CN1090584A - 合成多肽 - Google Patents

合成多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN1090584A
CN1090584A CN93118234.4A CN93118234A CN1090584A CN 1090584 A CN1090584 A CN 1090584A CN 93118234 A CN93118234 A CN 93118234A CN 1090584 A CN1090584 A CN 1090584A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
ser
serial
gly
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN93118234.4A
Other languages
English (en)
Inventor
R·V·菲什菜
P·J·格里尼
B·罗布森
A·P·莎士比亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protherics Medicines Development Ltd
Original Assignee
Proteus Molecular Design Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929218163A external-priority patent/GB9218163D0/en
Priority claimed from GB929219710A external-priority patent/GB9219710D0/en
Application filed by Proteus Molecular Design Ltd filed Critical Proteus Molecular Design Ltd
Publication of CN1090584A publication Critical patent/CN1090584A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种合成多肽，该多肽具有至少一种 对至少一种感染胰坏死病毒菌株的抗原性，该多肽基 本上包括选自化学式序列IDNos：1-9的氨基酸序 列，所说序列详见说明书。所说多肽用于治疗鱼的 IPNV感染。

Description

本发明涉及合成多肽，尤其涉及对感染胰坏死病毒（IPNV）的蛋白特定部位抗原性进行模拟的多肽。
IPNV是感染胰坏死的病原体，在年幼的孵化后的鲑鱼中可造成急性接触传染病并且是高死亡率的疾病。这种病毒首先从Brook鲑鱼（Salvelinus  fontinalis）中分离，随后发现它在有巨大经济意义的鲑鱼及非鲑鱼物种尤其是6个月龄的鱼中造成疾病。认为最易感染的那些物种包括虹鳟鱼（Salmo  gairdneri），河鳟鱼（Salmo  trutta），克氏鲑鱼（Salmo  clarki），amago鲑鱼（Oncorhynchus  rhodurns），红大马哈鱼（Oncorhynchus  nerka），北极鲑（Salvekinus  alpinus），大西洋鲑（Salmo  salar）和日本鳝（Anguilla  japonica）。这种疾病也发现在有条纹的鲈鱼类中，而且这种病毒也可潜伏在许多非鲑物种类型的鱼中，其中仅有少数物种能证明是易受该疾病感染，例如梭子鱼。
这种疾病的名叫外分泌胰脏的退化及严重坏死，通过组织病理学检验展示，即使患病鱼显示如下临床信号：失去对旋转的平衡，螺旋状游并随后死亡，以及特征性腹胀。
由于IPNV存活者可变成媒介物同时产生循环抗体，它们在面部散发病毒，从而导致病毒的外侧传播。也发生垂直的传播，起因于病毒对卵壳或对精子在卵的受精时渗透的吸附。
对北大西洋鲑鱼养殖总产量的最新估计为大约每年225，000吨，而主要生产者是挪威，每年养殖约160，000吨，价值1.5千万美元。其他主要养殖鲑鱼的国家是法国、英国、美国、加拿大、澳大利亚、西班牙、德国、新西兰和日本。经计算，世界鲑鱼市场平均以每年7.5%增长可延至2000年，形成每年36亿美元的产值。然而已报导IPNV蔓延在加拿大、丹麦、芬兰、法国、德国、希腊、日本、荷兰、南非、西班牙、瑞典、瑞士、英国和美国。虽然IPNV主要在鱼中造成疾病，但该病毒业已从软体动物和甲壳类中分离出来（见Hill，B.J.1976，Wildlife  diseases，ed.L.A.P445-452，Plenum  Press，New  York）。因此，这种疾病是可蔓延的，对可获利的鱼业养殖是个威胁。
已作努力用失活或衰减病毒对鱼接种来抗IPNV，但基于失活病毒的几种疫苗都不成功。况且，基于衰减病毒的疫苗并未显现给与保护以及未显示携带回复有毒性病毒类型的能力。一种无毒菌株，（74/53）在英国从鲈鱼中分离的，得到可复制的成果，但保护性在25-75%之间波动，取决于给药途径。
IPNV是Birnaviradae家系的一个成员，该组包括具有双片段的双股RNA基因的培养基大小。非封闭的二十面体动物病毒。较大的片段，片段A编码含有VP2和VP3的多蛋白，VP2是主要的病毒壳体蛋白而VP3是内部的蛋白。
本发明的一个目的是研制合成多肽，它可引出抗体的产生，尤其是对IPNV的VP2及VP3蛋白中和的抗体。
我们的发明在第一个方面是提供一种合成多肽，它具有至少一种感染胰坏死病毒的至少一种菌株的抗原特性，所说多肽基本包括选自公式序列ID号1-9的一种氨基酸序列：
序列ID号：1
X-Thr-Thr-Asn-Pro-Gln-Asp-Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Y;
序列ID号：2
X-Thr-Asp-Phe-R1-Ser-Asp-Leu-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Y;
序列ID号：3
X-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Trp-Arg-Asp-Y;
序列ID号：4
X-Thr-Lys-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Glu-Gly-Y;
序列ID号：5
X-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Ser-Gly-Y;
序列ID号：6
X-Gln-Glu-Thr-Ser-Ser-Tyr-R2-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Y;
序列ID号：7
X-Ser-Arg-Phe-Thr-Pro-Ser-Gly-Asp-R3-Y;和
序列ID号：8
X-Pro-His-Gln-Glu-Pro-Ala-Pro-R4-Phe-Tyr-Y;
序列ID号：9
X-Pro-Gln-Gly-R5-Gln-Ser-Met-Asn-Gly-Ala-R6-Y;
其中R1是Ser或Thr;R2是Thr或Asn;R3是Asp-Gly或Asn-Ala;R4是Asp-Asp或Glu-Glu;R5是Pro或Leu而R6是Arg或Lys;且X和Y每个分别是无或是一个或多个氨基酸基，附带限制是当它们存在时不生成IPNV任何菌株的VP2或VP3蛋白的抗原决定基部位或部分抗原决定基部位，在菌株的VP2或VP3蛋白的序列中该抗原决定基部位邻近X和Y是相连接的序列;这种多肽可选地含有官能性的偶联部分。
优选的是：R1为Ser，R2是Thr，R3是Asp-Gly，R4或为Asp-Asp或为Glu-Glu。还优选的是：当R5是Pro时R6是Arg以及当R5是Leu时R6是Lys。
在上述公式序列ID1-9号的多肽序列中，X和Y连接的序列（下文“核心序列”）要进行选择，其根据是它们对IPNV的VP2及VP3蛋白一个或多个抗原决定子的局部记载相似性。尤其是ID序列1-6号和9号涉及VP2;而序列ID7和8号涉及VP3。
无X及Y存在的公式序列ID1-9号的肽，例如在制备抗VP2和VP3抗体方面是有用的。当X或Y存在时它们可以是任何长度，但优选每个少于20个氨基酸，更优选少于10个，例如1-6个氨基酸。
如果X或Y存在，它们是相当短的序列，一般1-3个基的长度是特别优选的。在大多数情况下，或者Y是无而X是1或2个基的长度，或者X是无而Y是1或2个基的长度。
在本发明的肽偶联一种载体时是特别有效的。本发明的多肽可用任何常规方法来偶联载体。本发明多肽与载体的连接位点可在核心序列内，优选在X或Y序列内。
具有侧链适宜直接偶联载体分子的氨基酸，例如是Cys、Lys和Tyr，作为选择，例如可利用官能性的偶联部分来得到偶联。这样一种部分可以引入本发明的多肽，例如可用化学修饰（即官能性地）一种氨基酸以便使一种官能基为有助于偶联载体的专门目的而被引入。用于偶联载体的官能基实例包括硫羟基、氨基、肼基或酰肼基，醛或掩蔽的醛基。
利用例如与杂双官能偶联反应剂的反应也可将官能性的偶联部分引入本发明的多肽，上述偶联剂诸如N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧-琥珀酰亚胺，它可用来，例如将赖氨酸基在载体中偶联到C-端或将其他半胱氨酸基偶联在多肽中（Kitagawa，T.和Ackawa，T.，1976，J.Biochem.79，233）。其他的偶联反应及反应剂，例如它们或变得结合进入最终的结合物或者激活载体蛋白分子的某些反应位点以便随后的联结，这些已在文献中公开。在杂双官能基反应剂用于偶联反应的地方，连接本发明多肽的载体位点是在X或Y序列，以便得到这些反应剂高度特异性的优点。
无论采用何种偶联方法，连接位点在X或Y序列以及使多肽的抗原部分与载体隔开以便使其效果最佳化，这将是优选的。要获得这种隔开，例如可用包含的其它氨基酸（如Gly）进入偶联位点和抗原部分之间的X或Y处，或者作为选择，利用合适的杂双官能基偶联剂来获取所要求的隔开。
X或Y含有一个单一的氨基酸基，则氨基酸提供一个合适的偶联载体的位点，这种情况是优选的。还优选的是：X或Y含有两个氨基酸，一个氨基酸提供一个合适的偶联载体的位点而另个氨基酸基（如Gly）起一个间隔物的作用。在序列ID号1、3、8及9号中，X是无而Y是Gly-Cys是特别优选的;在序列ID2及4-7号中，X是无而Y是Cys的情况特别优选。
合适的载体包括，例如破伤风菌疫苗，霍乱疫苗和其B亚基，卵清蛋白，鸡γ球蛋白（CGG），大豆胰蛋白酶抑制剂，胞壁酰二肽及其类似物，及Braun脂蛋白;当然其他合适的载体可被本领域技术人员容易地找出。例如，可以使用多元的抗原肽（MAPs），象含有多赖氨酰核心的那些肽，例如庚赖氨酰，承受反应性氨基末端。本发明的多肽抗原，或合成的，可与氨基末端反应;且不同的多肽抗原可与同一核心或载体反应。
还设想现有的鱼疫苗可用作载体或佐剂来合成本发明的多肽。下列微生物或大分子亚基团而可当作合适的载体或佐剂：气单胞菌属Salmonicida，耶尔森菌属ruckeri，弧菌属anguillarm，弧菌属ordalii和Renibacterium  salmoniarum。
微生物的存在形式可以是，例如完整的杀死细胞，失活的细胞（如经甲醛液处理的），或活性减弱细胞。大分子亚基包括，例如破裂细胞（菌苗），额外细胞制品（ECP）及其类毒素，以及自天然或合成源的提纯抗原。抗疖病疫苗，该病由Aeromonas  salmonicida细菌所至，表明是所期待的这种疫苗包括完整的杀死或破裂细胞，ECP及其类毒素以及结合ECP的完整的杀死细胞，活性减弱细胞和提纯的抗原。此外，针对鱼或哺乳动物中培养抗原的超免疫血清已用于传递保护。抗耶尔森属ruckeri细菌所致肠红嘴病成功疫苗已被生产，包括甲醛失活的完整菌苗。在Northern  Hemisphere畅销的弧菌疫苗含有最普通物种弧菌属anguillarum和ordalii的混合物。这些疫苗是简单的失活培养物，含有完整细胞及ECP的混合物。
显而易见，本发明公式序列ID1-9号序列可以构成X及Y是蛋白主要部分的蛋白，而且抗原序列例如在球蛋白上是部分的裸露环。
本发明上述多肽由于在引出产生高效抗体方面特别有效而是优选的，尽管如此，引人注目的是在这些多肽由X和Y恰恰形成这样一种抗原决定基部位，即在IPNV菌株的VP2或VP3蛋白内部与X和Y连在一起的序列相邻接的抗原决定基部位，这些多肽也是优选的。因此在这些多肽中，与局部记载天然IPNV序列类似物同种物的或就是该类似物的部位将扩展出核心序列之外，在X及Y序列内邻接残基，以便包含邻近的一个抗原决定基部位或多个抗原决定基部位。然而，若具有天然序列同种物的部位太长，多肽的有效性则减小，例如是由于与它们相应制备的抗体有较低的特异性所致。因此，本发明的另一方面，提供公式序列ID1-9号的多肽，其中的R1、R2、R3、R4、R5和R6限定如上面所述，X和Y中一个分别是无或一个分别表示一个或多个氨基酸，其限制是，如果X或Y中具有IPNV任何菌株VP2或VP3蛋白序列的同种物的部位扩展进入X或Y序列，则同种物的部位必不能很长，否则在多肽作为疫苗的效能和/或多肽引出高特性抗体的能力方面有明显的不利作用。无论X或Y序列内，同种物的部位不能扩展超出核心序列之外多于例如20个氨基酸，这样才是优选的。特别优选的多肽中，同种物的部位没有超过10个氨基酸（例如6个）扩展进入X或Y序列。
本发明的肽可用任何合适方法合成，例如或者用标准的9-芴基甲氧羰基（Fmoc）化学方法（如参见Atherton，E和Sheppard，R.C.1985，J.Chem.Soc.Chem.Comm，165）或用标准的叔丁基碳酸酯化学方法（t-Boc）。准确的结构及提纯程度，通常纯度超过95%，要仔细检查。为此目的可采用例如各种色谱分析，包括反相高效液色谱，以及摄谱分析，包括质谱。为了促进高产量和高纯度，用Fmoc化学法制的肽可将其N-端乙酰化和/或C-端酰胺化，这种改进出包括在本发明范围内（Stuber，W.，Knolle，J.和Breipohl，G.等人，1989，“酸性不稳定固着基上利用Fmoc固相肽合成法合成肽酰胺”，Int.J.Pept.和Prot.Res.，34，215-221）。
本文所列出用标准I.U.P.A.C三字码缩写的所有序列中，氨基酸基定义如下：Gly-甘氨酸，Ala-丙氨酸，Val-缬氨酸，Leu-亮氨酸，Ile-异亮氨酸，Ser-丝氨酸，Thr-苏氨酸，Asp-天冬氨酸，Glu-谷氨酸，Asn-天冬酰胺，Gln-谷氨酰胺，Lys-赖氨酸，His-组氨酸，Arg-精氨酸，Phe-苯丙氨酸，Tyr-酪氨酸，Trp-色氨酸，Cys-半胱氨酸，Met-蛋氨酸和Pro-脯氨酸。
本发明多肽可用来产生一种抗体，该抗体可与IPNV菌株范围制备的VP2及VP3蛋白进行交叉反应。我们的分析表明，由于本发明多肽构象/局部记载/静电特性，使得它们很大可能地引出产生抗体，该抗体可与源自几个或许多菌株的VP2及VP3蛋白进行交叉反应，在较大多肽内结合几个变体多肽产生另外的优点。这种多肽具有如下通式（Ⅰ）：
其是F和G每个分别是公式序列ID1-9号中的任一个，L是个连结序列，a，b和c每个分别是0或1，m和n每个是正数，如1-10之间包含的数。L优选短的，构象易弯部分的多肽链，例如，并非限制性，Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（序列ID号，10），Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro（序列ID号，11），或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala（序列ID号，12）。应当明了，每个重复可任选地含有本发明多肽的不同变体。
应当注意的是，在序列ID2号的C-端部分和序列ID3号的N-端部分之间以及在序列ID6号的C-端部分和序列ID5号的N-端部分之间有同种物。当制备本发明公式Ⅰ的较大多肽时就显出这个同种物的优点了。与代表X或Y部分连在一起的连结序列可以省略，在支架内的残基可以选择，使得或者同种物的部位被重叠或者几个或全部重叠的残基被省略。在后一情况中，可以见到一个多肽的C-端部分与另个多肽的N-端部分合并。
式Ⅰ所定义的多价定子同种物被认为是假同种多价体，其中，基本同于定子同种物的变体可在单一多肽链内重复。此外，简单的同种多价多肽免疫原，它含有多个复制的序列ID1-9号定子同种物之一的同样的变体，它也是有效的并且也包括在本发明的范围内。
假同种多价免疫原多肽作为疫苗很有价值，这就是它们引出产生一个范围的（中和）抗体与类似物但不是相同第一特性的类似物，在它们之间可以与源自广范围IPNV菌株的VP2或VP3蛋白进行交叉反应，因此在给予保护性免疫方面更加有效。在构造杂多价多肽方面也有优点，这种多肽含有一个或多个本发明多肽之一的按任何指令的复制品，以及一个或多个其他多肽同种物或定子同种物的复制品。本发明提供的这种多肽具有如下的通式（Ⅱ）：
其中F是公式序列ID1-9号任一个的多肽，G是按序列ID1-9号任一个或其他序列的多肽，m和n是个正数，如1-10之间包含的数，d和e每个分别是0或1。“L”优选短的，构象上易弯曲部分的多肽链，例如，非限制性，Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（序列ID号：10），Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro（序列ID号：11）或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala（序列ID号：12）。
应当了解，保留母体多肽的一般形式及功能的上述等效多肽的任何抗原性明显的亚片段和/或抗原性明显的变体皆包括在本发明范围内。由具有可比较的构象性质和/或物理性质残基取代任何特殊残基，包括用稀有氨基酸（如D型立体异构体）或合成的氨基酸同种物的取代，亦包括在本发明范围内。例如用另外的类同Set的残基取代是包括在本发明轮廓内;Set限定如下：Set1-Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp和Met;Set2-Ser，Thr，Asn和Gln;Set3-Asp和Glu;Set4-Lys，His和Arg;Set5-Asn和Asp;Set6-Glu和Gln;Set7-Gly，Ala，Pro，Ser和Thr。所有类型氨基酸的D-立体异构体也可被取代，例如D-Phe，D-Tyr和D-Trp。
本发明的实施方案，其中存在X和/或Y，独立地包括一个或多个具有起T-细胞抗原决定基部位作用能力的蛋白序列片段。例如，至少在几个情况下显现起T-细胞抗原决定基部位作用的通式1-2-3-4的氨基酸序列片段，其中的1是Gly或一个带电氨基酸（如Lys，His，Arg，Asp或Glu），2是疏水氨基酸（如Ile，Leu，Val，Met，Tyr，Phe，Trp，Ala），3或者是个疏水氨基酸（定义同上）或者是个不带电极性氨基酸（如Asn，Ser，Thr，Pro，Gln，Gly），以及4是个极性氨基酸（如Lys，Arg，His，Glu，Asp，Asn，Gln，Ser，Thr，Pro）。见Rothbard，J.B.和Taylor，W.R.（1988）“普通T-细胞抗原决定基部位序列图样”，EMBO杂志7（1），93-100页。
类似的片段可含有1′-2′-3′-4′-5序列，其中的1′和上面定义的1等效，2′等效于2，3′和4′等效于3，而5′等效于4（ibid）。两种形式皆包括在本发明范围内，且可将一个或多个T-细胞抗原决定基部位（优选低于5个氨基酸）结合进本发明多肽中。每个抗原决定基部位或者有如上定义型或者有其他结构，并可被任何长度的间隔片段或组分（长度优选少于5个氨基酸）隔开，它们包括例如选自如下所列残基：Gly，Ala，Pro，Asn，Thr，Ser或诸如非α-氨基酸的多官能联结基。对C-或N-端联结基而言，代表一完整蛋白是可能的，因此，应排除对结合载体蛋白可能的需要。
还包括在本发明范围内的是按公式序列ID1-9号多肽的同种物，其中的x或是包括一种“向后反转”型氨基酸，即双官能的胺或双官能羧基。例如按照本发明并含有向后反转氨基酸的同种物可具有如下化学通式：
其中R是任何氨基酸侧链，如甘氨酸侧链或其他官能基，A1及A2每个优选至少是一个本发明合成的多肽或其他的肽序列，如它的N-或C-未端接上具有抗原性质（但不必相同）的序列。T-细胞抗原决定基部位可任选地包括在A1或A2中，这点上面已讨论过。
肽的向后反转修饰包括一个或多个肽键的反转，以便使产生的同种物与原始分子相比对酶降解有更强的抵抗力，并且给出一个常规途径来使分支免疫原增殖，分支免疫原针对大免疫原在培养方法方面含有高浓度抗原决定基部位。这些化合物用在大规模合成短键生物活性肽的向后反转同种物方面特别令人感兴趣。
应当注意，结合向后反转氨基酸衍生物的同种物不能直接用重组体DNA体系来制造。然而基本的同种物可用重组体手段来合成，然后将它们提纯，再用标准的肽/有机化学技术化学连接向后反转氨基酸。固相合成聚酰胺树脂型的向后反转肽，其实践上及常规的新工艺步骤最近已被公开（Gazerro，H.Pinori，M.和Verdin，A.S.1990，“固相合成向后反转肽的一般新工艺”，“固相合成中新生支及透视”一章，Roger  Epton，SPCC（UK）Ltd出版，伯明翰，英国）。
幼鱼孵化后，几周内特定的免疫体系并未完全成熟，这是因为硬骨鱼中主要淋巴器官，胸腺，肾和脾都未完全发挥功能。胸腺是发育淋巴细胞的第一个淋巴器官并使“T”淋巴细胞产生。“B”淋巴细胞也存在，但这种类型的细胞在硬骨鱼中的准确源并不知晓。激发带有抗原的鱼免疫体系，使它刚刚足够成熟就产生免疫力，这才是合乎需要的。
有几种方法将鱼疫苗给药：如注射，口服途径及经浸渍方法。
腹膜内注射是有效的接种方法并且进而允许利用佐剂增强免疫响应的大小。缺点是鱼需要麻醉并要掌握引起的应激反应，况且该方法也是非常强的体力劳动。然而，利用重发注射器和生产线系统，每小时可注射1000条鱼。但腹膜内注射不能用于最低15克以下的鱼。抗疖病，ERM和弧菌病的疫苗都可通过腹膜内注射给药。
口服接种适合于所有尺寸鱼的群体给药，并且不用掌握所强加给予的应激反应。但是存在内在的限制，因为需要大量疫苗而加大成本，并且不能确定单独的剂量。以粒状或小丸形式的食料组合物或饲料增补剂方式提供口服疫苗是优选的。口服疫苗的特定重量取决于鱼的喂养习性以及它们容纳的性质，尽管可以要求它，例如与空气空隙形成小丸或小粒，使得它们开始时漂浮而空隙充入水时下沉。
直接浸渍（D.I.）简单迅捷，接触疫苗仅需几秒即可。这种方法现已自动化，“浴池”或“淋洗”的改变视发育弧菌属及ERM疫苗而定，简单方式包括将疫苗倒旱容纳箱。虽然这种方法要消耗较多疫苗并需要较长的接触（大约一小时），包括水的氧合作用和密切监视鱼的应激反应，但毕竟比注射体力劳动强度要小。
腹膜内注射，口服接种及直接浸渍皆能良好地适应包括本发明多肽疫苗组合物的给药。
类似鸡尾酒的调配式免疫大为有利，它包括（ⅰ）可结合多于一种类型载体的给定多肽，和/或（ⅱ）同样载体结合多于一种的多肽。然而各种多肽，它们的结合物及其调配物可在任何合适的佐剂或输送体系内给药，多于一个的佐剂或输送体系相结合便形成一种所谓的“超级调配”。优选的佐剂及输送体系包括微球体，脂质体，胶束，noisame和ISCOMS。
为了在非鱼类的目标中引出抗体的生成，多肽，或单独或连结载体分子使用，其给药可以任何途径（如肠胃外的，经鼻的，口服的，阴道内的），用或不用常规佐剂（如氢氧化铝，或在实验动物情况下的弗洛伊德完全或不完全佐剂），和/或其他免疫增强剂。在我们的共同待批的PCT申请No.PCT/GB93/00716，1993.4.7.申请，我们公开了非离子表面活性剂泡囊（即niosomes）它可有利地用作本发明肽的佐剂。本发明还包括本发明多肽以缓释形式的配方，诸如皮下植入或贮存，例如包括脂质体（Allison，A.C.和Gregoriadis，G.，1974，Nature（伦敦）252，252），或由乳酸或甘醇酸共聚物制备的可生物降解的微胶囊（Gresser，J.D.和Sanderson，J.E.，1984“生物聚合物控制的缓释体系”，Ed.D.L.Wise，P127-138）。
再者，在某些情况下，包括（ⅰ）连结多于一种类型载体分子和/或（ⅱ）相同载体分子连结多于一种的多肽，这样的调配免疫是有利的。然而，任何多肽，它们的结合物及其调配体可在任何合适佐剂或传送体系中给药，而且多于一个的佐剂或传送体系可结合形成所谓的“超级调配”。
应当懂得，本发明的多肽可用任何常规方法来合成，或者直接用上述人工或自动的肽合成技术，或者直接利用RNA或DNA合成和分子生物及基团工程的常规技术。这种技术可用来制备含有一个或多个多肽插入另个多肽序列的杂交蛋白。
因此，本发明的另个一方面是提供一种编码至少一种本发明多肽的DNA分子，优选结合进合适表达媒介的DNA分子，它可在下列物中复制：微生物或哺乳动物，昆虫，植物，霉菌或其他细胞。该DNA也可是较长产物的部分DNA序列，例如，多肽可以作为它们已通过基因工程被插入的其他蛋白的一部分而被表达。对这种技术的一个实践指导是“分子无性系培养：实验室手册”，作者Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.（1989年第二版）。
本发明多肽既可单独又可连接合适载体来使用，如：
（a）肽疫苗，用来防止一种或多种IPNV菌株感染;
（b）作为血清分析中的配位体，例如来自IPNV阳性患者的血清;
（c）作为体外细胞生物分析的抗原，如干扰素和淋巴激活素分析，即在全血培养或淋巴细胞增生分析中对特定抗原反应而释放的干扰素和淋巴激活素进行检测的分析;
（d）作为试验时的质量控制剂，例如，针对多肽饲养抗体的结合程度;
（e）作为免疫试剂来增殖对合适动物免疫的单克隆或多克隆抗体，这种抗体是用于（ⅰ）科学研究IPNV，和（ⅱ）作为诊断试剂，例如作为组织化学反应剂的一部分。
本发明进一步提供对于一般工程的形式或亚组分，尤其中VH部位，它具有针对多肽饲养的抗体，并具有在其他动物中针对多肽起始饲养抗体的特性的（piscinised）形式，使用的技术已在文献中详述。
关于IPNV或抗IPNV抗体的检测和诊断，技术人员知道许多本领域公知的免疫技术，其中包括夹层分析，竞争和非竞争测定，以及直接和非直接标定的用途。
本发明又一方面是提供检测IPNV或抗IPNV抗体或结合其片段的抗原的一种方法，包括将鱼的组织样品或体液与至少一种本发明多肽一起培育，如果需要应决定所说样品和所说多肽之间是否发生交叉反应的程度和/或速度。
本发明另个方面，提供检测IPNV或抗IPNV抗体的用具，包括至少一种本发明的合成多肽。在某些场合，把本发明多肽混合物包括在用具里是合乎需要的，这种用具也包括载体工具（如塑料，聚苯乙烯，乳胶或血红细胞）和/或检测抗体或结合片段抗原结合合成多肽的工具（例如荧光的，辐射的或酶标记的抗IgG抗体）。
制备多克隆或单克隆抗体，尤其适合插入物质的重组体形式，例如抗体的鱼特性的形式（例如见Thompson  K.M.等人，1986，免疫学，58，P157-160），单区域结构抗体（例如见Ward，E.S.Gussow，D.，Griffiths，A.D.，Jones，P和Winter，G.1989，Nature  341，P544-546），它们特别结合到本发明合成多肽上，这可通过常规手段来完成，这些抗体应认为是构成本发明的一个部分。
本发明抗体可用于诊断鱼中感染IPNV的方法，它包括用有效量的按本文所述结合其片断的抗体或抗原培育上述鱼的组织或体液样品，如果需要，并确定在样品和抗体之间是否发生交叉反应的范围和/或速率。至少含一个抗体的诊断用具也构成本发明的一部分。该用具可包含一个或多个下述部分：承载方式（如上所述）;按照本发明结合其片断的抗体或抗原;至少一种本发明的合成多肽;和测定结合片断的抗体或抗原连接到合成多肽上的方式。
为测定组织切片上IPNV或抗IPNV抗体而使用按本发明结合其片断的合成多肽或抗体或抗原也构成本发明的一部分。
通过使用本发明合成多肽免疫作用栽培的抗体可用来栽培抗个体基因型抗体，这也构成本发明的一部分。另一个目的是提供制备抗个体基因型抗体的方法，它包括用结合其片断，特别是结合到本发明合成多肽上的抗体或抗原给哺乳动物进行免疫，并分离形成的抗个体基因型抗体或产生抗个体基因型抗体的细胞。
本发明另一个目的是提供如上所定义的用于刺激鱼免疫系统的合成多肽，以便治疗或预防鱼中IPNV感染和制备适合这种用途的药物。还包括含作为活性成分的至少一种多肽或按本文所述与一种或多种药物上允许的辅助剂，载体和/或赋形剂的多肽载体配合物的药物组合物，特别是疫苗。此外还包括这样的药物组合物，特别是疫苗组合物，它含有作为有效成分的专门结合其片断到本发明多肽或偶联载体的多肽上的抗体或抗原，它结合一种或多种药学上可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。该组合物可按口服、直接浸渍或尤其是肠胃外给药配制。
本发明还提供一种为治疗或预防鱼中IPNV感染而刺激鱼免疫系统的方法，它包括按上文给鱼确定的有效量的多肽来给药。
还提供一种治疗或预防鱼中IPNV感染的方法，它包括将专门结合其片断到本发明合成多肽或偶联载体的多肽上的有效量的抗体或抗原来给药。
图1表示按照下述工艺对鱼免疫接种8周后获得的抗体滴定度;
图2表示20周后免疫接种获得的抗体滴定度;
图3和4表示免疫接种8周后的血清中和。
下面用非限制性实施例说明本发明。
实施例A
具有如下序列的肽：
Thr-Thr-Asn-Gln-Asp-Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Gly-Cys
（ID序列No：1其中x是无，而y是-Gly-Cys）该肽用标准固相Fmoc方法合成，该肽在三氟乙酸存在下由树脂分裂。接着通过凝胶过滤、离子交换色谱和反相高效液相色谱提纯而得到。获得肽的纯度大于85%。通过MBS（m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）将该肽结合到载体，鸡γ-球蛋白（CGG）上，并用Freund′s完整佐剂（FCA）混合。
用这种制剂给兔皮下接种，4和8周后用另外相似量的Frennds非完全佐剂（FIA）激发免疫反应。第三次注射后两周取血样，并作中和活性试验抗血清。
在20℃将West  Buxton，Sp，Ab菌株和IPNV的Canada  1血清型（如Caswell-Reno，P.等人所述（1981），Journal  of  General  Virology，67：2193-2205）在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE-214;ATCC  No.CRl1681）中在添加10%牛胎血清的Eagle  s  MEM中繁殖。然后通过聚乙二醇沉淀浓缩病毒，用弗利昂113提取并通过等密度CsCl-梯度离心提纯。
中和试验
在56℃通过加热30分钟使试验抗血清失活并作倍比稀释。将稀释液等分试样同等体积含2X103TCID50/ml病毒的生长培养基混合，并在室温培育30分钟。然后将每秒0.1ml的病毒/抗血清混合物添加到96升微量滴定板的4个井的每个井中，在0.1ml生长培养基中单层培养CHSE-219细胞。在20℃培育7天后确定细胞致病作用。并计算50%中和剂量。
实施例B
肽合成
用标准Fmoc固相化学[Atherton，E.和Sheppard，R.C.（1985），J.Chem.Soc.Commun，165-166]合成下述C-末端的伸展的IPNV肽。将所有肽N-末端乙酰化。
1a  Thr-Thr-Asn-Pro-Gln-Asp-Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Gly-Cys
（序列ID  No：1，其中X是无而Y是Gly-Cys）
2a  Thr-Asp-Phe-Ser-Ser-Asp-Leu-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Cys
（序列ID No：2，其中R1是Ser，X是无而Y是Cys）
3a  Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Trp-Arg-Asp-Gly-Cys
（序列ID  No：3，其中X是无而Y是Gly-Cys）
4a  Thr-Lys-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Gln-Gly-Cys
（序列ID  No：4，其中X是无而Y是Cys）
5a  Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Cys
（序列ID  No：5，其中，X是无，Y是Cys）
6a  Gln-Glu-Thr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Cys
（序列ID No：6，其中R2是Thr，X是没有，而Y是Cys）
7a  Ser-Arg-Phe-Thr-Pro-Ser-Gly-Asp-Asp-Gly-Cys
（序列ID No：7，其中R3是Asp-Gly，X是无，而Y是Cys）
8a  Pro-His-Gln-Glu-Pro-Ala-Pro-Asp-Asp-Phe-Tyr-Gly-Cys
（序列ID No：8，其中R4是Asp-Asp，X是无，而Y是Gly-Cys）
8b  Pro-His-Gln-Glu-Pro-Ala-Pro-Glu-Glu-Phe-Tyr-Gly-Cys
（序列ID No：8，其中R4是Glu-Glu，X是无，Y是Gly-Cys）
9a  Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-Ser-Met-Asn-Gly-Ala-Arg-Gly-Cys
（序列ID No：9，其中R5是Pro，R6是Arg，X是无而Y是Gly-Cys）
使用95%三氟乙酸使这些肽从固体树脂载体分裂。用反相高效液相色谱确定这些肽的纯度。所有肽都是90%+纯度，除了肽7a，由于合成困难它的纯度只有41%。
肽与卵清蛋白和BSA的结合
用m-马来酰亚胺苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）将肽结合到卵清蛋白和BSA上。卵清蛋白：将100mg卵清蛋白（σ级V）（2.3μmol）和10mg的MBS（32μmol）在10ml的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）（PH7.2）溶液中混合。透析活化载体溶液并将其分成10×1ml等分。将在0.05M的PBS（PH6）中的肽（50-75μmol）8mg加到每个等分试样中。肽∶载体之比估计为15∶1。BSA：将100mg的BSA（σ级V）（1.5μmol）和10mgMBS（32μmol）在10ml的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）（PH7.2）溶液中混合。将活化载体溶液透析并分成10×0.25ml等分。将2mg在0.05M的PBS（PH6）中的肽（12-20μmol）添加到每等分中。
治疗组
试验开始时将225条每条大约35g（重量）的大西洋鲑鱼按每组15条分成独立的15个治疗组。在整个试验期间将鱼保持在10-15℃的下列新鲜水中。
组  治疗
1  疫苗1  肽9a+卵清蛋白与FCA
2  疫苗2  肽1a+卵清蛋白与FCA
3  疫苗3  肽2a+卵清蛋白与FCA
4  疫苗4  肽3a+卵清蛋白与FCA
5  疫苗5  肽4a+卵清蛋白与FCA
6  疫苗6  肽5a+卵清蛋白与FCA
7  疫苗7  肽6a+卵清蛋白与FCA
8  疫苗8  肽7a+卵清蛋白与FCA
9  疫苗9  肽8a+卵清蛋白与FCA
10  疫苗10  肽8b+卵清蛋白与FCA
11  疫苗11  肽1a+2a+9a+Adjnprime
12  疫苗12  肽1a+2a+9a+FIA
13  对比1  FCA+卵清蛋白
14  对比2  FCA
15  对比3  原样的
在试验的第1天给1-14组的鱼接种。在整个接种和放血之前，通过在苯坐卡因（50mg/L）中浸渍使鱼麻醉。整个接种，包括对比组，均通过腹膜内注射给药。血样，不少于200μl，取自臀脉。
组1-10的鱼接受100μlFCA与肽-卵清蛋白结合体（50μl结合体：50μlFCA）。每条鱼接受约35mg的肽。
组11和12的鱼接受130μl分别结合Adjnprime和FIA的肽-卵清蛋白结合体（65μl结合体：65μl  Adjnprime或FIA））。每条鱼接受约35μg的1a、2a和9a的各种肽的等效物。
组13的鱼接受100μl结合FCA的卵清蛋白（50μl在PBS中的卵清蛋白：50μl  FCA）。每条鱼接受约75μg的卵清蛋白。
组14的鱼接受50μl  FCA与50μl  PBS。
ELISA  方案
用ELISA免疫后8和20周测定血清抗肽抗体量。在来自组1-10的血清中，肽9a-BSA和1a-BSA直到8b-BSA分别用作包覆抗原（浓度＝5μg肽/ml）。在组11和12血清中，肽9a-BSA用作包覆抗原（浓度＝5μg肽/ml），在组13和14血清中，卵清蛋白是包覆抗原（浓度＝20μg肽/ml）。在组15血清中，肽9a-BSA是包覆抗原（浓度＝5μg肽/ml）。用单克隆鼠抗鲑鱼免疫球蛋白-辣根过氧化物酶结合体（抗1g/HRP）稀释度1∶4000）测定抗肽抗体，如前所述，Whyte等人（1987），J.Fich  Biol，31A，185-190。
中和试验
IPNV中和方案规定如下，取得大鳞大麻哈鱼（CHS）细胞并确定培养系统。IPNV从几种源获得并用到接种CHS细胞以产生试验的病毒无性种。用微量滴定技术滴定IPNV上清液，其中用各种稀释病毒接种显微板上生长的单层CHS细胞。在每个病毒稀释物上确定细胞病变效应（CPE），并计算中各试验病毒浓度。
制定一个显微中和试验，其中用一个等体积的来自一个血清稀释范围的稀释血清培养恒量病毒。1小时后将病毒/血清混合物加到在微细胞培养板上CHS细胞单层的培养基上。当在病毒/细胞对比井上观察CPE时，用10%缓冲的福尔马林固定单细胞层并且1%晶体紫溶液染色。通过确定细胞溶菌作用测定病毒活性，就是通过读出每个单细胞层在600nm上稀释染料的吸光率来估计。
从血清稀释液中将上述单细胞层吸收率读数与下面这个滴定度合在一起得出50%细胞保护抗病毒作用，以此确定中和滴定度。以IPNV保护单位/ml表示该值，这是将该读数乘以稀释度的倒数再除以试验体积（μl）。
结果
抗体滴定度
图（1）和（2）分别表示免疫接种后8和20周取的血清的抗体滴定度，每组测定10条鱼的血清并计算平均血清抗体滴定度（-log2）。
在免疫接种后8周，在对比组中发现少量抗体产生。但是免疫接种后20周，组1、2、4、5、7、8、9和10中引出产生对IPNV肽的好抗体。甚至在组3和6，抗体量几乎是对比组的二倍。这个结果表明，在鲑鱼中用结合卵清蛋白的IPNV肽单独接种并用FCA给药可提高抗IPNV肽好抗体的滴定度。
中和
图（3）和（4）表示在免疫接种后8周取的血清的中和能力，每组取10条鱼的血清测定，结果以平均血清保护单位/ml表示。
获得图（3）中的结果使用一种试验系统，其中TCID50（即在50%培养细胞中产生细胞病变效应的病毒量）为9000。图（4）中的结果TCID50为1000。
免疫接种后8周的抗体滴定度不高，因此不能期待良好的中和活力。但是，当与对比组13和15的血清相比，在组10的鱼和组2、3、8和10（可分别从图（3）和（4）看出）的鱼的血清中仍然是有显著的病毒中和度。

Claims (28)

1、一种制备合成多肽的方法，该多肽具有至少一种对至少一种感染胰坏死病毒菌株的抗原性，该多肽基本上包括选自化学式序列ID  Nos∶1-9的氨基酸序列：
序列ID号：1
X-Thr-Thr-Asn-Pro-Gln-Asp-Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Y；
序列ID号：2
X-Thr-Asp-Phe-R1-Ser-Asp-Leu-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Y；
序列ID号：3
X-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Trp-Arg-Asp-Y；
序列ID号：4
X-Thr-Lys-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Glu-Gly-Y；
序列ID号：5
X-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Ser-Gly-Y；
序列ID号：6
X-Gln-Glu-Thr-Ser-Ser-Tyr-R2-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Y；
序列ID号：7
X-Ser-Arg-Phe-Thr-Pro-Ser-Gly-Asp-R3-Y；和
序列ID号：8
X-Pro-His-Gln-Glu-Pro-Ala-Pro-R4-Phe-Tyr-Y；
序列ID号：9
X-Pro-Gln-Gly-R5-Gln-Ser-Met-Asn-Gly-Ala-R6-Y；
式中
R1是Ser或Thr；
R2是Thr或Asn；
R3是Asp-Gly或Asn-Ala；
R4是Asp-Asp或Glu-Glu；
R5是Pro或Leu；
R6是Arg或Lys；和
X和Y每个可任意地是无或任意是一个或多个氨基酸残基，条件是当它们存在时不形成IPNV任何菌株的VP2或VP3蛋白质的抗原决定基部位或部分抗原决定基部位，在菌株的VP2或VP3蛋白质序列中它与邻接X和Y的序列连接；该多肽任意地含有官能性的偶联部分，该方法包括用本质上已知的化学的、生物学的和/或重组体技术偶联残基，分离多肽和任意地引入官能性偶联部分。
2、根据权利要求1的方法，其中，在序列ID No：2中，R1是Ser，在序列ID No：6中，R2是Thr，和序列ID No：7中，R3是Asp-Gly，。
3、根据权利要求1的方法，其中，在序列ID No：9中，当R5是Pro时R6是Arg，和当R5是Leu时R6是Lys。
4、前述权利要求中任一个所要求的方法，其中，X和Y每个任意地是无或每个任意地代表小于20个的氨基酸。
5、根据权利要求4的方法，其中，X和Y每个任意地是无或每个任意地代表1-6个氨基酸。
6、根据权利要求5的方法，其中，X是无和Y表示1或2个氨基酸或Y是无和X表示1或2个氨基酸。
7、根据权利要求6的方法，其中，在序列中X或Y表示，或2个氨基酸。该氨基酸或这些氨基酸之一提供一个适合附着载体的位点。
8、一种制备合成多肽的方法，该多肽具有至少一种对至少一种感染胰坏死病毒菌株的抗原性，该多肽基本上包括选自化学式顺序列ID  Nos：1-9的氨基酸序列：
序列ID号：1
X-Thr-Thr-Asn-Pro-Gln-Asp-Lys-Val-Asn-Asn-Gln-Y;
序列ID号：2
X-Thr-Asp-Phe-R1-Ser-Asp-Leu-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Y;
序列ID号：3
X-Pro-Thr-Ser-Lys-Ala-Trp-Gly-Trp-Arg-Asp-Y;
序列ID号：4
X-Thr-Lys-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Glu-Gly-Y;
序列ID号：5
X-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Ser-Gly-Y;
序列ID号：6
X-Gln-Glu-Thr-Ser-Ser-Tyr-R2-Leu-Glu-Val-Ser-Glu-Ser-Gly-Y;
序列ID号：7
X-Ser-Arg-Phe-Thr-Pro-Ser-Gly-Asp-R3-Y;和
序列ID号：8
X-Pro-His-Gln-Glu-Pro-Ala-Pro-R4-Phe-Tyr-Y;
序列ID号：9
X-Pro-Gln-Gly-R5-Gln-Ser-Met-Asn-Gly-Ala-R6-Y;
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6定义如权利要求1，X和Y每个可任意地是无或每个任意表示一个或多个氨基酸，条件是如果X或Y是这样，即带有IPNV任何菌株VP2或VP3蛋白序列的同种部位扩展进入X或Y序列，则同种物部位必不能有如此长度，就是对多肽作为疫苗的功效和/或多肽引出高特性抗体的能力方面有明显有害作用的长度;该多肽可选地含有官能性偶联部分;该制备方法包括用基本上已知的化学、生物学和/或重组体技术偶联残基，分离多肽和任意引入官能性偶联部分。
9、根据权利要求1或权利要求8所要求的方法，其中合成多肽通式（Ⅰ）是：
式中F和G可每个任意如权利要求1或权利要求8所定义的化学式序列ID  Nos：1-9的任一个多肽，L是连接序列a、b和c每个任意是0或1，而m和n每个是正数。
10、根据权利要求1或权利要求8的方法，其中制备的合成多肽的通式（Ⅱ）是：
式中F是权利要求1或权利要求8所定义的化学式序列ID  Nos：1-9的任一个多肽，G是序列ID  Nos：1-9的任一个或其它序列的多肽，而m和n每个是正数。
11、制备合成多肽的方法，该多肽包括权利要求1-8的任一个所定义的多肽的抗原显著的亚片断和/或抗原显著的变体，该方法包括用基本上公知的化学、生物学和/或重组体技术偶联残基，分离多肽和可选地引入官能性偶联部分。
12、前述权利要求任一上所要求的方法，其中该多肽另外包括至少一个T-细胞表位。
13、制备前述权利要求任一个所定义的合成多肽的同种物的方法，其中，X或Y包含一个向后反转（retro-inrerso）氨基酸，该方法包括用基本上已知的化学、生物学和/或重组体技术偶联残基，分离多肽和可选地引入官能性偶联部分。
14、制备前述权利要求任一个所定义的偶联到载体上的合成多肽或同种物的方法，该方法包括用基本上已知的将多肽或同种物偶联到载体上。
15、制备结合其片断的抗体或抗原的方法，上述抗体或抗原特别地结合到权利要求1-14任一个所定义的合成多肽上，该方法包括用合成多肽给哺乳动物免疫接种和分离形成的抗体或产生抗体的细胞。
16、制备抗个体基团型抗体的方法，上述抗体是权利要求15所定义的结合其片断的特殊抗体或抗原，该方法包括用权利要求15所定义的结合其片断的抗体或抗原给哺乳动物免疫接种，分离形成的抗个体基因型抗体或产生抗个体基因型抗体的细胞。
17、制备编码至少一种权利要求1-12任一个所定义的合成多肽的DNA分子的方法，该方法包括通过基本上已知的化学、生物学和/或重组体技术偶联核苷酸。
18、一种测IPNV或抗IPNV抗体的工具手段，包括至少一种权利要求1-14任一个合成多肽，并可选地包括承载手段和/或抗体或抗原结合片段到合成多肽上检测这种结合的手段。
19、一种检测IPNV抗体的工具，它包括至少一种权利要求15所定义的结合其片断的抗体或抗原，并可选地包括承载用具，至少一种权利要求1-14任一个所定义的合成多肽，和/或将结合片断的抗体可抗原结合到上述合成多肽上检测这种结合的用具。
20、一种制备药物组合物的方法，它包括将至少一种权利要求1-14所定义的合成多肽或同种物和一种或多种药物允许的辅助剂、载体和/或赋形剂引入混合物中。
21、一种制备药物组合物的方法，它包括将至少一种权利要求13所定义的结合其片断的抗体或抗原和一种或多种药用辅助剂、载体和/或赋形剂引入混合物中。
22、权利要求1-14任一个所定义的多肽或同种物的用途，来制备为治疗和预防鱼中IPNV感染而激发鱼免疫系统的药物。
23、权利要求15所定义的结合其片断的抗体或抗原的用途，来制备治疗或预防鱼中IPNV感染的药物。
24、一种检测IPNV或抗IPNV抗体或结合其片断抗体的方法，它包括用至少一种权利要求1-14任一个所定义的多肽培育鱼组织或体液的试样，并确定，如果需要，在上述试样和上述多肽之间是否发生交叉反应的程度和/或速率。
25、一种诊断鱼中IPNV感染的方法，它包括用有效量的权利要求15所定义的结合其片断的抗体或抗原培育鱼组织或体液试样，并确定，如果需要，在上述试样和上述抗体之间是否发生交叉反应的程度和/或速率。
26、一种为治疗或预防IPNV感染而激发鱼免疫系统的方法，它包括将有效量的权利要求1-14所定义的多肽进行给药。
27、一种治疗或预防鱼中IPNV感染的方法，它包括将有效量的权利要求15所定义的结合其片断的抗体或抗原对鱼给药。
28、一种编码权利要求1-14任一个所定义的合成多肽的DNA分子。
CN93118234.4A 1992-08-26 1993-08-26 合成多肽 Pending CN1090584A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929218163A GB9218163D0 (en) 1992-08-26 1992-08-26 Synthetic polypeptides
GB9218163.5 1992-08-26
GB929219710A GB9219710D0 (en) 1992-09-17 1992-09-17 Synthetic polypeptides
GB9219710.2 1992-09-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1090584A true CN1090584A (zh) 1994-08-10

Family

ID=26301496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN93118234.4A Pending CN1090584A (zh) 1992-08-26 1993-08-26 合成多肽

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN1090584A (zh)
AU (1) AU4970193A (zh)
WO (1) WO1994004565A2 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE258188T1 (de) * 1992-08-27 2004-02-15 Deakin Res Ltd Retro-, inverso-, und retro-inverso synthetische peptidanaloge
TWI350310B (en) * 2002-12-13 2011-10-11 Novartis Ag Immunization of fish with plant-expressed recombinant proteins
GB201400311D0 (en) * 2014-01-08 2014-02-26 Aqua Gen As Treating Susceptibility
EP3166621A4 (en) * 2014-07-11 2018-05-09 Fundación Fraunhofer Chile Research Agent with antiviral properties for preventing or treating individuals exposed to a virus of the birnaviridae family

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2039168A1 (en) * 1989-09-04 1991-03-05 Yuto Kamei Neutralizing monoclonal antibody to infectious pancreatic necrosis virus

Also Published As

Publication number Publication date
WO1994004565A2 (en) 1994-03-03
WO1994004565A3 (en) 1994-06-09
AU4970193A (en) 1994-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4599230A (en) Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
Khusmith et al. Protection against malaria by vaccination with sporozoite surface protein 2 plus CS protein
BE1005485A5 (fr) Agent viral.
AU667578B2 (en) Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues
CN1111540C (zh) 串联的合成hiv－1肽类
FI84558B (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett vaccin mot hepatitis b-virus.
JPH03502691A (ja) 接合体ワクチンの担体分子としてのｔ細胞のエピトープ
CN1135181A (zh) 使用泛dr结合肽改变免疫应答
CN1062605C (zh) 大肠杆菌疫苗的制备方法
JPH09509568A (ja) 精子透明帯結合タンパク質の自己抗原エピトープに対応する精子抗原
CN1264425A (zh) 用于诊断和治疗的呼吸道合胞病毒表位和含有它们的抗体
CN1020857C (zh) 相应于轮状病毒的主要中和蛋白质的抗原和免疫决定子的肽
CN1054772A (zh) 合成多肽
CN1082053A (zh) 合成多肽
CN1090584A (zh) 合成多肽
GB2128621A (en) Polypeptides useful in vaccination against enteroviruses
CA2067469C (en) Recombinant vaccine against marek's disease
AU652611B2 (en) Analogs of piscine LHRH
CN1053642A (zh) 传染性支气管炎病毒疫苗
Zuckerman Subunit, recombinant and synthetic hepatitis B vaccines
CN1785425B (zh) 牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法
Wolowczuk et al. T-cell responsiveness towards various synthetic peptides of the P28 antigen in rat and mouse models during Schistosoma mansoni infection
CN1179181A (zh) GnRH－白细胞毒素嵌合体
US20090252751A1 (en) Immune adjuvant comprising ubiquinone

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication