FR2726576A1 - Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de production d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on introduit dans une cellule une construction d'ADN, - codant pour un peptide dont la séquence d'acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans ladite région hydrophobe, et - comportant des éléments assurant l'expression dudit peptide par la cellule. L'invention concerne également un peptide recombinant susceptible d'être ainsi obtenu, une séquence d'ADN correspondante et une bactérie la contenant.
Description
La présente invention se rapporte à des peptides recombinants, analogues de peptides naturels, et ayant conservé l'activité biologique de ces peptides naturels. Ces peptides peuvent être exprimés par différents types de cellules et leur production est améliorée par rapport à celle du peptide naturel.
Par peptide on entend toute substance composée d'un enchaînement d'acides aminés, c'est-à-dire oligopeptide, polypeptide et protéine.
Les peptides possèdent une grande variété de propriétés biologiques, et pour éviter les problèmes notamment de contamination liés aux techniques de purification à partir de produits biologiques, on a été amené à les produire par génie génétique.
Toutefois, la production de peptides par voie recombinante se heurte à des difficultés liées au système d'expression et à la cellule hôte. En effet, pour faciliter leur récupération, il est souhaitable que les peptides soient excrétés à travers la membrane cellulaire, afin de les obtenir dans le milieu extracellulaire ou, dans le cas de bactérie Gram négatif, dans l'espace périplasmique. On peut introduire dans une cellule, en particulier une bactérie, un système permettant l'expression du peptide sous forme fusionnée avec une séquence d'ancrage membranaire, de manière à obtenir le produit de fusion lié de manière covalente, à la surface membranaire.
C'est ainsi que dans le cadre de la préparation de vaccin contre le
VRS, les demandeurs ont mis au point un procédé de technique d'ADN recombinant permettant de modifier ponctuellement par mutagénèse dirigée, des nucléotides dans un gène codant pour une séquence polypeptidique, utile notamment pour l'obtention de vaccins par voie orale contre le virus respiratoire syncitial (VRS)
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est la cause la plus fréquente de maladies respiratoires chez le nouveau-né : bronchopneumopathies (bronchiolites). L'OMS estime chaque année 50 millions de cas atteints du
VRS, dont 160 000 décès dans le monde entier. Il existe deux sous groupes du virus (sous groupes A et B).
VRS, les demandeurs ont mis au point un procédé de technique d'ADN recombinant permettant de modifier ponctuellement par mutagénèse dirigée, des nucléotides dans un gène codant pour une séquence polypeptidique, utile notamment pour l'obtention de vaccins par voie orale contre le virus respiratoire syncitial (VRS)
Le virus respiratoire syncytial (VRS) est la cause la plus fréquente de maladies respiratoires chez le nouveau-né : bronchopneumopathies (bronchiolites). L'OMS estime chaque année 50 millions de cas atteints du
VRS, dont 160 000 décès dans le monde entier. Il existe deux sous groupes du virus (sous groupes A et B).
Le VRS est classé dans la famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité négative, codant pour 10 protéines spécifiques.
n n'existe pas actuellement de vaccin disponible, contre le VRS. Les vaccins à virus inactivé se sont montrés inefficaces et ont même parfois aggravé les infections des nourrissons. Dans les années 60, les tentatives de vaccination avec le VRS inactivé à la formaline ont conduit à l'échec au lieu de conférer une protection lors de la réinfection due au VRS, le vaccin a eu pour effet d'aggraver la maladie chez l'enfant.
La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiée sous forme monomérique ou désacétylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Toutefois les vaccins immunitaires testés à ce jour se sont montrés inefficaces ou ont induit une pathologie pulmonaire (bronchiolite ou péribronchite).
A l'heure actuelle il n'existe pas de traitement de fond des infections dues au VRS.
Les infections au VRS des voies aériennes supérieures : le traitement repose essentiellement sur les médications symptomatiques identiques à celles des autres infections virales.
Les infections au VRS des voies aériennes inférieures : le traitement chez les nourrissons repose sur le maintien d'une hydratation correcte, l'aspiration des sécrétions et l'administration d'oxygène si besoin. Un effet positif a été observé avec la ribavirine, nucléotide actif in vitro contre le
VRS.
VRS.
Afin de faciliter l'administration du vaccin, il serait souhaitable de disposer d'un produit actif par voie orale, générant une bonne immunité, avec des effets secondaires réduits.
Les demandeurs ont construit un système vecteur original, appelé encore vecteur navette, qui est fonctionnel dans Escherichia coli et
Staphylococcus xylosus : le vecteur renferme un signal séquence de sécrétion S, et une région XM d'ancrage membranaire d'origine de la protéine A du Staphylococcus aureus, avec un site de clonage entre S et XM permettant d'insérer un ou plusieurs gènes.
Staphylococcus xylosus : le vecteur renferme un signal séquence de sécrétion S, et une région XM d'ancrage membranaire d'origine de la protéine A du Staphylococcus aureus, avec un site de clonage entre S et XM permettant d'insérer un ou plusieurs gènes.
Afin de faciliter le passage transmembranaire du peptide, l'hydrophobicité de la molécule doit dans certains cas être modifiée.
Cependant, ces modifications ne doivent pas altérer les propriétés biologiques, notamment immunogènes du produit.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé de production d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on introduit dans une cellule une construction d'ADN, codant pour un peptide dont la séquence d'acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans ladite région hydrophobe, et comportant des éléments assurant l'expression dudit peptide par la cellule.
De préférence, la séquence d'acides aminés est modifiée au moins dans une région différente de la région transmembranaire du peptide naturel.
La modification devra de préférence intervenir dans une région non essentielle pour l'activité biologique d'intérêt du peptide, qui doit être maintenue.
Ce procédé met en jeu une construction d'ADN recombinant dans laquelle une séquence signal de secrétion fonctionnelle est liée à un gène de structure qui a été altéré afin de modifier la structure qui permette au produit recombinant de traverser la membrane de la cellule hôte, alors que le produit recombinant du gène de structure d'origine ne l'est pas quant il est lié à la même séquence signal de secrétion ; et les modifications structurelles du produit recombinant devraient être réalisées par génie génétique en altérant la localisation du produit recombinant exprimé dans une cellule hôte.
Les modifications, selon un aspect de l'invention, visent à modifier l'hydrophobicité du produit recombinant.
L'invention a donc pour objet un procédé de production de peptide recombinant dans lequel les modifications structurelles du gène conduisent à un peptide dans lequel au moins un acide aminé hydrophobe de la séquence du peptide naturel est remplacé par un acide aminé non hydrophobe. Dans un autre mode de réalisation dans le peptide recombinant, au moins un acide aminé hydrophobe est délété de la séquence du peptide naturel.
Les modifications structurelles du gène peuvent être faites par insertion de nucléotides, ou par délétion de nucléotides.
Les constructions dans lesquelles les modifications structurelles du gène sont faites par substitution de nucléotides par mutagénèse dirigée sont également comprises dans l'invention.
Les modifications structurelles du gène pourront changer la localisation de telle manière que le produit recombinant soit exposé à la surface membranaire de la cellule par une liaison covalente à la partie d'ancrage membranaire.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, les modifications structurelles du gène peuvent changer la localisation de telle manière que le produit recombinant soit sécrété dans le milieu de culture.
L'invention a donc également pour objet la construction d'ADN qui comprend une séquence signal de sécrétion liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour le peptide recombinant, et assurant la translocation dudit peptide et sa sécrétion extracellulaire.
Selon un autre aspect, I'invention se rapporte à un procédé caractérisé en ce que la construction d'ADN comprend une séquence signal liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide et permettant la translocation du peptide à travers la membrane de la cellule hôte et son ancrage membranaire.
Des peptides recombinants susceptibles d'être obtenus par le procédé caractérisés en ce qu'ils diffèrent du peptide naturel par au moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel sont un autre des objets de l'invention. Ces peptides seront notamment choisis parmi les analogues d'une protéine de structure du VRS ou d'un fragment d'une telle protéine ; plus particulièrement, le peptide recombinant comprend une séquence analogue de la protéine G du VRS, sous groupe A ou B, notamment comprise entre les résidus 130 et 230 de la protéine G du
VRS en présentant au moins 80 % d'homologie.
VRS en présentant au moins 80 % d'homologie.
La protéine G est une glycoprotéine d'enveloppe du VRS, de poids moléculaire compris entre 84 et 90 Kd, pauvre en méthionine. la séquence de la protéine G diffère pour les sous-groupes A et B du VRS ; les termes 'séquence de la protéine G" lorsqu'ils sont employés dans la présente demande, doivent s'entendre comme se référant à la fois à la séquence du sous-groupe A ou du sous-groupe B, lorsque cela n'est pas précisé différemment.
La Demanderesse a mis en évidence que la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G naturelle est particulièrement appropriée pour induire une protection efficace contre l'infection par le
VRS, sous-groupes A et B, sans induire les pathologies observées avec les vaccins basés sur le virus entier inactivé par le formol, ou observées avec les protéines F et G entières.
VRS, sous-groupes A et B, sans induire les pathologies observées avec les vaccins basés sur le virus entier inactivé par le formol, ou observées avec les protéines F et G entières.
Les moyens permettant l'expression du polypeptide sont connus de l'homme du métier et sont adaptés en fonction de la bactérie utilisée.
De préférence, la séquence d'ADN est introduite sous forme d'un plasmide, tel qu'un plasmide navette.
Les protéines du VRS ont été à ce jour exprimées dans différents systèmes d'expression comme le virus de la vaccine, les baculovirus ou les adénovirus. Cependant, des problèmes potentiels sont associés à la présence de particules virales résiduelles.
Le procédé selon la présente invention utilise une bactérie commensale de l'homme, apathogène et comestible. En particulier, la bactérie peut appartenir au genre Staphylococcus. Staphylococcus xylosus qui est une bactérie utilisée dans l'industrie alimentaire depuis de nombreuses années, et peut être administrée, vivante, par voie orale. Des systèmes d'expression d'épitopes hétérologues à la surface de S. xylosus ont été notamment décrits par N'guyen et al dans Gene, 1993 128: 89-94.
De préférence, le polypeptide hétérologue est exprimé à la surface de la membrane de la bactérie, sous une conformation essentiellement identique à celle de l'épitope correspondant de la protéine G naturelle.
La présentation de la protéine recombinante à la surface membranaire de la bactérie dépend de sa nature chimique et de son enchainement peptidique.
On peut utiliser la séquence naturelle de la protéine G du VRS et introduire une séquence d'ADN codant pour un peptide comportant la séquence ID n" 1 ou la séquence ID n" 2.
Selon un aspect de l'invention, dans la séquence correspondant à la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G, l'acide aminé cystéine en positions 173 et/ou 186 a été remplacé par un acide aminé ne formant pas de pont disulfure, en particulier la sérine.
Une telle mutation favorise la formation du pont disulfure entre les résidus cystéine restant en positions 176 et 182, qui est critique pour l'immunogénicité de la séquence ; elle évite la formation de ponts disulfures désordonnés.
Des peptides utiles pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont ceux comportant notamment l'une des séquences ID n" 3 ou ID n" 4.
Selon un autre aspect de l'invention dans la séquence du polypeptide hétérologue correspondant à la protéine G du VRS, les acides aminés phénylalanine correspondant aux positions 163, 165, 168 et/ou 170 de la séquence de la protéine G sont remplacés par un acide aminé polaire, en particulier la sérine.
Cette modification peut être associée aux mutations précédemment citées. Un tel polypeptide peut notamment présenter la séquence ID n" 5.
Lors de la mise en oeuvre du procédé, la suppression de la région hydrophobique située en amont de la boucle critique formée par le pont disulfure entre les acides aminés cystéine en positions 176 et 182, permet à la protéine recombinante de mieux traverser la membrane bactérienne et d'exposer correctement la partie immunodominante à la surface membranaire.
Selon encore un autre aspect de l'invention, dans la séquence peptidique correspondant à la protéine G du VRS, la séquence comprise entre les acides aminés numérotés 162 et 170 est délétée.
Plus particulièrement la séquence du peptide hétérologue exprimée dans la bactérie peut comporter la séquence ID n" 6.
L'invention comprend également une bactérie exprimant un peptide ou une protéine, susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit dans la présente demande. Ladite bactérie peut être utilisée vivante ou tuée.
Les polypeptides ou les bactéries présentant une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessus sont utiles à titre de médicament.
L'invention comprend des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent un polypeptide ou une bactérie selon l'invention en mélange avec des adjuvants pharmaceutiquement acceptables.
Le vaccin oral à base de vecteur vivant doit comprendre la protéine modifiée qui présente la conformation optimale pour induire la meilleure protection contre le VRS.
C'est pourquoi la présente invention à également pour objet une application d'une telle composition pharmaceutique à la préparation d'un vaccin par voie orale destiné à prévenir les infections provoquées par le virus respiratoire syncytial.
Enfin, l'invention a pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine G du virus respiratoire ou pour un polypeptide présentant au moins 80 % d'homologie avec ladite séquence peptidique, et comportant en outre les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane d'une bactérie non pathogène du genre Staphylococcus.
Une séquence d'ADN qui comprend
- une séquence signal de sécrétion fonctionnelle,
- une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant
analogue d'un peptide naturel, la séquence de peptide
recombinant présentant au moins une modification dans la région
hydrophobe du peptide naturel, fait partie de l'invention.
- une séquence signal de sécrétion fonctionnelle,
- une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant
analogue d'un peptide naturel, la séquence de peptide
recombinant présentant au moins une modification dans la région
hydrophobe du peptide naturel, fait partie de l'invention.
Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes
a. transformer les cellules hôtes avec une construction d'ADN recombinant renfermant une séquence signal qui est liée de manière opérationnelle à un gène structurel, et que ce dernier soit modifié de telle sorte que le produit recombinant peut être translocaté à travers la membrane de la cellule hôte;
b. fermenter ladite cellule hôte pour exprimer le produit recombinant
c. récupérer les protéines extracellulaires, sécrétées par les cellules transformées par les constructions.
a. transformer les cellules hôtes avec une construction d'ADN recombinant renfermant une séquence signal qui est liée de manière opérationnelle à un gène structurel, et que ce dernier soit modifié de telle sorte que le produit recombinant peut être translocaté à travers la membrane de la cellule hôte;
b. fermenter ladite cellule hôte pour exprimer le produit recombinant
c. récupérer les protéines extracellulaires, sécrétées par les cellules transformées par les constructions.
L'invention comprend également une cellule recombinante qui contient une séquence d'ADN ou une construction telle que définie précédemment.
Cette cellule hôte peut être une bactérie, Gram+ ou Gram-, une cellule de levure ou une cellule de mammifère.
Des bactéries particulièrement adaptées sont choisies dans le groupe comprenant Escherichia coli, Staphylococcus xylos us, Staphylococc us carnosus.
La séquence d'ADN peut être intégrée dans le chromosome de la bactérie, Gram positif ou Gram négatif.
Cette construction d'ADN recombinant peut renfermer le gène codant pour la protéine G de l'aminoacide 130 à 230 du VRS humain sousgroupe A fusionnée en amont et/ou en aval de celle du sous-groupe B.
Un type de construction peut etre réalisé avec le gène codant pour la protéine de l'amino-acide 130 à 230 du VRS bovin appartenant au sousgroupe A, ou sous sous-groupe B.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes - Figure 1 : Construction par assemblage de gènes du plasmide pRIT28G2av; - Figure 2: 1) Construction du gène G2 substitué par des résidus serine;
2) Construction du gène G2 délété des résidus 162 à 170; - Figure 3 : Construction du vecteur navette pSEiG2delBBXM ; - Figure 4 Analyse par cytométrie de flux des protéines recombinantes de surface; - Figure 5 : Analyse par SDiPage des protéines extraites de la membrane de S. Xylosus recombinant; - Figure 6 : Construction de vecteurs navettes comprenant la région d'ancrage membranaire - Figure 7 : Analyse par SDS-Page et immunoblot des protéines de fusion secrétées par S. xylosus; - Figure 8 : Analyse par cytométrie de flux des protéines secrétées par S.
2) Construction du gène G2 délété des résidus 162 à 170; - Figure 3 : Construction du vecteur navette pSEiG2delBBXM ; - Figure 4 Analyse par cytométrie de flux des protéines recombinantes de surface; - Figure 5 : Analyse par SDiPage des protéines extraites de la membrane de S. Xylosus recombinant; - Figure 6 : Construction de vecteurs navettes comprenant la région d'ancrage membranaire - Figure 7 : Analyse par SDS-Page et immunoblot des protéines de fusion secrétées par S. xylosus; - Figure 8 : Analyse par cytométrie de flux des protéines secrétées par S.
xylosus portant différents vecteurs navettes.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 n Construction de G2 Dar assemblage de ozènes synthétiques
Le gène codant pour la région en amino-acides 130-230 de la glycoprotéine G du virus RS, nommé G2, où nous avons en plus changé deux résidus Cys en position 173 et 186 en Ser par rapport à la séquence d'origine, est obtenu par les techniques d'assemblage de gènes en phase solide (Stahl S. et coL, 1993. BioTechniques, 14:424-434). La séquence des oligonucléotides a été optimisée en combinant les codons usuels de bactéries telles que Ecoli et Staphylococcus.
EXEMPLE 1 n Construction de G2 Dar assemblage de ozènes synthétiques
Le gène codant pour la région en amino-acides 130-230 de la glycoprotéine G du virus RS, nommé G2, où nous avons en plus changé deux résidus Cys en position 173 et 186 en Ser par rapport à la séquence d'origine, est obtenu par les techniques d'assemblage de gènes en phase solide (Stahl S. et coL, 1993. BioTechniques, 14:424-434). La séquence des oligonucléotides a été optimisée en combinant les codons usuels de bactéries telles que Ecoli et Staphylococcus.
Les oligonucléotides ont été synthétisés par la chimie des phosphoramidites sur le synthétiseur d'ADN automatique (Gene Assembler
Plus, Pharmacia Biotech) selon les recommandations du constructeur. Les oligonucléotides à fixer en phase solide sont biotinylés en extrémité 5' par le réactif Biotin-on phosphoramidite (Clontech). Les autres oligonucléotides sont phosphorylés en 5' par le réactif Phosphate-on amidite (Clontech) selon le protocole de Clontech. Les oligonucléotides sont déprotégés et sont purifiés selon les recommandations de Pharmacia. Les oligonucléotides biotinylés sont purifiés par chromatographie liquide sur phase réverse (colonne PEP RPC, Pharmacia).
Plus, Pharmacia Biotech) selon les recommandations du constructeur. Les oligonucléotides à fixer en phase solide sont biotinylés en extrémité 5' par le réactif Biotin-on phosphoramidite (Clontech). Les autres oligonucléotides sont phosphorylés en 5' par le réactif Phosphate-on amidite (Clontech) selon le protocole de Clontech. Les oligonucléotides sont déprotégés et sont purifiés selon les recommandations de Pharmacia. Les oligonucléotides biotinylés sont purifiés par chromatographie liquide sur phase réverse (colonne PEP RPC, Pharmacia).
Le gène est assemblé en deux parties : G2am (amont) de l'aa 130 à 177 avec deux sites de restriction BamHI et PstI en 5' et 3' du gène, G2av (aval) de l'aa 177 à 230 avec deux sites de restriction PstI et BamHI en 5' et en 3' du gène. Le gène G2 est reconstitué en ligaturant les deux fragments
G2am et G2av par le site PstI.
G2am et G2av par le site PstI.
a) Assemblage de gène de G2am (FIGURE 1):
Dans un micro tube, deux oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': TH1B = 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGA A-3'
et THZ = 5'-GTTTTTGGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3' sont hybridés et immobilisés sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine (Dynal,
Oslo, Norway). Le double brin immobilisé comprend un site de restriction
BamHI et le brin complémentaire à celui qui est biotinylé possède 6 à 15 nucléotides de dépassement de son côté 5' (phosphorylé) permettant à l'oligonucléotide suivant de venir s'hybrider.L'hybridation de ce dernier oligonucléotide est effectuée en élevant la température du milieu à 70 C pour éviter la formation de structures secondaires. La ligature est faite en ajoutant de la T4 DNA ligase (Gibco BRL). Ainsi le gène est construit successivement en prenant la précaution à chaque cycle de rincer le support solide afin d'éliminer l'excès d'oligonucléotides non liés avant d'ajouter l'oligonucléotide suivant. Le dernier double brin ligaturé contient un site de restriction PstI.
Dans un micro tube, deux oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': TH1B = 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGA A-3'
et THZ = 5'-GTTTTTGGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3' sont hybridés et immobilisés sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine (Dynal,
Oslo, Norway). Le double brin immobilisé comprend un site de restriction
BamHI et le brin complémentaire à celui qui est biotinylé possède 6 à 15 nucléotides de dépassement de son côté 5' (phosphorylé) permettant à l'oligonucléotide suivant de venir s'hybrider.L'hybridation de ce dernier oligonucléotide est effectuée en élevant la température du milieu à 70 C pour éviter la formation de structures secondaires. La ligature est faite en ajoutant de la T4 DNA ligase (Gibco BRL). Ainsi le gène est construit successivement en prenant la précaution à chaque cycle de rincer le support solide afin d'éliminer l'excès d'oligonucléotides non liés avant d'ajouter l'oligonucléotide suivant. Le dernier double brin ligaturé contient un site de restriction PstI.
Le double brin est ensuite libéré de son support solide en le digérant avec les enzymes de restrictions BamHI et Pstl puis ligaturé dans le vecteur de clonage et de séquençage prit28 (Hultman et col., 1988,
Nucleosides Nucleotides 7:629-638) digéré par les mêmes enzymes : le vecteur résultant est pRIT28G2am de taille 3067pb. La séquence nucléotique de G2am est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
Nucleosides Nucleotides 7:629-638) digéré par les mêmes enzymes : le vecteur résultant est pRIT28G2am de taille 3067pb. La séquence nucléotique de G2am est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
b) Assemblage de nène de G2av (FIGURE 1):
De la même manière le gène G2av est assemblé en phase solide sur billes magnétiques par les deux premiers oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': TH13B = (5'-Biotin-TGTGAAGCTT AGTCGACCGG TTTG-3') et TH12 = (5'-GCCGACCACC
AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'), ainsi de suite. Le double brin est libéré du support solide par digestion enzymatique successivement par PstI et Hindi!!, cloné dans pRIT28 : le vecteur résultant est nommé pRIT28G2av de taille 3091pb. La séquence nucléotique de G2av est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
De la même manière le gène G2av est assemblé en phase solide sur billes magnétiques par les deux premiers oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': TH13B = (5'-Biotin-TGTGAAGCTT AGTCGACCGG TTTG-3') et TH12 = (5'-GCCGACCACC
AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'), ainsi de suite. Le double brin est libéré du support solide par digestion enzymatique successivement par PstI et Hindi!!, cloné dans pRIT28 : le vecteur résultant est nommé pRIT28G2av de taille 3091pb. La séquence nucléotique de G2av est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
c) Construction du gène G2 = G2am + G2av:
Les deux fragments G2am et G2av sont ligaturés par le site de restriction PstI et le gène constitué est cloné dans pRIT28 par les sites
BamHI en 5' et HindIII en 3': le vecteur résultant est nommé pRIT28G2 de taille 3220pb. La séquence nucléotique de G2 est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2 est digéré par BamHI et HindI!! et cloné dans le vecteur navette : pSE'G2BBXM (7666 pb) (FIGURE 3).
Les deux fragments G2am et G2av sont ligaturés par le site de restriction PstI et le gène constitué est cloné dans pRIT28 par les sites
BamHI en 5' et HindIII en 3': le vecteur résultant est nommé pRIT28G2 de taille 3220pb. La séquence nucléotique de G2 est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2 est digéré par BamHI et HindI!! et cloné dans le vecteur navette : pSE'G2BBXM (7666 pb) (FIGURE 3).
Liste des oligonucléotides nécessaires pour l'assemblage de gènes G2
BamHI
TH1B (20mer) : 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGAA A-3'
BamHI
TH2 (30mer) : 5'-GTTTTTGGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3'
TH3 (28mer) : 5'-AACCAAAAAC ACCACGACCA CCCAGACC-3'
TH4 (31mer) : 5'-GTTTGCTCGG CTGGGTCTGG GTGGTCGTGG-3'
TH5 (31mer) : 5'-CAGCCGAGCA AACCGACCAC CAAACAGCGTC-3'
TH6 (29mer) : 5'-CGGTTTGTTC TGACGCTGTT TGGTGGTCG-3'
TH7 (29mer) : 5'-AGAACAAACC GCCGAACAAA CCGAACAAC-3'
TH8 (34mer) : 5'-CTTCGAAATG GAAATCGTTG TTCGGTTTGT TCGG-3'
TH9 (27mer) : 5'-GATTTCCATT TCGAAGTGTT CAACTTC-3'
Pst I TH10 (33mer) : 5'-TGCGCAGAT GCTGCTCGGC ACGAAGTlGA ACA-3'
Pst I
TH11 (22mer) : 5'-GTGCCGAGCA GCATCTGCAG CA-3'
HindIII
TH12 (33mer) : 5'-GCCGACCACC AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'
HindIII
TH13B (19mer) : 5'-Biotin-CCCTGTGAAG CTTGGTTTG-3'
TH14 (32mer): 5'-CATAAACCGC AGACCACCAA ACCGAAAGAA GT-3'
TH15 (32mer) : 5'-GTGGTCGGCA CTTCTTTCGG TTTGGTGGTC TG-3'
TH16 (31mer) : 5'-AAAACCGACC TTCAAAACCA CCAAAAAAGA T-3'
TH17 (31mer) : 5'-CGGTTTATGA TCTTTTTTGG TGGTTTTGAA G-3'
TH18 (30mer) : 5'-GGGCAAAAAA ACCACGACCA AACCGACCAA-3'
TH19 (31mer) : 5'-GTCGGTTTTT TGGTCGGTTT GGTCGTGGTT T-3'
TH20 (34mer): 5'-GGGGCGATCAG CAAACGTATC CCGAACAAAA AACC-3'
TH21 (33mer) : 5'-TTTTGCCCGG TTTTTTGTTC GGGATACGTT TGC-3' Pstl
TH22(25mer) : 5'-ATC TGCAGCAACA ACCCGACCTG CT-3'
Pst I
TH23 (34mer) : 5'-TGATCGCCCA GCAGGTCGGG TTGTTGCTGC AGAT-3'
II) Construction de G2sub par mutagénèse dirigée:
Le fragment de gène où les quatre résidus Phenylalanine en position 163, 165, 168 et 170 sont remplacés par des Sérines, est généré par amplification génique (PCR), à partir du gène G2 inséré dans le vecteur pRIT28, en utilisant comme couples d'amorces RIT27/TNG73 et
RIT28/TNG72 (voir FIGURE 2.(1)).Les amorces TNG72 et TNG73 sont complémentaires d'une région de 19 nucléotides renfermant trois des quatres Phénylalanine
Rit27 : 5'-GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTG-3'
Rit28 : 5'-AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG-3'
TNG72 5'- C CAT TGC GAA GTG TGC AAC TCC GTG CCG AGC AG-3'
TNG73 3'-GC TTG CTA AGG GTA AGG CTT CAC AGG TTG-5'
D'une part, l'amorce TNG73 introduit les trois premières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en amont amplifié avec RIT27. D'autre part l'amorce TNG72 introduit les trois dernières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en aval amplifié avec RIT28. Cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 50 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c. 15 sec; 60 c.
BamHI
TH1B (20mer) : 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGAA A-3'
BamHI
TH2 (30mer) : 5'-GTTTTTGGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3'
TH3 (28mer) : 5'-AACCAAAAAC ACCACGACCA CCCAGACC-3'
TH4 (31mer) : 5'-GTTTGCTCGG CTGGGTCTGG GTGGTCGTGG-3'
TH5 (31mer) : 5'-CAGCCGAGCA AACCGACCAC CAAACAGCGTC-3'
TH6 (29mer) : 5'-CGGTTTGTTC TGACGCTGTT TGGTGGTCG-3'
TH7 (29mer) : 5'-AGAACAAACC GCCGAACAAA CCGAACAAC-3'
TH8 (34mer) : 5'-CTTCGAAATG GAAATCGTTG TTCGGTTTGT TCGG-3'
TH9 (27mer) : 5'-GATTTCCATT TCGAAGTGTT CAACTTC-3'
Pst I TH10 (33mer) : 5'-TGCGCAGAT GCTGCTCGGC ACGAAGTlGA ACA-3'
Pst I
TH11 (22mer) : 5'-GTGCCGAGCA GCATCTGCAG CA-3'
HindIII
TH12 (33mer) : 5'-GCCGACCACC AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'
HindIII
TH13B (19mer) : 5'-Biotin-CCCTGTGAAG CTTGGTTTG-3'
TH14 (32mer): 5'-CATAAACCGC AGACCACCAA ACCGAAAGAA GT-3'
TH15 (32mer) : 5'-GTGGTCGGCA CTTCTTTCGG TTTGGTGGTC TG-3'
TH16 (31mer) : 5'-AAAACCGACC TTCAAAACCA CCAAAAAAGA T-3'
TH17 (31mer) : 5'-CGGTTTATGA TCTTTTTTGG TGGTTTTGAA G-3'
TH18 (30mer) : 5'-GGGCAAAAAA ACCACGACCA AACCGACCAA-3'
TH19 (31mer) : 5'-GTCGGTTTTT TGGTCGGTTT GGTCGTGGTT T-3'
TH20 (34mer): 5'-GGGGCGATCAG CAAACGTATC CCGAACAAAA AACC-3'
TH21 (33mer) : 5'-TTTTGCCCGG TTTTTTGTTC GGGATACGTT TGC-3' Pstl
TH22(25mer) : 5'-ATC TGCAGCAACA ACCCGACCTG CT-3'
Pst I
TH23 (34mer) : 5'-TGATCGCCCA GCAGGTCGGG TTGTTGCTGC AGAT-3'
II) Construction de G2sub par mutagénèse dirigée:
Le fragment de gène où les quatre résidus Phenylalanine en position 163, 165, 168 et 170 sont remplacés par des Sérines, est généré par amplification génique (PCR), à partir du gène G2 inséré dans le vecteur pRIT28, en utilisant comme couples d'amorces RIT27/TNG73 et
RIT28/TNG72 (voir FIGURE 2.(1)).Les amorces TNG72 et TNG73 sont complémentaires d'une région de 19 nucléotides renfermant trois des quatres Phénylalanine
Rit27 : 5'-GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTG-3'
Rit28 : 5'-AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG-3'
TNG72 5'- C CAT TGC GAA GTG TGC AAC TCC GTG CCG AGC AG-3'
TNG73 3'-GC TTG CTA AGG GTA AGG CTT CAC AGG TTG-5'
D'une part, l'amorce TNG73 introduit les trois premières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en amont amplifié avec RIT27. D'autre part l'amorce TNG72 introduit les trois dernières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en aval amplifié avec RIT28. Cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 50 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c. 15 sec; 60 c.
15 sec; 72 c, 15 sec) Les deux fragments amplifiés sont mélangés dans un seul tube dilué dans du tampon de PCR sans amorces et la réaction d'extension est faite en cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 30 sec; 72'c, 1 min). Le produit d'extension est dilué à 1/100 dans du tampon
PCR contenant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).
PCR contenant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).
Le fragment est ensuite digéré avec les enzymes de restrictions
BamHI/HindIII et cloné dans le vecteur prit28 digéré par les mêmes enzymes: pRIT28G2sub. La séquence nucléotique de G2Sub est déterminée par séquençage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment
G2sub est digéré par BamHI et HindllI et cloné dans le vecteur navette pSE'GZsubBBXM (7666 pb)(FIGURE 3).
BamHI/HindIII et cloné dans le vecteur prit28 digéré par les mêmes enzymes: pRIT28G2sub. La séquence nucléotique de G2Sub est déterminée par séquençage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment
G2sub est digéré par BamHI et HindllI et cloné dans le vecteur navette pSE'GZsubBBXM (7666 pb)(FIGURE 3).
ffl Construction de G2del: (voir FIGURE 2.(2))
De la même manière, le fragment de gène G2 délété de la partie renfermant les 4 résidus Phénylalanine de l'aa 162 à l'aa 170 est généré par PCR en deux fragments: en amont avec les amorces RIT27/TH48 d'une part et en aval avec RIT28/THll d'autre part. Les amorces TH11 et TH48 sont complémentaires de 13 nucléotides.
De la même manière, le fragment de gène G2 délété de la partie renfermant les 4 résidus Phénylalanine de l'aa 162 à l'aa 170 est généré par PCR en deux fragments: en amont avec les amorces RIT27/TH48 d'une part et en aval avec RIT28/THll d'autre part. Les amorces TH11 et TH48 sont complémentaires de 13 nucléotides.
TH11 5'GTGCCGAGCA GCATCTGCAG CA-3'
3'-GGCTTGTTT GGCTTGTTG CACGGCTCGT CGT-5' = TH48
Cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 52 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c, 15 sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 15 sec) Les deux fragments amplifiés sont mélangés dans un seul tube dilué dans du tampon de PCR sans amorce et la réaction d'extension est faite en cinq cycles de températures (96'c, 15 sec; 42'c, 30 sec; 72 c, 1 min). Le produit d'extension est dilué à 1/100 dans du tampon PCR contenant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).Le fragment est ensuite digéré avec les enzymes de restrictions BamHI/HindlII et cloné dans le vecteur prit28 digéré par les mêmes enzymes: pRlT28G2del. La séquence nucléotique de G2del est déterminée par séquençage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2del est digéré par BamHI et HindIII et cloné dans le vecteur navette : pSE'G2delBBXM (7639 pb)(FIGURE 3).
3'-GGCTTGTTT GGCTTGTTG CACGGCTCGT CGT-5' = TH48
Cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 52 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c, 15 sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 15 sec) Les deux fragments amplifiés sont mélangés dans un seul tube dilué dans du tampon de PCR sans amorce et la réaction d'extension est faite en cinq cycles de températures (96'c, 15 sec; 42'c, 30 sec; 72 c, 1 min). Le produit d'extension est dilué à 1/100 dans du tampon PCR contenant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).Le fragment est ensuite digéré avec les enzymes de restrictions BamHI/HindlII et cloné dans le vecteur prit28 digéré par les mêmes enzymes: pRlT28G2del. La séquence nucléotique de G2del est déterminée par séquençage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2del est digéré par BamHI et HindIII et cloné dans le vecteur navette : pSE'G2delBBXM (7639 pb)(FIGURE 3).
IV) Construction du vecteur navette:
Un linker d'oligonucléotides (5'-AGCTTGGCTG TTCCGCCATG GCrCGAG3', avec le brin complémentaire) est inséré dans le site Hindlll du plasmide pSZZmpl8XM (Hansson et col, 1992, J.Bacteriol 174 : 4239-4245), créant ainsi deux sites de restriction supplémentaires NcoI et Miol en aval du site HindIII du vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)XM. Un fragment de gène codant 198 acides aminés, nommé BB, de la région de fixation du sérum albumine de la protéine G streptococcique (Nygren et col, 1988.
Un linker d'oligonucléotides (5'-AGCTTGGCTG TTCCGCCATG GCrCGAG3', avec le brin complémentaire) est inséré dans le site Hindlll du plasmide pSZZmpl8XM (Hansson et col, 1992, J.Bacteriol 174 : 4239-4245), créant ainsi deux sites de restriction supplémentaires NcoI et Miol en aval du site HindIII du vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)XM. Un fragment de gène codant 198 acides aminés, nommé BB, de la région de fixation du sérum albumine de la protéine G streptococcique (Nygren et col, 1988.
J.Mol.Reconig., 1:69-74), est généré par PCR avec les amorces ( 1 = 5'-CCGAATTCAA GCTTAGATGC TCTAGCAAAA GCCAAG-3' et 2 = 5'-CCCCTGCAGT
TAGGATCCCT CGAGAGGTAA TGCAGCTAAA ATITCATC-3') sur le template plasmidique pSPG1 (Guss et col, 1986,EMBO J., 5 1567-1575). Le fragment est digéré avec HindlII et XhoI et cloné en aval du site multiple de clonage mp 18 du vecteur pSZZmpl8(Xhol)XM; le vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)BBXM est digéré par Noti et HindIII. Le fragment renfermant ZZ est remplacé par un autre fragment digéré par les mêmes enzymes de restriction du vecteur pE'mpî8 (Sophia Hober, non publié). Le vecteur navette résultant est nommé pSE'mpl8BBXM (FIGURE 3).
TAGGATCCCT CGAGAGGTAA TGCAGCTAAA ATITCATC-3') sur le template plasmidique pSPG1 (Guss et col, 1986,EMBO J., 5 1567-1575). Le fragment est digéré avec HindlII et XhoI et cloné en aval du site multiple de clonage mp 18 du vecteur pSZZmpl8(Xhol)XM; le vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)BBXM est digéré par Noti et HindIII. Le fragment renfermant ZZ est remplacé par un autre fragment digéré par les mêmes enzymes de restriction du vecteur pE'mpî8 (Sophia Hober, non publié). Le vecteur navette résultant est nommé pSE'mpl8BBXM (FIGURE 3).
EXEMPLE 2
Extraction et analvse de protéines membranaires des S. xvlosus recombinants
Dans un erlenmeyer de 1 litre, on inocule 250 ml de milieu (7,5 g de
TSB, 12,5 g de Yeast extract) contenant du Chloramphénicol (20 g/ml) avec 5 ml de préculture (overnight) de S. xylosus transformé par le vecteur navette pSE'G2BBXM ou pSE'G2subBBXM ou pSE'G2delBBXM selon le protocole de Götz et col, 1981, J Bacteriol., 145:7481. Incuber sous agitation à température = 32 C pendant une durée de 6 heures. Centrifuger le milieu à 5000 rpm, 12 min et à température = 4" C.Le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de TST, on rajoute 200 p1 de solution contenant de la lysostaphine (1 mg/ml) et 200 pi de lysozyme (50 mg/ml). Incuber pendant une heure à température = 37 C sous agitation modérée. Soniquer la solution pendant 2 min, avec l'appareil Vibra cell équipé d'une sonde dont la puissance est réglée à 7. Centrifuger à 13 500 rpm, pendant 20 min, à température = 4" C. Les protéines sont purifiées par affinité : le surnageant est passé sur colonne d'affinité HSA-Sépharose (Sérum
Albumine Humaine). Après avoir rincé la colonne, les protéines sont éluées avec un tampon acide pH 2,7 et lyophilisées.
Extraction et analvse de protéines membranaires des S. xvlosus recombinants
Dans un erlenmeyer de 1 litre, on inocule 250 ml de milieu (7,5 g de
TSB, 12,5 g de Yeast extract) contenant du Chloramphénicol (20 g/ml) avec 5 ml de préculture (overnight) de S. xylosus transformé par le vecteur navette pSE'G2BBXM ou pSE'G2subBBXM ou pSE'G2delBBXM selon le protocole de Götz et col, 1981, J Bacteriol., 145:7481. Incuber sous agitation à température = 32 C pendant une durée de 6 heures. Centrifuger le milieu à 5000 rpm, 12 min et à température = 4" C.Le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de TST, on rajoute 200 p1 de solution contenant de la lysostaphine (1 mg/ml) et 200 pi de lysozyme (50 mg/ml). Incuber pendant une heure à température = 37 C sous agitation modérée. Soniquer la solution pendant 2 min, avec l'appareil Vibra cell équipé d'une sonde dont la puissance est réglée à 7. Centrifuger à 13 500 rpm, pendant 20 min, à température = 4" C. Les protéines sont purifiées par affinité : le surnageant est passé sur colonne d'affinité HSA-Sépharose (Sérum
Albumine Humaine). Après avoir rincé la colonne, les protéines sont éluées avec un tampon acide pH 2,7 et lyophilisées.
Les protéines sont séparées sur deux gels SDS-PAGE (12%) identiques avec les marqueurs de tailles moléculaires standard (Gibco BRL) précolorés. Un gel est coloré au Bleu de Coomassie. Le deuxième est transféré sur membrane ProblotTM (Applied Biosystem) pour l'immunoblot avec l'anticorps spécifique anti-G1 (obtenu à partir du sérum de lapin immunisé avec le peptide Gl(aal74-187) selon les protocoles courants d'immunisation). Voir Figure 5.
EXEMPLE 3
Analvse par Cvtométrie de flux (FACScanDl) des Drotéines recombinantes à la surface de S. xvlosus:
Les cultures des bactéries recombinantes S. xylosus sont faites comme décrit précédemment. Pour constituer une solution stock, on resuspend la bactérie dans une solution de PBS à 0,1% de Sodium Azide (p/v) à la concentration finale estimée par densité optique (600nm) égale à l'unité. On aliquote 30 /Jl de solution stock dans chaque puits cônique d'une plaque de microtitres, on centrifuge à 550 g pendant 10 minutes à 4"
C. On resuspend le culot bactérien dans un volume de 150 pl de solution de
PBS contenant du sérum lapin polyclonal anti-G2 (titré 1/1 280 000) dilué au 1/200ème, incubation pendant 30 minutes.On rince deux fois les cellules bactériennes avec du PBS et on incube dans 150 /wI d'une solution de PBS renfermant de l'anti-lapin FITC (Sigma) dilué au 1/100ème pendant une durée de 30 minutes. Après avoir rincé les cellules deux fois avec du tampon PBS, on resuspend dans un tube Falcon contenant 1 ml de tampon PBS Paraformaldéhyde 1% (p/v). Les échantillons préparés sont analysés sur l'appareil FACScanTM (Becton Dickinson). La distribution de fluorescence de chaque suspension cellulaire est analysée par le logiciel
LYSIS IITM et est représentée par des histogrammes de fluorescence. Voir
Figure 4.
Analvse par Cvtométrie de flux (FACScanDl) des Drotéines recombinantes à la surface de S. xvlosus:
Les cultures des bactéries recombinantes S. xylosus sont faites comme décrit précédemment. Pour constituer une solution stock, on resuspend la bactérie dans une solution de PBS à 0,1% de Sodium Azide (p/v) à la concentration finale estimée par densité optique (600nm) égale à l'unité. On aliquote 30 /Jl de solution stock dans chaque puits cônique d'une plaque de microtitres, on centrifuge à 550 g pendant 10 minutes à 4"
C. On resuspend le culot bactérien dans un volume de 150 pl de solution de
PBS contenant du sérum lapin polyclonal anti-G2 (titré 1/1 280 000) dilué au 1/200ème, incubation pendant 30 minutes.On rince deux fois les cellules bactériennes avec du PBS et on incube dans 150 /wI d'une solution de PBS renfermant de l'anti-lapin FITC (Sigma) dilué au 1/100ème pendant une durée de 30 minutes. Après avoir rincé les cellules deux fois avec du tampon PBS, on resuspend dans un tube Falcon contenant 1 ml de tampon PBS Paraformaldéhyde 1% (p/v). Les échantillons préparés sont analysés sur l'appareil FACScanTM (Becton Dickinson). La distribution de fluorescence de chaque suspension cellulaire est analysée par le logiciel
LYSIS IITM et est représentée par des histogrammes de fluorescence. Voir
Figure 4.
EXEMPLE 4
Modulation secrétion-insertion en secrétion:
A partir des différents vecteurs navettes, il est possible d'insérer des codons de terminaison en amont de la région codant pour l'ancrage membranaire XM, comme le montre la figure 6. Un site unique de restriction XhoI entre BB et XM a été utilisé pour insérer un double brin d'oligonucléotides codant pour trois codons terminaison (Ter) dans les deux sens d'orientation, avec introduction d'un site de restriction Aat II::
Aat Il Ter Ter Ter - > 5'-TC GAC GTC TAA TGA TM TTA TCA TTA G-3'
3' CAG ATT ACT ATT AAT AGT AAT CAG CT-S'
< - Ter Ter Ter
Les vecteurs pSE'G2subBBXM et pSE'G2delBBXM sont ainsi digérés par Xho I et sont ligaturés avec le double brin d'oligonucléotides préalablement phosphorylés en 5'. Les vecteurs résultants sont respectivement pSE'G2subBB[TerjXM (7693 pb) et pSFG2delBB [Ter]XM (7666 pb). La culture des E. coli ou des S.xylosus transformées respectivement avec ces deux vecteurs suivie d'une purification sur colonne d'affinité (HSA Sépharose) permet d'obtenir des protéines G2subBB et G2delBB.La figure 7 montre: en
A) le gel SDS-PAGE, la séparation des protéines secrétées à partir des
S.xylosus, dans des conditions réduites, en 1 et en 2 représentent respectivement les protéines G2subBB et G2delBB à la taille attendue: 35,23
Kda et 34,28 Kda; en B) l'immunoblot des protéines montre que l'anticorps spécifique à la région G(aa174187) ou G1 du VRS reconnait bien les deux protéines secrétées. Très peu de dégradations protéolytiques ont été observées. De plus, l'analyse FACSCAN avec l'anticorps polyclonal antilapin, anti-BB a été réalisée sur les différents S.xylosus.La figure 8 montre que les spectres de S.xylosus portant des vecteurs navettes pSE'mpl8BBXM, pSE'G2subBBXM et pSE'G2delBBXM sont déplacés dans l'axe de l'intensité de fluorescence vers la droite, c'est-à-dire vers la présence des antigènes hétérologues à la surface de la bactérie. Alors que les spectres de S.xylosus portant des vecteurs navettes pSE'G2subBBTerXM et pSE'G2delBBTerXM n'y sont pas déplacés, ceci indique que les antigènes hétérologues sont absents à la surface de la bactérie et que l'on les a retrouvés et purifiés à partir du milieu de culture.
Modulation secrétion-insertion en secrétion:
A partir des différents vecteurs navettes, il est possible d'insérer des codons de terminaison en amont de la région codant pour l'ancrage membranaire XM, comme le montre la figure 6. Un site unique de restriction XhoI entre BB et XM a été utilisé pour insérer un double brin d'oligonucléotides codant pour trois codons terminaison (Ter) dans les deux sens d'orientation, avec introduction d'un site de restriction Aat II::
Aat Il Ter Ter Ter - > 5'-TC GAC GTC TAA TGA TM TTA TCA TTA G-3'
3' CAG ATT ACT ATT AAT AGT AAT CAG CT-S'
< - Ter Ter Ter
Les vecteurs pSE'G2subBBXM et pSE'G2delBBXM sont ainsi digérés par Xho I et sont ligaturés avec le double brin d'oligonucléotides préalablement phosphorylés en 5'. Les vecteurs résultants sont respectivement pSE'G2subBB[TerjXM (7693 pb) et pSFG2delBB [Ter]XM (7666 pb). La culture des E. coli ou des S.xylosus transformées respectivement avec ces deux vecteurs suivie d'une purification sur colonne d'affinité (HSA Sépharose) permet d'obtenir des protéines G2subBB et G2delBB.La figure 7 montre: en
A) le gel SDS-PAGE, la séparation des protéines secrétées à partir des
S.xylosus, dans des conditions réduites, en 1 et en 2 représentent respectivement les protéines G2subBB et G2delBB à la taille attendue: 35,23
Kda et 34,28 Kda; en B) l'immunoblot des protéines montre que l'anticorps spécifique à la région G(aa174187) ou G1 du VRS reconnait bien les deux protéines secrétées. Très peu de dégradations protéolytiques ont été observées. De plus, l'analyse FACSCAN avec l'anticorps polyclonal antilapin, anti-BB a été réalisée sur les différents S.xylosus.La figure 8 montre que les spectres de S.xylosus portant des vecteurs navettes pSE'mpl8BBXM, pSE'G2subBBXM et pSE'G2delBBXM sont déplacés dans l'axe de l'intensité de fluorescence vers la droite, c'est-à-dire vers la présence des antigènes hétérologues à la surface de la bactérie. Alors que les spectres de S.xylosus portant des vecteurs navettes pSE'G2subBBTerXM et pSE'G2delBBTerXM n'y sont pas déplacés, ceci indique que les antigènes hétérologues sont absents à la surface de la bactérie et que l'on les a retrouvés et purifiés à partir du milieu de culture.
LISTE DE SEQUENCES
Information pour la SEQ ID N0:1
TYPE DE SEQUENCE : acides @minés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 303 nucléotides NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 13.
Information pour la SEQ ID N0:1
TYPE DE SEQUENCE : acides @minés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 303 nucléotides NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 13.
N -Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gin
5'-ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG 143
Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn
CCG AGC AAA (CG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC 161 174
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn
AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC 179 187
Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg lie Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys
AAC (CG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA 197
Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp
AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA AAA GAT 215 23
His Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro - C Ter
CAT AAA (CG CAG ACC ACC AAA (CG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCA - 3'
Information pour la SEQ ID NO:Z
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 33 nucléotides
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : Protéine 13.
5'-ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG 143
Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn
CCG AGC AAA (CG ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC 161 174
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn
AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCG TGC AGC ATC TGC AGC AAC 179 187
Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg lie Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys
AAC (CG ACC TGC TGG GCG ATC TGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA 197
Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp
AAA ACC ACG ACC AAA CCG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA AAA GAT 215 23
His Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro - C Ter
CAT AAA (CG CAG ACC ACC AAA (CG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCA - 3'
Information pour la SEQ ID NO:Z
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 33 nucléotides
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : Protéine 13.
-Thr Ala Gin Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gin
5' -ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG 143
Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys
ACC AAC AAA CCG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC (CG (CG AAA AAA CCG AAA 161 174
Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Giy Asn
GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC AAC 179 187
Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys
AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG 197
Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg
AAA ((G ACC ATC AAA ((G ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA ACC ACC AAC AAA CGT 215 23
Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn - C Ter
GAT CCG AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG GAA ATC ATC ACC AAC - 3'
Inforiation pour la SEQ ID N:3
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 303 nucléotides
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 13.
5' -ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG 143
Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys
ACC AAC AAA CCG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC (CG (CG AAA AAA CCG AAA 161 174
Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Giy Asn
GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC TGC AGC ATC TGC GGC AAC 179 187
Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys
AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC TGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG 197
Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg
AAA ((G ACC ATC AAA ((G ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA ACC ACC AAC AAA CGT 215 23
Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn - C Ter
GAT CCG AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG GAA ATC ATC ACC AAC - 3'
Inforiation pour la SEQ ID N:3
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 303 nucléotides
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 13.
-Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gin Thr Gln
S' -ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG
143
Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gin Arg Gin Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn
CCG AGC AAA ((G ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC
161 174
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn
AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG (CG AGC AGC ATC TGC AGC AAC
179 187
Asn Pro Thr Cys Trp Ala lie Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys
AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC AGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA
197
Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp
AAA ACC ACG ACC AAA (CG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA AAA GAT
215 23
His Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro - C Ter
CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA (CG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCA - 3'
Information pour la SEQ ID N:4
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 33 nucléotides
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 13.
S' -ACC GTG AAA ACC AAA AAC ACC ACG ACC ACC CAG ACC CAG
143
Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gin Arg Gin Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn
CCG AGC AAA ((G ACC ACC AAA CAG CGT CAG AAC AAA CCG CCG AAC AAA CCG AAC
161 174
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn
AAC GAT TTC CAT TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG (CG AGC AGC ATC TGC AGC AAC
179 187
Asn Pro Thr Cys Trp Ala lie Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys
AAC CCG ACC TGC TGG GCG ATC AGC AAA CGT ATC CCG AAC AAA AAA CCG GGC AAA
197
Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp
AAA ACC ACG ACC AAA (CG ACC AAA AAA CCG ACC TTC AAA ACC ACC AAA AAA GAT
215 23
His Lys Pro Gin Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro - C Ter
CAT AAA CCG CAG ACC ACC AAA (CG AAA GAA GTG CCG ACC ACC AAA CCA - 3'
Information pour la SEQ ID N:4
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 101 acides aminés, 33 nucléotides
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 13.
N -Thr Ala Gin Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gin
5'-ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG 143
Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys
ACC AAC AAA (CG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC CCG CCG AAA AAA CCG AAA 161 174
Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Gly Asn
GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC AGC AGC ATC TGC GGC AAC 179 187
Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys
AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC AGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG 197
Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg
AAA ((G ACC ATC AAA ((G ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA ACC ACC AAC AAA CGT 215 230
Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn - C Ter
GAT ((G AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG GAA ATC ATC ACC AAC - 3'
Information pour la SEQ ID N0:5
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 3 acides aminés
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 16e 162 163 165 168 17 173
Asn Asn Asp Ser His Ser Glu Val Ser Asn Ser Val Pro Ser Ser 175 176 182 186
Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr (ys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile
Information pour la SEQ ID NO:6
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 3. acides aminés
NOMBRE DE BRINS : sinple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MCLECULE : protéine 16.
5'-ACC GCG CAG ACC AAA GGC CGT ATC ACC ACC AGC ACC CAG 143
Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys
ACC AAC AAA (CG AGC ACC AAA AGC CGT AGC AAA AAC CCG CCG AAA AAA CCG AAA 161 174
Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Gly Asn
GAT GAT TAC CAC TTC GAA GTG TTC AAC TTC GTG CCC AGC AGC ATC TGC GGC AAC 179 187
Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys
AAC CAG CTG TGC AAA AGC ATC AGC AAA ACC ATC CCG AGC AAC AAA CCG AAA AAG 197
Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg
AAA ((G ACC ATC AAA ((G ACC AAC AAA CCG ACC ACC AAA ACC ACC AAC AAA CGT 215 230
Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn - C Ter
GAT ((G AAA ACC CCG GCG AAA ATG CCG AAG AAG GAA ATC ATC ACC AAC - 3'
Information pour la SEQ ID N0:5
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 3 acides aminés
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : protéine 16e 162 163 165 168 17 173
Asn Asn Asp Ser His Ser Glu Val Ser Asn Ser Val Pro Ser Ser 175 176 182 186
Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr (ys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile
Information pour la SEQ ID NO:6
TYPE DE SEQUENCE : acides aminés et nucléotides
LONGUEUR DE LA SEQUENCE : 3. acides aminés
NOMBRE DE BRINS : sinple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MCLECULE : protéine 16.
Asn Asn Val Pro Ser Ser lie (ys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp
175
Ala île Ser Lys Arg lie Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr
LEGENDES DES FIGURES
Figure 5 : A) Coloration au bleu de Comassie : Gel SDS-Page des protéines de fusion extraites de membrane bactérienne et purifiées par affinité sur colonne Albumine des différents constructions
- Puits HW : Marquews de taille moléculaire (en Kda).
175
Ala île Ser Lys Arg lie Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr
LEGENDES DES FIGURES
Figure 5 : A) Coloration au bleu de Comassie : Gel SDS-Page des protéines de fusion extraites de membrane bactérienne et purifiées par affinité sur colonne Albumine des différents constructions
- Puits HW : Marquews de taille moléculaire (en Kda).
- puits 1 : S.xylosus [pSE'G2B8XM).
- puits 2 : S.xylosus (pSE'G2subBBXM).
- puits 3 : S.xylosus [pSE'G2delBBXM].
B) Immunoblot des protéines de fusion extraites de membrane bactérienne et purifiées par affinité sur colonne Albumine des différents constructions avec anticorps polyclonal lapin anti-G1.
- Puits HW : Marqueurs de taille moléculaire précolorés (en Kda).
- puits 1 : S.xylosus [pSE'G2BBXM].
- puits 2 : S.xylosus [pSE'G2subBBXM].
- puits 3 : S.xylosus [pSE'G2delBBXM].
Figure 7 : A) Coloration au bleu de Comassie : Gel SDS-Page des protéines de fusion secrétées et purifiées par affinité sur colonne Albumine des différentes constructions:
- puits 1: S xylosus [pSE'G2delBB] (34,28 Kda).
- puits 1: S xylosus [pSE'G2delBB] (34,28 Kda).
- puits 2 : S.xylosus (pSE'G2subBB] (35,23 Kda).
- puits HW : Marqueurs de taille moléculaire (en Kda).
B) Immunoblot des protéines de fusion secrétées et purifiées par affinité sur colonne
Albumine des différentes constructions avec anticorps polyclonal lapin anti-G1(VRS).
Albumine des différentes constructions avec anticorps polyclonal lapin anti-G1(VRS).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2delB8] (34,28 Kda).
- puits 2 : S.xylosus [pSE'G2subBB] (35,23 Kda).
- puits HW: Marqueurs de taille moléculaire précolorés (en Kda).
Claims (21)
1. Procédé de production d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on introduit dans une cellule une construction d'ADN, - codant pour un peptide dont la séquence d'acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans ladite région hydrophobe, et
- comportant des éléments assurant l'expression dudit peptide par la cellule.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés est modifiée au moins dans une région différente de la région transmembranaire du peptide naturel.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'au moins un acide aminé hydrophobe de la séquence du peptide naturel est remplacé par un acide aminé non hydrophobe.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'au moins un acide aminé hydrophobe est délété de la séquence du peptide naturel.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la construction d'ADN comprend une séquence signal de sécrétion liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour le peptide recombinant, et assurant la translocation dudit peptide et sa sécrétion extracellulaire.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la construction d'ADN comprend une séquence signal liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide et permettant la translocation du peptide à travers la membrane de la cellule hôte et son ancrage membranaire.
7. Peptide recombinant susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il diffère du peptide naturel par au moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel.
8. Peptide recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un analogue d'une protéine de structure du VRS ou d'un fragment d'une telle protéine.
9. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence analogue de la protéine G du VRS, sous groupe A ou B.
10. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence analogue de la séquence comprise entre les résidus 130 et 230 de la protéine G du VRS.
11. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il présente l'une des séquences ID n" 1, n" 2, n" 3, n" 4, n" 5 ou n" 6.
12. Séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'une des revendications 7 à 11.
13. Séquence d'ADN susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend - une séquence signal de sécrétion fonctionnelle, - une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant analogue d'un
peptide naturel, la séquence de peptide recombinant présentant au
moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel.
14. Cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence d'ADN selon l'une des revendications 12 et 13.
15. Cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie Gram-négatif.
16. Cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie Gram-positif.
17. Cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure.
18. Cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de mammifère.
19. Bactérie selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Escherichia coli, Staphylococcus xylosus,
Staphylococcus carnosus.
20. Bactérie Gram-négatif selon la revendication 15, caractérisée en ce que la séquence d'ADN recombinante s'est intégrée dans le chromosome de l'hôte.
21. Bactérie Gram-positif selon la revendication 16, caractérisée en ce que la construction recombinante s'est intégrée dans le chromosome de l'hôte.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9413307A FR2726576B1 (fr) | 1994-11-07 | 1994-11-07 | Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante |
| ZA959417A ZA959417B (en) | 1994-11-07 | 1995-11-07 | Production of peptides which are analogues of hydrophobic peptides recombinant peptide corresponding DNA sequence |
| JP8515108A JPH10508479A (ja) | 1994-11-07 | 1995-11-07 | 天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生 |
| EP95939336A EP0791059A1 (fr) | 1994-11-07 | 1995-11-07 | Production de peptides recombinants, analogues de peptides naturels hydrophobes |
| CA002204511A CA2204511A1 (fr) | 1994-11-07 | 1995-11-07 | Production de peptides recombinants, analogues de peptides naturels hydrophobes |
| AU41200/96A AU704594B2 (en) | 1994-11-07 | 1995-11-07 | Production of recombinant peptides as natural hydrophobic peptide analogues |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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Family
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|---|---|---|---|
| FR9413307A Expired - Fee Related FR2726576B1 (fr) | 1994-11-07 | 1994-11-07 | Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante |
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