JPH10508479A - 天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生 - Google Patents
天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞による上記ペプチドの発現および分泌のための要素と、ペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域に少くとも1つの改変を有する点で天然ペプチド配列と異なるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする配列とを含んでなる核酸構築体により形質転換された細胞を培養して、そのペプチドおよび/またはその組換えペプチドを保有した細胞を回収することにより、少くとも1つの疎水性領域を有する天然ペプチドのアナログとして生物学的に活性な組換えペプチドを分泌させるための方法。得られた組換えペプチド、対応DNA配列およびそれを含有した細菌も開示されている。
Description
【発明の詳細な説明】
天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生
本発明は、天然ペプチドのアナログであって、これら天然ペプチドの生物活性
を留めている組換えペプチドに関する。これらのペプチドは異なるタイプの細胞
により発現させることができ、それらの産生は天然ペプチドの場合と比較して改
善されている。
ペプチドはアミノ酸の鎖、即ち、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパ
ク質から構成されるあらゆる物質を意味すると理解されている。
ペプチドは様々な生物学的性質を有しており、それらを生物学的産物から精製
するために用いられる技術に伴う混入の問題を特に避けるために遺伝子操作によ
りそれらを産生する強い要求があった。
しかしながら、組換え経路によるペプチドの産生は発現系および宿主細胞に伴
う難しい問題を有する。事実、それらの回収を容易にするためには、細胞外培地
、またはグラム陰性細菌の場合にはペリプラズムスペースでそれらを得る上で、
細胞膜を通してペプチドが分泌されることが望ましい。膜につないだ配列に融合
された形でペプチドを発現させられる系は、膜表面に共有結合された融合産物を
得られるように、細胞、特に細菌中に導入させることができる。
この理由から、出願人らは、RSVに対するワクチンを製造することと共に、
ポリペプチド配列をコードする遺伝子でヌクレオチドの部位特異的変異誘発によ
り点修飾を行うことができる組換えDNA方法を開発したが、その方法は特に呼
吸器多核体ウイルス(RSV)に対する経口ワクチンを得る上で有用である。
呼吸器多核体ウイルス(RSV)は新生児における呼吸病:気管支肺症(細気
管支炎)の最も多い原因である。WHOは毎年5千万件のRSV感染があって、
全世界で160,000人が死亡しているとみている。2つのサブグループのウ
イルスが存在している(サブグループAおよびB)。
RSVは Paramyxoviridae科 Pneumovirus属に分類され、10の特異的タンパ
ク質をコードする負極性の非セグメントRNAゲノムを有している。
現在、RSVに対するワクチンは入手できない。不活性化ウイルスワクチンは
無効であることが示され、時には乳幼児の感染症を悪化させることさえある。ホ
ルマリン不活性化RSVで予防接種する1960年代の試みは失敗に終わった:
RSVによる再感染から保護する代わりに、ワクチンは幼児で疾患を悪化させる
作用を有していた。
出願WO 87/04185は、タンパク質F(融合タンパク質)またはプロ
テインGと称されるエンベロープタンパク質、22Kdの糖タンパク質、9.5
Kdのタンパク質または主要キャプシドタンパク質(タンパク質N)のような、
ワクチン目的向けのRSV構造タンパク質の使用について提案した。
出願WO 89/02935は、適宜にモノマーまたは脱アセチル化形で修飾
された全体RSV Fタンパク質により有される保護性質について記載している
。
Fタンパク質の一連の断片は、それらの中和性質を確かめる目的でクローニン
グされた。
しかしながら、今まで試験されてきた免疫ワクチンは無効であることがわかっ
たか、または肺の症状(細気管支炎または気管支周囲炎)を誘導した。
現時点において、RSVによる感染症の基本的治療法はない。
上気道のRSV感染症:治療は他のウイルス感染症の場合と同一の対症薬物療
法に本質的に基づいている。
下気道のRSV感染症:離乳していない幼児の場合、治療は適当な水分を維持
し、分泌物を吸引して、必要であれば酸素を与えることに基づいている。正の効
果は、インビトロでRSVに対して活性であるヌクレオチド、リバビリンで観察
された。
ワクチンの投与を容易にするために、経口で活性であり、良好な免疫を生じて
、副作用が減少した製品を利用できるようにすることが望ましい。
出願人らは、Escherichia coliおよびStaphylococcus xylosusで機能する、シ
ャトルベクターとも称される新規ベクター系を作った:そのベクターは分泌シグ
ナル配列Sと、Staphylococcus aureus タンパク質Aに由来する膜アンカー領域
XMを含んで、1以上の遺伝子が挿入できるクローニング部位をSとXMとの間
に有している。
ペプチドが膜から容易に通過させるために、分子の疎水性はある場合に改変さ
れねばならない。それにもかかわらず、これらの改変は産物の生物学的、特に免
疫学的な性質を変えてはならない。
この理由から、本発明は、アミノ酸配列が上記疎水性領域で少くとも1つの改
変により天然ペプチドの配列と異なるペプチドをコードし、かつそのペプチドが
細胞により発現および分泌されることを確実にする要素を含んだDNA構築体が
細胞中に導入される工程を含み、細胞が培養された後にそのペプチドおよび/ま
たはその組換えペプチドを保有した細胞が回収されることを特徴とする、少くと
も1つの疎水性領域を有した天然ペプチドのアナログである生物学的に活性な組
換えペプチドを産生するための方法に関する。
好ましくは、アミノ酸配列は1つの領域で少くとも改変されていて、そこは天
然ペプチドのトランスメンブレン領域とは異なっている。
改変は、ペプチドで関心ある生物学的活性にとり必須でなく、保存しておくべ
き領域で好ましくは行うべきである。
この方法では組換え産物を宿主細胞の膜から通過させる構造を改変するために
変えられた構造遺伝子に機能性分泌シグナル配列が連結されている組換えDNA
構築体を用いるが、オリジナル構造遺伝子の組換え産物はそれが同様の分泌シグ
ナル配列と連結されたときにこれを行えない;組換え産物の構造的修飾は、発現
組換え産物の宿主細胞で位置を変えながら遺伝子操作により行われるべきである
。
本発明の一面によれば、改変は組換え産物の疎水性を修正することに向けられ
ている。
したがって、本発明は、遺伝子の構造的改変によって天然ペプチドの配列の少
くとも1つの疎水性アミノ酸が非疎水性アミノ酸に代えられたペプチドに至る、
組換えペプチドを産生するための方法に関する。もう1つの態様において、少く
とも1つの疎水性アミノ酸は組換えペプチドにおいて天然ペプチドの配列から欠
失されている。
有利には、疎水性アミノ酸は下記群:トリプトファン、フェニルアラニン、プ
ロリン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから選択
される。
遺伝子の構造的改変は、ヌクレオチドを挿入するか、またはヌクレオチドを欠
失させることにより行える。
遺伝子の構造的改変が部位特異的変異誘発でヌクレオチドを置換することによ
り行われた構築体も、本発明に含まれる。
遺伝子の構造的改変は、組換え産物が膜つなぎ止め部分への共有結合により細
胞の膜表面で露出されるように、その位置を変えることであってもよい。
もう1つの態様において、遺伝子の構造的改変では組換え産物が培地中に分泌
されるようにその位置を変えることができる。
したがって、本発明は、組換えペプチドをコードしてそのペプチドの輸送と細
胞外へのその分泌を確実にするDNA配列と機能的に連結された分泌シグナル配
列を含んでいるDNA構築体にも関する。
もう1つの面によれば、本発明はDNA構築体が上記ペプチドをコードしてそ
のペプチドを宿主細胞の膜から輸送させて膜につなぎ止めるDNA配列と機能的
に連結されたシグナル配列を含むことを特徴とする方法に関する。
本発明は、本方法により得られる組換えペプチドにも関し、それらは天然ペプ
チドの疎水性領域における少くとも1つの改変により天然ペプチドと異なってい
ることを特徴とする。それらは宿主細胞の表面につなぎ止めることができる。こ
れらのペプチドはRSV構造タンパク質のアナログまたはこのようなタンパク質
の断片の中から特に選択され、更に詳しくは組換えペプチドは、RSVのプロテ
インGのアナログ、サブグループAまたはB、特にRSVプロテインGの残基1
30〜230であって、少くとも80%の相同性を示す配列を含んでなる。
プロテインGは、84〜90Kdの分子量を有して、メチオニンに乏しいRS
Vエンベロープ糖タンパク質である。プロテインGの配列はRSVのAおよびB
サブグループで異なり、本出願で用いられるとき、“プロテインGの配列”とい
う用語は、他で指摘されないかぎり、サブグループA配列またはサブグループB
配列の一方および双方であると理解されている。
出願人は、天然Gタンパク質のアミノ酸130〜230間に包含された配列が
、全ホルモル不活性化ウイルスに基づくワクチンで観察されるかまたは全Fおよ
びGタンパク質で観察される病状を誘導することなく、RSVサブグループAお
よびBによる感染に対して有効な保護を誘導する上で特に適していることを証明
した。
ポリペプチドを発現させるための手段は当業者に知られており、用いられる細
菌に応じて適合される。
好ましくは、DNA配列はシャトルプラスミドのようなプラスミドの形で導入
される。
RSVタンパク質はワクシニアウイルス、バキュロウイルスまたはアデノウイ
ルスのような異なる発現系で以前に発現されてきた。しかしながら、潜在的な問
題が残留ウイルス粒子の存在に伴う。
その態様の1つにおいて、本発明による方法では、ヒトと共生して、非病原性
であって、食用である細菌を用いる。特に、その細菌はStaphylococcus属に属し
、即ち長年にわたり食品産業で用いられてきた細菌であるStaphylococcus xylos
usが生きた状態で経口投与できる。S.xylosusの表面で異種エピトープを発現す
るための系は、特にN′guyen et al.,Gene,1993,128:89-94に記載されている。
好ましくは、異種ポリペプチドは天然プロテインGの対応エピトープの場合と
本質的に同一なコンホメーションで、細菌の膜表面で発現される。
細菌の膜表面における組換えタンパク質の提示は、その化学的性質とそのペプ
チド配列に依存している。
RSVプロテインGの天然配列が使用でき、配列番号1または配列番号2を含
んだペプチドをコードするDNA配列が導入できる。
本発明の一面によれば、プロテインGのアミノ酸130〜230間に包含され
た配列において、173および/または186位のアミノ酸システインはジスル
フィド架橋を形成しないアミノ酸、特にセリンに置き換えられている。
このような変異は176および182位に残留するシステイン残基間でジスル
フィド架橋の形成を促し、その架橋は配列の免疫原性にとり重要であって、この
ような変異は整合性のないジスルフィド架橋の形成を避ける。
このような方法を行う上で有用なペプチドは、特に配列番号3または配列番号
4の1つを含んだものである。
本発明のもう1つの面によれば、RSVプロテインGに相当する異種ポリペプ
チドの配列において、プロテインG配列の163、165、168および/また
は170位に相当するフェニルアラニンアミノ酸は極性アミノ酸、特にセリンに
置き換えられている。
この改変は既に記載された変異と組み合わせることができる。このようなポリ
ペプチドは特に配列番号5を示す。
その方法を行うとき、176および182位においてシステインアミノ酸間で
ジスルフィド架橋により形成される重要なループの上流に位置する疎水性領域を
抑制すれば、組換えタンパク質を細菌膜からもっと容易に通過させて、膜表面で
正確にその免疫優性部分を露出させることができる。
本発明の更にもう1つの面によれば、アミノ酸162〜170間に包含された
配列はRSVプロテインGに相当するペプチド配列で欠失されている。
更に詳しくは、細菌で発現される異種ペプチドの配列は配列番号6を含むこと
ができる。
本発明には、本出願で記載された方法により得られるペプチドまたはタンパク
質を発現する細菌も含む。上記細菌は生きたまたは死んだ状態で用いられる。
上記特徴のうち1以上を示すポリペプチドまたは細菌は薬剤として使用できる
。
本発明には医薬組成物も含み、それらは薬学上許容されるアジュバントと混合
された本発明によるポリペプチドまたは細菌を含むことを特徴とする。
生きたベクターに基づく経口ワクチンは、RSVに対して最良の保護を誘導す
る上で最適のコンホメーションを示す改変タンパク質を含んでいるべきである。
この理由から、本発明は呼吸器多核体ウイルスに起因する感染症を防止するた
めの経口ワクチンを製造する上で、このような医薬組成物の適用にも関する。
最後に、本発明は既に記載されたような天然ペプチドのアナログである組換え
ペプチドをコードするヌクレオチド配列に関し、これらの配列は1以上の特定宿
主細胞で確かにペプチドを発現させる要素を更に含むことができる。これらの要
素は細胞を標的にさせて、そこでその構築体がヒトまたは哺乳動物に投与された
ときに発現される。これらの配列は、好ましくはベクター中に組み込まれるDN
AまたはRNA構築体である。適切なベクターは特にアデノウイルスタイプのプ
ラスミドまたはウイルスであって、許容される賦形剤と一緒に医薬組成物中に処
方することができる。
その面の1つによれば、本発明は、呼吸器多核体ウイルスプロテインGのアミ
ノ酸残基130〜230間に包含されるペプチド配列により保有されるポリペプ
チドをコードするか、または上記ペプチド配列と少くとも80%の相同性を示す
ポリペプチドをコードして、しかもStaphylococcus属の非病原性細菌の膜の表面
でポリペプチドを発現させるための手段も含んでいるヌクレオチド配列に関する
。
‐機能性分泌シグナル配列
‐天然ペプチドのアナログである組換えペプチドをコードするDNA配列
(組換えペプチド配列は天然ペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域で少く
とも1つの改変を示す)
を含むDNA配列は、本発明の一部である。
本発明による方法は下記工程からなる:
a.構造遺伝子と機能的に連結されたシグナル配列を包含する組換えDNA構
築体で宿主細胞を形質転換させ(これは組換え産物が宿主細胞の膜を介して輸送
できるように修飾されている)、
b.組換え産物を発現するために上記宿主細胞を発酵させ、
c.構築体で形質転換された細胞により分泌された細胞外タンパク質を回収す
る。
本発明には、既に記載されたようなDNA配列または構築体を保有した組換え
細胞も含む。
この宿主細胞には、グラム陽性またはグラム陰性細菌、酵母細胞、または哺乳
動物細胞がある。
特に適切な細菌はEscherichia coli、Staphylococcus xylosusおよびStaphylo
coccus carnosus からなる群より選択される。
DNA配列は、グラム陽性またはグラム陰性細菌の染色体中に組み込むことが
できる。
この組換えDNA構築体は、サブグループBの場合の上流および/または下流
に融合されたヒトRSVサブグループAのプロテインGアミノ酸130〜230
をコードする遺伝子を含むことができる。
1タイプの構築体は、サブグループAまたはサブグループBに属するウシRS
Vのアミノ酸130〜230のタンパク質をコードする遺伝子を用いて作製する
ことができる。
下記例は本発明を説明するためであり、その範囲を何ら制限するものではない
。
これらの例では、下記図が参考にされる:
‐図1:遺伝子アセンブリーによるプラスミドpRIT28G2downの構築
‐図2:1)セリン残基により置換された遺伝子G2の構築
2)残基162‐170が欠失された遺伝子G2の構築
‐図3:シャトルベクターpSE′G2delBBXMの構築
‐図4:組換え表面タンパク質のフローサイトメトリーによる分析
‐図5:組換えS.xylosusの膜から抽出されたタンパク質のSDS‐PAGEに
よる分析
‐図6:対応シャトルベクターpSE′G2subBBXMまたは
pSE′G2delBBXMからの分泌ベクターの構築原理図
(その記載は例4に示されている)。ベクターを保有したS.xylosusの
増殖培地から分泌された産物(その停止コドンは(T)はXM膜アンカ
ー領域の上に挿入されている)
‐図7:S.xylosusにより分泌された融合タンパク質のSDS‐PAGEおよび
免疫ブロットによる分析
‐図8:異なるシャトルベクターを保有したS.xylosusにより分泌された
タンパク質のフローサイトメトリーによる分析
例
例1:I)合成遺伝子をアセンブリーすることによるG2の構築:
オリジナル配列と比較して、我々が更に173および186位の2つのCys
残基をSerに変えた、G2と称されるRSウイルスの糖プロテインGのアミノ
酸130‐230を包含した領域をコードする遺伝子は、固相遺伝子アセンブリ
ー技術により得る(Stahl S.et col.,1993.BioTechniques,14:424-434)。その
オリゴヌクレオチドの配列はE.coliおよびStaphylococcusのような細菌の共通コ
ドンを組み合わせることにより最良なものにさせた。
オリゴヌクレオチドは、製造業者の勧めに従い自動DNAシンセサイザー(Ge
ne Assembler Plus,Pharmacia Biotech)でホスホルアミダイト化学により合成
した。固相に結合されるオリゴヌクレオチドは、試薬ホスホルアミダイト担持ビ
オチン(Clontech)により5′末端でビオチニル化させる。他のオリゴヌクレオ
チドは、Clontechプロトコールに従い試薬アミダイト担持リン酸(Clontech)に
より5′末端でリン酸化させる。オリゴヌクレオチドをPharmaciaの勧めに従い
脱保護および精製する。ビオチニル化オリゴヌクレオチドを逆相液体クロマトグ
ラフィーにより精製する(PEP RPCカラム;Pharmacia)。
遺伝子は2つの部分:遺伝子の5′および3′に2つの制限部位BamHIお
よびPstIを有したアミノ酸130‐177のG2up(上流)と、遺伝子の
5′および3′に2つの制限部位PstIおよびBamHIを有したアミノ酸1
77‐230のG2down(下流)でアセンブリーする。G2遺伝子はPst
I部位により2つの断片G2upおよびG2downを連結させることにより再
構築させる。a)G2up遺伝子のアセンブリー(図1):
マイクロチューブで、2つの相補的オリゴヌクレオチド(そのうち1つは5′
‐ビオチニル化されている:TH1B=5′‐ビオチン‐CCGGATCCT
ATGACCGTGA A‐3′およびTH2=5′‐GTTTTTGGTTT
TCACGGTCA TAGGATCCGG‐3′)をストレプトアビジン(Dy
nal,Oslo,Norway)にカップリングされた磁気ビーズ上でハイブリッド形成させ
て、固定させる。固定された二本鎖はBamHI制限部位を含んでいて、ビオチ
ニル化鎖と相補的な鎖はその5′末端(ホスホニル化されている)に6〜15ヌ
クレオチドの突出部を有していて、それには下記オリゴヌクレオチドがハイブリ
ッド形成できる。この後者のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、二次構
造の形成を避けるために培地の温度を70℃に上げながら行う。連結はT4 D
NAリガーゼ(Gibco BRL)を加えることにより行う。遺伝子は、下記オリゴヌ
クレオチドを加える前に過剰の非結合オリゴヌクレオチドを除去するために固体
支持体をすすいでおく注意を各サイクルで払いながら、こうやってうまく構築さ
せる。連結される最後の二本鎖はPstI制限部位を含んでいる。
次いで二本鎖はそれを制限酵素BamHIおよびPstIで切断することによ
りその固体支持体から放出させ、その後同酵素で切断されたクローニングおよび
配列決定ベクターpRIT28(Hultman et al.,1988,Nucleosides Nucleotide
s 7: 629-638)中に連結させる:得られるベクターは大きさが3067bpのp
RIT28G2upである。G2upのヌクレオチド配列は、製造業者(Applie
d Biosystems)の勧めに従い自動ABIシークエンサーでDNA配列決定するこ
とにより調べる。b)G2down遺伝子のアセンブリー(図1):
同様にして、G2down遺伝子を2つの第一相補的オリゴヌクレオチド〔(
そのうち1つは5′‐ビオチニル化されている:TH13B=(5′‐ビオ
チン‐TGTGAAGCTT AGTCGACCGG TTTG‐3′)および
TH12=(5′‐GCCGACCACC AAACCGGTCG ACTAA
GCTTC ACA‐3′)など〕により磁気ビーズ上で固相アセンブリーさせ
る。二本鎖をPstIおよびHindIIIでの連続酵素切断により固体支持体か
ら放出させて、pRIT28中にクローニングさせる:得られるベクターはpR
IT28G2downと称され、大きさが3091bpである。G2downの
ヌクレオチド配列は、製造業者(Applied Biosystems)の勧めに従い自動ABI
シークエンサーでDNA配列決定することにより調べる。c)G2遺伝子=G2up+G2downの構築:
2つの断片G2up+G2downをPstI制限部位により連結させ、形成
された遺伝子を5′BamHI部位および3′HindIII部位を用いてpRI
T28中にクローニングさせる:得られるベクターはpRIT28G2と称され
、大きさが3220bpである。G2のヌクレオチド配列は、製造業者(Applie
d Biosystems)の勧めに従い自動ABIシークエンサーでDNA配列決定するこ
とにより調べる。G2断片をBamHIおよびHindIIIで切断して、シャト
ルベクター:pSE′G2BBXM(7666bp)中にクローニングさせる(
図3)。
G2遺伝子をアセンブリーするために要求されるオリゴヌクレオチドのリスト
:
II )部位特異的変異誘発によるG2subの構築:
163、165、168および170位の4つのフェニルアラニン残基がセリ
ンに置き換えられた遺伝子断片を、プライマー対としてRIT27/TNG73
およびRIT28/TNG72を用いてベクターpRIT28中に挿入されたG
2遺伝子から、遺伝子増幅(PCR)により作製する。プライマーTNG72お
よびTNG73は、4つのフェニルアラニンのうち3つを含んだ19ヌクレオチ
ドの領域と相補的である:
一方、プライマーTNG73はRIT27と一緒に増幅された上流断片で最初
の3つの変異(TTCからTCCへ)を導入する。他方、プライマーTNG72
はRIT28と一緒に増幅された下流断片中に最後の3つの変異(TTCからT
CCへ)を導入する。5サイクルの温度(96℃、15秒間;50℃、1分間;
72℃、1分間)に次いで、5サイクルの温度(96℃、15秒間;60℃、1
5秒間;72℃、15秒間)を続ける。2つの増幅断片を1本のチューブで混合
し、プライマーのないPCR緩衝液で希釈し、伸長反応を下記温度(96℃、1
5秒間;54℃、30秒間;72℃、1分間)を用いて5サイクルで行う。伸長
産物はRIT27およびRIT28プライマーを含有したPCR緩衝液で1/1
00希釈し、遺伝子増幅を下記温度(96℃、15秒間;54℃、15秒間;7
2℃、30秒間)で30サイクルにわたり行う。次いで断片を制限酵素BamH
I/HindIIIで切断し、同酵素で切断されたベクターpRIT28中にクロ
ーニングして、pRIT28G2subを得る。G2subのヌクレオチド配列
は製造業者(Applied Biosystems)の勧めに従いABI自動配列決定装置で
DNA配列決定することにより調べる。G2sub断片をBamHIおよびHi
ndIIIで切断して、シャトルベクターpSE′G2subBBXM(7666
bp)中にクローニングさせる(図3)。III) G2delの構築:
(図2.(2)参照)
同様にして、4つのフェニルアラニン残基を含む部分アミノ酸162〜アミノ
酸170が欠失されたG2遺伝子断片を、2断片の形でPCRにより作る:一方
において上流ではプライマーRIT27/TH48を用いて、他方下流ではRI
T28/TH11を用いる。プライマーTH11およびTH48は13のヌクレ
オチドにわたって互いに相補的である。
5サイクルの下記温度(96℃、15秒間;52℃、1分間;72℃、1分間
)に次いで、20サイクルの下記温度(96℃、15秒間;60℃、15秒間;
72℃、15秒間)を続ける。2つの増幅断片を1本のチューブで混合し、プラ
イマーのないPCR緩衝液で希釈し、伸長反応を5サイクルの下記温度(96℃
、15秒間;42℃、30秒間;72℃、1分間)で行う。伸長産物はRIT2
7およびRIT28プライマーを含有したPCR緩衝液で1/100希釈し、遺
伝子増幅を30サイクルの下記温度(96℃、15秒間;60℃、15秒間;7
2℃、30秒間)で行う。次いで断片を制限酵素BamHI/HindIIIで切
断し、同酵素で切断されたベクターpRIT28中にクローニングして、pRI
T28G2delを得る。G2delのヌクレオチド配列は製造業者(Applied
Biosystems)の勧めに従い自動ABI配列決定装置でDNA配列決定することに
より調べる。G2del断片をBamHIおよびHindIIIで切断して、シャ
トルベクターpSE′G2delBBXM(7639bp)中にクローニングさ
せる(図3)。IV )シャトルベクターの構築:
オリゴヌクレオチドリンカー(5′‐AGCTTGGCTG TTCCGCC
ATG GCTCGAG‐3′、相補鎖と一緒)をプラスミドpSZZmp18
XM(Hansson et al.,1992,J.Bacteriol.174: 4239-4245)のHindIII部位
中に挿入して、それにより得られるベクターpSZZmp18(XhoI)XM
のHindIII部位の下流に2つの追加制限部位NcoIおよびXhoIを作る
。StaphylococcusプロテインGの血清アルブミン結合領域からの、BBと称され
る198アミノ酸をコードする遺伝子断片(Nygren et al.,1988,J.Mol.Reconig
.,1: 69-74)は、プラスミドpSPG1(Guss et al.,1986,EMBO j.,5:1567-15
75)からなる鋳型で、プライマー(1=5′‐CCGAATTCAA GCTT
AGATGC TCTAGCAAAA GCCAAG‐3′および2=5′‐C
CCCTGCAGT TAGGATCCCT CGAGAGGTAA TGCA
GCTAAA ATTTCATC‐3′)を用いて、PCRにより作製する。そ
の断片をHindIIIおよびXhoIで切断し、ベクターpSZZmp18(X
hoI)XMのmp18マルチクローニング部位の下流にクローニングする;得
られたベクターpSZZmp18(XhoI)BBXMはNotIおよびHin
dIIIで切断する。ZZを含む断片は、ベクターpE′mp18(Sophia Hober
、未公表)から同様の制限酵素で切断されたもう1つの断片に代える。得られた
シャトルベクターはpSE′mp18BBXMと称される(図3)。
例2:組換えS.xylosus株からの膜タンパク質の抽出および分析:
クロラムフェニコール(20μg/ml)を含有した培地250ml(TSB7.
5g、酵母抽出物12.5g)を、Gotz et al.,1981,J.Bacteriol.,145: 74-81
のプロトコールに従いシャトルベクターpSE′G2BBXM、pSE′G2s
ubBBXMまたはpSE′G2delBBXMの1つで形質転換されたS.xylo
susの一夜予備培養物5mlと一緒に、1lエルレンマイヤーフラスコ中に接種
する。フラスコを振盪しながら32℃の温度で6時間にわたりインキュベートす
る。培地を4℃の温度で12分間にわたり5000rpmで遠心する。細菌ペレ
ットをTST40mlに再懸濁し、リソスタフィン(1 mg/ml)を含有した溶液
200μlとその後にリゾチーム(50 mg/ml)200μlを加える。混合液を
穏やかに振盪しながら37℃の温度で1時間インキュベートする。次いで溶液は
、パワーが7に調整されたプローブを備えたVibra細胞装置を用いて、2分間に
わたり超音波処理する。混合液を4℃の温度で20分間にわたり13,500r
pmで遠心する。タンパク質をアフィニティ精製する:上澄をHSA(ヒト血清
アルブミン)‐Sepharoseアフィニティカラムに通す。カラムがすすがれた後、
タンパク質をpH2.7の酸緩衝液で溶出させ、凍結乾燥する。
タンパク質は前染色標準分子量マーカー(Gibco BRL)を用いて2つの同一
な12%SDS‐PAGEゲルで分離させる。1つのゲルはクマシーブルーで染
色する。第二は(現行免疫プロトコールに従いG1(aa174‐187)ペプ
チドで免疫されたウサギの血清から得られた)抗G1特異的抗体で免疫ブロット
するための ProblotTM(Applied Biosystem)膜に移す。図5参照
例3:S.xylosus の表面における組換えタンパク質のフローサイトメトリー(FACS canTM)による分析:
組換えS.xylosus細菌の培養物を前記のように作製する。ストック溶液を作る
ために、その細菌は光学密度(600nm)で規定される単位の最終濃度で0.
1%(w/v)ナトリウムアジドを含有したPBSの溶液に再懸濁する。ストッ
ク溶液30μlを微量滴定プレートの各円錐形ウェル中に分けて、4℃で10分
間にわたり550gで遠心する。細菌ペレットは200倍希釈抗G2ポリクロー
ナルウサギ血清(力価1/1,280,000)含有PBS溶液150μl
の容量中に再懸濁して、混合液を30分間インキュベートする。細菌細胞をPB
Sで2回すすいで、30分間にわたり100倍希釈FITC抗ウサギ(Sigma)含
有PBS溶液150μl中でインキュベートする。細胞がPBS緩衝液で2回す
すがれた後、それらを1%(w/v)PBS‐パラホルムアルデヒド緩衝液1m
l含有Falconチューブ中に再懸濁する。こうして作られたサンプルをFACSc
anTM(Becton Dickinson)装置で分析する。各細胞懸濁液の蛍光分布はLYSIS
IITMソフトウェアを用いて分析し、蛍光ヒストグラムで表す。図4参照
例4:分泌/挿入から分泌へのモジュレーション:
異なるシャトルベクターを用いて、図6に示されたような膜つなぎ止めコード
領域XMの上流に終結コドンを挿入することができる。BBとXMとの間にある
ユニークXhoI制限部位を用いて、3つの終結コドン(Ter)をコードする
二本鎖オリゴヌクレオチドを双方向に挿入させ、AatII制限部位を導入する:
こうして、ベクターpSE′G2subBBXMおよびpSE′G2delBB
XMをXhoIで切断し、既に5′リン酸化された二本鎖オリゴヌクレオチドに
連結させる。得られたベクターは各々pSE′G2subBB〔Ter〕XM(
7693bp)およびpSE′G2delBB〔Ter〕XM(7666bp)
である。プロテインG2subBBおよびG2delBBは、これら2つのベク
ターで各々形質転換されたE.coliおよびS.xylosus細胞を培養して、その後アフ
ィニティカラム(HSA‐セファロース)で精製することにより得られる。図7
では、A)SDS‐PAGEゲルの場合において、S.xylosusから分泌されたタ
ンパク質の還元条件下における分離を示し(1および2は予想サイズ:35.2
3Kdaおよび34.28KdaのプロテインG2subBBおよびG2del
BBを各々表す)、B)においてタンパク質の免疫ブロットは、RSVのG(a
a174‐187)領域またはG1に特異的な抗体が2つの分泌タンパク質を容
易に認識することを証明している。タンパク質分解はほとんど観察されなかった
。加えて、FACScan分析はウサギ抗BBポリクローナル抗体を用いて異な
るS.xylosus株で行った。図8では、シャトルベクターpSE′mp18BBX
M、pSE′G2subBBXMおよびpSE′G2delBBXMを保有した
S.xylosusについてのスペクトルが蛍光強度の軸で右方向に、即ち細菌表面にお
ける異種抗原の存在方向に転移していることを示している。逆に、シャトルベク
ターpSE′G2subBBTerXMおよびpSE′G2delBBTerX
Mを保有したS.xylosusについてのスペクトルは転移されず、異種抗原が細菌表
面に不在であり、それらが培地に見出され、培地から精製されたことを示してい
る。
図面の説明
図5:A)クマシーブルー染色:異なる構築体を保有した細菌の膜から抽出さ
れてアルブミンアフィニティカラムで精製された融合タンパク質のSDS‐PA
GEゲル:
‐ウェルHW:分子サイズマーカー(Kda)
‐ウェル1:S.xylosus 〔pSE′G2BBXM〕
‐ウェル2:S.xylosus 〔pSE′G2subBBXM〕
‐ウェル3:S.xylosus 〔pSE′G2delBBXM〕
B)異なる構築体を保有した細菌の膜から抽出されてアルブミンアフィニティ
カラムで精製された融合タンパク質の、ウサギ抗G1ポリクローナル抗体で得ら
れた免疫ブロット:
‐ウェルHW:前染色分子サイズマーカー(Kda)
‐ウェル1:S.xylosus 〔pSE′G2BBXM〕
‐ウェル2:S.xylosus 〔pSE′G2subBBXM〕
‐ウェル3:S.xylosus 〔pSE′G2delBBXM〕
図7:A)クマシーブルー染色:異なる構築体を保有した細菌から分泌されて
アルブミンアフィニティカラムで精製された融合タンパク質のSDS‐PAGE
ゲル:
‐ウェル1:S.xylosus 〔pSE′G2delBB〕(34.28Kda)
‐ウェル2:S.xylosus 〔pSE′G2subBB〕(35.23Kda)
‐ウェルHW:分子サイズマーカー(Kda)
B)異なる構築体を保有した細菌から分泌されてアルブミンアフィニティカラ
ムで精製された融合タンパク質の、ウサギ抗G1(RSV)ポリクローナル抗体
で得られた免疫ブロット:
‐ウェル1:S.xylosus 〔pSE′G2delBB〕(34.28Kda)
‐ウェル2:S.xylosus 〔pSE′G2subBB〕(35.23Kda)
‐ウェルHW:前染色分子サイズマーカー(Kda)
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 38/00 A61K 39/265
39/265 48/00 ACD
48/00 ACD C07K 14/135
C07K 14/135 C12N 1/19
C12N 1/19 1/21
1/21 C12P 21/00 C
5/10 C12N 5/00 B
C12P 21/00 A61K 37/02
//(C12N 1/21
C12R 1:19)
(C12N 1/21
C12R 1:44)
(72)発明者 スタール,ステファン
スウェーデン国ストックホルム、トルファ
グスベーゲン、8
(72)発明者 ニグレン,ペール アイク
スウェーデン国スカルプナック、ピロトガ
タン、22
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 少くとも1つの疎水性領域を有する天然ペプチドのアナログである生物 学的に活性な組換えペプチドを分泌するための方法であって、 ‐細胞による上記ペプチドの発現および分泌を確実にする要素 ‐そのアミノ酸配列がペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域において少 くとも1つの改変により天然ペプチド配列と異なるペプチドをコードする配列を 含む核酸構築体で形質転換された細胞を培養し、そしてそのペプチドおよび/ま たはその組換えペプチドを有する細胞を回収することを特徴とする方法。 2. 天然ペプチド配列の少くとも1つの疎水性アミノ酸が非疎水性アミノ酸 で置き換えられた、請求項1に記載の方法。 3. 少くとも1つの疎水性アミノ酸が天然ペプチド配列から欠失された、請 求項1または2に記載の方法。 4. 疎水性アミノ酸が下記群:トリプトファン、フェニルアラニン、プロリ ン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから選択され る、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 5. DNA構築体が、組換えペプチドをコードし、かつそのペプチドの輸送 と細胞外へのその分泌を確実にするDNA配列と機能的に連結された分泌シグナ ル配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 6. DNA構築体が、ペプチドをコードし、かつそのペプチドを宿主細胞膜 から輸送し膜につなぎ止めるDNA配列と機能的に連結されたシグナル配列を含 む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 7. 天然ペプチドの疎水性領域において少くとも1つの改変により天然ペプ チドと異なっていることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載された 方法により得ることができる組換えペプチド。 8. 宿主細胞の表面につなぎ止められている、請求項7に記載の組換えペプ チド。 9. RSV構造タンパク質のアナログまたはこのタンパク質の断片である、 請求項7または8に記載の組換えペプチド。 10. RSVのプロテインGのアナログ、サブグループAまたはB、である 配列を含んでなる、請求項7〜9のいずれか一項に記載の組換えペプチド。 11. RSVプロテインGの残基130〜230間に包含された配列のアナ ログである配列を含んでなる、請求項7〜10のいずれか一項に記載の組換えペ プチド。 12. 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5また は配列番号6のうちの1つである、請求項7〜11のいずれか一項に記載の組換 えペプチド。 13. 請求項7〜12のいずれか一項に記載されたペプチドをコードするヌ クレオチド配列。 14. 1以上の特定宿主細胞におけるペプチドの発現を確実にする要素を更 に含む、請求項13に記載のヌクレオチド配列。 15. DNA配列である、請求項13または14に記載のヌクレオチド配列 。 16. RNA配列である、請求項13または14に記載のヌクレオチド配列 。 17. 請求項13〜16のいずれか一項に記載されたヌクレオチド配列を含 む特徴とする発現ベクター。 18. 請求項17に記載された発現ベクターを有することを特徴とする、ペ プチドのin situ 産生を行うために哺乳動物に投与される医薬組成物。 19. ‐機能性分泌シグナル配列 ‐天然ペプチドのアナログである組換えペプチドをコードするDNA配列 (組換えペプチド配列は天然ペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域で少く とも1つの改変を有する) を含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載された方法で用い られるDNA配列。 20. 請求項15、16または19に記載されたDNA配列を有することを 特徴とする組換え細胞。 21. グラム陰性細菌である、請求項20に記載の細胞。 22. グラム陽性細菌である、請求項20に記載の細胞。 23. 酵母細胞である、請求項20に記載の細胞。 24. 哺乳動物細胞である、請求項20に記載の細胞。 25. Escherichia coli、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus carnosus から選択される、請求項22または23に記載の細菌 。 26. 組換えDNA配列が宿主の染色体中に組み込まれていることを特徴と する、請求項21に記載のグラム陰性細菌。 27. 宿主の染色体中に組み込まれた組換えDNA配列を有することを特徴 とする、請求項22に記載のグラム陽性細菌。 28. 請求項20〜27のいずれか一項に記載された細胞を有することを特 徴とする医薬組成物。
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