JP2004527263A

JP2004527263A - 免疫抑制活性を有するエクスビボ単離ｃｄ２５＋ｃｄ４＋ｔ細胞とその使用

Info

Publication number: JP2004527263A
Application number: JP2003500238A
Authority: JP
Inventors: ロンカローロ、マリア、グラツィア; レヴィングス、メーガン
Original assignee: フォンダツィオーネテレソン
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2004-09-09
Also published as: EP1409650A1; US20040173778A1; ATE323151T1; US20090010950A1; EP1409650B1; DE60210623D1; WO2002097070A1; DE60210623T2

Abstract

エクスビボ単離したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ制御性細胞、それに由来するＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローン、クローンを単離する方法、並びに免疫調節剤、免疫抑制剤としての、および免疫応答を調節する分子の同定のためのエクスビボ単離されたヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞もしくは細胞クローンの使用。

Description

【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、エクスビボ単離したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ制御性（Ｔｒ）細胞、それに由来する増強された抑制活性を有する均一なクローン集団、並びに免疫応答の制御におけるかつサプレッサーＴ細胞特異的分子の同定と性状解析のための、これらの使用を提供する。さらに詳しくは、本発明は、免疫応答の下方制御／抑制が必要な症状（例えば、移植片対宿主反応病（ＧｖＨＤ）、臓器拒絶、遺伝子治療および自己免疫疾患）を予防もしくは治療するための、または免疫応答の制御に関与する分子の同定と性状解析のための、ポリクローナルＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞もしくはエクスビボで産生された均一なクローンＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｔ制御性（Ｔｒ）細胞は、自己抗原および無害な外来抗原に対する免疫寛容の維持に重要な役割を有する。Ｔｒ細胞の多くのサブセットが開示されており、その個体発生、機能および作用機序の理解において、最近大きな進展があった（（１）に総説されている）。一部のＴｒ細胞は、サイトカインを産生せず、直接的な細胞−細胞間接触を必要とする機構によりＴ細胞応答を抑制する（２、３）。他のサブセットのＴｒ細胞は、免疫制御サイトカイン(例えば、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）を産生し、少なくとも一部はこれらのサイトカインの作用を介してその抑制機能を発揮する（４〜８）。
【０００３】
ＩＬ−２Ｒ α鎖（ＣＤ２５）を構成的に発現するＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、マウスで同定されている（（２，３）に総説されている）。これらのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、インビトロとインビボの両方で顕著な抑制能力を示す。これらのＴｒ細胞の移送は、実験的に誘導された自己免疫疾患（例えば、甲状腺炎、胃炎、インスリン依存性糖尿病および結腸炎）（９〜１２）および実験的に誘導されたＧｖＨＤ（３１）の病状を緩和させ、一方ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の枯渇は、全身性自己免疫疾患の発症を引き起こす（１１、１３、１４）。
【０００４】
マウス（Ｍｕｒｉｎｅ）のＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、抗ＣＤ３ｍＡｂでインビトロで刺激するとアネルギー性であるが、外因性ＩＬ−２を添加すると増殖する（１５、１６）。ＴＣＲ介在性の刺激後、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、細胞−細胞間接触を必要とし、かつ多くの系で免疫抑制サイトカイン（１５、１６）の産生に非依存的である機序を介して、抗原非特異的（１６、１７）に、他のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性化と増殖を抑制する。マウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）（９）［Ｔ細胞活性化の負のレギュレーターであり、この分子の発現は、これらの細胞がインビボで免疫応答を抑制する能力に必要である（１０、１８）］を構成的に発現する。さらに、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＡＰＣ上のＣＤ８０とＣＤ８６の発現を下方制御することにより作用する（１９）が、一部の報告書は、その抑制活性にＡＰＣは必要ではないことを示唆し、直接的なＴ−Ｔ細胞相互作用が関与することを示している（１７）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の説明）
本発明は、免疫抑制作用を有するヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を末梢血から単離でき、機能を喪失することなくインビトロで増大することができるという知見、およびヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、それから抑制もしくは非抑制の活性を示す異なる細胞クローンを誘導することができ、かつＣＤ２５の発現に基づいて単離できる不均一集団を構成するという知見に基づく。単離されたヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞およびＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンは、免疫応答の低下が望まれる病態の予防または治療のために免疫抑制剤として使用することができる。典型的にはこれらは、ＧｖＨＤ、臓器拒絶、遺伝子治療中に導入された外来タンパク質に対する免疫応答、および自己免疫疾患（特に１型糖尿病）を予防するのに使用されるであろう。末梢血から単離されたＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、インビトロで刺激し培養することができ、抗原特異的サプレッサーＴ細胞を選択し増大する可能性を実現する。増大されたＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、インビトロでその制御能力を維持しているため、インビトロでＴ細胞応答を制御するのに使用することができる。一方、新たに単離したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞およびインビトロで増大したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、いずれもインビボでの治療に使用することができる。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の単離とインビトロでの増大のための方法と条件は、材料と方法欄に詳細に記載されている。
基本的には、新たに単離したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を、以下の条件における１以上の条件でインビトロで増大することができる：
支持細胞混合物との同時培養、ポリクローナル刺激、抗原特異的刺激、サイトカインの添加。
【０００６】
こうして得られるＴ細胞は、患者に再導入することができる。治療または予防でＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が使用される好適な態様は、予防／治療する特定の条件に依存するであろう。
【０００７】
例えば、ＧｖＨＤを予防するために、骨髄ドナーの白血球除去血輸血（Ｌｅｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）からＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒを単離し、必要であれば凍結し、移植時、移植前、または移植後に受容者に投与することができる。あるいは、宿主特異的応答をインビボで特異的に抑制するアロ抗原特異的ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を作成し増大するために、ドナーからのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を、インビトロで宿主ＡＰＣで刺激することができる。
【０００８】
臓器拒絶を予防／治療するために、受容者からＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を単離し、必要であれば凍結し、移植時、移植前、または移植後に受容者に投与することができる。あるいはＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を、問題の臓器からの組織と同時培養し、それによって間接経路を介して外来抗原を提示する自己ＡＰＣを用いて、インビトロで刺激することができる（３２）。生じるＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞株は、移植された臓器により発現される抗原に特異的であり、臓器特異的応答をインビボで抑制するのに使用できるであろう。
【０００９】
自己免疫疾患を予防するために、自己ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の大きな集団を単離し再注入することができる。あるいは、自己ＡＰＣおよび疾患の標的である組織から得られる自己抗原を用いて刺激することにより、抗原特異的ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞をインビトロで増大することができる。インビトロで増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を再投与することにより、これらの細胞は、抗自己応答をインビボで抑制するであろう。
【００１０】
遺伝子治療における免疫応答を予防するために、受容者からＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を単離し、治療ベクターによってコードされる抗原に特異的な細胞を、導入遺伝子を発現する形質導入自己抗原提示細胞で刺激することにより、インビトロで増大することができる。これらの細胞は必要であれば凍結し、後に遺伝子治療の時に投与することができる。
【００１１】
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ抑制性細胞の均一クローン集団は、上記の治療応用に有効に使用される。
抑制性ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒクローンの単離法は、基本的に
ａ）ＰＢＭＣからＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製する工程；
ｂ）ＣＤ２５^-Ｔ細胞からＣＤ２５⁺を分離する工程；
ｃ）限界希釈によりＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞をクローン化する工程；
ｄ）ＩＬ−２の存在下で、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）または抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激する工程；
ｅ）ＣＤ２５の構成的高発現を示す細胞クローンを選択する工程
を含む。
【００１２】
工程（ａ）に従って、抗ＣＤ４抗体結合マイクロビーズを用いて陽性選択によりＣＤ４⁺細胞を精製することができる。工程（ｂ）は、標識した抗ＣＤ４／２５モノクローナル抗体を使用してＣＤ２５⁺細胞をマークし、ＦＡＣＳソーティング解析によりＣＤ２５⁺細胞を精製することにより実施することができる。工程（ｃ）で得られたクローンは、５％プールヒト血清または自己ヒト血清を補充したＸ−ｖｉｖｏ１５培養培地もしくは他の細胞培地で維持することができるが、支持細胞混合物との同時培養により、抗原もしくはサイトカインにより、再刺激することが好ましく、放射線照射したＰＢＭＣからなる同種異系もしくは自己の支持細胞混合物により、放射線照射した自己もしくは同種異系のＥＢＶ形質転換細胞株（例えば、ＪＹ）と共にまたは無しで再刺激することがさらに好ましい。
【００１３】
ＣＤ２５の構成的高発現を示す抑制性クローンは、工程（ｄ）に従って、
ＩＬ−２の存在下での植物性血球凝集素もしくは抗ＣＤ３ｍＡｂによる刺激の少なくとも１０日後の休止期における、ＣＤ２５発現に関する１００％の一定の陽性率；
ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞から平行して単離されたＴ細胞クローン、またはＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞から単離された非抑制性クローンと比較して、有意に高いレベルでのＣＤ２５の発現
という特徴に基づいて選択することができる。
【００１４】
工程（ａ）〜（ｄ）の終了時、ＣＤ２５を構成的に発現し、アネルギー性で、かつ高い抑制能力を有する、均一なＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンが単離される。抑制性クローンは、非抑制性クローンと比較して、ＴＧＦ−βの多量の産生とＩＬ−２産生の欠如という特徴を有する。
【００１５】
さらなる実施態様において本発明は、ＣＤ２５を構成的に発現する、単離されたＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞および／またはＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローン、並びに任意の他の活性物質（例えばサイトカイン）または他の免疫抑制タンパク質を含有する、免疫抑制剤を提供する。この免疫抑制剤は、安定化された細胞調製物の形態のものが好ましい。
【００１６】
企図された臨床的応用以外に、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞抑制性クローンは、免疫応答を調節物質する分子、特にサプレッサーＴ細胞特異的分子の同定のためのインビトロ系を確立するのに使用することができる。好適な実施態様において、かかるＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンは、大規模な遺伝子発現アレイ、ディファレンシャルプロテオミクススクリーニング、およびＣＤ２５を構成的に発現するＴｒ細胞に特異的なモノクローナル抗体の作成において、使用されるであろう。これらの応用は、クローン性起源の細胞集団により提供されるような、比較試料の均一性により非常に助長される。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
ヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞の単離と細胞表面表現型
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ヒトＰＢＭＣ中に存在する。これらは平均して、総ＰＢＭＣの３．０％（範囲１．６〜４．４％、ｎ＝６）、およびＣＤ４⁺Ｔ細胞の１２．８％（範囲９．８〜１８．１％）である。これらの細胞は、９０％を越える純度で容易に単離することができる（図１Ａ）。新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の大部分（８２±５．１％）もまた、ＣＤ４５ＲＯを発現し、ＨＬＡ−ＤＲを発現するＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の割合は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺集団中より有意に高かった（１７．３±４．９％対６．４±２．９％、ｎ＝６）（図１Ｂ）。さらに、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞と比較して、より高レベルのＩＬ−２Ｒβを発現（６１．９±２．６％対３３．１±２．５％、ｎ＝５）（図１Ｃ）し、新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞のサブセットは、ＣＴＬＡ−４を発現した（８．４±１．６％、ｎ＝６）（図１Ｅ）。これに対してＩＬ−２ＲγとＣＤ６２Ｌの発現は、両方のＴ細胞集団で同等であった。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞とＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＣＤ３⁺ＴＣＲαβ⁺であった。すなわち、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、マウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞と同様に、記憶Ｔ細胞と低構成的レベルのＣＴＬＡ−４に特徴的なマーカーを発現する（９、１０、１５、１７、１８）。
【００１８】
ＴＣＲ介在刺激後に、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞と比較してより低レベルの活性化マーカーを発現した。ＣＤ４０Ｌ+ 細胞の比率は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞中で１７．３±２．３％であるのに対し、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞サブセット中で２８．４±１．８％（ｐ０．００５）であった。一方、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の３０．９％±７．０％がＣＤ６９を発現したのに対してＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の５４±９．１％がＣＤ６９を発現した（ｐ０．００６）（図１Ｄ）。経時変化実験は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞上のＣＤ４０ＬとＣＤ６９のレベルの低下は、変化した発現動態が原因ではないことを証明した。ＰＭＡとカルシウムイノノフォアで活性化した後は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞またはＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞細胞上のＣＤ６９またはＣＤ４０Ｌの発現の間に統計的に有意な差はなかったが、一般により少ないＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞がＣＤ４０Ｌを発現した。
【００１９】
抗ＣＤ３ｍＡｂ、またはＰＭＡおよびカルシウムイノノフォアで活性化後、ＣＴＬＡ−４を発現するＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の割合は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合より高かった。さらに、ＣＴＬＡ−４発現レベルは、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞で約３倍高かった（図１Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＴＣＲ活性化によりヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、ユニークであり他のＣＤ４⁺Ｔ細胞サブセットとは異なる表面分子発現プロフィールを有することを示している。
【００２０】
増殖とヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞によるサイトカイン産生
新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂに応答して増殖することはなく、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂの添加により、その増殖がわずかにかつ不定的に上昇した。これに対して、架橋した抗ＣＤ２８ｍＡｂは、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の非応答性を完全にＴＣＲ活性性に逆転させた。外因性ＩＬ−２の添加は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の増殖を抗ＣＤ３ｍＡｂに応答して部分的に回復させ、増殖は可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂによりさらに増強された（図２Ａ）。これらの結果は、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、ＴＣＲ介在性の活性化後における増殖能において特異的な欠陥を有することを示す（１５、１６）。
【００２１】
ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を、サイトカインを産生する能力について分析した。可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂと共にまたは無しで、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した後、検出可能なレベルのＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＴＧＦ−βまたはＩＦＮ−γは測定できなかった。これに対して、外因性ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激すると、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βを産生した（表１）。これらの刺激条件下でＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞に相当するサイトカインプロフィールを有した。
これに対して、同種異系のＡＰＣで活性化した後にサイトカイン産生の差が観察された。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺およびＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の両方とも、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＩＦＮ−γを産生したが、ＩＬ−４を産生しなかった。しかし、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺およびＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞集団の顕著な差は、ＣＤ２５⁺細胞はＩＬ−２を分泌できないことであり、これらの細胞がＩＬ−２の産生において特異的な欠陥を有することを示している。興味深いことにＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、アロ抗原刺激により、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞より一環して少ないＩＦＮ−γを産生した。
【００２２】
ヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞は、アロ抗原に対するナイーブ（ naive ）ＣＤ２５ ^- ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞の増殖応答を抑制する
我々は、アロ抗原に対するナイーブＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖応答を抑制する能力を試験することにより、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の制御性を調べた。ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を同種異系のＡＰＣで刺激し、自己ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を加えてその数を増加した。わずか２，５００個のＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を５０，０００個のＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞に添加すると、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖が低下した。１：１の比で、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ナイーブＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、平均７５．０±２．９％阻害した（ｎ＝９）（図２Ｂ）。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞自体は、アロ抗原に応答して増殖することはなかった。さらにＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＡＰＣの存在下でＰＨＡに応答して（平均８１．２±５．０％、ｎ＝６）、および固定化抗ＣＤ３単独に応答して（平均７９．４±１４．６％、ｎ＝３）、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖を抑制した。これらの後者のデータは、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、マウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞（１７）と同様に、Ｔ細胞に直接的な抑制作用を有し、ＡＰＣに非依存的であることを示す。さらにＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、抗ＣＤ３ｍＡｂまたは同種異系のＡＰＣで活性化したＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞によるＩＦＮ−γとＩＬ−２の産生を抑制した。
【００２３】
この抑制活性がＣＤ２５をインビボで構成的に発現するＴ細胞の固有の性質であることを証明するために、我々は、インビトロでの活性化後にＣＤ２５を発現したＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞が制御作用を示すかどうかを試験した。この目的のために、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８ｍＡｂで活性化し、４８時間後、ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を単離し、新たに単離した自己ＣＤ２５^-Ｔ細胞を抑制する能力について試験した。図２Ｃに示すように、インビトロ活性化後にＣＤ２５⁺になったＴ細胞はアロ抗原に応答して増殖し、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の応答を抑制するよりむしろ増強した。これらのデータは、Ｔ細胞増殖の阻害が、ＣＤ２５をインビボで構成的に発現する細胞のユニークな性質であることを示す。
【００２４】
いくつかの試験は、一部のＴｒ細胞（例えば、１型Ｔｒ細胞（Ｔｒ１）とＴｈ３細胞）が、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを産生し、これらのサイトカインの産生を介する免疫応答を抑制することを示す（４〜８）。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、同種異系ＡＰＣで刺激するとＩＬ−１０とＴＧＦ−βの両方を産生したため（表１）、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞による同種異系応答の阻害に対するこれらのサイトカインの役割を調べた。
図２Ｄに示すように、中和性抗ＩＬ−１０Ｒまたは抗ＴＧＦ−β ｍＡｂの添加は、アロ抗原に応答してＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖を抑制するＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の能力に有意な作用を及ぼさなかった。３つの独立した実験において、１０μg/mlの対照ＩｇＧの存在下で平均６７．２±６．０％、１０μg/mlの抗ＩＬ−１０Ｒで６３．８±５．８％、および１０μg/mlの抗ＴＧＦ−β ｍＡｂで６９．０±３．４％の抑制が観察された。５倍高濃度の抗ＴＧＦ−β ｍＡｂを用いて、同様の結果が得られた。抗ＩＬ−１０Ｒと抗ＴＧＦ−β ｍＡｂの両方の添加により、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞により仲介される抑制の小さく統計的に有意ではない逆転を生じた（６７．２±６．０％から５２．４±５．７％、ｐ０．０６）。
【００２５】
ＣＤ２８を介するシグナルに影響を与えることなくＣＤ８０／８６に結合するＣＴＬＡ−４の能力を特異的に阻止する抗体からのＦ(ab')2断片は、Ｔｒ１細胞によるＴＧＦ−βの産生を阻害することがすでに証明されている（２０）。同じ遮断抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂの添加は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の抑制活性に有意な作用はなかった。これらのデータは、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が高レベルのＣＴＬＡ−４を発現するという結果にもかかわらず（図１Ｅ）、この分子がＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の抑制活性に必要ではないことを示唆する。
【００２６】
ヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞はインビトロで増大できる
我々はすでに、クローン化されておりインビトロで増大されているヒトＴｒ１細胞が、その制御活性を維持していることを証明している（６）。Ｔｒ１細胞について記載したものと同様のプロトコールを使用して、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が増大できるかどうかを測定した。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、抗ＣＤ３抗体単独に応答して増殖はしなかった（図２Ａ）が、同種異系の支持細胞混合物と外因性ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３ｍＡｂで活性化すると、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞と類似の増大が得られた（１４日目に２０〜３０倍の上昇）。インビトロで増大したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、１ヶ月以上培養した後でもＣＤ２５が陽性であった（図３Ａ）。これに対して、すべてのＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、活性化後にＣＤ２５を発現したが、発現は経時的に徐々に減少した。ＣＤ２５の持続的発現はまた、インビボで活性化したマウスのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞で観察されている（２１）。
【００２７】
新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞と同様に、抗ＣＤ３ｍＡｂで活性化後にＣＤ４０Ｌを発現するインビトロで増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の比率は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞に比較して一貫して小さかった（１２．７±３．３％対３６．９±８．３％、ｐ０．０１）。しかし、新たに単離した細胞と比較して、培養したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ポリクローナルＴＣＲ介在性の活性化後に、正常レベルのＣＤ６９を発現した（図３Ｂ）。すなわち、ＣＤ４０Ｌの上方制御の減縮はまた、増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の特徴でもある。予測されるように、培養ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺およびＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＰＭＡとカルシウムイノノフォアで活性化後に、同様のレベルのＣＤ４０ＬとＣＤ６９の両方を発現した。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞のインビトロ増大は、ＣＴＬＡ−４の構成的発現を変化させず、これらは、この阻害性分子を、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺分子の対応分子より有意に高いレベルで発現し続けた（図３Ｃ）。
【００２８】
インビトロ増大ＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞は、アネルギー性を維持し、その抑制能を保持する
インビトロで増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、抗ＣＤ３ｍＡｂ単独に応答して増殖はせず、その増殖は、外因性ＩＬ−２の添加によってのみ完全に回復した（図４Ａ）。さらに培養ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、アロ抗原に応答して増殖はせず、自己ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を保持した（１：１の比で、平均６４±３．８％（ｎ＝３）の抑制が観察された）（図４Ｂ）。これらのデータは、インビトロで増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、その制御機能を維持し、新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞と同様の挙動をすることを示す。この実験において、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺反応Ｔ細胞は、あらかじめ活性化されインビトロ増大されているので、これらのデータは、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、新たに単離したナイーブＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の応答のみではなく、あらかじめ活性化した記憶ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の応答も抑制することを証明している（図４Ｂ）。最後に、新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を用いた観察結果と同様に、インビトロで増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞により仲介される抑制は、中和性抗ＩＬ−１０Ｒ、抗ＴＧＦ−βまたは抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂの添加によって逆転されなかった（図４Ｃ）。
【００２９】
本研究において我々は、インビボでＣＤ２５を発現するヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞がＴｒ細胞のユニークなサブセットであることを示す。ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、マウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞について記載されている（２，３）ように、アネルギー性であり、ＩＬ−２を産生せず、ＣＴＬＡ−４を構成的に発現し、そしてナイーブＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖を抑制する。さらに、ポリクローナルＴＣＲ介在性の活性化後、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＣＴＬＡ−４を強く上方制御し、ＣＤ４０Ｌの発現低下を示し、サイトカインを産生する。ＣＤ２５とＣＴＬＡ−４は、インビトロで増大したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞上で構成的に発現され続け、一方、活性化後、ＣＤ４０Ｌの上方制御は依然欠陥したままである。さらに興味深いことに、インビトロで増大したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、あらかじめ活性化した記憶Ｔ細胞に対しても強力な抑制活性を保持する。機能性Ｔｒ細胞がインビトロで増大でき、記憶Ｔ細胞の応答を制御することができるという観察結果は、Ｔ細胞介在疾患における細胞性治療法としてのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の使用について、重大な臨床的関連性を有する。
【００３０】
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞により仲介される抑制において、免疫制御性サイトカインの役割は、依然、未解決の問題である。アロ抗原活性化ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は増殖しなかったが、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βを産生し、実際Ｔｒ１細胞のサイトカイン産生プロフィール（すなわち、ＩＬ−１０＋ＩＦＮ−γ＋ＴＧＦ−β＋ＩＬ−４−ＩＬ−２−／低）に相当するプロフィールを有した（６）。しかし我々は、中和性抗ＩＬ−１０Ｒと抗ＴＧＦ−β ｍＡｂの両方の存在下で、抑制のわずかな逆転を観察し、これは、ＩＬ−１０とＴＧＦ−βの産生がＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の制御機能にとって重要ではないという以前の観察結果と整合する（１５、１６）。他方、実験的に誘導された結腸炎のマウスモデルにおいて、ＩＬ−１０とＴＧＦ−βの両方が、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞により仲介される抑制に必要であることが示されている（５、１０）。ＩＬ−１０とＴＧＦ−βの関与におけるこの矛盾の理由は不明である。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、ＩＬ−１０とＴＧＦ−βを産生する能力を有するが、これらのサイトカインの産生は、これらの成熟状態と、これらが活性化される環境とに依存することがある。
【００３１】
以前の報告は、マウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞がその抑制効果を発揮するのに、直接的な細胞−細胞間接触が必要であることを証明した（１５、１６）。ＣＴＬＡ−４の構成的および持続的な発現にもかかわらず、抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂは、ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の抑制活性を排除しなかった。これらのデータは、ＣＴＬＡ−４を介するシグナルがマウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞によるインビトロの抑制に重要ではないことを示す研究に一致する（１５）。しかし、より最近の報告は、ＣＴＬＡ−４の発現がこれらの細胞に仲介される抑制に必須であることを示す（１０、１８）。増殖の抑制は、刺激と微小環境に依存して異なる機構により作動するか、またはヒトおよびマウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が異なる機構により作用する可能性がある。最後に、マウスＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が転写レベルでＩＬ−２産生を抑制したように、抑制は、ＩＬ−２の消費だけが原因ではない（１５）。さらに、インビトロ活性化後にＣＤ２５を発現したヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞の応答を抑制せず、ＣＤ２５の高発現が単純にＩＬ−２の隔絶を生じないことを示している。
【００３２】
ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、インビトロで増大し、そのユニークな細胞表面マーカープロフィールと抑制機能を維持する。我々の知る限り、これらのデータは、ヒトＴサプレッサー細胞株のインビトロ増大の最初の報告である。
【００３３】
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ制御（Ｔｒ）細胞の臨床的使用は、多くの病態で好ましくない免疫応答を下方制御することであると考えられる。我々は、抑制機能を有するＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、末梢血から容易に単離できることを証明した。重要なことは、これらの細胞がインビトロで刺激し培養することができ、抗原特異的サプレッサーＴ細胞を選択し増大する可能性を可能にすることである。増大されたＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞は、インビトロで制御能を維持するため、インビトロでＴ細胞応答を制御するのに使用することができるであろう。
【００３４】
抑制能を有するヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞の単離とクローンレベルでの性状解析
ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞（２２）とＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞（２３、２４）の関係を調べるために、我々は、クローンレベルでＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の単離を試みた。ＣＤ４⁺でありＣＤ２５⁺率の高い末梢血単核細胞のわずかに約０．８％のみがインビトロで抑制能を有することが、すでに開示されている（２５）。従って、末梢血からＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製し、ＦＡＣＳソーティング解析により、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の約２．９％（このドナーでは総末梢血の０．６％）であるＣＤ２５^brightＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製した。生じたＣＤ２５^-とＣＤ２５^bright集団は、それぞれ９９％と９８％の純度であった（図５）。次いで、精製した細胞を、限界希釈により１細胞／ウェルにクローン化し、材料と方法で記載され、すでに記載されているのようにして（２６）、ＰＨＡと同種異系の支持細胞混合物で刺激した。８日後、各クローニングを行なった１つの９６ウェルプレートを、一晩チミジンを適用して、増殖しているウェルの数（クローニング効率）を測定した。ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞のクローニング効率は４２％であり、一方ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、わずか１０．２％の有意に低い効率を有した。１４日後、１２０個のＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンを取り上げ、再刺激して分析のために増大した。
【００３５】
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の決定的な特徴の１つは、ＣＤ２５の構成的かつ高い発現であるため、我々は、再刺激（休止期に）の少なくとも１０日後にＣＤ２５の発現についてＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンをスクリーニングした。図６に示すように、クローンはＣＤ２５について異種の発現を示した。約半分のクローンはＣＤ２５が９９〜１００％陽性であり、比較的高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有した。他のクローンは、多数のＣＤ２５^-細胞とより低いＭＦＩを有した。Ｔ細胞クローン由来ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、休止期に低率のＣＤ２５⁺細胞を示し、従って低いＭＦＩも示した。
【００３６】
次に、クローンを外因性ＩＬ−２の非存在下または存在下で、ＴＣＲを介する活性化に応答して増殖する能力について試験した。マウスとヒトのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞はいずれも、ＣＤ２８を介する同時刺激および／またはＩＬ−２の添加の欠如下、αＣＤ３ｍＡｂに応答して増殖しなかった（２３、２４、２６）。これがクローンレベルでも真実かどうかを調べるために、ＩＬ−２の存在下または非存在下で増殖する能力について、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンを試験した。ＣＤ２５の発現に関し観察された不均一性と同様に、クローンはまた増殖に関しても不均一であった。大多数のクローン（５８／７２、８０％）はアネルギー性であり、αＣＤ３ｍＡｂに応答して増殖はしなかったが、ＩＬ−２の存在下では首尾よく増殖した。残りのクローン（１４／７２、２０％）は、ＩＬ−２の非存在下であってもαＣＤ３ｍＡｂに応答して首尾よく増殖した。試験した７２クローンの代表的サブセットを図７に示す。
これに対して、試験したＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンの中で、大半（１４／２２、６５％）は、αＣＤ３ｍＡｂ単独に応答して首尾よく増殖した。
【００３７】
ＣＤ２５の発現と増殖についてのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンの不均一性は、ＰＢＭＣの０．６％のＣＤ２５^brightＣＤ４⁺Ｔｒ細胞集団中でさえ、必ずしもすべての細胞がサプレッサー細胞ではなく、一部は活性化Ｔヘルパー細胞であることを示唆する。この仮説を検定するために、我々はインビトロ抑制アッセイを行った。実際、図８に示すように、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンのわずかなサブセットのみが、Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣに架橋したαＣＤ３ｍＡｂ（８Ａ）またはプラスチック上に固定化されたαＣＤ３ｍＡｂ（８Ｂ）に応答して、自己ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖応答を抑制することができた。興味深いことに、アネルギー性でＣＤ２５の構成的高発現を示したクローンのみが、抑制性表現型を有した。試験したすべてのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンからのデータをまとめ、クローンを抑制群と非抑制群とに分離すると、ＣＤ２５の発現は、抑制活性を有する群で有意に高い（ｐ＜０．０００００７）ことがわかった（表２）。これに対して、非抑制群内のいくつかのクローンはアネルギー性であったため、αＣＤ３ｍＡｂに応答する増殖は、あまり信頼できない抑制能予測因子であった。これらのデータは、ＣＤ２５の構成的高発現は、クローンレベルでのＣＤ４⁺Ｔ制御細胞のマーカーであることを示す。
【００３８】
我々はまた、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンのサイトカイン産生プロフィールを調べた。表３に示すように、非抑制性クローンは、サイトカイン産生のＴｈ０パターンを有する傾向があり、試験したほとんどのサイトカインを中程度のレベルで産生した。これに対して、抑制活性を有するすべてのＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンは、多量のＴＧＦ−β、少量かつ不定量のＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを産生したが、検出可能なレベルのＩＬ−２やＩＬ−１０を産生しなかった。これらのデータは、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ制御細胞が、ＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞とは区別し得ることを示すが、これらが、分化段階が異なる同じ細胞であることは否定できない。すべての抑制性ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンの上清中で一貫して検出された唯一のサイトカインがＴＧＦ−βであるという事実は、当初経口寛容モデルで開示されたＴＧＦ−β産生Ｔｈ３細胞に、抑制性ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンが関連する可能性が高いことを示唆する（２７、２８）。
【００３９】
（表）
表１．ＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞によるサイトカイン産生。
精製細胞を指摘のように刺激し、２４時間（ＩＬ−２について）または７２時間後に上清を採取した。サイトカインの量はＥＬＩＳＡにより測定した。データは、４つの独立した実験からプールしたデータの平均値（pg/ml）である。同種異系のＡＰＣによるサイトカイン産生は差し引いてある。

【００４０】
表２．抑制性ＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞クローンは非抑制性クローンとは異なる表現型を有する。詳細に性状解析したすべてのＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞クローンの表現型の要約。
抑制パーセントは、指摘のＴ細胞クローンの存在下での、プラスチックに固定化したかまたはＴ細胞枯渇ＡＣＰ上の、αＣＤ３ｍＡｂで活性化した自己ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖低下の平均値で示す。数字は、２〜６個の独立した実験で観察された抑制の平均を示す。ＭＦＩは、２〜６個の独立にした試験で測定したＣＤ２５の発現の平均を示す。cpm は、プラスチックに固定化されたαＣＤ３ｍＡｂで活性化した後に取り込まれたチミジンの量を示す。数字は、単一の試験での二重測定の平均であり、いくつかの以後の試験で得られた結果の代表値である。

【００４１】
表３．ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンのサイトカイン産生プロフィール。Ｔ細胞クローンをαＣＤ３とαＣＤ２８ｍＡｂで活性化し、２４時間（ＩＬ−２について）または４８時間後に上清を採取した。上清中のサイトカインの量は、材料と方法に記載されているように、捕捉ＥＬＩＳＡおよび／またはＣＰＡ測定法で測定した。

【００４２】
（材料と方法）
１．ヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞の単離と性状解析
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の精製。
倫理委員会の認可に従って、健常ドナーからヒト末梢血を得た。フィコール−ハイパーク勾配（Nycomed Amersham、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）での遠心分離によりＰＢＭＣを調製し、ＣＤ４⁺MultisortキットまたはUntouched ＣＤ４⁺Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotech、グラドバッハ（Gladbach）、ドイツ）を用いて、それぞれ陽性選択または陰性選択（ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６およびＣＤ５６陽性細胞の枯渇により）により、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞の単離後、ＣＤ２５⁺細胞をＰＥ結合抗ＣＤ２５ｍＡｂで染色し、抗ＰＥ結合磁性ビーズ（Miltenyi Biotech）を添加後に精製した。あるいは、ＦＡＣＳ分析を促進するために、抗ＣＤ２５（Miltenyi Biotech）に直接結合した磁性ビーズを用いて、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製した。陰性もしくは陽性の選択により単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を用いて得られた結果と、直接または間接に結合したＣＤ２５ｍＡｂを用いて得られた結果は、同一であった。２×１０⁸のＰＢＭＣから出発して、典型的には、純度が９０〜９５％の２〜３×１０⁶のＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を単離した。純度が７０〜９０％のＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞も採取した。ＣＤ２５^-細胞のインビトロ活性化後のＣＤ２５⁺細胞の精製のために、固定化抗ＣＤ３（１０μg/ml）と可溶性抗ＣＤ２８（１μg/ml）ｍＡｂを用いてＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を４８時間活性化し、ＣＤ２５⁺Ｔ細胞を上記したように精製した。
【００４３】
Ｔ細胞株のインビトロ増大。
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺またはＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を上記したように単離した。Ｔ細胞（２×１０⁵細胞／ml）を、上記したように（２９、３０）、１×１０⁶ＰＢＭＣ／ml（６０００RADSを照射）および１×１０⁵ＪＹ細胞／ml（１０，０００RADSを照射）、高レベルのＨＬＡおよび同時刺激分子を発現するＥＢＶ−ＬＣＬ、並びにサイトカインからなる同種異系の支持細胞混合物の存在下で、抗ＣＤ３（１μg/ml）（ＯＫＴ３、Orthoclone、ヤンセンシラグ（Jansen Cilag）、イタリア）で刺激した。すべての培養は、１０％ＦＣＳ（Mascia Brunelli、ミラノ、イタリア）、１％ヒト血清プール、１００U/mlペニシリン／ストレプトマイシン（Bristol-Myers Squibb、セルモネタ（Sermoneta）、イタリア）および２mMグルタミン（Gibco-BRL、ミラノ、イタリア）を補足したＸ−ｖｉｖｏ１５培地（BioWhittaker、ベルガモ（Bergamo）、イタリア）（以後完全培地と呼ぶ）中で行った。活性化の３日後、４０U/mlのｒＩＬ−２（Chiron Italia、ミラノ、イタリア）を加えた。必要に応じて細胞を分けて、ＩＬ−２を有する新鮮な培地を加えた。１４日毎にＴ細胞株を再刺激した。増大した細胞についてのすべての実験は、活性化の少なくとも１０日後に行った。
【００４４】
Ｔ細胞の増殖と抑制。
ポリクローナル活性化に応答した増殖を分析するために、９６ウェル丸底プレート（Costar）を、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）中の抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μg/ml）で４℃で一晩被覆し、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｔ細胞を、最終容量２００μlの完全培地中に、初期密度５×１０⁵細胞／ml（１００，０００細胞／ウェル）で、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１μg/ml）（Pharmingen、サンジエゴ、カリホルニア州）、可溶性第２ウサギ抗マウス抗体（１０μg/ml）（Sigma、ミラノ、イタリア）および／またはＩＬ−２（１００U/ml）の非存在下または存在下で塗抹した。
【００４５】
抗原特異的Ｔ細胞増殖を試験するために、新たに単離したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞またはＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞（２．５×１０⁵細胞／ml）を、陰性選択（Dynal、Oxoid）により、ＣＤ３+ 細胞を枯渇させておいた放射線照射（６０００RADS）同種異系のＰＢＭＣ（２．５×１０⁵細胞／ml）で刺激した。抑制のために、新たに単離した自己ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を加えてその数を増やした（最大２．５×１０⁵細胞／ml）。細胞を、最終容量２００μlの完全培地で９６ウェル丸底プレート中で同時培養した。対照ＩｇＧ（１０μg/ml）（Pharmingen）、中和性抗ＩＬ−１０Ｒ（１０μg/ml）（３Ｆ９、Pharmingen）および／または抗ＴＧＦ−β_1,2,3（１０μg/mlまたは５０μg/ml）（Ｒ＆Ｄ）、またはＦ(ab')₂抗ＣＴＬＡ−４（１０μg/ml）（Ancell、ベイポート（Bayport）、ミネソタ州）ｍＡｂを、記載のように加えた。記憶Ｔ細胞の抑制のために、増大したＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞株からの細胞を、同種異系のＡＰＣ（同種異系の支持細胞混合物で使用したものとは異なるドナー由来）で培養し、増大させた自己ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞を上記したように加えてその数を増やした。
対照実験のために、インビトロ活性化ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞から精製したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、新たに単離した自己ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞と同種異系のＡＰＣに加えてその数を増やした。
【００４６】
記載の時間後、ウェルに１μCi／ウェルの³H-チミジン（Amersham、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）を１６時間適用した。細胞を採取し、シンチレーションカウンター中で計測した。
【００４７】
ＥＬＩＳＡ。
ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＧＦ−βの検出のために、抗ＣＤ２８（１μg/ml）とＩＬ−２（１００U/ml）と共にもしくは無しで、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μg/ml）で刺激しておいた細胞（１×１０⁶Ｔ細胞／ml）、または放射線照射ＣＤ３枯渇同種異系のＰＢＭＣ（１×１０⁶細胞／ml）の上清について、ＥＬＩＳＡを２４時間（ＩＬ−２について）もしくは７２時間行った。ＥＬＩＳＡは製造業者の説明書に従って行った。すべての捕捉および検出ｍＡｂは、Pharmingenから購入した。
検出限界は以下の通りである：
ＩＬ−２：１９pg/ml；ＩＬ−４：９．４pg/ml；ＩＬ−１０：１５．６pg/ml；ＩＦＮ−γ：６２．５pg/ml；ＴＧＦ−β：６２．５pg/ml。
【００４８】
ＦＡＣＳ解析。
抗−ＣＤ４ｍＡｂ、抗−ＣＤ２５ｍＡｂ、抗−ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ、抗−ＣＤ４５ＲＯｍＡｂ、抗−ＣＤ６２ＬｍＡｂ、抗−ＣＤ６９ｍＡｂ、および抗−ＣＤ４０ＬｍＡｂを、Becton Dickinson（マウンテンビュー、カリホルニア州）から購入し、ＦＩＴＣまたはＰＥに直接結合させた。関連するビオチン化ｍＡｂ（PharMingen）とストレプトアビジン結合トリカラー（TriColor）（Caltag）で染色して、ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）とＩＬ−２Ｒγ（ＣＤ１３２）の発現を測定した。休止していたか、または固定化抗ＣＤ３（１０μg/ml）またはＰＭＡ（１０μg/ml、Sigma）およびカルシウムイノノフォア（Ａ２３１８７、５００ng/ml、Sigma）で活性化した細胞を、記載のｍＡｂとＰＢＳ、２％ＦＣＳ、中で４℃で２０分間インキュベートし、１回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターによりCellquestソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して分析した。ビオチン化抗ＣＴＬＡ−４（PharMingen）、次いでストレプトアビジン結合ＰＥ（Caltag）を用いて細胞質染色して、ＣＴＬＡ−４の発現を測定した。休止細胞または活性化細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、サポニン緩衝液（ＰＢＳ、２％ＢＳＡおよび０．５％サポニン（Sigma）中でインキュベートして膜を透過性にした。染色と洗浄は、サポニン緩衝液で行い、細胞をＰＢＳ、２％ＢＳＡで１回洗浄した後、分析した。
【００４９】
２．ヒトＣＤ２５ ⁺ ＣＤ４ ⁺ Ｔｒ細胞クローンの単離と性状解析
ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の精製とクローニング。
ＰＢＭＣからのＣＤ４⁺Ｔ細胞は、上記したように得た。ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４およびＰＥ結合抗ＣＤ２５ｍＡｂ（Becton Dickinson）で染色し、ＣＤ２５⁺細胞とＣＤ２５^-細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ（Becton Dickinson）でＦＡＣＳソーティング解析して精製した。次に、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺およびＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレート中で、５×１０⁵ＰＢＭＣ／mlと５×１０⁴ＪＹ細胞／mlおよび０．０５μg/mlのＰＨＡからなる同種異系の支持細胞混合物の存在下で、限界希釈により１細胞／ウェルにクローン化した。３日後、ＩＬ−２（４０U/ml）を加えた。Ｔ細胞クローンを５％ヒト血清を有するＸ−ｖｉｖｏ１５で培養した。１４日目に、増殖しているウェルを取り上げ、上記した同種異系の支持細胞混合物で再刺激した。必要に応じて細胞を分けて、上記したように１４日毎に再刺激した。３〜５日毎に培地を補足した。先の再刺激の１０〜１４日（すなわち、休止期）の間に、実験のためにクローンを使用した。
【００５０】
Ｔ細胞の増殖と抑制。
ポリクローナル活性化に応答したＴ細胞クローンの増殖能力を分析するために、９６ウェル丸底プレート（Costar）を、０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５）中の抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μg/ml）を用いて４℃で一晩被覆し、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｔ細胞クローンを、初期密度２×１０⁵細胞／ml（４００，０００細胞／ウェル）で、最終容量２００μlの完全培地中に、ＩＬ−２（１００U/ml）の非存在下または存在下で塗抹した。Ｔ細胞クローンが自己ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖を抑制する能力について試験するために、新鮮なＣＤ４⁺Ｔ細胞を陽性選択（Miltenyi Biotech）により精製し、プラスチックに固定化した、または同種異系のＣＤ３枯渇ＰＢＭＣ（６０００RADSを照射）に結合した、抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞（４０，０００細胞／ウェル）を単独で、または９６ウェル丸底プレートの最終容量２００μlの完全培地中で１：１比のＴ細胞クローンの存在下で、培養した。
【００５１】
記載の時間後、ウェルに１μCi／ウェルの³H-チミジン（Amersham、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）を１６時間適用した。細胞を採取し、シンチレーションカウンター中で計測した。
【００５２】
ＥＬＩＳＡ。
Ｔ細胞クローン（１×１０⁶Ｔ細胞／ml）を、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μg/ml）と抗ＣＤ２８（１μg/ml）で刺激し、ＩＬ−２については２４時間後そして他のすべてのサイトカインについては４８時間後に上清を採取した。酸性化した上清中のＴＧＦ−βのレベルは、上記したように捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γのレベルは、上記したように捕捉ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）により、またはサイトメトリービーズアレイキット（ＣＢＡ）（BD Biosciences）により、製造業者の説明書に従って測定した。捕捉ＥＬＩＳＡとＣＢＡの直接比較は、２つの方法が、上清中で検出されるサイトカインの量において、非常によく似ていることを示した。
【００５３】
統計解析。
統計的な有意差のすべての解析は、対のあるスチューデントのｔ検定により行った。０．０５より小さいｐ値を有意とした。結果は平均±ＳＥＭで示す。
【００５４】
（略語）
ＣＤ分化のクラスター
ＩＬインターロイキン
ＴＧＦトランスフォーミング増殖因子
ＡＰＣ抗原提示細胞
ｍＡｂモノクローナル抗体
ＦＡＣＳ蛍光活性化細胞ソーティング解析
ＰＨＡ植物性血球凝集素
ＰＢＭＣ末梢血単核細胞
ＭＦＩ平均蛍光強度
ＥＢＶエプスタインバーウイルス
【００５５】
参考文献等

【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ−Ｃ】ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の単離と細胞表面表現型。ＣＤ４⁺Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離し、ＣＤ２５⁺画分とＣＤ２５^-画分とに分離した。純度（Ａ）と、ＣＤ４５ＲＯ、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂ）、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、およびＣＤ６２Ｌの発現（Ｃ）とを、ＦＡＣＳにより測定した。
【図１Ｄ−Ｅ】ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の単離と細胞表面表現型。ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺とＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、培地単独で培養、或いは固定化抗ＣＤ３ｍＡｂもしくはＰＭＡとカルシウムイオノフォアで、６時間（Ｄ）または２４時間（Ｅ）活性化した。細胞を、ＣＤ４０ＬとＣＤ６９の表面発現（Ｄ）、並びにＣＴＬＡ−４の細胞質内発現（Ｅ）について分析した。結果は、６つの独立した実験の代表である。
【図２】ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞はアネルギー性であり、アロ抗原への増殖を抑制する。精製したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（αＣＤ２８）（１μg/ml）、２次ウサギ抗マウス抗体（αＣＤ２８ＣＬ）（１０μg/ml）、および／またはＩＬ−２（１００U/ml）の非存在下または存在下で、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂ（αＣＤ３）（１０μg/ml）に応答して増殖する能力について試験した。７２時間培養後、3H-チミジンをさらに１６時間加えた（Ａ）。ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞（５０，０００細胞／ウェル）を、増加する数の自己ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の非存在下または存在下で、同種異系のＡＰＣに応答して増殖する能力について試験した（Ｂ）。ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を活性化して、ＣＤ２５発現を誘導した。４８時間後、ＣＤ２５⁺（ＣＤ２５⁺ⁱ）となったＴ細胞を精製し、アロ抗原に応答したＣＤ２５^-Ｔ細胞の増殖を抑制する能力について試験した（Ｃ）。ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、アロ抗原により、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞（１：１比）と共にまたは無しで、記載のｍＡｂ（１０μg/ml）の存在下で活性化した。数は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の非存在下での培養と比較した増殖の低下パーセントを示す（Ｄ）。Ｂ〜Ｄでは、９６時間後、³H-チミジンをさらに１６時間加えた。結果は、Ａについては６回の独立した実験の代表であり、Ｂについては９回の独立した実験の代表であり、ＣとＤについては３回の独立した実験の代表である。
【図３】ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の発現と細胞表面表現型。ＣＤ２５⁺細胞とＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製し、抗ＣＤ３ｍＡｂ、同種異系の支持細胞混合物、および外因性ＩＬ−２で活性化した。細胞を必要に応じて分離し、２週間後、ＣＤ２５とＣＤ４の発現についてＦＡＣＳにより分析した（Ａ）。平行して細胞を固定化抗ＣＤ３ｍＡｂまたはＰＭＡおよびカルシウムイオノフォアで６時間活性化後の、ＣＤ４０ＬとＣＤ６９の細胞表面発現について分析した（Ｂ）。ＣＴＬＡ−４発現の構成的レベルを、細胞質内染色により測定した（Ｃ）。結果は、３回の独立した実験の代表である。
【図４】培養したＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞はその抑制能力を保持する。ＣＤ２５⁺細胞とＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製し、抗ＣＤ３ｍＡｂ、同種異系の支持細胞混合物、および外因性ＩＬ−２で活性化した。１４日間培養後、Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１μg/ml）および／またはＩＬ−２（１００U/ml）の非存在下または存在下で、抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μg/ml）に応答して増殖する能力について試験した（Ａ）。培養したＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞（５０，０００細胞／ウェル）を、増加する数のインビトロ培養した自己ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の非存在下または存在下で、アロ抗原に応答して増殖能力について試験した（Ｂ）。培養したＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、記載のｍＡｂ（１０μg/ml）の存在下で、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞（１：１比）と共にまたは無しで、同種異系のＡＰＣ（増大に使用したものとは異なるドナーから）で活性化した。数は、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の非存在下での培養に比較した増殖の低下パーセントを示す（Ｃ）。すべての培養物について、４８時間後、³H-チミジンをさらに１６時間加えた。結果は、３回の独立した実験の代表である。
【図５】クローンレベルでのヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の単離。ＣＤ４⁺Ｔ細胞を末梢血から単離し、抗ＣＤ４と抗ＣＤ２５ｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳソーティング解析によりそれぞれ９８％と９９％以上の純度で、ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺とＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞に分離した。
【図６】ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンは、休止期のＣＤ２５の発現について不均一である。休止Ｔ細胞クローンを、最後の再刺激の１２〜１４日後に抗ＣＤ４と抗ＣＤ２５ｍＡｂで染色した。Ｔ細胞クローンの数（＃）は、上左に示し、ＣＤ２５陽性細胞のＭＦＩとパーセントを上右に示す。
【図７】ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンは、ＴＣＲを介する活性化に対するその増殖応答について不均一である。休止Ｔ細胞クローンを、ＩＬ−２（１００U/ml）の非存在下または存在下で抗ＣＤ３ｍＡｂ（１０μg/ml）に応答して増殖する能力について試験した。４８時間培養後、³H-チミジンを、さらに１６時間加えた。
【図８】ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンによるナイーブなＴ細胞応答の抑制。自己ＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製し、抗ＣＤ３ｍＡｂ、および放射線照射ＣＤ３枯渇ＡＰＣ（Ａ）、またはプラスチック上に固定化された抗ＣＤ３ｍＡｂに応答して増殖する能力について試験した。７２時間（Ａ）または４８時間（Ｂ）培養後、³H-チミジンをさらに１６時間加えた。数はナイーブなＣＤ４⁺Ｔ細胞単独に比較した増殖の低下パーセントを示す。

Claims

免疫調節剤または免疫抑制剤の調製のための、エクスビボ単離したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞の使用。
免疫調節剤または免疫抑制剤の調製のための、ＣＤ２５を構成的に発現するエクスビボ単離したヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンの使用。
移植片対宿主反応病、臓器拒絶、自己免疫疾患の予防または治療、および遺伝子治療後の導入遺伝子およびベクター由来タンパク質に対する有害な免疫応答の予防のための、請求項１または２の使用。
ヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞が、ＰＢＭＣから新たに単離されるかまたはインビトロで増大される、請求項１の使用。
ａ）ＰＢＭＣからＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製し；
ｂ）ＣＤ２５^-Ｔ細胞からＣＤ２５⁺を分離し；
ｃ）限界希釈によりＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞をクローン化し；
ｄ）ＩＬ−２の存在下で植物性血球凝集素または抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激し；
ｅ）ＣＤ２５の構成的高発現を示す抑制性クローンを選択する
工程により、
ＣＤ２５を構成的に発現するＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンを、エクスビボで単離する請求項２の使用。
ＣＤ２５を構成的に発現する、単離されたヒトＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞またはＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンを含有する、免疫抑制剤。
さらに、サイトカインまたは追加の免疫抑制剤を含む、請求項６の免疫抑制剤。
安定化された細胞調製物の形態である、請求項６または７の免疫抑制剤。
ａ）ＰＢＭＣからＣＤ４⁺Ｔ細胞を精製し；
ｂ）ＣＤ２５^-Ｔ細胞からＣＤ２５⁺を分離し；
ｃ）限界希釈によりＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞をクローン化し；
ｄ）ＩＬ−２の存在下で植物性血球凝集素または抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激し；
ｅ）ＣＤ２５の構成的高発現を示す抑制性クローンを選択する
工程を含む、免疫抑制性ＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンの単離方法。
工程（ｄ）における刺激が、放射線照射ＰＢＭＣからなる同種異系または自己の支持細胞混合物の存在下で行われる、請求項９の方法。
放射線照射した自己または同種異系のＥＢＶ形質転換細胞株を用いて行われる、請求項１０の方法。
工程（ｄ）において、
ＩＬ−２の存在下での植物性血球凝集素もしくは抗ＣＤ３ｍＡｂによる刺激の少なくとも１０日後の休止期における、ＣＤ２５発現に関する１００％の一定の陽性率；および
ＣＤ２５^-ＣＤ４⁺Ｔ細胞から平行して単離されたＴ細胞クローン、またはＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞から単離された非抑制性クローンと比較して、有意に高いレベルでのＣＤ２５の発現
という特徴に基づいて、抑制性クローンを選択する、請求項９の方法。
請求項９〜１１の方法により得られる単離されたＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローン。
ＩＬ−２を産生しない、請求項１２の単離されたＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローン。
免疫応答を調節する分子の同定のためのインビトロ系を調製するための、請求項１２〜１３のＣＤ２５⁺ＣＤ４⁺Ｔｒ細胞クローンの使用。
大規模遺伝子発現アレイ、ディファレンシャルプロテオミクススクリーニングにおける、およびモノクローナル抗体の作成のための、請求項１５の使用。