RU2784566C2 - РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ Т-КЛЕТОК - Google Patents
РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ Т-КЛЕТОК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784566C2 RU2784566C2 RU2018119684A RU2018119684A RU2784566C2 RU 2784566 C2 RU2784566 C2 RU 2784566C2 RU 2018119684 A RU2018119684 A RU 2018119684A RU 2018119684 A RU2018119684 A RU 2018119684A RU 2784566 C2 RU2784566 C2 RU 2784566C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- cell
- tissue
- skin
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 title claims abstract description 446
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 209
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims abstract description 123
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 claims abstract description 116
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 111
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 105
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 claims description 113
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 82
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 37
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 24
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 17
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001902 propagating Effects 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 83
- 239000002609 media Substances 0.000 description 51
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 49
- 101710036390 KLRK1 Proteins 0.000 description 46
- 102100012223 KLRK1 Human genes 0.000 description 46
- 230000004044 response Effects 0.000 description 37
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 35
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 35
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 35
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 35
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 30
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 30
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 30
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 29
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 29
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 27
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 27
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 25
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 21
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 19
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 17
- 102100014650 MICA Human genes 0.000 description 16
- 101700060941 MICA Proteins 0.000 description 16
- 101700040525 aceA Proteins 0.000 description 16
- 101710026144 acu-3 Proteins 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 16
- 101710004278 icl Proteins 0.000 description 16
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 16
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 16
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 15
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 15
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 14
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 14
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 14
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 14
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 13
- 102100019461 CD28 Human genes 0.000 description 12
- 101700033362 CD28 Proteins 0.000 description 12
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 12
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004967 Non-hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 10
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 10
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 101700029727 CCR8 Proteins 0.000 description 9
- 102100008148 CCR8 Human genes 0.000 description 9
- 101700080416 CD69 Proteins 0.000 description 9
- 102100005832 CD69 Human genes 0.000 description 9
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 9
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 9
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 11,19,21-trihydroxy-22-[5-[5-(1-hydroxyethyl)-5-methyloxolan-2-yl]-5-methyloxolan-2-yl]-4,6,8,12,14,18,20-heptamethyl-9-oxodocosa-10,16-dienoic acid Chemical compound O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M Sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 8
- -1 hydroxylmethylbut-2-enyl pyrophosphate Chemical compound 0.000 description 8
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 8
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 8
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 8
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 7
- 229920002319 Poly(methyl acrylate) Polymers 0.000 description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 7
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 7
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 7
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 7
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 7
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 description 6
- 101700070842 CCR3 Proteins 0.000 description 6
- 102100005861 CCR3 Human genes 0.000 description 6
- 101710004393 HAVCR2 Proteins 0.000 description 6
- 102100016384 HAVCR2 Human genes 0.000 description 6
- 102100012151 ITGAE Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 6
- 230000000139 costimulatory Effects 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000027675 major histocompatibility complex family Human genes 0.000 description 6
- 108091007937 major histocompatibility complex family Proteins 0.000 description 6
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 6
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101700024589 CCR4 Proteins 0.000 description 5
- 102100006400 CSF2 Human genes 0.000 description 5
- 101710011427 ENTPD1 Proteins 0.000 description 5
- 102100009509 ENTPD1 Human genes 0.000 description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 5
- 108050003558 Interleukin-17 family Proteins 0.000 description 5
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 5
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 5
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture media Substances 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 5
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 5
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 102100016531 CD9 Human genes 0.000 description 4
- 101700017162 CD9 Proteins 0.000 description 4
- 101700078818 CNOT6 Proteins 0.000 description 4
- 102100017099 CNOT6 Human genes 0.000 description 4
- 206010008958 Chronic lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 102100015541 FCGR3A Human genes 0.000 description 4
- 101710044656 FCGR3A Proteins 0.000 description 4
- 101710044657 FCGR3B Proteins 0.000 description 4
- 206010018651 Graft versus host disease Diseases 0.000 description 4
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012593 Hanks’ Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 4
- 101700048185 LAMP1 Proteins 0.000 description 4
- 102100005918 LAMP1 Human genes 0.000 description 4
- 208000000429 Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell Diseases 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101700014192 NOCT Proteins 0.000 description 4
- 102100005499 PTPRC Human genes 0.000 description 4
- 101700059076 PTPRC Proteins 0.000 description 4
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 102000001253 Protein Kinases Human genes 0.000 description 4
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 description 4
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- 229920001891 Small hairpin RNA Polymers 0.000 description 4
- 229920001985 Small interfering RNA Polymers 0.000 description 4
- 229940054269 Sodium Pyruvate Drugs 0.000 description 4
- XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N Zoledronic acid Chemical compound OP(=O)(O)C(P(O)(O)=O)(O)CN1C=CN=C1 XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 4
- YKAYCWPQDPILSA-UHFFFAOYSA-N bromohydrin pyrophosphate Chemical compound BrCC(O)(C)CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O YKAYCWPQDPILSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003334 potential Effects 0.000 description 4
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 4
- 229960004276 zoledronic acid Drugs 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N BRL-49594 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 3
- 102100015540 FCGR1A Human genes 0.000 description 3
- 101710003440 FCGR1A Proteins 0.000 description 3
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 3
- 208000005721 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 101710003110 IL17A Proteins 0.000 description 3
- 102100008982 IL17A Human genes 0.000 description 3
- 101710006572 ITGAM Proteins 0.000 description 3
- 102100019441 ITGAM Human genes 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 102100005748 KRT18 Human genes 0.000 description 3
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 3
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 3
- 101710010909 MS4A1 Proteins 0.000 description 3
- 102100000165 MS4A1 Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 108060006633 Protein Kinases Proteins 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 3
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 3
- 201000001820 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 3
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-azaniumyl-7-oxononanoate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M (R)-mevalonate Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC([O-])=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M 0.000 description 2
- 206010000880 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 229940009444 Amphotericin Drugs 0.000 description 2
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 229940112871 Bisphosphonate drugs affecting bone structure and mineralization Drugs 0.000 description 2
- 210000001124 Body Fluids Anatomy 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-Positive T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 102100010782 EGFR Human genes 0.000 description 2
- 101700039191 EGFR Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091007936 ERK family Proteins 0.000 description 2
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 2
- 102000009839 Endothelial Protein C Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010009900 Endothelial Protein C Receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 210000003953 Foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 2
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 2
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 2
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 2
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 2
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 210000002510 Keratinocytes Anatomy 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 208000008456 Leukemia, Myelogenous, Chronic, BCR-ABL Positive Diseases 0.000 description 2
- 208000007046 Leukemia, Myeloid, Acute Diseases 0.000 description 2
- 210000003563 Lymphoid Tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102100014649 MICB Human genes 0.000 description 2
- 101700039063 MICB Proteins 0.000 description 2
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229960000282 Metronidazole Drugs 0.000 description 2
- 108090000393 Muromonab-CD3 Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 210000004693 NK cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 102100017504 TBX21 Human genes 0.000 description 2
- 101700014592 TBX21 Proteins 0.000 description 2
- 101710024506 TH2 Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 201000005510 acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000004663 bisphosphonates Chemical class 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 2
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 2
- 201000006934 chronic myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 2
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 2
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 2
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 2
- 230000002496 gastric Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 2
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000770 pro-inflamatory Effects 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated Effects 0.000 description 2
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 2
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MDSIZRKJVDMQOQ-GORDUTHDSA-N (2E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate Chemical compound OCC(/C)=C/COP(O)(=O)OP(O)(O)=O MDSIZRKJVDMQOQ-GORDUTHDSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2R,3R,4S,5R,6S)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2R,3R,4S,5R,6R)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-LQLWEASQSA-N 63597-44-4 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-LQLWEASQSA-N 0.000 description 1
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 101710042656 BQ2027_MB1231C Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010007539 Blocking Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100008151 CCR7 Human genes 0.000 description 1
- 102100019459 CD27 Human genes 0.000 description 1
- 101700056583 CD27 Proteins 0.000 description 1
- 102100005830 CD70 Human genes 0.000 description 1
- 101700017377 CD70 Proteins 0.000 description 1
- 101700016900 CDH1 Proteins 0.000 description 1
- 102100005310 CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 101700054183 CTLA4 Proteins 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241001193938 Cavia magna Species 0.000 description 1
- 210000004534 Cecum Anatomy 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004207 Dermis Anatomy 0.000 description 1
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 1
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 101710044640 FCGR2A Proteins 0.000 description 1
- 101710044641 FCGR2B Proteins 0.000 description 1
- 102100015544 FCGR2C Human genes 0.000 description 1
- 101710044642 FCGR2C Proteins 0.000 description 1
- 101710021343 FDPS Proteins 0.000 description 1
- 102100002033 FDPS Human genes 0.000 description 1
- 101700064140 FOXP3 Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 241000282574 Gorilla gorilla Species 0.000 description 1
- 102000001398 Granzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000004349 Growth Plate Anatomy 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 101700024646 HCT1 Proteins 0.000 description 1
- 206010065430 HER-2 positive breast cancer Diseases 0.000 description 1
- VBJZVLUMGGDVMO-UHFFFAOYSA-N Hafnium Chemical compound [Hf] VBJZVLUMGGDVMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020243 Hodgkin's disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006743 Hodgkin's lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282418 Hominidae Species 0.000 description 1
- 241000282620 Hylobates sp. Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100014204 IL22 Human genes 0.000 description 1
- 210000003405 Ileum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 210000000207 Lymphocyte Subsets Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 Lysosomes Anatomy 0.000 description 1
- 101700036258 MECOM Proteins 0.000 description 1
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001616 Monocytes Anatomy 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010029592 Non-Hodgkin's lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010063834 Oversensing Diseases 0.000 description 1
- 108009000578 Oxidative Stress Proteins 0.000 description 1
- 102100019764 PDCD1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 102000000034 Programmed Cell Death 1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010080196 Programmed Cell Death 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940087463 Proleukin Drugs 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 1
- 229920001186 RNA-Seq Polymers 0.000 description 1
- 210000000664 Rectum Anatomy 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010001645 Rituximab Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108060007796 SPATA2 Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 240000003186 Stachytarpheta cayennensis Species 0.000 description 1
- 235000009233 Stachytarpheta cayennensis Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000004003 Subcutaneous Fat Anatomy 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001179 Synovial Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000662 T-Lymphocyte Subsets Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100015444 ULBP2 Human genes 0.000 description 1
- 101700049423 ULBP2 Proteins 0.000 description 1
- 206010046766 Uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N [(1R)-1-phenylethyl] N-(2-aminoethyl)-N-[(3-methoxy-4-phenylmethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound C1([C@@H](C)OC(=O)N(CCN)CC=2C=C(C(=CC=2)OCC=2C=CC=CC=2)OC)=CC=CC=C1 URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058061 alpha E integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-J aluminum;tetrahydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin B Drugs 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 201000005216 brain cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000008860 cerebrum cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 230000000112 colonic Effects 0.000 description 1
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning Effects 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000003112 degranulating Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 1
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 1
- 101700007096 fps Proteins 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 229910052735 hafnium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic Effects 0.000 description 1
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 201000009251 multiple myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N niobium Chemical compound [Nb] GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010955 niobium Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissues Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasites Species 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000003668 pericytes Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 1
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- OFPTZWGZSRJCOT-MSPNRCMCSA-M potassium;2-[(1S,2S,3R,4S,5S,6R)-3-(diaminomethylideneamino)-4-[(2R,3R,4R,5S)-3-[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy-2,5,6-trihydroxycyclohexyl]guanidine;(2S,5R,6R)-3,3-d Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O OFPTZWGZSRJCOT-MSPNRCMCSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 201000004681 psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 238000003559 rna-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N tantalum Chemical compound [Ta] GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000009377 thymus cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000001173 tumoral Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Настоящее изобретение относится к клеточной биологии и иммунологии, в частности к способу размножения негемопоэтических тканерезидентных γδ T-клеток in vitro. Для осуществления способа культивируют лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-15 или IL-15 и IL-2. При этом лимфоциты не находятся в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками в процессе культивирования. При это лимфоциты культивируются в отсутствии экзогенно добавленного агониста пути Т-клеточного рецептора. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность способа размножения γδ Т-клеток, находящихся в негемопоэтической ткани. 14 з.п. ф-лы, 1 пр., 35 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к способу размножения негемопоэтических тканерезидентных γδ T-клеток ex vivo. Термин "негемопоэтические тканерезидентные γδ T-клетки" относится к субпопуляциям Т-лимфоцитов, которые постоянно находятся в негемопоэтических тканях, но не в лимфоидных органах и крови. Такие клетки включают в себя клетки, отличные от Vδ2, например. Vδ1, Vδ3 и Vδ5. Изобретение также относится к применению таких клеток в адоптивной терапии с использованием Т-клеток и в терапии, опосредованной химерными антигенными рецепторами, а также к их применению в способе скрининга модуляторов, контролирующих ключевые точки. Изобретение также относится к клеткам, полученным в результате размножения ex vivo негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Растущий интерес к Т-клеточной иммунотерапии рака сосредоточен на очевидной способности субпопуляций Т-клеток CD8+ (1-4) и CD4+ αβ (5,6) распознавать раковые клетки и опосредовать защитный функциональный потенциал хозяина, особенно после дерепрессии под действием клинически опосредованного антагонизма ингибиторных путей, опосредуемых PD1 (7,8), CTLA4 (9,10) и другими рецепторами (11). Тем не менее, остается много вопросов. Например, существует множество основных клинических сценариев, при которых эффективность таких методов лечения оказывается низкой (11); часто возникают тяжелые побочные эффекты (AE) (12); возможность прогнозировать либо эффективность, либо AE чрезвычайно ограничена (13); и существует очень мало объяснений взаимодействий, позволяющих хозяину чувствовать опухолевые клетки (так называемая "иммуногенность"), что обязательно должно предшествовать активации ответов, опосредуемых обычными антигенспецифическими αβ T-клетками CD8+ и CD4+.
В этом отношении многие ученые и клиницисты также переоценивают потенциал γδ T-клеток, третьей линии лимфоцитов с соматически генерируемыми рецепторами, которые эволюционно являются также высоко консервативными, как αβ T-клетки и B-клетки. Существуют две основные субпопуляции человеческих γδ T-клеток: одна из них преобладает в периферической крови человека, экспрессируя, главным образом, рецептор T-клеток Vδ2 (TCR); а другая преобладает в негемопоэтических тканях, большинство из клеток этой субпопуляции экспрессирует TCR Vδ1, также существуют более маленькие популяции, экспрессирующие TCR, которые содержат цепь Vδ3, или Vδ5, или какую-либо другую цепь, отличную от Vδ2 (14).
У большинства взрослых клетки Vδ2 составляют в стационарном состоянии лишь небольшую и высоко вариабельную часть Т-клеток крови (0,01-5%), однако эти клетки быстро размножаются, временно достигая ~25% от клеток CD3+, после заражения широким спектром агентов, включающих в себя многочисленные бактерии и паразиты (14). Основой такого ответа является способность Vδ2 распознавать при посредстве TCR низкомолекулярные "фосфо-фрагменты", в том числе гидроксилметилбут-2-енилпирофосфат (HMBPP) (15), промежуточное соединение в ключевом микробном пути синтеза холестерина и других липидов, которые используются для модификации белков, например, путем геранилирования или фарнезилирования. У приматов этот синтез протекает через мевалонатный путь, одно из промежуточных соединений которого - изопентенилпирофосфат (IPP) - экспрессируется на очень высоких уровнях в инфицированных вирусом и трансформированных клетках и также является мишенью распознавания Vδ2, опосредованного TCR (16).
Кроме того, большинство T-клеток Vδ2 экспрессируют высокие уровни рецептора NKG2D, который может активировать или совместно стимулировать (вместе с TCR) цитолитические потенциалы клеток в присутствии лигандов NKG2D, например, MICA, MICB и ULBP. Эти лиганды представляют собой белки хозяина, которые подвергаются повышающей регуляции при воздействии на клетки таких факторов, как окислительный или осмотический стресс или ультрафиолетовый свет. Данные факторы стимулируют гиперактивный сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), регуляция которого также обычно нарушена в солидных опухолях человека (17).
Способность T-клеток Vδ2 обнаруживать трансформированные клетки с использованием их TCR и/или NKG2D (18-20), наряду с их мощной цитолитической способностью и выраженной способностью презентировать антигены T-клеткам CD8+ (21), обусловливает мнение, что T-клетки Vδ2 можно использовать в клинике для иммунотерапии рака. Этого можно достигнуть путем адоптивного переноса клеток, в связи с чем неспособность МНС подавлять γδ Т-клетки в значительной и благоприятной мере ограничивает возможность возникновения заболевания трансплантата против хозяина (GvHD) (22). Для этого постоянно присутствующие в крови клетки Vγ9Vδ2 γδ Т-клетки можно размножить ex vivo путем добавления цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-2, наряду с экзогенными TCR-активирующими средствами, такими как фосфо-фрагменты (например, BrHPP), или наряду с клинически одобренными бисфосфонатами (такими как золедроновая кислота), которые ингибируют фарнезилпирофосфатсинтазу в мевалонатном пути, тем самым индуцируя накопление TCR-активирующего фрагмента, IPP. Однако длительная активация клеток Vγ9Vδ2 под действием таких средств, как BrHPP, может привести к постепенному истощению клеток и уменьшению потенциала цитотоксичности.
Альтернативно собственные γδ Т-клетки пациентов можно активировать in situ с использованием либо фармакологически модифицированных форм HMBPP, либо клинически одобренных аминобензофосфонатов. Указанные подходы использовали для лечения более 250 больных раком, по-видимому, они являются безопасными, но полной ремиссии позволяют достичь только в редких случаях. Одной из основных проблем, обуславливающих ограниченную клиническую эффективность клеток, является их склонность к необратимому истощению при хроническом воздействии антигена. Вторая основная проблема заключается в их кажущейся неэффективности при возвращении в солидные опухоли и ткани, несущие такие опухоли (23).
Терапия с использованием Т-клеток, несущих химерные антигенные рецепторы (CAR-T), является перспективным клиническим методом лечения В-клеточных злокачественных опухолей. Однако при лечении солидных опухолей эффективность клеток CAR-T до настоящего времени была ниже ожиданий, наблюдалась более низкая эффективность при индуцировании полных реакций опухолей и высокая встречаемость внеопухолевой цитотоксичности (24). Что касается γδ T-клеток периферической крови, основным препятствием для успешного применения подходов с использованием CAR-T к солидным опухолям является вероятная неспособность системных клеток CAR-T мигрировать в участки злокачественной опухоли и оставаться там в функционально-эффективном состоянии (25). Кроме того, будучи зависимыми от обычных αβ Т-клеток, клетки CAR-T должны преодолевать иммуносупрессорные сигналы в микроокружении опухоли, например, сигналы, которые передаются через рецептор PD1.
Способы CAR-T с использованием γδ T-клеток могут иметь преимущества, поскольку эти клетки можно трансдуцировать активными в отношении опухоли антигенспецифичными химерными TCR и сохранить при этом их способность распознавать трансформированные клетки при посредстве таких рецепторов, как NKG2D. Таким образом, данные клетки могут одновременно обладать опухоль-адаптивными (TCR) и собственными (NKG2D)-опосредованными свойствами. Однако остается проблема кажущейся неспособности γδ Т-клеток человеческой крови возвращаться в опухоли твердых тканей и оставаться там в активной форме. Данная проблема инициировала более подробные исследования γδ T-клеток, которые обычно находятся в негемопоэтических тканях.
Такие Т-клетки мигрируют в негемопоэтические ткани, что является частью их развития, и, как таковые, отличаются от Т-клеток, например, тканерезидентных Т-клеток памяти TCRαβ+ (так называемых клеток TRM), которые инфильтруют ткань после системного примирования. Тканерезидентные γδ Т-клетки наиболее хорошо изучены у мышей, у которых они, как показано, распространены в коже, кишечнике и репродуктивных тканях, а также в других участках организма. Было показано, что многие такие клетки обладают функциональными механизмами, подобными врожденным механизмам, которые обуславливают их способность отвечать на заражение посредством активации рецептора NKG2D. Авторы настоящего изобретения недавно получили результаты, свидетельствующие о том, что кожа и кишечник человека также содержат большие популяции не гемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток с активностью, подобной врожденной. И еще следует отметить, что в исследованиях злокачественных новообразований, воспаления, атопии, аллергии и других патологий, формирующихся в негемопоэтических тканях, не учитывалось потенциальное воздействие указанных врожденных человеческих Т-клеток, постоянно находящихся в тканях, в которых присутствуют патологические поражения.
Человеческие γδ Т-клетки, постоянно присутствующие в негемопоэтических тканях, гораздо менее изучены, поскольку отбор образцов клеток осложнен вследствие их локализации и, кроме того, отсутствуют разработанные способы их культивирования. Из относительно скудной существующей информации можно заключить, что данный подтип включает в себя разнообразные клетки с MHC-неограниченным цитолитическим потенциалом, совсем не способные взаимодействовать с низкомолекулярными фосфо-фрагментами, поскольку они не экспрессируют TCR, содержащие Vγ2. Хотя для таких клеток известно очень мало TCR с конкретной специфичностью, существующие данные свидетельствуют о том, что данные клетки способны взаимодействовать с собственными антигенами, такими как эндотелиальный рецептор белка C (EPCR), который экспрессируется на повышенном уровне клетками, инфицированными цитомегаловирусом (CMV), а также клетками многих солидных опухолей (32). Негемопоэтические ассоциированные с тканями γδ Т-клетки также обычно экспрессируют NKG2D (14). Учитывая эти свойства и физиологическое местонахождение клеток в негемопоэтических тканях, таких как кожа и кишечник, адоптивный перенос таких клеток раковым пациентам может быть значительно более эффективным в отношении солидных опухолей, а, возможно, и других иммунопатологий.
Чтобы использовать клетки, отличные от Vδ2, для иммунотерапии, нужно либо разработать способ размножения клеток in situ, либо собрать клетки и размножить их ex vivo с последующей повторной инфузией. Обычно используют последний подход, поскольку отсутствуют известные TCR-активирующие средства, обладающие доказанной способностью стимулировать размножение большого числа отличных от Vδ2 клеток in situ. Чтобы преодолеть проблему ограниченного доступа к негемопоэтическим тканям, некоторые исследователи предприняли попытки размножить очень небольшое число отличных от Vδ2 клеток, взятых из крови, где Vδ2-экспрессирующие клетки являются доминирующей субпопуляцией, сделав предположение, что эти клетки эквивалентны тканерезидентным клеткам, отличным от Vδ2. Небольшое число отличных от Vδ2 γδ Т-клеток, взятых из крови, размножают по существу в процессе активной инфекции CMV, причем полученные клетки демонстрируют превосходную реакционную способность по отношению к CMV по сравнению с Т-клетками Vδ2 и, по-видимому, обладают способностью защищать человеческий плод в случаях инфекции CMV в утробе. Кроме того, реакционноспособные в отношении CMV отличные от Vδ2 γδ Т-клетки, по-видимому, защищают пациентов после трансплантации от повторной активации CMV в процессе иммуносупрессии, и, посредством перекрестных взаимодействий с трансформированными клетками, уменьшают риск вторичных злокачественных новообразований (26). Подобным образом, существуют данные, свидетельствующие о том, что γδ T-клетки играют полезную роль в борьбе с инфекцией HIV, в данном случае отличные от Vδ2 γδ Т-клетки размножают в крови по сравнению с Т-клетками Vδ2 (24).
Присутствующие в крови отличные от Vδ2 клетки размножают ex vivo либо путем добавления экзогенных средств, которые непосредственно активируют сигнальный путь TCR, например, таких средств, как антитело против CD3, pan γδ-TCR-специфичное антитело или фитогемагглютинин (PHA), либо путем совместного культивирования стимулированных отличных от Vδ2 Т-клеток с искусственными антигенпрезентирующими клетками (aAPC), где непосредственный контакт между γδ Т-клетками и aAPC необходим для размножения отличных от Vδ2 T-клеток ex vivo (41-44). Альтернативно размножение клеток осуществляют путем стимуляции сигнального пути рецептора NKG2D с помощью иммобилизованного рекомбинантного MICA (лиганд NKG2D), например, как при поддержании пролиферации ex vivo культур γδ T-клеток, полученных из эпителиальных лимфоцитов, инфильтрующих опухоли (TIL) (28). Таким образом, существующие в настоящее время способы размножения ex vivo Vδ2-экспрессирующих γδ Т-клеток крови, или отличных от Vδ2 γδ Т-клеток крови, требуют добавления средств, заведомо способствующих активации рецепторов TCR и/или NKG2D, наряду с дополнительными цитокинами, такими как интерлейкин-2 (IL-2) (41-44). Указанное сочетание рецептор-активирующих сигналов и цитокинов отражает стандартный подход к культивированию и выращиванию Т-клеток, широко используемый научным сообществом. На сегодняшний день не описаны способы эффективного размножения γδ Т-клеток, находящихся в негемопоэтической ткани. Такой способ описан в настоящем документе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В рамках фенотипической и функциональной характеристики Т-клеток человеческой кожи авторы настоящего изобретения выделили особую и большую популяцию γδ Т-клеток, обычно присутствующих в негемопоэтических тканях и обладающих уникальными свойствами по сравнению с αβ Т-клетками и присутствующими в крови γδ T клетками. Авторы обнаружили, что клетки способны давать сильные, TCR-независимые ответы, подобные врожденным, на NKG2D-лиганды и цитокины. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что, хотя для размножения первичных αβ T-клеток обычно требуется совместное культивирование с другими поддерживающими клетками в качестве источника полезных факторов роста (29), размножение γδ Т-клеток, присутствующих в коже и других негемопоэтических тканях, кардинально и специфично подавляется совместным культивированием этих клеток в контакте с аутологичными дермальными фибробластами и, возможно, с другими стромальными компонентами, такими как кератиноциты и эндотелиальные клетки. Устранение таких взаимодействий позволяет быстро размножать клетки в больших количествах для потенциальных клинических применений.
Кроме того, в отличие от предпринятых на сегодняшний день усилий по размножению γδ Т-клеток, полученных из крови и опухоли, авторы настоящего изобретения показали, что такие негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки можно размножать без преднамеренного добавления каких-либо экзогенных средств, активирующих сигнальные пути, опосредуемые TCR или NKG2D.
В данном документе раскрываются новые способы, позволяющие эффективно и воспроизводимо выделять и размножать γδ Т-клетки, полученные из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, такой как кожа и кишечник. Размножение инициируют путем нарушения контакта γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, с аутологичными фибробластами и, возможно, с другими стромальными компонентами и поддерживают путем культивирования в присутствии интерлейкина-2 (IL-2) и/или интерлейкина-15 (IL-15).
Размножение является высоко селективным, поскольку размножение αβ Т-клеток, или Vδ2-экспрессирующих Т-клеток, или NK-клеток не индуцируется путем нарушения их контактов с аутологичными фибробластами (фиг.3А, 3С и 3D). Указанное размножение негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток в результате освобождения от фибробласт-опосредованной модуляции контрольных точек также приводит к "спонтанной" активации эффекторных потенциалов клеток (фиг.5А и 5В), которые весьма желательны в контексте противоопухолевой активности. Эти разработки позволяют размножать в культуре и активировать негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки для потенциального применения в виде "готовых" клеточных инфузий пациентам. В то же время разработка антитела или другого ингибитора модуляции контрольной точки тканерезидентных γδ T-клеток фибробластами (или другими стромальными или эпителиальными клетками) должна обеспечить активацию негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in situ, например, у ракового пациента, посредством блокады контрольной точки.
Возможность получать и выращивать γδ Т-клетки, полученные из негемопоэтической ткани (например, кожи), позволила выявить четкие отличия от Т-клеток Vδ1, полученных из крови. Например, в Т-клетках Vδ1, полученных из кожи, наблюдаются маркеры предшествующей активации Т-клеток, такие как экспрессия CD69, положительная реакция на ICOS и TIM3, а также незначительная или не выраженная экспрессия классической костимуляторной молекулы CD28 (фиг.10А). Кроме того, в них наблюдается высокая экспрессия NKG2D. И наоборот, Т-клетки Vδ1, полученные из человеческой крови, не экспрессируют CD69 или TIM3, экспрессируют лишь незначительные уровни ICOS и также являются в некоторой степени положительными по экспрессии CD28. Более того, экспрессия NKG2D под действием Т-клеток Vδ1, полученных из крови, намного ниже, чем экспрессия под действием Т-клеток Vδ1, полученных из кожи, и, в отличие от Т-клеток Vδ1, полученных из крови, T-клетки Vδ1, полученные из кожи, обладают врожденной способностью взаимодействовать с лигандами NKG2D, такими как рекомбинантный MICA, в отсутствии стимуляции Т-клеточного рецептора (фиг.10В). Описанные здесь γδ Т-клетки из негемопоэтических тканей также могут характеризоваться более высокой экспрессией CCR3, CD39, CD11b, IL-13 и/или CD9, чем полученные из крови T-клетки Vδ1 и другие популяции лимфоцитов.
В первом аспекте изобретение предлагает способ размножения негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro, который включает в себя культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-2 и/или интерлейкина-15 (IL-15), где лимфоциты не находятся в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками в процессе культивирования.
Предпочтительно лимфоциты не находятся в непосредственном контакте с фибробластами в процессе культивирования.
γδ Т-клетки изначально присутствуют в негемопоэтической ткани in vivo.
Предпочтительно способ включает в себя культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-2 и IL-15.
В некоторых вариантах осуществления лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, можно выращивать в отсутствии активаторов TCR или костимуляторов, которые индуцируют активацию Т-клеток. Например, лимфоциты можно выращивать в отсутствии агонистов пути TCR, например, активаторов CD3, таких как антитела против CD3, в присутствии или отсутствии активаторов CD28.
Добавление таких экзогенных активаторов TCR-сигнализации не требуется для размножения негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток при использовании способов настоящего изобретения. Как таковая, среда для размножения γδ Т-клеток, подходящая для применения в способах настоящего изобретения, может быть лишена способности активировать Т-клетки, например, способности активировать αβ Т-клетки или γδ Т-клетки крови, и может не обладать способностью активировать или костимулировать TCR.
Например, среда для размножения γδ Т-клеток может не содержать, или практически не содержать средства или факторы, активирующие Т-клеточный сигнальный путь, такие как активаторы или костимуляторы TCR, включающие в себя экзогенные агонисты пути TCR. Среда для размножения γδ Т-клеток может содержать IL-2 и/или IL-15. В некоторых вариантах осуществления среда для размножения γδ Т-клеток помимо IL-2 и/или IL-15 может содержать один или несколько дополнительных факторов роста, таких как цитокины. Подходящие факторы роста не обладают способностью активировать Т-клетки. В других вариантах осуществления среда для размножения γδ Т-клеток может быть лишена факторов роста, отличных от IL-2 и/или IL-15; например, среда для размножения γδ Т-клеток может состоять из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
В одном варианте осуществления лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, можно выращивать в отсутствии стромальных или эпителиальных клеток. Например, стромальные или эпителиальные клетки можно удалить до культивирования. Предпочтительно, чтобы лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, можно культивировать в отсутствии фибробластов. Например, фибробласты можно удалить до культивирования.
Лимфоциты можно получить из любой подходящей негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, такой как ткань кожи, желудочно-кишечного тракта (например, толстой кишки или подвздошной кишки), молочной железы, легких, печени, поджелудочной железы, жировой ткани или предстательной железы.
Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки предпочтительно представляют собой клетки, отличные от Vδ2, наиболее предпочтительно клетки, экспрессирующие TCR, содержащие цепи Vδ1, т.е. клетки Vδ1. Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки также могут включать в себя так называемые двойные отрицательные (DN) γδ Т-клетки, определенные как клетки, экспрессирующие γδ TCR, не содержащие ни цепи Vδ1, ни цепи Vδ2.
Способ необязательно включает в себя стадию получения лимфоцитов из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного. Например, лимфоциты можно получить из образца негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного. Способ может включать в себя получение образца негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного и отделение лимфоцитов от негемопоэтических клеток указанного образца с получением популяции лимфоцитов, которая практически не содержит стромальных клеток.
Во втором аспекте изобретение предлагает способ размножения γδ Т-клеток, включающий в себя (i) получение популяции γδ Т-клеток из негемопоэтической ткани; и (ii) выращивание γδ Т-клеток, по существу не контактирующих со стромальными клетками, с получением увеличенной популяции γδ Т-клеток.
Популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, может представлять собой практически чистую популяцию γδ Т-клеток.
Популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, предпочтительно представляет собой клетки, отличные от Vδ2, наиболее предпочтительно клетки, экспрессирующие TCR, содержащие цепи Vδ1, т.е. клетки Vδ1. Популяция γδ Т-клеток может также содержать γδ T-клетки DN.
Популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, может экспрессировать один или несколько дополнительных маркеров тканерезидентных γδ Т-клеток, таких как CLA, IL13, CCL1, CD103 и CCR8. В некоторых вариантах осуществления популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, может содержать γδ Т-клетки Vδ1+ CCR8+.
γδ Т-клетки можно выращивать в отсутствии контакта со стромальными клетками с получением увеличенной популяции γδ Т-клеток (то есть при отсутствии контакта γδ клеток и стромальных клеток в культуре).
γδ Т-клетки можно выращивать в отсутствии сигналов активации TCR или костимуляторных сигналов. В некоторых вариантах осуществления стадию выращивания можно проводить в среде, кондиционированной по стромальным клеткам, или в присутствии IL-2, IL-15 или их сочетания. Например, γδ T-клетки можно выращивать в среде для культивирования γδ, содержащей IL-2 и/или IL-15. Подходящая среда для выращивания γδ не способна активировать или костимулировать TCR. Например, среда для выращивания γδ может не содержать или практически не содержать средств или факторов, которые активируют Т-клеточный сигнальный путь, таких как активаторы или костимуляторы TCR, в том числе агонисты пути TCR. Среда для выращивания γδ может содержать IL-2 и/или IL-15. В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания γδ помимо IL-2 и/или IL-15 может содержать один или несколько дополнительных факторов роста, таких как цитокины. Подходящие факторы роста не способны активировать Т-клетки. В других вариантах осуществления среда для выращивания γδ может не содержать факторы роста, отличные от IL-2 и/или IL-15; например, среда для выращивания γδ может состоять из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
В третьем аспекте изобретение предлагает способ размножения γδ Т-клеток, включающий в себя: (i) получение негемопоэтической ткани, содержащей негемопоэтические клетки и γδ Т-клетки; (ii) отделение γδ Т-клеток от негемопоэтических клеток с получением популяции γδ Т-клеток, которая по существу не содержит стромальных клеток; и (iii) выращивание популяции, полученной на стадии (ii), в отсутствии сигналов активации TCR или костимуляторных сигналов с получением увеличенной популяции γδ Т-клеток.
Например, γδ Т-клетки можно отделить от αβ Т-клеток.
Популяция, полученная на стадии (ii), может представлять собой практически чистую популяцию γδ Т-клеток.
γδ Т-клетки в популяции, полученной на стадии (ii), могут содержать γδ Т-клетки, отличные от Vδ2, наиболее предпочтительно экспрессирующие TCR, содержащие цепи Vδ1, т.е. γδ Т-клетки Vδ1. γδ Т-клетки в популяции, полученной на стадии (ii), также могут содержать γδ Т-клетки DN.
γδ Т-клетки в популяции, полученной на стадии (ii), также могут содержать γδ Т-клетки, которые экспрессируют один или несколько дополнительных маркеров тканерезидентных γδ Т-клеток, таких как CLA, CD103 и CCR8. В некоторых вариантах осуществления γδ Т-клетки в популяции, полученной на стадии (ii), могут содержать γδ Т-клетки Vδ1+CCR8+.
Выращивание на стадии (iii) можно проводить по существу в отсутствии контакта стромальных клеток с популяцией, полученной на стадии (ii), и/или в отсутствии сигналов активации TCR или костимулирующих сигналов. Например, выращивание можно проводить в отсутствии контакта γδ Т-клеток со стромальными клетками. В некоторых вариантах осуществления выращивание на стадии (iii) проводят в среде, кондиционированной по стромальным клеткам, или в присутствии IL-2, IL-15, или их сочетания.
В некоторых вариантах осуществления γδ Т-клетки можно выращивать в среде для культивирования γδ, содержащей IL-2 и/или IL-15. Подходящая среда для культивирования γδ не может активировать или костимулировать TCR. Например, среда для выращивания γδ может не содержать, или по существу не содержать средства или факторы, которые активируют Т-клеточный сигнальный путь, например, активаторы или костимуляторы TCR, такие как агонисты пути TCR. В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания γδ помимо IL-2 и/или IL-15 может содержать один или несколько дополнительных факторов роста, таких как цитокины. Подходящие факторы роста не способны активировать Т-клетки. В других вариантах осуществления среда для выращивания γδ может состоять из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
Число γδ Т-клеток в увеличенной популяции по второму или третьему аспекту может по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз или, по меньшей мере, в 10000 раз превышает число γδ Т-клеток в негемопоэтической ткани, или отделенных от негемопоэтических клеток. Увеличенную популяцию можно получить путем выращивания в течение 3 дней, 5 дней, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 дня или 28 дней.
γδ Т-клетки в увеличенной популяции предпочтительно представляют собой Т-клетки Vδ2-. Увеличенная популяция γδ Т-клеток может содержать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% клеток Vδ1+. Увеличенная популяция γδ Т-клеток может быть по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% положительной по одному, двум или всем трем из CCR4, CCR8 и CD103. Например, увеличенная популяция может быть по меньшей мере на 10% положительной по CD103, по меньшей мере на 30% положительной по CCR4 и по меньшей мере на 60% положительной по CCR8.
В четвертом аспекте изобретение относится к негемопоэтическим тканерезидентным γδ Т-клеткам или их популяциям, полученным по способу, описанному в первом, втором или третьем аспекте настоящего изобретения.
В пятом аспекте изобретение относится к способу скрининга модуляторов контрольных точек с использованием негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, где способ включает в себя:
(i) выращивание негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами) в присутствии и отсутствии тестируемого соединения, или выращивание негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro при непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами) в условиях изменения экспрессии тестируемого гена в γδ Т-клетках и/или в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах); и
(ii) определение скорости пролиферации или активации негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток в присутствии и отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии и отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (таких как фибробласты) и/или γδ Т-клетках, или определение скорости уничтожения стромальных или эпителиальных клеток (например, фибробластов) в присутствии и отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии и отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, в фибробластах) и/или γδ Т-клетках,
причем, если скорость пролиферации или активации Т-клеток в присутствии тестируемого соединения выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или γδ Т-клетках, выше, чем в отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или γδ Т-клетках, и/или если скорость уничтожения стромальных или эпителиальных клеток (например, фибробластов) в присутствии тестируемого соединения выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или γδ Т-клетках, выше, чем в отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в фибробластах и/или γδ Т-клетках, то тестируемое соединение, скорее всего, является модулятором контрольной точки, или тестируемый ген, по всей вероятности, является геном-кандидатом контрольной точки или его регулятором.
Экспрессию тестируемого гена в γδ Т-клетках и/или в стромальных или эпителиальных клетках (таких как фибробласты) можно изменить, например, с помощью РНК-направленного средства, такого как малая интерферирующая РНК (миРНК) или малая шпилечная РНК (мшРНК), или путем редактирования гена, например, с использованием системы CRISPR/Cas.
В шестом аспекте изобретение относится к способу лечения индивидуума с помощью адоптивной терапии Т-клетками, где способ включает в себя введение негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу, описанному в первом, втором или третьем аспекте настоящего изобретения, индивидууму, нуждающемуся в этом. Индивидуум предпочтительно представляет собой человека.
Индивидуум предпочтительно представляет собой человека-пациента, страдающего от рака или вирусной инфекции, такого как CMV-инфицированный пациент или ВИЧ-инфицированный пациент.
В седьмом аспекте изобретение относится к применению негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу, описанному в первом, втором или третьем аспекте настоящего изобретения, в способе лечения человека или отличного от человека животного с помощью адоптивной Т-клеточной терапии. Негемопоэтическая тканерезидентная γδ Т-клетка может обладать одним или несколькими из следующих свойств:
(i) имеет фенотип CD69высокий, ICOSвысокий, TIM3высокий и CD28низкий/отсутствует
(ii) осуществляет повышающую регуляцию одного или нескольких из CCR3, CD11b, CD9 и CD39,
(iii) продуцирует IFN-γ в ответ на лиганд NKG2D в отсутствии агонистов TCR,
(iv) продуцирует IL-13 в отсутствии агонистов TCR,
(v) продуцирует один или несколько из IFN-γ, TNF-α и GM-CSF в ответ на активацию TCR,
(vi) не продуцирует или практически не продуцирует IL-17 в ответ на активацию TCR,
(vii) растет в культуральной среде, содержащей IL-2 в отсутствии дополнительных факторов роста,
(viii) обеспечивает цитотоксический Т-клеточный ответ в отсутствии агонистов TCR и/или
(ix) обладает селективной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками.
В предпочтительном варианте осуществления человек представляет собой человека-пациента, страдающего от рака или вирусной инфекции, например, CMV-инфицированного или ВИЧ-инфицированного пациента, где инфекция CMV или ВИЧ связана с MICA.
В восьмом аспекте изобретение предлагает способ лечения индивидуума с помощью терапии, опосредованной химерным антигенным рецептором, где способ включает в себя введение негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу, описанному в первом, втором или третьем аспекте изобретения, индивидууму, нуждающемуся в этом. Индивидуум предпочтительно представляет собой человека.
В предпочтительном варианте осуществления индивидуум представляет собой человека-пациента, страдающего от рака.
В девятом аспекте изобретение относится к применению негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу, описанному в первом, втором или третьем аспекте настоящего изобретения, в способе лечения человека или отличного от человека животного с использованием химерного антигенного рецептора.
В предпочтительном варианте осуществления человек представляет собой человека-пациента, страдающего от рака.
Каждый из описанных выше вариантов осуществления можно объединить с одним или несколькими из любых других вариантов осуществления.
Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1A-1D показано, что кожа человека содержит заметную популяцию резидентных γδ Т-клеток. Фиг. 1A: Резидентные лимфоциты кожи выделяют с использованием органотипической клеточной культуры, описанной Clark et al. (29), "метод Кларка". В применении к клеткам CD45+ антитела против CD3 используют для окрашивания Т-клеток, а антитела против CD56 используют для идентификации NK-клеток CD3-CD56+ соответственно. В применении к клеткам CD3+ антитела против рецептора γδ Т-клеток pan используют для идентификации резидентных γδ T-клеток кожи, а антитела против CD8альфа используют для идентификации соотношений обычных CD4- и CD8-положительных αβ Т-клеток в воротах CD3+, pan γδ TCR. На фиг. 1B показаны результаты указанных экспериментов для 7-10 доноров с использованием метода Кларка. В данном методе лимфоциты кожи человека все еще находятся в контакте с дермальными фибробластами, либо в отсутствии каких-либо цитокинов, либо в присутствии интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-15 (IL-15), или IL-2 и IL-15, и полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление цитокинов не влияет на состав резидентных лимфоцитов кожи, за исключением небольшого увеличения популяции γδ T-клеток при добавлении к культуре IL-15, или IL-2 и IL-15, в соответствии с методом Clark et al. Состав лимфоцитов после 3-недельного органотипического культивирования кожи показан с указанием цитокинов в сумме для 4 доноров. Фиг. 1C: Резидентные γδ клетки кожи состоят преимущественно из Vδ1-экспрессирующих γδ Т-клеток (76,24%±17,3), небольшой популяции Vδ2-экспрессирующих Т-клеток (3,06%±6,1) и популяции pan-γδ TCR-положительных клеток, окрашиваемых отрицательно на Vδ1 или Vδ2, также называемых здесь двойные отрицательные (DN) γδ Т-клетки (20,7%±13,97). Контрольное окрашивание крови здоровых добровольцев демонстрирует сильную компартментализацию человеческих γδ T-клеток, поскольку внутри крови доминирует популяция γδ T-клеток, экспрессирующих цепь Vδ2 TCR. Фиг. 1D: Резидентные γδ Т-клетки кожи содержат маркеры, как показано ранее, ассоциированные с хронически активированными Т-клетками, хотя эти маркеры скорее являются характерными показателями постоянного нахождения в ткани, чем хронической активации. Гистограммы демонстрируют окрашивание указанных маркеров на γδ Т-клетках (закрашенная гистограмма) по сравнению с соответствующим изотипическим контролем для каждого антитела (незакрашенная гистограмма).
На фиг. 2А-2D показано, что резидентные γδ T-клетки кожи, полученные непосредственно из кожи человека по методу Кларка, дают так называемый TH1-смещенный ответ при активации под действием средств, обычно активирующих Т-клетки, и подобным образом дают TH1-смещенный ответ при активации только под действием лигандов NKG2D. Фиг. 2A: В резидентных γδ T-клетках кожи наблюдается высокий уровень экспрессии активаторного и ассоциированного с NK-клетками рецептора NKG2D (закрашенная гистограмма по сравнению с изотипом, представленным незакрашенной гистограммой). При активации под действием связанного с планшетом рекомбинантного MICA, одного из известных лигандов рецепторов NKG2D, γδ Т-клетки кожи отвечают в отсутствии какой-либо другой стимуляции, причем ответ не зависит от TCR, поскольку он отменяется в присутствии антител, блокирующих NKG2D. Клетки стимулируют в течение 6 часов в присутствии брефелдина А и 100 единиц IL-2/мл и затем анализируют дегрануляцию путем окрашивания на CD107a. Продукцию TNFα и INF-γ анализируют по пермеабилизации после поверхностного окрашивания и последующего окрашивания внутриклеточных цитокинов. Форбол 12-миристат 13-ацетат (P) в сочетании с иономицином (I) используют в качестве положительного контроля для активации Т-клеток. Фиг. 2B: Резидентные γδ T-клетки кожи дают TH1-смещенный ответ. γδ Т-клетки извлекают с помощью метода Кларка и стимулируют PMA и иономицином в течение 6 ч в присутствии брефелдина А, после чего окрашивают на внутриклеточные цитокины. γδ Т-клетки, свежевыделенные из человеческой кожи, продуцируют TNFα и IFN-γ после стимуляции, но лишь небольшие или недетектируемые количества цитокинов, например, IL-4, IL-17A, IL-13, IL-22, которые связаны с клетками TH2 или TH-17, тогда как обычные αβ Т-клетки CD4+ продуцируют гораздо более широкий спектр цитокинов. Фиг. 2C: Среди лимфоцитов, полученных непосредственно из кожи человека, γδ Т-клетки, обычные αβ Т-клетки CD8a+ и NK-клетки экспрессируют разные уровни рецептора NKG2D. Среди указанных клеток NK-клетки отвечают на воздействие только лигандов NKG2D, однако из Т-клеток лишь популяция γδ Т-клеток дает цитокиновый ответ при стимуляции лигандами NKG2D в отсутствии какой-либо стимуляции TCR (см. верхний ряд точечной диаграммы проточной цитометрии). Растворимые блокирующие антитела против NKG2D блокируют ответ, свидетельствуя о том, что ответ опосредуется исключительно рецептором NKG2D. Фиг. 2D: Среди резидентных γδ T-клеток кожи только γδ T-клетки Vδ1 и DN обладают врожденной способностью к активации под действием только рекомбинантного MICA (обозначены символом *). Vδ2-экспрессирующие Т-клетки, обнаруженные в небольших количествах в коже, не дают такого ответа.
На фиг.3А-3D показано, что резидентные γδ Т-клетки кожи исключительно отвечают на выделение из дермальной стромы сильной активацией и пролиферацией. Фиг. 3A: Резидентные лимфоциты кожи выделяют по методу Кларка. После органотипического культивирования в течение 3 недель лимфоциты кожи собирают, отделяют от остальных клеток кожи, включающих в себя фибробласты, и помещают в лунки для культивирования тканей при плотности 1 млн лимфоцитов/мл и добавляют 100 ед/мл IL-2. Еще через 3 недели резидентные γδ Т-клетки сильно увеличиваются в числе и обогащают культуру лимфоцитов кожи. Данное явление интенсивной пролиферации свойственно только резидентным γδ Т-клеткам, представленным в основном Т-клетками Vδ1+, число которых через 3 недели увеличивается в среднем в 127,18 раза, тогда как число обычных αβ T-клеток в среднем увеличивается только в 5,21 раза; что более чем в 20 раз меньше. Фиг. 3B: Резидентные Т-клетки кожи Vδ1+ реагируют на потерю ткани путем интенсивной повышающей регуляции маркера Ki-67 (указывающего на клеточный цикл) в течение 14 дней (изотипический контроль представлен незакрашенной гистограммой, ограниченной пунктирной линией, экспрессия Ki-67 на 0 день представлена незакрашенной гистограммой, экспрессия Ki-67 на 7 день представлена светло-серой гистограммой, экспрессия Ki-67 при окрашивании на 14 день представлена темно-серой гистограммой). Кроме того, резидентные T-клетки кожи Vδ1, которые в большинстве своем являются отрицательными по рецептору IL-2 альфа (CD25) при контакте с дермальной стромой, осуществляют повышающую регуляцию CD25 после выделения из ткани (изотипический контроль: пунктирная гистограмма, окрашивание на 0 день: светло-серая гистограмма, окрашивание на 7 день: темно-серая гистограмма).
Фиг. 3C: Высокие скорости клеточного цикла, о которых свидетельствуют значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) Ki-67, наблюдаются только в резидентных T-клетках кожи, представленных Т-клетками Vδ1+, и не наблюдаются ни в обычных αβ Т-клетках, ни в NK-клетках, где MFI фактически уменьшается в течение 14 дней. Фиг. 3D: После выращивания в течение 3 недель лимфоциты кожи, отделенные от стромальных клеток, сильно обогащены популяцией γδ T-клеток. Эта популяция γδ T-клеток состоит в основном из Vδ1-положительных клеток (77,49%±17,04) и pan γδ TCR-положительных T-клеток DN (21,46%±16,92). Небольшая популяция Vδ2 T-клеток, присутствующая изначально в свежесобранных лимфоцитах кожи, полученных по методу Кларка, уменьшается и почти исчезает (0,6%±1,204) после выращивания тканевых γδ T-клеток в течение 3 недель.
На фиг.4А и 4В показано, что резидентные γδ Т-клетки кожи отвечают на потерю ткани и удерживаются под контролем клеток дермальной стромы, особенно фибробластов, посредством зависимого от контакта механизма. Фиг. 4А: Смешанные лимфоциты кожи собирают после органотипического культивирования по методу Кларка в течение 3 недель. Затем смешанные лимфоциты высевают на поверхность достигшего слияния слоя аутологичных фибробластов кожи и в трансвел, чтобы контролировать наличие растворимых ингибиторов, продуцируемых фибробластами. Через 14 дней измеряют интенсивность размножения путем определения абсолютного числа γδ T-клеток и обычных αβ T-клеток. После отделения от ткани и в присутствии фибробластов резидентные γδ T-клетки кожи дают сильный пролиферативный ответ, но только в том случае, если они не находятся в непосредственном контакте с аутологичными фибробластами. Обычные αβ Т-клетки не дают такого ответа ни в каком тестируемом состоянии. Фиг. 4B: Смешанные лимфоциты, полученные из органотипической культуры, высевают на монослой аутологичных фибробластов (светло-серые гистограммы) или в пустые лунки (темно-серые гистограммы), добавляют IL-2 и выращивают в течение 7 дней. Резидентные Т-клетки кожи Vδ1+(левые панели), а также pan γδ TCR+ Т-клетки DN (правые панели) остаются спокойными в непосредственном присутствии фибробластов, но сильно активируются при отделении от дермальной органотипической культуры и в отсутствии фибробластов, на что указывает повышенная экспрессия (MFI) CD25, TH-ассоциированного фактора транскрипции T-bet и маркера клеточного цикла Ki-67 (пунктирные, незакрашенные гистограммы обозначают соответствующий изотипический контроль).
На фиг. 5А и 5В показано, что при размножении γδ Т-клеток кожи проявляются признаки дерепрессии и увеличения сильного цитотоксического потенциала. Фиг. 5A: Резидентные γδ Т-клетки кожи оставляют размножаться в течение 14 дней после отделения от органотипической клеточной культуры. Затем γδ Т-клетки подвергают отрицательному сортингу методом проточной цитометрии, исключая все обычные Т-клетки, окрашенные моноклональным антителом pan αβ TCR. Затем 150000 отсортированных γδ Т-клеток высевают в плоский 96-луночный культуральный планшет с двойными повторами и оставляют культивироваться в течение 24 часов без добавления цитокинов, или без добавления какого-либо активирующего лиганда. Супернатанты собирают и анализируют на наличие цитокинов с использованием цитокиновой матрицы Affymetrix LUMINEX®. Фиг. 5B: Полученные путем отрицательного сортинга γδ Т-клетки также высевают на линии раковых клеток, высеянных за 1 день до этого в концентрации 10000 клеток на лунку. В качестве контроля используют полученные путем отрицательного сортинга обычные αβ Т-клетки кожи. Т-клетки высевают в следующих эффекторных условиях: целевые соотношения указаны в присутствии и отсутствии блокирующего антитела NKG2D в присутствии 100 ед/мл IL-2. Резидентные γδ Т-клетки кожи обладают превосходной способностью к уничтожению, что демонстрируют по высвобождению злокачественными клеточными линиями, измеряемому методом ELISA, расщепленного каспазой эпителиального специфического цитокератина 18 (CK18), по сравнению с обычными αβ Т-клетками. Цитотоксичность по меньшей мере частично опосредуется рецептором NKG2D, что демонстрируется уменьшением его уровня в культурах, содержащих антитело, блокирующее рецептор NKG2D.
На фиг. 6A-6D показан анализ тканерезидентных γδ T-клеток в кишечнике человека. Фиг. 6A: Резидентные лимфоциты кишечника выделяют с помощью адаптированного метода Кларка. Смешанные лимфоциты кишечника содержат большую популяцию тканерезидентных γδ Т-клеток, которые в основном состоят из клеток Vδ1, но также содержат клетки Vδ2 и двойные отрицательные γδ Т-клетки. Фиг. 6B: γδ Т-клетки, выделенные из органотипической культуры клеток кишечника, дают ответы, подобные ответам γδ Т-клеток кожи, поскольку они после отделения от стромы кишечника активируют Ki-67 с течением времени. Фиг. 6C: γδ Т-клетки, полученные из кишечника, отвечают на стимулы, подобные врожденным, такие как рекомбинантный MICA, путем продукции IFN-γ и дегрануляции, что измеряют по регуляции CD107a. Фиг. 6D: γδ Т-клетки, выделенные из органотипической культуры клеток кишечника, дают ответы, подобные ответам γδ Т-клеток кожи, и растут со временем в культуре клеток, что можно видеть по общему обогащению культур лимфоцитов, лишенных контакта со стромой кишечника.
На фиг. 7А и 7В показан тканевой фенотип полученных после культивирования γδ Т-клеток кожи. Фиг. 7A: γδ Т-клетки кожи характеризуются положительным окрашиванием на кожный лимфоцитарный антиген (CLA), кожные хоминговые рецепторы хемокинов CCR4 и CCR8. Фиг. 7B: Уровни экспрессии в культивированных γδ Т-клетках, полученных из кожи или крови, различаются.
На фиг. 8 показано, что дерепрессия γδ Т-клеток кожи, без какой-либо стимуляции TCR, приводит к спонтанной продукции цитокина TH-1, и, что интересно, в отличие от свежих TCR-активированных γδ Т-клеток, к продукции атопического цитокина IL-13. Как и свеже полученные γδ Т-клетки, дерепрессированные и культивированные γδ Т-клетки продуцируют незначительное количество TH-2-ассоциированных цитокинов, таких как IL-4 и IL-5. γδ Т-клетки кожи оставляют расти в течение 14 дней и затем подвергают отрицательному сортингу путем исключения обычных αβ Т-клеток. 150000 смешанных γδ Т-клеток культивируют при плотности 1 млн клеток/мл в 96-луночном плоскодонном планшете с двойными повторами для 4 доноров без какой-либо стимуляции или добавления цитокинов. Супернатанты собирают через 24 часа и анализируют с использованием матрицы цитокинов на основе LUMINEX®, Affymetrix.
На фиг. 9A-9C показано, что полученные после культивирования и отрицательного сортинга γδ Т-клетки кожи обладают сильной цитотоксичностью в отношении разных линий опухолевых клеток человека, с которыми их совместно культивируют (фиг.9A: HCT1954, фиг.9B: HCT1 16, фиг.9C: MD231), где цитотоксичность измеряют методом ELISA по высвобождению клетками-мишенями расщепленного каспазой цитокератина 18.
На фиг. 10А и 10В показано, что в свежих, некультивированных Т-клетках кожи Vδ1 маркеры присутствуют до активации Т-клеток. Фиг. 10A: Т-клетки кожи Vδ1 экспрессируют CD69, ICOS и TIM3 на высоких уровнях и CD28 на низком уровне. Кроме того, они экспрессируют на высоком уровне маркер активации NKG2D. Данный фенотип поддерживается Т-клетками кожи Vδ1 в процессе культивирования in vitro. И наоборот, T-клетки Vδ1, полученные из человеческой крови, не имеют этих признаков активации, не экспрессируют CD69 или TIM3 и экспрессируют только незначительные уровни ICOS. Экспрессия NKG2D в Т-клетках крови Vδ1 значительно ниже, чем в Т-клетках кожи Vδ1, однако Т-клетки крови Vδ1 экспрессируют костимулирующую молекулу CD28. Фиг. 10B: Только Т-клетки кожи Vδ1 взаимодействуют с лигандами NKG2D, такими как рекомбинантный MICA, в отсутствие каких-либо других стимулов, таких как лиганд Т-клеточного рецептора. Т-клетки крови Vδ1 или Vδ2 не проявляют такой реакции на естественные стимулы. Клетки высевают в 96-луночные планшеты, содержащие рекомбинантный MICA или антитела против CD3, или то и другое, как указано. Клетки выращивают в течение 6 часов в присутствии 100 ед/мл IL-2 и BFA в течение последних 4 часов с последующим окрашиванием поверхностного антигена, пермеабилизацией и внутриклеточным окрашиванием IFN-γ.
На фиг. 11 показано, что Т-клетки кожи Vδ1 экспрессируют минорные уровни CD16, но экспрессируют высокоаффинный рецептор IgG CD64. Следовательно, помимо непосредственной цитотоксической активности тканевые T-клетки Vδ1 также можно использовать для повышения эффективности терапии моноклональными антителами, такой как терапия, направленная на CD20 или Her2, поскольку они определяются антителом со стороны злокачественных новообразований и метастазов, распознают опсонизированные опухолевые клетки и уничтожают их посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Результаты показаны для одного типичного донора (из четырех).
На фиг. 12 показано культивирование Т-клеток Vδ1 в присутствии IL-2 (левая панель), IL-15 (центральная панель) и IL-2+IL-5 (правая панель). Свежевыделенные лимфоциты кожи культивируют в течение 7 дней в 96-луночных плоскодонных планшетах в среде RPMI, содержащей 10% FCS и 1% Pen/Strep, в которую добавляют соответственно IL-2, IL-15 или IL-2+IL-15. И IL-2, и IL-15, а также сочетание обоих цитокинов индуцирует пролиферацию T-клеток Vδ1, что показывает сдвиг окраски KI-67 по сравнению с изотипическим (истинно отрицательным) окрашиванием в отсутствии каких-либо стромальных клеток. Ki-67 окрашивает только клетки, которые вышли из GO клеточного цикла и обычно ассоциируется с пролиферацией.
На фиг. 13 показаны результаты проточной цитометрии, которые свидетельствуют об экспрессии CD9, CCR3 и CD39 на поверхности культивированных γδ Т-клеток Vδ1 на 21-й день. В культивированных T-клетках кожи Vδ1 поддерживаются высокие уровни клеточных поверхностных маркеров, CCR3, CD39 и CD9, как указано (темная гистограмма) по сравнению с эквивалентным изотипическим окрашиванием (истинная отрицательная, незакрашенная гистограмма).
На фиг.14 показана экспрессия мРНК CCR3 и CD9 в T-клетках кожи Vδ1 (темные столбики) и T-клетках крови Vδ1 (светлые столбики). T-клетки кожи Vδ1 выращивают по описанному здесь способу, а Т-клетки крови Vδ1 выращивают с использованием связанных с планшетом антител против рецептора Т-клеток Vδ (20 мкг/мл). После выращивания Т-клетки Vδ1 получают методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) от трех доноров из обеих групп и выделяют РНК (кровь=серый, кожа=черный). Целую мРНК секвенируют, уровни экспрессии указанных мРНК нормализуют и трансформируют в log2. Все уровни экспрессии показаны в непосредственном сравнении и в отношении к GAPDH, распространенному гену домашнего хозяйства, экспрессируемому на высоких уровнях в большинстве человеческих клеток.
На фиг. 15 показана экспрессия мРНК IL-13 в T-клетках кожи Vδ1 (темные столбики) и тромбоцитах Vδ1, полученных из крови (светлые столбики). T-клетки кожи Vδ1 выращивают по описанному здесь способу, а Т-клетки крови Vδ1 выращивают с использованием высоких доз связанных с планшетом антител против рецептора Т-клеток Vδ (20 мкг/мл). После выращивания Т-клетки Vδ1 получают методом FACS от трех доноров из обеих групп и выделяют РНК (кровь=серый, кожа=черный). Целую мРНК секвенируют, уровни экспрессии мРНК IL-13 нормализуют и трансформируют в log2. Все уровни экспрессии показаны в непосредственном сравнении и в отношении к GAPDH.
На фиг. 16А и 16В показана продукция цитокинов в T-клетках кожи Vδ1 после стимуляции TCR PMA/иономицином (фиг.16А) или антителом против CD3 (фиг.16В). После выделения и выращивания T-клетки кожи Vδ1 очищают методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). 150000 Т-клеток Vδ1 высевают в 96-луночный плоскодонный планшет с двойными повторами для трех доноров и стимулируют либо связанным с планшетом антителом против CD3 (5 мкг/мл), либо PMA/иономицином в течение 24 часов. Супернатанты анализируют на абсолютные количества указанных цитокинов с использованием платформы LUMINEX®.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Гамма дельта Т-клетки (γδ Т-клетки) представляют собой небольшую субпопуляцию Т-клеток, которые экспрессируют на поверхности особый, определяющий Т-клетки рецептор (TCR). Этот TCR состоит из одной гамма (γ) и одной дельта (δ) цепи.
Существует два основных подтипа человеческих γδ Т-клеток: один из них преобладает в периферической крови, а второй преобладает в негемопоэтических тканях.
Локализация второго подтипа человеческих γδ T-клеток в негемопоэтической ткани затрудняет получение образцов, кроме того, отсутствуют стандартные способы культивирования таких клеток. Для удовлетворения данной потребности настоящее изобретение предлагает способ выращивания резидентных γδ Т-клеток негемопоэтической ткани, альтернативно называемых здесь нативные γδ Т-клетки негемопоэтической ткани. Указанные γδ Т-клетки обычно находятся в негемопоэтических тканях. Резидентные γδ Т-клетки негемопоэтической ткани, подходящие для применения в описанном здесь способе, могут происходить или быть получены из негемопоэтической ткани. Негемопоэтические ткани могут содержать негемопоэтические клетки и γδ Т-клетки.
С помощью описанного здесь способа можно выращивать γδ Т-клетки из любой негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, которую можно удалить из организма пациента, такой как ткань кожи, желудочно-кишечного тракта (например, ободочной кишки), молочной железы, легкого, простаты, печени, селезенки и поджелудочной железы. γδ Т-клетки также могут постоянно находиться в человеческих раковых тканях, например, в ткани опухоли молочной железы или предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления γδ Т-клетки могут быть получены из человеческих раковых тканей. В других вариантах осуществления γδ Т-клетки могут быть получены из негемопоэтической ткани, отличной от раковой ткани человека.
γδ Т-клетки, которые преобладают в крови, представляют собой, в основном, Т-клетки Vδ2, тогда как γδ Т-клетки, которые преобладают в негемопоэтических тканях, представляют собой, в основном, Т-клетки Vδ1, так что Т-клетки Vδ1 составляют примерно 70-80% от резидентной популяции γδ Т-клеток негемопоэтической ткани. Однако некоторые Т-клетки Vδ2 также присутствуют в негемопоэтических тканях, например, в кишечнике, где они могут составлять примерно 10-20% от γδ Т-клеток (фиг.6). Некоторые γδ Т-клетки, постоянно присутствующие в негемопоэтических тканях, не экспрессируют ни Vδ1, ни Vδ2 TCR, и авторы называют их двойные отрицательные (DN) γδ Т-клетки. Указанные γδ Т-клетки DN, скорее всего, преимущественно экспрессируют Vδ3, однако небольшое количество Т-клеток экспрессируют Vδ5.
Следовательно, γδ Т-клетки, которые обычно находятся в негемопоэтических тканях, и которые выращивают по способу настоящего изобретения, предпочтительно представляют собой Т-клетки, отличные от Vδ2, например, Т-клетки Vδ1, содержащие небольшое число γδ T-клеток DN.
В используемом здесь значении "двойные отрицательные" γδ Т-клетки (γδ T-клетки DN) представляют собой γδ Т-клетки, которые экспрессируют рецепторы γδ (то есть положительные окрашиваемые на pan-TCR), но являются отрицательными по рецепторам Vδ1 и Vδ2. γδ Т-клетки DN включают в себя клетки, которые экспрессируют рецепторы Vδ, отличные от Vδ1 и Vδ2 (например, Vδ3, Vδ4, Vδ5 или Vδ8). Клетку можно охарактеризовать как положительную по маркеру (например, как Vδ1+), если она экспрессирует маркер на уровне, превышающем уровень экспрессии в клетке, используемой в качестве отрицательного контроля, как определено стандартными методами пропускания FACS.
Описанный здесь способ может включать в себя культивирование in vitro лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного.
Лимфоциты могут быть получены из любой подходящей негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного. Негемопоэтическая ткань представляет собой ткань, отличную от ткани крови, костного мозга или тимуса. В некоторых вариантах осуществления γδ Т-клетки не получены из конкретных типов образцов биологических жидкостей, таких как кровь или синовиальная жидкость. Примерами таких подходящих негемопоэтических тканей человека или отличного от человека животного являются ткани кожи или ее части (например, дермы, эпидермиса), желудочно-кишечного тракта (например, желудочно-кишечного эпителия, толстой кишки, тонкой кишки, желудка, аппендикса, слепой кишки или прямой кишки), молочной железы, легкого (предпочтительно, если ткань не получена путем бронхоальвеолярного лаважа), простаты, печени, селезенки и поджелудочной железы. γδ Т-клетки также могут постоянно присутствовать в человеческих раковых тканях, например, в тканях рака молочной железы и предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления γδ Т-клетки не получают из раковой ткани человека. Образцы негемопоэтических тканей можно получить с помощью стандартных методов, таких как эксплантация (например, биопсийного образца).
Лимфоциты можно получить любым подходящим способом, который позволяет выделить лимфоциты из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного. Один из таких способов предложен в Clark et al. (29), где описана методика трехмерного культивирования эксплантата кожи для выделения лимфоцитов из кожи человека. Эксплантат можно прикрепить к синтетическому каркасу для облегчения выхода лимфоцитов из эксплантатов на каркас. Синтетический каркас представляет собой неприродную трехмерную структуру, подходящую для поддержания роста клеток. Синтетические каркасы можно изготовить из таких материалов, как полимеры (например, натуральные или синтетические полимеры, такие как поливинилпирролидоны, полиметилметакрилат, метилцеллюлоза, полистирол, полипропилен, полиуретан), керамические материалы (например, трикальция фосфат, алюминат кальция, гидроксиапатит кальция), или металлы (тантал, титан, платина и металлы из той же группы элементов, что и платина, ниобий, гафний, вольфрам, а также сочетания их сплавов). Биологические факторы (такие как коллагены (например, коллаген I или коллаген II), фибронектины, ламинины, интегрины, ангиогенные факторы, противовоспалительные факторы, гликозаминогликаны, витрогены, антитела и их фрагменты, цитокины (например, интерлейкин-2 (IL-2) или интерлейкин-15 (IL-15) и их сочетания) можно нанести на поверхность каркаса или инкапсулировать в каркасном материале для улучшения адгезии, миграции, выживания или пролиферации клеток в соответствии со способами, известными в данной области. Данный способ и другие способы можно использовать для выделения лимфоцитов из ряда других негемопоэтических тканей, таких как ткани кишечника, предстательной железы и молочной железы. Другие примеры подходящих способов включают в себя ферментативное расщепление ткани и метод "выползания", описанный Carrasco et al. (30), в котором ткань измельчают и добавляют IL-2, чтобы лимфоциты "выползали".
Как указано выше, можно использовать любые подходящие негемопоэтические ткани, такие как ткани кожи, желудочно-кишечного тракта (например, ободочной кишки), молочной железы, легкого, простаты, печени, селезенки и поджелудочной железы.
Резидентные γδ Т-клетки негемопоэтической ткани предпочтительно получают из ткани человека. Однако они могут быть получены из негемопоэтической ткани любого подходящего отличного от человека животного, такого как мышь, крыса, собака, лошадь и свинья.
Критической стадией является целенаправленное разделение, например, после культивирования в течение нескольких дней или недель, резидентных Т-клеток негемопоэтической ткани (например, в смешанной популяции лимфоцитов, которая может содержать, например, αβ, γδ2 и отличные от γδ2 Т-клетки) и негемопоэтических клеток (таких как стромальные клетки, особенно фибробласты) ткани, из которой были получены Т-клетки, с последующим культивированием лимфоцитов в присутствии цитокинов, как описано ниже. Это обеспечивает селективный и значительный рост в течение следующих дней и недель тканевых Т-клеток γδ 1 и γδ DN.
В настоящем описании термины "разделение", "разделенные" или "разделять" относятся к акту нарушения или прекращения физического контакта между разными популяциями клеток. Разделение можно осуществить, например, путем интенсивного пипетирования смешанной популяции клеток с целью разрушения межмембранных ассоциаций или путем индуцирования "выползания" популяции клеток, например, из тканевой матрицы, при культивировании, например, в присутствии хемокинов или цитокинов, как описано Carrasco et al. (30). Разделение можно поддерживать в процессе культивирования с использованием системы Трансвел или аналогичных методов культивирования, которые позволяют предотвратить физический контакт между разными популяциями клеток.
Используемый здесь термин "практически чистый" относится к чистоте более 90% по количеству, массе или объему. Термин "практически не содержит" означает наличие менее 5% по количеству, массе или объему указанного компонента. Лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, можно культивировать в течение по меньшей мере 3 дней, по меньшей мере 4 дней, по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере 6 дней, по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 8 дней, по меньшей мере 9 дней, по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, или по меньшей мере 4 недель.
Способ включает в себя культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-2. Концентрация IL-2 предпочтительно составляет по меньшей мере 10 международных единиц/мл (МЕ/мл или ед/мл), по меньшей мере, 20 ед/мл, по меньшей мере 30 ед/мл, по меньшей мере 40 ед/мл, по меньшей мере 50 ед/мл, по меньшей мере, 60 ед/мл, по меньшей мере, 70 ед/мл, по меньшей мере, 80 ед/мл, по меньшей мере 90 ед/мл или по меньшей мере 100 ед/мл.
Использование IL-2 для стимулирования экспрессии γδ Т-клеток кожи не является очевидным, поскольку клетки экспрессируют очень низкие уровни высокоаффинного рецептора IL-2, известного как CD25 (фиг. 1D). Однако данный рецептор подвергается повышающей регуляции в отдельных субпопуляциях γδ T-клеток в результате отделения от клеток других типов, таких как стромальные или эпителиальные клетки (например, фибробласты) (см. фиг.3B и 4B), что делает клетки высокочувствительными к IL-2.
Используемый здесь термин "IL-2" относится к IL-2 дикого типа (например, нативному или рекомбинантному), или к средству, которое действует как агонист на одну или нескольких субъединиц рецептора IL-2 (IL-2R) (такому как мутеины IL-2, аналоги IL-2 длительного действия, их субъединицы, комплексы с рецепторами). Такие средства могут поддерживать пролиферацию IL-2-зависимой клеточной линии, CTLL-2 (33, Американская коллекция типовых культур (ATCC®), TIB 214). Зрелый IL-2 человека встречается в виде последовательности из 133 аминокислот (меньше сигнального пептида, который дополнительно содержит 20 N-концевых аминокислот), как описано в Fujita, et al. (34). Мутеин IL-2 представляет собой полипептид, полученный в результате специфических замен в последовательности белка интерлейкина-2 и сохраняющий способность связывать IL-2Rβ, как описано в US 2014/0046026. Мутеины IL-2 могут содержать аминокислотные вставки, делеции, замены и модификации в одном или нескольких положениях нативной полипептидной цепи IL-2, или по другим остаткам нативной полипептидной цепи IL-2. В соответствии с настоящим описанием любые такие вставки, делеции, замены и модификации позволяют получить мутеин IL-2, который сохраняет способность к связыванию IL-2Rβ. Типичные мутеины можно получить путем замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую человеческий IL-2, можно получить с помощью традиционных способов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Аминокислотную последовательность человеческого IL-2 (Gene ID 3558) можно найти в Genbank под номером доступа NP_000577.2 GI: 28178861. Аминокислотную последовательность мышиного (Mus musculus) IL-2 (Gene ID 16183) можно найти в Genbank под номером доступа NP_032392.1 GI: 7110653.
Лимфоциты предпочтительно культивируют в присутствии IL-2 и IL-15, так как добавление IL-15 в сочетании с IL-2 приводит к усилению роста пролиферирующих негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток по сравнению с одним IL-2. Концентрация IL-15 предпочтительно составляет по меньшей мере 10 нг/мл.
IL-15, как и IL-2, является известным фактором роста Т-клеток, который может поддерживать пролиферацию IL-2-зависимой клеточной линии CTLL-2. IL-15 впервые описан Grabstein et al. (35) как зрелый белок, содержащий 114 аминокислот. Используемый здесь термин "IL-15" относится к нативному или рекомбинантному IL-15, а также к его мутеинам, аналогам, субъединицам или комплексам (например, рецепторным комплексам, таким как пептиды sushi, описанные в WO2007/046006), способным стимулировать пролиферацию клеток CTLL-2. Анализы пролиферации CTLL-2 демонстрируют, что супернатанты клеток, трансфицированных экспрессированным рекомбинантным методом предшественником и гибридами зрелых форм IL-15, полученными с сохранением рамки считывания, могут индуцировать пролиферацию клеток CTLL-2.
Используемый здесь термин IL-15 также относится к IL-15, полученному из разных видов млекопитающих, включающих в себя, например, человека, обезьян, быков, свиней, лошадей и мышей. "Мутеин" или "вариант" IL-15, в соответствии с данным документом, представляет собой полипептид, практически гомологичный последовательности нативного IL-15 млекопитающих, но имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности нативного полипептида IL-15 млекопитающих вследствие аминокислотных удалений, вставок или замен. Варианты могут содержать консервативно замещенные последовательности, то есть последовательности, в которых конкретный аминокислотный остаток заменен остатком, имеющим сходные физико-химические характеристики. Примеры консервативных замен включают замены одного алифатического остатка на другой, например, замены Ile, Val, Leu или Ala друг на друга, или замены одного полярного остатка на другой, например, замены между Lys и Arg; Glu и Asp; или Gln и Asn. Хорошо известны другие консервативные замены, например, замены целых участков, обладающих сходными характеристиками гидрофобности. Природные варианты IL-15 также входят в объем изобретения. Примерами таких вариантов являются белки, образовавшиеся в результате событий альтернативного сплайсинга мРНК или протеолитического расщепления белка IL-15, которые сохраняют связывающие свойства IL-15. Альтернативный сплайсинг мРНК может приводить к образованию укороченного, но биологически активного белка IL-15. Вариации, обусловленные протеолизом, включают в себя, например, различия в N- или С-концах при экспрессии в клетках-хозяевах разных типов вследствие протеолитического удаления одной или нескольких концевых аминокислот из белка IL-15 (обычно от 1 до 10 аминокислот).
Человеческий IL-15 можно получить с помощью способов, описанных Grabstein et al (35), или с помощью традиционных способов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). кДНК человеческого IL-15 помещена в ATCC® 19 февраля 1993 года с присвоением номера доступа 69245.
Аминокислотная последовательность человеческого IL-15 (Gene ID 3600) находится в Genbank под номером доступа NP000576.1 GI: 10835153 (изоформа 1) и NP_751915.1 GI: 26787986 (изоформа 2). Аминокислотная последовательность мышиного IL-15 (Mus musculus) (Gene ID 16168) находится в Genbank под номером доступа NP_001241676.1 GI: 363000984.
Лимфоциты можно культивировать в отсутствии IL-6, IL-23 и IL-1B, или в присутствии низких концентраций указанных цитокинов (например, менее 20 нг/мл), поскольку добавление этого сочетания цитокинов, по-видимому, снижает пролиферацию негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток. Это является неожиданным, так как считается, что указанные цитокины способствуют пролиферации.
Лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани, можно культивировать в отсутствии средств, активирующих Т-клеточный сигнальный путь (например, агонистов пути Т-клеточного рецептора (TCR)). Например, лимфоциты, полученные из негемопоэтической ткани, можно культивировать в среде, которая не поддерживает или не индуцирует пролиферацию или активацию αβ Т-клеток и резидентных γδ Т-клеток крови. Подходящая среда может не содержать или практически не содержать агонисты TCR или другие средства, активирующие Т-клеточный сигнальный путь. И наоборот, для культивирования γδ T-клеток из гемопоэтических тканей требуется присутствие средства, активирующего Т-клеточный сигнальный путь, такого как золедронат (41, 42) или антитело против CD3, такое как OKT3 (43).
Средства, активирующие Т-клеточный сигнальный путь, относятся к соединениям, которые индуцируют пролиферацию или активацию Т-клеток, таких как αβ Т-клетки и/или резидентные γδ Т-клетки крови, через сигнальный путь или костимуляцию TCR. Модуляторы Т-клеточного сигнального пути действуют путем последовательной активации Src-родственных тирозин-специфичных протеинкиназ (PTK), LcK и Fyn и связанной с зета-цепью (TCR) протеинкиназы размером 70 кДа (ZAP70). Указанные PTK фосфорилируют полипептиды, включая линкерный активатор Т-клеток (LAT), что приводит к нижестоящей стимуляции через киназу, регулируемую внеклеточными сигналами (ERK), c-Jun N-концевой киназы (JNK) и ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Совместная стимуляция, например, через CD28 и CD45, может усиливать фосфорилирование и сигнальные пути TCR. Таким образом, любое средство, направленное на часть TCR или костимуляторный путь, может активировать Т-клеточный сигнальный путь. Средства, активирующие Т-клеточный сигнальный путь, могут быть растворимыми или связанными с мембраной, и могут, например, презентироваться на клетках, таких как искусственные антигенпрезентирующие клетки (aAPC). aAPC, подходящие для активации Т-клеточного сигнального пути, известны в данной области (44).
В некоторых вариантах осуществления лимфоциты можно культивировать в отсутствии экзогенно добавленных агонистов пути Т-клеточного рецептора, таких как активаторы CD3 и/или CD28 (например, моноклональные антитела против CD3 и/или против CD28); фитогемагглютинин (PHA); конканавалин А, синтетические фосфоантигены, такие как BrHPP (бромгидринпирофосфат), 2M3B1PP (2-метил-3-бутенил-1-пирофосфат), HMBPP ((E)-4-гидрокси-3-метилбут-2-енила пирофосфат) или IPP (изопентенилпирофосфат); N-бисфосфонаты, такие как золедронат; рекомбинантный CD70; моноклональные антитела против CD2; моноклональные антитела против CD27; моноклональные антитела против pan-TCRγδ; моноклональные антитела против CD277; или искусственные антигенпрезентирующие клетки (aAPC). Средства, активирующие Т-клеточный сигнальный путь, также включают в себя молекулы, связанные с клеточной поверхностью, такие как комплексы MHC или HLA, связанные с антигенпрезентирующими клетками (APC) или искусственными APC. Подходящие способы активации Т-клеток путем экзогенного добавления агонистов пути TCR хорошо известны в данной области и приведены на фиг.1 в Deniger et al. (44).
Например, лимфоциты можно культивировать в среде, которая не содержит или практически не содержит экзогенно добавленных агонистов пути Т-клеточного рецептора. При использовании способа настоящего изобретения добавление таких средств, активирующих сигнальный путь Т-клеточного рецептора, не требуется для роста негемопоэтических резидентных γδ Т-клеток. И наоборот, для роста гемопоэтических тканевых γδ T-клеток требуется присутствие как IL-2, так и средства, активирующего сигнальный путь Т-клеточного рецептора, такого как золедронат (41, 42).
В некоторых вариантах осуществления лимфоциты можно культивировать в кондиционированных средах из культур стромальных клеток, чтобы обеспечить добавки, необходимые для роста γδ T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления γδ Т-клетки можно культивировать в среде для выращивания γδ, содержащей IL-2 и/или IL-15. Подходящая среда для выращивания γδ лишена средств, активирующих Т-клетки, например, средств, активирующих αβ Т-клетки или γδ Т-клетки крови, и, например, может не содержать или практически не содержать агонисты TCR или костимулирующие средства. В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания γδ может содержать один или несколько дополнительных факторов роста, таких как цитокины, в дополнение к IL-2 и/или IL-15. Подходящие факторы роста не обладают способностью активировать Т-клетки. В других вариантах осуществления среда для выращивания γδ может не содержать факторы роста, отличных от IL-2 и/или IL-15; например, среда для выращивания γδ может состоять из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
Существуют многочисленные основные культуральные среды, подходящие для пролиферации γδ T-клеток, в частности полные среды, такие как AIM-V, среда Искова и RPMI-1640 (Life Technologies). Среда может быть дополнена другими компонентами среды, такими как сыворотка, сывороточные белки и средства селекции, такие как антибиотики. Например, в некоторых вариантах осуществления можно использовать среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ глутамин, 10% FBS, 10 мМ HEPES, pH 7,2, 1% пенициллина-стрептомицина, пируват натрия (1 мМ, Life Technologies), незаменимые аминокислоты (например, 100 мкМ Gly, Ala, Asn, Asp, Glu, Pro и Ser; 1X MEM незаменимые аминокислоты Life Technologies) и 10 мкл/л β-меркаптоэтанола. Основная среда может быть дополнена IL-2 и/или IL-15 в стандартных концентрациях, которые может легко определить квалифицированный специалист путем рутинного эксперимента.
Обычно клетки культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, в подходящей культуральной среде.
Т-клетки γδ можно культивировать с помощью описанного здесь способа в любой подходящей системе, включая ферментеры с механическим перемешиванием, эрлифтные ферментеры, роллерные флаконы, культуральные мешки или чашки и другие биореакторы, в частности половолоконные биореакторы. Применение таких систем хорошо известно в данной области.
Способы и методы культивирования лимфоцитов хорошо известны в данной области (36-39).
В процессе культивирования лимфоциты не находятся в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками. Это связано с тем, что непосредственный контакт лимфоцитов со стромальными или эпителиальными клетками, по-видимому, препятствует росту тканерезидентных γδ T-клеток.
Стромальные клетки представляют собой негемопоэтические клетки соединительной ткани любого органа и поддерживают функцию паренхимных клеток этого органа. Примеры стромальных клеток включают в себя фибробласты, перициты, мезенхимальные клетки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и клетки негематологических опухолей. Предпочтительно лимфоциты не находятся в непосредственном контакте с фибробластами во время культивирования.
Эпителиальные клетки представляют собой негемопоэтические клетки, которые выстилают полости и поверхности кровеносных сосудов и органов по всему организму. Обычно они плоские, столбчатые или кубовидные по форме и могут находиться в виде одного слоя клеток или в виде двух или более слоев клеток.
Фибробласты и/или другие стромальные или эпителиальные клетки предпочтительно присутствуют во время культивирования лимфоцитов, поскольку факторы, секретируемые этими клетками, могут способствовать росту негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, но не находятся в непосредственном контакте с лимфоцитами, поскольку непосредственный контакт препятствует росту негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток. Например, лимфоциты можно культивировать в трансвелах, которые обеспечивают физическое разделение лимфоцитов и фибробластов. Примеры фибробластных клеточных линий, подходящих для применения, включают в себя фибробласты крайней плоти человека (например, BJ (ATCC® CRL-2522™)), нормальные фибробласты кожи (например, CCD-1059Sk (ATCC® CRL-2072™)) и фибробласты легких (например, HEL 299 (ATCC® CRL-137)).
С помощью метода Кларка негемопоэтические тканерезидентные лимфоциты можно собрать и отделить от стромальных клеток, таких как фибробласты кожи, например, путем жесткого пипетирования. Собранные лимфоциты можно затем промыть через нейлоновую сетку 40 мкл, чтобы сохранить агрегированные фибробласты, которые могут стать свободными во время процесса. Лимфоциты также можно выделить путем флуоресцентной или магнитной сортировки клеток с использованием, например, антител против CD45. Чтобы свести к минимуму активацию Т-клеток, их также можно отсортировать исключительно по параметрам прямого и бокового рассеяния. Затем лимфоциты можно выращивать отдельно от стромальных клеток (например, фибробластов), или в их присутствии, но не в непосредственном контакте. Например, лимфоциты можно выращивать в корзинке системы трансвел так, чтобы слившийся монослой фибробластов в лунке для культивирования клеток находился ниже, чтобы обеспечить обмен растворимыми факторами роста, продуцируемыми фибробластами, при отсутствии непосредственного контакта. Альтернативно фибробласты можно культивировать в корзинке системы трансвел, так, чтобы лимфоциты, растущие в лунке для культивирования клеток, находились значительно ниже. Можно также использовать среды, кондиционированные негемопоэтическими клетками (например, фибробластами), чтобы дополнить рост лимфоцитов.
Кондиционированная среда содержит растворимые факторы, секретируемые негемопоэтическими клетками (например, стромальными клетками, такими как фибробласты). Кондиционированные среды могут содержать или не содержать клетки, которые секретируют факторы. Например, γδ Т-клетки можно культивировать в присутствии клеток, которые секретируют кондиционирующие факторы в процессе культивирования γδ T-клеток. Альтернативно негемопоэтические клетки можно удалить из среды до культивирования γδ T-клеток, оставив в среде секретируемые ими факторы. Кондиционированные среды также включают в себя среды, дополненные предварительно полученными факторами негемопоэтических клеток (например, в виде концентрата или лиофилизированного порошка).
Хотя стромальные или эпителиальные клетки предпочтительно присутствуют во время культивирования лимфоцитов (но не находятся в непосредственном контакте с лимфоцитами), их можно удалить, так чтобы культивировать лимфоциты в отсутствии стромальных или эпителиальных клеток, например, в отсутствии фибробластов.
В некоторых вариантах осуществления после роста негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток в отсутствии средств, активирующих Т-клеточный сигнальный путь, таких как экзогенно добавленные агонисты пути Т-клеточного рецептора, описанные выше, размноженные γδ Т-клетки можно дополнительно культивировать в присутствии одного или нескольких средств, активирующих Т-клеточный сигнальный путь, таких как экзогенные агонисты пути Т-клеточного рецептора, и/или одного или нескольких факторов роста, таких как цитокины. После выращивания по описанному здесь способу и необязательно дополнительного культивирования негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки можно выделять или дополнительно очищать, хранить, смешивать с другими реагентами, такими как фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или использовать по мере необходимости.
Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, можно отличить от других γδ Т-клеток, полученных из крови, поскольку они отвечают на лиганд NKG2D (MICA), который в значительной степени ассоциируется со злокачественными новообразованиями, в отсутствии какого-либо лиганда, стимулирующего T-клеточный рецептор, например, по увеличению продукции TNFα, IFNγ и CD107a (фиг.2A-2D, 10A и 10B). Они также дают цитотоксический Т-клеточный ответ, не подвергаясь какой-либо экзогенной фармакологической или лиганд-опосредованной активации Т-клеточного рецептора и, следовательно, являются цитотоксичными в отсутствии стимуляции (фиг.3 и фиг.5). Это означает, что в отличие от других γδ Т-клеток, αβ Т-клеток или NK-клеток, негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, обладают уникальной способностью отвечать и размножаться в отсутствии добавления каких-либо экзогенных средств, активирующих сигнальный путь Т-клеточного рецептора (фиг. 3). Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, также положительно окрашиваются по CD69 и PD-1, не экспрессируют CD28 и содержат только низкие уровни CD25 (см. фиг.1D). Данное сочетание маркеров не экспрессируется γδ Т-клетками, полученными из крови. Кроме того, они экспрессируют тканевые хоминг-рецепторы, такие как CCR4 и CCR8, на более высоком уровне, чем полученные из крови культивированные Vd2 γδ Т-клетки (фиг. 7B). Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, можно культивировать в присутствии IL2 и/или IL15 и в отсутствии агонистов TCR или других факторов роста. Например, негемопоэтическая тканерезидентная γδ Т-клетка может расти в среде RPMI 1640, дополненной IL-2.
Таким образом, негемопоэтическая тканерезидентная γδ Т-клетка, полученная по способу настоящего изобретения, может обладать одним или несколькими из следующих свойств:
(i) имеет фенотип CD69высокий, ICOSвысокий, TIM3высокий и CD28низкий/отсутствует
(ii) осуществляет повышающую регуляцию одного или нескольких из CCR3, CD39, CD11b и CD9
(iii) продуцирует IFN-γ в ответ на лиганд NKG2D в отсутствии агонистов TCR,
(iv) продуцирует IL-13 в отсутствии агонистов TCR,
(v) продуцирует один или несколько из IFN-γ, TNF-α и GM-CSF в ответ на активацию TCR,
(vi) не продуцирует, или практически не продуцирует IL-17 в ответ на активацию TCR,
(vii) растет в культуральной среде, содержащей IL-2 в отсутствии дополнительных факторов роста,
(viii) дает цитотоксический Т-клеточный ответ в отсутствии агонистов TCR и/или
(ix) обладает избирательной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток в отличие от нормальных клеток.
Предпочтительно негемопоэтическая тканерезидентная γδ Т-клетка, полученная по способу настоящего изобретения, продуцирует IL-13 в отсутствии агонистов TCR, и/или продуцирует IFN-γ в ответ на лиганд NKG2D в отсутствии агонистов TCR.
Т-клетки γδ, полученные по способу настоящего изобретения, можно использовать в способе скрининга на модулятор контрольной точки негемопоэтических тканерезидентных γδ T-клеток. Идентификацию таких модуляторов контрольных точек можно использовать для разработки противораковых иммунотерапевтических средств, поскольку модулятор контрольной точки является потенциальной мишенью для противораковой терапии.
Чтобы определить, является ли тестируемое соединение модулятором контрольной точки, негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки можно культивировать in vitro при непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами) в присутствии или отсутствии тестируемого соединения. Скорость пролиферации или степень активации негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток определяют в присутствии и в отсутствии тестируемого соединения. Если скорость пролиферации или степень активации в присутствии тестируемого соединения выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, то тестируемое соединение, скорее всего, является возможным модулятором контрольной точки. Это связано с тем, что тестируемое соединение способно ослаблять контактное ингибирование стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами).
Тестируемое соединение выбирают на основе его способности модулировать контрольные точки тканерезидентных Т-клеток.
Кажущееся увеличение пролиферации негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, которое также может быть обусловлено ингибированием гибели клеток, можно измерить по увеличению количества Т-клеток или их маркеров и по уменьшению экспрессии маркеров программируемой гибели клеток. Повышенную активацию можно оценить путем измерения высвобождения цитокинов, таких как IFN-γ, которые секретируются активными тканерезидентными γδ Т-клетками.
Альтернативно негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки можно культивировать in vitro в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами) в условиях изменения экспрессии тестируемого гена в γδ Т-клетках, и/или стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах), или в клетках обоих типов. Экспрессию тестируемого гена в γδ Т-клетках, и/или в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах), можно изменить, например, с использованием средства, специфичного к РНК, такого как малая интерферирующая РНК (миРНК) или короткая шпилечная РНК (кшРНК), или путем редактирования генов, например, с использованием системы CRISPR/Cas. Скорость пролиферации или степень активации негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток определяют в присутствии и в отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах), и/или в γδ Т-клетках. Если при изменениях экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или в γδ Т-клетках скорость пролиферации или активации выше, чем при отсутствии изменения тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или в γδ Т-клетках, то тестируемый ген, скорее всего, является возможным геном контрольной точки.
Альтернативно, если скорость уничтожения стромальных или эпителиальных клеток (например, фибробластов) в присутствии тестируемого соединения выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, или при изменении экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах), и/или в γδ Т-клетках выше, чем при отсутствии изменения тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах), и/или в γδ Т-клетках, то тестируемое соединение, скорее всего, является модулятором контрольной точки, или тестируемый ген, скорее всего, является возможным геном контрольной точки. Скорость уничтожения можно измерить, например, путем количественного определения молекул, высвобождаемых умирающими клетками. Более высокая скорость гибели клеток в присутствии тестируемого соединения или при изменении экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или в γδ Т-клетках указывает на то, что контрольная точка, которая подавляла уничтожение клеток, была выключена, и поэтому можно сделать вывод, что тестируемое соединение, скорее всего, является модулятором контрольной точки, или тестируемый ген, скорее всего, является возможным геном контрольной точки.
Примеры линий фибробластов, которые можно использовать в каждом варианте осуществления, включают фибробласты крайней плоти человека (например, BJ (ATCC® CRL-2522™)), нормальные фибробласты кожи (например, CCD-1059Sk (ATCC® CRL-2072™)) и фибробласты легких (например, HEL 299 (ATCC® CRL-137™)).
Чтобы идентифицировать тестируемое соединение как возможный модулятор контрольной точки, или чтобы идентифицировать тестируемый ген как возможный ген контрольной точки, скорость пролиферации и/или активация γδ Т-клеток в присутствии тестируемого соединения или в присутствии изменения тестируемого гена должна быть по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, или по меньшей мере в 5 раз выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, или в отсутствии изменения тестируемого гена. Клеточный цикл можно определить с помощью ряда способов, например, путем определения абсолютного числа клеток в 0 день и 7 день, уровней экспрессии Ki-67 и CD25 (которые являются маркерами клеточного цикла), и путем использования клеточных культуральных красителей, таких как CFSE или CELLTRACE™ фиолетовый. Активацию клеток можно измерить по продукции эффекторных белков, таких как IFN-γ. Кажущееся увеличение пролиферации негемопоэтических тканерезидентных γδ T-клеток, которое также может быть обусловлено ингибированием гибели клеток, можно измерить по увеличению числа Т-клеток или их маркеров, и по уменьшению экспрессии маркеров программируемой гибели клеток.
γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, можно использовать в качестве лекарственного средства, например, для адоптивной терапии Т-клетками. Такая терапия включает в себя перенос пациенту γδ Т-клеток, полученных по способу настоящего изобретения. Терапия может быть аутологичной, когда γδ Т-клетки переносят обратно тому же пациенту, из организма которого они были получены, или терапия может быть аллогенной, когда γδ Т-клетки, полученные от одного индивидуума, переносят другому пациенту. Способ лечения может включать в себя:
получение образца негемопоэтической ткани от индивидуума-донора,
культивирование γδ Т-клеток из описанного выше образца с получением увеличенной популяции и
введение увеличенной популяции γδ T-клеток индивидууму-реципиенту.
Индивидуум-донор и индивидуум-реципиент могут быть одинаковыми или разными.
γδ Т-клетки можно вводить пациенту или индивидууму, нуждающемуся в лечении, любым подходящим способом. Например, γδ Т-клетки можно вводить пациенту или индивидууму, нуждающемуся в лечении, внутривенно или внутритуморально.
Пациент или индивидуум, подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой пациента-человека, страдающего от рака или вирусной инфекции, такой как инфекция CMV или HIV.
Поскольку γδ Т-клетки не связаны с МНС, они не распознают хозяина, которому их переносят как чужеродные, следовательно, они менее склонны вызывать болезнь трансплантат против хозяина. Это означает, что их можно использовать "в готовом виде" и переносить любому реципиенту, например, с целью аллогенной адоптивной терапии Т-клетками.
Поскольку они обычно находятся в негемопоэтических тканях, тканерезидентные Vδ1 T и DN γδ Т-клетки также с большей вероятностью будут возвращаться в опухолевые массы и оставаться там, чем их аналоги, обычно присутствующие в системной крови, и при адоптивном переносе указанные клетки с большей вероятностью будут эффективно направляться к солидным опухолям и, возможно, к другим негемопоэтическим тканеспецифическим иммунопатологиям.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения индивидуума, страдающего от опухоли в негемопоэтической ткани, может включать в себя:
получение образца указанной негемопоэтической ткани от индивидуума-донора,
культивирование γδ Т-клеток из описанного выше образца с получением увеличенной популяции и
введение увеличенной популяции γδ T-клеток индивидууму, несущему опухоль.
Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, экспрессируют NKG2D и отвечают на лиганд NKG2D (например, MICA), тесно связананый со злокачественными новообразованиями. Они также экспрессируют цитотоксический профиль в отсутствии какой-либо активации и, следовательно, могут эффективно уничтожать опухолевые клетки. Например, негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по описанному здесь способу, могут экспрессировать один или несколько, предпочтительно все из IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, CCL4, IL-13, гранулизина, гранзимов A и B и перфорина в отсутствии какой-либо активации. IL-17A может не экспрессироваться.
Таким образом, описанные здесь результаты являются убедительным доказательством практической пригодности негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу настоящего изобретения, для клинического применения в виде "готового" иммунотерапевтического реагента. Указанные клетки обладают врожденной способностью к уничтожению других клеток, не связаны с МНС и обладают улучшенной способностью достигать опухоли и/или оставаться в опухолях, по сравнению с другими Т-клетками.
Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, также можно использовать для терапии CAR-T. Данная терапия включает в себя получение рекомбинантных Т-клеточных рецепторов (TCR), чтобы перепрограммировать Т-клетку на новую специфичность, например, специфичность моноклонального антитела. Рекомбинантный TCR может придавать Т-клеткам специфичность к злокачественным клеткам и, следовательно, может использоваться для иммунотерапии рака. Например, Т-клетки могут распознавать раковые клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, такой как ассоциированный с опухолью антиген (ТАА), который не экспрессируется нормальными соматическими клетками ткани индивидуума. Таким образом, CAR-модифицированные Т-клетки можно использовать для адоптивной терапии Т-клетками, например, раковых пациентов.
Описано применение резидентных γδ Т-клеток крови в терапии CAR. Однако негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, вероятно, будут особенно хорошими средствами для подходов CAR-T, поскольку их можно трансдуцировать химерными антиген-специфическими TCR, и при этом они сохраняют свою врожденную способность распознавать трансформированные клетки и, по всей вероятности, обладают улучшенной способностью проникать в опухоль и оставаться там по сравнению с резидентными γδ Т-клетками крови или обычными системными αβ Т-клетками. Кроме того, отсутствие у них MHC-зависимой презентации антигена снижает вероятность заболевания трансплантат против хозяина и обеспечивает специфичность к опухолям, экспрессирующим низкие уровни МНС. Подобным образом, их нечувствительность к обычной костимуляции, например, посредством CD28, усиливает направленность на опухоли, экспрессирующие низкие уровни лигандов костимуляторных рецепторов.
Рак может характеризоваться аномальной пролиферацией злокачественных раковых клеток и может включать в себя лейкозы, такие как острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелолейкоз (CML), острый лимфобластный лейкоз (ALL) и хронический лимфолейкоз (CLL), лимфомы, такие как лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома и множественная миелома, а также солидные раковые опухоли, такие как саркомы, рак кожи, меланома, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак молочной железы, рак матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак шейки матки, рак печени, рак головы и шеи, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак почки, рак надпочечников, рак желудка, рак яичек, рак желчного пузыря и желчных путей, рак щитовидной железы, рак тимуса, рак кости и церебральный рак.
Раковые клетки у больного раком могут иммунологически отличаться от нормальных соматических клеток индивидуума (то есть раковая опухоль может быть иммуногенной). Например, раковые клетки могут вызывать системный иммунный ответ у ракового пациента в отношении одного или нескольких антигенов, экспрессируемых раковыми клетками. Антигены, которые вызывают иммунный ответ, могут представлять собой опухолевые антигены, или они могут также являться антигенами нормальных клеток. Раковый пациент может иметь по меньшей мере один идентифицируемый признак, симптом или результат лабораторного анализа, который является достаточным для постановки диагноза рака в соответствии с клиническими стандартами, известными в данной области. Примеры таких клинических стандартов можно найти в учебниках медицины, таких как "Принципы лечения внутренних болезней" Харрисона (40). В некоторых случаях диагностика рака у индивидуума может включать в себя идентификацию клетки конкретного типа (например, раковой клетки) в образце жидкости или ткани организма, полученном от индивидуума.
Пациент, субъект или индивидуум, подходящий для лечения по описанному выше способу может представлять собой млекопитающее, например, относящееся к семейству грызунов (например, морская свинка, хомяк, крыса, мышь), мышиных (например, мышь), собачьих (например, собака), кошачьих (например, кошка), лошадиных (например, лошадь), приматов, обезьян (например, мартышка или человекообразная обезьяна), мартышек (например, мартышка или бабуин), человекообразных обезьян (например, горилла, шимпанзе, орангутан или гиббон), или человека.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пациент, субъект или индивидуум представляет собой человека. В других предпочтительных вариантах осуществления пациент может представлять собой отличное от человека млекопитающее, особенно млекопитающее, которое обычно используют в качестве модели для демонстрации терапевтической эффективности у людей (такое как мышь, примат, свинья, собака или кролик).
В некоторых вариантах осуществления у пациента, субъекта или индивидуума может присутствовать минимальное остаточное заболевание (MRD) после первичного лечения рака.
Лечение может представлять собой любое лечение и терапию, человека или животного (например, в ветеринарных применениях), при котором достигается некоторый желаемый терапевтический эффект, например, ингибирование или задержка развития состояния, включая уменьшение скорости развития, прекращение развития, улучшение состояния, излечение или ремиссию (частичную или полную) состояния, предотвращение, отсрочку, устранение или прекращение одного или нескольких симптомов и/или признаков состояния, или увеличение продолжительности жизни индивидуума или пациента сверх ожидаемой в отсутствии лечения.
Изобретение также охватывает лечение как профилактическую меру (например, профилактику). Например, пациента, субъекта или индивидуума, предрасположенного или подверженного риску возникновения или повторного появления рака, можно лечить с помощью описанного здесь способа. Такое лечение может предотвратить или задержать возникновение или повторное появление рака у пациента, субъекта или индивидуума.
В частности, лечение может включать в себя ингибирование роста раковой опухоли, включая полную ремиссию рака, и/или ингибирование метастазирования рака. Рост раковой опухоли обычно характеризуется любым из нескольких показателей, которые свидетельствуют об изменении рака на более развитую форму. Так, показатели, используемые для измерения ингибирования роста раковой опухоли, включают в себя снижение выживаемости раковых клеток, уменьшение объема или морфологии опухоли (например, определяемое с помощью компьютерной томографии (КТ), сонографии или другого метода визуализации), замедление роста опухоли, разрушение сосудистой сети опухоли, улучшение показателей при кожном тесте на гиперчувствительность замедленного типа, увеличение активности цитолитических Т-лимфоцитов и уменьшение уровней опухолевых специфических антигенов. Снижение подавления иммунного ответа в раковых опухолях индивидуума может улучшить способность индивидуума противостоять росту раковой опухоли, в частности, росту уже присутствующей у индивидуума раковой опухоли, и/или уменьшить предрасположенность к росту рака у индивидуума.
Другие аспекты и варианты осуществления изобретения включают в себя описанные выше аспекты и варианты осуществления, где термин "содержащий" заменяется термином "состоящий из", а также описанные выше аспекты и варианты осуществления, где термин "содержащий" заменяется термином "состоящий по существу из".
Следует понимать, что, если контекст не указывает иначе, настоящая заявка раскрывает любые сочетания вышеописанных аспектов и вариантов осуществления. Подобным образом, если контекст не указывает иначе, настоящая заявка раскрывает любые сочетания предпочтительных и/или необязательных признаков либо отдельно, либо вместе с любым другим аспектом.
После прочтения настоящего описания для квалифицированного специалиста станут очевидны модификации вышеупомянутых вариантов осуществления, другие варианты осуществления и их модификации, которые также входят в объем настоящего изобретения.
Все документы и записи в базе данных последовательностей, упомянутые в настоящем описании, включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.
Используемый здесь термин "и/или" следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из двух указанных признаков или компонентов в присутствии или в отсутствии другого. Например, выражение "A и/или B" следует понимать как конкретное раскрытие каждого из (i) A, (ii) B и (iii) A и B, как если бы каждый из них был описан здесь отдельно.
Некоторые аспекты и варианты осуществления изобретения далее иллюстрируются посредством примера и со ссылкой на фигуры, описанные выше.
МЕТОДЫ
Выделение лимфоцитов из кожи человека путем трехмерного культивирования эксплантата
Разработан метод трехмерного культивирования эксплантата кожи, как описано в данном документе (29). Матрицы Cellfoam 9 мм×9 мм×1 мм (Cytomatrix Pty Ltd, Victoria, Australia) подвергают автоклавированию, затем инкубируют в растворе коллагена из сухожилий крысиного хвоста I (BD Biosciences) в PBS, 100 мг/мл, в течение 30 минут при комнатной температуре, затем один раз промывают PBS. Образцы кожи взрослого человека получают в течение 3-6 часов после кожной хирургии. Подкожный жир удаляют, а оставшуюся ткань кожи измельчают с получением фрагментов размером примерно 1 мм×1 мм. Примерно пять фрагментов/эксплантатов кожи помещают на поверхность каждой матрицы и прижимают. Каждую матрицу помещают в отдельную лунку 24-луночного планшета (Corning), содержащую 2 мл среды "Skin-T" (среда Дульбекко в модификации Искова (IMDM, Life Technologies), содержащая 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies ), L-глутамин (292 мг/мл, Life Technologies), пенициллин (100 единиц/мл, Life Technologies), стрептомицин (100 мг/мл, Life Technologies), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислоту (HEPES, 0,01 М, Life Technologies), пируват натрия (1 мМ, Life Technologies), минимальную эссенциальную среду (MEM), неэсенциальные аминокислоты (1×, Life Technologies) и 3,5 мкл/л 2-меркаптоэтанола (Life Technologies). В течение первых 7 дней культивирования в среду добавляют амфотерицин (2,5 мг/мл, Life Technologies). Среду заменяют три раза в неделю. Подпитку проводят путем отсасывания сверху 1 мл среды из каждой лунки и замены свежей средой. IL-2 и IL-15 добавляют вначале культивирования и при каждой замене среды до выделения лимфоцитов на 21 день. Человеческий рекомбинантный IL-2 (Proleukin, Novartis Pharmaceutical UK Ltd) добавляют в концентрации 100 ме/мл. Человеческий рекомбинантный IL-15 (Biolegend) добавляют в концентрации 20 нг/мл. До 96 лунок (четыре 24-луночных планшета) используют для культивирования для каждого донора.
Чтобы выделить лимфоциты, матрицы переносят в центрифужную пробирку (Corning) объемом 50 мл, содержащую 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS, Life Technologies) и 0,01 мМ HEPES (до 12 матриц/пробирку). Матрицы промывают клеточной суспензией с помощью пипетки на 10 мл, клеточную суспензию пропускают через фильтр 70 мкм (BD Biosciences) в свежую центрифужную пробирку (Corning) объемом 50 мл. "Промывание" матриц повторяют еще два раза. Среду из культуральной лунки также отсасывают и пропускают через фильтр 70 мкм (BD Biosciences) в свежую центрифужную пробирку (Corning) объемом 50 мл. Лунки промывают еще два раза 1 мл 0,01 мМ HEPES/HBSS и пропускают через фильтр 70 мкм (BD Biosciences). Затем клетки выделяют центрифугированием (1600 об/мин в течение 15 минут). Осадок ресуспендируют в среде "Skin-T". Конечный осадок клеток ресуспендируют в среде "Skin-T" для последующего анализа методом проточной цитометрии или функциональных исследований. Если нужно определить число клеток, лейкоциты считают на данной стадии либо (1) путем окрашивания трипановым синим (0,4%) (Life Technologies) с последующим использованием гемоцитометра, либо (2) с помощью цитометра CASY®, модель TT, и анализатора (Roche).
Чтобы выделить лимфоциты, матрицы переносят в центрифужную пробирку (Corning) объемом 50 мл, содержащую 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS, Life Technologies) и 0,01 мМ HEPES (до 12 матриц/пробирки). Матрицы промывают клеточной суспензией с помощью пипетки на 10 мл, клеточную суспензию пропускают через фильтр 70 мкм (BD Biosciences) в свежую центрифужную пробирку (Corning) объемом 50 мл. "Промывание" матриц повторяют еще два раза. Среду из культуральной лунки также отсасывают и пропускают через фильтр 70 мкм (BD Biosciences) в свежую центрифужную пробирку (Corning) объемом 50 мл. Лунки промывают еще два раза 1 мл 0,01 мМ HEPES/HBSS и пропускают через фильтр 70 мкм (BD Biosciences). Затем клетки выделяют центрифугированием (1600 об/мин в течение 15 минут). Осадок ресуспендируют в среде "Skin-T". Конечный осадок клеток ресуспендируют в среде "Skin-T" для последующего анализа методом проточной цитометрии или функциональных исследований. Если нужно определить число клеток, лейкоциты считают на данной стадии либо (1) путем окрашивания трипановым синим (0,4%) (Life Technologies) с последующим использованием гемоцитометра, либо (2) с помощью цитометра CASY®, модель TT, и анализатора (Roche).
Поскольку первичные образцы кишечника более подвержены загрязнению, полученные биопсийные образцы сначала дважды промывают IMDM, содержащей 10% FCS, пенициллин 500 ед/мл, стрептомицин 500 мг/мл, гентамицин 100 мг/мл, амфотерицин B 12,5 мкг/мл и метронидазол 5 мкг/мл, затем измельчают и помещают на сетки. Культуры клеток кишечника на сетках выращивали в среде Gut-T (IMDM, 10% FCS, пенициллина 100 ед/мл, стрептомицина 100 мг/мл, гентамбина 20 мг/мл, метронидазола 1 мг/мл. В течение первой недели выращивания также используют амфотерицин В, 2,5 мг/мл, как и при выращивании клеток кожи. Среда содержит IL-2 (100IU/мл) и IL-15 (20 нг/мл), замену среды проводят 3 раза в неделю. Поскольку структура кишечника является более рыхлой, чем структура кожи, лимфоциты можно собирать через неделю.
Выращивание тканевых γδ T-клеток
Для выращивания γδ T-клеток человеческой кожи смешанные лимфоциты, собранные после культивирования на сетке в течение 3-4 недель, промывают PBS, центрифугируют и повторно суспендируют в среде 1640 Мемориального института Розуэлла Парка (RPMI-1640, Life Technologies), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies), L-глутамин (292 мг/мл, Life Technologies), пенициллин (100 единиц/мл, Life Technologies), стрептомицин (100 мг/мл, Life Technologies), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислоту (HEPES, 0,01 М, Life Technologies), пируват натрия (1 мМ, Life Technologies), неэссенциальные аминокислоты минимальной эссенциальной среды (MEM) (1×, Life Technologies) и 10 мл/л 2-меркаптоэтанола Life Technologies), при плотности 1×106/мл и добавляют либо один IL-2 (100 ме/мл), либо IL-2 плюс IL-15 (20 нг/мл). Клетки высевают в количестве 2×105/лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты (Corning) или в количестве 2×106/лунку в 12-луночные планшеты (Corning) для выращивания. Клетки ежедневно контролируют с помощью микроскопии, свежую среду и цитокины добавляют 3 раза в неделю. По достижению полного слияния и после того, как клеточные агрегаты станут видимыми, клетки разделяли 1:1 в дополнительные лунки и планшеты соответственно. Клетки собирают и анализируют методом проточной цитометрии, или используют для функциональных анализов через 7, 14 или 21 день, в зависимости от анализа. Если нужны чистые γδ Т-клетки, клетки ресуспендируют в 1 мл буфера FACS (PBS, содержащем 2% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки и 0,01 М EDTA) и окрашивают на рецептор αβ Т-клеток (Biolegend, клон IP26, 1:50) в течение 30 минут в темноте на льду, после чего все отрицательные клетки сортируют с помощью сортера Aria, работающего с использованием DIVA (BD Biosciences).
Совместное культивирование с фибробластами
Для каждой культуры на сетке готовят две чашки Петри (100×25 мм, Corning), которые процарапывают в нескольких местах с помощью скальпеля. Измельченные кусочки кожи помещают на царапины. После высыхания на воздухе в течение 5-10 минут кусочки кожи обычно прилипают к чашке, после чего к ним добавляют 10 мл среды Skin-T. Среду меняют один раз в неделю, а первичные фибробласты собирают после обработки ACCUTASE® (Life Technologies) через 3 недели после начала выращивания. Фибробласты высевают либо в 48-луночные планшеты в количестве 1×104, либо в нижние камеры 24-луночных планшетов в количестве 2×104 в случае экспериментов с использованием системы трансвел. Через 2-3 дня, когда фибробласты достигнут слияния, начинают эксперименты по совместному культивированию с использованием RPMI и указанных цитокинов, путем добавления 2×105 смешанных лимфоцитов кожи в случае 48-луночных планшетов или 3×105 лимфоцитов в случае 24-луночных планшетов, донных лунок, а также трансвелов.
Проточная цитометрия
Проточную цитометрию проводят с использованием следующих антител, связанных с указанными флуорохромами: Ki-67-BV421, CD3-BV510, Vδ1-PeVio770, TIM-3-PE, CD9-PE, CCR3-BV421, CD39-BV421. Все образцы также всегда окрашивают на жизнеспособность помощью eFluor770NIR. Коммерческие антитела приобретают у Biolegend или Miltenyi. Краситель для подтверждения жизнеспособности (вблизи ИК) получают от eBioscience. Окрашивание Ki-67 проводят на клетках, фиксированных и пермеабилизированных с помощью набора для окрашивания Foxp3 (eBioscience). После завершения каждого эксперимента популяцию клеток промывают PBS и разделяют пополам. Клетки окрашивали eFluor770 NIR на жизнеспособность и промывают, а затем TrueStain (Biolegend), чтобы избежать неспецифического связывания окрашивающих антител. Половину образца окрашивают на указанные поверхностные маркеры, тогда как другую половину окрашивают только на маркеры линии (CD3, Vδ1) с использованием эквивалентного изотипического контроля для используемых поверхностных маркеров. Это означает, что соответствующее изотипическое мышиное антитело, конъюгированное с тем же флуорохромом, используют в такой же концентрации. Изотипические контроли не связываются с какими-либо известными человеческими антигенами и поэтому свидетельствуют о неспецифическом связывании или ложно-положительном ответе. Его также называют реально отрицательным. Каждая гистограмма (закрашенная) показана в сравнении с соответствующим изотипическим контролем (незакрашенная, пунктирные линии). Приведенные данные отражают процент клеток, положительно окрашенных по указанному маркеру, и, следовательно, характеризующихся уровнем, превышающем уровень в изотипическом контроле. Анализ результатов проточной цитометрии проводят на FlowJo (версия 10.1).
Секвенирование РНК
Т-клетки Vδ1 человеческой кожи и Т-клетки Vδ1 человеческой крови (после роста, инициированного Т-клеточным рецептором) сортируют (FACS), центрифугируют и клеточный осадок ресуспендируют в буфере RLT. РНК получают с помощью набора RNA-Micro-plus (QIAGEN). Библиотеки РНК получают с использованием набора KAPA Stranded RNA-seq с RiboErase (HMR) (KAPA BIOSYSTEMS). Секвенирование спаренных концов проводят на HiSeq 2500 (подсветка) с использованием химии быстрого запуска (длина прочтения: 100 п.о.). Прочтенные спаренные концы длиной 101 пара оснований выравнивают и подвергают количественному анализу с использованием RSEM (v1.2.1 1) и Bowtie2. Прочтенные последовательности выравнивают с транскриптомом человека, рассчитанные значения преобразовывают в log2 и подвергают квантильной нормализации.
Количественный анализ цитокинов
Клетки Vδ1 кожи человека стимулируют PMA и иономицином или связанным с планшетом mAb против CD3 (OKT3, 5 мкг/мл) в течение 24 часов. Затем супернатанты анализируют с использованием панели 1A ProcartaPlex Human Cytokine & Chemokine (34 компонента), eBioscience. Анализы проводят с помощью Luminex FlexMap3D (Luminex Corp). Результаты анализируют в Microsoft Excel, показаны средние значения от трех доноров (анализы проводят с двойными повторами). Планки погрешностей обозначают стандартное отклонение.
Выращивание γδ T-клеток крови
γδ T-клетки крови в популяции РВМС могут расти только после стимуляции лигандами TCR (в случае Vδ2 такими лигандами могут являться, например, IPP, HMBPP, бисфосфонаты) (41, 42), или после добавления антител, перекрестно связывающихся либо с рецептором TCR (mAb), либо с TCR-ассоциированной киназой CD3 (43). Такой же эффект перекрестного связывания TCR также можно достичь с использованием лектинов, таких как PHA. В отсутствии добавления таких TCR-стимулирующих средств γδ T-клетки в РВМС выживают в течение нескольких дней, но не могут размножаться и остаются в исходном составе субпопуляций Т-клеток с небольшими вариациями.
Кровь здоровых добровольцев используют для выделения РВМС путем наслоения целой крови на Фиколл с последующим центрифугированием при 400 g в течение 20 минут для разделения красных кровяных телец, плазмы крови и белых лимфоцитов/моноцитов. Белые кровяные клетки тщательно собирают пипеткой и промывают четыре раза холодным PBS. Клетки ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Life Technologies), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (Life Technologies), L-глутамин (292 мг/мл, Life Technologies), пенициллин (100 единиц/мл, Life Technologies), стрептомицин (100 Мг/мл, Life Technologies), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислоту (HEPES, 0,01 М, Life Technologies), пируват натрия (1 мМ, Life Technologies), неэссенциальные аминокислоты минимальной эсенциальной среды (MEM) (1×; Life Technologies), при плотности 1×106/мл и добавляют IL-2 (100 ме/мл). Клетки переносят в 24-луночный планшет, покрытый моноклональным антителом pan γδ TCR (20 мкг/мл, клон B1, Biolegend) за 90 минут до переноса клеток. Клетки выращивают в течение 14 дней, среду заменяют каждые 2-3 дня и добавляют свежие цитокины. По достижении слияния клетки разделяют 1:1. В указанных условиях через 14 дней первоначально минорная популяция γδ T-клеток обычно находится в высоко активированном через TCR (на что указывает повышающая регуляция CD69 и CD25) и в значительной степени обогащенном состоянии и состоит в основном из T-клеток Vδ2, но также содержит T-клетки Vδ1 (которые составляют до 30% от всех γδ Т-клеток). Т-клетки Vδ1 можно затем выделить методом FACS для функционального, фенотипического или генетического анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Человеческие γδ Т-клетки присутствуют в коже в большом количестве, экспрессируют TCR, отличный от Vδ2, и участвуют в контролирующем ответе лимфоидной ткани человека на стресс
По методу Кларка (29) культивируют образцы остаточной кожи человека, к которым добавляют IL-2 и IL-15, чтобы обеспечить разрастание тканерезидентных лимфоцитов в течение 3 недель, с получением популяции лимфоцитов, содержащей в среднем 240000 клеток на сетку. В соответствии с предыдущими сообщениями (29) авторы идентифицируют отдельные субпопуляции резидентных лимфоцитов кожи, причем большинство клеток экспрессирует обычный αβ TCR, в основном из тканерезидентного типа "TRM". В целом 59,9% (±8,6) клеток CD45+ являются CD4+, а 18,3% (±2,8) представляют собой αβ Т-клетки CD8+ с фракцией NK-клеток 8,7% (±3,6). Кроме того, авторы обнаружили у доноров значительную популяцию γδ T-клеток (в среднем 8,513% клеток CD45+, ±6,564%) (фиг. 1А и 3D). Данное представление субпопуляции лимфоцитов после органотипического культивирования является высоко воспроизводимым примерно у 100 доноров и сопоставимым со свеже расщепленными образцами кожи, отличающимися только по слегка увеличенной популяции γδ, но с практической точки зрения более полезное, поскольку оно предлагает гораздо более крупные и более чистые популяции лимфоцитов, чем стандартные методы расщепления ткани. В соответствии с описанными в литературе данными, касающимися тканевой компартментализации человеческих γδ T-клеток на основе дельта-цепи их TCR, большинство человеческих γδ Т-клеток кожи экспрессируют цепь TCR Vδ1 в паре с разными γ-цепями, идентифицированными методом проточной цитометрии. Этим они отличаются от большинства γδ Т-клеток периферической крови, которые содержат один специфический гетеродимер TCR с цепью Vδ2, соединенной с Vγ9, и практически отсутствуют в образцах кожи человека. Тем не менее, важно отметить, что значительная субпопуляция не экспрессирует ни Vδ1 TCR, ни Vδ2 TCR, что позволило ее назвать "двойные отрицательные" γδ T-клетки (фиг. 1С).
Резидентные γδ T-клетки кожи, выращенные по указанному способу, имеют фенотип с неполной дифференцировкой памяти, который характеризуется отсутствием экспрессии CD45RA и экспрессией разных уровней костимуляторной молекулы CCR7. Аналогично обычным системным Т-клеткам, интенсивная экспрессия поверхностного белка CD69 наряду с экспрессией рецептора программируемой гибели 1 (PD-1); низкий уровень рецептора IL-2 α (CD25) или его отсутствие; и отсутствие костимуляторной молекулы CD28 дают картину ранее активированных или хронически активированных Т-клеток (фиг. 1D). В соответствии с их локализацией в ткани клетки Vδ1 и DN экспрессируют кожные и тканевые хоминг-маркеры, такие как CLA, CCR4, CCR8 и интегрин αE (CD103) (см. Фиг. 7). Указанный набор тканевых хоминг-маркеров, по-видимому, может оказаться полезным при применении в иммунотерапии. Кроме того, резидентные γδ Т-клетки кожи экспрессируют на высоком уровне активаторный рецептор NKG2D (фиг. 2А), что позволяет предположить возможность участия этих клеток в контролирующем ответе лимфоидной ткани на стресс. Лиганды NKG2D, такие как MICA, MICB и ULBP, соответственно, подвергаются повышающей регуляции клетками в ответ на повреждение ДНК, активацию EGF-рецептора и окислительный стресс и, следовательно, могут обеспечивать экспрессию Т-клетками NKG2D для идентификации и устранения стрессированных или трансформированных клеток, тем самым поддерживая тканевый гомеостаз. В соответствии с этим принципом авторы обнаружили, что резидентные γδ T-клетки кожи, выращенные по способу настоящего изобретения, активируются при воздействии рекомбинантных лигандов рецептора NKG2D (MICA, ULBP2), демонстрируя дегрануляцию, измеряемую по повышающей регуляция ассоциированного с лизосомами мембранного белка CD107a (фиг. 2А). Данная врожденная функция присуща исключительно γδ Т-клеткам Vδ1+ и DN, так как другие тканерезидентные Т-клетки (фиг. 2C) и системные γδ T-клетки не способны давать такой ответ (фиг. 10B).
Таким образом, активированные резидентные γδ Т-клетки кожи Vδ1+ и DN выполняют провоспалительную TH1-смещенную цитокиновую программу (положительное окрашивание на IFN-γ, TNF-α и GM-CSF) после активации PMA/иономцином или лигандами NKG2D, например. рекомбинантным белком MICA (фиг.2А и 2В), тем самым подтверждая врожденные ответы клеток. И действительно, ответы на MICA почти полностью прекращаются в результате блокирования рецептора NKG2D под действием антитела (фиг. 2В и 2С).
Известно, что γδ Т-клетки секретируют IL-17 при определенных заболеваниях, таких как псориаз, и в некоторых типах опухолей. γδ Т-клетки, выращенные по способу настоящего изобретения, продуцируют низкий уровень или не продуцируют IL-17, даже при экстенсивной активации (фиг. 2В и 8). И наоборот, тканерезидентные CD4-экспрессирующие αβ T-клетки продуцируют IL-17 при активации TCR (фиг. 2B). Как правило, αβ T-клетки в ответ на PMA/иономицин продуцируют репертуар цитокинов, сильно отличающийся от продуцируемого γδ Т-клетками Vδ1+ и DN, которые ограничены TH1-смещенной программой, связанной с защитой хозяина.
Отделение от ткани вызывает активацию и массивную пролиферацию человеческих тканевых γδ Т-клеток
Чтобы дополнительно исследовать человеческую ткань, γδ Т-клетки и их биологию, смешанные лимфоциты кожи переносят в лунки для культивирования клеток и добавляют IL-2, чтобы поддерживать жизнеспособность с течением времени. Интересно, что авторы быстро обнаружили, что после отделения от стромальных и эпителиальных клеток, присутствующих в органотипической культуре, T-клетки Vδ1 демонстрируют уникальные признаки активации и пролиферации в отсутствии каких-либо других добавленных стимулов. В течение менее 7 дней в γδ Т-клетках Vδ1+ и DN наблюдается уникальная и массовая повышающая регуляция ядерного фактора Ki-67 и увеличение поверхностной экспрессии рецептора IL-2 α (CD25) (фиг. 3B и 4B). Удивительно, что после выращивания в течение 3 недель только в присутствии IL-2 тканевые γδ Т-клетки Vδ1+ и DN превосходят по росту все другие субпопуляции T-клеток, составляя до 65% от всех лимфоцитов кожи, причем их число увеличивается в среднем в 127,18 раз, тогда как число αβ T-клеток увеличивается только в 5,21 раза (р=0,0124), что определяют по абсолютному числу клеток (фиг.3А). MFI ассоциированного с клеточным циклом ядерного фактора KI-67 в γδ Т-клетках Vδ1+ и DN увеличивается с 2664,5 (±1876,1) до 8457,7 (±4574,2) за 14 дней, тогда как в αβ Т-клетках MFI уменьшается с 592,8 (±390,5) до 284,7 (±140,1) за тот же период времени (фиг.3C). Такой селективный рост резидентных γδ T-клеток кожи можно дополнительно поддерживать путем добавления рекомбинантного IL-15, который повышает жизнеспособность и общее число лимфоцитов.
γδ Т-клетки кожи активно подавляются фибробластами в контакт-зависимой манере
Удивительный рост γδ T-клеток Vδ1+ и DN, описанный в предыдущем абзаце, никогда не встречается в системах органотипического культивирования, в которых наблюдается экстенсивное разрастание фибробластов. Поэтому авторы выращивают аутологичные фибробласты, чтобы непосредственно проверить, действительно ли они при совместном культивировании с γδ T-клетками Vδ1+ и DN ингибируют рост Т-клеток. После культивирования на сетке в течение 3 недель смешанные лимфоциты кожи высевают в лунки, которые либо являются пустыми, либо содержат ранее полученный слившийся монослой фибробластов, причем в каждом случае в среду добавляют экзогенный IL-2, чтобы поддерживать рост Т-клеток. Кроме того, используют транслунки, которые препятствуют непосредственному контакту Т-лимфоцитов с фибробластами внутри одних и тех же лунок, но позволяют любым растворимым факторам, продуцируемым фибробластами, оказывать влияние на лимфоциты. После совместного культивирования в течение 14 дней γδ T-клетки Vδ1+ и DN начинают пролиферировать в лунках, в которых фибробласты отсутствуют, а также в лунках, в которых Т-клетки не могут непосредственно контактировать с фибробластами. В соответствии с полученными ранее результатами, пролиферация αβ T-клеток является низкой при любых условиях. Следует отметить, что если Т-клетки вступают в непосредственный контакт с фибробластами, скорость роста γδ T-клеток Vδ1+ и DN в течение двух недель значительно снижается с 22,6 (SEM 8,07) раз в лунках с отсутствием контакта с фибробластами до 3,3 (SEM 0,17) раз (фиг. 4А). Такое опосредуемое контактом ингибирование дополнительно подтверждается отсутствием повышающей регуляции CD25, Ki-67 и фактора транскрипции T-bet в клетках Vδ1 в течение 7 дней, в отличие от лимфоцитов, выращенных отдельно (фиг. 4В). Некоторая форма опосредованного тканью контроля иммунной системы, по-видимому, имеет фундаментальное значение для поддержания гомеостаза тканей, поскольку без такого контроля может существовать риск стойкого воспаления. Примером такого контроля может служить супрессорная регуляция γδ T-клеток Vδ1+ и DN стромальными фибробластами.
Таким образом, фенотип резидентных γδ T-клеток Vδ1+ и DN кожи и их удивительные функциональные потенциалы свидетельствуют о предварительно активированных Т-клетках, которые обычно контролируются соседними фибробластами кожи посредством зависимого от контакта механизма, который еще подлежит изучению. Инактивация этого механизма путем освобождения Т-клеток от контакта с фибробластами селективно обеспечивает выраженный рост γδ T-клеток Vδ1+ и DN, в отличие от других Т-клеток кожи.
Освобождение от опосредуемого контактом ингибирования вызывает цитотоксический TH1-смещенный цитокиновый ответ γδ T-клеток Vδ1+ и DN
Смешанные лимфоциты кожи выращивают в течение 14 дней и с помощью сортировки клеток, связанной с флуоресценцией, αβ Т-клетки отделяют от γδ Т-клеток, которые таким образом можно получить с чистотой до 90%. Полученные высокообогащенные клетки помещают в лунки для культивирования клеток в концентрации 150000 клеток/лунку в среде RPMI, содержащей 10% FCS, через 24 часа супернатанты собирают и анализируют на широкий спектр эффекторных цитокинов с использованием матрицы на основе LUMINEX®. Совершенно неожиданно обнаружено, что растущие γδ Т-клетки (рост которых инициируется только их отделением от фибробластов) спонтанно продуцируют большие количества TH1-ассоциированных цитокинов, таких как IFN-γ (12383,46±16,618,90 пг/мл), GM-CSF (4316,73±4,534,96 пг/мл), и провоспалительных хемокинов CCL4 (14877,34±10935,64 пг/мл) и CCL3 (1303,07±757,23 пг/мл) (фиг.5A).
Кроме того, в процессе роста клетки продуцируют большое количество спонтанного IL-13, связанного с атопическими ответами, в отличие от свежевыделенных TCR-активированных γδ Т-клеток кожи; другие цитокины продуцируются на гораздо более низких уровнях или совсем не продуцируются, например, IL-17A (фиг. 8). Высокие эффекторные потенциалы клеток можно дополнительно увеличить путем стимуляции рекомбинантным MICA (лигандом NKG2D), перекрестно сшитым антителом против CD3, или PMA/иономицином. Чтобы оценить цитотоксический потенциал выращенных γδ Т-клеток в отношении злокачественных клеток-мишеней, в 24-часовых экспериментах по совместному культивированию используют стандартные трансформированные клеточные линии. γδ T-клетки Vδ1+ и DN обладают очень высокой дозозависимой цитотоксической активностью по отношению к клеткам Hela (шейки матки) и Caco2 (толстой кишки), намного превосходя традиционные тканевые αβ T-клетки (фиг. 5B). Кроме того, цитотоксичность, опосредованную γδ-клетками, можно эффективно ингибировать путем блокирования рецептора NKG2D растворимыми моноклональными антителами, а это свидетельствует о том, что указанный рецептор по меньшей мере отчасти участвует в контролировании опухоли посредством дерепрессии человеческих γδ Т-клеток кожи. Цитотоксический потенциал этих клеток также подтверждают с использованием других мишеней: HCT1954, MDAMB231 (карцинома молочной железы), и HCT116 (толстая кишка) (фиг. 9).
Тканерезидентные γδ Т-клетки в кишечнике человека
Авторы также идентифицировали популяцию негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор Vδ1 в культурах на сетке, полученных из толстой кишки человека (фиг. 6). В случае 3 доноров авторам удалось размножить эти клетки с помощью методов, используемых 15 для клеток кожи, в течение 4-5 недель. Во время экспрессии γδ T-клетки Vδ1+ и DN, полученные из толстой кишки, характеризуются подобной картиной повышающей регуляции Ki-67 после их отделения от обогащенной фибробластами органотипической клеточной культуры. Аналогично γδ T-клетки Vδ1+ и DN толстой кишки подвергаются эффективной стимуляции под действием лигандов рецептора NKG2D. Ранее было описано, что полученные из крови γδ Т-клетки хорошо приспособлены для выполнения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности посредством экспрессии CD16, что подтверждает повышенную цитотоксичность, направленную против CD20-положительной лимфомы B-линии в сочетании с ритуксимабом. Подобным образом, клетки хронического лимфолейкоза (CLL) и HER2-положительного рака молочной железы уничтожаются более эффективно при использовании моноклональных антител (31). Чтобы оценить потенциал Т-клеток кожи Vδ1 для нацеливания на опсонизированные антителами клетки-мишени, проверяют уровни экспрессии трех IgG1-ассоциированных рецепторов Fc CD16, CD32 и CD64. Полученные из кожи T-клетки Vδ1 экспрессируют небольшие уровни рецептора FC CD16, но высокие уровни высокоаффинного рецептора IgG CD64 (фиг. 11). Следовательно, полученные из ткани T-клетки Vδ1 могут быть пригодными для применения в качестве адъюванта в терапии с использованием моноклональных антител, такой как CD20- или Her2-терапия, поскольку они могут направляться антителом к злокачественным опухолям и метастазам, распознавать опсонизированные опухолевые клетки и уничтожать мишени посредством ADCC.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sensi M et al. Cancer Research. 2005; 65(2):632-40.
2. Gaudin C et al. Journal of Immunology. 1999; 162(3):1730-8.
3. Echchakir H et al. Cancer Research. 2001; 61(10):4078-83.
4. Karanikas V et al. Cancer Research. 2001; 61(9):3718-24.
5. Pieper R et al. Journal of Experimental Medicine 1999; 189(5):757-66.
6. Wang RF et al. Science. 1999; 284(5418):1351-4.
7. Topalian SL et al. The New England Journal of Medicine. 2012; 366(26):2443-54.
8. Brahmer JR et al. The New England Journal of Medicine. 2012; 366(26):2455-65.
9. Hodi FS et al. The New England Journal of Medicine. 2010; 363(8):711-23.
10. Robert C et al. The New England Journal of Medicine. 2011; 364(26):2517-26.
11. Pardoll DM. Nature Reviews Cancer. 2012; 12(4):252-64.
12. Fecher LA et al. The Oncologist. 2013; 18(6):733-43.
13. Ribas A. The New England Journal of Medicine. 2012; 366(26):2517-9.
14. Vantourout P, Hayday A. Nature Reviews Immunology. 2013; 13(2):88-100.
15. Hintz M et al. FEBS Letters. 2001; 509(2):317-22.
16. Freed-Pastor WA et al. Cell. 2012; 148(1-2):244-58.
17. Vantourout P et al. Science Translational Medicine. 2014; 6(231):231ra49.
18. Wrobel P et al. Scandinavian Journal of Immunology. 2007; 66(2-3):320-8.
19. Todaro M et al. Journal of Immunology. 2009; 182(11):7287-96.
20. Gertner-Dardenne J et al. Journal of Immunology. 2012; 188(9):4701-8.
21. Mao C et al. Journal of Immunol Research. 2014; 2014:593562.
22. Godder KT et al. Bone Marrow Transplantation. 2007; 39(12):751-7.
23. Fournie JJ et al. Cellular & Molecular Immunology. 2013; 10(1):35-41.
24. Curran KJ et al. Journal of Clinical Oncology. 2015; 33(15):1703-6.
25. Hillerdal V et al. BioDrugs. 2015; 29(2):75-89.
26. Couzi L et al. Journal of the American Society of Nephrology. 2010; 21(1):181-8.
27. Zheng J et al. Cellular & Molecular Immunology. 2013; 10(1):50-57.
28. Deniger DC et al. Molecular Therapy. 2013; 21(3):638-47.
29. Clark RA et al. 2006. Journal of Investigational Dermatology. 126(5):1059-70.
30. Carrasco A. et al. 2013. Journal of Immunological Methods. 389(1-2):29-37.
31. Tokuyama H. et al. International Journal of Cancer. 2008; 122(11):2526-34.
32. Willcox CR et al. Nature Immunology. 2012; 13(9):872-9.
33. Gillis and Smith. Nature. 1977; 268(5616):154-6.
34. Fujita et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1984; 80(24):7437-41.
35. Grabstein et al. Science. 1994; 264(5161):965-8.
36. Helgason C et al. Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451.
37. Picot J. Methods in Molecular Medicine. Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223.
38. Freshney R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. John Wiley & Sons Inc., (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293.
39. Ho WY et al. Journal of Immunological Methods. 2006;310:40-52.
40. Fauci AS et al. eds. Harrison's Principles of Internal Medicine. 2001; 15th Ed., McGraw-Hill, New York.
41. Petrini I. et al. European Journal of Clinical Investigation. 2009; 39(9):813-8.
42. Gruenbacher et al. Blood. 2009; 114(20):4422-31.
43. Almeida et al. Clin Cancer Res (2016) 10.1158/1078-0432.CCR-16-0597.
44. Deniger D. et al. Frontiers in Immunology. 2014:5(636):1-10.
Claims (15)
1. Способ размножения негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro, включающий в себя культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии интерлейкина-15 (IL-15), где лимфоциты не находятся в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками в процессе культивирования, и где лимфоциты культивируются в отсутствии экзогенно добавленного агониста пути Т-клеточного рецептора.
2. Способ по п.1, где лимфоциты не находятся в непосредственном контакте с фибробластами в процессе культивирования.
3. Способ по п.1 или 2, где способ включает в себя культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-2 и IL-15.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ включает в себя культивирование лимфоцитов в отсутствии сигналов активации TCR.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лимфоциты культивируют в отсутствии стромальных или эпителиальных клеток.
6. Способ по п.5, где стромальные или эпителиальные клетки удаляют перед культивированием.
7. Способ по п.5, где лимфоциты культивируют в отсутствии фибробластов.
8. Способ по п.7, где фибробласты удаляют перед культивированием.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лимфоциты культивируют в среде для выращивания γδ, содержащей IL-2 и IL-15.
10. Способ по п.9, где среде для выращивания γδ не активирует или не стимулирует Т-клеточные рецепторы.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лимфоциты получают из ткани кожи, желудочно-кишечного тракта, молочной железы, легкого, печени, поджелудочной железы или предстательной железы.
12. Способ по п.11, где лимфоциты получают из толстой кишки.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где γδ Т-клетки представляют собой клетки, отличные от Vδ2.
14. Способ по п.13, где γδ Т-клетки представляют собой клетки Vδ1.
15. Способ по п.13, где γδ Т-клетки представляют собой двойные отрицательные (DN) γδ Т-клетки.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1519198.4A GB201519198D0 (en) | 2015-10-30 | 2015-10-30 | Expansion of gamma delta t cells resident in non-haematopoietic tissue and uses of these cells |
GB1519198.4 | 2015-10-30 | ||
GBGB1612731.8A GB201612731D0 (en) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | Expansion of non-haematopoietic tissue-resident gamma delta t cells and uses of these cells |
GB1612731.8 | 2016-07-22 | ||
PCT/EP2016/076264 WO2017072367A1 (en) | 2015-10-30 | 2016-10-31 | EXPANSION OF NON-HAEMATOPOIETIC TISSUE-RESIDENT γδ T CELLS AND USES OF THESE CELLS |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022129315A Division RU2022129315A (ru) | 2015-10-30 | 2016-10-31 | РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ T-КЛЕТОК |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018119684A RU2018119684A (ru) | 2019-12-02 |
RU2018119684A3 RU2018119684A3 (ru) | 2020-03-17 |
RU2784566C2 true RU2784566C2 (ru) | 2022-11-28 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KIM K. et al., Comparative analysis of human epidermal and peripheral blood γδ T cell cytokine profiles, Ann Dermatol., 2014, 26(3), pp. 308-313, doi: 10.5021/ad.2014.26.3.308. GARCIA V.E. et al., IL-15 enhances the response of human γδ T cells to nonpetide microbial antigens, J Immunol., 1998, 160(9), pp. 4322-4329. VAN ACKER H.H. et al., Interleukin-15 enhances the proliferation, stimulatory phenotype, and antitumor effector functions of human gamma delta T cells, J Hematol Oncol., 2016, 9, 101, doi: 10.1186/s13045-016-0329-3. ЗАДИОНЧЕНКО Е.В., Гамма дельта Т-ориентированная иммунотерапия при атопическом дерматите, Автореферат диссертации, Москва, 2005, 21 с. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230099491A1 (en) | Expansion of non-haematopoietic tissue-resident gamma delta t cells and uses of these cells | |
US20230242878A1 (en) | Expansion of gamma delta t cells, compositions, and methods of use thereof | |
Ronchetti et al. | Glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor-related protein: a key marker of functional regulatory T cells | |
US20210208131A1 (en) | Immune cell organoid co-cultures | |
JP6086904B2 (ja) | γδT細胞を含むリンパ球の細胞株、その組成物、及びその製造方法 | |
CA2988050A1 (en) | Methods for the production of tcr gamma delta+ t cells | |
KR20210111747A (ko) | 세포를 단리 및 증식하는 방법 | |
KR20210111746A (ko) | 세포를 단리 및 증식하는 방법 | |
Kitazawa et al. | Foxp3-expressing regulatory T cells expanded with CD28 superagonist antibody can prevent rat cardiac allograft rejection | |
RU2784566C2 (ru) | РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ Т-КЛЕТОК | |
EP3500298A2 (en) | Regulation of tumor-associated t cells | |
EA044224B1 (ru) | ЭКСПАНСИЯ γδ-T-КЛЕТОК, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | |
HAYDAY et al. | Patent 3003077 Summary | |
KR20240052771A (ko) | 림프구 효력 검정 | |
Verkerk et al. | Isolation and expansion of pure and functional γδ T cells | |
Funck | Innate immune cell crosstalk induces melanoma cell senescence | |
WO2023092155A1 (en) | Organoid and tumor-infiltrating lymphocyte co-culture for optimization of patient-specific immunotherapy response | |
Jak et al. | Activated T cells induce activation, proliferation and drug resistance in chronic lymphocytic leukemia cells |