FI84558B - Foerfarande foer framstaellning av ett vaccin mot hepatitis b-virus. - Google Patents

Description

1 84558

Menetelmä rokotteen valmistamiseksi hepatitis B-virusta vastaan Tämä keksintö kohdistuu rokotteen valmistusmenetelmään hepatitis B-virusta vastaan. Menetelmässä aikaansaadaan kemiallisesti syntetoituja polypeptidejä, jotka aminohappo-jäännösten järjestykseltään vastaavat olennaisesti aminohap-pojäännösten järjestystä luonnollisen, patogeeniin liittyvän proteiinin, erityisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin, T-solun ja B-solun determinanttialueissa. Kun näitä polypeptidejä annetaan isännälle sellaisenaan, polymeereinä tai kantajaan sidottuina konjugaatteina, niin ne indusoivat kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen isännissä, jotka on immunoitu hepatitis B-virusta vastaan.

Tämä keksintö kohdistuu uusien synteettisten antigeenien tuotantoon, joka perustuu DNA- ja/tai proteiiniketjuista saatuun informaatioon. Täsmällisemmin, tämä keksintö kohdistuu rokotteen valmistusmenetelmään, joka rokote perustuu synteettisiin antigeenisiin polypeptideihin, jotka vastaavat immunologisesti T-solun ja B-solun determinanttiosaa hepatitis B-viruksen pinnan antigeenissä (HBsAg), kun niitä käytetään sellaisenaan, polymeerinä tai kantajaan kytkettyinä.

Virusperäinen hepatitis on edelleen eräs merkittävimmistä hallitsemattomista ihmiskunnan sairauksista. Yleiskäsitteellä "virusperäinen hepatitis" tarkoitetaan periaatteessa hepatitis A:ta (hepatitis-infektio) ja hepatitis B:tä (see-rumihepatitis), vaikka myös muut tunnetut virukset, kuten keltakuumeen virus, Epstein-Barr-virus ja sytomegalovirus voivat aiheuttaa hepatitista ihmisessä. Hepatitis on erityisen tunnettu siitä, että se hyökkää pääasiallisesti maksan (kreikkaa: hepar) kimppuun, mutta tämä sairaus vaikuttaa myös muihin elimiin.

1965 Blumberg havaitsi, että tiettyjen ihmisten veressä kiersi eräs antigeeni [J. Am. Med. Assoc., 191, 541 (1965) sekä Ann. Int.

2 84558

Med., ^6 924 (1967j_/. Myöhemmin Prince totesi tämän aineen olevan hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni (HBsAg), jota syntyy runsaasti niissä henkilöissä, jotka kärsivät tämän viruksen kroonisesta infektiosta /Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 60, 814 (1968J7.

HBsAg:n immunokemiallisia piirteitä on pyritty laajasti selvittämään. Serologiset tutkimukset osoittavat, että heptatitis B-viruksen (HBV) monilla kannoilla on yksi tai useampi yhteinen determinantti, jota merkitään kirjaimella a. Kullakin kannalla on myös kaksi muuta determinanttia: joko d tai y sekä joko w tai r. Täten virusta on olemassa neljää mahdollista tyyppiä adw, ayw, adr ja ayr. HBsAgrn spesifisyys liittyy yhteen ainoaan polypeptidiin /Gold et ai., J. Immunol., 117, 1404 (1976) sekä Shih et ai., J. Immunol., 120, 520 (1978j_7» jonka koko 226 aminohappojäännöksestä muodostuva ketju perustuu nukleotidien järjestykseen HBV:n S-geenissä /Tiollais et ai., Science, 213, 406 (1981); Valenzuela et ai., Nature (Lontoo), 280, 815 (1979); Galibert et ai., Nature (Lontoo), 281, 646 (1979) sekä Pasek et ai., Nature (Lontoo), 282, 575 (1313)7.

Hepatitis B-rokote olisi välttämättä saatava aikaan niitä ryhmiä varten, jotka ryhmät ovat erityisen alttiita tälle infektiolle. Näihin ryhmiin kuuluvat terveydenhoitoon osallistuvat ja laboratorioissa työskentelevät henkilöt, sekä ne henkilöt, jotka tarvitsevat (1) ylläpitävää hemodialyysiä; (2) toistuvia verensiir toja tai joille jatkuvasti annetaan verituotteita; (3) sekä henkilöt, joita hoidetaan immuunijärjestelmää lamauttavilla tai sytotoksisilla lääkeaineilla ja (4) henkilöt, joita hoidetaan immuunireaktion heikentymiseen liittyvien pahanlaatuisten sairauksien tai häiriöiden johdosta. Lisäksi rokotetta tarvitsevat henkilöt, jotka elävät tietyillä trooppisilla seuduilla, missä hepatitis B:n infektio on tavallista.

Hepatitis A- ja B-virukset eivät kuitenkaan lisäänny merkittävästi soluviljelmissä, ja tällä hetkellä rokotteen valmistamiseksi ei ole käytettävissä laboratoriossa tuotettujen virusten lähdettä.

Il 3 84558

Yritykset siirtää hepatitis B-virusta (HBV) järjestelmällisesti kudos- tai elinviljelmiin, ovat jatkuvasti epäonnistuneet, mikä on estänyt tavanomaiseen rokotteeseen johtavaa kehitystyötä /Zuckerman, Amer. J. Med. Sei., 270, 205 (1975)7-

Rokotetta tuotetaan perinteisesti siten, että tapettu tai vaimennettu organismi viedään isäntäanalogiin yhdessä sopivien apuaineiden kanssa, jolloin normaali, tätä organismia vastaan vaikuttava immuunireaktio käynnistyy, mutta jolloin kuitenkin, toivottavasti, isännässä vältytään tämän organismin patogeenisiltä vaikutuksilta. Tähän lähestymistapaan liittyy lukuisia hyvin tunnettuja rajoituksia. Nämä rokotteet ovat monimutkaisia, ja ne eivät ainoastaan sisällä mielenkiintoista antigeenisyyden determinanttia, vaan myös monia muita asiaan kuuluvia ja kuulumattomia haitallisia aineita, joista mitkä tahansa saattavat indusoida isännässä, joissakin tai kaikissa yksilöissä, epätoivotun reaktion.

Perinteisellä tavalla tuotetut rokotteet voivat esimerkiksi sisältää keskenään kilpailevia antigeenejä, jotka häiritsevät toivottua immuunireaktiota, antigeenejä, joihin liittyy asiaankuulumattomia immuunireaktioita, organismista tai viljelmästä peräisin olevia nukleiininappoja, sekä koostumukseltaan ja alkuperältään tuntemattomia endotoksiineja ja aineita. Nämä monimutkaisten materiaalien avulla tuotetut rokotteet indusoivat luonnostaan suhteellisen suurella todennäköisyydellä jopa mielenkiinnon kohteena olevasta antigeenistä peräisin olevia kilpailevia reaktioita.

Antigeenejä on saatu aikaisemmin useilla menetelmillä, kuten luonnollisista materiaaleista eristämällä, kytkemällä hapteeni kantajaan sekä yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla. Tiettyjä synteettisiä antigeenejä on kuvattu julkaisussa Sela et ai. 7Proc* Nat. Acad. Sei. (USA), 6j), 1450 (1971); Science, 166, 1365 (1969); sekä Adv. Immun., 5, 12 9 (196627- 4 84558

Tiettyjä "synteettisiä" antigeenejä on tuotettu kytkemällä pieniä molekyylejä (esimerkiksi dinitrofenoli) kantajiin (kuten naudan seerumin albumiiniin), jolloin saadaan aikaan antigeenejä, jotka aiheuttavat tätä kytkettyä pientä molekyyliä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuotannon. Kantajamolekyyli on usein siitä syystä välttämätön, koska immuunijärjestelmä ei ehkä "tunnista" itse tätä pientä molekyyliä, joka isäntäeläimeen injektoitiin. Tätä tekniikkaa on myös käytetty erillisissä kokeissa, joissa antigeenejä valmistettiin kytkemällä polypepti-difragmentteja tunnetuista proteiineista kantajiin, kuten edellä mainituissa Sela'n et ai. julkaisuissa esitetään.

Tämä hapteeni-kantaja-yhdistelmää soveltava tekniikka on ollut hyödyllinen tutkittaessa immuunireaktion luonnetta, mutta sillä ei kuitenkaan ole ollut merkittävää käyttöä sellaisten antigeenien tuotannossa, joilla antigeeneillä olisi merkitystä diagnostisessa tai lääkinnällisessä käytännössä. Tämän puutteellisuuden eräänä syynä on se, että patogeenistä (esimerkiksi hepatitis B-viruksesta) peräisin olevan antigeenisyyden determinantin valikoimiseksi ja muodostamiseksi tällä tekniikalla tämän patogeenin koko proteiiniketju on kyettävä määrittämään, jotta onnistumiseen olisi jonkinlaiset mahdollisuudet. Tämän tehtävän vaikeudesta johtuen sitä on harvoin, mikäli koskaan, suoritettu.

Yhdistelmä-DNA-tekniikka on parantanut rokotetekniikan mahdollisuuksia, ja sen etuna on se, että valmistus aloitetaan monospe-sifisellä geenillä; kuitenkin suuri osa tästä edusta menetetään E. coli-bakteerissa tai muissa organismeissa tapahtuvassa antigeenin varsinaisessa tuotannossa. Tässä toimenpiteessä geeni-materiaali viedään plasmidiin, joka tämän jälkeen istutetaan E. coli-bakteeriin, joka puolestaan tuottaa toivottua proteiinia yhdessä aineenvaihdunnan muiden tuotteiden kanssa, näiden kaikkien muodostaessa seoksen ravinteiden kanssa. Tätä lähestymistapaa vaikeuttaa se epävarmuus, ilmentyykö toivottu proteiini transformoidussa E. coli-bakteerissa vai ei.

Il 84558 Tämän lisäksi, vaikKa toivottua proteiinia muodostuisikin, niin varmoja ei kuitenkaan voida olla siitä, saadaanko tämä proteiini otettua talteen vai ei, vai tuhoutuuko se E. coli-bakteerin kasvutapahtuman aikana. Esimerkiksi hyvin tunnettua on se, että E. coli-bakteeri pilkkoo vieraita tai muuntuneita proteiineja. Vaikka tätä proteiinia olisikin läsnä riittävän suurina määrinä ollakseen mielenkiintoinen, niin se on kuitenkin ensin erotettava E.coli-bakteerin aineenvaihdunnan muista tuotteista, sellaiset haitalliset aineet mukaan lukien, kuten epätoivotut proteiinit, endotoksiinit, nukleiinihapot, geenit sekä tuntemattomat tai ennalta arvaamattomat aineet.

Lopuksi, vaikka toivotun proteiinin erottaminen kaikista muista E. coli-bakteerin aineenvaihdunnan tuotteista olisikin mahdollista (tai saataisiin mahdolliseksi kehittyneiden, vaikkakin tällöin välttämättä hyvin kalliiden tekniikoiden avulla), niin rokote käsittäisi edelleen koko proteiinin, joka saattaa sisältää epätoivottuja antigeenisyyden determinantteja, joista eräiden tiedetään käynnistävän haitallisia reaktioita. Todellakin tunnettuja ovat eräät sellaiset proteiinit, joita muuten voitaisiin pitää rokotteina, mutta jotka sisältävät antigeenisyyden determinantin, joka indusoi vakavia häiriöitä tai sivureaktioita, jotka estävät tämän materiaalin käytön rokotteena.

Hybridomiteknologiaa käyttäen on myös mahdollista tuottaa viruksen geenituotteita vastaan vaikuttavia vasta-aineita. Periaatteessa, hybridomiteknologiassa lähdetään antigeenien monimutkaisesta seoksesta, ja myöhemmin prosessissa tuotetaan monospesi-fisiä vasta-aineita. Tämä keksintö on päin vastoin käänteinen prosessi, jossa lähdetään suhteellisesti erittäin puhtaasta antigeenisyyden determinantista, jolloin toivotun antigeeni-tuotteen puhdistamisen tarpeelta vältytään.

Tiedetään, että hybridomivasta-aineilla on alhainen vetovoima sekä alhaiset sitoutumisvakiot, ja näin ollen niiden arvo on rajoittunut. Lisäksi hybridomitekniikassa, vasta-aineiden tuotannossa on turvauduttava pahanlaatuisiin soluihin, jolloin 6 84558 huomiota on kiinnitettävä erityisesti erotustekniikoihin, puhtauteen ja turvallisuuteen.

Hybridomien tuotanto perustuu kudosviljelmään tai hiireen istuttamiseen, jolloin ilmeisenä tuloksena on se, että tuotanto on kallista ja että eri erät poikkeavat toisistaan menetelmästä johtuen.

Lisäksi sellaisten hybridomien valmistaminen on vaikeata, jotka hybridomit erittävät vasta-aineita niille molekyyleille , jotka edustavat ainoastaan pientä prosenttista osuutta välttämättömän lähtöaineen muodostaneesta monimutkaisesta seoksesta, tai jotka molekyylit ovat heikosti immunogeenisia ja joita häiritsevät voimakkaammat, dominoivat antigeenit.

Julkaisuissa Arnon et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 6jJ, 1450 (1971), Atassi, Immunochemistry, 12_, 423 (1975) sekä Vyas et ai., Science, 178, 1300 (1972) esitettyjä tutkimuksia tulkitsemalla ollaan todettu, että yleisesti ottaen lyhyet lineaariset aminohappojen ketjut hyvin epätodennäköisesti saavat aikaan vasta-aineita, jotka reagoivat luonnollisen proteiinirakenteen kanssa. Epäiltiin, että useimpien molekyylien useimpien alueiden tapauksessa antigeenisyyden determinantit olivat tuloksena aminohappojen jäännöksistä, jotka ovat selvästi erillään toisistaan lineaarisessa ketjussa, mutta lähellä toisiaan kokoontaittuneessa proteiinissa. Vasta-aineiden muodostamiseen käytettyjen polypep-tidien täsmällisen kolmiulotteisen rakenteen oletettiin olevan kriittinen useimmissa tapauksissa, jopa niidenkin antigeenien tapauksessa, jotka antigeenit käsittävät ketjussa lähellä toisiaan olevia aminohappoja.

Esimerkiksi Sela arveli välttämättömäksi syntetoida melko mutkikkaan kierukkarakenteen, jotta anti-lysotsyymireaktio saadaan aikaan. Atassi valmisti useita mutkikkaita molekyylejä, joista kukin pyrki jäljittelemään kohteena olevan proteiinin tertiääristä rakennetta. Ja Vyas päätteli, että hepatitis B-viruksen

II

7 84558 pinnan antigeenin kolmiulotteinen järjestäytyminen oli kriittinen tekijä, kun pyrkimyksenä oli saada aikaan tämän luonnollisen rakenteen kanssa reaktiivisia vasta-aineita.

Julkaisussa Sutcliffe et ai., Nature, 287, 801 (1980) havaittiin, että lineaaristen polypeptidien vasta-aineet reagoivat luonnollisten molekyylien kanssa, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että suhteellisen lyhyillä, kemiallisesti synte-toiduilla polypeptideillä voidaan saada aikaan vasta-aineita, jotka reagoivat lähes minkä tahansa, proteiinin paljaalla pinnalla olevan alueen kanssa /Green et ai., Cell, 2jJ, 477 (1982|_/. Lisäksi, koska aminohappojen ketjuja voidaan nykyään määrittää nopeasti nukleiinihappojen järjestyksen selvittävällä tekniikalla, niin on mahdollista valmistaa synteettisiä polypeptidejä, joiden avulla voidaan tuottaa aikaisemmin mahdottomia, täsmälleen toivottuja rokotteita. Täten vaivalloiset biosynteesit ovat tarpeettomia, epätaloudellisia ja vanhanaikaisia.

Nimellä Vyas myönnetyssä US-patentissa 4 415 491 julkaistaan sarja sellaisia polypeptidejä, jotka vastaavat hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin a-determinanttia. Vaikka tässä julkaisussa ei esitetä lainkaan isännän suojaamiseen liittyvää tietoa, niin kuitenkin peptidien esitetään olevan käyttökelpoisia hepatitis-rokotteen valmistuksessa.

Tämän hetkiset HBV-rokotteet käsittävät kroonisesta HBV-infektios-ta kärsivien luovuttajien plasmasta puhdistettuja, viruksen pinnan peitteen virusperäisiä komponentteja (HBsAg), jotka on inaktivoitu /McAuliffe et ai., Rev. Infect. Dis., 2_, 470 (1980JV· Tämän hetkisten HBsAg-rokotteiden turvallisuus ja tehokkuus on osoitettu kliinisin kokein, mutta tällaisten rokotteiden saanti on rajallista ja ne ovat suhteellisen kalliita, erityisesti niissä maissa, joissa esiintyy eniten HBV-sairautta. Täten huomattavia etuja saavutetaan kemiallisesti syntetoiduilla polypeptideillä, ajatellen HBV-rokotteiden käytön kustannuksia ja turvallisuutta.

8 84558

Tiedetään, että HBV-viruksen S-geenin lukuisten alueiden nukleotidien järjestyksen perusteella ennustettujen synteettisten polypeptidien antiseerumit reagoivat luonnollisen HBsAg:n kanssa radioimmunosaostuksissa /Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78_, 3403 (1981_)7 sekä kaupallisissa, anti-HBsAg:n osoittamiseksi käytettävissä, kiinteän faasin radioimmunokokeissa /Gerin et ai., Viral Hepatitis, Szmuness et ai. (toim.), 49-55 (1982 Γ7 ·

Viime aikoina ollaan todettu, että patogeenin kaltaista proteiinia voidaan jäljitellä immunologisesti tuottamalla sellaista synteettistä polypeptidiä, jonka ketju vastaa tämän patogeenin kaltaisen proteiinin determinanttialueen ketjua. Tällaisia tuloksia esitetään julkaisuissa Sutcliffe et ai., Nature, 287, 801 (1980) sekä Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78, 3403 (1981).

Lisäksi julkaisussa Gerin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 80, 2365 (1983) esitettiin jokin aika sitten, että rajoittunut suoja hepatitis B-virusta vastaan saavutetaan immunoinneilla, joissa käytetään kantajiin sidottuja synteettisiä polypeptidejä, joiden aminohappojäännösten järjestykset vastaavat aminohappo-ketjua HBsAg:n determinanttialueessa; erityisesti jäännöksiä 110-137.

Synteettisen HBsAg-rokotteen muodostaminen saattaa kuitenkin edellyttää B-solun (vasta-ainetta tuottavien) epitooppeja vastaavien synteettisten polypeptidien lisäksi sellaisia synteettisiä polypeptidejä, jotka vastaavat T-solun determinantteja, jotka eivät mene toistensa kanssa päällekkäin.

Edelleen taustana mainittakoon, että immuunijärjestelmässä on kolme solukomponenttia, B-solut (bursasta tai luuytimestä peräisin olevat lymfosyytit), T-solut (kateenkorvasta peräisin olevat lymfosyytit) sekä makrofaagit. B-solut kiertävät veressä ja imunesteessä, ja ne osallistuvat vasta-aineiden tuotantoon. T-solut vahvistavat tai heikentävät B-solujen aikaansaamaa reaktiota.

9 84558

Toisaalta, makrofaagit osallistuvat B- ja T-solujen antigeenien muodostamiseen sekä konsentroimiseen. Lisäksi makrofaagit eristävät useita biologisesti aktiivisia välittäjäaineita, jotka säätelevät sekä T- että B-solun reaktioiden luonnetta ja suuruutta, joko edistämällä tai heikentämällä solun jakautumista tai erikoistumista. Makrofaagit eivät ole spesifisiä ja ne reagoivat jokaista vierasta antigeeniä vastaan. T- ja B-solut ovat kuitenkin antigeenille spesifisiä ja ne reagoivat solu-membraanin reseptoreiden avulla, jotka reseptorit ovat spesifisiä tälle tietylle antigeenille.

HBsAg:tä vastaan vaikuttavien vasta-aineiden in vivo-tuotantoa hiirissä säätelee vähintään 2 immuunireaktion (Ir) geeniä, joista toinen on hiiren H-2-kompleksin I-A-ala-alueessa (Ir-HBs-1) ja toinen I-C-ala-alueessa (Ir-HBs-2). Todettiin, ettei d-determinanttia vastaavalla kemiallisesti syntetoidulla peptidillä toteutettu immunointi tehnyt mitään eroa erittäin reaktiivisen ja reaktioon kykenemättömän hiirikannan välillä Milich et ai., J. Immunol., 130, 1401 (1983). Tämän perusteella voidaan olettaa, että Ir-restriktio voi tapahtua siten,että T-solu tunnistaa molekyylistä muita, mahdollisesti toistensa kanssa päällekkäin joutumattomia alueita.

Pääasiallisen histologisesti yhteensopivan kompleksin sekä HBsAg:hen kohdistuvan immunologisen reaktiivisuuden säätelyn välinen yhteys hiirissä on ulotettu ihmisen immuunireaktioon, koska ollaan todettu, että HLA-DR-fenotyyppi ja viimeaikaiselle HBsAg-koerokotteelle reagoimattomuus riippuvat toisistaan. Täten synteettisen HBsAg-rokotteen muodostaminen saattaa edellyttää B-solun epitooppien lisäksi sitä, että T-solujen determinantit ovat riittävän monipuolisia mukautuakseen ihmispopulaatiossa esiintyvään geneettiseen muunteluun epitoopin tunnistamisessa.

Seuraavat tiedot olisivat erittäin arvokkaita synteettisen HBsAg-rokotteen kehittämisessä: (1) kykenevätkö luonnollisen IIBsAgrn erittäin rajallisia alueita (eli noin 6 aminohappoa) vastaavat synteettiset peptidifragmentit indusoimaan T-solujen lisääntymiseen johtavan reaktion, jota H-2:een kytkeytyneet 10 b453b geenit säätelevät, kuten luonnollisen HBsAgrn tapauksessa; (2) ovatko T-solun tunnistamiskohdat osittain päällekkäin vasta-aineen sitoutumiskohtien kanssa; (3) onko HBsAg:ssä lukuisia T-solun tunnistamiskohtia ja mikäli näin on, riippuvatko tunnistetut kohdat reagoivan kannan H-2-genotyypis-tä; (4) määräävätkö tunnistetut T-solun kohdat humoraali-reaktion (nestereaktion) spesifisyyden ja laadun; sekä (5) aktivoituvatko ihmisen HBsAg:llä immunoidut T-solut niiden samojen determinanttien vaikutuksesta, jotka determinantit indusoivat T-solujen lisääntymisen hiirissä.

Tämä keksintö kohdistuu rokotteen valmistusmenetelmään, joka rokote perustuu tiettyihin synteettisiin polypeptidei-hin, joilla on tietyt tunnusomaiset piirteet sekä ominaisuudet. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Tässä hakemuksessa käsitteitä "peptidi" ja "polypeptidi" käytetään toistensa synonyymeinä. Ohessa käytetyllä käsitteellä "synteettinen polypeptidi" tarkoitetaan kemiallisesti muodostettua, eikä biologisesti muodostunutta ja hajotettua, aminohappojäännösten ketjua, joka ei sisällä luonnollisesti esiintyviä proteiineja tai sen fragmentteja. Tällaiset synteettiset polypeptidit voivat indusoida isännässä anti-polypeptidisten vasta-aineiden tuotannon.

Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin aminohappojäännösten ketju on lyhyempi kuin hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin ketju mutta se sisältää sellaisen aminohappojäännöksistä muodostuvan ketjun, joka vastaa immunologisesti hepatitis B-viruksen pinnan antigeenin (HBsAg) vähintään yhden deter-minanttiosan aminohappojäännösten ketjua.

Kun tätä polypeptidiä, jota käytetään joko sellaisenaan, tai polymeerinä (synteettinen multimeeri) tai esimerkiksi keyhole limpet -etanan hemosyaniinista (KHL) tai muusta vastaavasta muodostuvaan kantajaan sidottuna konjugaattina, annetaan isäntäeläi-

II

11 84558 melle rokotteen muodossa olevana tehokkaana määränä, fysiologisesti siedettävässä laimentimessa, kuten vedessä, suolaliuoksessa ja/tai apuaineessa, niin se saattaa indusoida vasta-aineiden tuotannon sekä kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen isännässä.

Tämä rokote valmistetaan siten, että saadaan aikaan yksi tai useampi seuraavista polypeptideistä, niiden polymeeri tai niiden kantajaan sidottu konjugaatti, ja tehokas määrä tätä poly-peptidiä liuotetaan tai dispergoidaan fysiologisesti siedettävään laimentimeen.

Rokotteessa käytettävien synteettisten polypeptidien suositeltavimmat ketjut käsittävät HBsAg:n B-solun determinanttialueiden aminohappojäännösten ketjuja (tai niiden osia; joita ohessa kutsutaan myös B-soluja stimuloiviksi ja pohjustaviksi osiksi), ja niitä ovat mm. seuraavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän: (110) (120)

Phe(Ile)ProGlySerSer(Thr)ThrThrSerThrGlyProCys (130)

Arg(Lys)ThrCysMet(Thr)ThrThr(Pro)AlaGlnGly (137)

Thr(Asn)SerMetTyr(Phe)ProSerCys; (125) (130)

Met(Thr)ThrThr(Pro)AlaGlnGlyThr(Asn)SerMet (137)

Tyr(Phe)ProSerCys; ja (107) (110)

CysProLeuPhe(Ile)ProGlySerSer(Thr)ThrThrSerThr (120)

GlyProCysArg(Lys)ThrCysMet(Thr)ThrThr(Pro)Ala (130) (137)

GlnGlyThr(Asn)SerMetTyr(Phe)ProSerCys jossa kukin suluissa esitetty aminohappojäännös on vaihtoehtoinen sitä välittömästi edeltävälle aminohappojäännökselle, ja edellä i2 84558 olevissa ketjuissa tiettyjen aminohappojäännösten päällä suluissa esitetyt numerot tarkoittavat näiden tiettyjen aminohappo-jäännösten asemaa hepatitis B-viruksen pinnan proteiinin amino-pään suhteen. Tällaiset polypeptidit indusoivat niiden vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet voivat immunoreagoida hepatitis B-viruksen kanssa ja suojata isäntää infektiota vastaan.

Rokotteissa käytettävien synteettisten polypeptidien suositelta-vimpiin ketjuihin kuuluvat myös HBsAgrn T-solun determinantti-alueissa esiintyvät aminohappojäännösten ketjut (tai niiden osia), jotka indusoivat T-solujen lisääntymisen (ja joita ohessa kutsutaan myös T-solujen lisääntymistä edistäviksi osiksi), ja niitä ovat mm. seuraavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän: (38) (52)

SerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGlnAsn; (47) (52)

ValCysLeuGlyGlnAsn? (48) (60) CysLeuGlyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHis (70)

SerProThrSerCysProProThrCysProGlyTyr (81)

ArgTrpMetCysLeuArgArgPhelle; (95) (109)

LeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeu; sekä (140) (150) (154)

ThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSer jossa edellä olevissa ketjuissa tiettyjen aminohappojäännösten päällä suluissa esitetyt numerot tarkoittavat näiden tiettyjen aminohappojäännösten asemaa hepatitis B-viruksen pinnan proteiinin aminopään suhteen.

Lisäksi tämän keksinnön mukainen, hepatitis B-viruksen infektiota vastustava rokote saattaa sisältää tehokkaan määrän sellaista 11 i3 84558 synteettistä polypeptidiä, jonka aminohappojäännösten ketju vastaa immunologisesti olennaisesti aminohappojäännösten ketjua siinä luonnollisessa patogeenin kaltaisessa proteiinissa/ jota hepatitis B-virus koodaa, suurin piirtein asemasta 107 asemaan 154, 110-154 tai 125-154, lähtien proteiinin amino-päästä, sekä fysiologisesti siedettävää laimenninta. Kun tätä rokotetta annetaan isännälle, se kykenee indusoimaan isännässä vasta-aineiden tuotannon sekä kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen. Nämä vasta-aineet voivat immunoreagoida hepatitis B-viruksen kanssa ja rokote voi suojata isännän hepatitis B:stä johtuvaa virusinfektiota vastaan.

Esimerkiksi tällainen synteettinen polypeptidi voi käsittää seu-raavan kaavan mukaisen aminohappojäännösten ketjun, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän:

Phe(Ile)ProGlySerSer(Thr)ThrThrSerThrGly ProCysArg(Lys)ThrCysMet(Thr)ThrThr(Pro)Ala GlnGlyThr(Asn)SerMetTyr(Phe)ProSerCysCysCys ThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSer jossa kukin suluissa esitetty aminohappojäännös on vaihtoehtoinen sitä välittömästi edeltävälle aminohappojäännökselle.

Tämä ketju vastaa asemia 110-154, kuten kuvissa 1 ja 2 esitetään. Kuvissa 1 ja 2 esitetään myös ne aminohappojäännösten ketjut, jotka vastaavat asemia 107-154 sekä asemia 125-154.

Kutakin edellä mainitusta synteettisestä polypeptidistä voidaan käyttää sellaisenaan monomeerisessä muodossa tai kantajamolekyy-liin, kuten KLH:on tai tetanustoksoidiin, konjugoituna. Näitä synteettisiä polypeptidejä voidaan myös käyttää multimeerisessä muodossa.

Multimeerisessä muodossa käytettynä kukin polypeptidi muodostaa yhden lukuisista, tämän multimeerin toistuvista yksiköistä. Eräässä suoritusmuodossa tämä multimeeri käsittää vähintään kaksi i4 84558 tällaista polypeptidiä, jotka ovat sitoutuneet toisiinsa molekyylien päihin syntyneellä amidisidoksella, joka on muodostunut toisen polypeptidin aminopäässä olevan aminoryhmän ja toisen polypeptidin karboksipäässä olevan karboksiryhmän välille. Eräässä toisessa multimeerin suoritusmuodossa tämä poly-peptidi muodostaa yhden lukuisista polymeerin toistuvista yksiköistä, jossa polymeerissä nämä polypeptidien muodostamat toistuvat yksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa polypeptidien välisillä kysteiinin disulfidisidoksilla, jotka ovat muodostuneet polypeptidisissä toistuvissa yksiköissä olevien Cys-jäännösten välille.

Eräässä toisessa suoritusmuodossaan tämä keksintö käsittää diagnostisen järjestelmän, jolla voidaan määrittää solujen välittämän, HBsAgrhen kohdistuvan immunologisen reaktiivisuuden läsnäolo sekä hepatitis B-virusperäisen antigeenin läsnäolo isännässä, johon järjestelmään kuuluu edellä kuvattu synteettinen polypeptidi, jonka aminohappojäännösten järjestys vastaa aminohappo jäännösten järjestystä HBsAgrn T-solun determinantissa.

Kun tätä polypeptidiä annetaan isännälle ihon sisäisesti tehokkaana määränä ja fysiologisesti siedettävässä laimentimessa, niin se kykenee indusoimaan isännässä kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymisen. Tämän lisääntymisen osoituksena on punotus (erythema) sekä ihon kovettuminen (induraatio) siinä kohdassa, jossa polypeptidiä annettiin ihon sisäisesti.

Samoin oheisessa hakemuksessa julkaistaan menetelmät, joilla kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymistä voidaan indusoida isännässä, joka oli aikaisemmin immunoitu hepatitis B-virusta vastaan, sekä joilla voidaan määrittää hepatitis B-virusperäisen antigeenin läsnäolo isännässä. Nämä menetelmät käsittävät vaiheet, joissa käytetään ohessa tarkasteltua, T-solujen lisääntymistä indusoivaa polypeptidiä, ja tätä polypeptidiä annetaan tehokas annos isännälle ihon sisäisesti fysiologisesti siedettävässä laimentimessa, tämän menetelmän mukaisesti, ja kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntyminen sekä hepatitis B-v.irusperäisen antigeenin läsnäolo isännässä voidaan 11 15 84558 todeta punotuksena ja ihon kovettumisena siinä kohdassa, jossa polypeptidiä annettiin ihon sisäisesti.

Tällä keksinnöllä on lukuisia etuja ja hyviä puolia. Tämän keksinnön eräänä etuna on se, että synteettisen polypeptidin käyttö tekee sitä vastaavan kokonaisen proteiinin läsnäolon tarpeettomaksi. Tällä polypeptidillä itsellään saadaan aikaan rokote, joka riittää suojaamaan isännän tautia vastaan. Tämän seurauksena tämän keksinnön mukaisesta tuotteesta puuttuvat ne epäpuhtaudet, kuten esimerkiksi solujätteet sekä -toksiinit, jotka liittyvät virusperäisten proteiinien valmistamiseen bakteereissa.

Lisäksi synteettisellä hepatitis B-viruksen rokotteella, jossa on sekä B-solun että T-solun determinantit, vältetään tarve valikoida ihmisissä käytettäväksi soveltuva kantaja, jotta kateen-korvasta peräisin olevien solujen lisääntymistä vastaanottajassa saataisiin stimuloiduksi.

Tämän keksinnön muuna etuna on se, että antiseerumissa olevat, synteettisen polypeptidin vaikutuksesta muodostuneet vasta-aineet immunoreagoivat hepatitis B-virukseen liittyvien antigeenisten proteiinien ja polypeptidien kanssa, ja näitä vasta-aineita voidaan käyttää näiden proteiinien ja polypeptidien läsnäolon ilmaisemiseen.

Tämän keksinnön muut edut ja hyvät puolet ilmenevät alan asiantuntijalle· seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella.

Piirustuksissa, jotka muodostavat osan tästä julkaisusta:

Kuva 1 esittää HBsAg/ayw-proteiinin 226 aminohappojäännöksestä muodostuvaa ketjua, joka on tulkittu julkaisussa Pasek et ai., Nature, 282, 575 (1979) nukleiinihappojen järjestyksestä. Tämän keksinnön mukaiseen synteesiin valitut alueet tästä proteiinista on esitetty selvillä alleviivauksilla. Jäännökset, jotka eivät 16 84558 ole samat kolmessa, tästä nukleotidien järjestyksestä tehdyssä analyysissä, on alleviivattu heikosti /Pasek et ai,, mainittu edellä; Valenzuela et ai., Nature, 280, 815-819 (1979); sekä Galibert et ai., Nature, 281, 646-650 (1979/7· Seuraa-vat yksikirjaimiset sekä kolmikirjaimiset lyhenteet (katso kuva 2) vastaavat esitettyjä aminohappoja: A, Ala (L-alaniini); C, Cys (L-kysteiini); D, Asp (L-asparatiinihappo); E, Glu (L-glutaamihappo); F, Phe (L-fenyylialaniini); G, Gly (Glysiini); H, His (L-histidiini); I, Ile (L-isoleusiini); K, Lys (L-lvsiini); L, Leu (L-leusiini); M, Met (L-metioniini); N, Asn (L-asparagiini); P, Pro (L-proliini); Q, Gin (L-glutamiini); R, Arg (L-arginiini); S, Ser (L-seriini); T, Thr (L-treoniini)? V, Vai (L-valiini); W, Trp (L-tryptofaani); ja Y, Tyr (L-tyrosiini).

Kuva 2 esittää polypeptidien 1, 5, 5a, 6, 49, 49a, 71, 72, 72a ja 73 aminohappojäännöksistä muodostuvia ketjuja, käyttäen kustakin aminohaposta tavanomaista kolmikirjaimista lyhennettä. Nämä ketjut luetaan vasemmalta oikealle ja suunnassa polypeptidin aminopäästä karboksipäähän. Polypeptidit 1, 5, 5a ja 6 vastaavat HBsAg:n jäännöksiä 48-81, 38-52, 47-52, sekä 95-109, vastaavasti. Polypeptidit 49 ja 72 vastaavat HBsAgrn jäännöksiä 110-137 (peptidi 73 vastaa jäännöksiä 107-137), mikä on ennustettavissa S-geenin nukleotidijärjestyksestä ayw-luovuttajasta peräisin olevassa HBV DNA:ssa (polypeptidi 49) /Galibert et ai., Nature (Lontoo), 281 , 646-650 (1979/7 sekä adw-luovuttajasta peräisin olevassa HBV DNA:ssa (polypeptidit 72 ja 73 /Valenzuela et ai., Nature (Lontoo), 280, 815-819 (1979/7· Polypeptideissä 72 ja 73 alleviivatut jäännökset osoittavat niitä asemia, joissa aminohappo vaihtelee näiden kahden ketjun ja polypeptidin 49 välillä. Polypeptidit 49a ja 72a muodostuvat polypeptidien 49 ja 72, vastaavasti, 12:sta C-pään aminohaposta (jäännökset 125-137). Polypeptidi 71 vastaa HBsAg:n jäännöksiä 140-154.

Kuva 3 esittää hiiren C^H.Q-kannassa T-solujen lisääntymisreak-tioita polvitaipeen imusolmukkeen soluissa, jotka oli immunoitu HBsAgrllä (ad- tai ay-alatyyppi), jotka reaktiot oli indusoitu tl i7 84558 in vitro: luonnollisella HBsAg:llä; P25:llä (HBsAg:n 1-226 jäännöksen alayksikkö); seuraavilla P25:n tryptisillä fragmenteilla: P25-1 (jäännökset 1-122) ja P25-2 (jäännökset 123-226) sekä peptideillä P73, P72, P49, P6 , P5, P5a ja P2 (jäännökset 140-148). Ohessa käytetty kirjain "P" ennen numeroa tarkoittaa "peptidiä" tai "polypeptidiä". Lisääntyminen määritettiin sisällyttämällä tritiumia sisältävää tymidiiniä (^HTdR) solun DNA:hän, ja se ilmaistiin prosenttisena osuutena immunogeenin aikaansaamasta reaktiosta. Immunogeeni HBsAg/ad sai aikaan lisääntymisen, joka tuotti 20477 sykettä minuutissa (cpm) ja immunogeeni HBsAg/ay sai aikaan lisääntymisen, joka tuotti 33000 cpm.

Kuva 4 esittää hiiren BIO.A-kannassa T-solujen lisääntymis-reaktiot, jotka indusoitiin: luonnollisella HBsAg:llä, P25:llä (1-226 jäännöstä); P25:n seuraavilla tryptisillä fragmenteilla: P25-1 (jäännökset 1-122) ja P25-2 (jäännökset 123-226); sekä peptideillä P73, P72, P49, P6, P5, P5a ja P2. Lisääntymisreaktion annokset ja menetelmät niiden mittaamiseksi olivat samat kuin kuvan 3 yhteydessä. Immunogeenien HBsAg/ad ja HBsAg/ay aikaansaamat lisääntymisreaktiot olivat 8724 cpm ja 11444 cpm, vastaavasti. Yksityiskohtia kuvissa 3 ja 4 esitetyistä kokeista on löydettävissä osissa III ja IV.

I. Johdanto

Synteettisten polypeptidien, jotka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaavat olennaisesti HBsAg:n determinanttien d (P72) ja y (P49) aminohappoketjuja, synteesi on esitetty julkaisussa Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78_, 3403 (1981) . Näillä polypeptideillä on luonnollisten determinanttien antigeenisyyden spesifisyyttä, minkä osoittaa se, että ne kykenevät sitoutumaan luonnollista HBsAg:tä vastaan vaikuttaviin vasta-aineisiin. Lisäksi ollaan osoitettu, että keyhole limpet-etanan hemosyaniiniin (KLH) konjugoidulla peptidillä P49 toteutettu immunointi indusoi suuritiitterisen anti-y-reaktion hiiren synnynnäisesti reagoivassa kannassa Milich et ai., J. Immunol., 130, 1401 (1983).

ie 84558

Kuitenkin immunointi vapaalla (konjugoimattomalla) peptidillä P49 indusoi ainoastaan vähäistä tai ei lainkaan anti-y-tuotantoa. Samoin vapaa P72 indusoi erittäin vähäistä anti-d-reaktiota. Lukuisat tutkijat ovat todellakin törmänneet konjugoimattomien, synteettisten HBsAgrn peptidianalogien alentuneeseen immunogeenisyyteen (konjugoituihin peptideihin verrattuna).

Täten, näille synteettisille determinanteille on saatu aikaan epäspesifistä T-solujen avustajatoimintoa käyttämällä proteiinien muodostamia kantajamolekyylejä, kuten KLH:ta tai tetanus-toksoidia.

Sekä T-solun että B-solun determinantit sisältävän synteettisen HBsAg-rokotteen muodostamiseksi T-solun ja B-solun determinantit on ensin välttämättä tunnistettava HBsAgrstä.

Tiedetään, että hiiressä HBsAg:hen kohdistuvaa immuunireaktiota säätävät H-2-kytkeytyneet Ir-geenit, ja että tämä säätely ilmentyy T-solujen tasolla. Epäreaktiivisten haplotyyppien tunnusomaisena piirteenä on T-avustajasolun vajavainen toiminta, kun taas HBsAg:lie spesifiset B-soluesiintymät ovat vahingoittumattomat. Sen lisäksi, että HBsAg:n vapaiden, konjugoimattomien synteettisten peptidianalogien immunogeenisyys on alentunut, peptideillä P72 (jäännökset 110-137) tai P49 (jäännökset 110-137) toteutetuissa immunoinneissa ei todettu eroa erittäin reaktiivisten ja epäreaktiivisten kantojen välillä.

Nämä tulokset osoittavat, että P72 ja P49 edustavat B-solun epitooppeja luonnollisessa rakenteessa, mutta niistä puuttuvat asianmukaiset T-solujen determinantit.

Täten pelkästään näillä B-solun epitoopeilla toteutetut immu-noinnit ei saa aikaan välttämätöntä Ir-rajoitteista T-solun avustajatoimintoa.

Il i9 84558

Lukuisia synteettisiä HBsAg-peptidejä seulottiin ohessa kuvatusta HBsAg-spesifisessä, T-solujen lisääntymistä selvittävässä kokeessa, jotta T-solun determinantit saataisiin määritetyksi. Hiiriä immunoitiin in vivo joko luonnollisella HBsAg/ad:llä tai HBsAg/ay:llä, ja polvitaipeen imusolmukkeen (PLN) solut otettiin talteen ja altistettiin in vitro joko luonnolliselle HBsAg:lie tai erilaisille synteettisille polypeptideille.

Useita sellaisia polypeptidejä tunnistettiin, jotka stimuloivat HBsAg:llä immunoitujen PLN-solujen lisääntymistä in vitro. Erityisesti polypeptidit P5 (jäännökset 38-52), P5a (jäännökset 47-52), P6 (jäännökset 95-109) ja P71 (jäännökset 140-154), jotka on esitetty kuvissa 1 ja 2, stimuloivat T-solujen lisääntymistä hiiren PLN-soluissa, jotka on immunoitu in vivo HBsAgin joko ad- tai ay-alatyypillä.

Lisäksi vähintään polypeptidi P1 (jäännökset 48-81) sekä poly-peptidi P5 indusoivat T-solujen lisääntymisen ihmisen ääreisverenkierron lymfosyyteissä (PBL).

Huomattakoon, etteivät peptidit PI, P5, P5a, P6 ja P71 indusoi luonnollisen HBsAg:n kanssa ristireaktiivisten vasta-aineiden tuotantoa, ja ne eivät myöskään sitoudu luonnollisiin anti-HBs-vasta-aineisiin. Sitä vastoin P72 ja P49 eivät indusoi (tai parhaimmillaankin indusointi on minimaalista) T-solujen lisääntymistä, mutta sitovat spesifisyydeltään sopivaa anti-HBs:ää ja saavat aikaan vähäisen suojan hepatitis B-tautia vastaan.

Nämä tulokset osoittavat, että T-solun ja B-solun determinanteilla on selvät sijaintikohdat samassa HBsAg-polypeptidissä. Mahdollinen synteettinen antigeeni saadaan aikaan tämän keksinnön mukaisesti käyttämällä synteettistä T-solun determinanttia B-solun determinantin kanssa, mahdollisesti synteettisen B-solun determinantin kanssa.

2° 84558 H-2-hiirten samangeenisissä yhdistelmäkannoissa HBsAg:hen kohdistuvien immuunireaktioiden aikaisemmin suoritetun geneettisen analyysin perusteella voidaan päätellä "kantaja-determinantin" olemassaolo HBsAg:ssä, sillä kaikkien HBsAg-determinant-tien aiheuttamaan immuunireaktioon kohdistuva määräävä vaikutus on peräisin yhdestä ainoasta Ir-geenin sijaintikohdasta. Poly-peptidit 5, 5a ja 6 vastaavat tällaista kantaja-determinanttia luonnollisessa molekyylissä. Nämä polypeptidit toimivat sisäisinä kantajina ja saavat aikaan toiminnallista T-solun avustusta kaikissa niissä synteettisissä B-solun epitoopeissa, johon ne ovat kytkeytyneet.

Täten tämän keksinnön eräs piirre kohdistuu rokotteisiin, jotka sisältävät aktiivisena aineenaan tehokkaan määrän ohessa kuvattua, T-solujen lisääntymisen aikaansaavaa polypeptidiä, eli vähintään yhtä polypeptideistä 1, 5, 5a ja 6. Tätä rokotetta voidaan antaa isäntäeläimelle (tai ihmiselle) sen jälkeen, kun tämä eläin on immunoitu (pohjustettu) HBsAg:n B-solujen aktivaat-torilla, kuten esimerkiksi täydellisellä HBsAg-molekyyIillä tai polypeptideillä, kuten esimerkiksi polypeptideillä 49, 49a, 72 ja 72a. Tämän keksinnön mukaista T-solujen lisääntymisen aiheuttavaa polypeptidiä annetaan isäntäeläimelle mieluiten yhdessä pohjustavan, B-soluja stimuloivan immunogeenin kanssa, kuten esimerkiksi polypeptidien 49, 49a, 72 ja 72a kanssa.

Suositeltavampia, T-solujen lisääntymistä aiheuttavia ja B-soluja stimuloivia sekä pohjustavia polypeptidejä voidaan antaa isännälle erillisinä kokonaisuuksinaan yhdessä rokotteessa, jossa kumpikin on kytketty omaan kantajaansa tai homopolymeerinä, jonka toistuvat yksiköt muodostuvat aktiivisista polypeptideistä. Molemmat polypeptidityypit on mieluummin kytketty yhteen ainoaan kantajaan, jolloin ne muodostavat rokotteessa yhden ainoan aktiivisen kokonaisuuden. Edelleen, selvästi suositeltavampi ratkaisu on synteettinen HBsAg-rokote, joka sisältää polypeptideistä muodostuvia, kopolymeroituja toistuvia yksiköitä, jotka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaavat

II

2i 84558 olennaisesti luonnollisen molekyylin T-solun ja myös B-solun determinantteja, verrattuna siihen, että pyrittäisiin valitsemaan sopiva proteiinista muodostuva kantajamolekyyli, jota voidaan käyttää ihmiskohteiden immunointiin.

Lisäksi HBsAgrn kaltaisten synteettisten polypeptidien immuno-geenisyyden parantaminen on perustavaa laatua oleva tekijä synteettisen HBsAg-rokotteen kehittämisessä. Ohessa kuvatulla, erittäin immunogeenisellä synteettisellä HBsAg-rokotteella on toivottuja lääketieteellisiä sekä taloudellisia etuja tämänhetkisiin, ihmisen plasmasta saatuihin rokotteisiin verrattuna.

II. Tarkastelua Tästä tutkimuksesta saadut tiedot osoittavat, että hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni-(HBsAg)-molekyylissä olevat rajalliset alueet; erityisesti jäännökset 48-81 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä Pl), jäännökset 38-52 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P5), jäännökset 95-109 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P6), jäännökset 47-52 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P5a) sekä jäännökset 140-154 (jotka vastaavat synteettistä peptidiä P71), ovat kohtia, jotka HBsAgrllä pohjustetut T-solut mieluiten tunnistavat.

Vaikka synteettiset peptidit PI, P5, P5a, P6 ja P71 indusoivat-kin T-solujen lisääntymisen aiheuttavan reaktion, niin nämä peptidit eivät kuitenkaan vastaavasti indusoi tai sido vasta-aineita, jotka tunnistavat luonnollisen molekyylin. Tämä havainnollistaa sitä eroa determinantin spesifisyydessä, joka ero voi esiintyä B- ja T-solujen aiheuttamien, kompleksisiin, proteiinien muodostamiin antigeeneihin kohdistuvien reaktioiden välillä.

Tällainen ero on havaittu lukuisissa antigeenisissä järjestelmissä, ja sitä on kuvattu seuraavissa julkaisuissa Senyk et ai., J. Exp. Med., 133, 1294 (1971); Thomas et ai., J. Immunol., 126, 1095 (1981); Berkower et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 7ji, 4723 (1982); Kipps et ai., J. Immunol., 124, 1344 (1980).

22 84558

Sitä vastoin toiset tutkijat ovat todenneet T- ja B-soluresepto-reiden samanlaista antigeeniin kohdistuvaa spesifisyyttä, jota kuvataan julkaisuissa Twining et ai., Mol, Immunol., 18, 447 (1981); Rajewsky et ai., Eur. J. Immunol., £, 111 (1974); Backer et ai., Eur. J. Immunol., j>, 262 (1975). Kuitenkin oletukset, että T-solun ja B-solun tunnistusalueet menevät aina keskenään päällekkäin tai etteivät ne koskaan mene päällekkäin, ovat näin ollen liian yksinkertaistettuja.

HBsAgrta tarkastellen, hiirikannat C^H.Q (H-2^), tai yksinkertaisesti "C3H.Q" sekä B10.T(6R) (H-2q) eli "BIO.T(6R)" tunnistavat mieluiten HBsAg:n aminopäässä olevan fragmentin /erityisesti jäännökset 1-122 HBsAg:n polypeptidisessä P25-alayksikössä (P25-l)7 sekä komponenttipeptidit P5, P5a ja P6. Hiirikantoja C^H.Q ja B10.T(6R) kutsutaan ohessa "reaktiivisiksi kannoiksi" tai "erittäin reaktiivisiksi kannoiksi", perustuen lisääntymistä aiheuttavan reaktion suuruuteen.

Toisaalta hiirikannan B10.A(H-2a) eli "BIO.A" T-solujen lisääntymistä aiheuttava reaktio kohdistuu lähes yksinomaan HBsAg:n karboksipäässä olevaan fragmenttiin /erityisesti P25:n jäännöksiin 123-226 (P25-2^7 sekä synteettiseen P72-peptidiin, jotka toimivat myös vasta-aineen sitoutumiskohtana HBsAg:ssä. Hiiri-kantaa BIO.A nimitetään ohessa "keskinkertaisesti reagoivaksi kannaksi", koska lisääntymistä aiheuttava reaktio on pienempi kuin kannoissa C3H.Q tai B10.T(6R).

c

Hiirikanta SJL (H-2 ) tai "SJL" on todettu epäreaktiiviseksi HBsAg:llä toteutetulle immunoinnille, ja näin ollen sitä kutsutaan "epäreaktiiviseksi kannaksi".

Näin ollen vaikuttaa siltä, että HBsAg:ssä on lukuisia T-solun tunnistamiskohtia ja lisääntyvien T-solujen valikoiva aktivoituminen riippuu reagoivan hiirikannan pääsiallisen, histologi-sesti yhteensopivan kompleksin (H-2) haplotyypistä. Samankaltaista T-solun epitooppien suositummuisuusvalikointia I-alueen

II

geenien säätelemässä hapteeni-kantaja-järjestelmässä, hiiren H-2-kompleksissa, esitetään julkaisussa Seman et ai., J.

Immunol., 129, 2082 (1982).

23 84558

Humoraalista anti-HBsAg-reaktiota säätelee vähintään kaksi immuunireaktion (Ir) geeniä. Toinen näistä geeneistä on hiiren H-2-kompleksin I-A-ala-alueessa (Ir-HBs-1) ja toinen I-C-ala-alueessa (Ir-HBs-2). IrHBs-1 säätää kaikkia HBsAg:n determinanttien aiheuttamia reaktioita; kun taas Ir-HBs-2:n vaikutus on spesifistä alatyypille. (Yleiskuvaus Ir-geeneistä ja ala-alueista on löydettävissä julkaisusta Bach, Genetic Control of Immune Responses in Immunology, kappale 24, sivut 677-703 (John Wiley & Sons, New York 1982), joka julkaisu liitetään oheiseen hakemukseen tällä viittauksella).

Ohessa käytetyissä kannoissa HBsAg:n P25-polypeptidin alayksikön P25-1 sijaitsevan aminopään fragmentin sekä synteettisten poly-peptidien P5a tai P6 aiheuttamat positiiviset, T-solujen lisääntymisen aikaansaavat reaktiot osoittivat, että kaikkia HBsAg-determinantteja vastaan vaikuttavien anti-HBs-vasta-aineiden tuotanto oli parantunut. Sitä vastoin T-solujen lisääntymis-malli hiirikannassa BIO.A vastaa alentunutta anti-HBs-vasta-aineiden primääriä tuotantoa, joka rajoittuu alatyypin spesifisyyteen .

Synteettisten peptidien P5, P5a ja P6 aminopään fragmentissa oleva kohta, tai kohdat, toimii T-solun "kantaja-determinanttina", jonka T-avustajasolut tunnistavat, jotka T-avustajasolut kykenevät toimimaan a-, d- ja y-epitoopeille spesifisten ja I-A-ala-alueen rajoittamien B-solun kloonien toiminnallisena apuna. "Kantaja-determinantin" tunnistamisen puuttuessa I-C-ala-alueen rajoittamien, alatyypille spesifisten avustaja- tai vaimentaja-T-solujen vaikutusta tarkkaillaan. Koska kanta BIO.A tuottaa minimaalisen sekundäärisen anti-a-vasta-aineen reaktion, niin alatyypille spesifiset T-solut voivat myös toimia rakenteelliselle a-epitoopille spesifisten B-solun kloonien apuna.

24 84 5 58 Näillä havainnoilla on huomattavaa merkitystä synteettisen HBsAg-rokotteen kehittämisessä; ajatellen erityisesti sitä mahdollisuutta, että ihmisen HBsAg-pohjustetut T-solut saattavat tunnistaa samat epitoopit kuin hiiren T-solut.

Erityisesti pääasiallisen histologisesti yhteensopivan kompleksin ja HBsAgzn aiheuttaman immuunireaktiivisuuden säätelyn välinen yhteys hiirissä on ulotettu ihmisen immuunireaktiivisuu-teen. Julkaisussa Walker et ai., Proc. Amer. Assoc. Blood Banks, 4 (1981) esitetään, että ihmisen pääasiallisen histologisesti yhteensopivan kompleksin DR-geenin sijaintikohdassa esiintyvän tietyn fenotyypin ja jokin aika sitten kokeillun HBsAg-rokotteen epäreaktiivisuuden välillä on yhteyttä.

Täten synteettisen HBsAg-rokotteen muodostaminen käsittää mieluiten, B-solun determinanttien lisäksi, riittävän monipuolisten T-solun determinanttien läsnäolon, jotta nämä determinantit kykenisivät mukautumaan tavanomaisessa ihmispopulaatiossa epi-toopin tunnistamisessa esiintyvään geneettiseen vaihteluun.

III.Tulokset A. Hiiren B-solun epitooppien tunnistaminen

Hepatitis B-viruksen pinnan antigeenistä (HBsAg) tunnistettiin ne polypeptidiketjut, jotka indusoivat hiiren anti-HBsAg-vasta-aineiden tuotannon ja sitoutuvat näihin vasta-aineisiin.

Synteettisen polypeptidin synteesiin valittiin lukuisia polypep-tidiketjuja HBsAg-ryhmän a alatyypeistä yw (HBsAg/ayw). Näistä polypeptideistä käytetään lyhenteitä Pl, P2, P3, P4, P5, P5a, P6, P49, P49a, P71, P72, P72a sekä P73 ja ne on esitetty kuvassa 1.

Nämä peptidit syntetoitiin kemiallisesti oheisen julkaisun osassa VI kuvattuja kiinteän faasin menetelmiä käyttäen, jotka on kuvattu yksityiskohtaisemmin julkaisuissa Merrifield et ai., J. Am. Chem. Soc., 8j>, 2149 (1963) sekä Houghten et ai., Int. J. Peptide Protein Research, 16^, 311 (1980) . Kullekin näille

II

25 84558 synteettisille peptideille spesifisiä anti-polypeptidisiä vasta-aineita muodostui, kun nämä synteettiset polypeptidit kytkettiin KLH:hon ja annettiin kaniineille rokotteena, joka sisälsi myös vettä ja lisäainetta.

Nestemäiset puhdistetut HBsAg-ryhmän a alatyypin d (HBsAg/ad) sekä HBsAg-ryhmän a alatyypin y (HBsAg/ay) preparaatit saatiin tutkijalta Dr. Robert Louie (Cutter Laboratories, Berkeley, California). Synteettisten peptidien aikaansaamien vasta-aineiden ja HBsAg/ad- sekä HBsAg/ay-tyyppien välistä reaktiivisuutta analysoitiin ohessa kuvatulla tavalla hemagglutinaation kokeella (HA). Samoin jäljempänä kuvattavalla tavalla määritettiin näiden kiinteän faasin menetelmällä valmistettujen poly-peptidien kyky sitoa hiiren luonnollista HBsAg:tä vastustavia vasta-aineita, joiden spesifisyys oli joko d tai y.

Polypeptidit P73 (jäännökset 107-137), P72 (jäännökset 110-137) ja P72a (jäännökset 125-137) indusoivat sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet olivat ristireaktiivisia luonnollisen HBsAg:n ad-alatyypin kanssa. Toisaalta polypeptidit P49 (jäännökset 110-137) ja P49a (125-137) indusoivat sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka olivat ristireaktiivisia pääasiallisesti luonnollisen HBsAg:n ay-alatyypin kanssa. (Katso taulukko I).

26 84558

Taulukko 1 B-solun epitooppien tunnistaminen HBsAg:n synteettisissä peptidianalogeissa_

Peptidi"*· Anti-peptidin reaktiivisuus Anti-luonnollisen HBs:n luonnollisen HBsAg:n kanssa reaktiivisuus kiinteän faasin HA-tiitteri peptidien kanssa2 ha nitten RlA-tiitteri HBsAg/ad HBsAg/ay Anti-HBs/d Anti-HBS/y P73 1:1280 1:40 1:512 1:32

P72 1:160 O 1:1024 O

P72a 1:160 O ND4 ND

P49 1:805 1:160 1:32 1:128 P49a O 1:160 O 1:64

P6 O O O O

P5 O O 1:8 O

P5a 0 0 0 O

P4 O O 1:4 O

P3 O O 1:16 1:8

P2 O O O O

Pl O O 1:16 O

1. Anti-peptidiset antiseerumit tuotettiin kaniineissa; ja kaik— ki peptidit konjugoitiin keyhole limpet-etanan hemosyaniiniin (KLH), peptidejä P73, P72 ja Pl lukuunottamatta. Hiirissä /Milich et ai., J. Immunol., 130, 1401 (1983^7 ja simpansseissa /Gerin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 80, 2365 (1983]_7 tuotettujen anti-peptidisten antiseerumeiden spesifisyydet luonnolliselle HBsAg:lie todettiin samoiksi.

2. Peptidit (5 mikrogrammaa koloa kohden) adsorboitiin polysty-reenistä valmistettuihin mikrotiitterilevyihin.

3. Anti-HBs/d ja y tuotettiin immunoimalla BIO.S (9R)-hiiriä HBsAg/ad- ja HBsAg/ay-tyypillä, vastaavasti. Tässä H-2-yhdis-telmäkannassa saatiin ainoastaan alatyypille spesifinen vasta-ainereaktio.

4. ND = ei määritetty.

5. Ei spesifinen yhteiselle a-determinantille.

Il 27 84558

Polypeptidit P72 ja P72a vastaavat aminohappojäännösten järjesty stensä suhteen polypeptidejä P49 ja P49a, mutta ne sisältävät kuvissa 1 ja 2 esitetyt aminohappojen korvautumiset. Vaikka anti-P49-vasta-aineet reagoivatkin HBsAgrn molempien alatyyppien kanssa, niin kuitenkin HA-inhibition analyysi osoitti, ettei ristireaktiivisuus kohdistunut yhteiseen "a"-determinanttiin, vaan pikemminkin luonnollisessa HBsAg/ad:ssä, peptidissä P49 ja peptidissä P72 läsnäolevaan determinanttiin, joka puuttuu luonnollisesta HBsAg/ay-tyypistä.

Samoin tutkittiin edellä mainitun synteettisten polypeptidien sarjan kykyä sitoa hiiren luonnollista HBsAg:tä vastustavia vasta-aineita, joiden spesifisyys oli d tai y. Kuten taulukosta 1 nähdään, P72 sitoi anti-HBs/d:tä mutta se ei sitonut anti-HBs/y:tä; kun taas P49 sitoi anti-HBs/y:tä sekä anti-HBs/d:tä samassa määrin (mikä johtui oletettavasti sellaisesta risti-reaktiivisesta determinantista, joka ei liittynyt millään tavalla yhteiseen a-determinanttiin). Se tosiseikka, että P49a indusoi sellaisen anti-polypeptidisen vasta-aineen tuotannon, joka vasta-aine reagoi ainoastaan ay-alatyypin kanssa, ja sitoi anti-HBs/y:tä mutta ei anti-HBs/d:tä, osoittaa tämän polypepti-din y-spesifisyyden.

Peptidin P73, joka on identtinen peptidin P72 kanssa, lukuunottamatta aminopään ylimääräisiä aminohappoja, todettiin olevan pääasiassa d-spesifinen; kuitenkin immunogeenisyyskokeissa havaittiin pieni ristireaktiivinen komponentti. On mielenkiintoista todeta, että HA-inhibition analyysin perusteella tämä komponentti oli spesifinen determinantille, joka oli yhteinen molemmille alatyypeille (eli anti-a). Muut tässä määrityksessä käytetyt synteettiset polypeptidit eivät indusoineet sellaisia anti-peptidisiä vasta-aineita, jotka olisivat ristireaktiivisia HBsAg:n kanssa ei-denaturoivissa olosuhteissa, eivätkä ne sitoneet vähäisessäkään määrin luonnollista HBsAgrtä vastustavia vasta-aineita, tai sitoutuneet näihin vasta-aineisiin.

28 84558 Nämä tulokset ovat yleisesti ottaen yhtäpitäviä julkaisussa Gerin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 80, 2365 (1983) esitettyjen tulosten kanssa, ja ne vahvistavat d- ja y-alatyy-peille spesifisten vasta-aineen sitoutumiskohtien sijainnin synteettisissä polypeptideissä P72a ja P49a, vastaavasti.

Nämä synteettiset polypeptidit vastaavat jäännöksiä 125-137 HBsAgrn aminohappoketjussa, ja vaikka P49a eroaakin P72:sta neljän jäännöksen suhteen, niin julkaisussa Peterson et ai., J. Biol. Chem., 257, 10414 (1982) esitetään kuitenkin, että aminohappojen korvau tiimi set asemissa 131 ja 134 saavat aikaan alatyypille spesifisyyden.

Anti-luonnollisen HBsAg:n vähäinen ja matalatiitterinen reaktiivisuus lukuisten muiden synteettisten polypeptidien kanssa saattaa johtua näiden antiseerumeiden mutkikkuudesta, jotka antiseerumit mitä todennäköisimmin sisältävät HBsAg:n hajoamistuotteisiin kohdistuvaa spesifisyyttä. Tätä olettamusta tukee se, että polypeptidien P3, P4 ja P6 antiseerumit eivät reagoi luonnollisen HBsAg:n kanssa, mutta ne sitovat kuitenkin denaturoitunutta HBsAg:tä /Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78, 3403 (1981]_7· Peptidin P73 "a-kaltainen" aktiivisuus on ehkä selitettävissä siten, että peptidiin P72 on liittynyt ylimääräisiä kysteiinijäännöksiä, sillä jäännöksiä 122-137 vastaavan synteettisen polypeptidin syklisen muodon, joka on saatu aikaan ketjun sisäisellä disulfidisidoksella, on todettu sisältävän järjestäytymisestä riippuvan a-epitoopin _/l°nescu_

Matlo et ai., J. Immunol., 130, 1947 (198 3_)_/.

B. Hiiren T-solun epitooppien tunnistaminen HBsAg:sta tunnistettiin ne polypeptidiketjut, jotka luonnollisella HBsAG:llä immunoidut hiiren T-solut tunnistavat.

Luonnollista HBsAg/adw:tä puhdistettiin yhdestä kroonisesta kantajasta saadusta plasmasta, kuten esitetään julkaisussa Peterson et ai., J. Biol. Chem., 256, 6975 (1981). Tästä samasta HBsAg/adw-positiivisesta luovuttajasta saatiin P25,

II

29 84558 HBsAg:n polypeptidistä muodostuva alayksikkö, sekä kaksi peptidin P25 tryptistä fragmenttia, joista käytetään lyhenteitä P25-1 (jäännökset 1-122) sekä P25-2 (jäännökset 123-226), käyttämällä preparatiivista polyakryyliamidigeelillä toteutettua elektroforeesia, kuten myös esitetään edellä mainitussa Peterson'in et ai. julkaisussa. Synteettiset peptidit P73, P72, P49, P6, P5, P5a, P2 ja P1 (katso kuva 1) syntetoitiin ohessa kuvattujen menetelmien mukaisesti. Nämä polypeptidit ja synteettiset peptidit lyofilisoitiin, suspendoitiin uudestaan viljelyalustaan ja steriloitiin gammasäteilyllä (5000 rad). Viljelyalustana oli alkuperäinen Click'in alusta (kuvattu julkaisussa Click et ai., Cell Immunol., 3, 264 (19722_7, jota muunnettiin lisäämällä siihen kymmenen millimolaarista HEPES:iä /4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaani-sulfonihappo/ sekä 10 mikrogrammaa/millilitra gentamysiiniä ja korvaamalla sikiöastei-sen vasikan seerumi 0,5 %:lla syngeenistä, normaalia hiiren seerumia. Polypeptidit P25, P25-1 ja P25-2 eivät olleet täysin liukoisia viljelyalastaan. Viljelyalastaan suspendoituja polypeptidejä sekä synteettisiä peptidejä kutsutaan ohessa antigeeneiksi, ja niitä viljeltiin talteenotettujen polvitaipeen imusolmukesolujen (PLN) kanssa, kuten myöhemmin esitetään.

C3H.Q(H-2(3) on sukusiitetyn hiiren kanta, joka tuottaa sekä yhteisen a-alatyypin että d/y-determinanttien varhaisia (lo vrk.) IgG-vasta-aineita, HBsAg:llä toteutetun immunoinnin jälkeen, kuten esitetään julkaisussa Milich et ai., J. Immunol., 130, 1395 (1983). Viiden C^H.Q-hiiren muodostamat ryhmät immunoitiin hiirien takakäpäliin annetulla emulsiolla, joka sisältää täydellistä Freund'in apuainetta (CFA) ja kuusitoista mikrogrammaa yhdistettyä, puhdistettua HBsAg/ad- tai HBsAg/ay-preparaattia (saatu edellä kuvatusta). Polvitaipeen imusolmukesolut (PLN) otettiin talteen 12 vuorokauden kuluttua, ja niitä viljeltiin in vitro (2,5 x 10 solua/millilitra) edellä kuvatulla tavalla tuotettujen antigeenien kanssa.

3o 84558 Näitä antigeenejä testattiin viljelmässä tietyllä annostusalueel-la, kuitenkin kuvassa 3 esitetyt lisääntymisen aiheuttavat reaktiot vastaavat seuraavia in vitro-annoksia: luonnollinen HBsAg (1,0 mikrogrammaa/millilitra); P25, P25-1, P25-2 (10 mikrogram-maa/millilitra); ja synteettiset peptidit P73, P72, P49, P6, P5, P5a ja P2 (100 mikrogrammaa/millilitra).

Aina 13 vuorokautta immunoinnin jälkeen talteenotettujen PLN-solujen HBsAg-spesifinen lisääntymisen aiheuttama reaktio johtui T-solujen lisääntymisestä, kuten esitetään julkaisussa Milich et ai., J. Immunol., 130, 1401 (1983). Näin ollen määrityksissä käytettiin fraktioihin jakamattomia PLN-soluja.

HBsAg-spesifisyys osoitettiin antigeenin indusoiman lisääntymisen puuttumisena CFA-pohjustetuissa PLN T-soluissa. Lisääntyminen määritettiin sisällyttämällä tritiumpitoista tymidiiniä ( HTdR) DNArhan ja ilmaistiin prosenttisena osuutena antigeenin aikaansaamasta reaktiosta. Kokeet toistettiin vähintään kolmena erillisenä tapauksena.

T-solujen lisääntymisen aiheuttava reaktio ilmoitetaan prosenttisena osuutena synteettisen polypeptidin indusoimasta reaktiosta. C^H.Q-hiiristä saadut, HBsAg/ad-pohjustetut PLN T-solut reagoivat in vitro luonnolliseen HBsAg/adw:hen lähes yhtä hyvin kuin käytettyihin synteettisiin polypeptideihin, ja olennaisesti vähemmän luonnolliseen HBsAg/ay:hyn, mikä edustaa yhteiseen ryhmä-spesifiseen determinanttiin (determinantteihin) kohdistuvaa lisääntymistä (kuva 3a).

Polypeptidi P25 indusoi T-solujen lisääntymistä samassa määrin kuin se luonnollinen HBsAg/adw, josta se oli valmistettu. Vaikka polypeptidiä P25 tarvittiinkin useita mikrogrammoja millilitraa kohden, verrattuna luonnollisen antigeenin tapauksessa tarvittavaan 1,0 mikrogrammaan/millilitra, niin P25-valmiste ei kuitenkaan ollut täysin liukoinen viljelyalustaan, ja tehokas annos saattoi olla olennaisesti alhaisempi kuin 10 mikrogrammaa/milli-

II

litra. Tämä on mielenkiintoista, sillä P25 sitoo anti-HBs-vasta- ainetta suurin piirtein 300-kertaa tehottomammin kuin luonnol linen antigeeni.

3i 84558 P25-1 indusoi paremman lisääntymistä aiheuttavan reaktion kuin P25-2 (67 prosenttia, verrattuna 45 prosenttiin) määränä 10 mikrogrammaa/millilitra, ja merkittävästi suuremman lisääntymisen määränä 2,5 mikrogrammaa/millilitra (53 prosenttia verrattuna 13 prosenttiin). Peptidin P25-1 indusoiman paremman, lisääntymistä aiheuttavan reaktion tässä kannassa peptidiin P25-2 verrattuna vahvisti se seikka, että synteettiset polypeptidit P73 ja P72, jotka ovat P25-2:n komponentteja, indusoivat minimaalisia lisääntymistä aiheuttavia reaktioita; kun taas P6 (jäännökset 95-109), P5 (38-52) ja P5a (47-52), jotka ovat peptidin P25-1 komponentteja, indusoivat merkittävän lisääntymisen HBsAg/ad-pohjustetuissa hiirissä (kuva 3a). T-solujen lisääntymisen indusoitumiseen synteettisillä polypeptideillä tarvittiin 4 100-kertainen ylimäärä painoon perustuen ja 10 -kertainen ylimäärä mooleihin perustuen luonnolliseen HBsAg:hen verrattuna.

Korostettakoon, että peptidit P6, P5 ja P5a eivät indusoi luonnollisen HBsAgrn kanssa ristireaktiivisten vasta-aineiden tuotantoa eivätkä ne sitoudu luonnolliseen anti^HBs:ään, ja kääntäen, P73 ja P72 indusoivat ainoastaan vähäistä T-solujen lisääntymistä C^H.Q-hiirissä, mutta kuitenkin indusoivat anti-HBs/d:ta ja sitoutuvat siihen (katso taulukko 1). Nämä tulokset osoittavat, että samassa HBsAg-polypeptidissä on erilliset T-solun ja B-solun determinantit. Polypeptidi P5a, pituudeltaan ainoastaan 6 aminohappoa, indusoi paremmin T-solujen lisääntymistä po-lypeptidiin P5 verrattuna. Tämä voi johtua siitä syystä, että P5a on peräisin erittäin hydrofiilisestä alueesta HBsAgrn aminopään fragmentissa (P25-1), ja se on huomattavasti liukoi-sempi suolaliuokseen kuin polypeptidi P5. Kuten edellä tarkasteltiin, toinen tämän polypeptidin suuri hydrofiilinen osa vastaa vasta-aineiden niitä sitoutumisalueita, jotka sijaitsevat pääasiassa karboksipään fragmentissa (P25-2) .

32 84558 T-solureaktioiden alatyypeille spesifisyyden määrittämiseksi C^H.Q-hiiret pohjustettiin myös in vivo ay-alatyypin HBsAg:llä. Luonnollisen HBsAg:n ad-alatyypin sekä adw-peräisen P25:n ja tryptisten fragmenttien P25-1 ja P25-2 aiheuttamat, lisääntymistä aikaansaavat reaktiot pienenivät HbsAg/ad-pohjustettuihin hiiriin verrattuna. Kuitenkin synteettisten polypeptidien P6, P5 ja P5a tuottamat reaktiot olivat jokseenkin samanlaiset kuin HBsAg/ad-pohjustuksen jälkeen indusoituneet reaktiot (kuva 3b). Polypeptidit P73 ja P72 eivät stimuloineet HBsAg/ay-pohjustettu-ja T-soluja, ja P49 ei indusoinut lisääntymistä aiheuttavaa reaktiota kummallakaan HBsAg:n alatyypillä toteutetun pohjusta-misen jälkeen.

Nämä tulokset osoittavat, että P73 ja P72 edustavat alatyypille spesifisiä determinantteja T-solun ja B-solun tasolla. Toisaalta P6, P5 ja P5a edustavat molemmissa alatyypeissä läsnäolevia, yhteisiä T-solun tunnistamiskohtia. Tämä on yhtäpitävää aminohappoketjun kanssa, sillä P6- ja P5a-alueet ovat muuttumattomia HBsAg-ketjuissa, jotka tällä hetkellä tunnetaan, kun taas P72-alueessa esiintyy vaihtelua ja tässä alueessa esiintyvät aminohappojen korvautumiset määräävät alatyypille spesifi-syyden^ Gerin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 80, 2365 (1983) sekä Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78, 3403 (1981). Näiden reaktioiden HbsAg-spesifisyys osoitettiin CFA-pohjustettujen PLN T-solujen lisääntymisen puuttumisena HBsAg:lle tai siitä saaduille fragmenteille altistettaessa.

Polypeptidi 71

Polypeptidin P71 (jäännökset 140-154) kykyä stimuloida tai indusoida kateenkorvasta peräisin olevien solujen lisääntymistä HBsAg:tä vastaan pohjustetuissa isännissä tarkasteltiin samoin. Hiirikanta C^H.Q immunoitiin HBsAg:n alatyypillä ad ja HBsAg:n alatyypillä ay. Epäreaktiivisen hiirikannan (SJL) hiiret rokotettiin HBsAg:n alatyypillä ad. (Katso taulukko 2).

Il 84558 33

Taulukko 2

Tritiumia sisältävän tymidiinin (^HTdR) sisällyttäminen (cpm)^

Hiiri- Pohjustetut Polypeptidi 71 (rnikrogrammaa/millilitra)__ kanta T-solut 100 50 25 12 3_ 0,07 0,03 C3H.Q HBsAg/ad - - 20299 20331 15007 6832 3179 C3H.Q HBsAg/ay 8130 9694 11490 - - SJL HBsAg/ad 0 0 0 0 0 0 0 ^Muutos yksikössä sykettä minuutissa (cpm), sen jälkeen kun ver-tailualustasta saatu taustakorjaus on huomioitu.

Immunoinnit toteutettiin julkaisussa Milich et ai., J. Immunol., 130, 1395 (1983) esitetyllä tavalla. Viiden C3H.Q-hiiren ryhmät immunoitiin takakäpälistä emulsiolla, joka sisälsi täydellistä Freund'in apuainetta sekä kuusitoista mikrogrammaa nestemäistä puhdistettua HBsAg/ad- tai HBsAg/ay-preparaattia (saatu edellä esitetysti). Polvitaipeiden imusolmukesolut (PLN) otettiin talteen kahdentoista vuorokauden kuluttua ja niitä viljeltiin in vitro (2,5 x 10^ solua millilitrassa) edellä kuvatusti muunnetussa Click'in alustassa, sekä polypeptidin P71 läsnäollessa.

Kuten taulukosta 2 ilmenee, polypeptidiä P71 käytettiin tässä viljelmässä annosalueella 0,03-100 mikrogrammaa P71:tä/millilitra liuosta. HBsAg-spesifisyys osoitettiin antigeenin indusoiman, CFA-pohjustettujen PLN T-solujen lisääntymisen puuttumisena. Lisääntyminen määritettiin sisällyttämällä tritiumia sisältävää tymidiiniä (JHTdR) DNA:han, kuten jäljempänä esitetään yksityiskohtaisemmin .

Huomattakoon, ettei polypeptidillä P71 ole mitattavissa olevaa vaikutusta epäreaktiivisen SJL-hiiren HBsAg-pohjustettuihin T-soluihin. Kuitenkin taulukossa 2 esitetyt tiedot osoittavat, että P71 voi toimia T-solun determinanttina luonnollisen HBsAg-molekyylin karboksipään alueessa. Tämä on yhtäpitävää polypeptidin P25-2 (jäännökset 123-266) kyvyn kanssa indusoida T-solu-jen lisääntymistä kussakin tutkitussa reaktiivisessa kannassa.

34 84558 C. H-2-restriktion merkityksen määrittäminen hiiren T-solun tunnistamiskohdissa_________ BIO.A on sukusiitetty hiirikanta, joka tuottaa ainoastaan anti-HBsAg-d/y:n alatyypille spesifisen reaktion primäärin immunoin-nin jälkeen, kuten julkaisussa Milich et ai., J. Exp. Med., 159, 41 (1984) esitetään, jonka julkaisun sisältö liitetään oheen tällä viittauksella. Viiden BlO.A-hiiren ryhmät pohjustettiin in vivo joko HBsAg/ad:llä tai HBsAg/ay:llä. Katso kuva 4. Immunoinnin aikataulu, viljelyolosuhteet sekä antigeenien in vitro valmistaminen ja konsentroiminen, sekä T-solujen lisääntymisen testaaminen toteutettiin edellä osassa B esitetysti.

Koska erittäin reaktiivinen C^H.Q-kanta tunnistaa mieluiten peptidit P25-1, P6 ja P5 T-solujen tasolla ja tuottaa suuritiitte-ristä anti-HBs/a:ta ja anti-HBs/d:tä tai y:tä primäärin immunoinnin jälkeen, niin näiden antigeenien aiheuttamia T-solun reaktioita oli mielenkiintoista tarkastella keskinkertaisesti reaktiivisessa kannassa, joka tuottaa ainoastaan alatyypille spesifistä anti/HBs/d:tä tai y:tä primäärin immunoinnin jälkeen. BlO.A-kanta edustaa tällaista kantaa.

HBsAg/ad:llä pohjustetut BlO.A-hiiren PLN T-solut reagoivat luonnolliseen HBsAg/ad:hen, mutta eivät lainkaan luonnolliseen HBsAg/ay:hyn (kuva 3). Vaikka P25 stimuloikin BlO.A-hiiren HBsAg/ad-pohjustettuja PLN T-soluja, niin kuitenkin tryptisten fragmenttien P25-1 ja P25-2 aiheuttamat reaktiot osoittivat, että peptidin P25-2 aikaansaama reaktio tapahtui mieluummin kuin peptidin P25-1 aiheuttama reaktio, toisin kuin C^H.Q-kannan tapauksessa. Vastaavasti, polypeptidit P73 ja P72 indusoivat merkittävää lisääntymistä, kun taas polypeptidit P6, P5 ja P5a olivat jokseenkin BlO.A-hiiren PLN T-soluja stimuloimattomia, kun nämä PLN T-solut oli pohjustettu luonnollisella HBsAg/ad:llä tai HBs/ay:llä (kuva 3b).

HBsAg/ay-pohjustetuissa BIO.A-hiirissä todettiin ainoastaan vähäistä T-solujen lisääntymistä aiheuttavaa reaktiota HBsAg/ay-pohjustetuissa hiirissä (kuva 3a).

11 84558 35 Nämä tulokset osoittavat, että BlO.A-hiiren HBsAg-pohjustetut T-solut tunnistavat mieluummin polypeptidin (P25-2 ja P72) alatyypille spesifiset alueet kuin ryhmäspesifiset alueet, kuten C2H.Q-hiirikannan tapauksessa. Peptidin P72 kyky stimuloida d-spesifistä, lisääntymistä aiheuttavaa reaktiota, sekä indusoida ja sitoa antiluonnollista HBs/d:tä osoittaa selvästi, että sekä T-solut että B-solut tunnistavat alueen 110-137 BlO.A-hiirissä.

Jotta edellä mainittujen löydösten merkitys peptidin immunogeeni-syydelle sekä in vivo anti-HBs-vasta-aineiden tuotannolle saataisiin määritetyksi, C^H.Q- ja BlO.A-hiiret immunoitiin peptidillä P72, joka on d-determinantin analogi, ja anti-peptidi-sekä anti-HBs-tiitterit mitattiin seerumista ajan funktiona.

Kuten taulukosta 3 nähdään, luonnollisella HBsAg/ad:llä toteutetun immunoinnin jälkeen C^H.Q-kanta tuotti alatyypille spesifistä sekä ryhmäspesifistä anti-HBs:ää. BlO.A-kanta tuotti ainoastaan anti-HBs:ää ja vähemmässä määrin kuin C^H.Q-kanta. Kuitenkin P72:lla toteutetun kolmannen immunoinnin jälkeen BlO.A-kanta tuotti 32-kertaa suuremman anti-P72-reaktion ja 20-kertaa suuremman anti-HBs/d-reaktion kuin kanta C-jH.Q (taulukko 3).

36 84 558

Taulukko 3

Kannasta riippuva in vivo vasta-aineiden tuotanto synteettisellä peptidillä P72 toteutetun iimnunoinnin jälkeen

Kanta Imnunogeeni^ Anti-polypeptidin P72-tiitteri ja anti-HBs- tiitteri seerumissa (RIA) ^_ _ _ Anti-P72 Anti-HBs/ad Anti-HBs/ay C3H.Q HBsAg/ad (1°) - 1:2560 1:320 P72 (1°) 00 0 P72 (2°) 1:640 1:8 0 P72 (3°) 1:640 1:8 0 BIO.A HBsAg/ad (1°) - 1:320 0 P72 (1°) 1:160 0 0 P72 (2°) 1:2560 1:20 0 P72 (3°) 1:20480 1:160 0 ^Kuuden hiiren ryhmät immunoitiin vatsaontelon sisäisesti 4,0 mikrogrammalla luonnollista HBsAg/ad:tä tai 100 mikrogrammalla peptidiä P72 CFA:ssa. Peptidiä saaneet hiiret saivat samanlaiset sekundääriset (2°) ja tertiääriset (3°) immunoinnit 2 viikon ja 4 viikon välein, vastaavasti.

2

Seerumista saadut vasta-ainetiitterit mitattiin kiinteän faasin radioimmunokokeella (RIA), ja ilmoitettiin sinä suurimpana seerumilaimennoksena, jolla saatiin kaksinkertainen sykemäärä ennen immunointia saatuihin seerumeihin verrattuna.

Huomattakoon, että kantajaproteiiniin konjugoidulla P72-pepti-dillä immunoidut C^H.Q-hiiret tuottivat voimakkaita anti-P72-ja anti-HBs/d-reaktioita. Peptidin P72 alentunut immunogeeni-syys C^H.Q-kannassa on yhtäpitävää sen kanssa, että P72 ei kykene indusoimaan T-solujen lisääntymistä aiheuttavaa reaktiota HBsAg/ad-pohjustetuissa C^H.Q-hiirissä. Nämä tulokset osoittavat, että C^H.Q-kannan erittäin reaktiiviseksi luokittelu ei aiheudu siitä, että T-solu tunnistaa alatyypille spesifisen d-determinantin, mitä tapausta edustaa P72. Sitä vastoin B10.A-kanta, jossa todetaan HBsAg/ad-immunoinnin jälkeen P72-indusoitu-nut T-solujen lisääntyminen, kykeni reagoimaan P72:lla toteu-

II

37 84558 tettuun immunointiin siten, että se tuotti merkittäviä pitoisuuksia anti-P72- ja anti-HBs/d-vasta-aineita. Näin ollen synteettisten HBsAg-peptidianalogien immunogeenisyys edellyttää sekä T-solun että B-solun determinantteja; ja T-solun determinantin tunnistamisen määrää H-2-genotyyppi reagoivassa hiiri-kannassa.

D. HBsAg-spesifisen T-solujen lisääntymisen hiirissä aikaansaavien synteettisten peptidien määrittäminen, jotka peptidit HBsAg-pohjustetut T-solut tunnistavat rokotetta saaneessa ihmisessä_

Kahdesta, HBsAg/ad-rokotetta saaneesta ihmisestä peräisin olevia ääreisveren lymfosyyttejä ((PBL) (Haptavax, Merck & Co., Rahway, NJ), joista käytetään lyhenteitä "DM" ja "PW" sekä immunoimat-tomasta vapaaehtoisesta saatuja, lyhenteellä "CL" tunnettuja lymfosyyttejä verrattiin toisiinsa, niissä todetun, luonnolliseen HBsAg/ad:hen, luonnolliseen HBsAg/ay:hyn, sekä HBsAg:n synteettisten peptidianalogien sarjaan kohdistuvan T-solun reaktiivisuuden suhteen.

Kuten taulukossa 4 esitetään, yhdestä HBsAg-rokotetta saaneesta henkilöstä peräisin olevat ääreisveren lymfosyytit (DM) reagoivat luonnollisen HBsAgrn molemmille alatyypeille sekä polypeptideille P72 ja P5. Kuitenkin luonnollisen HBsAg/ad:n ja polypeptidin P72 aiheuttamat reaktiot olivat huomattavasti suuremmat kuin luonnollisen HBsAg/ay:n ja polypeptidin P5 aiheuttamat reaktiot stimuloitumisindeksin ja annosreaktion suhteen.

Sitä vastoin (PW):stä peräisin oleva PBL reagoi yhtä hyvin luonnollisen HBsAg:n molempiin alatyyppeihin, ja vastaavasti polypep-tidit P1 (jäännökset 48-81) ja P5 indusoivat lisääntymistä aiheuttavia reaktioita, kun taas polypeptidi P72 ei saanut tällaista indusoitumista aikaan. Muut testatut synteettiset peptidit eivät vaikuttaneet stimuloivasti, eikä yksikään antigeeni stimuloinut immunoimattomasta vertailusta (CL) saatuja PBL-ejä.

38 84558

Hiirimalleissa tehtyjen havaintojen mukaisesti ihmisissä esiintyvissä reaktioissa todettiin vähintään kahdentyyppistä T-solun spesifisyyttä. Toinen näistä tyypeistä on tunnusomainen sille, miten T-solu tunnistaa erillisiä determinantteja (P1 ja P5), jotka eivät indusoi anti-HBs-vasta-aineiden tuotantoa, eivätkä sitoudu niihin. Toinen tyyppi liittyy siihen, miten T-solut tunnistavat alatyypille spesifisen alueen, joka saattaa olla osittain päällekkäin B-solun determinanttien kanssa.

Il 39 84558 , Q H f\| ·ΐ Q CO £ i ' i—il O v O ^ O — 0) Ρ ε 3 ¢4 inn rm oo c m m h

(θ'" oj — cm —' -H > H P

™ ro ρ rö Cn (0

I ro :rö Ρ O P

ro -H cm ro C C > Ρ P )-t P m3 ·—· ,Or- O ro O 3 X Q) -P -Ή H cn cn - Q g C rö C 0) -H > 0) -P W d 2 ” p p Ρ -H E g +J ft (rl ro ro ro c p ro O O -n ea-H^ICrOOrö A! a 0) <0 <D -H 'Xl

0 S ~ PC β ES O =3 O P

PO) ft ςτ rn, “! <D 0) P C p P O 0) '3 U ml 3 EL 5 p *· *> ti ‘H '71 3 <n ^ x 01 Ή ·«. f—i vo -— q ro 3 I β -h

2 -H E Έ -- m g -H Ai C -H -H β :r0 -H

ro ro g <υ a> ρ p 3h E w m p ft p^ccropasA: EP p :r0 ro -H -H C ro ro -P m :r0 -P β O C :<Ö X* PO) , to^ Q — to — -H :r0 rH tO :rö :rt)

OO) Λ in -*f co O P P ro C Q) P 3 β ro P C

ί £ g ‘"'Sd §d $6 -3 3 * 3

Λ >i p P 3 Ρ P tn 2 P

ro ro > PWPcnroturoc o >. o ;ro es c e p u * -5 voi S °°> S °i P °i S o " -S e | Ρ P p m in H o (NO >i ro — :r0 rO >

<D P O in ^ — cn (OP PC :rOP

0) > -p rooccnroprop C ti ro -π ·· — P <D P ro (OCrR as p E ro ρ p >

P -H φ ..—. .—. *— M P 'O 1(0 O -Hi—I -H

P P Oli lO H On w H X > H fi H W O P

3 p n rf r· * n >. n » 3 i-hco ojco

4) -H t) ·ϋ&’ίη- i0 ro E tn 3 · C

EP ® c ^ ™ CU-pp EP — ro OP cd h 3η c <3 ro 3 ω ρ β m 3 o c

Π3 >h F3 φ PPEJroarop-HP

tn -H 51 Ci „ ^ ro · c p υ o Ptn

=ro O ^'JjfMr2®S?nScN Croc-HP E ro E E

P *p § Er- Ρ·ί 0°i- 4) tn -.ro I 0) :ro 3 H (0 O

v m g .CrroEtnPvoPrnp tn -.ro p > ro ρ P 0) c

•H 3h P ^ ^ -HrOPP tn3-HPC

Οβι-im βΡφ3(θ:θΌΡ Q) X >λ E P p -H ·π 34 P -H P β

x p :r0 7} hi -h ro ρ O ρ p 3 P

3 c β a) ro ro — — — Bropcro-ppro

p :ro :ro p -h x> r" co oo m croa)3PEroProP

3 :t0 G P g J3 £ 1« £ 3 p -p β C >, ρ β > ro M »E1 S £2 JS d- -h ero -h e ρ \ p ro

gi P (0 Cn E moj p P3tnp-HC<uro-HC

p ro 2 :ro E P3tntnoroa)P>P

, ro ro :ro ro β 3 p ro 3 p a> w

P— (DCQtn p m :ro 3 p p ro p P

kl ro S j ΡίΟΡΛίβιΟίΟβΡίΟ cqp \ ^-ro m- to- Eproa>Ppwg<p ftPOc (j eri - m o (n o ro e ro ρ -h o ro p —-0)P·· 2 f'- O to ^ ·*τ * p-ηρ ro β e Ui 0) ρ p E ro p p p p <n p OQ)3— e tr> · e e m ω ff> (3 ^ p ^ ^ PE-nfieprooroe Φ -h ro ^ ^ PO cu ro p ρ -n -h •HP -H ΕΕ·υβ3(ΟΕΟ)Ρ ρρρ ro ro p p ^ p e p p tr» a) prop pO O jn pdipro o ρ ρ ε o e >1 o S 2 Q 3 ppp rorooro p >1 - e ,3 £ CK ^ p pp ro 3p-pO ro e w:roc 2 inPEoronaroro-ctro oroo >1 o p e ε ro p ro ;ro

p ro 3 . ro O) :ro e P p P P P P

βρρ & __ o e λ; p 3 p ctic >,ro p ro <u - 3 e ro e p p p p p ro öo O O EProroc-H pppx; J-p ro — <00 p >ip p p e p p p a ;ro *· P3— o)Bd)roproQ)>.

cp ui 1 il Ö H 1-1 οχιό (Dfiprocu 3h

<D Ρ|ΕΚ CE®K:ro O' E 0) ro PP

MeöPtnp o) p cu 1 p p o p rorop roro pq-ho pro^xppp>iro)-iwro >roroSPro ro 3roco:ro^;ppp up t? if h fi > :ro :ro o Λί ro ε λ; p -h 3 p p ro o μ> 5 2 3 rop-nHiP ophm rocPcErop S o Prorororoc:ro:ro-pP3:ro

Mroro^'-ffl·· ·· ro ρ ρ μ} ιαε·ρ P3:ro

:t0 (0 C Ep ρ· Ρ βΡ :ro>:roro-ProE

Miroro, :ro>i>irowrocGPP

x xCPinrorop — ro o ε e p -6 cwm:op ro-H^roro ro + + 1 n :ro o ro ro ro en p ro p \ o) :ro p > ρ ρ Ό p x p ro 11 51 i3roBrowroEProP3

3? 9 5? t? 3 EPiHPAjroGcroroPQ

s E U CUv3PO>iPtn<uiEroE

S It ^ w - p N ro ^r- 4o 84558 IV. Materiaalit ja menetelmät A. Materiaalit

Sukusiitetyt hiirikannat C^H.Q ja BIO.A sekä Uuden Seelannin valkoiset kaniinit saatiin Scripps-klinikan tutkimuslaitoksesta,

La Jolla, CA. Kanta B10.T(6R) saatiin tutkijalta Dr. Hugh McDevitt (Stanford University, Palo Alto, CA). Kaikissa tutkimuksissa käytettiin naarashiiriä, jotka tutkimusten alussa olivat 6 ja 12 viikon ikäisiä.

Nestemäiset HBsAg/ad- ja HBsAg/ay-valmisteet saatiin tutkijalta Dr. Robert Louie (Cutter Laboratories, Berkeley, CA). Nämä valmisteet oli puhdistettu Cutter-laboratoriossa ihmisen plasmasta rutiininomaisten menetelmien yhdistelmällä, kuten esimerkiksi ultra-sentrifugointia, ammoniumsulfaatilla saostamista, pepsiinillä pilkkomista ja geelikromatografiaa käyttäen. Nämä HBsAg-valmis-teet eivät sisältäneet kontaminoivia ihmisseerumin proteiineja Ouchterlony-analyysin tai vuohen anti-ihmisseerumia vastaan toteutetun immunoelektroforeesin perusteella /Milich et ai., J. Immunol., 129, 320 (1982), jonka sisältö yhdistetään oheiseen julkaisuun tällä viittauksella7.

Luonnollista HBsAg/adw:tä puhdistettiin yhdestä ainoasta kroonisesta kantajasta saadusta plasmasta menetelmillä, jotka on aikaisemmin kuvattu julkaisussa Peterson et ai., J. Biol. Chem., 256, 6975 (1981). Rakenteellinen polypeptidi (P25) ja tryptiset fragmentit P25-1 (jäännökset 1-122) ja P25-2 (jäännökset 123-226 valmistettiin tästä samasta HBsAg/adw-positiivisesta kantajasta preparatiivisella, polyakryyliamidigeelillä toteutetulla elektroforeesilla, mikä on myös esitetty edellä mainitussa Peterson'in et ai. julkaisussa. Kuvassa 1 esitetyt synteettiset polypeptidit syntetoitiin kiinteän faasin menetelmillä, jotka kuvataan ohessa. Polypeptidit sekä tryptiset fragmentit lyofilisoitiin, suspen-doitiin uudestaan viljelyalastaan edellä esitetysti, ja ne steriloitiin gammasäteilyllä (5000 rad.).

B. Immunointi

Anti-polypeptidiset vasta-aineet tuotettiin kaniineissa. Poly-

II

4i 84558 peptidit kytkettiin keyhole limpet-etanan hemosyaniiniin (KLH) polypeptidissä jo olevien tai siihen lisättyjen kysteiinien avulla käyttäen kytkemisreagenssina m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksi-sukkinimidin esteriä (MBS) /Ocatso osa v (cjy. Kaniinit immunoi-tiin polypeptidistä ja KLH:sta muodostuvilla konjugaateilla seu-raavan aikataulun mukaisesti: (1) kaniineille annettiin 200 mikrogrammaa polypeptidiä täydellisessä Freund' in apuaineessa (CFA) ihon alaisesti Ortena vuorokautena; (2) 200 mikrogrammaa polypeptidiä epätäydellisessä Freund'in apuaineessa (IFA) 14:tenä vuorokautena; ja (3) 200 mikrogrammaa polypeptidiä ja 4 milligrammaa alumaa annettiin vatsaontelon sisäisesti 21:tenä ja 91:tenä vuorokautena. Eläimistä otettiin verta talteen 15 viikon kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Polypeptidit 1, 72 ja 73 injektoitiin ilman KLHrta. Edellä mainitut polypeptidien painot eivät sisällä kantajien painoja.

Vasta-aineiden in vivo tuotannon tutkimiseksi hiirissä hiirien muodostamat ryhmät immunoitiin 4,0 mikrogrammalla luonnollista HBsAg/ad:ta tai 100 mikrogrammalla peptidiä P72 CFArssa vatsaontelon sisäisiä injektointeja käyttäen. Peptidiä saaneet hiiret immunoitiin samalla tavalla toiseen ja kolmanteen kertaan 2 viikon ja 4 viikon väliajoin. In vivo-immunointi (pohjustaminen) imusolmukkeiden lisääntymiskoetta varten toteutettiin injektoimalla yhteensä 16,0 mikrogrammaa HBsAgrtä CFA:ssa 80 mikrolitran tilavuutena vastaanottavien hiirien kahteen takakäpälään.

C. Anti-HBs:n mittaaminen

Synteettisellä polypeptidillä tai luonnollisella HBsAg:llä toteutettujen immunointien indusoimat anti-HBs-vasta-aineet sekä polypeptidillä toteutetun immunoinnin indusoimat anti-polypep-tidiset vasta-aineet mitattiin kahdella menetelmällä. Anti-HBs-reaktiivisuus ja anti-polypeptidinen reaktiivisuus hiiren seerumeista arvioitiin epäsuoralla, immunoglobuliinin luokalle spesifisellä radioimmunokokeella (RIA) käyttäen kiinteän faasin HBsAg:tä (ad- tai ay-alatyyppi) tai synteettisiä peptidejä, vuo- 125 hen anti-hiiri-IgG:tä, ja kehitettiin I-merkittvä sian anti- 42 84558 vuohen Ig:tä käyttäen, kuten julkaisussa Milich et ai., J. Immunol., 129, 320 (1982) esitetään.

Anti-HBs-aktiivisuuden analysoimiseksi kaniinien seerumeista käytettiin hemagglutinaation (HA) menetelmää. Ihmisen "O"-tyypin, Rh-negatiivisia punaisia verisoluja pinnoitettiin HBsAg:llä (ad- tai ay-alatyyppi) kromikloridimenetelmällä, kuten julkaisussa Vyas et ai., Science, 170, 332 (1970) esitetään, joka julkaisu liitetään oheen tällä viittauksella.

Pinnoitetut solut lisättiin 0,25 millilitraan laimennussarjana oleviin testattaviin seerumeihin, joka laimennussarja oli tehty "V"-pohjaisille mikrotiitterilevyille. Kaikki anti-HBs-kokeet suoritettiin 5-10-prosenttisessa tavallisessa ihmisseerumissa, jolloin kontaminoivan ihmisplasman proteiineja vastaan vaikuttavat, mahdolliset vasta-aineet saatiin neutraloiduiksi, joita ihmisplasman proteiineja ei ehkä saatu poistetuiksi HBsAg-valmis-teesta käytetyillä puhdistamistoimenpiteillä.

D. Imusolmukkeiden lisääntymiskoe

Viiden hiiren ryhmät immunoitiin takakäpälistään emulsiolla, joka sisälsi CFA:ta ja 16 mikrogrammaa HBsAg:tä (ad- tai ay-alatyyppi) . Polvitaipeiden imusolmukesolut (PLN) otettiin talteen 12 vuorokauden kuluttua ja niitä viljeltiin in vitro pitoisuudeksi 5 x 10^ solua, altistaen ne eri antigeeneille. In vitro antigeenejä olivat luonnollinen HBsAg /ad (yhdistetty), ay (yhdistetty) tai adw, joka oli peräisin yhdestä luovuttajasta/; polypeptidi P25; tryptiset fragmentit P25-1 ja P25-2; sekä tämän keksinnön mukaiset synteettiset polypeptidit (P73, P72, P71, P49, P6, P5, P5a, P2, Pl).

Talteenotettavat polvitaipeen imusolmukesolut poistettiin kustakin hiirestä aseptisesti ja niistä valmistettiin yksisolu-suspensiot. Solut pestiin kahdesti tasapainotetulla suolaliuoksella (BSS), joka sisälsi fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (pH 7,2). Solut suspendoitiin uudestaan Click'in alustaan,

II

43 84558 joka sisälsi BSS:ta, L-glutamiinia, natriumpuryvaattia, antibiootteja, 2-merkaptoetanolia, olennaisia ja epäolennaisia aminohappoja sekä vitamiineja. /Katso julkaisu Click et ai., Cell Immunol., 3>, 264 (1972j_7- Click'in alusta muunnettiin kuitenkin lisäämällä siihen 10 millimolaarista HEPES'iä (N-2-hydroksietyyli-piperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo) ja gentamysiiniä (10 mikro-grammaa/millilitra) ja korvaamalla sikiöasteisen vasikan seerumi 0,5 %:lla syngeenisen normaalin hiiren seerumilla.

Antigeenejä testattiin viljelmissä tietyllä annosalueella. Kuvissa 3 ja 4 esitetyt lisääntymistä aiheuttaneet reaktiot vastaavat kuitenkin seuraavia in vitro annoksia: luonnollista HBsAgrtä 100 mikrogrammaa millilitraa kohden.

5 0,1 millilitrassa alustaa olevat elävät imusolmukesolut (4 x 10 ) laitettiin tasapohjaisiin mikrotiitterilevyn koloihin (Falcon 3072, Falcon Plastics, Inc.), joihin lisättiin: (a) 0,1 ml ad-tai ay-alatyypin HBsAg:tä (2,0-0,6 mikrogrammaa/millilitra), (b) viljelyalustaa ja ovalbumiinia (200 mikrogrammaa/millilitra), jotka toimivat negatiivisena vertailuna, tai (c) puhdistettua proteiinijohdannaista (PPD, 50 mikrogrammaa/millilitra), joka toimi positiivisena vertailuna.

Viljelmiä inkuboitiin 5 vuorokautta 37°C:n lämpötilassa kostutetussa ilmakehässä, jossa ilma sisälsi 5 prosenttia hiilidioksidia.

Neljäntenä vuorokautena kutakin viljelmää pulssitettiin radioaktii-3 3 visella H-tymidiinillä ( HTdR) (6,7 Ci/millimooli, New England Nuclear, Boston, MA) 16-18 tunnin ajan ennen solujen ottamista talteen. Lisääntyminen määritettiin ^HTdR:n sisältymisenä DNA:hän. Ominaislisääntyminen on stimulointi-indeksi (SI), joka saadaan, kun testattavan antigeenin sykkeet minuutissa (cpm) jaetaan vertailuna toimivan alustan sykkeillä minuutissa (cmp). Aikaisemmin osoitettiin, että HBsAg-spesifinen lisääntymistä aiheuttava reaktio tutkittavissa PLN-soluissa, jotka otettiin talteen jopa 13 vuorokauden kuluttua immunoinnin jälkeen, johtui lisääntyvistä 44 84558 T-soluista /Milich et ai., J. Immunol. 130, 1401 (1983j_7· Täten ohessa kuvattavissa kokeissa käytettiin fraktioimattomia PLH-soluja.

V· Peptidisynteesi ja valikointi A. Polypeptidien synteesi Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit syntetoitiin kemiallisesti kiinteän faasin menetelmillä, jotka kuvataan julkaisuissa Merrifield et ai,, J. Am. Chem. Soc., £5, 2149 (1963) sekä Houghten et ai., Int. J. Peptide Protein Research, 16_, 311 (1980).

Ohessa käytettävät suhteellisen lyhyet polypeptidit vastaavat olennaisesti HBsAg:n antigeenisyyden determinantteja.

Kuva 1 esittää 226 aminohappojäännöksestä muodostuvaa HBsAg-ket-jua. Ohessa kuvattujen suositeltavampien synteettisten polypeptidien aminohappojäännösten ketjut on esitetty kuvissa 1 ja 2. Joissakin tapauksissa kysteiinijäännös lisättiin joidenkin polypeptidien aminopäähän tai karboksipäähän, jolloin tämä kysteiini-jäännös mahdollisti proteiinin kytkemisen kantajaan, kuten jäljempänä esitetään. Kaikkien polypeptidien koostumus varmistettiin aminohappoanalyys illä.

Yleisesti ottaen immunogeeni tai synteettinen polypeptidi valmistetaan vaiheissa, joissa käytetään lukuisia sellaisia aminohappoja, jotka vastaavat aminohappojäännöksiä HBsAgin antigeenisyyden determinanttialueessa, ja nämä aminohapot syntetoidaan polypeptidiksi, jonka peptidiketju vastaa tämän antigeenisyyden determinantin peptidiketjua. Tätä tuotettua synteettistä poly-peptidiä voidaan käyttää rokotteen valmistamiseen, tavallisesti siten, että se kytketään kantajaan konjugaatiksi, jonka jälkeen tehokas määrä tätä konjugaattia dispergoidaan fysiologisesti siedettävään laimentimeen.

Nämä polypeptidit syntetoidaan mieluiten edellä mainittujen kiinteän faasin menetelmien mukaisesti kysteiinihartsia käyttäen.

Katso edellä mainittu Merrifield"in et ai. julkaisu. Yksittäisten

II

45 84558 aminohappojen sivuketjut suojataan seuraavasti: Arg-tosyyli,

Ser-, Thr-, Glu- ja Asp-O-bentsyyli; Tyr-O-bromobentsyylioksi-karbamyyli; Trp-N-formyyli. Trp-jäännöksissä oleva N-formyyli-ryhmä poistetaan sen jälkeen, kun peptidi on irrotettu hartsi-tuestaan, käsittelemällä peptidiä 0,1 molaarisella ammoniumbi-karbonaatilla peptidin pitoisuuden ollessa 1,0 milligrammaa/ millilitra 16 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, Yamashiro et ai., J. Org. Chem., 3£^, 2594-2597 (1973). Kytkeytymisen tehokkuutta kussakin vaiheessa voidaan seurata ninhydriinillä tai pikriini-hapolla, ja tehokkuus on mieluiten suurempi kuin 99 prosenttia kaikissa tapauksissa. Katso Gisin, Anal. Chem. Acta, 58, 248-249 (1972) sekä Kaiser, Anal. Biochem., 34_, 595-598 (1980).

Tässä hakemuksessa käsite "vastaa immunologisesti olennaisesti", jota kuvauksessa sekä patenttivaatimuksissa käytetään lukuisissa kieliopillisissa muodoissaan polypeptidiketjujen yhteydessä, tarkoittaa sitä, että kuvattu polypeptidiketju indusoi sellaisten vasta-aineiden tuotannon, jotka vasta-aineet sitoutuvat tähän polypeptidiin ja (a) sitoutuvat luonnollisen HBsAgrn antigeeni-syyden determinanttiin polypeptidien 49, 49a, 72 ja 72a tapauksessa tai (b) indusoivat T-solujen lisääntymistä polypeptidien 1, 5, 5a, 6 ja 71 tapauksessa. Täten tämän keksinnön mukaiset peptidit toimivat immunologisesti kuten vastaavat osat HBsAg-molekyyleissä-, ja kykenevät myös indusoimaan itseään vastaan vaikuttavien vasta-aineiden tuotannon.

Oheisessa kuvauksessa sekä patenttivaatimuksissa käytetty, eri kieliopillisissa muodoissaan esiintyvä käsite "vastaa olennaisesti" tarkoittaa polypeptidiketjujen yhteydessä kuvattua polypeptidiket jua, josta puuttuu tai johon on lisätty korkeintaan kolme aminohappojäännöstä joko amino- tai karboksipäähän tai molempiin päihin, ja joka käsittää ainoastaan konservatiivisia korvautumisia tietyissä polypeptidiketjun aminohappojäännöksissään.

Edellä käytetty käsite "konservatiivinen korvautuminen" tarkoittaa sitä, että jokin aminohappojäännös on korvautunut toisella, biologisesti samankaltaisella jäännöksellä. Esimerkkinä konservatii- 46 84558 visesta korvautumisesta mainittakoon hydrofobisen jäännöksen, kuten Ile,, Vai, Leu tai Met, korvautuminen toisinaan, tai polaarisen jäännöksen korvautuminen toisella polaarisella jäännöksellä, kuten jäännösten Arg ja Lys, Glu ja Asp tai Gin ja Asn väliset keskinäiset korvautumiset sekä muut vastaavat.

Joissakin tapauksissa ionisen jäännöksen korvautumista vastakkaisesti varautuneella ionisella jäännöksellä, kuten esimerkiksi jäännöksen Asp korvautumista jäännöksellä Lys, kutsutaan alalla konservatiiviseksi korvautumiseksi, sillä näiden ionisten ryhmien ajatellaan ainoastaan parantavan liukoisuutta. Kuitenkin yleisesti ottaen, koska ohessa tarkasteltavat korvautumiset ovat tapahtuneet suhteellisen lyhyissä synteettisissä, polypeptidistä muodostuneissa antigeeneissä koko proteiiniin verrattuna, niin ionisen jäännöksen korvautumista toisella ionisella, vastakkaisesti varautuneella jäännöksellä pidetään ohessa "radikaalina korvautumisena", jollaisia ovat myös ionittomien ja ionisten jäännösten korvautumiset toisillaan, tai suurten jäännösten, kuten Phe,

Tyr tai Trp, ja pienempien jäännösten, kuten Gly, Ile ja Vai, väliset korvautumiset toisillaan.

Käsitteitä "ioniton" ja "ioninen" jäännös käytetään ohessa tavanomaisissa merkityksissään tarkoittamaan sellaisia aminohappojäännöksiä, joilla tavallisesti ei ole varausta tai joilla tavallisesti on varaus, vastaavasti, fysiologisissa pH-arvoissa. Esimerkkeinä ionittomista jäännöksistä mainittakoon Thr ja Gin, ja esimerkkeinä ionisista jäännöksistä mainittakoon Arg ja Asp.

Sanaa "antigeeni" käytetään perinteisesti tarkoittamaan sellaista kokonaisuutta, jonka vasta-aine sitoo, sekä tarkoittamaan kokonaisuutta, joka indusoi vasta-aineiden tuotannon. Nykyisessä käytännössä antigeenin merkitys rajoittuu sellaiseen kokonaisuuteen, jonka vasta-aine sitoo, kun taas käsitettä "immunogeeni" käytetään sellaisesta kokonaisuudesta, joka indusoi vasta-aineiden tuotannon. Joissakin tapauksissa antigeeni ja immunogeeni ovat sama kokonaisuus, esimerkiksi silloin, kun synteettistä polypeptidiä 47 84558 käytetään vasta-aineiden tuotannon indusoimiseen, ja nämä vasta-aineet sitoutuvat tähän polypeptidiin. Kuitenkin samaa poly-peptidiä (P49a) voidaan myös käyttää sellaisten vasta-aineiden indusoimiseen, jotka vasta-aineet sitoutuvat koko proteiiniin, kuten HBsAg:hen, missä tapauksessa tämä polypeptidi on sekä immu-nogeeni sekä antigeeni, kun taas HBsAg on antigeeni. Mikäli ohessa tarkasteltu kokonaisuus on sekä immunogeeninen että antigeeninen, niin sitä kutsutaan yleisesti antigeeniksi.

B. Polymeerien valmistaminen Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan kytkeä toisiinsa, jolloin muodostuu antigeeninen polymeeri (synteettinen multimeeri), joka käsittää lukuisia polypeptidin muodostamia toistuvia yksiköitä. Tällaisen polymeerin etuna on parantunut immunologinen reaktiivisuus, ja mikäli tämän polymeerin valmistamiseen käytetään erilaisia polypeptidejä, niin tämä polymeeri kykenee lisäksi indusoimaan sellaisia vasta-aineita, jotka immunoreagoivat HBsAg:n lukuisten antigeenisyyden determinanttien kanssa.

Polymeeri (synteettinen multimeeri) voidaan valmistaa syntetoi-malla polypeptidejä edellä esitetysti, ja lisäämällä kysteiini-jäännös sekä amino- että karboksipäähän, jolloin muodostuu "diCys-päätteinen" polypeptidi. Tämän jälkeen tyypillisessä laboratoriomenetelmässä, 10 milligrammaa tätä diCys-polypeptidiä (sisältää kysteiinijäännökset hapettumattomassa muodossa) liuotetaan 250 millilitraan 0,1 molaarista ammoniumbikarbonaatti-puskuria. Tämän jälkeen liuotettu diCys-päätteinen polypeptidi hapetetaan ilman avulla sekoittamalla tuloksena olevaa liuosta varovaisesti noin 18 tunnin ajan, tai niin kauan, ettei liuoksessa ole vapaata merkaptaania Ellman'in kokeen mukaan./Katso julkaisu Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82_, 70 (1959^7- Näin valmistettu polymeeri (synteettinen multimeeri) sisältää toistuvina yksikköinään lukuisia tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä. Nämä polypeptidin muodostamat toistuvat yksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa hapettuneilla kysteiinijäännöksillä.

48 84558 C. Polypeptidien kytkeminen proteiinikantajiin

Synteettiset polypeptidit kytkettiin keyhole limpet-etanan hemo-syaniiniin (KLH) tai tetanustoksoidiin (TT) jompaa kumpaa seuraa-vista menetelmistä käyttäen. Ensimmäisessä menetelmässä kantaja aktivoitiin m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidin esterillä ja kytkettiin tämän jälkeen polypeptidiin polypeptidin amino-tai karboksipäähän lisätyn kysteiinijäännöksen välityksellä, kuten esitetään julkaisussa Liu et ai., Biochem., 80, 690 (1979). Toisessa menetelmässä polypeptidi kytketään kantajaan vapaiden aminoryhmien välityksellä, käyttäen 0,04-prosenttista glutaraldehy-diliuosta, kuten hyvin tunnetaan. Katso esimerkiksi julkaisu Klipstein et ai., J. Inpect. Disc., 147, 318 (1983).

Kuten edellä esitetään, synteettisen polypeptidin amino- ja/tai karboksipäähän lisättyjen kysteiinijäännösten on todettu olevan erityisen käyttökelpoisia, kun muodostetaan konjugaatteja di-sulfidisidoksilla ja Michael'in additioreaktion tuotteita, mutta myös muita alalla hyvin tunnettuja menetelmiä konjugaattien valmistamiseksi voidaan käyttää. Esimerkkeinä muista sitomismenetel-mistä mainittakoon dialdehydien, kuten glutaraldehydin käyttö (esitetty edellä) ja muiden dialdehydien käyttö, tai karbodi-imidi-tekniikan käyttö, esimerkiksi vesiliukoisen karbodi-imidin, kuten l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidin käyttö amidi-sidosten muodostamiseksi kantajaan.

Käyttökelpoiset kantajat ovat alalla hyvin tunnettuja, ja tavallisesti ne ovat itsekin proteiineja. Esimerkkeinä tällaisista kantajista mainittakoon keyhole limpet-etanan hemosyaniini (KLH), edestiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten naudan seerumin albumiini tai ihmisen seerumin albumiini (BSA tai HSA, vastaavasti) , punaiset verisolut kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), tetanustoksoidi, koleratoksoidi, sekä polyaminohapot, kuten poly-(D-lysiini:D-glutaamihappo) ja muut vastaavat.

Kuten alalla hyvin tunnetaan, tämä synteettinen polypeptidi on usein edullista sitoa kantajaansa välittävän kytkevän ryhmän avulla. Kuten edellä on mainittu, glutaraldehydi on eräs tällainen li 49 84558 kytkevä ryhmä. Kuitenkin kysteiiniä käytettäessä tämä välittävä kytkevä ryhmä on mieluiten m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksi-sukkinimidin esteri (MBS). MBS lisätään tyypillisesti ensin tähän kantajaan esterin ja amidin välistä vaihtoreaktiota käyttäen. Tämän jälkeen voi seurata edellä mainittu Michael'in reaktio tai lisääminen voidaan toteuttaa suojatun merkaptoryhmän kuten tioetikkahapon (CH^COSH) lisäyksenä maleimido-kaksoissidoksen poikki. Suojaavan asyyliryhmän irrottamisen jälkeen disulfidi-sidos muodostuu kytkevän ryhmän suojaamattoman merkaptaanin ja synteettiseen polypeptidiin lisätyssä kysteiinijäännöksessä olevan merkaptaanin välille.

Kantajan valinta riippuu pikemminkin antigeenin lopullisesta käyttötarkoituksesta kuin antigeenin determinanttiosasta, ja tämä valinta perustuu kriteereihin, jotka eivät liity erityisesti tähän keksintöön. Esimerkiksi mikäli rokotetta aiotaan käyttää eläimissä, niin tällöin tulisi valita sellainen kantaja, joka ei saa aikaan haitallista reaktiota tässä eläimessä. Mikäli rokotetta on tarkoitus käyttää ihmisessä, niin tällöin on pääasiallisesti huolehdittava siitä, ettei kantaja ja/tai tuloksena oleva antigeeni aiheuta immunokemiallisia tai muun kaltaisia sivureaktioita, sekä tuotteen turvallisuudesta ja tehokkuudesta - eli huomiota on kiinnitettävä niihin samoihin seikkoihin, jotka pätevät mihin tahansa ihmisessä käytettäväksi aiottuun rokotteeseen.

VI. Immunointitoimenpiteet

Ohessa käytettävät siirrosteet tai rokotteet sisältävät tehokkaan määrän polypeptidiä sellaisenaan, polymeerinä, jossa erilliset polypeptidit ovat sitoutuneet toisiinsa hapettuneilla kysteiini-jäännöksillä tai kantajaan kytkettynä konjugaattina. Siirrostet-ta kohden käytettävä polypeptidin tehokas määrä riippuu muun muassa rokotettavan eläimen lajista, tämän eläimen ruumiinpainosta sekä valitusta rokotustavasta, kuten hyvin tunnetaan. Rokotteet valmistetaan tyypillisesti kuivatusta kiinteästä polypepti-distä tai polypeptidejä sisältävästä polymeeristä suspendoimalla tätä polypeptidiä tai polypeptidejä sisältävää polymeeriä veteen, 50 84558 suolaliuokseen tai apuaineeseen, tai kytkemällä tämä polypeptidi ensin kantajaan ja suspendoimalla tätä kantajaan kytkettyä po-lypeptidiä (konjugaattia) samanlaiseen fysiologisesti siedettävään laimentimeen, esimerkiksi apuaineeseen, kuten edellä esitetään .

Nämä siirrosteet sisältävät polypeptidiä tyypillisesti pitoisuutena noin 20 mikrogrammasta noin 500 milligrammaan siirrostean-nosta kohden. Mainitut polypeptidimäärät tarkoittavat polypepti-din painoa ilman kantajan painoa, mikäli kantajaa käytetään.

Nämä rokotteet sisältävät samoin fysiologisesti siedettävää (hyväksyttävää) laimenninta, kuten vettä, fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta tai suolaliuosta, ja lisäksi ne sisältävät tyypillisesti apuainetta. Apuaineet, kuten täydellinen Freund'in apuaine (CFA), epätäydellinen Freund'in apuaine (IFA) ja aluma ovat alalla hyvin tunnettuja materiaaleja, ja niitä on kaupallisesti saatavana lukuisista eri lähteistä.

Rokotteen varastoliuokset valmistettiin CFA:ta, IFA:ta tai alumaa käyttäen seuraavasti: sellainen määrä synteettistä polypeptidiä, polypeptideistä muodostunutta polymeeriä tai konjugaattia, jolla määrällä siirrosteeseen saadaan toivottu määrä polypeptidiä, liuotettiin fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS), pH-arvo 7,2. Sitten tähän polypeptidiä sisältävään liuokseen sekoitettiin yhtä suuri tilavuus CFA:ta, IFA:ta tai alumaa, jolloin saatiin polypeptidiä, vettä ja apuainetta sisältävä rokote, jossa veden ja öljyn välinen suhde oli noin 1:1. Tämän jälkeen tämä seos homogenoitiin, jolloin saatiin rokotteen varas-toliuos.

Kaniineihin injektoitiin ihon alaisesti ja vatsaontelon sisäisesti edellä kuvatulla tavalla rokotetta, joka sisälsi 200-400 mikrogrammaa polypeptidin konjugaattia, josta oli muodostettu emulsio täydelliseen Freund'in apuaineeseen (CFA), epätäydelliseen Freund'in apuaineeseen (IFA) tai alumaan (kussakin tapauksessa li 5i ö 4 b b Ö 5 milligrammaa millilitraa kohden), 0:tena, 14:tenä ja 21jtenä vuorokautena, vastaavasti. Kukin rokotus (immunointi) käsitti neljä injektiota tällä rokotteella. Hiiret immunoitiin samalla tavalla, käyttäen kuitenkin injektiota kohden yhtä kymmenesosaa edellä mainituista annoksista.

Eläimistä otettiin veri talteen 7 ja 14 vuorokauden kuluttua viimeisestä injektoinnista. Joissakin tapauksissa eläimille annettiin lisäinjektointeja alumassa, ja niistä otettiin verta tämän jälkeen tarvittaessa. Vertailuna toimivaa, immunointia edeltävää seerumia saatiin kustakin eläimestä ottamalla verta talteen juuri ennen ensimmäistä immunointia.

Rokotteen varastoliuoksia voidaan myös valmistaa käyttämällä keyhole limpet-etanan hemosyaniinia (KLH), KLH:ta epätäydellisessä Freund'in apuaineessa (IFA), KLH:ta absorboituna alumaan, KLH:ta ja alumaan absorboitua hinkuyskän toksiinia (pertussis) edestii-niä, tyroglobuliinia, tetanustoksoidia, tetanustoksoidia IFA:ssa, koleratoksoidia sekä koleratoksoidia IFA:ssa.

Kun tätä antigeeniä tai rokotetta injektoitiin isäntään tai annettiin isännälle muulla tavalla, niin isännän immuunijärjestelmä reagoi tuottamalla suuria määriä tätä antigeeniä vastustavaa vasta-ainetta. Koska valmistetun antigeenin, eli synteettisestä polypeptidistä ja kantajasta muodostuvan antigeenin spesifinen antigeenisyyden determinantti vastaa immunologisesti olennaisesti mielenkiinnon kohteena olevan luonnollisen antigeenin determinanttia, niin isännästä tulee immuuni tälle luonnolliselle antigeenille. Tapauksissa, joissa tätä keksintöä sovelletaan rokotteeseen, tämä on toivottu tulos.

VII. Viivästyvä vliherkkyystyyppi (Ihoreaktion koe)

Edellä kuvatut diagnostiset järjestelmät ja kokeet perustuvat in vitro kokeisiin. Vaikka näiden kokeiden tiettyjä vaiheita voidaankin toteuttaa in vivo, niin varsinainen immuunireaktio 52 84558 mitataan kuitenkin kudosviljelmästä. Kuitenkin tätä keksintöä voidaan soveltaa myös sellaisiin diagnostisiin järjestelmiin, joissa T-solujen reaktiot mitataan in vivo. Eräänä esimerkkinä tällaisesta järjestelmästä mainittakoon viivästyvän yliherkkyys-tyypin reaktio (DTH), joka yleisemmin tunnetaan ihoreaktion kokeena.

DTH-reaktio voi esiintyä ainoastaan sellaisessa yksilössä, joka on aikaisemmin altistettu (herkistetty) tietylle antigeenille. Yksilön ensimmäinen altistaminen antigeenille ei saa aikaan minkäänlaisia näkyviä muutoksia, mutta tämän yksilön immuunitila muuttuu siten, että tuloksena on yliherkkyys tälle antigeenille uudestaan altistettaesa. Täten, kun tätä antigeeniä injektoidaan ihon sisäisesti tai ihon alaisesti (mieluiten puskuroidussa suolaliuoksessa), niin injektiokohtaan kehittyy tunnusomainen ihovaurio , joka ihovaurio ei kehity tälle antigeenille ensimmäisen kerran altistettaessa. Koska toisen (hyökkäävän) antigeeni-rokotuksen aiheuttama reaktio viivästyy tyypillisesti 24-48 tuntia, niin tätä reaktiota kutsutaan viivästyväksi yliherkkyys-tyypiksi.

Ihmisissä altistuminen herkistävälle antigeenille tapahtuu siten, että ihminen joutuu kosketuksiin tautia aiheuttavan mikro-organismin kanssa (esimerkiksi Mycobacterium tuberculosis-bakteeris-ta peräisin oleva tuberkuliini, Salmonella typhi-bakteerista peräisin oleva tyfoidiini ja Brucella abortus-organismista peräisin oleva abortiini) ja tämä herkistyminen tapahtuu kroonisen infektion seurauksena. Eläimissä tämä herkistyminen voidaan saavuttaa rokottamalla veteen, suolaliuokseen tai apuaineeseen emul-goitua antigeeniä.

Sekä ihmisissä että eläimissä yliherkkyys testataan in vivo injektoimalla niihin fysiologisesti siedettävään laimentimeen, kuten suolaliuokseen liuotettua antigeeniä ihon sisään (joko ihon sisäisesti tai ihon alaisesti). Tavallisesti DTH on herkempi diagnostinen koe kuin tämän antigeenin tuottaman vasta-aineen

II

53 84558 määrän määrittäminen tai mittaaminen. Esimerkiksi, ainoastaan erittäin vähäisiä määriä proteiinia (parisataa mikrogrammaa) tarvitaan hiiren herkistämiseksi DTH-reaktiota varten, kun taas vasta-aineiden tuotannon indusoimiseen tarvitaan paljon suurempi määrä.

Koska tämän keksinnön mukaiset polypeptidit (erityisesti poly-peptidit 1, 5, 5a, 6 ja 7) stimuloivat ihmisessä ja hiiressä T-solujen lisääntymistä aktiivisella HBsAgrllä tai polypeptideillä 49, 49a, 72 ja 72a toteutetun immunoinnin (herkistämisen) jälkeen, niin sellainen ihoreaktion koe kehitettiin, jossa kokeessa hyökkäävänä antigeeninä käytetään yhtä tai useampaa ohessa kuvattua synteettistä polypeptidiä.

Valitut hiirikannat immunoitiin apuaineeseen, kuten täydelliseen Freund'in apuaineeseen (CFA) emulgoidulla luonnollisella HBsAg:llä siten, että antigeeni injektoitiin ihon sisäisesti eläinten kylkeen. DTH-herkistyminen tapahtuu koetilanteissa ainoastaan silloin, kun herkistävä antigeeni annetaan apuaineessa, mieluiten täydellisessä apuaineessa, joka sisältää tuberkuloosibakteereita.

Kun immunoinnista on kulunut seitsemän vuorokautta, hiiret altistetaan toistamiseen tälle antigeenille korvaan tai käpälään toteutetuilla ihon sisäisillä rokotuksilla, käyttäen ennalta määrättyä antigeenimäärää, joka sisältää (a) luonnollista HBsAgrtä tai (b) yhtä tai useampaa oheisista synteettisistä polypepti-deistä, sekoitettuna tunnettuun määrään fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS). Vertailuhiiriin injektoidaan ihon sisäisesti sama määrä PBSria, joka ei sisällä antigeeniä. Muina vertailuina käytettiin hiiriä, jotka immunoitiin ainoastaan CFA:11a.

DTH-reaktion osoituksena on kudoksen turpoaminen siinä kohdassa, josta antigeeniä injektoitiin, verrattuna vertailueläimien vastaaviin kohtiin. Täten korvien ja käpälien paksuudet mitataan ennen toista altistamista tälle antigeenille sekä 4, 24 ja 48 tunnin kuluttua tästä altistamisesta.

54 84 558 Nämä tulokset osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset synteettiset polypeptidit (esimerkiksi P71) voivat olla käyttökelpoisia hiiren diagnostisessa in vivo-järjestelmässä, jolla HBsAgrn aiheuttama soluvälitteinen immuunireaktion läsnäolo voidaan todeta.

Sen jälkeen kun edellä kuvattujen polypeptidien turvallisuus ja tehokkuus on osoitettu eläinkokeissa, niin näitä polypeptidejä voidaan käyttää hyökkäävinä antigeeneinä ihmisen ihoreaktion kokeessa HBsAg-rokotteita saaneiden henkilöiden tapauksessa.

Nämä polypeptidit syntetoidaan edellä kuvatusti, ne puhdistetaan korkeapaineisen nestekromatografiän (HPLC) menetelmillä, steriloidaan ja testataan niiden pyrogeenisten ominaisuuksien selvittämiseksi.

Koska T-solujen lisääntymistä aiheuttavat reaktiot HBsAg-rokotet-ta saaneissa henkilöissä voivat vaihdella sangen paljon polypeptidin spesifisyyden suhteen, niin rokotetta saaneet henkilöt sekä vertailuna toimivat rokottamattomat yksilöt altistetaan toistamiseen polypeptidien sarjalla. Kineettiset ominaisuudet sekä antigeenin optimiannos voidaan määrittää rokotetta saaneiden henkilöiden ryhmästä käyttäen eläinkokeissa saatuja tuloksia suuntaviivana.

Akuutista tai kroonisesta HBV-infektiosta kärsivistä yksilöistä voidaan myös selvittää HBsAg-spesifinen T-solujen herkistyminen siten, että synteettisiä polypeptidejä käytetään antigeeneinä ihoreaktion kokeessa.

Kussakin tapauksessa hyökkäävää antigeeniä annetaan injektoimalla ihon sisäisesti kyseistä polypeptidiä fysiologisesti hyväksyttävässä liuoksessa (noin 1 millilitra) käsivarren sisäpinnalle. Kokoluokan 25 tai 27 neulaa käyttämällä antigeeniä saadaan annetuksi ihon sisäisesti eikä ihon alaisesti. Ihon alainen injektoiminen saattaa johtaa antigeenin laimenemiseen kudoksissa, mikä saattaa tuottaa paikkaansa pitämättömän negatiivisen

II

55 84558 koetuloksen. Tämän jälkeen, 4, 24 ja 48 tunnin kuluttua tästä toisesta altistamisesta injektiokohtia tarkastellaan mahdollisen punoituksen (erythema) ja ihon kovettumisen (induraatio) tai turpoamisen toteamiseksi.

Edellä esitetyn on tarkoitus havainnollistaa tätä keksintöä, mutta ei rajoittaa sitä. Sitä voidaan muuntaa usealla eri tavalla, kuitenkaan poikkeamatta tässä keksinnössä aikaansaatujen uusien sovellutusten hengestä tai tavoitteista. Huomattakoon, ettei keksinnössä pyritä rajoittumaan ohessa esitettyihin erityisiin valmisteisiin ja sovellutuksiin.

Claims (4)

56 84558

1. Menetelmä hepatitis B-viruksen aiheuttamaa infektiota vastaan vaikuttavan rokotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) aikaansaadaan toistuva polypeptidiyksikkö, jossa on vähintään yksi sellainen synteettinen polypeptidi, jonka aminohappojäännösten järjestys valitaan seuraavista, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karbok-sipäähän: SerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGlnAsn; ValCysLeuGlyGlnAsn; CysLeuGlyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHis SerProThrSerCysProProThrCysProGlyTyr ArgTrpMetCysLeuArgArgPhelle; LeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeu; sekä ThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSer; ja vähintään yksi sellainen synteettinen polypepti, jonka aminohappojäännösten järjestys valitaan seuraavista, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä kar-boksipäähän: PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArgThrCys MetThrThrAlaGlnGlyThrSerMetTyrProSerCys; MetThrThrAlaGlnGlyThrSerMetTyrProSerCys; IleProGlySerThrThrThrSerThrGlyProCysLysThrCys ThrThrProAlaGlnGlyAsnSerMetPheProSerCys; ThrThrProAlaGlnGlyAsnSerMetPheProSerCys; j a CysProLeuIleProGlySerThrThrThrSerThrGlyPro CysLysThrCysThrThrProAlaGlnGlyAsnSerMet PheProSerCys; sekä b) liuotetaan tai dispergoidaan mainitun toistuvan poly-peptidiyksikön tehokas määrä fysiologisesti siedettävään laimentimeen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen a) ja vaiheen b) välissä olevan vaiheen, jossa mainitut polypeptidit kytketään kantajaan konjugaatin muodostamiseksi. 84558

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi: a) aikaansaadaan synteettinen multimeeri, jossa on useita mainittuja toistuvia polypeptidiyksiköitä, jolloin on läsnä vähintään kaksi Cys-jäännöstä, ja mainittu synteettinen multimeeri käsittää vähintään yhden molekyylin sisäisen kysteiinin disulfidisidoksen, joka on muodostunut vähintään kahdesta läsnäolevasta Cys-jäännöksestä; ja b) liuotetaan tai dispergoidaan tämän synteettisen multi-meerin tehokas määrä fysiologisesti siedettävään laimenti-meen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen a) ja vaiheen b) välissä olevan vaiheen, jossa mainittu synteettinen multimeeri kytketään kantajaan konjugaatin muodostamiseksi.