CN101848730A

CN101848730A - 衣壳蛋白及其用途

Info

Publication number: CN101848730A
Application number: CN200880103549A
Authority: CN
Inventors: 曹韫旭
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2028-06-18
Also published as: CA2691033C; EP2170380A1; WO2008154868A1; CN101848730B; AU2008265367A1; EP2170380A4; US8088392B2; JP2011510909A; JP5560510B2; US20090181046A1; CA2691033A1; AU2008265367B2

Abstract

本发明提供一种包含融合蛋白和所需抗原的组合物，其中所述融合蛋白包括如热休克蛋白hsp65的分子伴侣蛋白和如HBV核心抗原的衣壳蛋白，该组合物可形成作为抗原载体的具有免疫原性的大分子结构物。本发明还提供了一种制备这种组合物的方法，步骤包括在变性剂如尿素或盐酸胍存在下纯化重组衣壳蛋白，然后再重新装配变性后的重组衣壳蛋白。该组合物可用来进行预防性或治疗性免疫接种。

Description

衣壳蛋白及其用途

相关美国申请数据

本发明要求2007年6月18申请的编号为60944780的临时申请的优先权。

发明领域

本发明涉及治疗和预防接种的免疫原性组合物的研发。

背景技术

多种病毒衣壳蛋白具有自我装配成高度有序的颗粒的固有能力。通过采用重组DNA技术，衣壳蛋白可从不同的宿主(如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母菌和E.coli)重组生成。通常，生成的衣壳蛋白能在宿主中自我装配成很类似于病毒体的颗粒。得到的颗粒称为病毒样颗粒(VLPs)。由于缺少病毒基因组，VLPs是非复制和非感染性的(1-14)。

在利用病毒衣壳蛋白制成的VLPs作为疫苗，或利用VLPs作为抗原载体或抗原输送系统(或抗原运载体)以运载所需要的表位或抗原，用以增强运载的表位或抗原的免疫原性，并在体内引发Class I的细胞毒反应(1-14、62-68)的领域有许多成文的研究结果和已授权的专利。大多数的抗原输送系统本质上具有颗粒状的结构。很多的物质，包括脂质、蛋白质、多糖、聚丙烯酯等可以被配制成颗粒状的结构，以用作抗原输送系统。在它们之中，而由衣壳蛋白形成的病毒样颗粒(VLPs)是用作输送其它疾病的异源抗原的抗原载体的主要候选物，这是因为它们的颗粒大小的理想尺寸、简单性和能够诱导所需要类型的免疫反应的能力(62-68)。而且，不同的抗原输送系统的相对免疫原性的差异性很大，基于衣壳蛋白形成的颗粒的抗原输送系统可比其它的颗粒抗原的输送系统更具免疫原性(62-68，109)。

毫无疑问，VLPs可在多种表达系统中通过重组DNA技术进行大量的表达。对于使用VLPs作为疫苗或使用它们作为抗原载体以诱发增强的免疫应答，尤其是细胞介导的抗运载的抗原或表位的免疫应答的预防或治疗的潜能很少存有疑问。由于它们的颗粒状特性，VLPs通常可通过纯化方法使其纯化为颗粒，例如使用硫酸铵进行盐沉淀、密度梯度离心，过滤和凝胶过滤。然而，使用这些技术制成的药物，特别是用于人类的药物时，仍然存在着一些未解决的问题，这些问题涉及从表达宿主系统中经济且可重复的制备具有明确组分的完整均一的颗粒并且能够经受长期的保存(8)。

当通过重组DNA技术制备VLPs时，VLPs像其他重组蛋白一样，将被宿主蛋白、脂质、核酸等污染，因此，必须把这些污染物除去，使其含量非常低，以满足医疗应用的要求。然而，从VLPs中除去污染物较为复杂，这是因为当VLPs在表达系统中表达和组合时，宿主蛋白和脂质可整合到VLPs中，且宿主核酸可包覆进入VLPs中(15-20)。纯化整个VLPs也不能除去这些整合进的或包覆进的污染物。此外，VLPs为超分子结构，其分子量通常超过1000Kd。由于与单体蛋白或其它小分子相比，VLPs的尺寸巨大，在色谱过程中的传质就会较差，因此当通过使用吸收树脂，其结合，洗脱和分布收集对VLPs进行分离时就不像较小的分子那样有效和有效率。

能够纯化完全解离的衣壳蛋白的重要性在美国专利6962777和其它文献(8、21)中有提及。组装VLPs需要正确地折叠的衣壳蛋白才能开始。在非变性的条件下，采用体外的方法对VLPs进行定量的解离和随后进行的重装配对每个独特的衣壳蛋白都有很高的特异性，美国专利6962777可能是唯一的使用VLPs来解决此问题的公开出版物，其中所述的VLPs由人乳头瘤病毒(HPV)L1主要衣壳蛋白制备。目前，科学上对VLPs的形成和影响其稳定性的许多重要因素还没有很好的阐述。公知的是，许多的因素都会影响VLPs的分解和组装。例如，Ph值、离子强度、病毒衣壳蛋白翻译后的修饰、二硫键和二价阳离子的键合。由于许多的VLPs的解离和组装经常需要分子伴侣蛋白质参与，且由于一些VLPs的形成需要某些特定结构的核酸分子的参与(8、21-36)，以上所述种种因素使上述问题变得更加复杂。发展VLPs体外解离和重组装的生产工艺面临的另一个主要障碍是部分解离或完全解离所形成的衣壳蛋白质分子很容易在工艺生产过程中形成聚集体沉淀(8)。

如果只是简单的解离VLPs颗粒结构，可使用高浓度的离液剂如尿素或盐酸胍(Gu.HCl)处理，因为这些试剂能打开非共价键，如氢键、范德华力和衣壳蛋白中的疏水作用力，另外，衣壳蛋白中的二硫键可通过还原剂或磺化反应打开。如果目的仅仅是制备纯的衣壳蛋白，那么使用高浓度的Gu.HCl和尿素处理VLPs，再加上必要的试剂来打开VLPs中的二硫键是有利纯化操作过程的，这是因为：(1)在高浓度的尿素或Gu.HCl中，衣壳蛋白不太可能形成集合体，故纯化过程更加有效并更容易放大；(2)高浓度的尿素或Gu.HCl可削弱衣壳蛋白与污染物之间的相互作用(氢键、范德华力和疏水作用力)，故就去除污染物而言，纯化过程更有效；(3)VLPs在高浓度的尿素或Gu.HCl中其结构会被打开，在纯化过程中表现出更均匀的特性；(4)颗粒结构被打开的VLPs更可能使整合进或包覆进颗粒内的污染物被释放出或暴露出，从而可以通过纯化过程除去这些污染物。然而，离液剂如尿素或Gu.HCl也是强的蛋白变性剂，在用高浓度的尿素或Gu.HCl处理后，蛋白也会变性，并且在如何正确地重折叠变性的衣壳蛋白方面目前仍然缺少知识。如果不能正确地重折叠变性的衣壳蛋白，它们通常形成集合体沉淀，而不会自我装配成VLPs(8、21)。

宿主对病毒的免疫反应或免疫耐受可能是使用真实VLPs作为抗原载体所面临的问题。衣壳蛋白形成的VLPs是作为输送不同抗原的抗原载体的主要的候选物，这是因为它们的颗粒大小的理想尺寸、简单性和能够诱导所需要的免疫应答的能力(62-68)。然而，机体可能已被病毒感染，，且感染可导致宿主形成对相同病毒或很相近的病毒所形成的VLPs的免疫应答，或者感染可导致机体形成对相同病毒或很相近的病毒所形成的VLPs的免疫耐受性。在任一情况下，在这些机体中使用VLPs作为抗原载体的有效性将会大大地降低。

如果可利用具有自我组装能力的衣壳蛋白质分子组装颗粒(大分子结构物)用作抗原载体，所述颗粒的形态学特征与天然的病毒样颗粒(authentic VLPs)不同，就会有优势。因为由于形态上的差异，大分子结构物会相对于真实VLPs呈现或暴露出不同的表位肽，并相对于真实VLPs具有以下优点：(1)可通过使用具有不同形态的大分子结构物的颗粒以避开机体预先存在的对真实VLPs的免疫性；(2)可通过使用具有不同形态的大分子结构物的颗粒以避开机体对衣壳蛋白所产生的免疫耐受性；(3)通过使用具有不同形态的大分子结构物可避开使用市售的抗衣壳蛋白检验的干扰问题。

因此，有需要在该领域内开发一种通用的方法，可以通过一个或多个步骤在高浓度的离液剂(变性条件)加上必要的试剂打开二硫键，对重组表达的衣壳蛋白进行纯化，接着再对纯化后均一的衣壳蛋白进行体外的重折叠和重装配。另外，在该领域内也需要利用病毒的衣壳蛋白制备颗粒(大分子结构物)用于运载抗原的载体，这种颗粒在形态学上与真实VLPs不一样，以避开机体预先存在的对VLPs的免疫应答或已存在的对VLPs的免疫耐受性。

发明概述

本发明涉及利用衣壳蛋白本身具有的自我装配能力和分子伴侣蛋白具有的与变性蛋白质结合，防止变性蛋白质聚集并促进其复性的能力制备一种具有免疫原性的大分子结构物。

在本发明中，所述的大分子结构物从一种融合蛋白质制备，该融合蛋白质含有病毒的衣壳蛋白(或核衣壳蛋白)和分子伴侣蛋白。所述融合蛋白称为FCCP。FCCP通过重组技术制备，并在高浓度的离液剂溶剂中以变性的形式纯化。变性的FCCP经过重折叠并重装配成为大分子结构物。

本发明的一个主要目的是使用源自FCCP的大分子结构物替代VLPs作为抗原或表位的载体，以增强治疗或预防接种所运载的抗原或表位的免疫原性。

这种源自FCCP的并携带有异源抗原或表位的大分子结构物可通过以下方式制备：(1)使异源的抗原或表位与FCCP或源自FCCP的大分子结构物以化学连接或或缀合的方式连接；(2)通过肽键将异源的抗原或表位与FCCP相连接形成包含所述异源抗原和FCCP的单个融合蛋白，接着重组生成异源的抗原-FCCP融合蛋白，纯化变性的异源的抗原-FCCP融合蛋白，然后将变性的异源的抗原-FCCP融合蛋白重折叠和重装配，以形成大分子结构物。

在本发明中，携带有异源抗原的源自FCCP的大分子结构物的组合物可通过诱导期望的免疫应答，尤其是诱导对所携带抗原的细胞介导的免疫应答，用于治疗或预防性接种。

不使用真实VLPs而使用本发明的大分子结构物具有以下的优点：(1)可通过使用具有不同形态的大分子结构物避开机体对真实VLPs可能预先存在的免疫性；(2)可通过使用具有不同形态的大分子结构物避开机体对真实衣壳蛋白可能存在的免疫耐受性；(3)可通过使用具有不同形态的大分子结构物避开市售的抗衣壳蛋白检验的干扰问题。

具体实施方式

衣壳蛋白的重折叠和重装配受诸多因素的影响，很多的因素还不能明确限定且部分因素至今未知。如果一些相关的因素未知或不能明确限定，就很难重折叠和重装配变性的衣壳蛋白。为解决这个问题，基于以下的原因设计了衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的融合蛋白(FCCP)：(1)病毒衣壳蛋白具有自我装配成颗粒的固有能力；(2)病毒衣壳蛋白可容纳某些长度的在其N-末端或C-末端融合的肽，并仍然保留自我装配成颗粒的能力(12、12、36-37)；(3)分子伴侣蛋白可结合并防止非天然或变性蛋白的聚集并促进它们的折叠(38-59、103-104)；(4)当外源性抗原以颗粒形式存在时，它们所表现出的抗原性在I级和II级通路中较可溶性抗原高出1000或10000倍(5，60-68)。FCCP由衣壳蛋白和分子伴侣蛋白组合而成，所述分子伴侣蛋白通过肽键连接到衣壳蛋白的N-末端或C-末端上，以形成单个分子。设计以上所述的FCCP的目的是：(1)当融合蛋白在宿主系统中重组表达时，可采用一个或多个步骤在高浓度的离液剂中进行分离和纯化的过程，例如高达10M的尿素或Gu.HCl可用于纯化过程中，优选4M-8M的尿素和3M-6M的Gu.HCl；(2)可用包括逐渐去除在纯化的样品中的离液剂的方法来重折叠纯化后均一的FCCP；(3)在重折叠过程中，FCCP将自我装配成含有多个FCCP亚单元的大分子结构物，组装成的大分子结构物可以是VLP结构或含有完全不同形态的其它结构；(4)大分子结构物可用作抗原或表位的运载系统，如基于蛋白质或多肽的抗原或表位可通过重组DNA的方法与FCCP融合，以生成肽键连接的融合蛋白，或者可以通过体外化学连接或缀合到FCCP上；在重组装过程中，纯化的FCCP可用于将所需要的部分，例如核酸、蛋白、肽、激素、抗癌剂和抗病毒剂合并进入大分子结构物中。在FCCP分子中，因为衣壳蛋白固有的自我装配能力，所以其是主要负责组装形成大分子结构物的组分，分子伴侣蛋白是一种使得在高浓度的离液剂的条件下对变性形式的FCCP的纯化以及随后的重折叠和重装配成为可能的组分。单独变性的衣壳蛋白在重折叠过程中通常形成聚集体沉淀，而且由于聚集体的形成，变性的衣壳蛋白通常不能以可溶性的形式存在于非变性溶液中。可能的机制可能涉及衣壳蛋白中的疏水区。衣壳蛋白的疏水区在自我装配和保持VLP结构中很重要，且它们掩埋在VLP结构中的衣壳蛋白内部(69-74)。在高浓度的变性剂中，如尿素或Gu.HCl溶液中，衣壳蛋白被变性且掩埋的疏水区暴露在溶液中。当变性剂在重折叠过程中逐渐从溶液中去除时，暴露的疏水部分之间的逐渐增加的相互作用使得衣壳蛋白形成聚集体。当FCCP处于高浓度的尿素或Gu.HCl中时，衣壳蛋白的疏水区也暴露在溶液中，但是当变性剂在重折叠过程中逐渐从溶液中去除时，融合蛋白中的分子伴侣蛋白可保护衣壳蛋白中暴露的疏水区，使得FCCP可保留在溶液中以进行重折叠和自我装配过程，形成可溶的大分子结构物。FCCP是不同于衣壳蛋白的分子，通过逐渐去除变性的FCCP溶液中的离液剂来进行的体外重折叠和组装的过程，在本质上不同于衣壳蛋白折叠和自我装配成VLPs的自然过程。鉴于上述原因，从本发明制备的大分子结构物的形态可完全不同于真实VLPs。

本发明的一个发现是由不具有真实VLPs的形态的FCCP自我装配形成的大分子结构物具有很好的免疫原性，而且与真实VLPs相比，其可具有下述的优点：(1)可通过使用不同形态的大分子结构物以避开机体对VLPs的预先存在的免疫性；(2)可通过使用具有不同形态的大分子结构物以避开机体对真实衣壳蛋白存在的免疫耐受性；(3)可通过使用不同形态的大分子结构物可避开市售的抗衣壳蛋白检验的干扰问题；(4)大分子结构物在溶液中更稳定。大分子结构物具有很强的免疫原性的原因可能是由于：(1)当外源性抗原以适当大小的颗粒形式存在时，它们所表现出的抗原性在I级和II级通路中较可溶性抗原高出1000或10000倍，本发明的大分子结构物具有颗粒抗原的特征；(2)机体的天然免疫系统可能能够识别FCCP分子中的衣壳蛋白的一些保守序列，并协同机体的其他免疫系统产生强烈持久的免疫学应答。此外，FCCP中的衣壳蛋白可用来包裹核酸。众所周知，一些核酸(如双链RNA和未甲基化的CpG-DNA)能够显著增强免疫应答(75-83)。

本领域的技术人员将会认识和理解到，在FCCP分子中，衣壳蛋白可以是整个蛋白、整个蛋白的一部分、仍然保留有自我装配成含有多个亚单元的大分子结构物的能力的衣壳蛋白的科学突变体或变异体。这些突变体或变异体包括但不限于氨基酸(一般是1-500个、较佳的是1-200个、更佳的是1-50个氨基酸)的添加、缺失、插入和/或取代。本领域的技术人员能够使用公开的方法(106-108)生成所述的衣壳蛋白的突变体或变异体。很多种具有自我装配能力的衣壳蛋白都可用于本发明中。在一个实施方式中，所述的衣壳蛋白是人乙肝(HBV)核心抗原。分子伴侣蛋白可以是全长蛋白、功能等同体，如整个分子伴侣蛋白的片段、分子伴侣蛋白的人为的科学突变体或变异体，本领域的技术人员能够使用公开的方法(91-102、104)生成所述的功能等同体。很多分子伴侣蛋白是热休克蛋白。即，在对升高的环境温度或其它细胞应激反应中表达的蛋白(38-59、105)。该行为的原因是因为蛋白质的折叠受热的影响很大，而热休克蛋白表达的增加有助于修复由于蛋白质错误折叠导致的损害。有些分子伴侣蛋白与正在核糖体中正在合成的蛋白质的肽链的折叠有关。

分子伴侣蛋白有着许多不同的家族；每个家族都以不同的方式协助蛋白的折叠。在诸如E.coli的细菌中，很多这样的蛋白都在高应激条件下高度表达，例如置于高温下。为此，术语“热休克蛋白”已在历史上用于命名这些分子伴侣蛋白。前缀“Hsp”指蛋白是热休克蛋白。

一些常见的分子伴侣蛋白家族是Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100和小分子量的Hsp蛋白家族(38-59)。分子伴侣蛋白不限于Hsp蛋白，本领域的技术人员将认识到，在本发明所提供的方法中，目前未知的分子伴侣蛋白也可用来生成FCCP，只要这些蛋白被发现。在一个实施方式中，所述的分子伴侣蛋白是M.bovis BGG hsp65蛋白(84)。在本发明中，其想法是通过肽键使肽或蛋白连接到衣壳蛋白上形成融合蛋白，，接着对融合蛋白的处理是经过一个或多个步骤在高浓度的离液剂如尿素或Gu.HClr存在下的溶液中在变性的的形式下进行的，然后，纯化的融合蛋白通过从样品中逐渐去除离液剂的方式进行重折叠和自我装配过程以形成大分子结构物。

在FCCP中，可在衣壳蛋白与分子伴侣蛋白之间设置连接子，通常连接子是1-100个氨基酸的肽，较佳的是1-50个氨基酸，更佳的是1-10个氨基酸。特异性的酶裂解位点或化学裂解位点可加到衣壳蛋白与分子伴侣蛋白之间的连接子上。在纯化、重折叠和重装配过程之后，所述的分子伴侣蛋白可用化学方法或酶解方法从FCCP中剪掉。例如，特异性的酶裂解位点可设计在衣壳蛋白与分子伴侣蛋白的结合处，例如，asp asp asp asp lys可由肠激酶识别，且可将此序列引入衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的连接子中，重折叠和重装配之后，肠激酶可用于去除分子伴侣蛋白。

本发明的一个主要目的是使用源自FCCP的大分子结构物来替代源自衣壳蛋白的VLPs作为抗原或表位载体，以增强治疗或预防接种的运载的表位或抗原的免疫原性。

运载异源的抗原或表位的源自FCCP的大分子结构物的组合物可通过以下的方法制备：(1)使异源的抗原或表位化学连接或缀合到FCCP上，或化学连接或缀合到源自FCCP的大分子结构物上；(2)通过肽键使异源的抗原或表位连接到FCCP上，以形成含有所述异源抗原和所述FCCP的单个融合蛋白。异源的抗原可连接到FCCP的N-末端或C-末端上。较佳地，所述的异源抗原可连接至所述的衣壳蛋白。在本发明中，所述抗原可以是任何蛋白、肽或非肽分子或其任意的组合，例如抗原或者抗原片段，或者抗原或其片段的任意的组合，其中所述的抗原或其片段源自：(a)病毒；(b)细菌；(c)寄生虫；(d)朊病毒；(e)肿瘤；(f)自体分子；(g)非肽半抗原分子；(h)过敏原；(i)激素和(j)从(a)到(i)的任意抗原的抗原片段；或者是源自以下的表位：(a)病毒；(b)细菌；(c)寄生虫；(d)朊病毒；(e)肿瘤；(f)自体分子；(g)过敏原和(h)激素。

在一个实施方式中，所述的异源抗原是人乳头瘤病毒E7抗原，且E7抗原通过肽键连接到FCCP的衣壳蛋白的N-末端，以形成含有E7抗原和FCCP的融合蛋白。

一旦选择了衣壳蛋白和分子伴侣蛋白，设计了融合位置的顺序，在某些情况下也可设定连接子，接着，基于蛋白或多肽的抗原或表位可设计融合到FCCP上，形成经肽键连接的单个融合蛋白。较佳地，异源的抗原或表位作为单个融合蛋白连接到FCCP的衣壳蛋白上。通过将融合蛋白序列反向翻译成DNA序列可得到编码融合蛋白质的核苷酸序列。该DNA序列可以通过化学方法合成得到，也可以者通过使用重组DNA技术或者使用化学合成和重组DNA技术的组合得到所述的DNA序列。所述的DNA序列可以通过优化以在所期望的宿主中获得较好的的表达。

所述的核苷酸序列作为单独的开放阅读框架插入到合适的重组表达载体中，所述开放阅读框架带有在选择的系统中适于其表达的必需的补充序列。用表达载体转化或转染适当的宿主细胞。然后培养转化或转染的宿主细胞，并重组表达所期望的融合蛋白。

重组表达的FCCP-异源抗原融合蛋白可使用已知的分离和纯化方法来分离并纯化。这些方法包括但不限于细胞破碎、离心、过滤、盐层析、柱色谱法或其它的色谱法。在分离和纯化方法中的至少一个步骤或多个步骤中使用高浓度的离液剂如尿素或Gu.HCl，用于分离和纯化方法中的尿素或Gu.HCl的浓度可高达10M，对于尿素，较佳的是4M-8M，对于Gu.HCl，较佳的是3M-6M。通过对已知的分离和纯化方法的摸索，本领域的技术人员通常可以获得较佳的分离和纯化方法，并得到高度纯化的样品。

纯化后均一的FCCP-异源抗原融合蛋白以逐渐地去除纯化样品中的离液剂的方法使其重折叠和重装配为含有多单元的FCCP-异源抗原的大分子结构物。有多种可用于去除纯化样品中的离液剂的方法，这些方法包括但不限于透析、超滤和其它方法，如凝胶过滤。

在FCCP-异源抗原融合蛋白中的衣壳蛋白可用来包裹核酸。众所周知，一些核酸(如双链RNA和未甲基化的CpG-DNA)能够显著增强免疫应答。因此，通过将所期望的双链RNA或未甲基化的CpG-DNA加入纯化后的FCCP-异源抗原的变性融合蛋白中，然后通过逐渐去除变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法使变性的FCCP-异源抗原重装配为包裹有双链RNA或未甲基化的CpG-DNA的大分子结构物是很受期望的。

在FCCP-异源抗原融合蛋白中，分子伴侣蛋白的作用是促进变性的衣壳蛋白的重折叠，在某些情况下；在重折叠和重装配过程完成之后去除FCCP中的分子伴侣蛋白是所期望的。通过另外的方法也能制备一种组合物，其分子伴侣蛋白可以从最后的制备物中采用以下的步骤去除：

1.设计一种融合蛋白，其包含衣壳蛋白通过肽键与异源抗原和分子伴侣蛋白相连接，在衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的结合处设计独特的酶裂解位点，所述独特的酶裂解位点是凝血酶裂解位点或任何其它的独特的酶裂解位点；

2.通过表达系统重组生成所述的融合蛋白，其在衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的结合处含有特异性的酶裂解位点；

3.用一个或多个步骤分离和纯化重组表达的变性形式的融合蛋白；其包括使用高浓度的离液剂，例如在分离或纯化过程使用浓度高达10M的尿素或Gu.HCl或者缓冲液，较佳的是4-8M的尿素和3-6M的Gu.HCl。

4.通过包含逐渐地清除在变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法，将所述的融合蛋白重折叠和重装配为大分子结构物；

5.通过使用所需要的酶从大分子结构物中剪切分子伴侣蛋白，如使用凝血酶或肠激酶；

6.将大分子结构物与剪切的分子伴侣蛋白分离；

7.最后的大分子结构物包含有主要是由衣壳蛋白与异源抗原相融合的亚基。

源自运载异源抗原或表位的FCCP的大分子结构物的组合物也可通过使用另外的不同方法制备。

可使用已知的技术将生成的异源抗原或表位和由FCCP或FCCP分子生成的大分子结构物化学缀合或共价连接到一起，例如可以通过一些标准技术，以暴露的酪氨酸残基，或赖氨酸残基的ε-氨基或天门冬氨酸酯或谷氨酸酯的羧基完成共价连接使异源抗原连接到FCCP或FCCP生成的大分子结构物上。异源抗原和从FCCP生成的大分子结构物或FCCP也可以通过亲合相互作用非共价地缀合到一起。任何已知高亲合力的相互作用都可用来非共价地将异源抗原与由FCCP生成的大分子结构物或FCCP相连接。例如，可以将生物素基团加到由FCCP生成的大分子结构物或FCCP上，异源抗原可表达成抗生物素蛋白-抗原融合蛋白。抗生物素蛋白-抗原融合蛋白将能强烈地结合到生物素化的大分子结构物或FCCP。

异源抗原可被重组表达，然后被纯化；或通过化学合成，或者从天然来源分离和纯化而成。

包含FCCP的大分子结构物能从FCCP分子制备。一旦选择了衣壳蛋白和分子伴侣蛋白，设计了融合位置的顺序，在某些情况下也可设定连接子。通过将融合蛋白序列反向翻译成DNA序列可得到编码融合蛋白质FCCP的核苷酸序列。该DNA序列可以通过化学方法合成得到，也可以通过使用重组DNA技术或者使用化学合成和重组DNA技术的组合得到。所述的DNA序列可以通过优化以在所期望的宿主中获得较好的的表达。

所述的核苷酸序列作为单独的开放阅读框架插入到合适的重组表达载体中，所述开放阅读框架带有在选择的系统中适于其表达的必需的补充序列。用表达载体转化或转染宿主细胞。然后培养转化或转染的宿主细胞，并重组表达所期望的融合蛋白。

重组表达的FCCP融合蛋白可使用已知的分离和纯化方法来分离并纯化。这些方法包括但不限于细胞破碎、离心、过滤、盐层析、柱色谱法或其它的色谱法。在分离和纯化方法中的至少一个步骤或多个步骤中使用高浓度的离液剂如尿素或Gu.HCl，用于分离和纯化方法中的尿素或Gu.HCl的浓度可高达10M，对于尿素，较佳的是4M-8M，对于Gu.HCl，较佳的是3M-6M。通过对已知的分离和纯化方法的摸索，本领域的技术人员通常可以获得较佳的分离和纯化方法，并得到高度纯化的样品。

纯化后均一的FCCP融合蛋白以逐渐地去除纯化样品中的离液剂的方法使其重折叠和重装配为含有多单元的FCCP的大分子结构物。有多种去除纯化样品中的离液剂的方法，这些方法包括但不限于透析、超滤和其它方法，如凝胶过滤。

在FCCP融合蛋白中的衣壳蛋白可用来包裹核酸。众所周知，一些核酸(如双链RNA和未甲基化的CpG-DNA)能够显著增强免疫应答。因此，通过将所期望的双链RNA或未甲基化的CpG-DNA加入纯化后的FCCP的变性融合蛋白中，然后通过逐渐去除变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法使变性的FCCP重装配为包裹有双链RNA或未甲基化的CpG-DNA的大分子结构物是很受期望的。

在FCCP融合蛋白中，分子伴侣蛋白的作用是促进变性的衣壳蛋白的重折叠，在某些情况下；在重折叠和重装配过程完成之后去除FCCP中的分子伴侣蛋白是所期望的。通过另外的方法也能制备一种组合物，其分子伴侣蛋白可以从最后的制备物中采用以下的步骤去除：

1.设计FCCP融合蛋白，其在衣壳蛋白和分子伴侣蛋白的结合处具有独特的酶裂解位点，且独特的酶裂解位点是凝血酶裂解位点或肠激酶裂解位点，或者任何其它的独特的酶裂解位点；

3.用一个或多个步骤分离和纯化重组表达的变性形式的融合蛋白，其包括使用高浓度的离液剂，例如在分离或纯化过程使用浓度高达10M的尿素或Gu.HCl或者缓冲液，较佳的是4-8M的尿素和3-6M的Gu.HCl。

4.通过使用包含逐渐地清除变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法，将所述的融合蛋白重折叠和重装配为大分子结构物；

6.将大分子结构物与剪切的分子伴侣蛋白分离；

7.最后的大分子结构物包含有主要是衣壳蛋白的亚基。

可用已有的多种方法来确定根据本发明的方法制备的大分子结构的粒度分布。这些方法包括但不限于分子筛色谱法、超滤，使用测量颗粒大小的仪器，如供应商如Malvern Instruments Ltd(http://www.malvern.com)的粒度测量仪。

因此，本发明的目的是解决现有技术的问题，并提供新颖的具有免疫原性的组合物，该组合物含有所述的大分子结构物，或者含有所述的携带有异源抗原或表位的大分子结构物。

具体而言，本发明的目的是提供一种新颖的方法，其利用衣壳蛋白和分子伴侣蛋白制备大分子结构物。所述的大分子结构物经FCCP自我装配形成，该FCCP是分子伴侣蛋白和衣壳蛋白形成的融合蛋白，或是分子伴侣蛋白和衣壳蛋白的功能性片段融合在一起形成的融合蛋白。

更具体地说，本发明的目的是使用大分子结构作为抗原载体以诱导增强的免疫应答，尤其是抗所携带的抗原或表位的细胞介导的免疫反应。例如，基于蛋白或肽的抗原或表位可经重组DNA技术融合到FCCP上，或者所期望的抗原或表位可化学连接或缀合到FCCP上，或者所期望的抗原或表位也可能经亲合相互作用非共价地进行连接。

本发明的又一目的是提供一种方法，其能在一个或多个步骤中使用高浓度的离液剂(如尿素或Gu.HCl)纯化变性形式的FCCP，然后通过从变性的FCCP样品中逐渐地去除离液剂，将纯化的均一的FCCP重折叠并重装配成大分子结构物。

本发明的又一目的是提供一种包裹或封装大分子结构物中的所期望部分的方法，所期望部分例如是治疗剂或诊断剂。

本发明的又一目的是提供一种新颖的输送系统以在重装配过程中将所期望的部分，如核酸、蛋白、肽、激素、抗癌剂和抗病毒剂并入到大分子结构物中。

本发明的又一目的是提供一种新颖的方法，其能够在可扩展的步骤中制备均一且明确限定的免疫原性的组合物。

本发明的又一目的是提供一种新颖的方法，以制备可能避开对真实VLP预先存在的免疫反应的大分子结构物。

本发明的又一目的是提供一种新颖的方法，以制备可能避开对衣壳蛋白的存在的免疫耐受性的大分子结构物。

本发明的再一目的是提供一种新颖的方法，以制备可以避开涉及市售的基于抗衣壳蛋白测定的干扰的与真实VLP相关的问题。

上述的本发明的具有免疫原性的组合物较佳的是用于治疗性接种。然而，所述组合物也可能用于预防接种。本发明的组合物适合于注射以及其它的给药途径和方法，其包括但不限于标准的肌肉内、皮下、皮层内、静脉内、口服或直肠的途径和方法。此外，本发明的组合物可包含并与其它的药理学上可接受的组分一起给药。本发明的组合物也可通过组合佐剂的或其它辅助的物质来配制，所述佐剂或辅助物质例如是免疫刺激分子，以增强其作为治疗性疫苗的效果，并在接受的宿主内刺激较佳类型的免疫应答。有用的佐剂包括但不限于：双链RNA、未甲基化的CpG-DNA、氢氧化铝。这些佐剂和/或其它的辅助物质可单独使用或根据需要组合使用。

用于治疗或预防目的的本发明的组合物的量为给药后能在患者体内诱导有效的免疫应答的量。此外，给予患者的组合物的量视多种因素而变，这些因素包括但不限于：本发明组合物的配方、佐剂及其用量、患者的身材、年龄、体重、性别、总体健康和免疫学应答状况。本领域的技术人员在其能力范围内可以给予患者有效的量，能调整和操作设定的剂量范围。例如，本发明的组合物的有效的量可以从0.1微克-约10毫克/千克体重，较佳的是1微克-1毫克/千克体重。可间隔给予一种或多种剂量的疫苗。本领域的技术人员可容易地使患者的剂量最优化。

以下的实施例用于解释并进一步说明本发明，但并不解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1运载HPV抗原的FCCP分子

使源自分支杆菌bovis BCG hsp65基因(84)的分子伴侣蛋白-Hsp65融合到乙肝病毒(HBV)亚型ADW2(85-86)的核衣壳蛋白(核心抗原)的C-末端上，以形成FCCP分子。使来自人乳头瘤病毒型16(87)的E7抗原融合到FCCP分子的N-末端上。始于N-末端的单个融合蛋白是E7蛋白，E7抗原的C-末端融合到衣壳蛋白的N-末端，且衣壳蛋白的C-末端融合到Hsp65蛋白的N-末端。所述融合蛋白的理论分子量为89.2KD，并以E7-核心-Hsp65表示。通过化学合成法合成编码E7-核心-Hsp65融合蛋白的DNA序列。编码E7-核心-Hsp65的DNA序列来源于GenBank相应的DNA序列(86-87、110)。

合成的DNA序列命名为Ankegens 2479bp，并克隆进入来自Stratagene的SmaI消化的pBluescript II SK(+/-)以形成pBSK-Ankegens-2479bp(88)。

实施例2 E7-核心-Hsp65融合蛋白的表达和纯化

通过NdeI和EcoRI 从pBSK-Ankegens-2479bp剪下E7-核心-Hsp65DNA片段，然后亚克隆进入pET-23a相应位点，以形成pET-23a-2479(89)。将pET-23a-2479转化至来自Novagen的Rosetta-gami(DE3)。根据Novagen′s pET系统手册，通过使用0.5mM的异丙基-硫代-半乳糖苷(IPTG)来发酵和诱导转化的Rosetta-gami(DE3)细胞，以使E7-核心-BCG65在E.coil细胞中表达。发酵之后，通过离心过滤收获细胞。将100g湿菌悬浮在1000ml缓冲液A(100mMTris-Hcl pH9.0；5mM EDTA)中清洗细胞一次，然后以8500rpm的速度离心30分钟。弃去上清液，然后再次将细胞球悬浮在1000ml的缓冲液B(50mM乙酸钠；2mM EDTA)中。在760bar的压力下，通过匀浆的方法破裂悬浮的细胞，接着以8500rpm的速度离心30分钟。收集上清液并测量其体积。根据0.7g尿素：1ml上清液，将尿素加入上清液中，然后加入氯化钠，使其最终浓度为100mM，再加入L-半胱氨酸至最终浓度为20mM。室温下搅拌所述溶液，以使所有的尿素都溶解，然后在4℃下搅拌过夜。搅拌过夜之后，将样品加到含有300ml的SP-Sepharose(GE Health)的XK-50柱(GE Health)中，所述的SP-Sepharose之前用1M氯化钠清洗并用缓冲液C(50mM乙酸钠、100mMNaCl、2mM EDTA、8M尿素、10mM L-半胱氨酸)平衡。加载样品之后，用10个柱体积的缓冲液D(50mM乙酸钠、100mM NaCl、2mM EDTA、8M尿素、10mM L-半胱氨酸、2.5％Triton-X-100)将柱清洗过夜，以去除内毒素。用缓冲液D清洗过夜之后，用5个柱体积的缓冲液C清洗所述的柱，以去除Triton-X-100，接着用3个柱体积的缓冲液E(50mM乙酸钠、300mM NaCl、2mM EDTA、8M尿素、10mM L-半胱氨酸)清洗柱，以去除污染物。使用缓冲液D(50mM乙酸钠、800mM NaCl、2mM EDTA、8M尿素、10mM L-半胱氨酸)洗脱E7-核心-BCG65融合蛋白。收集洗脱的蛋白并在4×40体积的缓冲液F(50mM乙酸钠、6M尿素)中透析，以除去NaCl和L-半胱氨酸。透析之后，通过分别加入最终浓度为200mM和50mM的亚硫酸钠和连四硫酸钠，进行磺化反应，并在室温下反应过夜。用缓冲液F将经磺化反应后的样品稀释5倍体积，接着，上样到含有150ml的Q-Sepharose(GE Health)的XK-50柱(GE Health)中，所述的Q-Sepharose之前用1M氯化钠清洗并用缓冲液F平衡。上样后，用2个柱体积的95％的缓冲液F和5％的缓冲液G(50mM乙酸钠、1M氯化钠、6M尿素)清洗柱；E7-核心-BCG65采用线性梯度洗脱，该线性梯度起始于95％的缓冲液F和5％的缓冲液G，终止于50％的缓冲液F和50％的缓冲液G；线性梯度的体积为8个柱体积。收集洗脱的E7-核心-BCG65融合蛋白，再使用1×40体积的Tris.HCl pH9.0、含有100mM的NaCl的1X40体积的Tris.HCl pH7.5进行透析，以除去尿素和重折叠E7-核心-BCG65融合蛋白。最终样品(在含有100mM的Tris.HCl pH7.5中的E7-核心-BCG65)中的内毒素的含量低于5EU/mg蛋白。

SDS-PAGE表明纯化的样品含有靠近97.4Kd标记下迁移的单个主带。纯化的样品经N-末端的氨基酸测序后确定其N-末端的氨基酸序列为MHGDTPTLHEYMLD，其与理论上的E7-核心-BCG65的N-末端的序列相符。基于SDS-PAGE和N-末端测序结果，确定纯化的样品为E7-核心-BCG65融合蛋白。

使用Malvern Instruments Ltd的Malvern Zetasizer Nano ZS(http://www.malvern.com)对于重折叠后的E7-核心-BCG65的颗粒大小分布进行了分析测定，测得的样品的Z-平均粒度为：61.3nm，PDI＜0.2。结果质量：好。

重折叠后的E7-核心-BCG65、牛血清白蛋白(BSA，分子量为67Kd的单体蛋白)与HPV L1衣壳蛋白重组表达形成的真实病毒样颗粒(WisonBioengineering Ltd.上海)之间的相对分子量的大小通过分子筛色谱法进行了比较。柱的直径为1.5cm，柱的体积和填料为180ml Sepharose-4B FF(GEHealthcare)；使用的缓冲液是100mM PB、0.4M NaCl，pH6.5；流速为2ml/分；每个样品的样品体积为1ml。重折叠的E7-核心-BCG65的洗脱体积为70ml，与源自HPV L1衣壳蛋白的真实病毒样颗粒相同，BSA的洗脱体积接近150ml。

重折叠后的E7-核心-BCG65在电子显微镜下观察为无定形结构。

在Western蛋白印迹实验中，来自Abcam的乙肝病毒核心抗原的抗体不能检测到重折叠后的E7-核心-BCG65的核心抗原，该结果可能表明该样品能够给予具有预先存在的抗HBV免疫反应的宿主。

实施例3在小鼠中E7-核心-BCG65治疗的治疗和预防效果

E7-核心-BCG65是携带有HPV 16型的E7抗原的FCCP。实验采用表达E7抗原的TC-1肿瘤细胞评价E7-核心-BCG65对患有TC-1肿瘤或受到TC-1肿瘤细胞侵袭的小鼠的治疗和预防应用。

从上海SLAC实验动物有限公司购买6-8周龄(20.0±2.0g)的雌性C57BL/6小鼠。质量控制号：SCXK(上海)2003-0003。

TC-1细胞系为Lin等人所述的以HPV16型E7基因和激活的人C-Ha-ras共同转化C57BL/6小鼠的原代肺细胞得到的表达HPV16型E7蛋白的细胞系(90)。TC-1细胞在RPMI1640培养基中生长，其中该培养基中补充有10％的胎牛血清、2mM的非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸酯和青霉素/链霉素，通过胰蛋白酶消化收获细胞，用PBS将所述细胞清洗3次，然后在PBS中重悬。将1×10⁵个TC-1细胞通过皮下接种到小鼠中，根据小鼠的实验分组，用E7-核心-BCG65或盐水以皮下注射的方式对小鼠进行治疗。

动物实验分组：

通过触诊以监测小鼠的肿瘤存在或不存在，每周2次使用游标卡尺(Vernier Caliber)测量肿瘤的长和宽，以确定肿瘤的体积；测量的结果推断为mm³，并以平均的肿瘤体积±平均的标准误差表示。记录小鼠的生命周期。

在对照组，TC-1接种4天后观察到肿瘤的存在；接种10天后，肿瘤的平均体积长到40mm³，接种36天后长到7499.84mm³。接种后的60天，对照组的所有小鼠都死亡。

在治疗组，接种TC-1的48小时和16天后用E7-核心-BCG65治疗小鼠；接种36天后，肿瘤的平均体积长到181.89mm³(500μg)、671.34mm³(100μg)和2148.57mm³(20μg)。接种之后，所有的小鼠存活60天。

在预防组，14天内用E7-核心-BCG65接种小鼠2次，第二次接种之后，用TC-1对小鼠进行接种；接种36天后，肿瘤的平均体积长到22.43mm³(100μg)和89.08mm³(20μg)。接种之后，所有的小鼠存活60天。

表1：不同实验组的平均肿瘤体积(mm³)(x±s)

本领域的技术人员将会认识到或能够确认，可改变本发明的的基本结构以得到使用本发明的方法的其它的实施方式。因此，应该理解，本发明的范围由所附的权利要求限定，而非以实施例的方式所展现的特定的实施方式来确定。

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110.Hsp65(GenBank Accession：M17705.1 GL 149933)。

Claims

1.一种包括融合蛋白的组合物，其特征在于，所述的融合蛋白包括衣壳(或核衣壳)蛋白、分子伴侣蛋白和通过肽键连接在一起的所期望的抗原。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的所期望的抗原通过肽键连接到权利要求1的融合蛋白中的衣壳蛋白。

3.组合物，其包括至少一种所期望的抗原和通过肽键连接分子伴侣蛋白的衣壳蛋白的融合蛋白。

4.根据权利要求3的组合物，其特征在于，所述的所期望的抗原以化学的方式连接或缀合到权利要求3的融合蛋白上，或者所期望的抗原通过亲合相互作用非共价地连接到权利要求3的融合蛋白上。

5.根据权利要求1和3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的衣壳蛋白是：(a)全长蛋白，(b)全长蛋白的一部分，或(c)(a)或(b)的蛋白的突变体或变异体，其仍然保留自我装配的能力。

6.根据权利要求5所述的衣壳蛋白，其特征在于，所述的衣壳蛋白是乙肝病毒的核心抗原。

7.根据权利要求1和3所述的融合蛋白，其特征在于，所述分子伴侣蛋白是分子伴侣蛋白质家族之一的成员，且其中分子伴侣蛋白是全长蛋白、功能等同体，如全分子伴侣蛋白的功能性片段、分子伴侣蛋白的科学突变体或变异体。

8.根据权利要求7所述的分子伴侣蛋白，其特征在于，所述的分子伴侣蛋白是M.bovis BCG Hsp65蛋白。

9.根据权利要求1和3所述的组合物，其特征在于，所述的所期望的抗原是选自以下的抗原或者抗原的任意组合或者它们的片段：(a)病毒；(b)细菌；(c)寄生虫；(d)朊病毒；(e)肿瘤；(f)自体分子；(g)非肽半抗原分子；(h)过敏原；(i)激素和(j)从(a)到(i)的任意抗原的片段；其中所需抗原包括一种或多种源自以下的表位：(a)病毒；(b)细菌；(c)寄生虫；(d)朊病毒；(e)肿瘤；(f)自体分子；(g)过敏原和(h)激素。

10.权利要求1的组合物的制备方法，其包括以下的步骤：

a)通过表达系统重组制备权利要求1的融合蛋白；

b)在离液剂存在下分离和纯化所述的融合蛋白，藉此得到变性形式的纯化的融合蛋白；

c)通过包括逐渐地去除变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法，将变性的融合蛋白重折叠和重装配为含有多单元的融合蛋白的大分子结构物。

11.如权利要求3所述的组合物的制备方法，其包括以下步骤：

a)通过表达系统重组制备权利要求3的融合蛋白；

c)通过包括逐渐地去除变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法，将所述融合蛋白重折叠和重装配为含有多单元的融合蛋白的大分子结构物；

d)使所期望的抗原化学连接或缀合到大分子结构物上，或者通过亲合相互作用使所期望的抗原非共价地连接到大分子结构物上。

12.权利要求3所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：

a)通过表达系统重组制备权利要求3的融合蛋白；

c)使所期望的抗原化学连接或缀合到变性的融合蛋白上；

d)通过包括逐渐地去除变性的融合蛋白样品中的离液剂的方法，将融合蛋白重折叠和重装配为含有多单元的连接有或缀合有所期望的抗原的融合蛋白的大分子结构物。

13.根据权利要求10-12所述的方法，其特征在于，步骤b)包括使用高达10M的尿素或盐酸胍溶液(或缓冲溶液)，优选4-8M的尿素或3-6M的盐酸胍缓冲溶液作为离液剂。

14.如上所述的大分子结构物的制备方法，其特征在于，在所述融合蛋白的衣壳蛋白与分子伴侣蛋白之间设有特异性的酶裂解位点；且所述的方法进一步包括步骤(a)用识别所述的特异性的酶裂解位点的酶处理所述的大分子结构物；以及(b)收获经过酶处理的大分子结构物。

15.根据权利要求10-12和14所述的大分子结构物，其特征在于，所述的大分子结构物具有与真实病毒样颗粒(VLPs)不同的形态。

16.组合物，其包括：

a)任意一种如上所述的组合物；

b)至少一种免疫刺激的物质。

17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述的免疫刺激的物质是含未甲基化的CpG的寡核苷酸，或双链RNA，并结合或包裹进入所述的大分子结构物中。

18.一种在宿主体内对所期望的抗原产生免疫应答的方法，其包括对宿主给予有效量的来自上述任意一种组合物的组合物。

19.一种预防和治疗接种的方法，其包括给予有需要的宿主有效量的来自上述任意一种组合物的组合物，其中疾病的预防或疾病的治疗涉及抗所期望抗原的免疫应答。

20.一种组合物，其包括至少一种如上所述的大分子结构物，其特征在于，所述组合物在给予组合物的宿主体内诱导产生针对衣壳蛋白的所期望的免疫应答。

21.一种组合物，其包括：

a)权利要求20所述的组合物；

b)至少一种免疫刺激的物质。

22.根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述的免疫刺激的物质是含未甲基化的CpG的寡核苷酸，或双链RNA，并结合或包裹进入所述的大分子结构物中。

23.一种在宿主体内对衣壳蛋白抗原产生免疫应答的方法，其包括给予有效量的来自上述任意一种组合物的组合物。

24.一种预防或治疗接种的方法，其包括给予有需要治疗的宿主有效量的来自上述任意一种组合物的组合物，其中疾病的预防或疾病的治疗涉及抗衣壳蛋白的免疫应答。

25.一种通过使用来自上述任意一种组合物的组合物来给予宿主以避开对真实VLPs预先存在的免疫性的方法，其特征在于，所述的组合物包括具有与真实VLPs不同形态的大分子结构物。

26.一种通过使用来自上述任意一种组合物的组合物给予宿主以避开对真实病毒样颗粒存在的免疫耐受性的方法，其特征在于，所述的组合物包括具有与真实病毒样颗粒不同形态的大分子结构物。

27.一种通过使用来自上述任意一种组合物的组合物给予宿主以避开真实病毒样颗粒干扰市售的抗衣壳蛋白检验的问题的方法，其特征在于，所述的组合物包括具有与真实病毒样颗粒不同形态的大分子结构物。