiivisella aineella tehdyn käsittelyn jäl-10 keen kolmanneksi aggregoituneeksi muodoksi III.

Verosolut ovat erityisen edullisia edellä kuvatun HIV-glykoproteiinin 160 valmistukseen. Tämä solujärjestel-mä valittiin, koska sillä on suhteellisen suuri kasvunopeus ja se on valmiiksi hyvin soveltuva ihmisrokotteiden 15 valmistukseen. Verosolujen infektointi yhdistelmälehmärok- koviruksella, joka sisältää haluttua, tämän keksinnön mukaisella menetelmällä eristettävää proteiinia koodattavan geenin, johtaa halutun proteiinin normaaliin synteesiin, sen glykosyloitumiseen sekä mahdollisiin jatkokäsittely-20 vaiheisiin. Käyttämällä kaksoisinfektointijärjestelmää, jossa on kaksi yhdistelmää, voidaan halutun proteiinin määrää nostaa huomattavasti. Tämä järjestelmä sisältää yhdistelmän, joka saa aikaan T7-faagin polymeraasin tuotannon lehmärokkoviruksen P7.5-promoottorin ohjauksessa. 25 Tätä yhdistelmää käytetään infektointiin yhdessä yhdistelmän kanssa, joka sisältää HIV:n T7-promoottorin ja glyko-proteiini 160 -geenin. T7-promoottori on sangen voimakas promoottori ja varmistaa korkean iImentyrnistason, esimerkiksi noin 10-kertaisen määrän haluttua proteiinia.

30 Kuvattuja järjestelmiä on pidettävä edullisina jär jestelminä. Yleiskatsaus moniin mahdollisuuksiin käyttää tiettyjä vektoreita haluttujen geenien yhdistämiseen, lisätä näitä vektoreita halutuissa soluissa ja valmistaa vieraiden geenien koodittamia proteiineja esitetään esim. 35 teoksissa Genetic Engineering 3, toim. Robert Williamson, 9 97058

Academic Press 1982 ja Spektrum der Wissenschaft, Indus-trielle Mikrobiologie 1985.

Ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine, joiden läsnä-tai poissaolo vaikuttaa oleellisesti fysiologisesti aktii-5 visista soluista eristettyjen proteiinien esiintymiseen keskenään erilaisissa aggregoituneissa muodoissa tai mono-meerimuodossa, on edullisesti tietty ioninen, ioniton tai kahtaisioninen pinta-aktiivinen aine. Proteiinikemiassa tai proteiinien puhdistusmenettelyissä on tunnettuna on-10 gelmana se, että pinta-aktiivisen aineen valinta halutun proteiinin talteenottamiseksi toisaalta hyvin puhtaassa muodossa ja toisaalta biologisesti aktiivisessa tilassa on aina jonkinlainen haaste. Nyt on yllättävästi käynyt ilmi, että käyttämällä ei-denaturoivia pinta-aktiivisia aineita, 15 joilla on tietty ioninen, ioniton tai kahtaisioninen luonne, voidaan täyttää täysin edellä mainitut proteiinien puhdistusmenetelmälle asetetut vaatimukset, jolloin yhteen kerääntyneiden proteiinien, joita esiintyy näissä proteiineja tuottavissa soluissa, odottamattomat konfiguraatio-20 muutokset lisäksi täyttävät mainitut vaatimukset yllättävän optimaalisesti. Kuten edellä mainittiin, erityisesti aggregoituneessa muodossa II, avautuneessa eli pilvimäi-sessä konfiguraatiossa, voimistuu yksittäisen proteiinin sisältämä biologinen aktiivisuus selvästi, olipa se sitten . 25 luonteeltaan entsymaattinen tai antigeeninen.

Eräs edullinen ioniton pinta-aktiivinen aine on oktyyliglukosidi tai tämän pinta-aktiviisen aineen johdannainen edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %.

30 Samoin on edullista käyttää pinta-aktiivisena ai neena sappihapon suolaa samoin kuin sen johdannaista, edullisesti pinta-aktiivista deoksikolaattia (DOC), joka on erityisen sopiva useiden HIV-glykoproteiinien 160 muodostaman pallomaisen konfiguraation eristämisen ja puhdis-35 tamisen yhteydessä, jos tämä proteiini sekä puhdistetaan 10 97058 käyttämällä mainittua pinta-aktiivista ainetta pitoisuutena 0,25 - 5 %, edullisesti 1 %, että käytetään deoksiko-laattia GP 160:n käytön yhteydessä, esimerkiksi yhdistettynä alumiinihydroksidiin.

5 Ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine, jota käyte tään edullisesti aggregoituneiden proteiinien muuttamiseen muodossa II monomeeriseen muotoon III, on ZwittergentR-sar-jaan kuuluva kahtaisioninen pinta-aktiivinen aine samoin pitoisuutena 0,25 - 5 %, edullisesti 1 %. ZwittergentR-sar-10 jän pinta-aktiiviset aineet ovat kahtaisionisia pinta-ak-tiivisia aineita, jotka ovat tulleet tunnetuiksi sulfobe-taiineina ja joilla on seuraava yleinen rakennekaava: + ch2 o 15 CnH2n-fl-“-<CH2»2-S-°' 6

Aggregoituneessa muodossa I olevat proteiinit sopivat, kuten edellä mainittiin, erityisen hyvin proteiinien 20 säilyttämiseen stabiileina. Niitä voidaan kuitenkin käyttää myös haluttuihin biokemiallisiin muuttamisiin tai reaktioihin, koska myös aggregoituneeseen muotoon I kerääntyneet proteiinit ovat biologisesti aktiivisia.

Aggregoituneessa muodossa II olevia proteiineja . 25 käytetään edullisesti proteiinien biologisen vaikutuksen voimistamiseen.

Proteiinien kukin aggregoitunut muoto soveltuu terapeuttiseen, profylaktiseen tai diagnostiseen käyttöön sekä kuvatuissa pallomaisissa, pilvimäisissä tai monomee-30 risissa muodoissa että edellä kuvatuissa muiden suurimole-kyylisten proteiinien kanssa kytketyissä muodoissa.

Eräs aggregoituneiden proteiinien lisäkäyttö on substituutiokäsittely, rokotusaineiden tai monoklonaalis-ten vasta-aineiden talteenotto sekä aineiden talteenotto

II

11 97058 tällaisten aineiden osoittamiseksi kvalitatiivisesti ja määrittämiseksi kvantitatiivisesti elimistönesteistä.

Joukosta proteiineja koostuvien hiukkasten lisäksi, jotka ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen läsnä- tai 5 poissaolon mukaan voivat olla muodoltaan erilaisissa kon-figuraatioissa, jotka voivat muuttua reversiibelisti toisikseen, tämä keksintö koskee myös menetelmää haluttujen proteiinien, joita tuotetaan soluissa, edullisesti geeniteknisesti käsitellyissä soluissa, eristämiseksi ja puh-10 distamiseksi, jolloin ensimmäisessä puhdistusvaiheessa ensimmäisessä aggregoituneessa muodossa olevista proteiineista poistetaan pinnalla olevat epäpuhtaudet, muutetaan sitten proteiinit käyttämällä ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta toiseen aggregoituneeseen muotoon II ja 15 poistetaan toisessa puhdistusvaiheessa tässä aggregoituneessa muodossa II saavutettavissa olevat epäpuhtaudet, ja proteiinit ovat muutettavissa monomeeriseen muotoon III lisäämällä toista ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta ja reversiibelisti takaisin aggregoituneeseen muotoon I 20 tai II poistamalla ei-denaturoivat pinta-aktiiviset aineet.

Tämän menetelmän valtavia etuja on käsitelty jo edellä olennaisilta osiltaan ja ne perustuvat siihen, että proteiinien erilaiset aggregoituneet muodot ovat reversii-. 25 belisti muutettavissa toisikseen.

Suurin piirtein pallomainen muoto I mahdollistaa proteiinien tiiviin järjestymisen ansiosta esimerkiksi kasvualustan aineosien helpomman poistamisen pallomaisen proteiinikerääntymän pinnalta. Kun sen jälkeen on toteu-30 tettu toinen puhdistusvaihe, jossa poistetaan epäpuhtaudet, jotka ovat aggregoituneessa muodossa II avautumisen ansiosta erityisen helposti saavutettavissa, voidaan valmistaa reversiibelisti takaisin aggregoitunut muoto I poistamalla ei-denaturoiva reagenssi, jossa muodossa esi-35 merkiksi proteiinien aktiiviset keskukset ovat erityisen 12 97058 hyvin suojattuina pallomaisen proteiinimuodostelman sisällä, niin että proteiineja voidaan erityisen hyvin säilyttää aggregoituneessa muodossa I. Aggregoituneella muodolla II on, kuten jo mainittiin, niiden etujen lisäksi, jotka 5 liittyvät tuotteen helpompaan puhdistamiseen isäntäsolun, jossa proteiini on tuotettu, rakenneosista tai vektoreista, jotka sisältävät eristettyä proteiinia koodittavan geenin, se lisäetu, että proteiinien biologista aktiivisuutta voidaan voimistaa oleellisesti useiden aktiivisten 10 keskusten ollessa kolmiulotteisesti lähellä toisiaan proteiinien aggregoituneen tilan ansiosta.

Kulloisenkin koejärjestelyn mukaan poistetaan solut tai solukalvot sentrifugoimalla ja uutetaan ne puskuri-liuoksella, joka sisältää ei-denaturoivaa pinta-aktiivista 15 ainetta sekä proteaasi-inhibiittorijärjestelmää tai, jos haluttu suurimolekyylinen aine siirtyy soluista superna-tanttiin, lisätään tähän supernatanttiin ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta ja proteaasi-inhibiittorijärjestelmää, jolloin ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine on 20 esimerkiksi deoksikolaatti (DOC) ja sitä käytetään pitoisuutena noin 0,25 - 5 %, edullisesti kuitenkin 1 %.

Jos eristettävä ja puhdistettava aine on glykopro-teiini, konsentroidaan siten saadut liuokset lektiineillä, jotka on immobiloisoitu kiinteään matriisiin, ja erotetaan 25 hiilihydraattia sisältämättömät epäpuhtaudet. Käytettä vällä, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella aineella on tässä vaiheessa sen ominaisuuden lisäksi, että se muuttaa aineen muotoon II, myös kyky estää epäspesifinen adsorptio. Eluointi tehdään glykosideilla.

30 Toinen edullinen puhdistusvaihe voidaan toteuttaa sitomalla esipuhdistettu, suurimolekyylinen aine spesifisesti immuuniadsorbtiopylväälle. Kun on tehty riittävä pesu puskurilla, tehdään eluointi kaotrooppisella aineella, esimerkiksi urealla tai KSCN:lla (2-8, edullisesti 35 3 mol/1). Tekemällä sen jälkeen dialyysi puskuria vastaan tl 13 97058 päästään takaisin hiukkasmaiseen muotoon I. Tarvittaessa suurimolekyylinen aine muutetaan tietyllä kahtaisionisella pinta-aktiivisella aineella monomeeriseen muotoon III ja puhdistetaan ioninvaihtokromatografisesti. Dialysoimalla 5 pinta-aktiivista ainetta sisältämätöntä puskuria vastaan saadaan monomeerisesta muodosta lii jälleen aggregoitunei-ta muotoja II ja I.

Kuvattujen solujen tuottamien proteiinien erilaiset aggregoituneet muodot voidaan tehdä elektronimikroskopias-10 sa nähtävissä oleviksi.

Keksintöä valaistaan seuraavassa yksityiskohtaisesti kuvin ja esimerkein.

Kuvio 1 on elektronimikroskooppikuva glykoproteii-nista 160 tris-puskurissa, suurennus 278 640-kertainen. 15 Proteiinit ovat tiiviissä, pallomaisessa aggregoituneessa muodossa I.

Kuvio 2 on elektronimikroskooppikuva HIV-glykopro-teiinista 160 puskurissa, joka sisältää 1 %:n DOC:tä. Proteiinit ovat avoimessa, pilvimäisessä aggregoituneessa 20 muodossa II.

Esimerkki 1 HIV-glykoproteiinin 160 eristys ja puhdistus HIV-glykoproteiinin 160 eristys ja puhdistus tehdään seuraavan ohjelman mukaisesti: 25 1. Geeniteknisesti käsitellyt verosolut, jotka tuottavat XIV-glykoproteiinia 160, sentrifugoidaan tiheyden ollessa haluttu.

2. Sentrifugoimalla saatu pelletti suspendoidaan uudelleen TBS-puskuriin (pH 7,4), joka sisältää 1 mmol/1 30 CuS04:a ja 0,5 mmol/1 ZnCl2:a.

3. Uudelleen suspendoitu pelletti uutetaan 50 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 8,3), joka sisältää 1 %:n D0C:tä, 1 mmol/1 CuS04:a ja 0,5 mM ZnCl2:a. Suspensio kirkastetaan sentrifugoimalla 30 minuuttia lämpötilassa 25 eC.

14 97058 4. Supernatantille tehdään linssilektiinikromato-grafia, jossa halutut proteiinit adsorboidaan pylväälle ja pestään DOC-puskurilla. Proteiinit eluoidaan 5 % metyyli-glykosidia sisältävällä pesupuskurilla.

5 5. Lektiinipylväästä tullut eluaatti laimennetaan

Tween-puskurilla. Sen jälkeen tehdään absorbointi immuu-niaffiniteettikromatografiapylväälle, joka pestään TBS-Tween-puskurilla ja sen jälkeen TBS:llä. Tehdään käsittely DNA:ta ja RNA:ta pilkkovilla entsyymeillä. Eluoidaan 3 M 10 KSCN-liuoksella ja dialysoidaan pinta-aktiivisia aineita sisältämätöntä puskuria vastaan.

6. Dialysoituun eluaattiin lisätään pitoisuudeksi 1 % Zwittergentiä ja pitoisuudeksi 5 % betaiinia ja tehdään adsorbointi anioninvaihtimena toimivalle mono-Q-mat- 15 riisille, eluoidaan KSCN-gradientilla ja dialysoidaan puskuria vastaan.

7. Tehdään toinen linssilektiinikromatografia absorboimalla ja pesemällä pinta-aktiivisia aineita sisältämättömällä puskurilla. Eluointi tehdään 5-%:isella metyy- 20 liglykosidiliuoksella, minkä jälkeen tehdään dialyysi TBS:ää vastaan. Tällä menettelyvaiheella saadaan aikaan proteiinin konsentrointi.

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukaisella menettelyllä puhdistetulle 25 HIV:n glykoproteiinille (GP) 160 tehtiin tehokkuustesti, joka osoittaa sekä tiiviissä, pallomaisessa muodossa I että avautuneessa, pilvimäisessä muodossa II olevan glyko-proteiini 160:n immunogeenisen tehon.

Kutakin rokotetta kohden tehtiin 5 laimennosta, 30 jotka sisälsivät 10 pg, 2,5 pg, 0,625 pg, 0,158 pg ja 0,04 pg GP 160/ml. Kullakin laimennoksella immunisoitiin ihonalaisesti 10 BALBc-hiirtä; kutakin rokotelajia varten tarvittiin siten 50 eläintä. Tässä kokeessa testattiin neljää erilaista adsorptiomenetelmää.

15 97058 1. GP 160 + 0,2 % Al(OH)3 2. [GP 160 + 0,25 % DOC] + 0,2 % Al(OH)3 3. [GP 160 + 0,25 % DOC] + [0,2 % Al(OH)3 + 0,25 % DOC] 5 4. [GP 160 + 0,25 % DOC] + [0,2 % Al(OH)3 + pesty)]

Kaikki eläimet immunisoitiin ihonalaisesti 1 ml:11a liuosta. Kunkin yksittäisen eläimen seerumista tutkittiin Anti-HIV ELISA:n (SORIN) avulla GP 160 -vasta-aineiden läsnäolo ja laskettiin kullekin rokotelajille GP 160:n 10 ED50-arvo reagoivissa eläimissä tunnetulla Spearman-Kaerber-menetelmällä.

Tulokset 1. I - V 10 pg GP 160/ml + 0,2 % Al(0H)3 -_ Reagoineita Pitoisuus

J. D

eläimiä korkeintaan I väkevä 1 100 II 1:4 1 10 III 1:16 0 / 20 IV 1:64 1 10 V 1:256 1 10 ED5Q: 10 pg/ml GP 160 2. VI - X 10 pg (GP 160/ml + DOC + 0,2 % Ai(OH)3 25 Reagoineita Pitoisuus • - eläimiä korkeintaan VI väkevä 7 1000 VII 1:4 5 200 VIII 1:16 1 10 30 IX 1:64 0 / X 1:256 0 / ED5q: 3,3 pg/ml GP 160 16 97058 3. XI - XV 10 /ig GP 160/ml + DOC + DOC-Al(OH)3

Reagoineita Pitoisuus eläimiä korkeintaan XI väkevä 7 800 5 XII 1:4 5 1000 XIII 1:16 6 100 XIV 1:64 2 100 XV 1:256 1 100 ED50: 1,03/jg/ml GP 160 10 4. XVI - XX 10 μg GP 160/ml + DOC + Al(OH)3

Reagoineita Pitoisuus eläimiä korkeintaan XVI väkevä 0 / 15 XVII 1:4 1 10 XVIII 1:16 0 / XIX 1:64 0 / XX 1:256 0 / ED™: 10 ug/ml GP 160 20 HIV-glykoproteiinin 160 tehokkuustestin tulokset osoittavat glykoproteiini 160:n immunogeenisyyden vaihtelun aggregoituneen muodon mukaan. ED50-arvo, joka osoittaa sen määrän käytettyä ainetta, johon 50 % rokotetuista 25 eläimistä reagoi, pienenee huomattavasti, jos pinta-aktiivista ainetta DOC on läsnä. Pinta-aktiivisen DOC:n ollessa läsnä on glykoproteiini 160 aggregoituneessa muodossa II, jossa antigeeniset epitoopit ovat toisaalta vapaina ja toisaalta kuitenkin kolmiulotteisesti yhdessä, niin että 30 tuloksena on voimistunut immuunivaste.

Keksintöä on valaistu käyttämällä esimerkkinä glykoproteiini 160:ta. Se ei kuitenkaan rajoitu millään tavoin tähän proteiiniin.

Claims (6)

97058

1. Menetelmä soluissa tuotettavan terapeuttisesti käyttökelpoisen HIV:n glykoproteiinin GP 160:n eristämisek- 5 si ja puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että ensimmäisessä puhdistusvaiheessa ensimmäisessä aggregoituneessa muodossa I olevasta GP 160:stä poistetaan pinnalla olevat epäpuhtaudet sinänsä tunnetulla tavalla, muutetaan GP 160 sitten käyttämällä ei-denaturoituvaa pinta-aktiivista ai-10 netta, joka on oktyyliglukosidia tai sen johdannaista, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 % tai sappihapon suola tai sen johdannainen, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 % toiseen aggregoituneeseen muotoon II ja poistetaan toisessa puhdistusvaiheessa tässä aggregoituneessa muodossa II saa-15 vutettavissa olevat epäpuhtaudet sinänsä tunnetulla tavalla, ja mahdollisesti GP 160 muutetaan monomeeriseen muotoon III lisäämällä toista, ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta, joka on Zwittergent®-sarjän ainetta, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, joka muoto voidaan reversiibelisti 20 taas muuttaa aggregoituneeseen muotoon I tai II poistamalla mainitut ei-denaturoivat pinta-aktiiviset aineet vastaavasti .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GP 160 on geeniteknisesti muo- 25 kettujen solujen, erityisesti proteiineja ylimäärin tuottavien solujen, ilmentymistuote.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunne t t u siitä, että solut ovat eukaryoottisia, edullisesti eläin- tai ihmissoluja.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, : tunnettu siitä, että solut otetaan talteen primaa- risoluviljelmistä tai solulinjöistä ja ovat erityisesti Vero-soluja, CHO-soluja tai primaarisia kananalkiofibro-blastisoluja. 97058

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisenä, ionittomana pin-ta-aktiivisena aineena käytetään oktyyliglukosidia tai sen johdannaista, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityi- 5 sesti 1 %, ja toisena, kahtaisionisena pinta-aktiivisena aineena käytetään Zwittergent®-sarjan ainetta, edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pinta-aktiivinen aine on sap- 10 pihapon suola tai sen johdannainen, edullisesti deoksiko-laatti (DOC), edullisesti pitoisuutena 0,25 - 5 %, erityisesti 1 %. I! 19 97058