CN1544638A - 可载荷多肽的病毒样颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明通过基因工程技术将大肠杆菌热休克蛋白Hsp70家族中的成员DnaK的多肽结合结构域呈现在乙肝核心抗原HbcAg的MIR区，使其体外装配为50nm左右大小的纳米级颗粒。这种含有200多个多肽结合结构域的纳米颗粒可以用于荷载和传输疫苗多肽和多肽衍生物。

Description

可载荷多肽的病毒样颗粒

本发明涉及基因工程、生物化学和免疫学领域。更具体地，本发明涉及一种新的能以非共价方式载荷多肽的病毒样颗粒，构成该颗粒的蛋白分子氨基酸序列和对应的基因序列，用于表达该基因的表达载体和工程菌，以及该病毒样颗粒的制备方法和用途。

当前的多肽疫苗有以下几方面的缺点：1.国外通常将疫苗多肽与白喉毒素或破伤风毒素偶联来强化免疫原性，对于已经免疫过白喉和破伤风疫苗的患者，会出现表位抑制，降低效果；2.往往需要添加佐剂才能激发较强的免疫反应；3.注射才能激发较强的免疫反应；4.需要反复多次注射加强免疫，才能激发机体产生高滴度高亲和力抗体；由于被免疫者的顺应性较差，不完全免疫的情况时常发生；

通常，尺度在几十个纳米的颗粒在肌体内容易被巨噬细胞，树突状细胞等专职抗原递呈细胞摄取.本发明的直接目的是通过发展一种能自主聚合成为纳米颗粒，不需要化学偶联就能载荷疫苗多肽的“病毒样颗粒”，这种纳米颗粒可以不需要添加佐剂激发机体产生强烈免疫应答；通过非注射途径也能激发机体产生强的免疫应答。

乙肝核心抗原是一种由240个亚基自聚合的纳米颗粒蛋白，由于它很容易被专职抗原递呈细胞摄取，因此，不需要佐剂就能诱发肌体产生强烈的免疫应答。国内外许多学者都将肿瘤抗原多肽插入乙肝核心抗原突起的表位区(MIR)，研制肿瘤疫苗。通常，疫苗多肽须与载体蛋白共价结合才能强化多肽的免疫原性，仅仅与载体蛋白混合通常不能提高多肽的免疫原性。然而，HSP70家族热激蛋白的多肽结合凹槽较为特殊，只须将疫苗多肽与HSP70混合，使疫苗多肽的部分肽段嵌入凹槽中，不需额外添加佐剂就能提高多肽的免疫原性，热休克蛋白Hsp70这种在位佐剂(built-in adjuvant)功能已经被人们广泛用于免佐剂疫苗的开发.本发明是将大肠杆菌HSP70的多肽结合结构域呈现到HBcAg的突起处，将这种融合多肽在体外聚合成为纳米尺度的颗粒(直径约50-60nm)，这样，在每个颗粒表面呈现有200多个源于HSP70能结合多肽的小beta-折迭桶结构。将带有能与HSP70高亲和力结合的疫苗多肽与这种纳米粒混合，多肽将嵌入纳米粒表面的多肽结合凹槽中，在机体内很容易被树突状细胞、巨噬细胞摄取和递呈，不需要佐剂就能诱发机体产生强烈的免疫应答。

本发明的目的是提供一种能非共价结合多肽的病毒样颗粒并提供构成病毒样颗粒亚基的氨基酸序列和为之编码的DNA序列。

本发明的另一目的是提供制备这种病毒样颗粒的方法.

本发明的再一目的是提供这种病毒样颗粒的用途。

在本发明的第一方面，提供一种能非共价结合多肽的病毒样颗粒并提供构成病毒样颗粒亚基的氨基酸序列和为之编码的DNA序列。该病毒样颗粒是将大肠杆菌热休克蛋白Hsp70家族成员DnaK的多肽结合结构域呈现在乙肝核心抗原颗粒表面得到，构成该病毒样颗粒亚基具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。提供了编码该构成病毒样颗粒亚基的DNA序列包括SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供制备能非共价结合多肽的病毒样颗粒的方法.其技术路线详述如下：

1.从乙型肝炎病人血样中扩增获得HBcAg1-149的核苷酸，插入市售的质粒载体pET28a中。乙肝病毒核心抗原基因全长可编码183个氨基酸残基，本发明只选取1-149位氨基酸，这样做的目的使该外壳蛋白不会将菌体的核酸包裹到颗粒内，这有利于以后的分离纯化，也增加了最终产品的安全性。

2.从大肠杆菌基因组DNA中扩增获得编码DnaK多肽结合结构域的DNA，它包括SEQ ID NO.2中90-200位的氨基酸序列，并且在其两端引入柔性肽段(G)₄S(G)₄，用以克服空间因素的影响。

3.在HBcAg1-149中引入限制性内切酶AgeI的识别位点，将编码DnaK的多肽结合结构域的核苷酸序列插入AgeI位点，形成病毒样颗粒的的表达载体质粒，它含有上述的编码该病毒样颗粒的的DNA序列。重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。这种编码能非共价结合多肽的病毒样颗粒的DNA能引入多种类型的宿主细胞中表达，可以是原核生物如大肠杆菌，芽孢杆菌等，也可以病毒样颗粒的是酵母或哺乳动物细胞等真核生物细胞。较佳的，该宿主细胞是原核细胞，更佳的是大肠杆菌。

4.工程菌发酵及重组病毒样颗粒多肽的获得以LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，在玉米浆培养基中37℃培养重组工程菌，通过添加乳糖继续培养2-12小时诱导细胞表达病毒样颗粒蛋白。发酵参数如下：温度36-38℃，pH6.8-7.2。以洗涤液I20mmol Tris-HCl(pH8.0)，0.75％TritonX100，5mmolEDTA，洗涤液II 2M Urea，洗涤液III 8M Urea+10mmol巯基乙醇分步洗涤包涵体。

5.病毒样颗粒的体外装配

在50mmolTris-HCl(pH8.5)中以尿素8M～0M建立梯度透析3天，再在50mmol Tris-HCl(pH7.0)中以NaCl0mM～500mM建立梯度透析1天，用SephadexG-150柱层析分离，收集最先出来的峰，获得较纯的病毒样颗粒。

6.病毒样颗粒的电镜观察，磷钨酸负染色法和醋酸双氧铀正染色法是电子显微镜检查的常规方法。用这两种方法都能观察到纳米尺度的病毒样颗粒。用磷钨酸负染色法，背景为黑色，病毒样颗粒的蛋白为白色，颗粒中由于无核酸存在，故染料能够进入壳中，使颗粒核心为浅灰色，外周一圈白色为DnaK多肽结合结构域。用醋酸双氧铀正染色法，其特征在于，背景为白色，蛋白为黑色，可以看到HBcAg为黑色，外周一圈DnaK为浅黑色。

在本发明的第三方面是提供这种病毒样颗粒的用途。在免疫学研究领域，人们常常将抗原插入病毒外壳蛋白，使抗原能呈现到病毒样颗粒的表面，研制成强免疫原性且不需佐剂的疫苗。本发明不是将抗原肽段直接插入病毒外壳蛋白基因中，而是将能结合多肽的DnaK多肽结合结构域呈现到乙肝核心抗原颗粒表面，凭借DnaK多肽结合结构域与多肽的结合，间接将多肽捕获到病毒样颗粒的表面，这使得该病毒样颗粒具有以下常规病毒样颗粒不具备的功能：

1、该病毒样颗粒可以装载混合的多肽，如从肿瘤组织中提取的抗原多肽混合物。

2、该病毒样颗粒不仅可以装载多肽，也能装载多肽衍生物，如接加了甘露糖的多肽。

3、该病毒样颗粒可以装载二聚化的多肽或分枝的多肽，这有利于进一步提高多肽的免疫原性。

实施例

材料

(1)菌株与质粒：

宿主菌E.coli BL21(DE3)由本实验室保存

质粒pCR3.1-Uni、pET-28a购自Invitrogen公司

(2)乙肝病毒

提取自南京市第二医院HBcAg阳性病人血清

(3)酶和试剂

分子克隆工具酶购自MBI公司

PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品

乙肝病毒基因组提取试剂盒为Qiagen公司产品

树脂Sephadex G-150为上海化学试剂厂产品

其它试剂向上海生工订购

(4)培养基

LB培养基，配方见《分子克隆实验指南》。

方法

PCR、反转录PCR、质粒提取、内切酶、DNA片段的纯化、回收、连接、转化大肠杆菌等：操作方法见《分子克隆实验指南》(第三版)  (美)J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔 著 科学出版社。

重组蛋白分离纯化方法：反复冻融法破碎菌体、包涵体分步复性和柱层析。电镜照片：中国药科大学电镜室拍摄

实施例1.pET-C149’的构建

用QIAamp DNA Blood Mini Kit从南京市第二医院HBcAg阳性病人血清中提取乙肝病毒基因组RNA。并用市场销售的随机引物将RNA反转录为DNA，根据乙肝核心抗原基因序列分别合成两队对能与该基因互补的引物(P1 5’AAA AAGCTT ATG GAC ATT GAC ACG TAT AAA GAA 3’和P2 5’TTT TTC TGC AGA CCG GTTGGG TCT TCC AAA TTA CTT CC 3’；P3 5’ATC ACC GGT CGG GAA TTA GTA GTCGGT TAT GTC AAT G 3’和P4 5’TTG TCT AGA CTA ACA TTG AGA TTC CCG AGA TTG3’)，以反转录获得的乙肝病毒DNA为模板，以P1和P2扩增出HbcAg的N端，再以P3和P4扩增出HBcAg的C端，经过酶切依次连入pCR3.1-Uni，这样就在HBcAg的80、81位引入了AgeI位点。然后再设计一对引物Px和Px，以前面构建的质粒为模板扩增出HBcAg1-149，经NcoI和HindIII双酶切，连接入pET-28a，转化大肠杆菌BL21后经PCR筛选，得到重组工程菌BL21/pET-C149，从该工程菌中抽提的质粒由上海生工公司用核苷酸自动测序仪进行测定。

实施例2.工程菌BL21/pET-C149-DnaK的构建

设计和合成一对寡核苷酸引物(P5 5’CGC ACC GGT GGT GGT GGTAGC GGTGGT GGT GGT ACC CCG CTG TCT CTG GGT A 3’和P6 5’GGG ACC GGT ACC ACCACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA AGC CTT GAT GGT GAT CTT CT 3’)，以提取的大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增出DnaK多肽结合结构域的基因片段，经AgeI酶切后，连入用相同的酶切开的pET-C149，转化大肠杆菌BL21，经PCR筛选确定插入方向，得到阳性克隆。从该工程菌中抽提的质粒pET-C149-DnaK由上海生工公司用核苷酸自动测序仪进行测定。

实施例3.含DnaK多肽结合结构域的病毒样颗粒的制备

工程菌的培养：从平皿中挑取单菌落接入LB培养基，37℃培养至对数生长期作为一级种子，以2％接种量接入到含250毫升玉米浆培养基的1000ml摇瓶中，37℃摇床培养4小时后，加入2％乳糖诱导，继续培养12小时后收集菌体。

重组蛋白的分离纯化：4800rpm离心20min收集菌体，每1克湿菌体加入0.8mg溶菌酶，悬浮于4ml菌体裂解液(0.05MpH8.0Tris-HCl，0.5％(v/v)100％Triton)中，反复冻融2次，加入DNaseI 37℃摇床消化0.5小时。15000rpm离心30min得到包涵体，以洗涤液I 20mmolTris-HCl(pH8.0)，0.75％TritonX100，5mmolEDTA，洗涤液II 2M Urea，洗涤液III 8M Urea+10mmol巯基乙醇分步洗涤包涵体。在50mmolTris-HCl(pH8.5)中以尿素8M～0M建立梯度透析3天，再在50mmol Tris-HCl(pH7.0)中以NaCl0mM～500mM建立梯度透析1天，用Sephadex G-150柱层析分离，收集最先出来的峰，获得较纯的病毒样颗粒。

实施例5.电镜拍照

a.磷钨酸负染色：背景为黑色，蛋白多肽为白色。

b.醋酸双氧铀正染色：背景为白色，蛋白多肽为黑色。

图1，重组质粒pET-C149’。

图2.重组质粒pET-C149’-Dnak。

图3.重组可载荷多肽的病毒样颗粒基因测序结果。

图4.SDS-PAGE电泳显示重组可载荷多肽的病毒样颗粒基因的表达.1.标准分子量蛋白；2.空载宿主菌大肠杆菌BL21细胞全蛋白，3.载荷pET-C149’质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；4.载荷pET-C149’-Dnak质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白。A箭头显示乙肝核心抗原1-149多肽的位置；B箭头显示插入了Dnak多肽结合结构域的乙肝核心抗原1-149多肽的位置。

图5.SDS-PAGE电泳显示重组可载荷多肽的病毒样颗粒的纯化.1.标准分子量蛋白；2.洗涤液I处理后的上清；3.洗涤液I处理后的沉淀；4.洗涤液II处理后的上清；5.洗涤液II处理后的沉淀；6.洗涤液III处理后的上清；7.洗涤液III处理后的沉淀。

图6.非变性SDS-PAGE电泳显示重组可载荷多肽的病毒样颗粒的复性。1.标准分子量蛋白；2.洗涤液I处理后的沉淀(重组可载荷多肽的病毒样颗粒复性前)；3.复性后的重组可载荷多肽的病毒样颗粒。

图7.可载荷多肽的病毒样颗粒的电镜照片(醋酸双氧铀正染色法)。

图8.可载荷多肽的病毒样颗粒的电镜照片(磷钨酸负染色法)。

序列表

1.一般信息：

(1)申请人：中国药科大学

(2)发明名称：可载荷多肽的病毒样颗粒

(3)序列数目：2

2.SEQ ID NO.1的信息：

(1)序列特征：

(A)长度：840bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(2)分子类型：DNA

(3)序列描述：SEQ ID NO.1：

ATGGACATTG ACACGTATAA AGAATTTGGA GCTTCTGTGG AGTTACTCTC TTTTTTGCCT  60

TCTGACTTCT TTCCTTCTAT TCGAGATCTC CTCGACACCG CCTCAGCTCT ATATCGGGAG 120

GCCTTAGAGT CTCCGGAACA TTGTTCACCT CACCATACAG CACTCCGGCA AGCTATTCTT 180

TGTTGGGGTG AGTTGATGAA TCTGGCCACC TGGGTGGGAA GTAATTTGGA AGACCCAACC 240

GGTGGTGGTG GTAGCGGTGG TGGTGGTGTT ACCCCGCTGT CTCTGGGTAT CGAAACCATG 300

GGCGGTGTGA TGACGACGCT GATCGCGAAA AACACCACTA TCCCGACCAA GCACAGCCAG 360

GTGTTCTCTA CCGCTGAAGA CAACCAGTCT GCGGTAACCA TCCATGTGCT GCAGGGTGAA 420

CGTAAACGTG CGGCTGATAA CAAATCTCTG GGTCAGTTCA ACCTGGATGG TATCAACCCG 480

GCACCGCGCG GCATGCCGCA GATCGAAGTT ACCTTCGATA TCGATGCTGA CGGTATCCTG 540

CACGTTTCCG CGAAAGATAA AAACAGCGGT AAAGAGCAGA AGATCACCAT CAAGGCTTCT 600

GGTGGTGGTG GTTCTGGTGG TGGTGGTACC GGTCGGGAAT TAGTAGTCGG TTATGTCAAT 660

GTTAATATGG GCCTGAAAAT CAGACAACTA TTGTGGTTTC ACATTTCCTG TCTTACTTTT 720

GGAAGAGAAA CTGTCCTTGA ATATTTGGTG TCTTTTGGAG TGTGGATTCG CACTCCTCCC 780

GCTTACAGAC CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGGAAACTAC TGTTGTTTAA 840

3.SEQ ID NO.2的信息：

(1)序列特征：

(A)长度：280个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构：线性

(2)分子类型：多肽

(3)序列描述：SEQ ID NO.2：

MDIDTYKEFG ASVELLSFLP SDFFPSIRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL  60

CWGELMNLAT WVGSNLEDPT GGGGSGGGGV TPLSLGIETM GGVMTTLIAK NTTIPTKHSQ 120

VFSTAEDNQS AVTIHVLQGE RKRAADNKSL GQFNLDGINP APRGMPQIEV TFDIDADGIL 180

HVSAKDKNSG KEQKITIKAS GGGGSGGGGT GRELVVGYVN VNMGLKIRQL LWFHISCLTF 240

GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV#                       280

Claims (8)

1.一种能载荷多肽的病毒样颗粒，其特征在于，该颗粒由大肠杆菌热休克蛋白Hsp70家族中DnaK的多肽结合结构域呈现在乙肝核心抗原表面得到。

2.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其特征在于，构成该颗粒的亚基具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种构建的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求3所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列包括SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求3所述DNA序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5所述的表达载体所转化。

7.一种产生该病毒样颗粒的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将乙肝核心抗原的核苷酸序列可操作地连接于表达调控序列，在将编码DnaK的多肽结合结构域的核苷酸序列插入乙肝核心抗原突起的表位区(MIR)，形成病毒样颗粒的表达载体。

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成能表达病毒样颗粒蛋白的重组细胞。

(c)在LB培养基中37℃培养重组工程菌，通过添加乳糖继续培养2-12小时诱导细胞表达病毒样颗粒蛋白。

(d)反复冻融菌体三次，加溶菌酶、DNaseI消化30分钟，15000rpm离心30分钟，以洗涤液I 20mmolTris-HCl(pH8.0)，0.75％TritonX100，5mmolEDTA，洗涤液II 2M Urea，洗涤液III 8M Urea+10mmol巯基乙醇分步洗涤包涵体。在50mmolTris-HCl(pH8.5)中以尿素8M～0M建立梯度透析3天，再在50mmolTris-HCl(pH7.0)中以NaCl0mM～500mM建立梯度透析1天，用SephadexG-150柱层析分离，收集最先出来的峰，获得较纯的病毒样颗粒。

8.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其功能在于能通过颗粒表面的DnaK的多肽结合结构域非共价结合多肽，能用于向机体传输疫苗多肽，也能用于向机体传输能与机体细胞表面受体结合的多肽和多肽衍生物。

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