JP5937003B2 - 免疫介在性疾患における臨床応用のための、抑制機能の高められた制御性ｔ細胞のエクスビボ増加方法 - Google Patents

Description

本発明は、制御性Ｔ細胞の抑制機能を高める方法に関する。具体的には、本発明は、制御性Ｔ細胞のエクスビボ増加方法であって、前記細胞が高い抑制特性を示す方法を提供する。

制御性Ｔ細胞、即ち、Ｔｒｅｇは、免疫系の活性化を抑制することによる自己抗原に対する寛容性の維持において重要であることが知られている。全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematous）、多発性硬化症、関節リウマチ、喘息、潰瘍性大腸炎、及びクローン病等の炎症性／自己免疫疾患を有する患者では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを発現させる転写因子Ｆｏｘｐ３の機能に欠陥があるか又は頻度が低下している。このような自己免疫疾患では、患者の免疫系は、細胞又は細胞の一部を患者自身として認識することができず、組織を破壊する。

関節リウマチ、喘息、及び移植片対宿主病（「ＧＶＨＤ」）を含むが、これらに限定されない様々な動物疾患モデルの治療において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの投与の治療効果が示されている。治療応用におけるＴｒｅｇの使用は、Ｔｒｅｇがヒトの末梢血単核細胞のほんの僅かな割合、約１〜２％しか存在しないので、問題となる。したがって、特定の疾患の治療において使用するためのＴｒｅｇのエクスビボにおける活性化及び増加、又は増殖方法が開発されている。

実施例１の集団由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ頻度を示すグラフ。 実施例２の精製ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを示すグラフ。 実施例３のＴｒｅｇ増加を示すグラフ。 Ｆｏｘｐ３を発現した実施例３のエクスビボで増加した細胞の割合を示すグラフ。 実施例４の増加したＴｒｅｇの阻害活性を示すグラフ。 実施例４の増加したＴｒｅｇの阻害活性を示すグラフ。

本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのエクスビボ増加方法、前記方法から得られる組成物、及び前記組成物の使用方法を提供する。前記方法を使用することにより得られる細胞は、新鮮Ｔｒｅｇ細胞と比べて、高い抑制活性を示す。本発明は、自己抗原又はアレルゲンに対する望ましくないヒトの免疫応答を阻害するために用いることができる、エクスビボで増加されたＴｒｅｇを生成する方法を提供する。更に、エクスビボで増加されたＴｒｅｇは、炎症性／自己免疫疾患の治療を提供することができる。

１つの実施形態では、本発明は、ａ）個体からＴ細胞集団を得ることと；ｂ）前記Ｔ細胞集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの亜集団を単離及び精製することと；ｃ）前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増加させることとを含む、から本質的になる、及びからなる方法であって、前記増加されたＴｒｅｇ細胞が、個体から新たに精製された増加されていないＴｒｅｇの集団に比べて高い抑制活性を示す方法を提供する。

全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）、多発性硬化症（「ＭＳ」）、喘息、関節リウマチ（「ＲＡ」）、クローン病（「ＣＤ」）、及び潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）を含むが、これらに限定されない自己免疫／炎症性疾患を有するヒトのＴｒｅｇは、同じヒトから新たに精製されたＴｒｅｇと比べたとき、高い抑制活性を示してＴ細胞の増殖を阻害することが本発明で見出された。Ｔｒｅｇは、向上された抑制機能を有しながら、エクスビボで１００〜１，０００倍に増加し得ることが本発明で見出された。

本発明の方法の最初の工程では、Ｔ細胞集団が得られる。Ｔ細胞は、個体の末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、又は骨髄を含むが、これらに限定されない任意の好適な源から得ることができる。好ましくは、Ｔ細胞は、ヒトの末梢血から得られる。より好ましくは、Ｔ細胞は、自己免疫／炎症性疾患を有する個体から得られ、最も好ましくは、寛解期であろうと、活動性である期間中であろうと、ＳＬＥ、ＭＳ、喘息、ＲＡ、ＣＤ、及びＵＣのうちの１つ以上を有する個体から得られる。最も好ましくは、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ ｒｅｇは、全血ユニット（whole blood units）又はｌｅｕｋｐａｋから精製される。

次いで、任意の都合のよい方法によって、フローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない、Ｔｒｅｇ特異的細胞マーカーに基づいた任意の都合のよい分離技術を用いてＴ細胞集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの亜集団が単離される。例えば、このような単離及び精製を実施するためのキットが多数市販されている。市販のキットとしては、ＡｕｏｔｍａｃｓのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｔｒｅｇキット、ＣｌｉｎＭＡＣＳ等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、４０％超がＦｏｘｐ３について陽性であり、かつ９０％超がＣＤ４について陽性である集団が得られるまで、単離及び精製を行う。

次いで、自己抗原特異的制御性Ｔ細胞刺激組成物を用いてＴｒｅｇ亜集団をエクスビボで増加させる。好ましくは、組成物は、抗原特異的に結合して、Ｔ細胞の受容体複合体を活性化させる。より好ましくは、増加は、有効量の第１及び第２の活性化剤及び共刺激剤活性化剤の存在下で実施される。有効量とは、制御性Ｔ細胞を所望の程度まで刺激するのに有効な量を意味する。

第１の活性化剤は、抗ＣＤ抗体等の抗原非特異的活性化剤、及びペプチドが自己免疫／炎症性疾患に関連するペプチドであるＭＨＣペプチドマルチマー等の抗原特異的活性化剤を含むが、これらに限定されない、多価抗体又はＴＣＲ／ＣＤ３のリガンドであってもよいＴＣＲ／ＣＤ３活性化剤である。好ましくは、ＴＣＲ／ＣＤ３活性化剤は、抗ＣＤ３抗体である。

組成物は、更なる好適な制御性Ｔ細胞刺激剤である第２の活性化剤を含む。この成分としては、インターロイキンを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、ＩＬ−２が用いられる。ＩＬ−２は、典型的に、組換え型で用いられ、約１，０００ＩＵ／ｍＬの量で用いられる。

ＴＣＲ共刺激剤に特異的な多価抗体又はリガンドは、共刺激剤活性化剤として用いることができる。好ましくは、共刺激剤活性化剤は、ＣＤ２８である。活性化剤は、ラパマイシン、Ｐ１３キナーゼ阻害剤、抗ＩＬ６等が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の添加剤を使用することによって強化することができる。

ＴＣＲ／ＣＤ３活性化剤及びＴＣＲ共刺激剤活性化剤は、好ましくは三次元固体表面上、より好ましくはビーズ上に固定化される。ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の好適なビーズが市販されている。Ｔｒｅｇのビーズに対する比は、好ましくは１：３である。最適なビーズの大きさは、効率的に抗体を集合させるのに必要な大きさに対する考慮に依存し、典型的には、直径約１〜１０マイクロメートルである。ビーズ表面上の抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の比は、約１〜２０又は約２０〜１で変化し得る。

増加は、少なくとも１００倍、好ましくは１，０００倍超に増加するように実施される。増加は、刺激及び培養の長さに依存する。しかし、培養に他の変更を行ってもよく、培養時間を更に長くしてもよいので、他の好ましくない因子を実質的に組み込むことなく大部分の細胞を得られる培養時間にしてもよい。

本発明は、以下の非限定的な実施例を考察することによって明確にされる。

（実施例１）
ＳＬＥ患者９人、ＲＡ患者７人、喘息患者７人、ＭＳ患者１０人、及びＣＤ患者７人、並びに自己免疫疾患ではない１１人から、各５０ｃｃの末梢血サンプル約５〜１０個を採取した。

前記サンプルの末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）からＣＤ４＋Ｔｒｅｇを単離し、精製した。Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた密度勾配遠心分離によって血液サンプルからＰＢＭＣを単離した。製造業者の説明書に従ってヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてａｕｔｏＭＡＣＳによりＰＢＭＣからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを精製した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δ及びＣＤ２３５ａに対するモノクローナル抗体の混合物で非ＣＤ４細胞を枯渇させることによって、先ずＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性単離した。次いで、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団から、抗ヒトＣＤ２５抗体がコンジュゲートしたマイクロビーズを用いてヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを陽性単離した。細胞内Ｆｏｘｐ３染色を用いてＦｏｘｐ３発現ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの頻度を評価し、フローサイトメトリーによって分析した。以下の図１に結果を示し、これは、各ヒトのＣＤ４＋プール集団におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの百分率を示す。

（実施例２）
ＳＬＥ患者９人、ＲＡ患者７人、喘息患者７人、ＭＳ患者８人、及びＣＤ患者７人、並びに自己免疫疾患ではない２５人から、各５０ｃｃの末梢血サンプル約５〜１０個を採取した。

前記サンプルのＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔｒｅｇを精製した。精製は、実施例１に記載の通り実施した。０日目における精製したＣＤ４＋Ｔｒｅｇの純度を細胞内Ｆｏｘｐ３染色を用いて評価し、フローサイトメトリーによって分析し、結果を図２のグラフに示す。精製した細胞の約４０〜７５％がＦｏｘｐ３を発現していた。

（実施例３）
ＳＬＥ、ＲＡ、喘息、ＭＳ、ＣＤ、及びＵＣ患者から各５０ｃｃの約５〜１０個の末梢血サンプルを採取した。前記サンプルのＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔｒｅｇを精製した。精製は、実施例１に記載の通り実施した。

１０００ＩＵ／ＭＩのヒトｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）の存在下で、１０％のプールしたヒトＡＢ血清（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ １５（商標）培地（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）中にて、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを培養した。更に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８をコーティングしたビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を、細胞対ビーズ比１：３で添加した。インキュベータ内で３７℃にて３週間培養した後、増加したＴｒｅｇは、図３のグラフに示すように、１００〜１，０００倍増加した、即ち、１０億個の細胞に達した。図４は、２週間目の細胞内染色によって、エクスビボで増加した細胞の平均４０〜５０％がＦｏｘｐ３を発現していたことを示すグラフである。

（実施例４）
実施例３のＴｒｅｇを、以下の通り標準化された抑制アッセイを用いて２週間目に評価した。抗ＣＤ３で刺激する培養では、同じドナー由来のアロジェニックなＣＤ４＋ＣＤ２５＋ヒトＴ細胞（５×１０^４細胞／ウェル）をレスポンダー細胞として用い、１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及びアロジェニックなヒト樹状細胞（１人のドナー由来、５×１０^３細胞／ウェル）及び段階希釈した増加Ｔｒｅｇを、トリプリケートで９６ウェルプレートに入れた。アロ抗原で刺激する培養では、１人のドナー由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ヒトＴｒｅｇ細胞（５×１０^４細胞／ウェル）、別のドナー由来の５×１０^３個のヒト樹状細胞、及び段階希釈した増加Ｔｒｅｇを、トリプリケートで９６ウェルプレートに入れた。

図５のグラフに示す結果は、エクスビボで増加されたヒトＴｒｅｇが、インビトロ機能アッセイでＴ細胞の増殖を阻害する強力な阻害活性を有していたことを示す。更に、Ｔｒｅｇの阻害活性は、同じヒトから新たに精製されたＴｒｅｇよりも高かった。この抑制活性を用いて、自己免疫／炎症性疾患における望ましくないヒトの免疫応答を阻害することができ、自己免疫／炎症性疾患に対する臨床的な治療の可能性をもたらす。

〔実施の態様〕
（１） ａ）全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、クローン病、又は潰瘍性大腸炎から選択される免疫介在性疾患の個体からＴ細胞集団を得ることと；ｂ）前記Ｔ細胞集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの亜集団を単離及び精製することと；ｃ）前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増加させることとを含む方法であって、前記増加されたＴｒｅｇ細胞が、前記個体から新たに精製された増加されていないＴｒｅｇの集団に比べて高い抑制活性を示す、方法。
（２） 前記増加が、約１００〜１，０００倍である、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記増加が、約３週間にわたって行われた、実施態様１に記載の方法。
（４） 免疫介在性疾患の個体を治療する方法であって、ａ）全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、クローン病、又は潰瘍性大腸炎から選択される免疫介在性疾患の個体からＴ細胞集団を得ることと；ｂ）前記Ｔ細胞集団からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの亜集団を単離及び精製することと；ｃ）前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増加させることと；ｄ）前記免疫介在性疾患の治療が施されるヒトにＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の一部を投与することとを含む、方法。
（５） 前記免疫介在性疾患が、全身性エリテマトーデスである、実施態様４に記載の方法。
（６） 前記免疫介在性疾患が、多発性硬化症である、実施態様４に記載の方法。
（７） 前記免疫介在性疾患が喘息、関節リウマチである、実施態様４に記載の方法。
（８） 前記免疫介在性疾患が、関節リウマチである、実施態様４に記載の方法。
（９） 前記免疫介在性疾患が、クローン病である、実施態様４に記載の方法。
（１０） 前記免疫介在性疾患が、潰瘍性大腸炎である、実施態様４に記載の方法。

Claims (5)

1. ａ）喘息のヒトの全血から得られたＴ細胞集団から、Ｆｏｘｐ３について４０〜７５％が陽性であり、ＣＤ４について９０％超が陽性である、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の亜集団を提供することと、
   ｂ）有効量の抗ＣＤ３抗体，抗ＣＤ２８抗体およびヒト組み替えＩＬ−２の存在下、前記ａ）の前記亜集団のＴｒｅｇ細胞を増加させることとを含む方法であって、
   前記増加されたＴｒｅｇ細胞が、前記ヒトから新たに精製された増加されていないＴｒｅｇ細胞の集団に比べて高い抑制活性を示す、エクスビボ方法。
2. 前記増加が、１００〜１，０００倍である、請求項１に記載の方法。
3. 前記増加が、２〜３週間にわたって行われた、請求項１に記載の方法。
4. 請求項１に記載の方法によって作製された、増加されたＴｒｅｇ細胞を含む、喘息の治療に使用するための、治療用組成物。
5. 喘息の治療のための医薬品の製造における、請求項１に記載の方法によって作製された、増加されたＴｒｅｇ細胞の使用。

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