KR20210111746A - 세포를 단리 및 증식하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-9(IL-9); (b) 인터루킨-15(IL-15); 및 (c) 인터루킨-21(IL-21);의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및 비-조혈조직 시료로부터 배양된 림프구 집단을 수집하는 단계;를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구(특히 γδ T 세포)를 단리하는 방법에 관한 것이다. 후속 증식 방법와 함께 방법에 의해 수득된 단리된 세포 집단 및 이의 용도가 제공된다.
Description
본 발명은 비-조혈조직-상재 림프구(non-haematopoietic tissue-resident lymphocytes), 특히 γδ T 세포의 단리 및/또는 증식을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 γδ T 세포는 비-Vδ2 세포, 예를 들면 Vδ1, Vδ3 및 Vδ5 세포를 포함하며, 상기 비-조혈조직은 피부와 장을 포함한다. 상기 단리 및/또는 증식된 비-조혈조직-상재 림프구는 입양 T 세포 치료(adoptive T cell therapies)와 키메라 수용체 치료법 등에 매우 유용함을 알 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 개별 세포 및 세포 집단 모두에 관한 것이다.
암에 대한 T 세포 면역치료요법에 대한 관심이 증가하면서, 특히 PD-1, CTLA-4 및 기타 수용체에 의해 발휘되는 억제 경로의 임상적으로 매개되는 길항작용에 의해 탈-억제될 때 암세포를 인식하고 숙주를 보호하는 기능적 잠재력을 매개하는 CD8+ 및 CD4+ αβ T 세포 서브세트의 명백한 능력에 초점이 맞춰져 왔다. 그러나, αβ T 세포는 MHC-제한적이며, 이는 이식편대숙주질환(graft versus host disease)을 야기할 수 있다.
감마 델타 T 세포(γδ T 세포)는 표면에 독특하고, 뚜렷한 γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포의 서브세트이다. TCR은 하나의 감마(γ)와 하나의 델타(δ) 사슬로 구성된다. 인간 γδ TCR 사슬은 3개의 주요 δ 사슬, Vδ1, Vδ2 및 Vδ3와 6개의 γ 사슬에서 선택된다. 인간 γδ T 세포는 특정 γ 및 δ 유형이 하나 이상의 조직 유형에서 배타적이지는 않더라도 더 우세하게 발견되기 때문에, TCR 사슬을 기준으로 대략적으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 대부분의 혈액-상재 γδ T 세포는 Vδ2 TCR(예를 들어 Vγ9Vδ2)을 발현하는 반면, 이는 피부에서는 Vδ1을, 장에서는 Vγ4를 더 자주 사용하는 조직-상재 γδ T 세포에서는 덜 일반적이다.
림프구를 단리하는 대부분의 방법은 혈액에서 이러한 세포 유형을 단리하는 것에 의존해 왔다. αβ T 세포, γδ T 세포 및 NK 세포와 같은 비-조혈조직-상재 림프구는 비-조혈 종양 및 기타 타겟을 표적으로 하는 것과 같은 특정 용도에 특히 적합한 특성을 가질 수 있다. 그러나, 특히 많은 적응증에 대해 임상 용량은 108 이상의 세포가 필요하기 때문에 이러한 조직 상재 림프구를 임상적으로 적절한 양으로 단리하는 것은 난제로 남아 있다. 무엇보다도, 생산 중 상당한 세포가 손실된다는 것은 더 많은 원료 세포가 준비되어야 한다는 것을 의미한다.
비-조혈조직-상재 림프구, 특히 αβ T 세포, γδ T 세포 및 NK 세포는 많은 수로 쉽게 얻을 수 없기 때문에, 그들은 치료적 응용을 위해 특징이 잘 분석되거나 연구되지 않았다. 따라서, 당분야에서는 예를 들면, 입양 T 세포 치료제로서 연구와 잠재적으로 치료에 채택하기 충분한 양으로 비-조혈조직-상재 림프구, 특히 γδ T 세포를 단리하고 증식시키는 방법이 필요하다.
Clark 등(J. Invest. Dermatol. 2006, 126 (5) : 1059-70)은 정상 및 병든 피부로부터 피부 상재 T 세포를 단리하는 방법을 기술하였다. 그러나 기재된 방법은 동물 제품이 존재할 뿐 아니라 특히 단리된 세포의 수율이 조직 ㎠ 당 106 세포에 미치지 못하는 상대적으로 낮은 수율 때문에 임상 사용에 적합하지 않다. Clark 등에 기재된 방법은 조직 시료의 구조적 무결성에 의도적인 손상을 초래한 다진(minced) 시료를 사용한다. WO2017072367과 WO2018/202808은 적어도 인터루킨-2(IL-2) 및/또는 인터루킨-15(IL-15)의 존재 하에 비-조혈조직에서 얻은 림프구를 배양하는 것에 의한 시험관 내 비-조혈조직-상재 γδ T세포의 증식 방법에 관한 것이다. WO2015189356은 IL-2, IL-15 및 IL-21에서 선택된 적어도 2종 유형의 사이토카인을 포함하는 혈장교환에 의해 수득한 시료로부터 얻어진 림프구의 증식을 위한 조성물을 기술한다. 따라서, 임상 사용에 적합한 더 많은 양의 세포를 얻을 수 있는, 예를 들면 피부로부터, 조직-상재 비-조혈 림프구를 단리하는 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본 발명의 첫 번째 양태에 따르면,
(i) (a) 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-9(IL-9);
(b) 인터루킨-15(IL-15); 및
(c) 인터루킨-21(IL-21);
의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및
(ii) 비-조혈조직 시료로부터 배양된 림프구 집단을 수집하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 단리하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
(i) (a) IL-2 또는 IL-9;
(b) IL-15; 및
(c) IL-21;
의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및
(ii) 비-조혈조직 시료로부터 배양된 γδ T 세포 집단을 수집하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 림프구 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 림프구 집단을 적어도 5일간 추가로 배양하여 증식된 림프구 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 γδ T 세포 집단을 적어도 5일간 추가로 배양하여 증식된 γδ T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
도 1: 도 1a: 총 세포 수율과 γδ T 세포 및 Vδ1 세포의 비율을 2종 사이토카인(IL-2 및 IL-15)와 4종 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21)을 사용한 단리방법으로 측정하였다. 도 1b: 4종 사이토카인 방법을 사용하여 얻어진 γδ T 세포 및 Vδ1 세포의 비율을 2종 사이토카인 방법과 비교하여 백분율로 나타내었다.
도 2: 도 2a: G-REX6에서 총 세포 수율을 2종 사이토카인 '2CK' (IL-2 및 I:-15). 3종 사이토카인 '3CK' (IL-2, IL-15 및 IL-21) 및 4종 사이토카인 '4CK' (IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21) 방법으로 AIM-V 배지+5% 혈청 대체제에서 측정하였다. 도 2b: γδ T 세포의 비율, 및 도 2c: γδ T 세포 중 Vδ1 세포의 비율도 나타내었다.
도 3: 24-웰 플레이트에서 2CK와 4CK 방법을 사용하여 AIM-V+5% 인간 AB 혈청에서 단리한 Vδ1 세포의 표현형을 TIGIT 및 CD27 발현 비율을 측정하는 것에 의해 분석하였다.
도 4: G-REX6에서 2CK, 3CK와 4CK 방법을 사용하여 AIM-V 배지+5% 혈청 대체제에서 단리한 Vδ1 세포의 표현형을 도 4a: CD27의 발현 비율, 도 4b: TIGIT 발현 비율을 측정하는 것에 의해 분석하였다.
도 5: 3 ㎜ 펀치 생검과 표준 피부 다짐법으로부터 얻어진 총 세포 수율을 비교하는 초기 테스트.
도 6: 메스로 다진 대조군 시료와 비교한 4-웰 플레이트, AIM-V+5% 인간 AB 혈정에서 다양한 크기의 단리된 펀치 생검으로부터의 γδ 세포 수율.
도 7: AIM-V+5% 인간 AB 혈청으로 다른 배양용기를 사용한 생검(위) 및 플레이트(아래) 당 총 세포 수율.
도 8: 2종 사이토카인, 3종 사이토카인 및 4종 사이토카인 단리 프로토콜을 사용하여 단리한 세포에서의 CD27의 발현 수준.
도 9: G-REX6에서 2CK 및 4CK 방법을 사용하여 10% 인간 AB 혈청(좌) 또는 5% 혈청 대체제(우)을 포함한 배지에서 단리된 Vδ1 세포의 표현형을 도 9a: CD27 발현 비율, 및 도 9b: TIGIT 발현비율을 측정하여 분석하였다. 도 9c: 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 2CK 및 4CK 방법을 사용하여 단리한 αβ T 세포(CD3+, panγδ- 세포)에 대해서 PD-1 발현을 함께 측정하였다.
도 10: 실시예 6에 기재된 단리 방법에 사용된 다른 배지의 비교를 보여주는 그래프.
도 11: G-REX6에서 AIM-V+표시된 혈청 보충물에서 2주(위) 또는 3주(아래) 단리된 총 세포 수율의 비교.
도 12: 5% G-REX6에서 혈청 대체제(SR) vs 5% 또는 10% 인간 AB 혈청(AB)을 포함하는 AIM-V 배지를 사용하여 단리한 총 세포 수율과 Vδ1의 비율.
도 13: A: 2CK 또는 B: 4CK 방법을 사용하여 단리한 후 4CK 방법을 사용하여 증식한 집단에서 세포 유형의 분포.
도 14: 도 14a~도14f: 2CK 또는 4CK 방법을 사용하여 단리한 후 4CK 방법을 사용하여 증식한 Vδ1 세포의 다양한 마커의 발현 분석.
도 15: 2CK 또는 4CK 방법을 사용하여 단리한 후 4CK 방법을 사용하여 증식한 γδ 세포 및 Vδ1 세포의 총 수.
도 2: 도 2a: G-REX6에서 총 세포 수율을 2종 사이토카인 '2CK' (IL-2 및 I:-15). 3종 사이토카인 '3CK' (IL-2, IL-15 및 IL-21) 및 4종 사이토카인 '4CK' (IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21) 방법으로 AIM-V 배지+5% 혈청 대체제에서 측정하였다. 도 2b: γδ T 세포의 비율, 및 도 2c: γδ T 세포 중 Vδ1 세포의 비율도 나타내었다.
도 3: 24-웰 플레이트에서 2CK와 4CK 방법을 사용하여 AIM-V+5% 인간 AB 혈청에서 단리한 Vδ1 세포의 표현형을 TIGIT 및 CD27 발현 비율을 측정하는 것에 의해 분석하였다.
도 4: G-REX6에서 2CK, 3CK와 4CK 방법을 사용하여 AIM-V 배지+5% 혈청 대체제에서 단리한 Vδ1 세포의 표현형을 도 4a: CD27의 발현 비율, 도 4b: TIGIT 발현 비율을 측정하는 것에 의해 분석하였다.
도 5: 3 ㎜ 펀치 생검과 표준 피부 다짐법으로부터 얻어진 총 세포 수율을 비교하는 초기 테스트.
도 6: 메스로 다진 대조군 시료와 비교한 4-웰 플레이트, AIM-V+5% 인간 AB 혈정에서 다양한 크기의 단리된 펀치 생검으로부터의 γδ 세포 수율.
도 7: AIM-V+5% 인간 AB 혈청으로 다른 배양용기를 사용한 생검(위) 및 플레이트(아래) 당 총 세포 수율.
도 8: 2종 사이토카인, 3종 사이토카인 및 4종 사이토카인 단리 프로토콜을 사용하여 단리한 세포에서의 CD27의 발현 수준.
도 9: G-REX6에서 2CK 및 4CK 방법을 사용하여 10% 인간 AB 혈청(좌) 또는 5% 혈청 대체제(우)을 포함한 배지에서 단리된 Vδ1 세포의 표현형을 도 9a: CD27 발현 비율, 및 도 9b: TIGIT 발현비율을 측정하여 분석하였다. 도 9c: 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 2CK 및 4CK 방법을 사용하여 단리한 αβ T 세포(CD3+, panγδ- 세포)에 대해서 PD-1 발현을 함께 측정하였다.
도 10: 실시예 6에 기재된 단리 방법에 사용된 다른 배지의 비교를 보여주는 그래프.
도 11: G-REX6에서 AIM-V+표시된 혈청 보충물에서 2주(위) 또는 3주(아래) 단리된 총 세포 수율의 비교.
도 12: 5% G-REX6에서 혈청 대체제(SR) vs 5% 또는 10% 인간 AB 혈청(AB)을 포함하는 AIM-V 배지를 사용하여 단리한 총 세포 수율과 Vδ1의 비율.
도 13: A: 2CK 또는 B: 4CK 방법을 사용하여 단리한 후 4CK 방법을 사용하여 증식한 집단에서 세포 유형의 분포.
도 14: 도 14a~도14f: 2CK 또는 4CK 방법을 사용하여 단리한 후 4CK 방법을 사용하여 증식한 Vδ1 세포의 다양한 마커의 발현 분석.
도 15: 2CK 또는 4CK 방법을 사용하여 단리한 후 4CK 방법을 사용하여 증식한 γδ 세포 및 Vδ1 세포의 총 수.
본 발명의 첫 번째 양태에 따르면,
(i) (a) 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-9(IL-9);
(b) 인터루킨-15(IL-15); 및
(c) 인터루킨-21(IL-21);
의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및
(ii) 비-조혈조직 시료로부터 배양된 림프구 집단을 수집하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 단리하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
(i) (a) IL-2 또는 IL-9;
(b) IL-15; 및
(c) IL-21;
의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및
(ii) 비-조혈조직 시료로부터 배양된 γδ T 세포 집단을 수집하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리하는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 세포, 특히 림프구 및/또는 γδ T 세포의 "단리"라 함은 세포가 제거, 분리, 정제, 농축 또는 다른 방법으로 조직 또는 세포의 풀로부터 꺼내어지는 방법 또는 공정을 의미한다. 상기 지칭은 "분리된", "제거된", "정제된", "농축된" 등의 용어를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. γδ T 세포의 단리는 온전한 비-조혈조직 시료 또는 비-조혈조직의 기질세포(예를 들면, 섬유아세포 또는 상피세포)로부터 세포를 단리 또는 분리하는 것을 포함한다. 상기 단리는 대안적으로 또는 부가적으로 다른 조혈 세포(예를 들면, αβ T 세포 또는 다른 림프구)로부터 γδ T 세포의 단리 또는 분리를 포함할 수 있다. 단리는 정의된 기간 동안 수행될 수 있으며, 예를 들어 조직 외식편(explant) 또는 생검을 단리 배양액에 넣는 때 시작하여 단리된 세포집단을 증식 배양액으로 옮기거나 다른 목적으로 사용하기 위하여 원심분리 또는 다른 수단에 의해 세포가 배양액으로부터 수집되거나, 혹은 원래의 조직 외식편 또는 생검이 배양액에서 제거될 때 종료된다. 단리 단계는 최소 약 3일 내지 약 45일 동안일 수 있다. 일 실시예에서, 단리 단계는 최소 약 10일 내지 최소 28 일 동안이다. 추가 실시예에서, 단리 단계는 최소 14일 내지 최소 21일 동안이다. 따라서 단리 단계는 최소 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 약 35일, 약 40일 또는 약 45일일 수 있다. 단리된 세포 증식이 본 단리 단계동안 큰 규모로 일어나는 것은 아니지만, 전혀 일어나지 않는 것이 아님은 당연하다. 실제로 당업자에게는 단리된 세포가 또한 분열을 시작하여 조직 및/또는 스캐폴드(scaffold)를 포함하는 단리 용기 내에서 다수의 상기 세포를 생성 할 수 있음은 당연하다.
따라서, 본 명세서에서 "단리된 γδ T 세포", "단리된 γδ T 세포 집단", "γδ T 세포의 단리된 집단", "분리된 γδ T 세포", "분리된 γδ T 세포 집단" 또는 "γδ T의 분리된 집단"은 세포가 비-조혈세포 또는 온전한 비-조혈조직 내에 존재하는 세포와 실질적으로 접촉하지 않도록 원래의 비-조혈조직 시료로부터 단리, 분리, 제거, 정제 또는 농축된 γδ 세포를 포함하는 조혈세포 또는 조혈세포 집단을 지칭한다. 마찬가지로, 본 명세서에서 "Vδ1 T 세포의 단리 또는 분리된 집단"은 세포가 비-조혈세포 또는 온전한 비-조혈조직 내에 존재하는 세포와 실질적으로 접촉하지 않도록 원래의 비-조혈조직 시료로부터 단리, 분리, 제거, 정제 또는 농축된 Vδ1 T 세포를 포함하는 조혈세포를 지칭한다. 따라서, 단리 또는 분리는 비-조혈세포(예를 들면, 기질세포, 섬유아세포 및/또는 상피세포)로부터 조혈세포(예를 들면, γδ T 세포 또는 기타 림프구)의 단리, 분리, 제거, 정제 또는 농축을 의미한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이 γδ T 세포의 단리 방법은 조직의 파괴(예를 들면, 다지기) 후 다른 유형의 세포로부터 γδ T 세포를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같이 γδ T 세포의 단리 방법은 조직 상재 림프구가 물리적으로 조직 매트릭스의 파괴없이 조직 매트릭스와 분리되는 온전한 비-조혈조직 시료 또는 외식편 또는 생검의 조직 매트릭스로부터 γδ T 세포 및 기타 세포 유형의 "크롤 아웃(crawl-out)"을 포함할 수 있다. 조직 매트릭스의 무결성을 유지함으로써, 섬유아세포와 같은 억제 세포 유형이 거의 또는 전혀 배출되지 않으면서 조직 상재 림프구가 조직 매트릭스로부터 우선적으로 배출된다는 것이 발견되었으며, 억제 세포 유형은 단리의 마지막에 쉽게 제거될 수 있는 외식편 또는 생검에 남아있게 된다. 따라서, 일부 실시예에서, 온전한 비-조혈조직 시료 또는 조직 매트릭스의 사용은 조직에서 배양액으로 방출되는 섬유아세포가 적어지도록 한다. 온전한 비-조혈조직 시료 또는 조직 매트릭스를 사용하는 이러한 "크롤링" 방법은 비-조혈조직 시료 또는 조직 매트릭스의 과도한 처리에 대한 필요성을 감소시키고 비-조혈조직 또는 조직 매트릭스의 구조적 무결성을 유지하는 이점을 가지며, 더 높은 단리 세포의 수율을 초래하는 예상치 못한 이점을 제공할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 비-조혈조직 유래 림프구의 단리 방법은 비-조혈조직의 온전한 생검 또는 외식편으로부터 비-조혈조직 유래 림프구를 단리하는 방법을 포함한다. 상기 온전한 생검 또는 외식편은 조직 시료로부터 생검 또는 외식편을 제거하는 적출 주변부에서 생검 또는 외식편의 구조적 무결성이 의도적으로 파괴되지 않은 것이다. 상기 온전한 생검 또는 외식편은 취급으로 인한 경미한 손상을 제외하고는 대부분 3차원 구조가 유지된다. 따라서 온전한 생검 또는 외식편은 예를 들어 다지기나 잘게 자르는 것에 의해 기계적으로 손상되거나, 화학적 효소적으로 파손되지 않았다. 그러나, 파괴된 조직도 본 발명의 단리 방법에서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 단리된 림프구는 αβ T 세포이다. 다른 실시예에서 단리된 림프구는 γδ T 세포이다. 또 다른 실시예에서, 단리된 림프구는 NK 세포이다. 하나 이상의 유형의 림프구가 동일한 단리 단계로부터 분리될 수도 있다.
"크롤 아웃" 또는 예를 들어 본 명세서에서 정의된 바와 같은 방법을 사용하는 γδ T 세포의 단리 방법은 γδ T 세포 및/또는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 다른 림프구의 단리 또는 분리를 유도하기에 충분한 사이토카인 및/또는 케모카인의 존재 하에 세포 및/또는 비-조혈조직 시료를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서, 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포의 단리는 IL-2, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 비-조혈조직 시료를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포의 단리는 IL-9, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 비-조혈조직 시료를 배양하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 γδ T 세포의 단리는 비-조혈조직 시료를 인터루킨-4(IL-4)의 존재 하에서 배양하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-4의 존재 하에서 배양된다. 대안적인 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 IL-9, IL-15, IL-21 및 IL-4의 존재 하에서 배양된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "IL-2"는 하나 이상의 IL-2 수용체(IL-2R) 서브유닛(예를 들어, 돌연변이체, 뮤테인, 유사체, 서브유닛, 수용체 복합체, 단편, 이소형 및 이의 펩티도모사체)에 대한 작용제로서 작용하는 천연 또는 재조합 IL-2 또는 이의 변이체를 의미한다. 이러한 제제는 IL-2-의존성 세포주 CTLL-2(33; American Type Culture Collection (ATCC®) TIB 214)의 증식을 도울 수 있다. 성숙한 인간 IL-2는 Fujita 등. Cell 1986. 46.3 : 401-407에 기재된 바와 같이 133개의 아미노산 서열(추가의 20N-말단 아미노산으로 구성된 신호 펩티드가 적은)로 존재한다. IL-2 뮤테인은 US 2014/0046026에 기재된 바와 같이 IL-2Rβ에 결합하는 능력을 유지하면서 인터루킨-2 단백질에 대한 특이적 치환이 이루어진 폴리펩티드이다. IL-2 뮤테인은 천연 IL-2 폴리펩티드 사슬의 다른 잔기 내 또는 다른 잔기에서 하나 이상의 부위에 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 변형된 것이 특징이다. 본 명세서에 따라 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 변형은 IL-2Rβ 결합 활성을 보유하는 IL-2 뮤테인을 유도한다. 예시적인 뮤테인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
인간 IL-2를 암호화하는 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 인간 IL-2(Gene ID 3558)의 아미노산 서열은 Genbank 수탁 로케이터(accession locator) NP_000577.2 GI : 28178861에서 찾을 수 있다. 쥐(Mus musculus) IL-2 아미노산 서열(유전자 ID 16183)은 Genbank 수탁 로케이터 NP_032392.1 GI : 7110653에서 발견된다.
IL-2는 또한 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 돼지, 말 및 쥐을 포함하는 다양한 포유동물 종으로부터 유래된 IL-2를 지칭할 수 있다. 변이체는 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있으며, 이는 소정의 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체된 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 Ile, Val, Leu 또는 Ala와 같은 하나의 지방족 잔기가 서로에 대해 다른 하나의 지방족 잔기로 치환, 또는 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn간의 치환과 같이 하나의 극성 잔기가 다른 것으로 치환되는 것을 포함한다. 예를 들면, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환과 같은 다른 상기 보존적 치환이 잘 알려져 있다. 자연적으로 발생하는 IL-2 변이체 역시 본 발명에 포함된다. 상기 변이체의 예는 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternate splicing) 이벤트 또는 IL-2 단백질의 단백질분해(proteolysis) 절단으로 인해 유래된 단백질이며, 여기서 IL-2 결합 특성은 유지된다. mRAN의 선택적 스플라이싱은 끝이 절단되었으나, 생물학적으로 활성인 IL-2 단백질을 생성할 수 있다. 단백질분해에 기인한 변이체는 IL-2 단백질에서 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로는 1~10 아미노산)의 단백질분해 제거로 인해 예를 들면, 다른 유형의 숙주 세포에서 발현시 N- 또는 C- 말단의 차이를 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 말단 또는 내부는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화학적 그룹을 사용하여, 그 물리적 특성이 변경되도록 변형될 수 있다(Yang, et al. Cancer 1995. 76 : 687-694). 일부 실시예에서, 단백질의 말단 또는 내부는 추가의 아미노산으로 변형 될 수 있다(Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90 : 3574-3577).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "IL-15"는 하나 이상의 IL-15 수용체(IL-15R) 서브유닛(예를 들어, 돌연변이체, 뮤테인, 유사체, 서브유닛, 수용체 복합체, 단편, 이소형 및 이의 펩티도모사체)에 대한 작용제로서 작용하는 천연 또는 재조합 IL-15 또는 이의 변이체를 의미한다. IL-2와 마찬가지로 IL-15는 IL-2-의존성 세포주인 CTLL-2의 증식을 도울 수 있는 공지된 T-세포 성장 인자이다. IL-15는 114개 아미노산 성숙 단백질로서 Grabstein 등(Grabstein, et al. Science 1994. 264.5161 : 965-969)에 의해 처음 보고되었다. 본 명세서에 사용된 것처럼 용어 "IL-15"는 천연 또는 재조합 IL-15 및 뮤테인, 유사체, 이의 서브 유닛 또는 이의 복합체 (예를 들면, 수용체 복합체, 예를 들어 WO 2007/046006에 기재된 바와 같은 스시(sushi) 펩티드)를 의미하고, 이의 각각은 CTLL-2 세포의 증식을 자극할 수 있다. CTLL-2 증식 분석에서, 재조합적으로 발현된 전구체 및 IL-15의 성숙한 형태의 인프레임 융합체로 형질주입된 세포의 상등액은 CTLL-2 세포 증식을 유도 할 수 있다.
인간 IL-15는 Grabstein 등(Grabstein, et al. Science 1994. 264.5161 : 965-969)에 기재된 공정 또는 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 통상적인 절차에 따라 수득될 수 있다. 인간 IL-15 cDNA는 1993년 2월 19일 ATCC®에 기탁되었으며, 수탁번호 69245를 부여받았다.
인간 IL-15(Gene ID 3600)의 아미노산 서열은 Genbank 수탁 로케이터 NP000576.1 GI : 10835153 (이소형 1) 및 NP_751915.1 GI : 26787986 (이소형 2)에서 발견된다. 쥐(Mus musculus) IL-15 아미노산 서열 (Gene ID 16168)은 Genbank 수탁 로케이터 NP_001241676.1 GI : 363000984에서 발견된다.
IL-15는 또한 예를 들어 인간, 유인원, 소, 돼지, 말 및 쥐를 포함하는 다양한 포유동물 종으로부터 유래 된 IL-15를 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 IL-15 "뮤테인" 또는 "변이체"라 함은 천연 포유동물 IL-15의 서열과 실질적으로 상동성이지만, 아미노산 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 포유동물 IL-15 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 칭한다. 변이체는 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있으며, 이는 소정의 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체된 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 Ile, Val, Leu 또는 Ala와 같은 하나의 지방족 잔기가 서로에 대해 다른 하나의 지방족 잔기로 치환, 또는 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn간의 치환과 같이 하나의 극성 잔기가 다른 것으로 치환되는 것을 포함한다. 예를 들면, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환과 같은 다른 상기 보존적 치환이 잘 알려져 있다. 자연적으로 발생하는 IL-15 변이체 역시 본 발명에 포함된다. 상기 변이체의 예는 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternate splicing) 이벤트 또는 IL-15 단백질의 단백질분해 절단으로 인해 유래된 단백질이며, 여기서 IL-15 결합 특성은 유지된다. mRAN의 선택적 스플라이싱은 끝이 절단되었으나, 생물학적으로 활성인 IL-15 단백질을 생성할 수 있다. 단백질분해에 기인한 변이체는 IL-15 단백질에서 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로는 1~10 아미노산)의 단백질분해 제거로 인해 예를 들면, 다른 유형의 숙주 세포에서 발현시 N- 또는 C- 말단의 차이를 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 말단은, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화학적 그룹을 사용하여, 그 물리적 특성이 변경되도록 변형될 수 있다(Yang, et al. Cancer 1995. 76 : 687-694). 일부 실시예에서, 단백질의 말단 또는 내부는 추가의 아미노산으로 변형 될 수 있다(Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90 : 3574-3577).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "IL-4는 하나 이상의 IL-4 수용체(IL-4R) 서브유닛(예를 들어, 돌연변이체, 뮤테인, 유사체, 서브유닛, 수용체 복합체, 단편, 이소형 및 이의 펩티도모사체)에 대한 작용제로서 작용하는 천연 또는 재조합 IL-4 또는 이의 변이체를 의미한다. 이러한 제제는 미감작 도움 T 세포(naㅿve helper T cells, Th0 세포)를 Th2 세포로 분화시키는 것을 지원할 수 있다. 성숙한 인간 IL-4는 129개의 아미노산 서열(추가의 24 N-말단 아미노산으로 구성된 신호 펩티드가 적은)로 존재한다. IL-4 뮤테인은 미국특허 6,313,272에 기재된 바와 같이 IL-4Rα에 결합하는 능력을 유지하면서 인터루킨-4 단백질에 대한 특이적 치환이 이루어진 폴리펩티드이다. IL-4 뮤테인은 천연 IL-4 폴리펩티드 사슬의 다른 잔기 내 또는 다른 잔기에서 하나 이상의 부위에 아미노산이 삽입, 결실, 치환 및 변형된 것이 특징이다. 본 명세서에 따라 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 변형은 IL-2Rα 결합 활성을 보유하는 IL-4 뮤테인을 유도한다. 예시적인 뮤테인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
인간 IL-4를 암호화하는 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 인간 IL-4(Gene ID 3565)의 아미노산 서열은 Genbank 수탁 로케이터 NG_023252에서 찾을 수 있다. 쥐(Mus musculus) IL-4 아미노산 서열(유전자 ID 16189)은 Genbank 수탁 로케이터 NC_000077.6.에서 발견된다.
IL-4는 또한 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 돼지, 말 및 쥐을 포함하는 다양한 포유동물 종으로부터 유래된 IL-4를 지칭할 수 있다. 변이체는 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있으며, 이는 소정의 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체된 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 Ile, Val, Leu 또는 Ala와 같은 하나의 지방족 잔기가 서로에 대해 다른 하나의 지방족 잔기로 치환, 또는 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn간의 치환과 같이 하나의 극성 잔기가 다른 것으로 치환되는 것을 포함한다. 예를 들면, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환과 같은 다른 상기 보존적 치환이 잘 알려져 있다. 자연적으로 발생하는 IL-4 변이체 역시 본 발명에 포함된다. 상기 변이체의 예는 mRNA의 선택적 스플라이싱 이벤트 또는 IL-4 단백질의 단백질분해 절단으로 인해 유래된 단백질이며, 여기서 IL-4 결합 특성은 유지된다. mRAN의 선택적 스플라이싱은 끝이 절단되었으나, 생물학적으로 활성인 IL-4 단백질을 생성할 수 있다. 단백질분해에 기인한 변이체는 IL-4 단백질에서 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로는 1~10 아미노산)의 단백질분해 제거로 인해 예를 들면, 다른 유형의 숙주 세포에서 발현시 N- 또는 C- 말단의 차이를 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 말단은, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화학적 그룹을 사용하여, 그 물리적 특성이 변경되도록 변형될 수 있다(Yang, et al. Cancer 1995. 76 : 687-694). 일부 실시예에서, 단백질의 말단 또는 내부는 추가의 아미노산으로 변형 될 수 있다(Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90 : 3574-3577).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "IL-21"은 하나 이상의 IL-21 수용체(IL-21R) 서브유닛(예를 들어, 돌연변이체, 뮤테인, 유사체, 서브유닛, 수용체 복합체, 단편, 이소형 및 이의 펩티도모사체)에 대한 작용제로서 작용하는 천연 또는 재조합 IL-21 또는 이의 변이체를 의미한다. 이러한 제제는 자연살해(NK) 및 세포독성(CD8+) T 세포의 증식을 도울 수 있다. 성숙한 인간 IL-21은 133개의 아미노산 서열(추가의 22 N-말단 아미노산으로 구성된 신호 펩티드가 적은)로 존재한다. IL-21 뮤테인은 미국특허 US 9,388,241에 기재된 바와 같이 IL-21Rα에 결합하는 능력을 유지하면서 인터루킨-21 단백질에 대한 특이적 치환이 이루어진 폴리펩티드이다. IL-21 뮤테인은 천연 IL-21 폴리펩티드 사슬의 다른 잔기 내 또는 다른 잔기에서 하나 이상의 부위에 아미노산이 삽입, 결실, 치환 및 변형된 것이 특징이다. 본 명세서에 따라 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 변형은 IL-21Rα 결합 활성을 보유하는 IL-21 뮤테인을 유도한다. 예시적인 뮤테인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
인간 IL-21를 암호화하는 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인공정에 의해 수득될 수 있다. 인간 IL-21(Gene ID 59067)의 아미노산 서열은 Genbank 수탁 로케이터 NC_000004.12에서 찾을 수 있다. 쥐(Mus musculus) IL-21 아미노산 서열(유전자 ID 60505)은 Genbank 수탁 로케이터 NC_000069.6에서 발견된다.
IL-21은 또한 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 돼지, 말 및 쥐을 포함하는 다양한 포유동물 종으로부터 유래된 IL-21을 지칭할 수 있다. 변이체는 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있으며, 이는 소정의 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체된 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 Ile, Val, Leu 또는 Ala와 같은 하나의 지방족 잔기가 서로에 대해 다른 하나의 지방족 잔기로 치환, 또는 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn간의 치환과 같이 하나의 극성 잔기가 다른 것으로 치환되는 것을 포함한다. 예를 들면, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환과 같은 다른 상기 보존적 치환이 잘 알려져 있다. 자연적으로 발생하는 IL-21 변이체 역시 본 발명에 포함된다. 상기 변이체의 예는 mRNA의 선택적 스플라이싱 이벤트 또는 IL-21 단백질의 단백질분해 절단으로 인해 유래된 단백질이며, 여기서 IL-21 결합 특성은 유지된다. mRAN의 선택적 스플라이싱은 끝이 절단되었으나, 생물학적으로 활성인 IL-21 단백질을 생성할 수 있다. 단백질분해에 기인한 변이체는 IL-21 단백질에서 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로는 1~10 아미노산)의 단백질분해 제거로 인해 예를 들면, 다른 유형의 숙주 세포에서 발현시 N- 또는 C- 말단의 차이를 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 말단은, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화학적 그룹을 사용하여, 그 물리적 특성이 변경되도록 변형될 수 있다(Yang, et al. Cancer 1995. 76 : 687-694). 일부 실시예에서, 단백질의 말단 또는 내부는 추가의 아미노산으로 변형 될 수 있다(Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90 : 3574-3577).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "IL-9"은 하나 이상의 IL-9 수용체(IL-9R) 서브유닛(예를 들어, 돌연변이체, 뮤테인, 유사체, 서브유닛, 수용체 복합체, 단편, 이소형 및 이의 펩티도모사체)에 대한 작용제로서 작용하는 천연 또는 재조합 IL-9 또는 이의 변이체를 의미한다. 성숙한 인간 IL-9은 144개의 아미노산 서열로 존재한다. IL-9 뮤테인은 IL-9R에 결합하는 능력을 유지하면서 인터루킨-9 단백질에 대한 특이적 치환이 이루어진 폴리펩티드이다. IL-9 뮤테인은 천연 IL-9 폴리펩티드 사슬의 다른 잔기 내 또는 다른 잔기에서 하나 이상의 부위에 아미노산이 삽입, 결실, 치환 및 변형된 것이 특징이다. 본 명세서에 따라 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 변형은 IL-9R 결합 활성을 보유하는 IL-9 뮤테인을 유도한다. 예시적인 뮤테인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
인간 IL-9을 암호화하는 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 인간 IL-9의 아미노산 서열은 UniProtKB P15248에 의해 제공된다.
IL-9은 또한 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 돼지, 말 및 쥐을 포함하는 다양한 포유동물 종으로부터 유래된 IL-9을 지칭할 수 있다. 변이체는 보존적으로 치환된 서열을 포함할 수 있으며, 이는 소정의 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체된 것을 의미한다. 보존적 치환의 예는 Ile, Val, Leu 또는 Ala와 같은 하나의 지방족 잔기가 서로에 대해 다른 하나의 지방족 잔기로 치환, 또는 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn간의 치환과 같이 하나의 극성 잔기가 다른 것으로 치환되는 것을 포함한다. 예를 들면, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환과 같은 다른 상기 보존적 치환이 잘 알려져 있다. 자연적으로 발생하는 IL-9 변이체 역시 본 발명에 포함된다. 상기 변이체의 예는 mRNA의 선택적 스플라이싱 이벤트 또는 IL-9 단백질의 단백질분해 절단으로 인해 유래된 단백질이며, 여기서 IL-9 결합 특성은 유지된다. mRAN의 선택적 스플라이싱은 끝이 절단되었으나, 생물학적으로 활성인 IL-9 단백질을 생성할 수 있다. 단백질분해에 기인한 변이체는 IL-9 단백질에서 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로는 1~10 아미노산)의 단백질분해 제거로 인해 예를 들면, 다른 유형의 숙주 세포에서 발현시 N- 또는 C- 말단의 차이를 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 말단은, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화학적 그룹을 사용하여, 그 물리적 특성이 변경되도록 변형될 수 있다(Yang, et al. Cancer 1995. 76 : 687-694). 일부 실시예에서, 단백질의 말단 또는 내부는 추가의 아미노산으로 변형 될 수 있다(Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90 : 3574-3577).
특정 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 최소 100 IU/mL처럼, 일반적으로 최소 10 IU/mL(예를 들어, 10 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 20 IU/mL 내지 800 IU/mL, 25 IU/mL 내지 750 IU/mL, 30 IU/mL 내지 700 IU/mL, 40 IU/mL 내지 600 IU/mL, 50 IU/mL 내지 500 IU/mL , 75 IU/mL 내지 250 IU/mL, 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 예를 들어 10 IU/mL 내지 20 IU/mL, 20 IU/mL 내지 30 IU/mL, 30 IU/mL 내지 40 IU/mL, 40 IU/mL 내지 50 IU/mL, 50 IU/mL 내지 75 IU/mL, 75 IU/mL 내지 100 IU/mL, 100 IU/mL 내지 150 IU/mL, 150 IU/mL 내지 200 IU/mL, 200 IU/mL 내지 500 IU/mL, 또는 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL) 농도의 IL-2를 포함한다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 500 IU/mL 미만처럼, 일반적으로 1,000 IU/mL 미만 농도의 IL-2를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 약 100 IU/mL 농도의 IL-2를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 최소 10 mg/mL처럼, 일반적으로 최소 0.1 ng/mL(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 10,000 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 1,000 ng/mL, 5 ng/mL 내지 800 ng/mL, 10 ng/mL 내지 750 ng/mL, 20 ng/mL 내지 500 ng/mL, 50 ng/mL 내지 400 ng/mL , 또는 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 예를 들어 0.1 ng/mL 내지 1.0 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 5.0 ng/mL, 5.0 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20ng/mL, 20 ng/mL 내지 100 ng/mL, 20 ng/mL 내지 50 ng/mL, 40 ng/mL 내지 70 ng/mL, 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 50 ng/mL 내지 60 ng/mL, 100 ng/mL 내지 200 ng/mL, 200 ng/mL 내지 500 ng/mL, 또는 500 ng/mL 내지 1,000 ng/mL) 농도의 IL-15를 포함한다. 추가적인 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 100 ng/mL 미만처럼, 일반적으로 500 ng/mL 미만 농도의 IL-15를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 약 50 ng/mL 농도의 IL-15를 포함한다.
일부 실시예에서, 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포의 단리는 IL-2 및 IL-15 둘 모두의 존재 하에 각각 상기 열거된 어느 하나의 농도에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 경우에는, IL-2의 농도는 약 100 IU/mL이고 IL-15의 농도는 55 ng/mL이다.
다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 최소 0.1 ng/mL처럼, 일반적으로 최소 10 ng/mL(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 1,000 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 100 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 50 ng/mL, 2 ng/mL 내지 50 ng/mL, 3 ng/mL 내지 10 ng/mL, 4 ng/mL 내지 8 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 6 ng/mL 내지 8 ng/mL, 예를 들어 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 5 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 10ng/mL, 1.0ng/mL 내지 20ng/mL) 농도의 IL-21을 포함한다. 추가적인 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 50 ng/mL 미만처럼, 일반적으로 100 ng/mL 미만 농도의 IL-21을 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 6.25 ng/mL처럼 약 6 ng/mL 농도의 IL-21을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 최소 0.1 ng/mL처럼, 일반적으로 최소 10 ng/mL(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 1,000 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 100 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 50 ng/mL, 2 ng/mL 내지 50 ng/mL, 3 ng/mL 내지 40 ng/mL, 4 ng/mL 내지 30 ng/mL , 5 ng/mL에서 20 ng/mL, 10 ng/mL에서 20 ng/mL, 예를 들어 0.1 ng/mL에서 50 ng/mL, 1.0 ng/mL에서 25 ng/mL, 5 ng/mL 내지 25ng/mL) 농도의 IL-4를 포함한다. 추가적인 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 50 ng/mL 미만처럼, 일반적으로 100 ng/mL 미만 농도의 IL-4를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 약 15 ng/mL 농도의 IL-4를 포함한다.
본 명세서에서 "비-조혈조직" 또는 "비-조혈조직 시료"는 피부(예를 들면, 인간 피부) 및 장(예를 들면 인간 장)을 포함한다. 비-조혈조직은 혈액, 골수 또는 흉선 조직 이외의 조직이다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 피부(예를 들면, 인간 피부)이다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 장 또는 위장관(예를 들면, 인간 장 또는 인간 위장관)이다. 일부 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 혈액 또는 활액(synovial fluid)과 같은 특정 유형의 생물학적 유체 시료로부터는 수득되지 않는다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 따라 림프구 및/또는 γδ T 세포가 분리되는 비-조혈조직 시료는 피부(예를 들면, 인간 피부)로, 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제공된 림프구 및/또는 γδ T 세포의 분리 방법은 위장관(예를 들면, 대장 또는 위장), 유선, 폐, 전립선, 간, 비장, 췌장, 자궁, 질 및 기타 피부, 점막 또는 장액막에 적용될 수 있다. 림프구 및/또는 γδ T 세포는 또한 인간 암 조직 시료, 예를 들면 유방 또는 전립선 종양에 상재 할 수 있다. 일부 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 인간 암 조직 시료(예를 들어, 고형 종양 조직)에서 유래할 수 있다. 다른 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 인간 암 조직 이외의 비-조혈조직 시료(예를 들어, 상당한 수의 종양 세포가 없는 조직)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 주변 또는 인접한 암 조직과 분리된 피부 영역(예를 들면, 건강한 피부)에서 유래할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, γδ T 세포는 인간 암 조직으로부터 수득되지 않는다. 다른 실시예에서, 림프구는 인간 암 조직으로부터 수득되지 않는다.
일 실시예에서 본 명세서에 정의된 방법의 비-조혈조직 시료는 인간으로부터 수득되었다. 다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법의 비-조혈조직 시료는 인간이 아닌 동물 대상체로부터 수득되었다.
이러한 조직을 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 방법의 예는 메스 외식편 또는 펀치 생검을 포함하며, 방법에 따라 크기가 다를 수 있다. 일부 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 펀치 생검에 의해 수득된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 온전한 생검이다. 본 명세서에서 "온전한" 생검 또는 "외식편"은 조직 시료로부터 생검 또는 외식편을 제거하는 적출 주변부에서 생검 또는 외식편의 구조적 무결성이 의도적으로 파괴되지 않은, 파괴되지 않았거나, 실질적으로 파괴되지 않은 조직 및 조직 시료를 포함한다. 상기 온전한 생검 또는 외식편은 취급으로 인한 사소한 손상을 제외하고는 대부분 유지된 3차원 구조를 가질 것이다. 따라서 온전한 생검 또는 외식편은 예를 들어 다지기나 잘게 자르는 것에 의해 기계적으로 손상되거나, 화학적 효소적으로 파손되지 않았다. 온전한 생검 또는 온전한 조직 시료는 전체 조직, 완전한 조직, 조직의 일부 또는 상기 조직의 모든 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서 온전한 생검은 피부의 모든 층을 포함한다. 다른 실시예에서, 생검은 피부의 표피 및 진피층을 포함한다. 생검이 온전한 상기 실시예에서, 상기 층 사이의 분리 및 구별이 유지되는 것은 당연할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 "온전한"이라 함은 추가로 비-조혈조직 시료의 전체 두께의 생검을 포함한다.
따라서 본 발명의 특정 일실시예에서, 비-조혈조직 시료는 다져지지 않는다. 다른 실시예에서, 온전한 생검은 펀치 생검이다. 또 다른 실시예에서, 온전한 생검은 펀치 생검에 의해 수득된다. 비-조혈조직 시료가 온전한 생검인 본 명세서에 제시된 실시예는 다지지 않고/않거나 온전한 비-조혈조직 시료로부터 많은 수의 단리되거나 분리된 세포를 얻는 현저한 이점을 제공한다. 또한, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 본 명세서에 정의된 방법에 따라 다지지 않고/않거나 온전한 비-조혈조직 시료로부터 수득된 세포는 당업계에 공지된 후속의 증식 및/또는 조작 방법에 유용한 표현형(phenotype)을 보유할 수 있다.
다른 실시예에서, 온전한 생검은 피부(예를 들면, 인간 피부)이거나 온전한 생검은 장(예를 들면, 인간 장)이다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 1 ㎜ 이상의 최소 단면을 갖는다. "최소 단면"은 조직 시료의 중심을 통해 측정된 최소 또는 최단 길이를 의미한다. 또한 "최대 단면"은 조직 시료의 중심을 통해 측정된 최대 또는 가장 긴 길이를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "중심"은 조직 시료의 모든 점(point)의 평균 또는 중간 위치이다. 다른 실시예에 따르면, 비-조혈조직 시료는 2 ㎜ 이상, 3 ㎜ 이상, 4 ㎜ 이상, 최소 5 ㎜ 이상, 6 ㎜ 이상, 7 ㎜ 이상 또는 8 ㎜ 이상의 최소 단면을 갖는다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 8 ㎜ 이하, 7 ㎜ 이하, 6 ㎜ 이하, 5 ㎜ 이하, 4 ㎜ 이하, 3 ㎜ 이하 또는 2 ㎜ 이하의 최소 단면을 갖는 것으로 이해된다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 2 ㎜ 내지 4 ㎜와 같이, 1 ㎜ 내지 8 ㎜(포함)의 최소 단면을 갖는다. 특정 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 약 3 ㎜의 최소 단면을 갖는다. 특정 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 약 3 ㎜의 단면을 갖는다. 다른 실시예에 따르면, 비-조혈조직 시료는 2 ㎜ 이상, 3 ㎜ 이상, 4 ㎜ 이상, 최소 5 ㎜ 이상, 6 ㎜ 이상, 7 ㎜ 이상 또는 8 ㎜ 이상의 최대 단면을 갖는 것으로 이해된다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 8 ㎜ 이하, 7 ㎜ 이하, 6 ㎜ 이하, 5 ㎜ 이하, 4 ㎜ 이하, 3 ㎜ 이하 또는 2 ㎜ 이하의 최대 단면을 갖는다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 2 ㎜ 내지 4 ㎜와 같이, 1 ㎜ 내지 8 ㎜(포함)의 최대 단면을 갖는다. 특정 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 약 3 ㎜의 최대 단면을 갖는다.
다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 1 ㎟ 이상의 최소 단면적을 갖는다. "최소 단면적"은 조직 시료의 중심 부근에서 측정된 가장 작은 단면의 면적을 의미한다. 또한 "최대 단면적"은 조직 시료의 중심 부근에서 측정된 가장 큰 단면의 면적을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "중심"은 조직 시료의 모든 점(point)의 평균 또는 중간 위치이다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 2 ㎟ 이상, 3 ㎟ 이상, 4 ㎟ 이상, 5 ㎟ 이상, 6 ㎟ 이상, 7 ㎟ 이상, 8 ㎟ 이상, 9 ㎟ 이상 또는 10 ㎟ 이상의 최소 단면적을 갖는다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 50 ㎟ 이하, 40 ㎟ 이하, 30 ㎟ 이하, 25 ㎟ 이하, 20 ㎟ 이하, 15 ㎟ 이하, 10 ㎟ 이하 또는 8 ㎟ 이하의 최소 단면적을 갖는다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 3 ㎟ 내지 12 ㎟와 같이, 1 ㎟ 내지 50 ㎟의 최소 단면적을 갖는다. 특정 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 약 7 ㎟의 최소 단면적을 갖는다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 2 ㎟ 이상, 3 ㎟ 이상, 4 ㎟ 이상, 5 ㎟ 이상, 6 ㎟ 이상, 7 ㎟ 이상, 8 ㎟ 이상, 9 ㎟ 이상 또는 10 ㎟ 이상의 최대 단면적을 갖는다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 50 ㎟ 이하, 40 ㎟ 이하, 30 ㎟ 이하, 25 ㎟ 이하, 20 ㎟ 이하, 15 ㎟ 이하, 10 ㎟ 이하 또는 8 ㎟ 이하의 최대 단면적을 갖는다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 3 ㎟ 내지 12 ㎟와 같이, 1 ㎟ 내지 50 ㎟의 최대 단면적을 갖는다. 특정 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 약 7 ㎟의 최대 단면적을 갖는다.
다른 실시예에 따르면, 비-조혈조직 시료는 5 ㎣ 이상의 부피를 갖는다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 8 ㎣ 이상, 10 ㎣ 이상, 15 ㎣ 이상, 20 ㎣ 이상, 25 ㎣ 이상, 30 ㎣ 이상, 35 ㎣ 이상, 40 ㎣ 이상, 50 ㎣ 이상 또는 60 ㎣ 이상의 부피를 갖는다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 250 ㎣ 이하, 200 ㎣ 이하, 예컨대 180 ㎣ 이하, 1600 ㎣ 이하, 140 ㎣ 이하, 120 ㎣ 이하, 100 ㎣ 이하, 80 ㎣ 이하, 60 ㎣ 이하, 50 ㎣ 이하 또는 40 ㎣ 이하의 부피를 갖는다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 15 ㎣ 내지 65 ㎣와 같이, 5 ㎣ 내지 250 ㎣의 부피를 갖는다. 특정 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 약 35 ㎣의 부피를 갖는다.
일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 펀치 생검이다. 펀치 생검은 원형 단면이 편리하고 직경이 1 ㎜ 이상이 적절하지만 어떤 모양이든 무방하다. 또 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 직경 3 ㎜ 이상, 직경 4 ㎜ 이상, 직경 5 ㎜ 이상, 직경 6 ㎜ 이상, 직경 7 ㎜ 이상 또는 직경 8 ㎜ 이상과 같이 직경 2 ㎜ 이상의 펀치 생검을 포함한다. 추가 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 직경 7 ㎜ 이하, 직경 6 ㎜ 이하, 직경 5 ㎜ 이하 또는 직경 3 ㎜ 이하와 같은 직경 8 ㎜ 이하의 펀치 생검을 포함한다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 직경 2 ㎜ 내지 4 ㎜와 같이, 직경 1 ㎜ 내지 8 ㎜의 펀치 생검을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 직경 3 ㎜의 펀치 생검을 포함한다.
특정 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 상기에서 정의된 크기, 면적, 부피 및/또는 직경에 따른 생검(예를 들면, 펀치 생검, 특히 원형 단면의 펀치 생검)을 포함하며, 최대 깊이는 생검을 얻은 위치에 의해 결정된다(깊이는 줄어들 수 있음). 일 실시예에서, 생검은 피부 생검이고 표피 및 진피 층을 포함한다. 다른 실시예에서, 생검은 실질적으로 피하지방을 포함하지 않는다. 따라서, 일 실시예에서, 생검은 표피 및 진피 층을 포함하고 실질적으로 피하지방 층을 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 생검은 피하지방을 포함하지 않는다. 또는 피하지방이 제거되지 않고, 따라서 생검에 존재( 또는 적어도 부분적으로 존재)한다. 따라서, 또 다른 실시예에서, 생검은 표피 및 진피 층으로 구성된다. 일 실시예에서, 생검은 비-조혈조직 시료의 전체 두께를 포함한다.
본 발명의 방법은 본 명세서에 정의된 바와 같이 비-조혈조직 시료를 배양하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 "배양"이라 함은 세포 및/또는 비-조혈조직 시료에 필요하거나 바람직한 성장 인자 및/또는 필수 영양소를 포함하는 배지에 비-조혈조직 시료로부터 단리, 분리, 제거, 정제 또는 농축된 것을 포함하는 세포 및/또는 비-조혈조직 시료를 첨가하는 것을 포함한다. 상기 배양 조건은 본 발명에 따른 비-조혈조직 시료로부터 단리 될 세포 또는 세포 집단에 따라, 또는 비-조혈조직 시료로부터 단리 및 증식될 세포 또는 세포집단에 따라 조정될 수 있음은 당연하다.
특정 실시예에서, 비-조혈조직 시료의 배양은 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포의 분리에 충분한 시간 동안 이루어진다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료의 배양은 비-조혈조직 시료(예를 들어, αβ T 세포 및/또는 NK(자연 살해) 세포)로부터 γδ T 세포 이외의 림프구를 분리하기에 충분한 시간 동안 이루어진다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 따른 배양 기간은 14일 이상이다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 따른 배양 기간은 예를 들어 30 일 미만, 25 일 미만과 같이 45일 미만이다. 다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 따른 배양 기간은 14일 내지 35일, 예컨대 14일 내지 21일이다. 또 다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 따른 배양 기간은 약 21 일이다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 따라 단리된 림프구 및/또는 γδ T 세포는 비-조혈조직 시료의 배양 후 비-조혈조직 시료의 배양물로부터 수집된다. 본 명세서에 정의된 림프구 및/또는 γδ T 세포의 수집은 배양물로부터 림프구 및/또는 γδ T 세포의 물리적 수집, 다른 림프구(예를 들어, αβ T 세포, γδ T 세포 및/또는 NK 세포)로부터의 림프구 및/또는 γδ T 세포의 단리, 또는 기질세포(예를 들어, 섬유아세포)로부터 림프구 및/또는 γδ T 세포의 단리 및/또는 분리를 포함한다. 일 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 기계적 수단(예를 들어, 피펫팅)에 의해 수집된다. 다른 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 자기(magnetic) 분리 및/또는 표지에 의해 수집된다. 또 다른 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 FACS와 같은 유세포분석 기술에 의해 수집된다. 따라서, 특정 실시예에서, γδ T 세포는 γδ T 세포를 특이 적으로 표지함으로써 수집된다. 다른 실시예에서, 림프구는 배양물 내 다른 세포와 구별하기 위한 림프구의 특이적 표지에 의해 수집된다. 상기 림프구 및/또는 γδ T 세포의 수집은 비-조혈조직 시료의 배양물로부터의 물리적 제거, 별도의 배양용기 또는 별도 혹은 다른 배양 조건로의 이송을 포함할 수 있음은 당연하다.
상기 림프구 및/또는 γδ T 세포의 수집은 비-조혈조직 시료로부터 림프구 및/또는 γδ T 세포의 집단을 단리하기에 충분한 시간 후에 수행되는 것은 당연하다. 특정 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 비-조혈조직 시료를 1 주일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상 또는 14일 이상 배양한 후 수집된다. 적절하게는, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 38일 이전, 36일 이전, 34일 이전, 32일 이전, 30일 이전, 28일 이전, 26일 이전 또는 24일 이전과 같이 40일 이전에 수집된다. 일 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 비-조혈조직 시료를 14일 이상 배양한 후에 수집된다. 다른 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 비-조혈조직 시료를 14 내지 21일 배양한 후에 수집된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 실질적으로 혈청이 없는 배지(예를 들어, 무혈청(serum-free) 배지 또는 혈청 대체제(SR, serum-replacement)를 함유하는 배지)에서 배양된다. 따라서, 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 무혈청 배지에서 배양된다. 상기 무혈청 배지는 또한 혈청 대체제 배지를 포함할 수 있으며, 혈청 대체제는 인간 또는 동물 유래 혈청의 사용을 피하기 위하여 화학적으로 정의된 성분을 기반으로 한다. 다른 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 혈청(예를 들어, 인간 AB 혈청 또는 소태아혈청(FBS))을 함유하는 배지에서 배양된다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 혈청 대체제를 함유하는 배지에서 배양된다. 일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 동물 유래의 제품을 함유하지 않는 배지에서 배양된다.
비-조혈조직 시료가 무혈청 배지에서 배양되는 본 발명에 따른 실시예는 혈청의 여과, 침전, 오염 및 공급 문제를 피할 수 있는 이점이 있음은 당연하다. 또한, 동물 유래 제품은 인간 치료제의 임상등급 제조 시 사용에 유리하지 않다. 본 명세서에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 놀랍게도 세포, 특히 Vδ1 γδ 세포의 단리에 무혈청 배지를 사용하면 AB 혈청 함유 배지를 사용하는 것에 비해 비-조혈조직 시료로부터 얻는 세포의 수가 크게 증가한다는 것을 발견하였다. 특히, 무혈청 배지에서 배양된 비-조혈조직 시료에서 γδ T 세포를 단리하면 Vδ1 세포의 수율이 증가한다.
일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 단리 용기에서 수행된다. "단리 용기"는 림프구 및/또는 γδ T 세포의 분리를 위한 비-조혈조직 시료를 포함하는 용기를 지칭하며, 선택적으로 합성 스캐폴드를 추가로 포함한다. 단리 용기는 단리 방법에만 사용되고, 이후 증식 단계에는 사용되지 않을 수도 있다.
일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 기체 투과성 소재를 포함하는 용기(예를 들어, 단리 용기)에서 수행된다. 상기 소재는 산소, 이산화탄소 및/또는 질소와 같은 기체가 투과되어, 용기의 내용물과 주변 대기 사이의 기체 교환을 허용한다. 본 명세서에서 "용기"는 배양 접시, 배양 플레이트, 단일-웰 접시, 다중-웰 접시, 다중-웰 플레이트, 플라스크, 다층 플라스크, 병(예를 들면, 롤러 병), 생물반응기, 가방, 튜브 등을 포함함은 당연하다. 상기 용기는 비-부착 세포 및 기타 림프구의 증식을 포함하는 방법에 사용하기 위해 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 본 명세서에 보여주는 바와 같이, 기체 투과성 소재를 포함하는 용기는 놀랍게도 일반적으로 부착되는 것으로 간주되는 γδ T 세포의 단리에 유용성을 나타낸다. 상기 용기를 배양에 사용하면 비-조혈조직 시료로부터 단리된 γδ T 세포의 수율을 크게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 상기 용기는 또한 부착 세포 유형을 포함한 섬유아세포 및 기타 기질세포(예를 들어, 상피세포)에 비해 γδ T 세포 및 기타 림프구를 우선적으로 지지하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 기체 투과성 소재를 포함하는 용기는 γδ T 세포 및 기타 림프구(예를 들어, αβ T 세포 및/또는 NK 세포)를 우선적으로 지지한다. 다른 실시예에서, 기체 투과성 소재를 포함하는 용기에서 수행되는 배양물에는 섬유아세포 및/또는 기타 기질세포(예를 들어, 상피세포)가 없다.
기체 투과성 소재를 포함하는 상기 용기는 비-다공성인 기체 투과성 재료를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 기체 투과성 소재는 비-다공성이다. 일부 실시예에서, 기체 투과성 소재는 실리콘, 플루오로에틸렌 폴리프로필렌, 폴리올레핀 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체와 같은 멤브레인 필름이다. 또한 상기 용기는 기체 투과성 소재, 기체 투과성 멤브레인 필름 또는 비-다공성 기체 투과성 소재의 일부만을 포함할 수 있다. 따라서, 또 다른 실시예에 따르면, 용기는 상부, 바닥 및 적어도 하나의 측벽을 포함하며, 적어도 상기 용기 바닥의 일부는 상기 상부가 상기 바닥의 위에 있을 때 실질적으로 수평면인 기체 투과성 소재를 포함한다. 일 실시예에서, 용기는 상부, 바닥 및 적어도 하나의 측벽을 포함하며, 적어도 상기 바닥의 일부는 상기 상부가 상기 하부의 위에 있을 때 수평면인 가스 투과성 소재를 포함한다. 다른 실시예에서, 용기는 상부, 바닥 및 적어도 하나의 측벽을 포함하며, 상기 적어도 하나의 측벽은 상기 상부가 상기 바닥 위에 있을 때 수직면이거나 또는 상기 상부가 상기 바닥의 위에 있지 않을 때 수평면인 가스 투과성 소재를 포함한다. 상기 실시예에서, 상기 바닥 또는 상기 측벽의 일부만이 기체 투과성 소재를 포함할 수 있음은 당연하다. 또는, 상기 바닥의 전체 또는 상기 측벽의 전체가 기체 투과성 소재를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 기체 투과성 소재를 포함하는 상기 용기의 상기 상부는 예를 들어 O-링을 사용하여 밀봉될 수 있다. 이러한 실시예는 용기 내용물의 유출을 방지하거나 증발을 감소시키기 위한 것이다. 따라서, 특정 실시예에서, 용기는 기체 교환을 허용하는 기체 투과성 소재를 포함하는 액체 밀봉용기를 포함한다. 다른 실시예에서, 기체 투과성 소재를 포함하는 상기 용기의 상기 상부는 수평면에 있고 상기 바닥의 위에 있으며 밀봉되어 있지 않다. 따라서, 특정 실시예에서, 상기 상부는 용기의 상부로부터 기체 교환을 허용하도록 구성된다. 다른 실시예에서, 기체 투과성 용기의 상기 바닥은 용기의 바닥에서 기체 교환이 허용되도록 구성된다. 또 다른 실시예에서, 기체 투과성 소재를 포함하는 상기 용기는 액체 밀봉용기 일 수 있고, 주입구와 배출구 또는 튜브를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시예에서, 기체 투과성 소재를 포함하는 용기는 상부, 바닥 및 선택적으로 적어도 하나의 측벽을 포함하며, 상기 상부 및 상기 바닥의 적어도 일부는 기체 투과성 소재를 포함하고, 존재한다면, 적어도 최소 하나의 측벽의 일부는 기체 투과성 소재를 포함한다. 용기의 예는 WO2005035728 및 US9255243에 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 이러한 용기는 또한 G-REX6 웰-플레이트, G-REX24 웰-플레이트 및 G-REX10 용기처럼 Wilson Wolf Manufacturing에서 제공하는 G-REX® 세포 배양장치와 같이 상업적으로 입수할 수 있다.
일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 합성 스캐폴드에 배치된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "합성 스캐폴드", "스캐폴드" 및 "그리드"는 상호 교환적으로 사용되며 세포 성장을 지지하는 데 적합한 비천연 3차원 구조물을 의미한다. 비-조혈조직 시료는 외식편에서 스캐폴드로 림프구의 배출을 용이하게 하기 위하여 합성 스캐폴드에 배치되거나 부착될 수 있다. 합성 스캐폴드는 고분자(예를 들어, 폴리 비닐 피를리돈, 폴리메틸메타크릴레이트, 메틸 셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리우레탄과 같은 천연 또는 합성 고분자), 세라믹(예를 들어, 제삼인산칼슘, 알루미늄산 칼슘, 수산화인회석칼슘(calcium hydroxyapatite))또는 금속(예를 들어, 탄탈, 티타늄, 백금 및 백금과 같은 족의 금속, 니오븀, 하프늄, 텅스텐 및 이들 조합의 합금)과 같은 천연 및/또는 합성 소재로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 합성 스캐폴드는 탄탈로 코팅된다. 생물학적 인자(예를 들어, 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 I 또는 콜라겐 II), 피브로넥틴, 라미닌, 인테그린, 혈관형성 인자, 항염증 인자, 글리코사미노글리칸, 비트로겐, 항체 및 이의 단편, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-15, IL-4, IL-21, IL9 및 이들의 조합)이 당업계에 공지된 방법에 따라 스캐폴드 표면에 코팅되거나, 스캐폴드 소재 내에 캡슐화되거나, 또는 배지에 첨가되어 세포 부착, 이동, 생존 또는 증식을 증진시킬 수 있다. 이 방법 및 다른 방법은 예를 들어 피부, 장, 전립선, 유방, 림프구와 같은 다수의 다른 비-조혈조직 유형으로부터 림프구를 단리하는데 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 비-조혈조직 시료는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 분리하는 데 사용되는 용기 내부의 합성 스캐폴드에 배치된다. 다른 실시예에서, 합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 용기의 바닥으로 림프구 및/또는 γδ T 세포의 배출이 용이하도록 구성된다. 상기 실시예는 비-조혈조직 시료 및/또는 기질세포(예를 들어, 섬유아세포 및/또는 상피세포)로부터 림프구(예를 들어, γδ T 세포, αβ T 세포 및/또는 NK 세포)의 단리 및/또는 분리를 허용하는 이점을 갖는다. 또한 상기 실시예는 비-조혈조직 시료로부터 배양용기의 바닥으로 림프구(예를 들어, γδ T 세포, αβ T 세포 및/또는 NK 세포)의 수집을 허용한다. 특정 실시예에서, 합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포의 배출이 용이하도록 구성된다. 다른 실시예에서, 합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 αβ T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 림프구의 배출이 용이하도록 구성된다.
따라서, 본 명세서에 정의된 방법의 일 양태에서, 합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 배양용기의 바닥으로 림프구 배출이 용이하도록 구성된다. 본 명세서에 정의된 방법의 다른 양태에서, 합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 용기의 바닥으로 γδ T 세포의 배출이 용이하도록 구성된다.
본 발명의 방법은 종래 기술된 것보다 훨씬 더 큰 총 세포 수율을 제공한다. 일 실시예에서, 총 단리된 세포 수는 106 세포/㎠ 이상, 2x106 세포/㎠ 이상, 5x106 세포/㎠ 이상, 10x106 세포/㎠ 이상, 20x106 세포/㎠ 이상, 30x106 세포/㎠ 이상, 40x106 세포/㎠ 이상, 50x106 세포/㎠ 이상, 60x106 세포/㎠ 이상, 70x106 세포/㎠ 이상, 80x106 세포/㎠ 이상, 90x106 세포/㎠ 이상, 100x106 세포/㎠ 이상, 150x106 세포/㎠ 이상, 200x106 세포/조직시료 ㎠ 이상이다. 특정 실시예에서, 총 단리된 세포 수는 50x106 세포/㎠ 이상이다. 다른 실시예에서, 총 단리된 세포 수는 100x106 세포/㎠이다.
혈액에 우세한 γδ T 세포는 주로 Vδ2 T 세포인 반면, 비-조혈조직에서 우세한 γδ T 세포는 주로 Vδ1 T 세포로 Vδ1 T 세포는 비-조혈조직-상재 세포 집단의 약 70-80%를 차지한다. 그러나 일부 Vδ2 T 세포 역시 비-조혈조직에서도 발견되며, 예를 들어, 장에서는 Vδ2 T 세포가 γδ T 세포의 10~20%를 구성할 수 있다. 비-조혈조직에 상재하는 일부 γδ T 세포는 Vδ1도, Vδ2 TCR도 발현하지 않으며, 본 명세서에서는 이를 이중 음성(DN) γδ T 세포라한다. DN γδ T 세포는 Vδ5를 발현하는 소수의 T 세포와 함께 주로 Vδ3를 발현할 가능성이 있다. 따라서, 일반적으로 비-조혈조직에 상재하고 본 발명의 방법에 의해 단리되는 γδ T 세포는 예를 들어. Vδ1 T 세포와 같이, 더 적은 양의 DN γδ T 세포를 포함한 비-Vδ2 T 세포인 것이 바람직하다.
따라서, 바람직한 일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 의해 단리된 γδ T 세포는 Vδ1 T 세포의 집단을 포함한다. 일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 의해 단리된 γδ T 세포는 DN γδ T 세포의 집단을 포함한다. 일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 의해 단리된 γδ T 세포는 Vδ3 T 세포의 집단을 포함한다. 일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 의해 단리된 γδ T 세포는 Vδ5 T 세포의 집단을 포함한다.
γδ T 세포는 또한 이들이 발현하는 γ 사슬의 유형에 의해 정의될 수 있다. 다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법에 의해 단리된 γδ T 세포는 Vγ4 T 세포의 집단을 포함한다. 대부분의 경우 Vγ4 T 세포는 장 조직 시료에서 수득된다.
단리 방법은 참조집단보다 많은 수의 단리된 γδ T 세포의 집단을 제공한다(예를 들어, 2배 이상의 수, 3배 이상의 수, 4배 이상의 수, 5배 이상의 수, 6배 이상의 수, 7배 이상의 수, 8배 이상의 수, 9배 이상의 수, 10배 이상의 수, 15배 이상의 수, 20배 이상의 수, 25배 이상의 수, 30배 이상의 수, 35배 이상의 수, 40배 이상의 수, 50배 이상의 수, 60배 이상의 수, 70배 이상의 수, 80배 이상의 수, 90배 이상의 수, 100배 이상의 수, 200배 이상의 수, 300배 이상의 수, 400배 이상의 수, 500배 이상의 수, 600배 이상의 수, 700배 이상의 수, 800배 이상의 수, 900배 이상 수, 1,000배 이상의 수, 5,000배 이상의 수, 10,000배 이상의 수).
일부 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 단리된 γδ T 세포의 집단은 TIGIT를 발현하는 세포의 비율이 낮다. 예를 들어, γδ T 세포의 단리된 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만일 수 있다. 또는, γδ T 세포의 단리된 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20% 또는 약 10%일 가질 수 있다. 특정 실시예에서, γδ T 세포의 단리된 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 80% 미만이다. 따라서, 일 실시예에서, γδ T 세포의 단리된 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 70%이다. 다른 실시예에서, γδ T 세포의 단리된 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 60% 미만이다. 또 다른 실시예에서, γδ T 세포의 단리된 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 30%이다. 따라서, 일 실시예에서 단리된 γδ T 세포는 실질적으로 TIGIT를 발현하지 않는다.
일부 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 낮다. 예를 들어, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 다른 Vδ1 T 세포 집단에 비해 TIGIT+ 세포 빈도가 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만일 수 있다. 또는, 단리된 Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20% 또는 약 10%일 수 있다. 특정 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 80% 미만이다. 따라서, 일 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 70%이다. 다른 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 60% 미만이다. 또 다른 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 30%이다. 따라서, 일 실시예에서 단리된 Vδ1 T 세포는 실질적으로 TIGIT를 발현하지 않는다.
일부 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 분리된 γδ T 세포 집단은 CD27을 발현한다. 예를 들어, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과일 수 있다. 또는, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90%일 수 있다. 특정 실시예에서, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 10% 초과이다. 따라서, 일 실시예에서, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 20%이다. 다른 실시예에서, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 20% 초과이다. 일 실시예에서, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 20%이다.
일부 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포의 집단은 CD27을 발현한다. 다른 실시예에서, 단리된 γδ T 세포는 CD27을 발현한다. 일부 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과이다. 또는, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 90%일 수 있다. 특정 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 10% 초과이다. 따라서, 일 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 20%이다. 다른 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 CD27+ 세포 빈도가 20% 초과이다. 일 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 20%이다.
전술한 양태들 중의 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포의 집단은 참조집단에 비하여(예를 들어, 다른 방법을 사용하여 단리된 γδ T 세포 집단에 비하여) CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 표면 발현이 더 크다. 추가적으로 또는 그 대신에, 단리된 γδ T 세포의 집단은 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 더 클 수 있다. 특히 마커는 CD45RA 및 CD25에서 선택된다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포의 집단은 참조집단에 비하여 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 표면 발현이 더 낮다. 추가적으로 혹은 그 대신에, 단리된 γδ T 세포의 집단은 참조집단에 비하여 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 낮을 수 있다.
일부 실시예에서, 단리된 Vδ1 T 세포 집단은 참조집단에 비하여 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 발현이 더 크다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 기준에 비하여 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 더 크다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 참조집단에 비하여 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 표면 발현이 더 낮다. 다른 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 참조집단에 비하여 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 더 낮다.
비-조혈조직(예를 들면, 피부)에서 단리되면, γδ T 세포는 일반적으로 예를 들어 αβ T 세포, B 세포 및 자연살해(NK) 세포를 포함하는 더 큰 림프구 집단의 일부가 된다. 일부 실시예에서, 단리된 림프구 집단의 1%-10%는 γδ T 세포이다(예를 들어, 단리된 피부-유래 림프구 집단의 1-10%는 γδ T 세포이다). 대부분의 경우, γδ T 세포 집단(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 집단)은 큰 Vδ1 T 세포의 집단을 포함한다. 일부 실시예에서, 단리된 림프구(예를 들어, 피부-유래 림프구)의 집단의 1-10%는 Vδ1 T 세포이다(예를 들어, Vδ1 T 세포는 단리된 집단 γδ T 세포 집단의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상을 나타낼 수 있다). 일부 예에서, 단리된 γδ T 세포 집단의 10% 미만이 Vδ2 T 세포이다 (예를 들어, 단리된 피부-유래 γδ T 세포 집단의 10% 미만이 Vδ2 T 세포이다).
Vδ2 T 세포, αβ T 세포, B 세포 또는 NK 세포와 같은 비-Vδ1 T 세포 또는 비-DN T 세포는 (예를 들어, 증식 이전, 도중 또는 이후에) 단리된 γδ T 세포 집단으로부터 제거될 수 있다.
단리된 γδ T 세포(예를 들어, 피부에서 단리된 γδ T 세포, 예를 들어, 피부에서 단리된 Vδ1 T 세포)는 해당 조혈조직-유래 세포(예를 들어, 혈액-유래 γδ T 세포 및/또는 혈액-유래 Vδ2 T 세포)와 구별되는 표현형을 갖는다. 예를 들어, 단리된 γδ T 세포 집단은 예를 들어, TCR 활성화 된 비-조혈조직 상재 γδ T 세포 집단 또는 해당 조혈조직-유래 세포(예를 들어, 혈액-유래 γδ T 세포 및/또는 혈액-유래 Vδ2 T 세포)의 집단과 같은 참조집단에 비해 더 높은 수준의 CCR3, CCR4, CCR7, CCR8 또는 CD103을 발현할 수 있다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CCR3+ 세포; 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CCR4+ 세포; 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CCR7+ 세포; 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CCR8+ 세포; 및/또는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CD103+ 세포를 포함한다. 단리된 γδ T 세포 집단은 CCR3, CCR4, CCR7, CCR8, 또는 CD103 중 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 여섯 모두를 발현할 수 있다.
일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 예를 들어, TCR 활성화 된 비-조혈조직 상재 γδ T 세포 집단 또는 해당 조혈조직-유래 세포(예를 들어, 혈액-유래 γδ T 세포 및/또는 혈액-유래 Vδ2 T 세포)의 집단과 같은 참조집단에 비해 더 높은 수준의 NKGD2, CD56, CD69, 및/또는 TIM3를 발현할 수 있다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 NKGD2+ 세포; 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CD56+ 세포; 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 CD69+ 세포; 및/또는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 TIM3+ 세포를 포함한다. 단리된 γδ T 세포 집단은 NKGD2, CD56, CD69, 및/또는 TIM3 중 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 다섯 모두를 발현할 수 있다.
단리된 비-조혈조직-유래 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 피부-유래 Vδ1 T 세포)의 집단은 또한 기능의 특징을 갖는다. 본 발명의 임의의 비-조혈조직-유래 세포(예를 들어, 단리된 γδ T 세포, 피부-유래 Vδ1 T 세포 집단 또는 γδ T 세포 및/또는 피부-유래 Vδ1 T 세포의 증식된 집단)와 참조집단(예를 들어, 비-조혈조직 상재 γδ T 세포의 TCR 활성화된 집단 또는 해당 조혈조직-유래 세포 집단, 예를 들어 혈액-유래 γδ T 세포 및/또는 혈액-유래 Vδ2 T 세포) 간의 기능적 차이를 밝히기 위하여 당업계에 공지된 기능평가(functional assays)를 수행할 수 있다. 이러한 분석에는 증식 평가, 세포독성 평가, 결합 평가, 측정 지속성 및/또는 위치 평가 등이 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포 집단을 분리하기 위하여 본 명세서에 정의된 방법은 소진되지 않은 림프구 및/또는 γδ T 세포 집단과 일치하는 표면 표현형을 포함하는 집단을 생성한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 림프구(예를 들어, 피부-유래 αβ T 세포 및/또는 NK 세포)의 집단이 제공된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 림프구(예를 들어, 피부-유래 αβ T 세포 및/또는 NK 세포)의 집단이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 γδ T 세포 집단이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 γδ T 세포 집단이 제공된다.
일 실시예에서, 단리된 집단은 7% 내지 12% γδ T 세포와 같이, 5% 초과의 γδ T 세포를 포함한다. 일 실시예에서, 단리된 집단은 Vδ1 세포를 포함하고, 여기서 50% 미만, 예를 들어 40% 미만의 Vδ1 세포가 CD27을 발현한다. 일 실시예에서, 단리된 집단은 Vδ1 세포를 포함하고, 여기서 50% 초과, 예를 들어 60% 초과의 Vδ1 세포가 CD27을 발현한다. 일 실시예에서, 단리된 집단은 Vδ1 세포를 포함하고, 여기서 50% 초과, 예를 들어 60% 초과의 Vδ1 세포가 CD27을 발현한다.
단리된 비-조혈조직-상재 림프구는 추가로 증식하지 않고도 사용에 적합할 수 있으며, 또는 추가의 단계에서 증식될 수도 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 비-조혈조직-상재 림프구 및/또는 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 αβ T 세포, NK 세포, γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T)를 증식하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법은 시험관 내에서 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, γδ T 세포는 본 명세서에 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 단리된 γδ T 세포 집단으로부터 증식된다. 일반적으로, 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 기질세포(예를 들어, 피부 섬유아세포)와의 물리적 접촉이 제거되면 자발적으로 증식할 수 있다. 본 명세서에 정의된 방법은 이러한 분리를 유도하는 데 사용될 수 있으며, 그 결과 γδ T 세포의 억제를 해제하여 증식을 촉발할 수 있다. 특정 실시예에서, 림프구(예를 들어, 피부-유래 αβ T 세포 및/또는 NK 세포, 장-유래 αβ T 세포 및/또는 NK 세포)는 본 명세서에 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 단리된 림프구 집단으로부터 증식된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증식된" 또는 "림프구 및/또는 γδ T 세포의 증식된 집단"이라 함은 비-증식 집단보다 더 크거나 더 많은 수의 세포를 함유하는 세포 집단을 포함한다. 이러한 집단은 집단 내에서 특정 세포 유형 또는 비율이 증식하는 다수, 소수 혹은 혼합 집단일 수 있다. 용어 "증식 단계"는 증식 또는 증식된 집단을 초래하는 과정을 칭하는 것으로 이해 될 것이다. 따라서, 증식 또는 증식된 집단은 증식 단계가 수행되지 않은 집단 또는 모든 증식 단계 이전의 집단에 비해 세포의 수가 더 많거나 더 많은 수의 세포를 포함할 수 있다. 또한 증식을 나타내기 위해 본 명세서에 표시된 모든 숫자(예를 들어, 배(fold)-증가 또는 배-증식)는 세포 집단의 수 또는 크기, 또는 세포의 수의 증가를 설명하며, 증식의 양을 나타내는 것임은 당연하다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 단리된 γδ T 세포가 증식된다. 상기 증식은 선택적으로 IL-4 포함하고, IL-2, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 증식은 선택적으로 IL-4 포함하고, IL-9, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 모든 증식 단계는 림프구 및/또는 γδ T 세포의 증식된 집단을 생산하는 데 효과적인 기간동안 수행되어 짐은 당연하다. 일 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 기간은 최소 5 일이다. 따라서, 일 실시예에서, 증식은 IL-2, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 양으로 최소 5일 동안 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 증식은 IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-4의 존재 하에 γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 양으로 적어도 5 일 동안 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 증식은 IL-9, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 양으로 적어도 5 일 동안 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 증식은 IL-9, IL-15, IL-21 및 IL-4의 존재 하에 γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 양으로 적어도 5 일 동안 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 증식은 γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 양으로 (예를 들어, 최소 5일, 최소 6일, 최소 7일, 최소 8일, 최소 9일, 최소 10일, 최소 11일, 최소 12일, 최소 13일, 최소 14일, 최소 21일, 최소 28일 또는 그 이상, 예를 들어, 5일 내지 40일, 7일 내지 35일, 14일 내지 28일, 또는 약 21일) 동안 림프구 및/또는 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 배양물에서 수 시간(예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18 또는 21 시간) 내지 약 35일(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35일) 동안 증식된다. 일 실시예에서, 림프구 및/또는 γδ T 세포는 14 내지 21일 동안 증식된다. 따라서, 일부 실시예에서, 단리 배양 기간(예를 들어, 14 내지 21일과 같이, 1 내지 40일)을 포함하여, 단리 및 증식 단계는 28 내지 56일, 또는 약 41일 간 지속될 수 있다.
다른 실시예에서, 증식은 γδ T 세포를 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 21일 이상, 28일 이상 또는 그보다 더 오래, 예를 들어, 5일 내지 40일, 7일 내지 35일, 14일 내지 28일 또는 약 21일 동안 배양하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 증식 단계는 증식된 집단을 생성하기 위해 적어도 10, 15 또는 20일 동안 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 증식 단계는 γδ T 세포를 14일 내지 21일과 같이, 5일 내지 25일 동안 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 증식 단계는 약 20일간 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 IL-2의 전형적인 양은 1 IU/mL 내지 2,000 IU/mL(예를 들어, 5 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 20 IU/mL 내지 400 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 예를 들어, 5 IU/mL 내지 10 IU/mL, 10 IU/mL 내지 20 IU/mL, 20 IU/mL 내지 30 IU/mL, 30 IU/mL 내지 40 IU/mL, 40 IU/mL 내지 50 IU/mL, 50 IU/mL 내지 60 IU/mL, 60 IU/mL 내지 70 IU/mL, 70 IU/mL 내지 80 IU/mL, 80 IU/mL 내지 90 IU/mL, 90 IU/mL 내지 100 IU/mL, 100 IU/mL 내지 120 IU/mL, 120 IU/mL 내지 140 IU/mL, 140 IU/mL 내지 150 IU/mL, 150 IU/mL 내지 175 IU/mL, 175 IU/mL 내지 200 IU/mL , 200 IU/mL 내지 300 IU/mL, 300 IU/mL 내지 400 IU/mL, 400 IU/mL 내지 500 IU/mL, 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 1,000 IU/mL 내지 1,500 IU/mL, 1,500 IU/mL 내지 2,000 IU/mL 또는 그 이상)이다. 일부 실시예에서, γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 IL-2의 양은 약 100 IU/mL이다.
일부 실시예에서, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 IL-15의 전형적인 양은 0.1 ng/mL 이상(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 10,000 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 1,000 ng/mL, 5 ng/mL 내지 800 ng/mL, 10 ng/mL 내지 750 ng/mL, 20 ng/mL 내지 500 ng/mL, 50 ng/mL 내지 400 ng/mL, 또는 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 1.0 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 5.0 ng/mL, 5.0 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 50 ng/mL, 50 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 200 ng/mL, 200 ng/mL 내지 500 ng/mL 또는 500 ng/mL 내지 1,000 ng/mL)이다. 일부 실시예에서, γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 IL-15의 양은 약 10 ng/mL이다.
일부 실시예에서, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 IL-21의 전형적인 양은 1.0 ng/mL 이상과 같이 0.1 ng/mL 이상이다(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 1,000 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 100 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 50 ng/mL, 2 ng/mL 내지 50 ng/mL, 3 ng/mL 내지 10 ng/mL, 4 ng/mL 내지 8 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 6 ng/mL에서 8 ng/mL, 예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 10 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 5 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 10 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 20 ng/mL). 다른 실시예에서, IL-21의 양은 50ng/mL 미만처럼, 일반적으로 100ng/mL 미만이다. 일부 실시예에서, 방법은 약 6.25 ng/mL와 같은 약 6 ng/mL 농도의 IL-21을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 10 ng/mL 이상과 같이, 일반적으로 0.1 ng/mL 이상 농도의 IL-4를 포함한다(예를 들어, 0.1 ng/mL 내지 1,000 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 100 ng/mL, 1.0 ng/mL 내지 50 ng/mL, 2 ng/mL 내지 50 ng/mL, 3 ng/mL 내지 40 ng/mL, 4 ng/mL 내지 30 ng/mL , 5 ng/mL에서 20 ng/mL, 10 ng/mL에서 20 ng/mL, 예를 들어 0.1 ng/mL에서 50 ng/mL, 1.0 ng/mL에서 25 ng/mL, 5 ng/mL 내지 25ng/mL). 추가적인 실시예에서, 본 명세서에 정의된 방법은 50 ng/mL 미만처럼, 전형적으로 100 ng/mL 미만, 특히 20 ng/mL 농도의 IL-4를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 약 15 ng/mL 농도의 IL-4를 포함한다.
비-조혈조직-상재 림프구 및/또는 γδ T 세포의 증식 배양에서 다른 인자의 치환 또는 추가 역시 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-1β, 인간 혈소판 용해물(HPL, human platelet lysate) 및 기질세포-유래 인자-1 (SDF-1)으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 인자는 IL-2 및 IL-15 중 어느 하나에 추가로 또는 그 대신 포함된다. αβ T 세포 또는 NK 세포와 같은 림프구의 증식을 위한 이러한 추가 또는 대안 인자는 당업계에 공지되어 있다. 일 실시예에서, 상기 인자는 γδ T 세포의 증식을 선택적으로 촉진하는 증식에 사용된다. 다른 실시예에서 상기 인자는 αβ T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 림프구의 증식을 선택적으로 촉진하는 증식에 사용된다.
γδ T 세포의 증식된 집단을 생성하는 데 필요한 상기 사이토카인의 각각의 양은 하나 이상의 다른 사이토카인의 농도에 따라 달라지는 것은 당연하다. 예를 들어, IL-2의 농도가 증가하거나 감소하면, IL-15의 농도는 그에 따라 각각 감소 또는 증가될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 증식된 집단을 생성하는 데 효과적인 양이라 함은 세포 증식에 대한 모든 인자의 복합 효과를 의미한다.
증식 방법은 참조집단보다 더 많은 수의 γδ T 세포의 증식된 집단을 제공한다. 일부 실시예에서, γδ T 세포의 증식된 집단은 증식 단계 이전의 γδ T 세포의 단리된 집단보다 수가 더 많다(예를 들어, 증식 단계 이전의 γδ T 세포의 단리된 집단에 비해 2배 이상의 수, 3배 이상의 수, 4배 이상의 수, 5배 이상의 수, 6배 이상의 수, 7배 이상의 수, 8배 이상의 수, 9배 이상의 수, 10배 이상의 수, 15배 이상의 수, 20배 이상의 수, 25배 이상의 수, 30배 이상의 수, 35배 이상의 수, 40배 이상의 수, 50배 이상의 수, 60배 이상의 수, 70배 이상의 수, 80배 이상의 수, 90배 이상의 수, 100배 이상의 수, 200배 이상의 수, 300배 이상의 수, 400배 이상의 수, 500배 이상의 수, 600배 이상의 수, 700배 이상의 수, 800배 이상의 수, 900배 이상 수, 1,000배 이상의 수, 5,000배 이상의 수, 10,000배 이상의 수 또는 그 이상).
일 실시예에서, 증식 단계는 실질적인 기질세포 접촉이 없는 상태에서 단리된 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 증식 단계는 실질적인 섬유아세포 세포 접촉이 없는 상태에서 분리된 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 증식 단계는 더 나아가 IL-4의 존재 하에 단리된 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 따라서, 일 실시예에서, 증식은 IL-2, IL-15, IL-4 및 IL-21의 존재 하에 단리된 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또는, 증식은 IL-9, IL-15, IL-4 및 IL-21의 존재 하에 단리된 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 정의된 증식 방법은 다른 림프구(예를 들어, αβ T 세포 및/또는 NK 세포)의 증식에도 적용될 수 있음은 당연하다. 상기 실시예에서, 증식 단계는 증식된 림프구 집단(예를 들어, αβ T 세포 및/또는 NK 세포)을 생성하기 위하여, 관련 성장 인자 및/또는 영양소(예를 들어, 사이토카인 및/또는 케모카인)의 존재 하에 단리된 림프구를 배양하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 γδ T 세포 집단의 증식 방법은 무혈청 배지에서 γδ T 세포 또는 다른 림프구를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 명세서에 정의된 γδ T 세포 집단의 증식 방법은 혈청 대체제를 함유하는 배지에서 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 따라서, γδ T 세포의 이러한 무혈청 또는 혈청 대체제를 함유하는 배지에서의 증식은 전술한 것과 유사한 이점을 가질 것임은 당연하다.
일부 실시예에서, 증식 단계 동안 실질적인 TCR 경로 활성화는 존재하지 않는다(예를 들어, 외인성 TCR 경로 활성화제는 배양물에 포함되지 않는다). 일 실시예에서, 증식 단계는 외인성 TCR 경로 작용제가 없는 것을 포함한다. 또한, 본 명세서에는 본 명세서에 정의된 방법에 따라 단리된 γδ T 세포를 증식하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 증식 방법은 영양 세포, 종양 세포 및/또는 항원 전달 세포와의 접촉을 포함하지 않는다. 따라서, 본 명세서에 정의된 방법의 다른 실시예에서, γδ T 세포의 증식은 실질적인 기질세포 접촉이 없는 상태에서 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또한 비-조혈조직-유래 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 대규모 집단을 고농도로 빠르게 생산하는 수단이 제공된다(예를 들어, 기질세포 접촉 및/또는 TCR 자극을 제거하거나, 유효량의 인자 존재 하에서 배양하는 것에 의해). 일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 증식 단계는 γδ T 세포를 증식에 대한 배가시간(doubling time)이 작으며, 배가시간은 다음 수식에 의해 제공된다:
본 명세서에 제공된 정보가 주어지면, 당업자는 본 발명이 비 조혈조직-유래 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)를 5일 미만(예를 들어, 4.5일 미만, 4.0일 미만, 3.9일 미만, 3.8일 미만, 3.7일 미만, 3.6일 미만, 3.5일, 3.4일 미만, 3.3일 미만, 3.2일 미만, 3.1일 미만, 3.0일 미만, 2.9일 미만, 2.8일 미만, 2.7일 미만, 2.6일 미만, 2.5일 미만, 2.4일 미만, 2.3일 미만, 2.2일 미만, 2.1일 미만, 2.0일 미만, 46 시간 미만, 42 시간 미만, 38 시간 미만, 35 시간 미만, 32 시간 미만) 동안 증식하는 방법을 제공하는 것임을 인식할 것이다.
일부 실시예에서, 배양 7 일 이내에, γδ T 세포의 증식된 집단(예를 들어, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포의 증식된 집단)은 증식 전 γδ T의 단리된 집단에 비해 10배수 이상의 γδ T 세포 수(예를 들어, 증식 전 γδ T 세포의 단리된 집단에 비해 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 1,000배 이상, 2,000배 이상, 3,000배 이상, 4,000배 이상, 5,000배 이상, 6,000배 이상, 7,000배 이상 또는 8,000배 이상의 γδ T 세포 수)를 포함한다. 일부 실시예에서, 배양 14일 이내에, γδ T 세포의 증식된 집단(예를 들어, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포의 증식된 집단)은 증식 전 γδ T의 단리된 집단에 비해 20배수 이상의 γδ T 세포 수(예를 들어, 증식 전 γδ T 세포의 단리된 집단에 비해 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 1,000배 이상, 2,000배 이상, 3,000배 이상, 4,000배 이상, 5,000배 이상, 6,000배 이상, 7,000배 이상, 8,000배 이상, 9,000배 이상 또는 10,000배 이상의 γδ T 세포 수)를 포함한다. 일부 실시예에서, 배양 21 일 이내에, γδ T 세포의 증식된 집단(예를 들어, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포의 증식된 집단)은 증식 전 γδ T의 단리된 집단에 비해 50배수 이상의 γδ T 세포 수(예를 들어, 증식 전 γδ T 세포의 단리된 집단에 비해 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 1,000배 이상, 2,000배 이상, 3,000배 이상, 4,000배 이상, 5,000배 이상, 6,000배 이상, 7,000배 이상, 8,000배 이상, 9,000배 이상 또는 10,000배 이상의 γδ T 세포 수)를 포함한다. 일부 실시예에서, 배양 28 일 이내에, γδ T 세포의 증식된 집단(예를 들어, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포의 증식된 집단)은 증식 전 γδ T의 단리된 집단에 비해 100배수 이상의 γδ T 세포 수(예를 들어, 증식 전 γδ T 세포의 단리된 집단에 비해 110배 이상, 120배 이상, 130배 이상, 140배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 1,000배 이상, 2,000배 이상, 3,000배 이상, 4,000배 이상, 5,000배 이상, 6,000배 이상, 7,000배 이상, 8,000배 이상, 9,000배 이상, 10,000배 이상, 12,000배 이상 또는 15,000배 이상의 γδ T 세포 수)를 포함한다.
본 명세서에 제공된 방법에 의해 증식된 비-조혈조직-유래 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)는 항 종양 효능에 매우 적합한 표현형을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 Vδ1 T 세포)의 증식된 집단은 참조집단(예를 들어, 증식 단계 전 γδ T 세포의 단리된 집단)보다 CD27의 평균 발현이 더 크다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 CD27의 평균 발현이 2배 이상(예를 들어, 단리된 γδ T 세포 집단에 비해, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 1,000배 이상, 5,000배 이상, 10,000배 이상, 20,000배 이상 또는 그 이상)이다.
증식된 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포) 집단의 특유의 부분은 CD27을 상향조절할 수 있는 반면, 다른 부분은 CD27low 또는 CD27negative이다. 이 경우, CD27positive 세포의 빈도는 단리된 γδ T 세포 집단보다 증식된 집단에서 더 클 수 있다. 예를 들어, 증식된 γδ T 세포 집단은 증식 전 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 최소 5% 더 높은 빈도의 CD27positive 세포(예를 들어, 증식 전 단리된 γδ T 집단에 비해 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%까지 더 높은 빈도의 CD27positive 세포)를 갖는다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 증식된 집단에서 CD27positive 세포의 수가 증가될 수 있다. 예를 들어, 증식된 γδ T 세포 집단은 증식 전의 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 CD27positive 세포의 수가 2배 이상일 수 있다. 증식된 γδ T 세포 집단은 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과의 CD27+ 세포 빈도를 가질 수 있다. 또는, 증식된 γδ T 세포 집단은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 CD27+ 세포 빈도를 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 50% 초과의 CD27+ 세포 빈도를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 증식 방법은 참조집단(예를 들어, 증식 단계 이전의 단리된 γδ T 세포 집단)에 비해 TIGIT 발현이 낮은 증식된 비-조혈조직-유래 γδ T 세포(예를 들어 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포) 집단을 생성한다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 참조집단(예를 들어, 증식 단계 이전의 단리된 γδ T 세포 집단)보다 TIGIT의 평균 발현이 더 낮다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 단리된 γδ T 세포 집단보다 TIGIT의 평균 발현이 최소 10% 더 적다(예를 들어, 단리된 γδ T 세포 집단 보다 최소 20% 적거나, 최소 30% 적거나, 최소 40% 적거나, 최소 50% 적거나, 최소 60% 적거나, 최소 70% 적거나, 최소 80% 적거나, 최소 90% 적거나, 100%까지 적다). 증식된 γδ T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만일 수 있다. 또는, 증식된 γδ T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20% 또는 약 20%일 수 있다. 특정 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 80% 미만이다.
일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)은 CD27+ 세포의 수 또는 빈도는 높고 TIGIT+ 세포의 빈도는 낮다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 참조집단(예를 들어, 증식 전의 단리된 γδ T 세포 집단에 비해)에 비해 CD27+ TIGIT- 세포 빈도가 높다. 예를 들어, 증식된 γδ T 세포 집단은 증식 이전의 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 최소 5% 더 높은 빈도의 CD27+ TIGIT- 세포(예를 들어, 증식 전 단리된 γδ T 집단에 비해 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%까지 더 높은 빈도의 CD27+ TIGIT- 세포)를 갖는다. 일부 실시예에서, 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 증식된 집단에서 CD27+ TIGIT- 세포의 수가 증가될 수 있다. 예를 들어, 증식된 γδ T 세포 집단은 증식 전의 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 2배 이상의 CD27+ TIGIT- 세포 수(예를 들어, 증식 전 단리된 γδ T 세포 집단에 비하여 최소 10%, 최소 15%, 최소 20%, 최소 25%, 최소 30%, 최소 35%, 최소 40%, 최소 45%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 100%까지 높은 빈도의 CD27+ TIGIT- 세포)를 가질 수 있다.
일부 예에서, 증식된 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는 Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포) 집단에서 CD27+ γδ T 세포 집단에 대한 TIGIT의 평균 발현은 참조집단에 비해 낮다. 일부 실시예에서, 증식된 CD27+ γδ T 세포 집단은 참조집단(예를 들어, 증식 단계 이전의 단리된 CD27+ γδ T 세포 집단)보다 TIGIT의 평균 발현이 더 낮다. 일부 실시예에서, 증식된 CD27+ γδ T 세포 집단은 단리된 CD27+ γδ T 세포 집단보다 TIGIT의 평균 발현이 최소 10% 더 적다(예를 들어, 분리된 CD27 + γδ T 세포 집단보다 최소 20% 적거나, 최소 30% 적거나, 최소 40% 적거나, 최소 50% 적거나, 최소 60% 적거나, 최소 70% 적거나, 최소 80% 적거나, 최소 90% 적거나, 100%까지 적다).
추가적으로 또는 그 대신에, 증식된 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포) 집단에서 TIGIT- γδ T 세포 집단에 대한 CD27의 발현 중앙값(median)은 참조집단보다 높다. 예를 들어, 증식된 TIGIT- γδ T 세포 집단은 증식 이전의 단리된 TIGIT- γδ T 세포 집단 에 비해 최소 5% 더 큰 CD27+ 세포 빈도(예를 들어, 증식 이전의 단리된 TIGIT- γδ T 세포 집단에 비해 최소 10%, 최소 15%, 최소 20%, 최소 25%, 최소 30%, 최소 35%, 최소 40%, 최소 45%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 또는 최대 100% 더 큰 CD27+ 세포 빈도)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 단리된 TIGIT- γδ T 세포 집단에 비해 증식된 집단에서 CD27+ 세포의 수가 증가될 수 있다. 예를 들어, 증식된 TIGIT- γδ T 세포 집단은 증식 전의 단리된 TIGIT- γδ T 세포 집단에 비해 2배 이상의 CD27+ 세포 수(예를 들어, 증식 이전의 단리된 TIGIT- γδ T 세포 집단에 비해 최소 10%, 최소 15%, 최소 20%, 최소 25%, 최소 30%, 최소 35%, 최소 40%, 최소 45%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 또는 최대 100% 더 큰 CD27+ 세포 빈도)를 가질 수 있다.
하나 이상의 증식된 비-조혈조직-유래 γδ T 세포 집단(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 특징 분석을 위하여 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30, CD2, NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64을 포함하는 다른 마커들의 증가 또는 감소를 추가적으로 혹은 대안적으로 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포) 집단은 예를 들어, 증식 전의 단리된 γδ T 집단에 비하여 CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 평균 발현이 더 크다. 추가적으로 또는 그 대신에, 증식된 γδ T 세포 집단은 단리된 γδ T 세포 집단에 비해, CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Fas 리간드, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 및 CD2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 더 클 수 있다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포 집단은 단리된 γδ T 세포 집단에 비해, NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 더 낮다. 증식된 집단은 유사하게 단리된 γδ T 세포 집단에 비해 NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 및 CD64로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 빈도가 더 낮을 수 있다.
따라서 본 발명의 방법에 의해 생산된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 다음 중 하나 이상의 특성을 가질 수 있다: (i) 표현형 CD69high, TIM3high 및 CD28low/absent를 나타냄; (ii) CCR3, CD39, CD11b 및 CD9 중 하나 이상을 상향 조절; (iii) TCR 작용제의 부재 하에 NKG2D 리간드에 대한 반응으로 IFN-γ를 생성; (iv) TCR 작용제의 부재 하에 IL-13을 생성; (v) TCR 활성화에 반응하여 IFN-γ, TNF-α 및 GM-CSF 중 하나 이상을 생성; (vi) TCR 활성화에 반응하여 IL-17을 생성하지 않거나 실질적으로 생성하지 않음; (vii) 추가 성장 인자없이 IL-2를 포함하는 배양배지에서 성장; (viii) TCR 작용제의 부재 하에 세포독성 T 세포 반응을 나타냄; 및/또는 (ix) 정상 세포보다 종양 세포에 대한 선택적 세포 독성을 나타냄.
일부 예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 TCR 작용제가 없는 상태에서 IL-13을 생성하고/생성하거나 TCR 작용제가 없는 상태에서 NKG2D 리간드에 대한 반응으로 IFN-γ를 생성한다.
γδ T 세포의 증식에 사용하기 적합한 수많은 기초 배양 배지, 특히 AIM-V, Iscoves 배지 및 RPMI-1640 (Life Technologies)과 같은 배지가 이용 가능하다. 배지에는 혈청, 혈청 단백질 및 선택적 제제(예를 들어, 항생제)와 같은 본 명세서에 정의된 다른 배지 인자를 보충할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, RPMI-1640 배지는 2 ㎜ 글루타민, 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7.2, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 피루브산 나트륨(1 mM; Life Technologies), 비필수 아미노산(예를 들어, 100 μM Gly, Ala, Asn, Asp, Glu, Pro 및 Ser, 1X MEM 비필수 아미노산(Life Technologies)) 및 10 μl/L β-머캅토에탄올을 포함한다. 다른 실시예에서, AIM-V 배지는 CTS 면역 혈청 대체제 및 암포테리신 B로 보충될 수 있다. 본 명세서에 정의된 특정 실시예에서, 배지는 추가로 IL-2 및 IL-15로 보충될 수 있다. 간편하게, 세포는 단리 및/또는 증식 동안 적절한 배양 배지에서 5% CO2를 포함하는 가습 분위기의 37℃에서 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 림프구 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 림프구 집단을 (예를 들면, 최소 5일간) 추가로 배양하여 증식된 림프구 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
일 실시예에서, 림프구는 αβ T 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 αβ T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 αβ T 세포 집단을 (예를 들면, 최소 5일간) 추가로 배양하여 증식된 αβ T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 αβ T 세포를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
단계 (ii)에서의 배양은 αβ T 세포가 단계 (i)에서 단리된 집단에 존재하는 다른 세포 유형보다 우선적으로 증식되는 배양 조건을 선택하는 것과 같은 선택적 증식에 의한 것일 수 있다. 또는, 증식 조건은 선택적이지 않고 단계 (ii)에서 배양한 후 비-표적 세포(예를 들어, αβ T 세포 이외의 세포)를 고갈(depletion)시킬 수 있다. 또는, 증식 조건은 선택적이지 않으며 비-표적 세포(예를 들어, αβ T 세포 이외의 세포)의 고갈 단계는 (ii)에서 배양하기 전에 일어난다. 이들 실시예의 목적은 αβ T 세포의 총 수를 증식하는 동시에 집단에서 그들의 비율을 증가시키는 것임을 주목한다.
일 실시예에서, 림프구는 NK 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 NK 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 NK 세포 집단을 (예를 들면, 최소 5일간) 추가로 배양하여 증식된 NK 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 NK세포를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
단계 (ii)에서의 배양은 NK 세포가 단계 (i)에서 단리된 집단에 존재하는 다른 세포 유형보다 우선적으로 증식되는 배양 조건을 선택하는 것과 같은 선택적 증식에 의한 것일 수 있다. 또는, 증식 조건은 선택적이지 않고 단계 (ii)에서 배양한 후 비-표적 세포(예를 들어, NK 세포 이외의 세포)를 고갈시킬 수 있다. 또는, 증식 조건은 선택적이지 않으며 비-표적 세포(예를 들어, NK 세포 이외의 세포)의 고갈 단계는 (ii)에서 배양하기 전에 일어난다. 이들 실시예의 목적은 NK 세포의 총 수를 증식하는 동시에 집단에서 그들의 비율을 증가시키는 것임을 주목한다.
일 실시예에서, 림프구는 γδ T 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 γδ T 세포 집단을 (예를 들면, 최소 5일간) 추가로 배양하여 증식된 γδ T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T세포를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
단계 (ii)에서의 배양은 γδ T 세포가 단계 (i)에서 단리된 집단에 존재하는 다른 세포 유형보다 우선적으로 증식되는 배양 조건을 선택하는 것과 같은 선택적 증식에 의한 것일 수 있다. 또는, 증식 조건은 선택적이지 않고 단계 (ii)에서 배양한 후 비-표적 세포(예를 들어, γδ T 세포 이외의 세포)를 고갈시킬 수 있다. 또는, 증식 조건은 선택적이지 않으며 비-표적 세포(예를 들어, γδ T 세포 이외의 세포)의 고갈 단계는 (ii)에서 배양하기 전에 일어난다. 이들 실시예의 목적은 γδ T 세포의 총 수를 증식하는 동시에 집단에서 그들의 비율을 증가시키는 것임을 주목한다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(i) (a) IL-2 또는 IL-9;
(b) IL-15; 및
(c) IL-21;
의 존재 하에서 증식된 γδ T 세포 집단을 생성하는데 효과적인 양으로 상기 γδ T 세포 집단을 최소 5일간 배양하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이러한 양태의 특정 실시예에서, 상기 γδ T 세포 집단을 배양하는 것은 IL-4의 존재를 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서,
(i) 본 명세서에서 정의된 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(i) (a) IL-2 또는 IL-9;
(b) IL-15;
(c) IL-21; 및
(d) IL-4
의 존재 하에서 증식된 γδ T 세포 집단을 생성하는데 효과적인 양으로 상기 γδ T 세포 집단을 최소 5일간 배양하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리 및 증식하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 림프구(예를 들어, 피부-유래 αβ T 세포 및/또는 NK 세포)의 증식된 집단이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 림프구의 증식된 집단이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 γδ T 세포의 증식된 집단이 제공된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 γδ T 세포의 증식된 집단이 제공된다.
일 실시예에서, 단리된 집단은 50% 초과의 γδ T 세포, 예를 들어 75% 초과의 γδ T 세포, 특히 85% 초과의 γδ T 세포를 포함한다. 일 실시예에서, 단리된 집단은 Vδ1 세포를 포함하고, 여기서 Vδ1 세포의 50% 미만, 예를 들어 25% 미만이 TIGIT를 발현한다. 일 실시예에서, 단리된 집단은 Vδ1 세포를 포함하고, 여기서 50% 초과, 예를 들어 60% 초과의 Vδ1 세포가 CD27을 발현한다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 림프구 및/또는 γδ T 세포는 예를 들어 입양 T 세포 치료를 위한 약제로 사용될 수 있다. 이는 본 발명의 방법에 의해 수득된 림프구 및/또는 γδ T 세포를 환자에게 전달하는 것을 포함한다. 치료는 γδ T 세포가 수득된 동일 환자에게 다시 전달하는 것처럼 자가유래(autologous)일 수 있으며, 한 사람으로부터 수득한 γδ T 세포를 다른 환자에게 전달하는 동종이계(allogenic)일 수도 있다. 동종이계 전달을 포함하는 경우, γδ T 세포에는 αβ T 세포가 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, αβ T 세포는 예를 들어, 증식 후 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단을 사용하여 (예를 들어, 음성 선택에 의해, 예를 들어 자기 비드를 사용하여) γδ T 세포 집단으로부터 고갈될 수 있다. 치료 방법은 공여자 개체로부터 수득된 비-조혈조직 시료를 제공하고; 상기 기재된 바와 같이 시료로부터 γδ T 세포를 배양하여 증식된 집단을 생성하며; 증식된 γδ T 세포 집단을 수용자 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
치료될 환자 또는 대상체는 바람직하게는 인간 암 환자(예를 들어, 고형 종양에 대해 치료되는 인간 암 환자) 또는 바이러스 감염 환자(예를 들어, CMV-감염 또는 HIV 감염 환자)이다. 일부 예에서, 환자는 고형 종양을 갖고 있으며/있거나 치료 중이다. 그들은 평상시 일반적으로 비-조혈조직에 상재하기 때문에 조직-상재 Vδ1 T 및 DN γδ T 세포는 또한 전신적인 혈액-상재 대응물보다 종양 덩어리로 향하여 그 안에 머물 가능성이 더 높으며, 이러한 세포의 입양 전이는 고형 종양 및 잠재적으로 다른 비-조혈조직-관련 면역병리를 표적화하는 것이 더 효과적일 가능성이 있다.
γδ T 세포는 비-MHC 제한성이므로, 외래물질로서 전이되는 숙주를 인식하지 못하며, 이는 이식편대숙질환을 일으킬 가능성이 적음을 의미한다. 이는 이들이 "기성품(off the shelf)"으로 사용될 수 있고, 예를 들어 동종이계 입양 T 세포 치료를 위해, 모든 수용자에게 전달될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 NKG2D를 발현하고 악성 종양과 밀접하게 연관된 NKG2D 리간드(예를 들어, MICA)에 반응한다. 그들은 또한 활성화 부재 하에 세포독성 프로파일을 발현하므로, 종양 세포를 사멸시키는 데 효과적일 가능성이 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 수득된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, CCL4, IL-13, 그라눌리신(Granulysin), 그랜자임(Granzyme) A와 B, 및 퍼포린 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 발현할 수 있다. IL-17A는 발현되지 않을 수 있다.
따라서, 본 명세서에 보고된 결과는 "기성품" 면역치료 시약으로서 본 발명의 방법에 의해 수득된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포의 임상 적용에 대한 실용성 및 적합성에 대한 강력한 증거를 제공한다. 이들 세포는 선천적-유사 사멸능을 가지며, MHC 제한성이 없고, 다른 T 세포에 비해 종양 내에서 향상된 귀소 및/또는 체류성을 나타낸다.
일부 실시예에서, 비-조혈조직에 종양이 있는 개체의 치료 방법은 공여자 개체로부터 수득된 비-조혈조직 시료를 제공하고, 상기 기재된 바와 같이 시료로부터 γδ T 세포를 배양하여 증식된 집단을 생성하며; 증식된 γδ T 세포 집단을 종양이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수 등과 같은 완충액; 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타치온과 같은 킬레이팅제; 보조제(aduvants, 예를 들어, 수산화 알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 동결보존 용액은 예를 들어 DMSO를 포함한다. 조성물은 예를 들어 정맥 내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
일 실시예에서, 제약 조성물은 예를 들어, 내독소 또는 마이코플라스마와 같은 검출가능한 수준의 오염물이 없다.
일부 예에서, 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득된 증식된 γδ T 세포의 치료적 유효량은 대상체에게 (예를 들어, 암 치료, 예를 들어 고형 종양 치료를 위해) 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 증식된 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 치료적 유효량은 용량 당 10 x 1012 세포 미만(예를 들어, 용량 당 9 x 1012 세포 미만, 용량 당 8 x 1012 세포 미만, 용량 당 7 x 1012 세포 미만, 용량 당 6 x 1012 세포 미만, 용량 당 5 x 1012 세포 미만, 용량 당 4 x 1012 세포 미만, 용량 당 3 x 1012 세포 미만, 용량 당 2 x 1012 세포 미만, 용량 당 1 x 1012 세포 미만, 용량 당 9 x 1011 세포 미만, 용량 당 8 x 1011 미만 세포, 용량 당 7 x 1011 세포 미만, 용량 당 6 x 1011 세포 미만, 용량 당 5 x 1011 세포 미만, 용량 당 4 x 1011 세포 미만, 용량 당 3 x 1011 세포 미만, 용량 당 2 x 1011 세포 미만, 용량 당 1 x 1011 세포 미만, 용량 당 9 x 1010 세포 미만, 용량 당 7.5 x 1010 세포 미만, 용량 당 5 x 1010 세포 미만, 용량 당 2.5 x 1010 세포 미만, 용량 당 세포 1 x 1010 개, 용량 당 7.5 x 109 세포 미만, 용량 당 5 x 109 세포 미만, 용량 당 2.5 x 109 세포 미만, 용량 당 1 x 109 세포 미만, 용량 당 7.5 x 108 세포 미만, 용량 당 5 x 108 세포 미만, 용량 당 2.5 x 108 세포 미만, 용량 당 1 x 108 세포 미만, 용량 당 7.5 x 107 세포 미만, 용량 당 5 x 107 세포 미만, 용량 당 2.5 x 107 세포, 용량 당 1 x 107 세포 미만, 용량 당 7.5 x 106 세포 미만, 용량 당 5 x 106 세포 미만, 용량 당 2.5 x 106 세포 미만, 용량 당 1 x 106 세포, 용량 당 7.5 x 105 세포 미만, 용량 당 5 x 105 세포 미만, 용량 당 2,5 x 105 세포 미만, 또는 용량 당 1 x 105 세포 미만)이다. 일부 실시예에서, 증식된 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 치료적 유효량은 치료 과정동안 10 x 1012 세포 미만(예를 들어, 치료 과정동안 9 x 1012 세포 미만, 8 x 1012 세포 미만, 7 x 1012 세포 미만, 6 x 1012 세포 미만, 5 x 1012 세포 미만, 4 x 1012 세포 미만, 3 x 1012 세포 미만, 2 x 1012 세포 미만, 1 x 1012 세포 미만, 9 x 1011 세포 미만, 8 x 1011 세포 미만, 7 x 1011 세포 미만, 6 x 1011 세포 미만, 미만 5 x 1011 세포 미만, 4 x 1011 세포 미만, 3 x 1011 세포 미만, 2 x 1011 세포 미만, 1 x 1011 세포 미만, 9 x 1010 세포 미만, 7.5 x 1010 세포 미만, 5 x 1010 세포 미만, 2.5 x 1010 세포 미만, 1 x 1010 세포 미만, 7.5 x 109 세포 미만, 5 x 109 세포 미만, 2.5 x 109 세포 미만, 1 x 109 세포 미만, 7.5 미만 x 108 세포, 5 x 108 세포 미만, 2,5 x 108 세포 미만, 1 x 108 세포 미만, 7.5 x 107 세포 미만, 5 x 107 세포 미만, 2,5 x 107 세포 미만, 1 x 107 세포 미만, 7.5 x 106 미만 세포, 5 x 106 세포 미만, 2,5 x 106 세포 미만, 1 x 106 세포 미만, 7.5 x 105 세포 미만, 5 x 105 세포 미만, 2,5 x 105 세포 미만 또는 1 x 105 세포 미만)이다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포의 용량은 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 또는 5 x 108 세포/kg을 포함한다. 일부 실시예에서, 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 용량은 최소 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 또는 5 x 108 세포/kg을 포함한다. 일부 실시예에서, 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 용량은 최대 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 또는 5 x 108 세포/kg을 포함한다. 일부 실시예에서, 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 용량은 약 1.1 x 106 - 1.8 x 107 세포/kg을 포함한다. 일부 실시예에서, 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 용량은 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 또는 5 x 109 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 용량은 최소 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 또는 5 x 109 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)의 용량은 최대 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 또는 5 x 109 세포를 포함한다.
일 실시예에서, 대상체는 대상체의 체중 kg 당 104 내지 106 개의 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포(예를 들어, 피부-유래 γδ T 세포 및/또는, Vδ1 T 세포 및/또는 DN T 세포와 같은 비-Vδ2 T 세포)를 투여 받는다. 일 실시예에서, 대상체는 비-조혈조직-상재 γδ T 세포 집단의 개시 투여(예를 들어, 대상체의 체중 kg 당 104 내지 106 γδ T 세포(예를 들어, 대상체의 체중 kg 당 104 내지 105 γδ T 세포)의 개시 투여)와 1회 이상(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5)의 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포의 후속 투여(예를 들어, 1회 이상의 대상체의 체중 kg 당 104 내지 106 γδ T 세포(예를 들어 대상체 체중 kg 당 104 내지 105 증식된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포의 후속 투여)를 받는다. 일 실시예에서, 1회 이상의 후속 투여는 이전 투여 후 15일 미만, 예를 들어 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 일, 예를 들어, 이전 투여 후 4, 3, 또는 2일 미만에 투여된다. 일 실시예에서, 대상체는 최소 3회의 γδ T 세포 집단의 투여 과정에 걸쳐 대상체의 체중 kg 당 총 약 106 γδ T 세포를 투여받으며, 예를 들어 대상체는 1 x 105 γδ T 세포의 개시 용량을 투여받고, 3 x 105 γδ T 세포의 2차 투여 및 6 x 105 γδ T 세포의 3차 투여를 받으며, 예를 들어, 각 투여는 이전 투여 후 4, 3 또는 2 일 이내에 투여된다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 또한 CAR-T 요법과 같은 향상된 치료 특성을 위해 유전자 조작될 수 있다. 이것은 새로운 특이성, 예를 들어 단일클론 항체의 특이성을 갖는 T 세포를 재프로그래밍하기 위해 조작된 T 세포 수용체(TCR)의 생성을 포함한다. 조작된 TCR은 T 세포를 악성 종양 세포에 특이적으로 만들 수 있으므로 암 면역요법에 유용하다. 예를 들어, T 세포는 대상체 조직의 정상 체세포에 의해 발현되지 않는 종양관련 항원과 같은 종양 항원을 발현하는 암 세포를 인식할 수 있다. 따라서, CAR-변형된 T 세포는, 예를 들어 암 환자의, 입양 T 세포 치료에 사용될 수 있다.
CAR에 대한 혈액-상재 γδ T 세포의 사용이 기술되었다. 그러나, 본 발명의 방법에 의해 수득된 비-조혈조직-상재 γδ T 세포는 형질전환된 세포를 인식하는 선천-유사 능력을 유지하면서 키메라 항원 특이적 TCR로 형질도입될 수 있기 때문에 CAR-T 접근을 위한 특히 좋은 매개체가 될 가능성이 있으며, 혈액-상재 γδ T 세포 또는 종래의 전신성 αβ T 세포보다 우수한 종양 침투 및 보유 능력을 가질 가능성이 있다. 이에 더하여, MHC 의존성 항원 제공의 결여는 잠재적인 이식편대숙주질환의 가능성을 줄이고, MHC의 발현 수준이 낮은 종양을 표적화할 수 있도록 한다. 마찬가지로, 예를 들어 CD28의 개입을 통한 통상적인 공동-자극에 대한 비-의존성은 공동 자극 수용체에 대한 리간드의 발현 수준이 낮은 종양의 표적화를 향상시킨다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 추가 치료제는 면역 치료제, 세포독성제, 성장억제제, 방사선 치료제, 항-혈관신생제, 또는 이들의 2개 이상의 제제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 치료제는 증식된 γδ T 세포의 투여와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다. 추가 치료제는 면역 치료제일 수 있으며, 이는 대상체의 신체 내 표적(예를 들어, 대상체 자신의 면역계) 및/또는 전달된 γδ T 세포에 작용할 수 있다.
조성물의 투여는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양 내로, 비강 내로, 골수 내로, 근육 내로, 정맥 내 주사에 의해, 또는 복강 내로, 예를 들어 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 비-조혈조직-상재 γδ T 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 명세서에 설명된 모든 실시예는 본 발명의 모든 양태에 적용될 수 있음은 당연하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 특정된 값보다 최대 10% 이상 및 최대 10% 이하를 포함하며, 적절하게는 특정된 값보다 최대 5% 이상 및 최대 5% 이하를 포함하고, 특히 특정된 값을 포함한다. 용어 "내지"는 특정된 경계 값을 포함한다.
이제 본 발명의 특정 양태 및 실시예를 예로써, 그리고 위에서 기술된 도면을 참조하여 설명할 것이다.
실시예
실시예 1. 분석 방법
별도로 언급되지 않는 한, 다음 방법을 사용하여 하기 실시예의 결과를 생성하였다.
유세포 분석
다음의 항체-형광색소 접합체(conjugate)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다: Ki-67-BV421, CD3-BV510, Vδ1-PeVio770, TIM-3-PE, CD9-PE, CCR3-BV421 및 CD39-BV421. 시료는 또한 eFluor770NIR을 사용하여 생존도를 위해 염색하였다. 상업적 항체는 Biolegend 또는 Miltenyi에서 구입하였다. 생존도 염료(근 적외선)는 eBioscience에서 구입하였다. Ki-67 염색은 Foxp3 염색 버퍼 세트(eBioscience)를 사용하여 고정 및 투과화된 세포에서 수행하였다. 각 실험이 끝나면, 세포 집단을 PBS로 세척하고 반으로 나누었다. 세포는 생존도를 위하여 eFluor770 NIR로 염색하고 세척한 후, TrueStain(Biolegend)으로 염색하여 염색 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 시료의 절반은 지정된 표면 마커에 대해 염색하였으며, 나머지 절반은 사용된 표면 마커에 대해 동등한 아이소타입(isotype) 대조군과 함께 계통 마커(lineage marker, CD3, Vδ1)에 대해서만 염색하였다. 동일한 형광 색소에 접합된 상응하는 마우스 아이소타입 항체를 동일한 농도로 사용하였다. 아이소타입 대조군은 알려진 인간 항원에 결합하지 않으며, 따라서 비특이적 결합 또는 위양성을 나타낸다. 히스토그램은 상응하는 아이소타입 대조군 또는 지정된 대조군과 비교하여 나타내었다. 데이터 요약은 비교된 지정된 마커에 대해 양성으로 염색되고, 따라서 아이소타입보다 높은 수준으로 염색된 세포의 비율을 나타낸다. 유세포 분석의 데이터 분석은 FLOWJO(버전 10.1)에서 수행되었다.
CD27 및 TIGIT의 발현을 포함하여, 각 세포 집단의 초기 및 최종 표현형 또한 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 결정하였다.
집단 분석
피부 상재 림프구는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 분리하였다. CD45+ 세포 내에서, 항-CD3를 사용하여 T 세포를 염색하고, 항-CD56 항체를 사용하여 NK 세포, CD3-CD56+를 각각 확인하였다. CD3+ 세포 내에서, pan γδ T 세포 수용체에 대한 항체를 사용하여 피부-상재 γδ T 세포를 확인하고, 항-CD8α를 사용하여 CD3+, pan γδ TCR- 게이트 내의 통상적인 CD4 및 CD8 양성 αβ T 세포의 비율을 확인하였다.
총 세포 수 결정
총 세포 수는 NC-250 Nucleocounter(Chemometec, Copenhagen Denmark)과 제조사의 지침을 사용하여 생성하였다.
실시예 2. 인간 피부 시료로부터 림프구의 분리
3 차원 피부 외식편 프로토콜을 확립하고, 본 명세서에 기술하였다. 탄탈로 코팅된 망상 유리질의 탄소 스캐폴드(그리드라고도 함)(Ultramet, California, USA) 또는 20㎜ x 1.5㎜ 크기의 등가물을 가압멸균하고 세척한 다음, 사용하기 전에 PBS에 완전히 침지시켰다.
1 L의 AIM-V배지(Gibco, Life Technologies), 50 mL의 CTS 면역 혈청 대체제(Life Technologies), 인간 재조합 IL-2(Miltenyi Biotech, Cat no 130-097-746) 및 인간 재조합 IL-15(Miltenyi Biotech, Cat no 130-095-766)와 함께, 3종 사이토카인(3CK) 결정을 위해서는 인간 재조합 IL-21 (Miltenyi Biotech, Cat no 130-095-784), 4종 사이토카인(4CK) 결정을 위해서는 인간 재조합 IL-4(Miltenyi Biotech, Cat no 130-093-922)를 하기 기재된 농도로 포함하는 완전 단리 배지(complete isolation medium)을 제조하였다. 배양 첫 7일 동안에는, 10 mL의 암포테리신 B(250 μg/mL, Life Technologies)를 포함하는 완전 단리 배지("+AMP")를 사용하였다. 완전 단리 배지에서 사이토카인의 최종 목표 농도는 다음과 같다.
성인 인간 피부 시료는 수집된 지 48 시간 이내에 수득, 배송 및 처리되었다. 메스와 핀셋을 사용하여 시료에서 과도한 피하지방과 털을 제거하였다. 피부 시료는 표피면이 위로 향하도록 배치하였으며, 멸균 핀셋으로 생검 주위의 피부를 고정한 채 적절한 크기의 펀치 생검을 사용하여 피부를 절단하였다.
표피 쪽이 위로 향한 세 개의 생검을 하나의 탄탈 코팅된 탄소 그리드의 표면에 균일하게 간격을 두고 부착시켰다. 멸균 핀셋를 사용하여 30 mL의 완전 단리 배지(+AMP)를 함유하는 G-REX6 웰 플레이트(Wilson Wolf Manufacturing)의 웰과 같이 기체 투과성 멤브레인이 있는 조직배양 용기로 옮기거나, 300 mL의 완전 단리 배지(+AMP)를 포함하는 G-REX100 생물반응기(Wilson Wolf Manufacturing)로 그리드를 이송하였다. 하나의 그리드는 G-REX6 웰 플레이트의 각 웰에 배치하였으며, 3 개의 그리드는 G-REX10 생물반응기에, 또는 10 개의 그리드는 G-REX100 생물반응기에 배치하였다. 또는, 생검은 통상적인 24 웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양물은 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
별도로 언급하지 않는 한, 배지는 7일마다 생물반응기의 바닥에 있는 세포를 교란하지 않도록 주의하면서 상층 배지를 부드럽게 흡인하고 2X 완전 단리배지 (AMP가 없는)로 교체하여 바꿔주었다.
림프구를 단리하기 위해, 피부가 있는 그리드를 G-REX6 웰 플레이트 또는 G-REX10 또는 G-REX100 생물반응기에서 제거하고, 폐기하였다. 플레이트 또는 생물반응기의 바닥에 존재하는 세포를 재현탁하고, 500 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음 원심 분리하였다(예를 들어, 10 분 동안 300g).
세포 계수가 필요한 경우, 실시예 1에 기재된 바와 같이 본 단계에서 림프구를 계수하였다. 예시적인 연구의 결과를 표 2에 나타내었다.
실시예 3. 단리 단계에서 추가 사이토카인의 사용
단리 단계동안 추가적인 사이토카인의 사용을 시험하였다. 3종 사이토카인 단리 방법(즉, IL-2, IL-15 및 IL-21) 및 4종 사이토카인 단리 방법(즉, IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-4)을 시험하고 2종 사이토카인(즉, IL-2 및 IL-15) 단리 방법과 직접 비교하였다. 피부 시료는 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
총 세포 수율과 γδ T 세포 및 Vδ1 세포의 비율은 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였었다. 결과는 도 1에 나타내었다. 단리 시 4종 사이토카인을 사용하면 세포 수율이 향상되고, 단리된 γδ T 세포 및 Vδ1 세포의 수가 증가하는 것을 알 수 있다. 도 2에 제시된 결과는 또한 3종 사이토카인이 세포 수율과 단리된 γδ T 세포 및 Vδ1 세포의 수를 증가시키는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
단리된 Vδ1 세포의 표현형은 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 TIGIT 및 CD27의 발현을 결정하여 분석하였다. 낮은 TIGIT 발현 및 높은 CD27 발현을 갖는 Vδ1 세포는 바람직한 표현형을 갖는 것으로 간주된다. 결과는 도 3과 4에 나타내었다. 전반적으로, 2종 사이토카인을 사용하여 단리된 세포에 비해 4종 사이토카인과 3종 사이토카인을 사용하여 단리된 세포에서 TIGIT의 발현은 더 낮고 CD27 발현은 더 높았다.
실시예 4. 펀치 생검 크기의 최적화
초기 시험은 3 ㎜ 펀치 생검이 표준의 피부 다짐 방법보다 성능이 우수함을 보여주었다(도 5).
대조군으로 2㎜ 메스로 다진 외식편을 사용하고, 1 ㎜, 2 ㎜, 3 ㎜, 4 ㎜ 및 8 ㎜ 펀치 생검 크기를 시험하는 것에 의해 최적의 펀치 생검 크기를 추가로 조사하였다. 피부 시료는 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 각각의 크기는 하나의 생검을 표피면이 위로 향하도록 탄소 그리드의 표면에 부착하고 24-웰 플레이트(Corning)의 웰에 배치하여 시험하였다. 각각의 웰에는 위에서 언급한 농도의 AIM-V 10% 인간 AB 혈청 + IL-2 및 IL-15에, 추가로 표준 농도의 β-머캅토에탄올(2ME) 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 들어있었다.
생검은 세포 수확 및 세포 수율 분석 전에 21일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 배지는 주당 3회 새로 갈아주었다(배지의 절반 변경).
총 세포 수율은 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 결과는 표 3에 나타내었다. 결과는 2-4 ㎜ 직경의 생검이 가장 높은 세포 수율을 제공함을 보여준다.
세포 수율에 존재하는 γδ T 세포의 비율을 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다. 결과는 3 ㎜ 직경의 생검이 가장 높은 수율의 γδ T 세포를 제공함을 보여준다.
실시예 5. 단리 용기의 최적화
24 웰 플레이트에서의 단리를 G-REX6 웰 플레이트(Wilson Wolf Manufacturing)와 같은 기체 투과성 소재를 포함하는 용기를 사용하는 것과 비교하였다. 피부 시료는 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 생검을 탄소 그리드의 표면에 표피가 위로 향하게 부착한 다음, 24 웰 플레이트 또는 G-REX6 웰 플레이트의 웰에 배치하였다. 24-웰 플레이트에는 9 ㎜ 그리드를 사용하였으며, G-REX6 웰 플레이트에는 20 ㎜ 그리드를 사용하였다. 모든 시료는 AIM-V 10% AB 혈청 + P/S + 2ME + IL-2 및 IL-15에서 배양하였으며, 배지는 일주일에 세 번 새로 갈아주었다. 24 웰 플레이트의 경우 배지를 일주일에 세 번 새로 갈아주었다. G-REX6 웰 플레이트의 경우에는, 매주 한 번만 배지를 새로 갈아주는 것이 요구되었다. 생검은 세포 수율 분석 전에 21일 동안, 37℃, 5% CO2 배양기에서에서 배양하였다.
플레이트 당 및 생검 당 총 세포 수율을 실시예 1에 기술된 바와 같이 결정 하였다. 실험은 G-REX6 웰 플레이트가 24 웰 플레이트와 비교할 때 생검 당 및 플레이트 당 증가된 세포 수율을 제공함을 보여주었다(도 7 및 표 4). G REX6 웰 플레이트는 배양할 조직의 양을 늘릴 수 있도록 하였으나(24 웰 플레이트에 비해 2.5배 더 많은 조직), 놀랄만한 25배 세포수의 증가를 야기하였다.
G-REX 용기의 사용을 2종 사이토카인, 3종 사이토카인 및 4종 사이토카인 단리 프로토콜로 시험하였다. Vδ1 세포의 표현형은 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 TIGIT 및 CD27 발현을 측정함으로써 분석하였다. PD-1 발현은 단리된 αβ T 세포(CD3+, panγδ- 세포)에서 측정하였다. 결과는 도 8 및 9에 나타내었다. 이러한 결과로부터 G-REX 용기를 사용하여 4종 사이토카인으로 단리한 Vδ1 세포가, G-REX 용기를 사용하여 2종 사이토카인으로 단리한 Vδ1 세포에 비해 TIGIT의 발현은 더 낮고, CD27 발현은 더 높은 반면, 4종 사이토카인에서 단리한 αβ T 세포는 2종 사이토카인에서 단리한 αβ T 세포에 비해 PD-1의 발현이 더 낮음을 확인하였다.
실시예 6. 단리 프로토콜의 최적화
단리 프로토콜을 최적화하기 위하여, 3 ㎜ 펀치 생검의 사용을 추가로 시험하였다. 피부 시료는 실시예 2에 기재된 바와 같이 3 ㎜ 펀치 생검을 사용하여 제조하고, 수득하였다.
다른 배지와 비교 시험하였다. 생검을 그리드에 배치하고 다음 중 하나의 24 웰 플레이트에서 배양하였다.
● 5% 인간 AB 혈청과 IL-2/IL-15(2CK) 또는 IL-2/IL-15/IL-21/IL-4(4CK)를 함유하는 AIM-V; 또는
● 10% 우태아혈청(FCS) 및 IL-2/IL-15(2CK) 또는 IL-2/IL-15/IL-21/IL-4(4CK)를 함유하는 SKIN-T.
생검은 세포 수율 분석 전, 14일(AIM-V) 또는 21일(SKIN-T)동안 37ㅊC, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그리드 당 총 세포 수율은 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 결과는 도 10에 나타내었다. AIM-V에서의 단리는 심지어 더 짧은 기간에도 더 나은 세포 수율과 전체적으로 더 높은 Vδ1 세포 수를 초래하였다.
세포 단리 기간도 시험하였다. 실시예 2에 기술한 바와 같이, 3㎜ 펀치 생검을 그리드에 배치하고, G-REX6 웰 플레이트 또는 G-REX10 생물반응기에 배치하였다. 생검은 AIM-V(5% 혈청 대체제(SR), 5% 인간 AB 혈청 또는 5% SR/5% AB "혼합물"을 포함) + 2ME + P/S + IL2/15에서, 세포 수율 분석 전 14일 또는 21일 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그리드 당 총 세포 수율은 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 결과는 도 11에 나타내었다. 모든 배지 유형에서, 3주 후 단리는 2주 후 단리에 비해 세포 수율을 향상시켰다.
혈청 대체제 vs 인간 AB 혈청(5% 또는 10%)의 사용도 역시 시험하였다. 생검은 세포 분석 전, 21일 동안 37ㅊC, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그리드 당 총 세포 수율 및 Vδ1 세포의 %를 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 도 12에 나타내었다. 인간 AB 혈청에 비해 5% 혈청 대체제가 보충된 배지를 사용하여 증가된 세포 수율 및 더 높은 비율의 Vδ1 세포가 수득되었다.
실시예 7. 세포 증식
전술한 프로토콜을 사용하여 세포가 단리되면, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 증식될 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포의 선택적 증식은 WO2017072367에 개시된 증식 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
추가적인 사이토카인을 사용한 γδ T 세포의 증식 역시 시험하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 2종 사이토카인(2CK) 또는 4종 사이토카인(4CK)을 사용하여 단리된 피부 조직 림프구를 배양 21일 후에 수집하였다. 수집된 세포는 5% 혈청 대체제와 인간 재조합 IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21을 함유하는 TexMAC(Miltenyi Biotech) 배지에서 배양하였다. 세포 유형은 FACS를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결과는 도 13에 나타내었다. 단리 동안 4종 사이토카인을 사용하면 단리 동안 2종 사이토카인을 사용하는 것에 비하여 증식 후 더 큰 γδ T 세포 집단이 생성되었다.
Vδ1 세포의 표현형은 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 다양한 마커의 발현을 측정하는 것에 의해 분석하였다. 결과는 도 14에 나타내었다. 단리 동안 4종 사이토카인을 사용하고 이후 증식하면 2종 사이토카인으로 단리된 세포에 비해 CD27 발현이 더 높은 세포가 생성되었다.
그리드 당 γδ 세포 및 Vδ1 세포의 총 수는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 도 15에 나타내었다. 단리 동안 4종 사이토카인을 사용하면, 증식 후 Vδ1 세포의 전체 수율이 증가함을 보여주었다.
Claims (77)
- (i) (a) 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-9(IL-9);
(b) 인터루킨-15(IL-15); 및
(c) 인터루킨-21(IL-21);
의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및
(ii) 비-조혈조직 시료로부터 배양된 림프구 집단을 수집하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 단리하는 방법.
- (i) (a) IL-2 또는 IL-9;
(b) IL-15; 및
(c) IL-21;
의 존재 하에서 비-조혈조직 시료를 배양하는 단계; 및
(ii) 비-조혈조직 시료로부터 배양된 γδ T 세포 집단을 수집하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리하는 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
단계 (i)은 인터루킨-4(IL-4)의 존재 하에 비-조혈조직 시료를 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
비-조혈조직 시료의 배양물로부터 수집된 림프구 집단이 αβ T 세포 집단인 방법.
- 청구항 1에 있어서,
비-조혈조직 시료의 배양물로부터 수집된 림프구 집단이 NK 세포 집단인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
림프구 또는 γδ T 세포는 최소 배양 7일 후 수집되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
림프구 또는 γδ T 세포는 최소 배양 14일 후 수집되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
림프구 또는 γδ T 세포는 배양 35일 전에 수집되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
림프구 또는 γδ T 세포는 배양 21일 전에 수집되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 무혈청 배지에서 배양되는 방법.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 혈청 또는 혈청 대체제를 포함하는 배지에서 배양되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 온전한 생검인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 단계 (i) 전에 다져지지 않은 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최소 단면이 1 ㎜ 이상인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최소 단면이 2 ㎜ 이상인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최소 단면이 약 3 ㎜인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최대 단면이 8 ㎜ 이하인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최대 단면이 4 ㎜ 이하인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최소 단면적이 1 ㎜2 이상인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최소 단면적이 4 ㎜2 이상인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 단면적이 약 7 ㎜2인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최대 단면적이 64 ㎜2 이하인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최대 단면적이 50 ㎜2 이하인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 최대 단면적이 16 ㎜2 이하인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 직경이 1 ㎜ 이상인 펀치 생검을 포함하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 직경이 2 ㎜ 이상인 펀치 생검을 포함하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 직경이 약 3 ㎜인 펀치 생검을 포함하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 직경이 8 ㎜ 이하인 펀치 생검을 포함하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 직경이 4 ㎜ 이하인 펀치 생검을 포함하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 피부인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 표피 및 진피 층을 포함하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 장 또는 위장관인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
가스 투과성 소재를 포함하는 용기에서 수행되는 방법.
- 청구항 33에 있어서,
상기 용기는 기체 교환을 허용하는 기체 투과성 소재를 포함하는 액체 밀봉 용기인 방법.
- 청구항 33 또는 청구항 34에 있어서,
상기 용기의 바닥은 용기의 바닥으로부터 기체 교환을 허용하도록 구성되는 방법.
- 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 용기 내부의 합성 스캐폴드에 배치되는 방법.
- 청구항 36에 있어서,
합성 스캐폴드는 탄탈-코팅되어 있는 방법.
- 청구항 36 또는 청구항 37에 있어서,
합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 용기의 바닥으로 림프구의 배출이 용이하도록 구성되는 방법.
- 청구항 36 또는 청구항 37에 있어서,
합성 스캐폴드는 비-조혈조직 시료로부터 용기의 바닥으로 γδ T 세포의 배출이 용이하도록 구성되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
비-조혈조직 시료는 인간으로부터 수득되는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
IL-2는 인간 IL-2이거나 그의 기능적 등가물인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
IL-9은 인간 IL-9이거나 그의 기능적 등가물인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
IL-15은 인간 IL-15이거나 그의 기능적 등가물인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
IL-21은 인간 IL-21이거나 그의 기능적 등가물인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
IL-4는 인간 IL-4이거나 그의 기능적 등가물인 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
단리된 세포 집단은 Vδ1 T 세포 집단을 포함하는 방법.
- 청구항 46에 있어서,
Vδ1 T 세포 집단은 CD27을 발현하고/하거나 TIGIT를 실질적으로 발현하지 않는 방법.
- 청구항 46 또는 청구항 47에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 80% 미만인 방법.
- 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 60% 미만인 방법.
- 청구항 46 내지 49 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 40%인 방법.
- 청구항 46 내지 50 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 30%인 방법.
- 청구항 46 내지 51 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 20%인 방법.
- 청구항 46 내지 52 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 TIGIT+ 세포 빈도가 약 10%인 방법.
- 청구항 46 내지 53 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포 집단은 TIGIT를 실질적으로 발현하지 않는 방법.
- 청구항 46 내지 54 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 10% 초과인 방법.
- 청구항 46 내지 55 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 20% 초과인 방법.
- 청구항 46 내지 56 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 40%인 방법.
- 청구항 46 내지 57 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 약 80%인 방법.
- 청구항 46 내지 58 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포의 집단은 CD27+ 세포 빈도가 80% 초과인 방법.
- 청구항 46 내지 59 중 어느 한 항에 있어서,
Vδ1 T 세포 집단은 CD27을 발현하는 방법.
- 임의의 선행하는 청구항에 있어서,
단리된 림프구 또는 γδ T 세포 집단을 증식시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- (i) 임의의 선행하는 청구항에 따른 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 림프구 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 림프구 집단을 최소 5일간 추가로 배양하여 증식된 림프구 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 림프구를 단리 및 증식하는 방법.
- (i) 임의의 선행하는 청구항에 따른 방법에 따라 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포 집단을 단리하는 단계; 및
(ii) 상기 γδ T 세포 집단을 최소 5일간 추가로 배양하여 증식된 γδ T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는 비-조혈조직 시료로부터 γδ T 세포를 단리 및 증식하는 방법.
- 청구항 62 또는 청구항 63에 있어서,
증식 단계는,
(a) IL-2 또는 IL-9;
(b) IL-15; 및
(c) IL-21;
의 존재 하에서 증식된 γδ T 세포 집단을 생성하는데 효과적인 양으로 γδ T 세포를 최소 5일간 배양하는 것을 포함하는 방법
- 청구항 64에 있어서,
IL-4의 존재 하에 γδ T 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 61 내지 65 중 어느 한 항에 있어서,
증식 단계는 무혈청 배지에서 림프구 또는 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 61 내지 65 중 어느 한 항에 있어서,
증식 단계는 혈청 또는 혈청 대체제를 포함하는 배지에서 림프구 또는 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 63 내지 67 중 어느 한 항에 있어서,
증식 단계는 실질적인 기질세포 접촉이 없는 상태에서 γδ T 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 63 내지 68 중 어느 한 항에 있어서,
증식 단계는 외인성 TCR 경로 작용제의 부재를 포함하는 방법.
- 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 단리된 림프구 집단.
- 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 림프구 집단.
- 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 단리된 γδ T 세포 집단.
- 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 γδ T 세포 집단.
- 청구항 61 내지 67 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 단리 및 증식된 림프구 집단.
- 청구항 61 내지 67 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리 및 증식된 림프구 집단.
- 청구항 61 내지 69 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 단리 및 증식된 γδ T 세포 집단.
- 청구항 61 내지 69 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 단리 및 증식된 γδ T 세포 집단.
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