ES2637812T3 - Inmunoterapia dirigida a patógenos intracelulares - Google Patents

Abstract

Un péptido inmunogénico que comprende (i) un epítopo de célula T restringido a MHC de clase II de un antígeno de un virus y (ii) un motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST], en el que dicho motivo está inmediatamente adyacente a dicho epítopo o está separado de dicho epítopo de célula T por un conector de como mucho 7 aminoácidos, y en el que la secuencia de aminoácidos de dicho antígeno no comprende una secuencia de motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST] dentro de una secuencia de 11 aminoácidos en el N o C terminal de dicho epítopo en dicho antígeno, para su uso en la prevención o en el tratamiento de una infección viral por dicho virus.

Description

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DESCRIPCION

Inmunoterapia dirigida a patogenos intracelulares Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a peptidos inmunogenicos y a su uso en la prevencion y/o el tratamiento de infecciones con patogenos intracelulares.

Antecedentes de la invencion

Numerosas enfermedades infecciosas se deben a microorganismos con un ciclo de vida esencialmente intracelular. Son ejemplos las enfermedades virales tales como la gripe, infecciones por Mycobacterium tales como la tuberculosis, infecciones bacterianas tales como Mycoplasma y enfermedades parasitarias tales como la Leishmania y la malaria. Los procedimientos de vacunacion actuales destinados a patogenos intracelulares, cuando estan disponibles, generan principalmente celulas T CD4+ que son eficaces ayudando a las celulas B a producir anticuerpos espedficos, pero no producen, o producen muy poca, actividad citolftica. Por lo tanto, la eficacia de la vacuna se mantiene limitada.

Debido a su localizacion intracelular, estos microorganismos solo se ven afectados marginalmente por la inmunidad humoral y anticuerpos espedficos. Una defensa eficaz frente a las infecciones intracelulares depende de la generacion de la inmunidad celular, es decir, de que las celulas reconozcan a las celulas infectadas en virtud de la presentacion de los antfgenos derivados del microorganismo en el contexto de los antfgenos del MHC de clase I y de clase II. Despues del reconocimiento, las celulas inmunocompetentes se activan y destruyen celulas infectadas usando diversos mecanismos que incluyen la exocitosis de enzimas citolfticas y la induccion de IFN-gamma de la oxido mtrico sintasa (NOS). El IFN-gamma activa la formacion de productos intermedios de oxfgeno reactivo y de nitrogeno reactivo, e induce la transcripcion de la indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) con la posterior privacion del triptofano. La privacion del triptofano puede afectar severamente a la supervivencia intracelular de los patogenos bacterianos tales como Chlamydiae. En las infecciones con Candida, la morfologfa fungica y la sensibilidad a los agentes antifungicos esta profundamente afectada por las concentraciones de triptofano intracelular (Bozza et al. (2005) J. Immunol. 174:2910-2918).

Los productos intermedios de oxfgeno reactivo se generan mediante la activacion de la NADPH oxidasa producida por productos bacterianos e IFN-gamma o IL-8. Esta activacion produce la formacion de superoxido (O2"), que se convierte en H2O2 y anion hidroxilo (OH-). Tras la activacion de la mieloperoxidasa, se forman acido hipocloroso (HClO) y cloramina. Todos estos productos intermedios tienen fuertes actividades antimicrobianas y tumoricidas.

La oxido mtrico sintasa inducible (iNOS), cuando se induce por el IFN-gamma o el TNF-alfa genera radicales NO, que pueden convertirse en peroxinitrilo (ONOO-) o en nitrotioles. Los radicales NO ejercen potentes efectos microbicidas. La iNOS esta bajo control transcripcional por factores tales como NFk-B y el complejo Jak/STAT. El NO influye directa o indirectamente en el ciclo de vida de los virus, de las bacterias y de los parasitos. De esta manera, por ejemplo, la S-nitrosilacion de la cistema proteasa 3C del virus Coxsackie interrumpe el ciclo de vida viral (Saura et al. (1999) Immunity 10:21-28). La produccion de O2" por Helicobacter pylori da lugar a peroxinitrilo microbicida por la interaccion con el NO del huesped (Nagata et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:14071-14073). A la inversa, la ausencia de enzima participando en la elaboracion de productos intermedios reactivos, tal como por el defecto en la mieloperoxidasa, da lugar al desarrollo de infecciones fungicas cronicas, tales como Candida albicans (Nguyen y Katner (1997) Clin. Infect. Dis. 24:258-260).

Las rutas anteriores convergen hacia la eliminacion de patogenos tanto extracelulares como intracelulares y se desencadenan por el IFN-gamma. Una fuente de IFN-gamma que proporciona altas concentraciones en los sitios de la infeccion por lo tanto proporciona un posible beneficio en la eliminacion de tales patogenos. Una estrategia mas optima para luchar contra los patogenos intracelulares podna ser combinar mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos con la inmunidad espedfica adaptativa. Un ejemplo podna ser disenar un sistema por el que se envianan altas concentraciones de IFN-gamma de forma precisa en los sitios de la infeccion, de tal manera que se eviten los efectos secundarios sistemicos de las citocinas pro-inflamatorias.

El documento WO2008/017517 se presento el 13.08.2017 y se publico el 14.02.2008. Este documento desvela peptidos que comprenden un epftopo de una celula T de un antfgeno (tales como alergenos y autoantfgenos) y un motivo redox, y el uso de estos peptidos como un medicamento, para por ejemplo alergias y enfermedades autoinmunitarias. El documento WO2009/100505 se presento el 14.02.2008 y se publico el 20.08.2009 sin reivindicar prioridad. Este documento desvela peptidos que comprenden un epftopo de una celula T de una protema aloantigenica de un aloinjerto y un motivo redox, y el uso de estos peptidos previniendo el rechazo del trasplante.

Los documentos WO2009/101204, WO2009/101205, WO2009/101206 y WO 2009/101207 se presentan el 16.02.2009 y se publican el 20.08.2009 y reivindican una fecha de prioridad del 14.02.2008. Los tres primeros documentos desvelan peptidos que comprenden un epftopo de una celula T de un antfgeno (respectivamente protemas de vector viral, antfgenos asociados a tumores y alofactores solubles) y un motivo redox, y su uso como un medicamento. El documento WO 2009/101207 proporciona metodos para identificar celulas T citotoxicas espedficas

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de antigeno.

De La Cruz et al. (1989) J. Immunol. 142, 3568-3575 y el documento US4886782 desvelan peptidos de antigenos de la malaria que comprenden un epftopo de una celula T y una secuencia de un motivo redox.

El documento US2003152581 desvela un peptido de fusion con un epftopo de una celula T de la toxina tetanica y un epftopo de una celula B del alergeno Der p1.

Tindle et al. (1991) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 88, 5887-5891 desvelan peptidos de antigenos del virus del papiloma humano que comprenden un epftopo de una celula T y un motivo redox. Los autores indican que la protema E7 merece consideracion como antigeno candidato para una posible vacuna frente a VPH.

Voo et al. (2005) Cancer Res. 65, 1577-1586 desvelan peptidos con epftopos de celula T de un antfgeno nuclear del virus de Epstein Barr, algunos de los cuales comprenden una secuencia de motivo redox. Estan los peptidos sin motivo redox que se usan para preparar celulas cooperadoras CD4 y celulas reguladoras.

Okubo et al. (2004) J. Obst. Gyn. Res. 30, 120-129 desvelan peptidos del antigeno E7 del VPH que se anaden a CMSP. Las celulas que se han generado no se han sometido a prueba para determinar la toxicidad frente a celulas que presentan antigeno. Hohn et al. (1999) J. Immunol. 163, 5715-5722 desvelan peptidos del VPH que se anaden a celulas B autologas, seguido por incubacion con linfocitos que infiltran tumores.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de peptidos inmunogenicos aislados para prevenir o para tratar un sujeto que padece una infeccion con un virus y para inducir en dicho sujeto celulas T reguladoras CD4+ que estimulen los mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos en las celulas del sujeto infectadas con el virus.

La presente invencion se refiere en un aspecto al uso de al menos un peptido inmunogenico aislado que comprende (i) un epftopo de celula T restringido a MHC de clase II de un antfgeno de un virus y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o esta separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos, y en el que la secuencia de aminoacidos de dicho antfgeno no comprende una secuencia de motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST] dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal de dicho epftopo en dicho antigeno, para la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar, en un sujeto, la infeccion por dicho virus.

Estos peptidos inducen en un sujeto celulas T reguladoras CD4+ que estimulan mecanismos microbiocidas intracelulares no espedficos en celulas de dicho sujeto infectado con dicho virus.

De manera general, la invencion proporciona peptidos inmunogenicos que comprenden (i) un epftopo de celula T restringido a MHC de clase II de antfgeno de un virus y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o esta separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos, y en el que la secuencia de aminoacidos de dicho antfgeno no comprende una secuencia de motivo [CST]-(X)2-C o C-X(2)-[CST] dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal de dicho epftopo en dicho antfgeno, para su uso en la prevencion o el tratamiento de un sujeto que padece infeccion con virus.

En particular dicho motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C se posiciona en el N terminal en el epftopo de la celula T. Aun mas en particular, al menos una X en dicho motivo [CST]-(X)2-[CST] es Gly, Ala, Ser o Thr. Adicionalmente o como alternativa al menos una X es His o Pro. En realizaciones particulares al menos una C en dicho motivo C-(X)2- [CST] o [CST]-(X)2-C esta metilada.

En realizaciones particulares del peptido inmunogenico para usar en las aplicaciones anteriores, dicho peptido inmunogenico comprende ademas una secuencia de direccionamiento endosomico. Cualquiera de los peptidos inmunogenicos anteriores puede producirse mediante smtesis qrnmica o mediante expresion recombinante.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a metodos para obtener una poblacion de celulas T reguladoras espedficas de antfgeno viral con propiedades citotoxicas, comprendiendo dichos metodos las etapas de:

- proporcionar celulas de sangre periferica;

- poner en contacto dichas celulas con un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de una celula T derivado de un antfgeno viral y (ii) un motivo C-(X)2-[CS] o [CST]-(X)2-C en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o esta separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos; y

- expandir dichas celulas en presencia de IL-2.

Se desvelan metodos para obtener una poblacion de celulas T CD4+ espedficas de antfgeno viral con propiedades citotoxicas, y tales metodos comprenden las etapas de:

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- proporcionar un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de celula T de un antigeno viral y (ii) un motivo C-(X)2-[CS] o [CST]-(X)2-C;

- administrar dicho peptido inmunogenico a un sujeto; y

- obtener dicha poblacion de celulas T reguladoras espedficas de antigeno viral de dicho sujeto.

Las poblaciones de celulas T CD4+ citotoxicas contra un antigeno viral obtenibles por los metodos anteriores tambien son parte de la invencion, as^ como su uso para la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar, en un sujeto, una infeccion con dicho virus.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a peptidos inmunogenicos aislados que comprenden un epftopo de una celula T de un antfgeno viral y, adyacente a dicho epftopo de una celula T o separado de dicho epftopo de una celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos, un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o esta separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos, y en el que la secuencia de aminoacidos de dicho antfgeno no comprende una secuencia de motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST] dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal de dicho epftopo en dicho antigeno.

En realizaciones espedficas de estos peptidos el epftopo y la secuencia de motivo redox estan separados como mucho por 7, o como mucho por 4 aminoacidos.

En realizaciones espedficas, estos peptidos tienen una longitud de entre 12 y 50, mas espedficamente tienen una longitud de entre 12 y 30 aminoacidos.

En realizaciones espedficas, el motivo redox en estos peptidos es CxxC.

En realizaciones espedficas, el epftopo es un epftopo de celula T del MHC de clase II.

Leyenda de la figura

La Figura 1 muestra especies reactivas de oxfgeno producidas por las celulas dendrfticas despues de la administracion de celulas T incubadas con epftopos de celulas T naturales y modificadas. Las barras en esta Figura ilustran el cambio en la produccion intracelular de especies reactivas de oxfgeno (ROI) de las celulas dendrfticas incubadas en diferentes condiciones y evaluadas por analisis Facs de oxidacion CDFDA (“IFM delta” = IFM = intensidad de fluorescencia media).

- CD + T (ts-pep): celulas dendrfticas incubadas con celulas T expandidos con epftopo de celula T natural (tipo silvestre, ts) [SEC ID N°: 1] derivado de adenovirus;

- CD + T (cc-pep): celulas dendrfticas incubadas con celulas T expandidos con epftopo de celula T derivado de adenovirus, en las que dicho epftopo de celula T se modifica anclando los aminoacidos CHGC al N-terminal del epftopo [SEC ID N°: 2];

- CD (ts-pep) + T (ts-pep): celulas dendrfticas incubadas con epftopo natural de celula T [SEC ID N°: 1] derivado de adenovirus y con celulas T expandidos con epftopo de celula T natural [SEC ID N°: 1].

- CD (ts-pep) + T (cc-pep): celulas dendrfticas incubadas con epftopo natural de celula T [SEC ID N°: 1] derivado de adenovirus y con celulas T expandidos con epftopo de celula T modificado [SEC ID N°: 2], (modificacion como en “DC+T (cc-pep)”);

Vease el Ejemplo 1 para los detalles de los epftopos de celulas T.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

El termino “peptido” cuando se usa en el presente documento se refiere a una molecula que comprende una secuencia de aminoacidos de entre 2 y 200 aminoacidos, conectados por enlaces peptfdicos, pero que pueden en una realizacion particular comprender estructuras no aminoaddicas (como por ejemplo un compuesto de union organico). Los peptidos de acuerdo con la invencion pueden contener cualquiera de los 20 aminoacidos convencionales o versiones modificadas de los mismos, o pueden contener aminoacidos no de origen natural incorporados por smtesis qrnmica de peptidos o por modificacion qrnmica o enzimatica.

El termino “epftopo” cuando se usa en el presente documento se refiere a una o varias partes (que pueden definir un epftopo conformacional) de una protema o un factor que es/son espedficamente reconocidos y unidos por un anticuerpo o una parte del mismo (Fab', Fab2', etc.) o un receptor presentado en la superficie celular de una celula B o T, y que es capaz, por dicha union, de inducir una respuesta inmunitaria.

El termino “antfgeno” cuando se usa en el presente documento se refiere a una estructura de una macromolecula

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que comprende uno o mas hapteno o haptenos (que provocan una respuesta inmunitaria solamente cuando se unen a un vehmulo) y/o que comprenden uno o mas epftopos de celulas T. Normalmente, dicha macromolecula es una protema o un peptido (con o sin polisacaridos) o esta hecho de una composicion proteica y comprende uno o mas epftopos; dicha macromolecula puede denominarse como alternativa en el presente documento “protema antigenica” o “peptido antigenico”.

El termino “epftopo de celula T” o “epftopo-celula T” en el contexto de la presente invencion se refiere a un epftopo de celula T dominante, subdominante o inferior, es decir, una parte de una protema o un factor antigenico que se reconoce espedficamente y que se une por un receptor en la superficie celular de una celula T. Si un epftopo es dominante, sub-dominante o menor depende de la reaccion inmunitaria provocada frente al epftopo. La dominancia depende de la frecuencia a la que tales epftopos se reconocen por las celulas T y son capaces de activarlos, entre todos los posibles epftopos de celula T de una protema. En particular, un epftopo de celula T es un epftopo unido por las moleculas del CMH de clase I o del CMH de clase II.

El termino “CMH” se refiere a “antigeno mayor de histocompatibilidad”. En seres humanos, los genes del CMH se conocen como genes HLA (“antigeno leucocitario humano”). Aunque no hay una convencion seguida consistentemente, algunas referencias bibliograficas usan HLA para referirse a las moleculas de protemas de HLA, y CMH para referirse a los genes que codifican las protemas de HLA. Como tal los terminos “CMH” y “HLA” son equivalentes cuando se usan en el presente documento. El sistema HLA en el hombre tiene su equivalente en el raton, es decir, el sistema H2. Los genes de HLA mas intensamente estudiados son los nueve denominados genes clasicos del CMH: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1. En humanos, el CMH esta dividido en tres regiones: Clase I, II y III. Los genes A, B y C pertenecen al CMH de clase I, mientras que los seis genes D pertenecen a la clase II. Las moleculas del CMH de clase I estan hechas de una unica cadena polimorfica que contiene 3 dominios (alfa 1, 2 y 3), que se asocia con la beta 2 microglobulina en la superficie celular. Las moleculas de clase II estan hechas de 2 cadenas polimorficas, conteniendo cada una 2 cadenas (alfa 1 y 2 y beta 1 y 2).

Las moleculas del CMH de clase I se expresan virtualmente en todas las celulas nucleadas. Los fragmentos peptfdicos presentados en el contexto de las moleculas del CMH de clase I se reconocen por las celulas T CD8+ (celulas T citotoxicas o CTL). Las celulas T CD8+ frecuentemente maduran en efectores citotoxicos que pueden lisar las celulas que llevan el antfgeno estimulante. Las moleculas del CMH de clase II se expresan principalmente en linfocitos activados y en celulas presentadoras de antfgeno. Las celulas T CD4+ (celulas T ayudantes o HTL) se activan con el reconocimiento de un unico fragmento peptfdico presentado por una molecula del CMH de clase II, normalmente encontrado en una celula presentadora de antfgeno como un macrofago o una celula dendrftica. Las celulas T CD4+ proliferan y secretan citocinas que apoyan una respuesta mediada por anticuerpos a traves de la produccion de IL-4 o IL-10 o bien apoyan una respuesta mediada por celulas a traves de la produccion de IL-2 e IFN-gamma.

Los HLA funcionales se caracterizan por una hendidura de union profunda a la que se unen los peptidos endogenos asf como extranos potencialmente antigenicos. La hendidura se caracteriza adicionalmente por una forma y unas propiedades ffsico-qmmicas bien definidas. Los sitios de union del HLA de clase I estan cerrados, donde los extremos de los peptidos estan inmovilizados en los extremos de la hendidura. Tambien estan envueltos en una red de enlaces de hidrogeno con restos de HLA conservados. En vista de estas restricciones, la longitud de los peptidos unidos se limita a 8-10 restos. Sin embargo, se ha demostrado que los peptidos de hasta 12 restos de aminoacidos tambien son capaces de unirse al HLA de clase I. La superposicion de las estructuras de diferentes complejos de HLA confirma un modo general de union en el que los peptidos adoptan una conformacion relativamente lineal, extendida.

Por el contrario a los sitios de union del HLA de clase I, los sitios de la clase II estan abiertos por ambos extremos. Esto permite a los peptidos extenderse desde la region de union real, de esta manera “colgando” de ambos extremos. Los HLA de clase II pueden por lo tanto unir ligandos peptfdicos de longitud variable, que vana de 9 a mas de 25 restos de aminoacidos. Similar al HLA de clase I, la afinidad de un ligando de clase II se determina por un componente “constante” y uno “variable”. La parte constante de nuevo resulta de una red de enlaces de hidrogeno formados entre restos conservados en la hendidura del HLA de clase II y la cadena principal de un peptido de union. Sin embargo, este patron de enlaces de hidrogeno no esta confinado a los restos N- y C-terminales del peptido sino que se distribuye a lo largo de la cadena entera. Lo ultimo es importante porque restringe la conformacion de los peptidos que forman complejos en un modo de union estrictamente lineal. Esto es comun para todos los alotipos de clase II. El segundo componente que determina la afinidad de union de un peptido es variable debido a ciertas posiciones de polimorfismo dentro de los sitios de union de clase II. Diferentes alotipos forman diferentes bolsillos complementarios dentro de la hendidura, de esta manera contando para la seleccion dependiente de subtipos de los peptidos, o la especificidad. De manera importante, las restricciones en los restos de aminoacidos retenidos dentro de los bolsillos de clase II son en general mas “suaves” que las de la clase I. Hay mucha mas reactividad cruzada de los peptidos entre diferentes alotipos del HLA de clase II. La secuencia de los +/- 9 aminoacidos de un epftopo de celula T del CMH de clase II que se ajustan a la hendidura de la molecula de CMH II se numeran normalmente de P1 a P9. Los aminoacidos N-terminales adicionales del epftopo se numeran P-1, P-2 y asf sucesivamente, los aminoacidos C-terminales del epftopo se numeran P+1, P+2 y asf sucesivamente.

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La frase “compuesto organico que tiene una actividad reductora” cuando se usa en el presente documento se refiere a compuestos, mas en particular a secuencias de aminoacidos, capaces de reducir enlaces disulfuro en las protemas. Una frase como alternativa usada para estas secuencias de aminoacidos es “motivo redox”.

La frase “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad del peptido de la invencion o un derivado del mismo, que produce el efecto terapeutico o preventivo deseado en un paciente. Por ejemplo, con referencia a una enfermedad o un trastorno, es la cantidad que reduce en algun grado uno o mas smtomas de la enfermedad o trastorno y mas particularmente devuelve a la normalidad, parcial o completamente, los parametros fisiologicos o bioqmmicos asociados con o causantes de la enfermedad o el trastorno. De acuerdo con una realizacion particular de la presente invencion, la cantidad terapeuticamente eficaz es la cantidad el peptido de la invencion o el derivado del mismo, que dara lugar a una mejora o una restauracion de la situacion fisiologica normal. Por ejemplo, cuando se usa para tratar terapeuticamente a un mairnfero afectado por un trastorno inmunitario, es una cantidad diaria de peptido/kg de peso corporal de dicho mamffero. De manera alternativa, donde la administracion es a traves de terapia genica, la cantidad de ADN desnudo o de vectores virales se ajusta para asegurar la produccion local de la dosis relevante del peptido de la invencion, del derivado o del homologo del mismo.

El termino “natural” cuando se usa en el presente documento se refiere a una secuencia con respecto al hecho de que la secuencia es identica a una secuencia de origen natural o es identica a parte de tal secuencia de origen natural. Por el contrario a ello el termino “artificial” se refiere a una secuencia que no se da en la naturaleza. Salvo que se especifique de otra manera, los terminos natural y artificial refiriendose a una secuencia de esta manera se refieren exclusivamente a una secuencia de aminoacidos (o nucleotidos) particular (por ejemplo la secuencia del peptido inmunogenico, una secuencia que comprende dentro del peptido inmunogenico una secuencia de epftopo) y no se refiere a la naturaleza del peptido inmunogenico como tal. Opcionalmente, una secuencia artificial se obtiene de una secuencia natural por modificaciones limitadas tales como cambiar uno o mas aminoacidos dentro de la secuencia de origen natural o anadiendo aminoacidos en el N o C terminal a una secuencia de origen natural. Los aminoacidos se denominan en el presente documento con su nombre completo, su abreviacion de tres letras o su abreviacion de una letra. Los motivos de las secuencias de aminoacidos se escriben en el presente documento de acuerdo con el formato de Prosite (Hula et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34 (numero de base de datos D227-D230). El sfmbolo X se usa para una posicion donde se acepta cualquier aminoacido. Las alternativas se indican listando los aminoacidos aceptables para una posicion dada, entre corchetes ('[ ]'). Por ejemplo: [CTS] significa un aminoacido seleccionado de Cys, Ser o Thr. Los aminoacidos que se excluyen como alternativas se indican listandolos entre llaves ('{ }'). Por ejemplo: {AM} significa cualquier aminoacido excepto Ala y Met. Los diferentes elementos en un motivo se separan entre sf por un guion -. La repeticion de un elemento identico en un motivo puede indicarse colocando detras de ese elemento un valor numerico o un intervalo numerico entre parentesis. Por ejemplo: X(2) corresponde a X-X, X(2, 4) corresponde a X-X o X-X-X o X-X-X-X, A(3) corresponde a A-A-A.

El termino “homologo” cuando se usa en el presente documento con referencia a los epftopos usados en el contexto de la invencion, se refiere a moleculas que tienen al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de la secuencia de aminoacidos con el epftopo de origen natural, de esta manera manteniendo la capacidad del epftopo de unirse a un anticuerpo o a un receptor de la superficie celular de una celula B y/o T. Las realizaciones particulares de los homologos de un epftopo corresponden al epftopo natural modificado a lo sumo en tres, mas particularmente a lo sumo en dos, mas particularmente en un aminoacido.

El termino “derivado” cuando se usa en el presente documento con referencia a los peptidos de la invencion se refiere a moleculas que contienen al menos la parte activa del peptido (es decir capaz de producir actividad citolftica de las celulas T CD4+) y, ademas de ello comprende una parte complementaria que puede tener diferentes fines tales como establecer los peptidos o alterar las propiedades farmacocineticas o farmacodinamicas del peptido.

La frase “identidad de secuencia” de dos secuencias cuando se usa en el presente documento se refiere al numero de posiciones con nucleotidos o aminoacidos identicos dividido por el numero de nucleotidos o aminoacidos en la mas corta de las secuencias, cuando las dos secuencias se alinean. En realizaciones particulares, dicha identidad de secuencia es del 70 % al 80 %, del 81 % al 85 %, del 86 % al 90 %, del 91 % al 95 %, del 96 % al 100 % o del 100 %.

Las frases “polinucleotido (o acido nucleico) que codifica un peptido” y “peptido que codifica un polinucleotido (o acido nucleico)” cuando se usan en el presente documento se refieren a una secuencia de nucleotidos, que, cuando se expresa en un medio apropiado, da como resultado la generacion de la secuencia del peptido relevante o un derivado u homologo del mismo. Tales polinucleotidos o acidos nucleicos incluyen las secuencias normales que codifican para el peptido, asf como los derivados y los fragmentos de estos acidos nucleicos capaces de expresar un peptido con la actividad requerida. De acuerdo con una realizacion, el acido nucleico que codifica los peptidos de acuerdo con la invencion o el fragmento del mismo es una secuencia que codifica el peptido o un fragmento del mismo originario de un mamfero o que corresponde a un mai^ero, mas particularmente un fragmento peptfdico humano.

Descripcion detallada

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La invencion se basa en el descubrimiento inesperado de que la estimulacion de las celulas T CD4+ espedficas de virus con peptidos que abarcan un epftopo de celula T y una secuencia consenso con actividad tiorreductasa provocan la maduracion y la expansion de un nuevo subconjunto de celulas T CD4+. Tales celulas tienen la capacidad de inducir la apoptosis en las celulas presentadoras de antigeno (CPA) solo cuando se activan por interaccion afm con los peptidos presentados por el CMH de clase II. Ademas, las celulas T CD4+ producen grandes cantidades de IFN-gamma, con la activacion de la formacion de productos intermedios reactivos de oxfgeno y reactivos de nitrogeno en las CPA, asf como la activacion de la IDO (indolamina-2,3-dioxigenasa). El nuevo subconjunto de CD4+ tambien se caracteriza por alta expresion en la superficie de CTLA-4, dotado con una capacidad adicional de inducir la IDO.

La invencion por lo tanto proporciona compuestos y metodos para producir y usar tales compuestos en el contexto de las infecciones causadas por patogenos virales intracelulares. La administracion local de altas concentraciones de IFN-gamma maximiza los mecanismos microbicidas no espedficos mientras que se evitan los efectos secundarios sistemicos. En particular se preve una metodologfa por la que las celulas T CD4+ espedficas se vuelvan potentes celulas citolfticas, mientras que mantienen una especificidad completa para el antigeno derivado del microorganismo. La consecuencia es doble:

(1) induccion de la actividad microbicida intracelular a traves de la produccion de IFN-gamma y senalizacion inversa mediada por la interaccion entre el CTLA 4 en las celulas T CD4+ y el B7 en la superficie de la CPA, dando como resultado una induccion de radicales oxidantes y de nitrogeno toxicos para el microorganismo y la privacion del triptofano a traves de la induccion de la IDO.

(2) eliminacion rapida de las celulas por la induccion de apoptosis en una etapa temprana despues de la infeccion, abortando de esta manera la infeccion.

De esta manera, en un aspecto la invencion se refiere al uso de al menos un peptido inmunogenico aislado que comprende (i) un epftopo de una celula T derivado de un antfgeno viral y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, para la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar, en un sujeto, la infeccion con dicho virus. Por lo tanto, el peptido o peptidos inmunogenicos o el medicamento que los comprende pueden usarse para el tratamiento anterior o profilactico o la inmunizacion de un sujeto para evitar/abortar la infeccion posterior/de novo con un virus. De forma analoga, los peptidos inmunogenicos o los medicamentos que los comprenden pueden usarse para tratamiento terapeutico o inmunizacion de un sujeto infectado con un virus. El tratamiento no debe dar como resultado necesariamente la “esterilizacion” del sujeto inmunizado, es decir, la erradicacion/eliminacion completa del patogeno del sujeto. Por lo tanto, se acepta que para algunas enfermedades es deseable evitar el desarrollo de un estado cronico y se acepta que la fase aguda de esa enfermedad lo mas probable no se pueda evitar. De forma analoga, en un sujeto ya infectado, el objetivo del tratamiento puede ser conseguir una disminucion/bajada sustancial de la carga patogenica en ese sujeto.

Se desvela adicionalmente el uso de al menos un peptido inmunogenico aislado que comprende (i) un epftopo de celula T derivado de un antfgeno de un virus y (ii) un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, para la fabricacion de un medicamento para inducir en un sujeto celulas T reguladoras CD4+ que estimulen los mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos en las celulas de dicho sujeto infectado con dicho virus.

En los usos anteriores, el peptido o peptidos inmunogenicos o el medicamento que los comprende puede usarse para tratamiento anterior o profilactico o inmunizacion de un sujeto para inducir una activacion normalmente inesperada en las celulas T reguladoras CD4+ en el sujeto inmunizado que estimulan mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos en las celulas de dicho sujeto que se infectan de novo/posteriormente con el virus. De forma analoga, los peptidos inmunogenicos o los medicamentos que los comprenden pueden usarse para el tratamiento terapeutico o la inmunizacion de un sujeto para inducir una activacion normalmente inesperada en las celulas T reguladoras CD4+ en el sujeto inmunizado que estimulan mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos en las celulas de dicho sujeto infectado con el virus. En particular, tales mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos incluyen la induccion de los productos intermedios reactivos de oxfgeno y de nitrogeno, la induccion de la IDO y la privacion de los aminoacidos esenciales para la supervivencia del virus tales como el triptofano. Ademas, dichas celulas T reguladoras CD4+ muestran una transcripcion aumentada del IFN-gamma y de granzimas (que contribuyen a sus propiedades citotoxicas microbicidas) y una sobreexpresion del CTLA-4 de la superficie. La produccion de IFN-gamma provoca en la celula diana la produccion de productos intermedios reactivos de oxfgeno y reactivos de nitrogeno. La senalizacion inversa inducida por el contacto celular entre el CTLA- 4 en las celulas T reguladoras CD4+ y las moleculas B7 en la superficie de las celulas diana induce, junto con el IFN-gamma, una produccion aumentada de la IDO con la posterior degradacion de triptofano.

Ademas, las anteriores celulas T reguladoras CD4+ adquieren propiedades citotoxicas para la celula que presenta un epftopo de celula T derivado de un antfgeno viral. Las celulas presentadoras de antfgeno pueden ser celulas convencionales tales como celulas dendrfticas, macrofagos o linfocitos B, pero tambien celulas T activadas u otras celulas que tras la activacion expresan determinantes del CMH de clase II.

Es importante darse cuenta de que las cineticas de induccion de la actividad microbicida intracelular son rapidas y tardan de unos pocos minutos a unas pocas horas. Por el contrario, la induccion de la apoptosis de las celulas diana

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tarda de 6 a 24 horas. Estos dos mecanismos de eliminacion de patogenos actuan por lo tanto en secuencia mas que juntos.

En cualquiera de los usos descritos anteriormente en el presente documento, el sujeto o receptor es un mamftero, en particular un primate (no humano) o un ser humano.

En cualquiera de los usos anteriores el antigeno asociado al patogeno intracelular procede de virus. Los virus incluyen virus de ADNmc, ADNbc y ARN, siendo ejemplos los Herpesviridae, Flaviviridae y Picornaviridae, gripe, sarampion y virus de inmunodeficiencia.

Las celulas T reguladoras CD4+ provocadas por los peptidos inmunogenicos de la presente invencion pueden suprimir las respuestas inmunitarias incluso frente a antigenos virales complejos. Un requisito mmimo para que se activen tales celulas es reconocer un peptido afm presentado por los determinantes del CMH de clase II, dando lugar a la apoptosis de la CPA, de esta manera suprimiendo las respuestas de las celulas T (tanto celulas T CD4+ como CD8+) a todos los epftopos de celulas T presentados por la CPA.

Hay situaciones en que mas de un antigeno viral esta presente en un sujeto. Bajo tales circunstancias, la misma CPA puede no presentar todos los antfgenos virales relevantes, ya que algunos de tales antigenos pueden tomarse por diferentes CPA posibles. Se anticipa por lo tanto que puede usarse la combinacion de dos o mas peptidos inmunogenicos para la prevencion o el tratamiento de la infeccion con un virus.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a los metodos y usos como se describe anteriormente en el presente documento en los que dicho uno o mas peptidos inmunogenicos se reemplazan por poblaciones de celulas T reguladoras CD4+ cebados con los peptidos inmunogenicos, o por una o mas secuencias de nucleotidos que codifican para el peptido inmunogenico (por ejemplo en la forma de ADN desnudo o un vector viral a administrarse a un individuo en lugar del peptido inmunogenico.

En realizaciones particulares, puede usarse una combinacion de multiples peptidos inmunogenicos (o poblaciones de celulas T), es decir mas de 1 (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) en cualquiera de los anteriores.

Estos aspectos de la invencion, asf como la modificacion adicional del peptido inmunogenico se describen con detalle en lo sucesivo.

La presente invencion se basa en el descubrimiento de que un peptido inmunogenico, que comprende un epftopo de celula T derivado de un antfgeno viral y una secuencia peptfdica que tiene actividad reducida es capaz de generar una poblacion de celulas T reguladoras CD4+, que tienen un efecto citotoxico en las celulas presentadoras de antfgeno.

En consecuencia, la invencion se refiere a peptidos inmunogenicos, que comprenden al menos un epftopo de celula T de un antfgeno viral con una posibilidad de activar una reaccion inmunitaria, acoplado a un compuesto organico que tiene una actividad reducida, tal como un peptido con una secuencia motivo de tiorreductasa. El epftopo de celula T y el compuesto organico se separan opcionalmente por un conector (por ejemplo una molecula espaciadora organica o una secuencia peptfdica). En realizaciones adicionales opcionales el peptido inmunogenico comprende adicionalmente una secuencia de direccionamiento endosomico (por ejemplo secuencia de direccionamiento endosomico tardfo) y/o secuencias “flanqueantes” adicionales.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden representarse esquematicamente como ALB o BLA, donde A representa un epftopo de celula T de un antfgeno (propio o no propio) con un potencial para generar una reaccion inmunitaria, L representa un conector y B representa un compuesto organico que tiene una actividad reductora.

La actividad reductora de un compuesto organico puede ensayarse para su capacidad para reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de la insulina conocido en la tecnica, en el que la solubilidad de la insulina se altera tras la reduccion, o con una insulina marcada con fluorescencia. El compuesto organico reductor puede acoplarse al lado amino-terminal del epftopo de celula T o en el carboxi-terminal del epftopo de celula T.

Generalmente el compuesto organico con actividad reductora es un peptido. Los fragmentos peptfdicos con actividad reductora se encuentran en las tiorreductasas que son pequenas enzimas reductoras de disulfuro que incluyen glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras oxidorreductasas tiol/disulfuro. Ejercen actividad reductora para los enlaces disulfuro de las protemas (tales como enzimas) a traves de las cistemas activas redox dentro de las secuencias consenso de dominio activas conservadas: C-X(2)-C, C-X(2)-S, C-X(2)-T, S-X(2)-C, T-X(2)- C (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225), en las que X significa cualquier aminoacido. Tales dominios tambien se encuentran en protemas mas grandes tales como la protema disulfuro isomerasa (PDI) y la fosfolipasa C espedfica de fosfoinositida.

En consecuencia, en realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos para usar de acuerdo con la presente invencion comprenden como motivo redox la secuencia motivo de tiorreductasa C-(X)2-[CT] o [CT]-(X)2-C. En una realizacion adicional, el motivo C-(X)2-[CT] o [CT]-(X)2-C se posiciona en el N terminal en el epftopo de celula T. Mas espedficamente, en dicho motivo redox al menos una de las posiciones [CT] esta ocupada por una Cys; de

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esta manera el motivo es C-(X)2-[CT] o bien [CT]-(X)2-C. En la presente solicitud un tetrapeptido tal se denominara “el motivo”. En realizaciones mas particulares los peptidos contienen la secuencia motivo C-X(2)-C.

Como se explica en detalle mas adelante, los peptidos inmunogenicos de la presente invencion pueden fabricarse por smtesis qmmica, que permite la incorporacion de aminoacidos no naturales. En consecuencia, en el motivo para reducir compuestos de acuerdo con realizaciones particulares de la presente invencion, C representa cistema o bien otros aminoacidos con un grupo tiol tales como mercaptovalina, homocistema u otros aminoacidos naturales o no naturales con una funcion tiol. Para tener actividad reductora, las cistemas presentes en el motivo debenan no estar como parte de un puente disulfuro de cistemas. No obstante, el motivo puede comprender cistemas modificadas tales como cistema metilada, que se convierte en cistema con grupos tiol libres in vivo.

Cada uno de los aminoacidos X en el motivo [C]-(X)2-[CT] o [CT]-(X)2-[C] de las realizaciones particulares de los peptidos inmunogenicos de la invencion puede ser cualquier aminoacido natural, incluyendo S, C o T o puede ser un aminoacido no natural, con lo que los dos aminoacidos X son el mismo o bien diferentes. En realizaciones particulares X es un aminoacido con una pequena cadena lateral tal como Gly, Ala, Ser o Thr. En realizaciones particulares adicionales, X no es un aminoacido con una cadena lateral voluminosa tal como Tyr. En realizaciones particulares adicionales al menos una X en el motivo [CT]-(X)2-[CT] es His o Pro.

En los peptidos inmunogenicos de la presente invencion que comprenden el motivo (redox) descrito anteriormente, el motivo se localiza de tal manera que, cuando el epftopo se ajusta en la hendidura del CMH, el motivo se mantiene fuera del hendidura de union del CMH. El motivo se localiza inmediatamente adyacente a la secuencia epitopica con el peptido inmunogenico o bien se separa del epftopo de celula T por un conector. Mas particularmente, el conector comprende una secuencia de aminoacidos de 7 aminoacidos o menos. Mas particularmente, el conector comprende 1, 2, 3 o 4 aminoacidos. De forma alternativa, un conector puede comprender 6, 8 o 10 aminoacidos. Los aminoacidos tfpicos usados en los conectores son serina y treonina. Los ejemplos de peptidos con conectores de acuerdo con la presente invencion son CXXC-G-epftopo (SEC ID N°: 15), CXXC-GG-epftopo (SEC ID N°: 16), CXX- SSS-epftopo (SEC ID N°: 17), CXXC-SGSG-epftopo (SEC ID N°: 18) y similares.

En esas realizaciones particulares de los peptidos de la invencion cuando la secuencia motivo esta adyacente a la secuencia epitopica esto se indica como posicion de P-4 a P-1 o de P+1 a P+4 en comparacion con la secuencia epitopica. Ademas de un conector peptfdico pueden usarse otros compuestos organicos como conectores para conectar entre sf las partes del peptido inmunogenico.

Los peptidos inmunogenicos de la presente invencion pueden comprender secuencias de aminoacidos cortas adicionales en el N o C terminal de la secuencia (artificial) que comprende el epftopo de celula T y el compuesto reductor (motivo). Una secuencia de aminoacidos tal se denomina generalmente en el presente documento una “secuencia flanqueante”. Una secuencia flanqueante puede posicionarse en el N y/o C terminal del motivo redox y/o del epftopo de celula T en el peptido inmunogenico. Cuando el peptido inmunogenico comprende una secuencia de direccionamiento endosomico, puede estar presente una secuencia flanqueante entre el epftopo y la secuencia de direccionamiento endosomico y/o entre el compuesto reductor (por ejemplo el motivo) y una secuencia de direccionamiento endosomico. Mas particularmente una secuencia flanqueante es una secuencia de hasta 10 aminoacidos, o de entre 1 y 7 aminoacidos, tal como una secuencia de 2 aminoacidos.

En realizaciones particulares de la invencion, el motivo redox en el peptido inmunogenico se localiza en el N terminal del epftopo.

En realizaciones particulares adicionales, donde el motivo redox presente en el peptido inmunogenico contiene una cistema, esta cistema esta presente en el motivo en la posicion mas remota del epftopo, de esta manera el motivo se da como C-X(2)-[T] en el N terminal del epftopo o se da como [T]-X(2)-C en el carboxilo terminal del epftopo.

En ciertas realizaciones de la presente invencion, los peptidos inmunogenicos se proporcionan comprendiendo una secuencia epitopica y una secuencia motivo. En realizaciones particulares adicionales, el motivo se da varias veces (1, 2, 3, 4 o incluso mas veces) en el peptido, por ejemplo como repeticiones del motivo que pueden espaciarse entre sf por uno o mas aminoacidos (por ejemplo CXXc X CXXC X CXXC; SEC ID N°: 19), como repeticiones que estan adyacentes entre sf (CXXC CXXC CXXC; SEC ID N°: 20) o como repeticiones que se solapan entre sf CXXCXXCXXC (SEC ID N°: 21) o CXCCXCCXCC (SEC ID N° 22). De forma alternativa, uno o mas motivos se proporcionan tanto en el N como en el C terminal de la secuencia epitopica de celula T. Otras variaciones previstas para los peptidos inmunogenicos de la presente invencion incluyen peptidos que contienen repeticiones de una secuencia de un epftopo de celula T o multiples epftopos de celula T diferentes en los que cada epftopo se precede y/o se sigue por el motivo (por ejemplo repeticiones de “motivo-epftopo” o repeticiones de “motivo-epftopo-motivo”. En el presente documento todos los motivos pueden tener la misma secuencia pero esto no es obligatorio. Se observa que las secuencias repetitivas de los peptidos que comprenden un epftopo que por sf mismo comprende el motivo tambien dara como resultado una secuencia que comprende tanto el ‘epftopo’ como un 'motivo'. En tales peptidos, el motivo dentro de una secuencia epitopica funciona como un motivo fuera de una segunda secuencia de epftopo. En realizaciones particulares sin embargo, los peptidos inmunogenicos de la presente invencion comprenden solamente un epftopo de celula T.

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Como se describe anteriormente los peptidos inmunogenicos de acuerdo con la invencion comprenden, ademas de un compuesto/motivo reductor, un epftopo de celula T derivado de un antigeno viral. Un epftopo de celula T en una secuencia proteica puede identificarse por ensayos funcionales y/o uno o mas ensayos de prediccion in silico. Los aminoacidos en una secuencia de un epftopo de celula T se numeran de acuerdo con su posicion en la hendidura de union de las protemas del CMH. En realizaciones particulares, el epftopo de celula T presente en los peptidos de la invencion consiste en entre 8 y 25 aminoacidos, todavfa mas particularmente en entre 8 y 16 aminoacidos, todavfa mas particularmente consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoacidos. En una realizacion mas particular, el epftopo de celula T consiste en una secuencia de 9 aminoacidos. En una realizacion particular adicional, el epftopo de celula T es un epftopo, que se presenta a las celulas T por las moleculas del CMH de clase II. En realizaciones particulares de la presente invencion, la secuencia epitopica de celula T es una secuencia epitopica que se ajusta en la hendidura de una protema del CMH II, mas particularmente un nonapeptido que encaja en la hendidura del CMH II. El epftopo de celula T de los peptidos inmunogenicos de la invencion puede corresponder a una secuencia de un epftopo natural de una protema o bien puede ser una version modificada de la misma, con la condicion de que el epftopo de celula T modificado conserve su capacidad para unirse dentro de la hendidura del CMH, parecido a la secuencia epitopica de celula T natural. El epftopo de celula T modificado puede tener la misma afinidad de union por la protema del CMH que el epftopo natural, pero puede tener tambien una afinidad disminuida. En realizaciones particulares la afinidad de union del peptido modificado no es menor a 10 veces menos que el peptido original, mas particularmente no menor a 5 veces menos. Es un descubrimiento de la presente invencion que los peptidos de la presente invencion tengan un efecto estabilizante en los complejos proteicos. En consecuencia, el efecto estabilizante del complejo peptido CMH compensa la afinidad disminuida del epftopo modificado por la molecula del CMH.

En realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos de la invencion comprenden adicionalmente una secuencia de aminoacidos (u otro compuesto organico) que facilitan la toma del peptido en endosomas (tardfos) para procesar y la presentacion dentro de los determinantes del CMH de clase II. El direccionamiento endosomico tardm se media por senales presentes en la cola citoplasmatica de las protemas y corresponde con los motivos peptfdicos bien identificados tales como el motivo basado en dileucina [DE]XXXL[LI] (SEC ID N°: 23) o DXXLL (SEC ID N°: 24) (por ejemplo DXXXLL; SEC ID N°: 25), el motivo basado en tirosina yXX0 o el denominado motivo de grupo acido. El sfmbolo 0 representa restos de aminoacidos con unas cadenas laterales hidrofobas voluminosas tales como Phe, Tyr y Trp. Las secuencias de direccionamiento endosomico tardm permiten el procesamiento y la presentacion eficaz del epftopo de celula T derivado de antigeno por las moleculas del CMH de clase II. Tales secuencias de direccionamiento endosomico se incluyen, por ejemplo, dentro de la protema gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J Cell Biol 130, 807-820), la protema gamma CD3 humana, el HLA-BM p (Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 1017-1027), la cola citoplasmatica del receptor de DEC205 (Mahnke et al. (2000) J Cell Biol 151, 673-683). Otros ejemplos de peptidos que funcionan como senales de clasificacion se desvelan en la revision de Bonifacio y Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. De manera alternativa, la secuencia puede ser la de un epftopo de celula T subdominante o inferior de una protema, que facilita la captacion en un endosoma tardm sin superar la respuesta de la celula T frente al epftopo de celula T derivado de antigeno viral.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden generarse acoplando un motivo reductor como se ha descrito anteriormente, en el N o C terminal a un epftopo de celula T de un antfgeno viral (directamente adyacente al mismo o bien separado por un conector). Ademas la secuencia epitopica de la celula T del peptido inmunogenico y/o del motivo redox puede modificarse y/o una o mas secuencias flanqueantes y/o una secuencia diana pueden introducirse (o modificarse), en comparacion con la secuencia epitopica de celula T de origen natural. En consecuencia, la secuencia resultante del peptido inmunogenico diferira en muchos casos de la secuencia del antigeno/protema viral de interes. En este caso, los peptidos inmunogenicos de la invencion son peptidos con una secuencia artificial, que no es de origen natural.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden variar sustancialmente en longitud, por ejemplo de aproximadamente 12-13 aminoacidos (un epftopo de celula T de 8-9 aminoacidos y el motivo redox de 4 aminoacidos) a hasta 50 o mas aminoacidos. Por ejemplo, un peptido inmunogenico de acuerdo con la invencion puede comprender una secuencia de direccionamiento endosomico de 40 aminoacidos, una secuencia flanqueante de aproximadamente 2 aminoacidos, un motivo como se describe en el presente documento de 4 aminoacidos, un conector de 4 aminoacidos y un peptido de epftopo de celula T de 9 aminoacidos. En realizaciones particulares, los peptidos inmunogenicos de la invencion consisten en entre 12 aminoacidos y 20 hasta 25, 30, 50, 75, 100 o 200 aminoacidos. En una realizacion mas particular, los peptidos consisten en entre 10 y 20 aminoacidos. Mas particularmente, cuando el compuesto reductor es un motivo redox como se describe en el presente documento, la longitud del peptido inmunogenico que comprende el epftopo y el motivo opcionalmente conectado por un conector es de 19 aminoacidos o menos, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 aminoacidos.

Como se ha detallado anteriormente, los peptidos inmunogenicos para usar en el direccionamiento de virus de acuerdo con la invencion comprenden un motivo reductor como se describe en el presente documento unido a una secuencia de un epftopo de celula T. De acuerdo con una realizacion particular los epftopos de celula T derivan de antfgenos virales que no comprenden dentro de su secuencia natural nativa una secuencia de aminoacidos con propiedades redox dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal adyacente al epftopo de celula T de interes. Mas particularmente, la invencion abarca generar peptidos inmunogenicos a partir de antfgenos virales

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que no comprenden una secuencia seleccionada de C-X(2)-S, S-X(2)-C, C-X(2)-C, S-X(2)-S, C-X(2)-T, T-X(2)-C dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal adyacente a la secuencia epitopica. En realizaciones particulares adicionales, la presente invencion proporciona peptidos inmunogenicos de antigenos virales que no comprenden las secuencias de aminoacidos anteriormente descritas con propiedades redox en su secuencia.

En realizaciones particulares adicionales, los peptidos inmunogenicos de la invencion son peptidos que comprenden epftopos de celulas T que no comprenden una secuencia de aminoacidos con propiedades redox en su secuencia natural. Sin embargo, en realizaciones alternativas, un epftopo de celula T que se une a la hendidura del CMH puede comprender un motivo redox tal como se describe en el presente documento dentro de su secuencia de epftopo; los peptidos inmunogenicos de acuerdo con la invencion que comprenden tal epftopo de celula T deben comprender adicionalmente otro motivo redox acoplado (adyacente o separado por un conector) en el N o C terminal al epftopo de tal manera que el motivo unido pueda garantizar la actividad reductora (contrario al motivo presente en el epftopo, que se oculta dentro de la hendidura).

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a los metodos para generar peptidos inmunogenicos de la presente invencion descritos en el presente documento. Tales metodos incluyen la identificacion de epftopos de celulas T en un antigeno viral de interes; las vfas para la identificacion in vitro e in silico de epftopos de celulas T se conocen ampliamente en la tecnica y algunos aspectos se elaboran despues en lo sucesivo. Los peptidos inmunogenicos generados pueden evaluarse para la capacidad de inducir celulas T reguladoras CD4+ espedficas de antfgeno viral que son citotoxicas para (parte de) las celulas presentadoras de antfgeno viral de interes.

Los peptidos inmunogenicos de acuerdo con la invencion se generan partiendo de un epftopo o epftopos de celulas T del antfgeno o antfgenos virales de interes. En particular, el epftopo de celula T usado puede ser un epftopo de celula T dominante. La identificacion y la seleccion de un epftopo de celula T de un antfgeno viral, para usar en el contexto de la presente invencion se conoce por un experto en la materia. Por ejemplo, las secuencias peptfdicas aisladas de un antfgeno viral se ensayan por, por ejemplo, tecnicas de biologfa de celulas T, para determinar si las secuencias del peptido provocan una respuesta de celulas T. Esas secuencias peptfdicas que se encontro que provocan una respuesta de las celulas T se definen como que tienen actividad estimulante de las celulas T. La actividad estimulante de las celulas T humanas puede ensayarse adicionalmente cultivando celulas T obtenidos de un individuo sensibilizado a un antfgeno viral con un peptido/epftopo derivado del antfgeno viral y determinando si la proliferacion de las celulas T se da en respuesta al peptido/epftopo como se mide, por ejemplo, por la toma celular de timidina tritiada. Los indices de estimulacion para las respuestas por las celulas T a los peptidos/epftopos pueden calcularse como el CPM maximo en respuesta a un peptido/epftopo dividido entre el CPM control. Un mdice de estimulacion (I. E.) de una celula T igual a o mayor de dos veces el nivel de fondo se considera “positivo”. Los resultados positivos se usan para calcular el mdice de estimulacion medio para cada peptido/epftopo para el grupo de peptidos/epftopos ensayado. Los epftopos de celulas T no naturales (modificadas) ademas pueden ensayarse opcionalmente para su afinidad de union a las moleculas del CMH de clase II. La union de los epftopos de celulas T no naturales (o modificadas) a las moleculas del CMH de clase II puede realizarse de diferentes formas. Por ejemplo, las moleculas de HLA de clase II solubles se obtienen por lisis de celulas homocigotas para una molecula de clase II dada. La ultima se purifica por cromatograffa de afinidad. Las moleculas de clase II solubles se incuban con un peptido de referencia marcado con biotina producido de acuerdo con su fuerte afinidad de union por esa molecula de clase II. Los peptidos a evaluarse para la union a la clase II se incuban despues a diferentes concentraciones y se calcula su capacidad de desplazar el peptido de referencia de su union a la clase II por la adicion de neutravidina. Los metodos pueden encontrarse en por ejemplo Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184. Los peptidos inmunogenicos de la invencion tienen un mdice de estimulacion de celulas T medio mayor de o igual a 2,0. Un peptido inmunogenico que tiene un mdice de estimulacion de celulas T de mas de o igual a 2,0 se considera util como agente profilactico o terapeutico. Mas particularmente, los peptidos inmunogenicos de acuerdo con la invencion tienen un mdice de estimulacion de celulas T medio de al menos 2,5, al menos 3,5, al menos 4,0 o incluso al menos 5,0. Ademas, tales peptidos tendran normalmente un mdice de positividad (I.P.) de al menos aproximadamente 100, al menos 150, al menos aproximadamente 200 o al menos aproximadamente 250. El mdice de positividad para un peptido se determina multiplicando el mdice de estimulacion por el porcentaje de individuos, en una poblacion de individuos sensibles a un antfgeno viral (por ejemplo, al menos 9 individuos, al menos 16 individuos o al menos 29 o 30, o incluso mas), que tienen celulas T que responden al peptido (de esta manera correspondiendo al SI multiplicado por la naturaleza promiscua del peptido/epftopo). De esta manera, el mdice de positividad representa tanto la fuerza de una respuesta de celulas T a un peptido (I.E.) como la frecuencia de una respuesta de celulas T a un peptido en una poblacion de individuos sensibles a un antfgeno viral. Para determinar los epftopos de celulas T optimos por, por ejemplo, tecnicas de mapeo refinadas, un peptido que tiene actividad estimulante de las celulas T y por lo tanto que comprenden al menos un epftopo de celula T como se determina por tecnicas de biologfa de celulas T se modifica por la adicion o la delecion de restos de aminoacidos en el N- o bien en el C-terminal del peptido y se ensayan para determinar un cambio en la reactividad de las celulas T al peptido modificado. Si dos o mas peptidos que comparten un area de solapamiento en la secuencia de la protema nativa se encuentra que tienen actividad estimulante de las celulas T humanas, como se determina por tecnicas de biologfa de celulas T, pueden producirse peptidos adicionales que comprenden todo o una parte de tales peptidos y estos peptidos adicionales pueden ensayarse por un procedimiento similar. Siguiendo esta tecnica, los peptidos se seleccionan y se producen recombinante o sinteticamente. Los epftopos o peptidos de celulas T se seleccionan

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basandose en diversos factores, incluyendo la fuerza de la respuesta de las celulas T al peptido/epttopo (por ejemplo, mdice de estimulacion) y la frecuencia de la respuesta de las celulas T al peptido en una poblacion de individuos.

Los antigenos candidatos pueden identificarse por uno o mas algoritmos in vitro para identificar una secuencia epitopica de celula T dentro de una protema antigenica. Los algoritmos adecuados se describen por ejemplo en Zhang et al. (2005) Nucleic Acids Res 33, W180-W183 (PREDBALDB); Salomon y Flower (2006) BMC Bioinformatics 7, 501 (MHCBN); Schuler et al. (2007) Methods Mol Biol. 409, 75-93 (SYFPEITHI); Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34, W194-W197 (SVMHC); Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276, 172-174 y Guan et al. (2003) Appl Bioinformatics 2, 63-66 (MHCPred). Mas particularmente, tales algoritmos permiten la prediccion dentro de una protema antigenica de una o mas secuencias nonapeptfdicas que encajaran en la hendidura de una molecula de MCH II.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden producirse por expresion recombinante, por ejemplo, en celulas bacterianas (por ejemplo Escherichia coli), celulas de levadura (por ejemplo, especies de Pichia, especies de Hansenula, especies de Saccharomyces o de Schizosaccharomyces), celulas de insecto (por ejemplo de Spodoptera frugiperda o Trichoplusia ni), celulas vegetales o celulas de mairnferos (por ejemplo, celulas CHO, COS). La construccion de los vectores de expresion (incluyendo informacion adicional tal como secuencias promotoras y de terminacion) adecuados por lo tanto requeridos implica tecnicas convencionales de ADN recombinante. Los peptidos inmunogenicos producidos recombinantemente de la invencion pueden derivarse de una protema precursora mas grande, por ejemplo, a traves de rotura enzimatica de sitios de corte de enzimas insertados adyacentes a los N- y/o C-terminales del peptido inmunogenico, seguido de una purificacion adecuada.

En vista de la longitud limitada de los peptidos inmunogenicos de la invencion, pueden prepararse por smtesis qrnmica de peptidos, en la que los peptidos se preparan acoplando los diferentes aminoacidos entre sf. La smtesis qrnmica es particularmente adecuada para la inclusion de por ejemplo D-aminoacidos, aminoacidos con cadenas laterales no de origen natural o aminoacidos naturales con cadenas laterales modificadas tales como cistema metilada. Los metodos de smtesis qrnmica de peptidos estan bien descritos y los peptidos pueden pedirse de compares tales como Applied Biosystems y otras compares. La smtesis de peptidos puede realizarse como smtesis de peptidos en fase solida (SPPS) o bien smtesis de peptidos en fase contraria a solucion. Los metodos de SPPS mejor conocidos son qrnmica en fase solida t-Boc y Fmoc que se conocen ampliamente por los expertos en la materia. Ademas, los peptidos pueden unirse entre sf para formar peptidos mas largos usando una estrategia de ligacion (acoplamiento quimio selectivo de dos fragmentos peptfdicos sin proteger) como describio originalmente Kent (Schnolzer y Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) y revisado por ejemplo en Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205. Esto proporciona la tremenda posibilidad de conseguir una smtesis de protemas que esta junto al alcance de la SPPS. Muchas protemas con el tamano de 100-300 restos se han sintetizado satisfactoriamente por este metodo. Los peptidos sinteticos han continuado jugando un papel crucial en aumento en los campos de investigacion de la bioqmmica, la farmacologfa, la neurobiologfa, la enzimologfa y la biologfa molecular debido a los enormes avances en la SPPS.

Las propiedades ffsicas y qrnmicas de un peptido inmunogenico de interes (por ejemplo solubilidad, estabilidad) se examinan para determinar si el peptido es/sena adecuado para usar en composiciones terapeuticas. Normalmente esto se optimiza ajustando la secuencia peptfdica. Opcionalmente, el peptido puede modificarse despues de la smtesis (modificaciones qrnmicas por ejemplo anadir/eliminar grupos funcionales) usando tecnicas conocidas en la tecnica.

Todavfa en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona metodos para generar celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno viral (Treg o celulas T reguladoras CD4+) in vivo o bien in vitro (ex vivo). En particular las celulas T que se proporcionan son citotoxicas frente a cualquier celula que presente un antfgeno viral y son obtenibles como una poblacion celular. La invencion se extiende a (poblaciones de) Treg citotoxicas espedficas de antfgeno viral obtenibles por los metodos descritos en el presente documento.

En realizaciones particulares, se proporcionan metodos que comprenden el aislamiento de celulas de sangre periferica, la estimulacion de la poblacion celular in vitro poniendo en contacto un peptido inmunogenico de acuerdo con la invencion con las celulas de sangre periferica aisladas y la expansion de la poblacion celular estimulada, mas particularmente en presencia de IL-2. Los metodos de acuerdo con la invencion tienen la ventaja de que se producen numeros mas altos de Tregs y las Tregs que pueden generarse son espedficas para el antfgeno viral (usando un peptido que comprende un epftopo espedfico de antfgeno). De manera alternativa, las celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno viral pueden obtenerse por incubacion en presencia de CPA que presentan un peptido inmunogenico espedfico del virus de acuerdo con la infeccion despues de la transduccion o la transfeccion de las CPA con una construccion genetica capaz de dirigir la expresion de tal peptido inmunogenico. Tales CPA pueden de hecho administrarse por sf mismas a un sujeto que necesite desencadenar in vivo en dicho sujeto la induccion del subconjunto de celulas T CD4+ citotoxicas beneficioso que tambien son capaces de estimular mecanismos microbicidas intracelulares no espedficos en las celulas de dicho sujeto infectado con un virus.

En una realizacion alternativa, las Treg pueden generarse in vivo, es decir por la administracion de un peptido inmunogenico proporcionado en el presente documento a un sujeto y la recogida de las Treg generadas in vivo.

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Las celulas T reguladoras espedficas de antigeno viral obtenibles por los metodos anteriores son de interes particular para usar en la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar la infeccion con un antigeno intracelular. Para cualquiera de los usos anteriormente descritos de los peptidos inmunogenicos de la invencion, dichos peptidos pueden reemplazarse por dichas Treg espedficas de antfgeno viral. Se preve el uso de celulas tanto alogenicas como autogenicas. Cualquier metodo que comprenda la administracion de dichas Treg espedficas de antigeno viral a un sujeto que lo necesite (es decir, para prevenir o tratar una infeccion con un virus) tambien se conoce como terapia celular adoptiva. Las Tregs son cruciales en la inmunorregulacion y tienen un gran potencial terapeutico. La eficacia de la inmunoterapia basada en Treg depende de la especificidad del Ag de las celulas T reguladoras. Ademas, el uso de Treg espedfico de Ag opuesto al Treg expandido policlonal reduce el numero total de Treg necesarias para la terapia.

Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a las secuencias de acidos nucleicos que codifican los peptidos inmunogenicos de la presente invencion y a los metodos para su uso, por ejemplo, para la expresion recombinante o en terapia genica. En particular, dichas secuencias de acidos nucleicos son capaces de expresar los peptidos inmunogenicos de la invencion.

Los peptidos inmunogenicos de la invencion pueden ciertamente administrarse a un sujeto que lo necesite usando cualquier metodo de terapia genica adecuado. En cualquier uso o metodo de la invencion para la prevencion y/o el tratamiento de una infeccion con un virus, puede combinarse la inmunizacion con un peptido inmunogenico de la invencion con la transferencia celular adoptiva de (una poblacion de) Treg espedfica para dicho peptido inmunogenico y/o con terapia genica. Cuando se combinan, dicha inmunizacion, la transferencia celular adoptiva y la terapia genica pueden usarse simultanea o secuencialmente en cualquier combinacion posible.

En terapia genica, las moleculas de acido nucleico recombinantes que codifican para los peptidos inmunogenicos pueden usarse como ADN desnudo o en liposomas o en otros sistemas lipfdicos para liberarlos a las celulas diana. Otros metodos para la transferencia directa de ADN plasmfdico en las celulas se conocen bien por los expertos en la materia para usar en terapia genica humana y que implica marcar el ADN en los receptores en las celulas formando complejos del ADN plasirndico con las proternas. En su forma mas sencilla, la transferencia de genes puede realizarse simplemente inyectando cantidades minoritarias de ADN dentro del nucleo de una celula, a traves de un proceso de microinyeccion. Una vez que los genes recombinantes se introducen en una celula, pueden reconocerse por los mecanismos normales de las celulas para la transcripcion y la traduccion y se expresara el producto genico. Otros metodos tambien se han descrito para introducir ADN en gran numero de celulas. Estos metodos incluyen: transfeccion, en la que el ADN se precipita con fosfato calcico y se introduce en las celulas por pinocitosis; electroporacion, en la que las celulas se exponen a grandes impulsos de tension para introducir orificios en la membrana; lipofeccion/fusion liposomal, en la que el ADN se empaqueta en vesfculas lipofilas que se fusionan con una celula diana; y bombardeo de partfculas usando ADN unido a pequenos proyectiles. Otro metodo para introducir ADN en las celulas es acoplar el ADN a proternas qmmicamente modificadas. Las proternas de adenovirus son capaces de desestabilizar los endosomas y potenciar la introduccion del ADN en las celulas. La mezcla de adenovirus en soluciones que contienen complejos de ADN, o la union del ADN a la polilisina unida covalentemente al adenovirus usando agentes de reticulacion de proternas mejora sustancialmente la captacion y la expresion del gen recombinante. Los vectores virales adenoasociados pueden usarse para el envfo genico en las celulas vasculares. Como se usa en el presente documento, “transferencia genica” significa el proceso de introducir una molecula de acido nucleico extrana dentro de una celula, que se realiza comunmente para habilitar la expresion de un producto particular codificado por el gen. El dicho producto puede incluir una protema, un polipeptido, un ADN o ARN anti-sentido o un ARN enzimaticamente activo. La transferencia genica puede realizarse en celulas cultivadas o por la administracion directa en marnfferos. En otra realizacion, se proporciona un vector que comprende una secuencia de una molecula de acido nucleico que codifica un peptido inmunogenico de acuerdo con la invencion. En realizaciones particulares, el vector se genera de tal manera que la secuencia de la molecula de acido nucleico se expresa solamente en un tejido espedfico. Los metodos para conseguir la expresion genica espedfica de tejido se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, colocando la secuencia que codifica un peptido inmunogenico de la invencion bajo el control de un promotor, que dirige la expresion del peptido espedficamente en uno o mas tejido o tejidos u organo u organos. Los vectores de expresion derivados de virus tales como retrovirus, virus de la vacuna, adenovirus, virus adenoasociados, virus de ARN o virus del papiloma bovino pueden usarse para liberar secuencias de nucleotidos (por ejemplo, ADNc) que codifican peptidos, homologos o derivados de los mismos de acuerdo con la invencion en los tejidos o en la poblacion celular diana. Pueden usarse metodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores virales recombinantes que contengan tales secuencias codificantes. De manera alternativa, en la terapia genica pueden usarse celulas modificadas por ingeniena genetica que contienen una molecula de acido nucleico que codifica un peptido inmunogenico de acuerdo con la invencion.

Cuando la administracion de uno o mas peptidos de acuerdo con la invencion se garantiza a traves de la transferencia de genes (es decir la administracion de un acido nucleico que garantiza la expresion de los peptidos de acuerdo con la invencion in vivo tras la administracion) la dosis apropiada del acido nucleico puede determinarse basandose en la cantidad de peptido expresado como resultado del acido nucleico introducido.

De acuerdo con la presente invencion los medicamentos se preven entre otros para el tratamiento de una infeccion con virus. El medicamento de la invencion es normalmente, pero no necesariamente, una formulacion (farmaceutica) que comprende como principio activo al menos uno de los peptidos inmunogenicos de la invencion, unos (poblacion

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de) Treg espedficos para dicho peptido inmunogenico o un vector de terapia genica capaz de expresar dicho peptido inmunogenico. Aparte del principio o principios activos, tal formulacion comprendera al menos uno de un diluyente), veldculo o adyuvante (farmaceuticamente aceptables). Normalmente, los compuestos farmaceuticamente aceptables (tales como diluyentes, veldculos y adyuvantes) pueden encontrarse en, por ejemplo, un manual de farmacopea (por ejemplo, Farmacopea europea o internacional). El medicamento o la composicion farmaceutica de la invencion normalmente comprenden una cantidad (profilactica o terapeuticamente) eficaz del principio o principios activos en el que la eficacia es respecto a la afeccion o trastorno a prevenir o a tratar. En particular, las composiciones farmaceuticas de la invencion son vacunas para aplicacion profilactica o terapeutica.

Puede ser necesario administrar a un sujeto que lo necesite el medicamento o la composicion farmaceutica de la invencion como parte de un regimen profilactico o terapeutico que comprenda administraciones multiples de dicho medicamento o composicion. Tales administraciones multiples normalmente se proporcionan secuencialmente y el intervalo de tiempo entre dos administraciones puede variar y se ajustara a la naturaleza del principio activo y a la naturaleza de la afeccion a prevenir o a tratar. La cantidad de principio activo proporcionada a un sujeto que lo necesite en una administracion unica puede variar tambien y dependera de factores tales como el estado ffsico del sujeto (por ejemplo, peso, edad), del estado de la afeccion a prevenir o a tratar y de la experiencia del doctor, medico o enfermera tratante.

El termino “diluyentes” se refiere, por ejemplo, a soluciones salinas fisiologicas. El termino “adyuvante” se refiere normalmente a un agente farmacologico o inmunologico que modifica (preferentemente aumenta) el efecto de otros agentes (por ejemplo, farmacos, vacunas) mientras que tiene pocos, si los tuviera, efectos directos cuando se dan por sf mismos. Como un ejemplo de un adyuvante se da el hidroxido de aluminio (alumbre), en el que puede adsorberse un peptido inmunogenico de la invencion. Ademas, muchos otros adyuvantes se conocen en la tecnica y pueden usarse con la condicion de que faciliten la presentacion de peptidos en la presentacion del MHC de clase II y la activacion de las celulas T. La frase “vetuculo farmaceuticamente aceptable” significa cualquier material o sustancia con la que el principio activo se formula para facilitar su aplicacion o su diseminacion al lugar a tratar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o difundiendo dicha composicion y/o facilita su almacenamiento, su transporte o su manipulacion sin danar su eficacia. Se incluyen cualquiera y todos los disolventes, los medios de dispersion, los recubrimientos, los agentes antibacterianos y antifungicos (por ejemplo fenol, acido sorbico, clorobutanol), los agentes isotonicos (tales como azucares o cloruro sodico) y similares. Pueden incluirse ingredientes adicionales para controlar la duracion de la accion del principio activo en la composicion. El vetuculo farmaceuticamente aceptable puede ser un solido o un lfquido o un gas que se ha comprimido para formar un lfquido, es decir las composiciones de esta invencion pueden usarse adecuadamente como concentrados, emulsiones, soluciones, granulados, polvos, pulverizadores, aerosoles, suspensiones, pomadas, cremas, comprimidos, granulos o polvos. Los veldculos farmaceuticamente adecuados para usar en dichas composiciones farmaceuticas y su formulacion son bien conocidas por los expertos en la materia y no hay restriccion particular para su seleccion dentro de la presente invencion. Tambien pueden incluir aditivos tales como agentes humectantes, agentes de dispersion, aglutinantes, adhesivos, agentes emulsionantes, disolventes, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos (por ejemplo fenol, acido sorbico, clorobutanol), agentes isotonicos (tales como azucares o cloruro sodico) y similares, con la condicion de que los mismos sean coherentes con la practica farmaceutica, es decir, veldculos y aditivos que no crean un dano permanente a los mamfferos. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden prepararse de cualquier manera conocida, por ejemplo, mezclando homogeneamente, recubriendo y/o moliendo los principios activos, en un procedimiento de una etapa o multi-etapa, con el material vehfculo seleccionado y, cuando sea apropiado, los otros aditivos tales como los agentes tensioactivos. Tambien pueden prepararse por micronizacion, por ejemplo, en vista de obtenerlos en forma de microesferas que tienen normalmente un diametro de aproximadamente 1 a 10 |im, a saber para la fabricacion de microcapsulas para la liberacion controlada o sostenida de los principios activos.

Los peptidos inmunogenicos, los homologos o los derivados de los mismos de acuerdo con la invencion (y sus sales fisiologicamente aceptables o las composiciones farmaceuticas todas incluidas en la frase “principios activos”) pueden administrarse por cualquier via apropiada para la afeccion a prevenir o a tratar y apropiada para los compuestos, aqrn las protemas inmunogenicas a administrarse. Las via posibles incluyen regional, sistemica, oral (en forma solida o inhalacion), rectal, nasal, topica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intraarterial, intratecal y epidural). La via de administracion preferida puede variar, por ejemplo, con el estado del receptor o con la afeccion a prevenir o a tratar.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los metodos bien conocidos en la materia de la farmacia. Las formulaciones de la presente invencion adecuadas para la administracion oral pueden presentarse como unidades discretas tales como capsulas, obleas o comprimidos conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo; como un polvo o granulos; como solucion o una suspension en un lfquido acuoso o en un lfquido no acuoso; o como una emulsion lfquida de aceite en agua o una emulsion lfquida de agua en aceite. El principio activo tambien puede presentarse como un bolo, un electuario o una pasta. Un comprimido puede fabricarse por compresion o moldeo, opcionalmente con uno o mas ingredientes accesorios. Los comprimidos que se han comprimido pueden prepararse comprimiendo en una maquina adecuada el principio activo en una forma libre de fluidez tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante, un lubricante, un diluyente inerte, un conservante, un tensioactivo o un

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agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una maquina adecuada una mezcla del compuesto pulverizado humedecido con un diluyente ftquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse o marcarse opcionalmente y pueden formularse de tal manera que proporcionen una liberacion lenta o controlada del principio activo en los mismos.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a peptidos inmunogenicos aislados que comprenden un epftopo de celula T de un antigeno viral y, adyacente a dicho epftopo de celula T o separado de dicho epftopo de celula T por un conector, un motivo C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C. En realizaciones particulares el antigeno es una protema de la capside.

La presente invencion se ilustrara ahora por medio de los siguientes ejemplos, que se proporcionan sin ninguna intencion de limitacion.

Ejemplos

EJEMPLO 1. Las celulas T reguladoras citotoxicas a los adenovirus provocan una generacion aumentada de los productos intermedios reactivos de oxfgeno en las celulas dendnticas que presentan el peptido afm.

Se uso el adenovirus de serotipo 5 (Ad. RR5, E1/E3-eliminado) en estos experimentos. De esta manera, se administraron 5 |il de una solucion que contiene 2x1011 partmulas virales/ml por v^a intravenosa a ratones C57BI/6 de 6 semanas de edad. Diez dfas despues, el bazo de tales ratones se recupero y se purificaron las celulas T CD4+ por separacion magnetica.

Un epftopo de celula T se identifico dentro de la secuencia de la protema principal de la capside, por una combinacion de algoritmos. Se selecciono un epftopo de celula T que abarca los restos de aminoacidos 912-921, con la secuencia: PTLLYVLFEV (SEC ID N°: 1; epftopo natural). Se obtuvo un peptido sintetico que codifica esta secuencia epitopica natural. Se sintetizo un segundo peptido que contema adicionalmente una secuencia consenso de tiorreductasa (o motivo redox) y tiene la secuencia: CHGCpTLLYVLFEV (SEC ID N°: 2; motivo redox subrayado; epftopo modificado).

Las celulas T CD4+ obtenidas de los ratones inmunizados Ad. RR5 se cultivaron en presencia de celulas adherentes de bazo empobrecido en celulas T usadas como celulas presentadoras de antfgeno pre-incubadas con el peptido de SEC ID N°: 1 o bien con el peptido de SEC ID N°: 2. Despues de dos ciclos de reestimulacion, las lrneas celulares de celulas T CD4+ se dejaron descansar durante 10 dfas. Las lrneas celulares expandidas con el peptido de SEC ID N°: 1 se compararon con las lrneas celulares expandidas con el peptido de SEC ID N°: 2 en un ensayo en que las celulas dendnticas de ratones C57BI/6 vftgenes se usaron para la presentacion de antfgenos. Despues, la generacion de productos intermedios reactivos de oxfgeno (ROI) por las celulas dendnticas se evaluo despues de 2 h de co-cultivo. Las celulas dendnticas se prepararon a partir del bazo de ratones C57BI/6 por clasificacion en perlas magneticas recubiertas con un anticuerpo espedfico anti-CD11c.

De esta manera, se incubaron 105 celulas dendnticas durante 1 h con 10 |il de DCFDA, un derivado de la fluorescema usado como un indicador de la generacion de ROI. En un experimento control, no se uso peptido para cargar las celulas dendnticas, que se incubaron despues durante 18 h con 2x105 de una lrnea celular obtenida por expansion con el peptido de SEC ID N°: 1 o de SEC ID N°: 2 para establecer un valor de fondo para la generacion de ROI. En experimentos paralelos se cargaron 105 celulas dendnticas con 10 |il de DCFDA durante 1 h junto con 10 |ig del peptido de SEC ID N°: 1 (secuencia natural). Estas celulas dendnticas cargadas se co-cultivaron despues durante 2 h a 37 °C con 2x105 de una lrnea celular obtenida por expansion con el peptido de SEC ID N°: 1 o bien de SEC ID N°: 2. Se mostro que la produccion de ROI por las celulas dendnticas se induda en las celulas presentadoras de antfgeno usando analisis Facs. Los aumentos de fluorescencia generados por la oxidacion de DCFDA por los productos intermedios reactivos de oxfgeno se leen en un Facs cerrado en celulas CD11 c(+).

La Figura 1 muestra que las celulas dendnticas cargadas con el peptido de SEC ID N°: 1 produdan significativamente mas rOi cuando se co-cultivaban con una lrnea celular T expandida con el peptido de SEC ID N°: 2. Estos experimentos mostraron que, en comparacion con los epftopos de celulas T derivados de virus naturales, tales epftopos modificados por la union de un motivo de tiorreductasa desencadenan una generacion aumentada de los productos intermedios reactivos de oxfgeno en las celulas que presentan el epftopo de celula T natural.

EJEMPLO 2. Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis es responsable de cientos de muertes cada ano. La unica vacunacion disponible, la vacuna basada en Mycobacterium bovis de Calmette-Guerin (BCG), no es eficaz. Ademas, muchas cepas de Mycobacterium muestran resistencia a la quimioterapia convencional. Se sabe que se dan celulas CD4+ espedficas de antfgeno en la tuberculosis (Winslow et al. (2003) J. Immunol. 170:2046-2052), que pueden ser protectores (Khader et al. (2007) Nature Immunol. 8:369-377).

El antfgeno secretor temprano (AST) producido por M. tuberculosis es uno de los principales antfgenos reconocidos tanto por seres humanos como por animales tales como ratones. Un epftopo de celula T dominante, denominado ESAT-6, que corresponde a la secuencia de aminoacidos 1-20, se ha mapeado y se ha mostrado que es promiscuo,

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ya que activa las celulas T CD4+ en las cepas principales de ratones y en seres humanos. Se ha identificado un epftopo de celula T (natural) que contiene los aminoacidos 3-17, con la secuencia: FAGIEAAAS (SEC ID N°: 3). La adicion de una secuencia consenso CGHC con actividad tiorreductasa (acortado: motivo redox) en el extremo amino terminal del peptido genera un epftopo de celula T modificado con la secuencia: CGHCFAGIEAAAS (SEC ID N°: 4, motivo subrayado).

Los ratones C57BI/6 se inmunizan con el peptido de SEC ID N°: 3 junto con un adyuvante tal como el alumbre. Se realizan tres inyecciones de 50 |ig del peptido en intervalos de quincenas. Dos semanas despues de la ultima inmunizacion, los ratones se sacrifican y las celulas T CD4+ se preparan a partir del bazo por una combinacion de centrifugacion en gradiente de densidad y seleccion en perlas magneticas recubiertas de anticuerpos. Las celulas T CD4+ se activan despues y se expanden in vitro usando celulas presentadoras de antfgeno cargadas con el peptido de SEC ID N°: 4 y se clonan por dilucion limitante.

Se muestra que la produccion de productos intermedios reactivos de oxfgeno y reactivos de nitrogeno se induce en las celulas presentadoras de antigeno usando analisis Facs y RT-PCR, respectivamente, de la siguiente manera. Las celulas dendnticas se preparan a partir del bazo de ratones C57BI/6 por clasificacion en perlas magneticas recubiertas con un anticuerpo espedfico anti-CD11c. Las celulas dendnticas se pre-incuban durante 1 h tanto con DCFDA 10 |iM, un derivado de la fluorescema usado como un indicador de la generacion de intermedios reactivos de oxfgeno, como con 10 |ig del peptido de SEC ID N°: 3. Despues de esto, se co-cultivan 105 celulas dendnticas con 2x105 celulas T CD4+ durante 2 h a 37 °C. El aumento de fluorescencia generado por la oxidacion de DCFDA por los productos intermedios reactivos de oxfgeno se lee en un Facs cerrado en celulas CD11 c(+). La produccion de especies reactivas de nitrogeno se evalua por la transcripcion aumentada de oxido mtrico sintasa inducida. De esta manera, 5x105 celulas dendnticas preparadas como se indica anteriormente a partir del bazo de ratones C57BI/6 se co-cultivan durante 6 h con 1o6 celulas T CD4+ y el peptido de SEC ID N°: 4. Las celulas se tratan despues con EDTA 2 mM en solucion salina con tampon fosfato enfriado para disociar las celulas T CD4+ de las celulas dendnticas. Las celulas dendnticas se purifican despues usando perlas magneticas recubiertas con anticuerpos anti-CD11 c y se analizan por RT-PCR para detectar presencia de transcritos de oxido mtrico sintasa.

Ademas, las celulas dendnticas y las celulas T CD4+ preparadas como se describe anteriormente se co-cultivan durante 12 h en presencia del peptido de SEC ID N°: 4. Despues se anade diacetato de DAF-FM 5 |iM (diacetato de amino-metilamino difluorescema) durante 30 minutos seguido de lavado de las celulas. Las celulas se analizan despues por citometna de flujo cerrada en las celulas CD11c(+). La presencia de productos intermedios reactivos de nitrogeno aumenta la fluorescencia generada por el DAF-FM.

Para evaluar las propiedades citolfticas de los clones de las celulas T CD4+ activadas por el peptido de SEC ID N°: 4, las celulas dendnticas se cargan con el peptido de SEC ID N°: 3 y se mezclan en una relacion 1/1 con las celulas T CD4+.

Despues de un periodo de incubacion de 18 h, las celulas dendnticas se analizan por citometna de flujo para la expresion de marcadores de apoptosis. De esta manera, se detecta la anexina V unida a la superficie de las celulas apoptoticas por la adicion de una anexina V marcada con fluorescencia.

EJEMPLO 3. Plasmodium falciparum

El Plasmodium falciparum es un parasito responsable de la malaria. La enfermedad se desarrolla despues de una picadura de mosquito. Los mosquitos infectados inyectan los esporozoitos de Plasmodium en la corriente sangumea, que se toman por los hepatocitos en los que se transforman en la forma de merozoito. Tras la lisis de los hepatocitos los merozoitos se toman por los eritrocitos, que da como resultado una hemolisis masiva.

No hay una vacuna satisfactoria disponible y la malaria es responsable de ± 1 millon de muertes al ano, a pesar del uso de los productos qmmicos a los que el parasito normalmente se vuelve resistente, tales como nivaquina.

Hay dos etapas en las que podna preverse la vacunacion (De Groot et al. (1989) J. Immunol. 142:4000-4005; Reece et al. (2004) Nature Med. 10:406-410). La prevencion podna obtenerse mejor si la forma de esporozoito del parasito se previniera de invadir los hepatocitos. La atenuacion de la enfermedad en curso se conseguina haciendo diana la forma de merozoito para prevenir la entrada a los eritrocitos. Los esfuerzos actuales en el desarrollo de vacunas se centran esencialmente en la prevencion. De esta manera, se ha considerado un numero de antfgenos de la forma de esporozoito para el diseno de la vacunacion espedfica (Good et al. (1988) J. Immunol. 140:1645-1650).

El antfgeno CSP (protema del circumsporozoito) es la protema predominante en la superficie del parasito. Es una protema que tiene una longitud de 120 restos de aminoacidos con una masa molecular de 58 kDa.

Se han identificado dos regiones que contienen epftopos de celula T promiscuos en el extremo carboxi-terminal de la protema. El epftopo (natural) Th2R se ha mapeado para los restos de aminoacidos 328-336 y corresponde a DKHIEQYLK (SEC ID N°: 5) que es un epftopo de celula T promiscuo reconocido por muchas cepas de raton incluyendo ratones H2d y ± el 50 % de los seres humanos. Este epftopo de celula T se modifica por la adicion de una secuencia de 4 aminoacidos que llevan un motivo consenso tiorredox del tipo CGHC, que genera un peptido de secuencia: CGHCDKHIEQYLK (SEC ID N°: 6; motivo consenso subrayado; epftopo de celula T modificado).

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Un segundo epftopo de celula T (natural), que ofrece mucho menos polimorfismo aunque mantiene la promiscuidad, abarca los residuos 380-388 dentro de la misma region del antfgeno CSP, la secuencia del cual es:

EKKICKMEK (SEC ID N°: 7). La adicion de un motivo consenso del tipo CGHC en el extremo amino-terminal de este epftopo de celula T genera un nuevo peptido de secuencia: CGHCEKKICKMEK (SEC ID N°: 8; motivo consenso subrayado; epftopo de celula T modificado).

En un ajuste experimental similar al descrito anteriormente para Mycobacterium tuberculosis (vease el Ejemplo 1), los clones de celulas T CD4+ generados por la inmunizacion de BALB/c con el peptido de SEC ID N°: 6 u 8, o ambos, se analizan por su capacidad de inducir la apoptosis de las celulas presentadoras de antigeno que presentan el peptido natural de SEC ID N°: 5 o 7, o los dos juntos.

Los experimentos paralelos demuestran que el contacto entre las celulas T citolfticas CD4+ y las celulas dendrfticas induce una senalizacion inversa que da lugar a la expresion de IDO. De esta manera, se co-cultivan 106 celulas dendrfticas pre-cargadas con el peptido de SEC ID N°: 5 o 7 con 2x106 celulas T CD4+ obtenidos a partir del bazo de ratones inmunizados con el peptido de SEC ID N°: 6 u 8, respectivamente. Despues de 8 h de incubacion, las celulas dendrfticas se separan de las celulas T CD4+ por tratamiento con solucion salina con tampon fosfato fna que contiene 2 mM de EDTA. Las celulas dendrfticas se separan de las celulas T CD4+ por clasificacion en perlas magneticas recubiertas con un anticuerpo espedfico anti-CD11c. Las celulas dendrfticas se analizan despues por transferencia Western para detectar la presencia de IDO (indolamina-2,3-dioxigenasa).

Para evaluar los papeles respectivos del IFN-gamma y del CTLA-4 en la induccion de la IDO, se realizan experimentos en presencia de 20 |ig/ml de un anticuerpo anti-IFN-gamma o bien en presencia de CD80 y CD86 recombinantes solubles (10 |ig/ml).

EJEMPLO 4. Virus de la gripe

El virus de la gripe, como cualquier otro virus, es un patogeno intracelular obligado. Se sabe bien que afecta a tres millones de personas cada ano por razones que se relacionan con su alto grado de contagio y su capacidad de mutar rapidamente, presentando inmunidad adquirida no operativa de un ano para otro. El virus lleva una morbilidad y una mortalidad muy significativas. Las estrategias de vacunacion actuales hacen uso de las protemas de superficie tales como la hemaglutinina y la neuraminidasa, que inducen altos tftulos de anticuerpos espedficos pero son bastante ineficaces produciendo celulas T citolfticas que eliminanan las celulas infectadas.

El antfgeno de la hemaglutinina lleva un numero de epftopos de celulas T que se presentan en el contexto de los determinantes del MHC de clase II y activan celulas T efectoras, que proporcionan ayuda para la produccion de anticuerpos espedficos.

De esta manera el peptido KYVKQNTLK (SEC ID N°: 9) abarca un epftopo (natural) de celula T CD4+ reconocido tanto por cepas de raton como por seres humanos. Este epftopo de celula T se modifica por la adicion de una secuencia de 4 aminoacidos que llevan un motivo consenso tiorredox del tipo CGHC, que genera un peptido de secuencia: CGHCKYVKQNTLK (SEC ID N°: 10; motivo consenso subrayado, epftopo de celula T modificada).

La administracion del peptido de SEC ID N°: 10 en la forma de una vacuna junto con un adyuvante tal como el alumbre se evalua para su capacidad de expandir las celulas T CD4+ que han adquirido propiedades citolfticas para las celulas infectadas por el virus de la gripe. Se analiza el efecto de los clones de celulas T CD4+ obtenidos por inmunizacion de ratones con el peptido de la SEC ID N°: 10 en la induccion de la apoptosis de las celulas presentadoras de antfgeno que presenta el peptido procesado de forma natural que corresponde a la SEC ID N°: 9.

Se usan metodos similares a los descritos anteriormente para Mycobacterium tuberculosis o para Plasmodium falciparum (Ejemplos 1-2) para analizar la induccion de la apoptosis de las celulas dendrfticas cargadas con el peptido de SEC ID N°: 9.

EJEMPLO 5. Leishmaniosis

Las infecciones por Leishmania son frecuentes y pueden adoptar diferentes formas, desde la forma cutanea benigna que se cura espontaneamente hasta formas viscerales tales como el kala azar. La enfermedad la causan flebotomos, que inyectan la forma de promastigoto bajo la piel. Este se toma por los macrofagos, en los que se multiplican en amastigotos, que pueden dispersarse por todo el cuerpo si no se desarrolla una inmunidad eficaz. La respuesta inmunitaria incluye la formacion de anticuerpos, pero estos no son protectores. La inmunidad eficaz depende de las respuestas celulares fuertes (Pingel et al. (1999) J. Exp. Med. 189:1111-1120; Gumy et al. (2004) Int. J. Parasitol. 34:433-444).

Los experimentos animales han ilustrado claramente la dependencia de la eliminacion del patogeno en la respuesta celular, al menos para Leishmania major. De esta manera, los ratones C57BI/6 (H2b) desarrollan una fuerte respuesta Th1 y son resistentes a la enfermedad, mientras que los ratones BALB/c (H2d) desarrollan una respuesta Th2 y son susceptibles a la enfermedad. El antfgeno LACK (quinasa c activada por Leishmania) de Leishmania major es central dirigiendo la respuesta inmunitaria. De esta manera, LACK posee 2 epftopos de celula T principales,

Claims (13)

1. 2.

   10 3.
2. 4.

   15
3. 5.
4. 6.

   20
5. 7.

   25
6. 8.

   30

   35 9.
7. 10.
8. 11.

   40
9. 12.
10. 13.
11. 14.

    REIVINDICACIONES

    Un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de celula T restringido a MHC de clase II de un antigeno de un virus y (ii) un motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST], en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o esta separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos, y en el que la secuencia de aminoacidos de dicho antfgeno no comprende una secuencia de motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST] dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal de dicho epftopo en dicho antfgeno,

    para su uso en la prevencion o en el tratamiento de una infeccion viral por dicho virus.

    El peptido de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el motivo es C-X(2)-C.

    El peptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una

    infeccion viral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho virus es un virus de ADN bicatenario, un

    virus de ADN monocatenario o un virus de ARN.

    El peptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una

    infeccion viral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste

    en herpesviridae, picornaviridae y flaviviridae.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion viral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho conector consta como mucho de 4 aminoacidos.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion viral de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho peptido inmunogenico comprende adicionalmente una secuencia de direccionamiento endosomico.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion viral de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que

    - al menos una X en dicho motivo C es Gly, Ala, Ser o Thr, o

    - en el que al menos una X en dicho motivo C es His o Pro, o

    - en el que al menos una C en dicho motivo esta metilada.

    Un metodo para obtener una poblacion de celulas T CD4+ citotoxicas contra un antigeno viral, comprendiendo el metodo las etapas de:

    - proporcionar celulas de sangre periferica;

    - poner en contacto dichas celulas in vitro con un peptido inmunogenico que comprende (i) un epftopo de celula T de dicho antfgeno viral y (ii) un motivo CST-(X)2-C o C-(X)2-CS, en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o esta separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos; y

    - expandir dichas celulas en presencia de Interleucina 2 (IL-2).

    El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el motivo de dicho peptido es C-X(2)-C.

    El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en

    herpesviridae, picornaviridae y flaviviridae.

    Una poblacion de celulas T CD4+ citotoxicas contra un antfgeno viral obtenible por el metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que dichas celulas tienen la capacidad de inducir apoptosis en las celulas que presentan antfgeno, de producir IFN-gamma y de expresar CTL-4.

    Una poblacion de celulas T CD4+ citotoxicas, de acuerdo con la reivindicacion 11, contra un antfgeno de un virus, para prevenir o tratar una infeccion viral por dicho virus.

    Un peptido inmunogenico aislado que comprende un epftopo de celula T de un antfgeno viral y un motivo [CST]-(X)2-C o C-(X)2-[CST], en el que dicho motivo esta inmediatamente adyacente a dicho epftopo o separado de dicho epftopo de celula T por un conector de como mucho 7 aminoacidos, en el que la secuencia de aminoacidos de dicho antfgeno no comprende una secuencia de motivo [CST]-(X)2-C o C- (X)2-[CST] dentro de una secuencia de 11 aminoacidos en el N o C terminal de dicho epftopo en dicho antfgeno.

    El peptido de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que el motivo es C-(X)2-C.

12. 15.

    El peptido de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que dicho conector consta como mucho de 4 aminoacidos.

13. 16.

    El peptido de acuerdo con las reivindicaciones 14 o 15, en el que el virus es un virus de ADN bicatenario, un virus de ADN monocatenario o un virus de ARN.

    5 17.

    El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en herpesviridae, picornaviridae y flaviviridae.