CN101525378B

CN101525378B - 鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用

Info

Publication number: CN101525378B
Application number: CN2009100200859A
Authority: CN
Inventors: 肖鹏; 莫照兰; 王波; 李�杰
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2009-03-28
Filing date: 2009-03-28
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2029-03-28
Also published as: CN101525378A

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ IDNO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO：2所示。所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。该表达蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。

Description

鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。

背景技术

鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)是一种革兰氏阴性杆状细菌，是淡水和海水养殖鱼类和野生鱼类的病原菌，引起鱼类的出血性败血症，造成世界范围鱼类养殖的重大经济损失。在我国，鳗利斯顿氏菌不仅是养殖对虾红腿病症的病原，还是鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、石斑鱼和欧洲鳗鲡等鱼类的皮肤肌肉溃烂、出血症病原，对我国养殖鱼类的危害巨大。

VI型分泌系统(Type VI Secret System，T6SS)是最近确定的一种新的细菌分泌系统，它参与细菌的致病作用，并已经在多个植物或动物的病原菌中发现。目前的研究表明，革兰氏阴性细菌的T6SS基因簇结构比较保守，一般由12至25个基因组成，其中包括一个基质蛋白基因hcp。hcp基因在不同细菌中具有较高的保守性，它编码的蛋白在T6SS的分泌过程中具有重要作用，研究表明它可能作为T6SS的基质蛋白参与组装分泌通道，hcp基因的缺失可以阻断T6SS的分泌。但目前还没有关于HCP蛋白具有免疫保护效果的文献报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白：鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO：2所示。

鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用：所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重～0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。

本发明所具有优点如下：

1.hcp基因在细菌中的保守性较高，本发明以lahcp基因的表达蛋白制备的亚单位疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱导水产养殖动物的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。

2.本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。

3.本发明的抗原蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。

附图说明

图1为本发明鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸电泳图。

图2为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白质谱分析结果。

图4为使用本发明疫苗免疫牙鲆后鳗利斯顿氏菌感染牙鲆死亡情况图。

图5为使用本发明疫苗免疫蓝鳗龙后鳗利斯顿氏菌感染蓝鳗龙死亡情况图。为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗鳗利斯顿氏菌抗体效价变化情况图。

图6为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗LAHCP抗体效价变化情况图。

具体实施方式

下面根据附图说明和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

根据鳗利斯顿氏菌T6SS基质蛋白基因lahcp的核酸序列，以及载体pETDuet(购自Novagen公司)的酶切图谱设计扩增引物：

lahcp-for-EcoRI：5’-GGCGAATTCATGCCAACTGCATG-3’(下划线碱基序列为限制性内切酶EcoRI的识别位点)；

lahcp-rev-SalI：5’-ATCGGTCGACTTACGCTTCAACAG3’(下划线碱基序列为限制性内切酶SalI的识别位点)。

以鳗利斯顿氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应(PCR仪购自Takara公司，型号TP600)，反应体系与反应参数如下：(试剂尽量用中文表示)

PCR反应体系(25μL)

10×PCR buffer 2.5μL

dNTP混合液 0.5μL(各0.2mM)

MgCl₂ 2.0μL(1.5mM)

引物lahcp-for-EcoRI 0.5μL(0.5μM)

引物lahcp-rev-SalI 0.5μL(0.5μM)

鳗利斯顿氏菌基因组DNA 1.0μL(30ng)

Taq酶 0.25μL(5U/μL)

灭菌双蒸水 17.75μL

反应体系 25.0μL

PCR反应参数

95℃ 3min

72℃ 15min

end

反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得一个519bp的DNA片段(参见图1)。使用PCR产物纯化试剂盒(Invitrogen公司)回收目的片断，将目的片断与pGMT(tiangen公司)载体连接，连接反应体系如下：

连接反应体系(10μL)

10×ligation buffer 1μL

聚乙二醇 1μL

pGM-T 1μL

PCR产物 3μL

T4连接酶 1μL

灭菌双蒸水 3μL

反应体系 10μL

反应混合物于16℃恒温过夜。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用抗生素(氨苄青霉素)与α互补实验筛选目标重组质粒阳性大肠杆菌单菌落，提质粒，将此重组质粒命名为pGMT-lahcp，对其进行测序(上海博亚公司)，测序结果表明获得了序列正确的鳗利斯顿氏菌lahcp基因片断(参见序列表SEQ ID NO：1)。

SEQ ID NO：1

ATGCCAACTGCATGTTATATCTCTATCGAAGGCGAAACTCAGGGCCT

GATCACTGCTGGTGCTCTGTCTACTGATTCACTCGGTGATGCGTTCG

TTGAAGGTCATGAAGACCAAATGTTGGTTCAACAATTTGACCACGT

TGTAACTGTACCGACTGATCCACAATCAGGTCAGCCTTCTGGTCAA

CGTGTTCACAAACCATTTAAATTCACCGTAGCGCTAAACAAAGCGG

TTCCTCTTCTTTATAACGCACTGGCGTCTGGCGAGAAGATGAAATCG

GTTGAGCTAAAATGGTACCGCACTTCTATCGAAGGTAAGCAAGAGA

ACTTCTTCACTACTACACTCGAAAGCGCGTCTATCGTGGACATTCAC

TGTGAAATGCCACACTGCCAAGATCCAGCGAACGGCGACTTCACA

CAAAACGTTACGGTTTCTATGTCTTACCGTAAAATCCTGTGGGATCA

CGTGAATGCGGGTACTTCAGGCTCTGACGACTGGCGCAAGCCTGTT

GAAGCGTAA

a)序列特征：

●长度：519bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：鳗利斯顿氏菌

将pGMT-lahcp用限制性内切酶EcoR和SalI(Takara公司)进行双酶切，酶切体系如下：

H-buffer 1μL

质粒(Plasmid) 1μL

EcoRI&SalI 各0.5μL

超纯水(DDw) 7μL

反应总体系 10μL

将酶切产物用T4DNA连接酶(Takara公司)连接入载体pETDuet的EcoRI和SalI酶切位点之间，连接反应体系如下：

连接反应体系(10μL)

10×ligation buffer 1μL

PEG4000 1μL

pETDuet 1.5μL

酶切产物 4.5μL

T4连接酶 1μL

灭菌双蒸水 1μL

反应体系 10μL

反应混合物于16℃恒温过夜。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用抗生素(氨苄青霉素)筛选目标重组质粒阳性大肠杆菌单菌落，提质粒，将此重组质粒命名为pETDuet-lahcp。

将构建好的质粒pETDuet-lahcp，转化入大肠杆菌表达工程菌BL21(DE3)中，采用抗生素(氨苄青霉素)筛选阳性大肠杆菌菌落，接种于5ml LB液体培养基中，在37℃下培养12小时，然后按照1∶100的比例将菌液接种于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养3-4小时至OD600达0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，在相同条件下继续培养4小时。培养结束后，离心收集菌体，用PBS洗涤两遍，完全除去培养液，最后重悬于PBS；用超声波裂解细菌，超声5s间隔10s，200W，破菌时间为90min-120min，直至菌液澄清。

因重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，用镍鳌合的琼脂糖柱Ni-Sepharose(购自Qiagen公司)进行亲合纯化，纯化步骤依照产品说明书进行。首先将初步纯化的蛋白溶液加到平衡好的Ni-Sepharose上，以清洗液(50mM磷酸缓冲液，200mM氯化钠，pH7.8)洗3～5个柱体积；然后以含有梯度浓度咪唑的洗涤液(50mM磷酸缓冲液，200mM氯化钠，10-400mM咪唑，pH7.8)各洗3个柱体积，释放重组蛋白。进行SDS-PAGE电泳检测纯化结果(参见图2)。通过蛋白质质谱分析，得纯化的表达蛋白LAHCP，即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白(参见图3和序列表2)。

SEQ ID NO：2

MPTACYISIEGETQGLITAGALSTDSLGDAFVEGHEDQMLVQQFDHVV

TVPTDPQSGQPSGQRVHKPFKFTVALNKAVPLLYNALASGEKMKSVE

LKWYRTSIEGKQENFFTTTLESASIVDIHCEMPHCQDPANGDFTQNVT

VSMSYRKILWDHVNAGTSGSDDWRKPVEA

(a)序列特征：

●长度：172氨基酸残基

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：鳗利斯顿氏菌

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂(Sigma)，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内，免疫后30天仍按上述的剂量进行加强免疫，同时将上述完全弗氏佐剂采用不完全弗氏佐剂(Sigma)替换，仍按按体积1∶1比例将其与鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白混合，按：2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内。

实施例2

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于大菱鲆体内。

实施例3

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。

实施例4

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。

实施例5

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。

应用例1

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内，免疫后30天进行加强免疫。再将上述蛋白与不完全弗氏佐剂按体积1∶1比例将其混合，而后以蛋白注射用量：2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内。

第二次免疫后第30天取免疫牙鲆，以鳗利斯顿氏菌进行注射攻毒实验，鳗利斯顿氏菌的感染浓度为1.28×10⁷cells/mL，每尾注射0.1mL，持续观察8天，记录各组死亡情况(参见图4)。

应用例2

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。免疫后第30天取免疫鱼，以鳗利斯顿氏菌进行注射攻毒实验，鳗利斯顿氏菌的感染浓度为2.13×10⁴cells/mL，每尾注射0.1mL，持续观察8天，记录各组死亡情况(参见图5)。

应用例3

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于大菱鲆体内，分别于免疫后的第7、14、21、28天，采集免疫大菱鲆的血液制备血清，通过ELISA方法检测抗体效价(参见图6)。

序列表.txt

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>519

<212>DNA

<213>鳗利斯顿氏菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(519)

<223>

<400>1

atg cca act gca tgt tat atc tct atc gaa ggc gaa act cag ggc ctg 48

Met Pro Thr Ala Cys Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Glu Thr Gln Gly Leu

1 5 10 15

atc act gct ggt gct ctg tct act gat tca ctc ggt gat gcg ttc gtt 96

Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val

20 25 30

gaa ggt cat gaa gac caa atg ttg gtt caa caa ttt gac cac gtt gta 144

Glu Gly His Glu Asp Gln Met Leu Val Gln Gln Phe Asp His Val Val

35 40 45

act gta ccg act gat cca caa tca ggt cag cct tct ggt caa cgt gtt 192

Thr Val Pro Thr Asp Pro Gln Ser Gly Gln Pro Ser Gly Gln Arg Val

50 55 60

cac aaa cca ttt aaa ttc acc gta gcg cta aac aaa gcg gtt cct ctt 240

His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu

65 70 75 80

ctt tat aac gca ctg gcg tct ggc gag aag atg aaa tcg gtt gag cta 288

Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu

85 90 95

aaa tgg tac cgc act tct atc gaa ggt aag caa gag aac ttc ttc act 336

Lys Trp Tyr Arg Thr Ser Ile Glu Gly Lys Gln Glu Asn Phe Phe Thr

100 105 110

act aca ctc gaa agc gcg tct atc gtg gac att cac tgt gaa atg cca 384

Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser Ile Val Asp Ile His Cys Glu Met Pro

115 120 125

cac tgc caa gat cca gcg aac ggc gac ttc aca caa aac gtt acg gtt 432

His Cys Gln Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gln Asn Val Thr Val

130 135 140

tct atg tct tac cgt aaa atc ctg tgg gat cac gtg aat gcg ggt act 480

Ser Mer Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr

145 150 155 160

tca ggc tct gac gac tgg cgc aag cct gtt gaa gcg taa 519

Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala

165 170

<210>2

<211>172

<212>PRT

<213>鳗利斯顿氏菌

<400>2

Met Pro Thr Ala Cys Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Glu Thr Gln Gly Leu

1 5 10 15

Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val

20 25 30

Glu Gly His Glu Asp Gln Met Leu Val Gln Gln Phe Asp His Val Val

35 40 45

Thr Val Pro Thr Asp Pro Gln Ser Gly Gln Pro Ser Gly Gln Arg Val

50 55 60

His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu

65 70 75 80

Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu

85 90 95

Lys Trp Tyr Arg Thr Ser Ile Glu Gly Lys Gln Glu Asn Phe Phe Thr

100 105 110

Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser Ile Val Asp Ile His Cys Glu Met Pro

115 120 125

His Cys Gln Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gln Asn Val Thr Val

130 135 140

Ser Met Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr

145 150 155 160

Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala

165 170

<210>3

<211>172

<212>PRT

<213>鳗利斯顿氏菌

<220>

<221>PRT

<222>(1)..(172)

<223>

<400>3

Met Pro Thr Ala Cys Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Glu Thr Gln Gly Leu

1 5 10 15

Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val

20 25 30

Glu Gly His Glu Asp Gln Met Leu Val Gln Gln Phe Asp His Val Val

35 40 45

Thr Val Pro Thr Asp Pro Gln Ser Gly Gln Pro Ser Gly Gln Arg Val

50 55 60

His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu

65 70 75 80

Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu

85 90 95

Lys Trp Tyr Arg Thr Ser Ile Glu Gly Lys Gln Glu Asn Phe Phe Thr

100 105 110

Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser Ile Val Asp Ile His Cys Glu Met Pro

115 120 125

His Cys Gln Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gln Asn Val Thr Val

130 135 140

Ser Met Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr

145 150 155 160

Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val G1u Ala

165 170

Claims

1.一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白，其特征在于：鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白，氨基酸序列如表SEQ ID NO：2所示。

2.一种按权利要求1所述的鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用，其特征在于：所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白在制备防治鳗利斯顿氏菌病的药物的应用。

3.按权利要求2所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白在制备防治鳗利斯顿氏菌病的药物的应用，其特征在于：将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重～0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。