JP2017148042A - Ｉｌ−１３産生ｔｒ１−様細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】ＩＬ−１３を産生し免疫抑制活性を有する、単離されたＴｒ１−様細胞集団、並びにその使用方法の提供。
【解決手段】ＩＬ−１０に加えＩＬ−１３を産生可能であって、ＣＤ４と低レベルのＣＤ１２７と低レベルのＣＤ６２Ｌを発現し、ＩＩ型コラーゲン、オボアルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質等の抗原に特異的であり、免疫反応、移植片対宿主病及び臓器拒絶反応、アレルギー疾患、炎症性疾患若しくは自己免疫状態を予防または治療に有効なヒトＴｒ１細胞集団の提供。
【選択図】なし

Description

本発明は、単離したＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞、その同定／分離／濃縮方法、及び、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患の診断又は治療方法のための方法及びキット、並びに、単離したＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を使用した臓器移植の条件に関する。

免疫系の恒常性は、自己抗原に対する侵入病原体及び免疫寛容に対する免疫応答の間のバランスに依存する。中枢及び末梢の両方のトレランスは、Ｔ細胞トレランスの誘発及び維持のための重要なメカニズムである。過去１０年間で、末梢免疫寛容の維持に重要な役割を果たす制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が注目されてきた。Ｔｒｅｇ細胞は、２つの異なるサブタイプ：天然のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）及び、ＴＧＦ−β誘発Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞又はＴｈ３細胞などの誘発可能なＴｒｅｇ細胞群に分けることができるということは、今はしっかりと確立されている。ｎＴｒｅｇは、主に、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞として記載され、一方、Ｔｒ１細胞は、ＩＬ−１０産生制御性Ｔ細胞として記載されている（Ａｌｌａｎら、２００８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ、２２３：３９１〜４２１）。ＦｏｘＰ３＋ｎＴｒｅｇは、ナイーブ及びメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞、Ｂ細胞、単球及び樹状細胞を含む様々な異なる免疫系細胞を調節／制御する。Ｔｒ１細胞は、ＩＬ−１０及び形質転換増殖β因子（ＴＧＦ−β）を分泌することにより免疫反応を調節し、ナイーブ及びメモリーの両方のＴ細胞応答を抑制する能力を有する。

クローン病を有する患者にＴｒ１細胞を注射すると患者の症状が回復したため、Ｔｒ１細胞は、細胞療法に有用であることが証明されている。しかしながら、Ｔｒ１細胞を使用したこの細胞治療の効果を改善する必要性は解消されていない。

驚くべきことに、発明者らは、ＩＬ−１３を産生可能なＴｒ１細胞の亜集団を発見した。発明者らは、これらの細胞は、Ｔｒ１細胞の特徴であるＩＬ−１０の抑制作用に加えて、ＩＬ−１３による抑制効果を有することが示された。

本発明の一つの目的は、単離されたＴｒ１−様細胞集団であり、好ましくは、単離されたヒトＴｒ１−様細胞集団であり、これはＩＬ−１３を産生することができる。一実施形態において、単離された本発明のＴｒ１−様細胞集団は、本発明において記載されるように、試験Ａの条件においてＩＬ−１３を産生することができる。本発明の一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は、低量のＩＬ−４を産生する。本発明の別の実施形態において、前記単離されたＴｒ−１様細胞集団は、以下を発現する：
−ＣＤ４及び
−低レベルのＣＤ１２７及び
−低レベルのＣＤ６２Ｌ。

本発明の別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１様細胞は休止細胞であり、低レベルのＣＤ２５及び低レベルのＦｏｘＰ３を発現する。本発明の別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は活性化され、ＣＤ２５及び中程度のレベルのＦｏｘＰ３を発現する。

本発明の別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞は抗原に特異的であり、好ましくは、抗原はＩＩ型コラーゲン、オボアルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質又はＨＳＰである。

本発明の一実施形態において、単離されたＴｒ１−様細胞集団は、Ｔｒ１−細胞集団であり、好ましくはヒトＴｒ１細胞集団であり、好ましくは試験Ａの条件においてＩＬ−１３を産生することが可能である。本発明の一実施形態において、本発明のＴｒ１−様細胞集団は、好ましくは本発明のＴｒ１細胞集団であり、好ましくは試験Ａの条件においてＩＬ−１０を産生する。

本発明の別の目的は、単離されたＴｒ１−様クローンであり、好ましくは単離されたヒトＴｒ１−様クローンであり、ＩＬ−１３を産生することができる。一実施形態において、本発明の単離されたＴｒ１−様クローンは、本発明において説明するように、試験Ａの条件においてＩＬ−１３を産生することができる。本発明の一実施形態において、前記単離したＴｒ１−様クローンは、低量のＩＬ−４を産生する。別の実施形態において、前記Ｔｒ１−様クローンは以下を発現する：
−ＣＤ４及び
−低レベルのＣＤ１２７及び
−低レベルのＣＤ６２Ｌ。

本発明の別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様クローンは、抗原に特異的であり、好ましくは、抗原はＩＩ型コラーゲン、オボアルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質又はＨＳＰである。

本発明の一実施形態において、単離したＴｒ１−様クローンは、Ｔｒ１クローンであり、好ましくはヒトＴｒ１クローンであり、試験Ａの条件においてＩＬ−１３を産生することができる。
本発明の一実施形態において、本発明のＴｒ１−様クローンは、好ましくは、本発明のＴｒ１クローンであり、試験Ａの条件においてＩＬ−１０を産生する。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団を同定する方法であり、以下の：
細胞集団上において、ＣＤ４の細胞表面発現とＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌマーカーの内の少なくとも一つの細胞表面発現とを検出することと、
ＩＬ−１３産生を検出することと、
を含み、ここで、ＣＤ４及び低レベルＣＤ１２７及び／又は低レベルＣＤ６２Ｌを発現し、且つ、ＩＬ−１３を産生する細胞が、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団である。

一実施形態において、本発明の方法は、単離されたヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団を同定するためのものであり、前記方法は、更に、ＩＬ−１０の産生を検出することを含む。

本発明の別の目的は、細胞集団においてＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を富化させるための方法であり、以下の：
ＣＤ４及び低レベルＣＤ１２７及び／又は低レベルＣＤ６２Ｌを発現し、且つ、ＩＬ−１３を産生する細胞を同定することと、
前記細胞を選択することと
を含み、それによって、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞に富んだ細胞集団を得られ、ここで、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合は、富化前のＩＬ−１３産生Ｔｒ−１様細胞の割合の少なくとも２倍である。

一実施形態において、本発明の方法は、細胞集団においてヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団を富化させるためのものであり、ここで前記方法は、更に、ＩＬ−１０産生の検出を含む。

本発明の別の目的は、本明細書中に上述した方法によって得られた、富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団である。本発明の一実施形態において、該集団は、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞に富む。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団、好ましくはヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団、を同定又は単離するためのキットであり、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの細胞表面発現を検出するための手段と、ＩＬ−１３の産生もしくはＩＬ−１０とＩＬ−１３の産生を検出するための手段とを含む。

本発明の別の目的は、単離された及び／又は富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団、好ましくは単離された及び／又は富化されたヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団、であるか、若しくはＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン、好ましくは、免疫反応、移植片対宿主病及び臓器拒絶反応、アレルギー性疾患、炎症性疾患又は自己免疫状態を防ぐ又は治療するためのヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１クローン、である。
本発明の別の目的は、細胞集団においてＩＬ−１３産生Ｔｒ１様細胞を減少させるための方法であり、この方法は：
−本明細書中で上述したように、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を同定することと、
−前記細胞を減少させることと、
を含み、これによって、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の減少した細胞集団が得られ、ここで、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合は、減少させる前のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合の少なくとも０．５倍である。

本発明の一実施形態において、本発明の方法は、細胞集団においてヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を減少させるためのものである。

本発明の別の目的は、本明細書中で上述した方法によって得られた、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を減少させた細胞集団である。本発明の一実施形態において、該減少させた細胞集団では、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞が減少している。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を減少させた細胞集団である。本発明の一実施形態において、それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための該減少させた細胞集団では、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞が減少している。

ＩＬ−１３によるＴ細胞増殖活性のＩｎ ｖｉｔｒｏでの阻害 組換え型ヒトＩＬ−１３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で活性化したヒトＰＢＭＣの培養物に添加した。３日間の培養後に、ＷＳＴ−１で生細胞を標識することにより細胞の増殖を評価した。 ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞による、Ｔ細胞増殖活性のＩｎ ｖｉｔｒｏでの阻害 パネルＡは、４８時間の間の抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体処置後におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１３産生調節性細胞のサイトカイン分泌パターンを示す。パネルＢは、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いて培養中で三日間刺激したヒトＰＢＭＣの増殖に対する、ＩＬ−１３活性化細胞の上澄み液の抑制ポテンシャルを示す。パネルＣは、抗ＩＬ１３阻害抗体の添加が、ＩＬ−１３産生調節性細胞の上澄み液の抑制作用を逆転させることができることを示す。 ヒトＩＬ−１３産生調節性細胞の表現型 フローサイトメトリー分析のために、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ又はＦｏｘＰ３に特異的な蛍光標識モノクローナル抗体を用いてヒトＩＬ−１３調節性細胞を染色した。細胞を、休止状態で、あるいはＩＬ−２及びＣＤ３＋ＣＤ２８刺激剤を用いた７日間の活性化の後に、分析した。 異なるＴｒ１クローンによる、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生 ２人の異なるドナー由来のヒトＴｒ１クローンを、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した。４８時間後、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−１３の産生を、ＥＬＩＳＡ法により上澄み液中で測定した。結果は、試験した２人の異なるドナーにおいて、いくつかのクローンがＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを産生できるがＩＬ−１３を産生できない一方で、その他のクローンが三種のサイトカインを産生することができることを示す。

本発明は、免疫抑制能力を有する、新規の単離したＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団及びその使用を提供する。発明者らは、これらの細胞が、Ｔｒ１細胞よりも同じ表面マーカーを表すためＴｒ１−様細胞であること、及び、これらの細胞がＩＬ−１３及び低レベルのＩＬ−４を産生することが可能であることを発見した。発明者らは、それらの免疫抑制能力が、部分的にＩＬ−１３によって媒介されることを発見した。更に、これらのＴｒ１−様細胞の内のいくつかはまた、ＩＬ−１０を産生することができる。従って、発明者らは、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生することができるこれらの細胞は、Ｔｒ１細胞の亜集団であることを提示する。

発明者らは、驚くべきことに、このＴｒ１細胞の亜集団が促進された免疫抑制効果を有することを発見し、これは細胞療法における大きな関心事である。

理論に束縛されることをいとわずに、発明者らは、前記促進された免疫抑制効果は、標的細胞におけるＩＬ−１０及びＩＬ−１３の異なり且つ補完的な効果によるものであり得ることを示している。例えば、Ｍｉｎｔｙら（Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９７；８（２）：１８９−２０１）は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０が活性化単球の異なるサイトカイン分泌プロファイルを誘発したことを示した。

本発明の一つの目的は、好ましくは試験Ａの条件において、ＩＬ−１３を産生することができる単離されたＴｒ１−様細胞集団である。好ましくは、単離されたＴｒ１−様細胞集団は、ヒト細胞集団である。

本明細書中で使用されるように、用語「ＩＬ−１３」は、インターロイキン１３を指す。

本明細書中で使用される場合、用語「ＩＬ−１３産生」は、５０ｐｇ／ｍｌ超、好ましくは培養培地中において１００ｐｇ／ｍｌ超、より好ましくは２００ｐｇ／ｍｌ超、更により好ましくは５００ｐｇ／ｍｌ超、更により好ましくは約１，０００、２，０００、４，０００、６，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１６，０００、１８，０００、又は２０，０００ｐｇ／ｍｌ超であるか、それよりも多い、ＩＬ−１３の分泌量を指す。別の方法では、それは、２５０ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、好ましくは、５００ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、より好ましくは、１０００ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、のＩＬ−１３の分泌量を指す。本明細書において使用される場合、数字の前に用いられる用語「約」は、前記数字の値のプラスマイナス１０％を意味する。

本発明の一実施形態において、本発明のＴｒ１−様細胞は、好ましくは試験Ａの条件において、ＩＬ−１０を産生するためＴｒ１細胞である。

本明細書中で使用されるように、用語「ＩＬ−１０」は、インターロイキン１０を指す。

本発明の一実施形態において、本発明のヒトＴｒ１細胞は、高レベルのＩＬ−１０を産生する。

本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ−１０産生」は、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地中において少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは培養培地中において少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌ、典型的には、約１，０００、２，０００、４，０００、６，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００、１４，０００、１６，０００、１８，０００又は２０，０００ｐｇ／ｍｌ超であるか、またはそれよりも多い、ＩＬ−１０の分泌量を指す。別の方法において、それは、２５０ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、好ましくは５００ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、より好ましくは１０００ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、のＩＬ−１０の分泌量を指す。

本発明の一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は、好ましくは試験Ａの条件において、低量のＩＬ−４を産生する。

本明細書中で使用されるように、用語「ＩＬ−４」は、インターロイキン４を指す。

本明細書中で使用されるように、用語「低量のＩＬ−４」は、５００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは２５０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ未満の量を指す。

あるいは、用語「低量のＩＬ−４」は、２０００ｐｇ未満／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、好ましくは１０００ｐｇ未満／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、より好ましくは５００ｐｇ未満／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、更により好ましくは１００ｐｇ未満／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、のＩＬ−４の量を指す。

本発明の一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は、好ましくは試験Ａの条件において、中程度のレベルのＴＧＦ−βを産生する。

本明細書中で使用されるように、用語「ＴＧＦ−β」は、トランスフォーミング増殖因子βを指す。

本明細書で使用される場合、用語「中程度のレベルのＴＧＦ−β」は、少なくとも約１００ｐｇ／ｍｌ、典型的には約２００、３００、４００、６００、８００又は１０００ｐｇ／ｍｌ超であるか、またはそれよりも多い、ＴＧＦ−βの量を指す。

別の方法においては、それは、少なくとも約４００ｐｇ／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、典型的には、約８００、１２００、１６００、２４００、３２００、又は、４０００ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞であるか、またはそれよりも多い、ＴＧＦ−βの量を指す。

本発明の一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は、好ましくは試験Ａの条件において、中程度のレベルのＩＦＮ−γを産生する。

本明細書で使用されるように、用語「ＩＦＮ−γ」は、インターフェロンγを指す。

本明細書で使用される場合、用語「中程度のレベルのＩＦＮ−γ」は、０．１ｐｇ／ｍｌ〜少なくとも４００ｐｇ／ｍｌ、典型的には６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００ｐｇ／ｍｌ超またはそれよりも多い、の間に含まれるＩＦＮ−γの量を指す。

あるいは、用語「中程度のレベルのＩＦＮ−γ」は、０．４ｐｇ／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞〜少なくとも１６００ｐｇ／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、典型的には約２４００、３２００、４０００、４８００、５６００、６４００、７２００、又は８０００ｐｇ超／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞またはそれよりも多い、の間に含まれるＩＦＮ−γの量を指す。

本発明の一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は、好ましくは試験Ａの条件において、低量のＩＬ−２を産生する。

本明細書で使用されるように、用語「ＩＬ−２」は、インターロイキン２を指す。

本明細書で使用される場合、用語「低量のＩＬ−２」は、約５００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２５０、１００、７５、又は５０ｐｇ／ｍｌ未満であるか、またはそれよりも少ない、量を指す。

あるいは、それは、約２０００ｐｇ未満／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、好ましくは約１０００、４００、３００、又は２００ｐｇ未満／１０^６個のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞であるか、またはそれよりも少ない、ＩＬ−２の量を指す。

本発明の一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞集団は、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１集団であり、これは、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、中程度のレベルのＩＦＮγ及びＴＧＦβ並びに低量のＩＬ−４及び／又はＩＬ−２を産生する。本実施形態によると、単離されたＴｒ１−様細胞集団は、発明者らが、Ｔｒ１細胞は試験Ａの条件においてＩＬ−１３を産生し得るか、又はし得ないことを示したように（実施例参照）、ヒトＴｒ１細胞の亜集団である。

細胞が、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０の産生、中程度のレベルのＩＦＮγ及びＴＧＦβの産生、及び、低量のＩＬ−４及び／又はＩＬ−２の産生が可能か否かを評価するための方法は、当業者に周知である。

本発明において定義する試験Ａは、本明細書の以下に説明し、試験Ａの条件において細胞を培養することにより、サイトカイン産生の判断をすることができる。試験Ａは、一つ以上のＴＣＲ活性化剤を用いた細胞の活性化に対応する。

一実施形態において、ＴＣＲ活性化剤は、抗−ＣＤ３＋抗−ＣＤ２８抗体又はインターロイキン２、ＰＭＡ＋イオノマイシンなどの、Ｔリンパ球の多クローン性活性化因子である。

別の実施形態において、ＴＣＲ活性化剤は、抗原提示細胞によって提示された抗原である。

例えば、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ又はＤＭＥＭ培地中の１ １０^６個の細胞は、４８時間の間、一つ以上のＴＣＲ活性化剤の存在下で活性化する。培地を次に採取し、サイトカイン産生を当技術分野で公知な方法により測定した。

これらの方法の一例は、以下のようなものである：細胞を、抗−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）及び抗−ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）存在下で４８時間の間活性化し、サイトカイン分泌は、この時点でＥＬＩＳＡ法又はＦＡＣＳ法により測定する。

本発明の別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞は、その表面に、ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及び低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する。
一実施形態において、前記単離されたＴｒ１細胞の亜集団は、その表面に、ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及び低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する。

一実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞は、休止しており、その表面にＣＤ２５を発現しない。一実施形態において、前記単離されたＴｒ１細胞の亜集団は、休止しており、その表面にＣＤ２５を発現しない。

別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１−様細胞は、活性化されており、その表面にＣＤ２５を発現する。別の実施形態において、前記単離されたＴｒ１細胞の亜集団は、活性化されており、その表面にＣＤ２５を発現する。

本明細書中で使用されるように「単離した」は、その天然の環境（例えば、抹消血など）から取り除かれた細胞又は細胞集団、及び、単離され、精製又は分離された細胞又は細胞集団を指し、天然に存在するものを含む他の細胞から、少なくとも約７５％存在しない、８０％存在しない、８５％存在しない、及び、好ましくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％存在しないが、細胞が単離されたかどうかに基づく細胞表面マーカーが欠如している。

本明細書中で使用されるように、用語「細胞表面マーカー」は、細胞集団を指定するために使用することができる細胞表面上のタンパク質、炭水化物又は脂質を指す。

本明細書中で使用されるように、用語「発現」は、互換的に、遺伝子又は遺伝子生成物の発現を指し、エンコードされたポリペプチド又はタンパク質を含む。遺伝子生成物の発現は、例えば、ポリペプチドと結合した抗体を使用する免疫測定法により決定し得る。或いは、遺伝子の発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ｑＰＣＲ法などのｍＲＮＡレベルの測定により決定し得る。

用語「ナイーブ」は、当該技術分野において公知であり、未だ特定の抗原に遭遇していない免疫細胞又は細胞の集団を指す。

用語「休止」は、当該技術分野において公知であり、増殖しない免疫細胞又は細胞集団を指し、サイトカインを産生せず、且つ、表面にＣＤ２５などの従来の免疫細胞活性化分子を発現しない。

用語「活性化した」は、当該技術分野において公知であり、増殖する、及び／又はサイトカインを産生する免疫細胞又は細胞集団を指し、表面にＣＤ２５などの従来の免疫細胞活性化分子を発現する。

特にＴリンパ球について、休止から活性化状態への経路は、その特定の抗原とＴ細胞との遭遇又はサイトカイン若しくはマイトジェンの活性化を用いた活性化によって媒介される

ＣＤ１２７^ｌｏ／−、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−、又はＣＤ２５^ｌｏ／−について使用される用語「ｌｏｗ（低い）」又は「ｌｏ（低い）」又は「ｌｏ／−（低い／−）」は、当該技術分野において公知であり、対象とする細胞マーカーの発現レベルを指し、この場合、細胞マーカーの発現レベルは、全体として分析される細胞集団における細胞マーカーの発現レベルと比較すると低い。より具体的には、用語「ｌｏ（低い）」は、一つ以上の他の個別の細胞集団よりも、低いレベルで細胞マーカーを発現する個別の細胞集団を指す。

用語「ｈｉｇｈ（高い）」又は「ｈｉ（高い）」又は「ｂｒｉｇｈｔ（鮮やかな）」は、当該技術分野において公知であり、対象とする細胞マーカーの発現レベルを指し、この場合、細胞マーカーの発現レベルは、全体として分析される細胞集団における細胞マーカーの発現と比較して高い。

用語「＋」及び「−」は、当該術分野で公知であり、対象とする細胞マーカーの発現レベルを指し、この場合、「＋」に相当する細胞マーカーの発現レベルは、高いか又は中間であり、「−」に相当する細胞マーカーの発現レベルは、低いか又はゼロである。一般的に、染色強度の上位２、３、４又は５％の細胞が「ｈｉ（高い）」と指定されており、集団の上位半分に該当するものが「＋」として分類される。蛍光強度の５０％未満に該当する細胞が「ｌｏ」細胞として、５％未満のものが「−」細胞として指定される。

本明細書中において使用される場合、用語「ＣＤ１２７」は、細胞表面に存在する「インターロイキン−７受容体」（ＩＬ−７Ｒ）を指す。ＩＬ−７受容体α鎖は、文献（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｔｈら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：９４１〜９５１）に記載されている。ＩＬ−７Ｒはまた、該文献において、ＣＤ１２７とも呼称される。ＣＤ１２７^＋は、ＣＤ１２７に向けたラベルされた抗体で処理した場合に中間程度に又は鮮やかに染色される細胞を指す。ＣＤ１２７^ｌｏ／−は、ラベルされたＣＤ１２７抗体と接触しても、僅かに／鈍く、又は全く染色されないタイプの細胞を指す。一般的に、細胞は、当業者に知られているように、容易に認識できる染色強度の差に基づいて、それらのＣＤ１２７発現レベルによって識別される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２７^ｌｏ／−細胞として細胞を指定するためのカットオフは、全ての細胞について観察された蛍光強度分布の観点から設定することができ、蛍光強度の５０％、４０％、３０％又は２０％未満に該当する細胞がＣＤ１２７^ｌｏ／−細胞として指定される。ＣＤ１２７⁻細胞は、蛍光強度についてボトムの１０パーセンタイル未満に該当する細胞として指定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２７染色の頻度分布は、全ての細胞に対して得られ、集団曲線はより高い染色集団及びより低い染色集団に適合し、細胞は、それらが最も統計的に、それぞれの集団分布の統計的分析の観点から属している集団に割り当てられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２７^ｌｏ／−細胞は、ＣＤ１２７^＋細胞よりも２〜３倍低い強度で染色する。

本明細書で使用するように、用語「ＣＤ６２Ｌ」は、リンパ球移動のための重要な接着分子であるＬ−セレクチンを指す。ＣＤ６２Ｌ^＋は、ＣＤ６２Ｌに向けられたラベルされた抗体で処理された場合に中間程度に又は鮮やかに染色される細胞を指す。ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−は、ラベルされたＣＤ６２Ｌ抗体と接触しても、僅かに／鈍く、又は全く染色されないタイプの細胞を指す。一般的に、細胞は、当業者に知られているように、容易に認識できる染色強度の差に基づいて、それらのＣＤ６２Ｌ発現レベルによって識別される。いくつかの実施形態において、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−細胞として細胞を指定するためのカットオフは、全ての細胞について観察された蛍光強度分布の観点から設定することができ、蛍光強度の５０％、４０％、３０％又は２０％未満に該当する細胞がＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−細胞として指定される。ＣＤ６２Ｌ⁻細胞は、蛍光強度についてボトムの１０パーセンタイル未満に該当する細胞として指定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ６２Ｌ染色の頻度分布は、全ての細胞に対して得られ、集団曲線はより高い染色集団及びより低い染色集団に適合し、細胞は、それらが最も統計的に、それぞれの集団分布の統計的分析の観点から属している集団に割り当てられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋細胞よりも２〜３倍低い強度で染色する。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ４」は、典型的には成熟したヘルパーＴ細胞及び未熟胸腺細胞ならびに単球及びマクロファージ上に見出される細胞表面糖タンパク質を指す。Ｔ細胞において、ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体であり、チロシンキナーゼｌｃｋをリクルートする。そのＤ１部分を用いて、ＣＤ４は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のβ２−ドメインと接続することができる。ＣＤ４^＋は、ラベルされた抗ＣＤ４抗体と接触すると鮮やかに染色する細胞を指し、ＣＤ４⁻は、蛍光的にラベルされたＣＤ４抗体と接触すると、ほとんど鮮やかではない、鈍いか、又は全く染色しないタイプの細胞を指す。一般的に、ＣＤ４染色は明らかに二峰性であるため、細胞は、容易に認識できる染色強度の差に基づいて、それらのＣＤ４発現レベルによって識別される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４染色の頻度分布は、全ての細胞に対して得られ、集団曲線はより高い染色集団及びより低い染色集団に適合し、細胞は、それらが最も統計的に、それぞれの集団分布の統計的分析の観点から属している集団に割り当てられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ４⁻細胞は、ＣＤ４^＋細胞よりも２〜３倍低い強度で染色する。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ２５」は、５５ｋＤの分子量を有する単鎖糖タンパク質であるインターロイキン−２受容体のαサブユニットを指す。モノカインインターロイキン−１の存在下における抗原またはマイトジェンでのＴ細胞の活性化に続いて、インターロイキン２（ＩＬ−２）が迅速に合成及び分泌される。これに応答して、Ｔ細胞の亜集団は、ＩＬ−２に対する高親和性受容体を発現する。これらの細胞は増殖し、ヘルパー機能、サプレッサー機能及び細胞毒性機能を媒介することができるＴ細胞集団を増殖させる。ＩＬ−２受容体は、Ｔ細胞上に独特に見出される訳ではない。ＣＤ２５^ｈｉは、ラベルされた抗ＣＤ２５抗体と接触すると鮮やかに染色する細胞を指し、ＣＤ２５^＋は、ラベルされた抗ＣＤ２５抗体と接触するとそれよりも低度の鮮やかさで染色する細胞を指し、ＣＤ２５^ｌｏ／―は、ラベルされたＣＤ２５抗体と接触すると、最も鮮やかさが低い、つまり鈍いか、又は全く染色しないタイプの細胞を指す。一般的に、細胞は、当業者に知られているように、容易に認識できる染色強度の差に基づいて、それらのＣＤ２５発現レベルによって識別される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５発現カテゴリｈｉ、＋、ｌｏ又は−細胞として、細胞を指定するためのカットオフは、全ての細胞について観察された蛍光強度分布の観点から設定することができる。一般的に、染色強度の上位２、３、４又は５％の細胞が「ｈｉ」として指定され、集団の上位半分に該当するものが「＋」として分類される。蛍光強度の５０％未満に該当する細胞がＣＤ２５^ｌｏ細胞として、５％未満のものがＣＤ２５⁻細胞として指定される。

前記Ｔｒ１様細胞は、このように、それらの細胞表面マーカー及びそれらのＩＬ−１３を産生する能力により、操作可能に特徴付けられる。前記Ｔｒ１細胞の亜集団は、このように、それらの細胞表面マーカー及びそれらのＩＬ−１３並びにＩＬ−１０を産生する能力により、操作可能に特徴付けられる。これらの細胞表面マーカーは、特に、細胞表面マーカーに結合する試薬によって識別することができる。例えば、Ｔｒ１細胞上のタンパク質、炭水化物、又は脂質は、免疫学的に特定のタンパク質や炭水化物に特異的な抗体によって認識することができる（マーカーに対する抗体の使用のために、抗体を使用するＨａｒｌｏｗを参照されたい：また、例えば実験室マニュアル（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９９９）も参照されたい）。Ｔｒ１−様細胞の表面上に存在するマーカーのセット及びこれらの細胞の表面に存在しないマーカーのセットは、Ｔｒ１−様細胞に対して特徴的である。従って、Ｔｒ１−様細胞は、細胞表面マーカーを使用して、陽性及び陰性の選択により選択することができる。Ｔｒ１−様細胞により発現した細胞表面マーカーに結合する試薬である、「陽性マーカー」は、Ｔｒ１−様細胞の陽性選択のために使用することができる（即ち、細胞表面マーカーを発現する細胞を保持している）。逆に、陰性選択は、特定の細胞表面マーカーが、Ｔｒ１−様細胞により発現していないという事実に依存する。従って、「陰性マーカー」（即ち、Ｔｒ１−様細胞の細胞表面上に、マーカーが存在しない）は、陰性マーカーについて特異的である試薬と結合する細胞の除去によるＴｒ１−様細胞ではない集団における、これらの細胞の除去に使用することができる。

一実施形態において、細胞表面マーカーの検出された発現に基づく細胞間の識別は、細胞表面マーカーの発現と、対照の細胞集団による平均発現とを比較することにより生じる。例えば、Ｔｒ１−様細胞上のマーカーの発現は、Ｔｒ１−様細胞と同じサンプル由来の他の細胞における同じマーカーの平均の発現と比較することができる。マーカー発現による細胞間の識別の他の方法は、試薬の組み合わせを使用するフローサイトメトリーによる細胞のゲーティングを含む（Ｇｉｖａｎ Ａ， Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２）； Ｏｗｅｎｓ Ｍ Ａ ＆ Ｌｏｋｅｎ Ｍ Ｒ．， Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５）を参照）。

「試薬の組み合わせ」によりは、Ｔｒ１様細胞の表面上に存在するか（ポジティブマーカー）若しくは存在していないか（ネガティブマーカー）のいずれかの細胞表面マーカーに結合する、又は、ポジティブ及びネガティブマーカーの組み合わせに結合する少なくとも二つの試薬を意味する。例えば、Ｔｒ１−様細胞表面マーカーに特異的な抗体の組み合わせの使用は、様々なサンプル／組織からのＴｒ１−様細胞の単離及び／又は濃縮をもたらす。

本発明による「抗−Ｘ線抗体」又は「Ｘ線抗体」は、特にＸに結合できる抗体である。例えば、抗−ＣＤ１２７抗体又はＣＤ１２７抗体は、ＣＤ１２７と結合することができる。本発明による使用のための抗体は、組換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト又は霊長類モノクローナル抗体、及び抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない。非常に多くのリンパ球バイオマーカーに特異的な抗体が市販されている。これらは、抗−ＣＤ１２７、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ６２Ｌ、抗−ＣＤ２５、抗−ＩＬ−４、抗−ＩＬ−１０及び抗−ＩＬ−１３抗体を含む（Ｒ＆Ｄ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。「抗体」は、特に、抗原に結合し且つ識別する、免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントからの骨組み領域を含むポリペプチドを指す。識別された免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子と同様に無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、順番にそれぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。典型的に、抗体の抗原−結合領域は、結合の特異性及び親和性において最も重要となる。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の同一の二つのペアから構成され、各ペアは、一つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び一つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、約１００〜１１０以上の抗原識別に主に関与するアミノ酸を定義する。用語、可変的な軽鎖（ＶＬ）及び可変的な重鎖（ＶＨ）は、それぞれ軽鎖及び重鎖のものを指す。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、又は、様々なペプチダーゼによる消化によって産生された、多数の良く特徴付けられたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、Ｆ（ａｂ）’２を産生するヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下の抗体を消化し、それ自身が軽鎖であるＦａｂの二量体は、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合している。Ｆ（ａｂ）’２は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を壊すために、穏やかな条件下で還元し得、それにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’一量体へ変換する。Ｆａｂ’一量体は、本質的にヒンジ領域を備えるＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｐａｕｌ ｅｄ．， ３ｄ ｅｄ． １９９３）を参照）。完全抗体の消化の観点から、様々な抗体フラグメントが定義される一方、当業者は、そのようなフラグメントが、化学的に、又はＤＮＡ方法論を用いて、新たに合成され得ることを理解するであろう。従って、抗体という用語はまた、本明細書で使用されるように、抗体全体の修飾により産生されたか、組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成されたかのいずれかによる抗体フラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ）、又は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体フラグメント（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４ （１９９０）を参照）を含む。いくつかの実施形態において、標的の高親和性リガンドは、抗体の代わりに使用され得る。タンパク質又はペプチドについて言及する場合、抗体へ「特異的（又は選択的）結合する」又は、「特異的（又は選択的）免疫反応性」という語句は、多くの場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団においてタンパク質の存在を判断する、結合反応を指す。そのような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質へのその特異性により選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であるが、他のタンパク質とは免疫反応性ではない免疫反応ポリクローナル抗体のみを得るように選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り去ることにより達成され得る。

好ましくは、「ラベル」又は「検出可能な部分」は、抗体に共有結合的に又は非共有結合的に結合している。ラベルは、分光、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能であり得る。特に有用なラベルは、蛍光染料である。抗体へラベルを取り付ける方法は、当業者に公知である。特に好ましいラベルは、生理的条件下で所定の酵素との接触により、容易に切断又は分離又は加水分解を受けることが可能なリンカーにより、抗体に結合しているものである。抗体はまた、常磁性マイクロビーズなどの磁性粒子と結合させることができる（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。磁気的にラベルした抗体によって結合された活性化したＴ細胞は、磁気細胞選別を含むがそれに限定されない技法を使用して単離され得る。ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４及びＣＤ２５並びに多くの他の分化クラスターへ適切にラベルされた抗体は、市販されており、当業者に知られている。抗体は、サンプルとの接触前若しくは後に、又は、ＣＤとの接触前若しくは後に、ラベルされ得る。ＣＤ抗体は、ＣＤ−抗体に結合するラベルされた抗体との接触により、ラベルされ得る。本明細書中で使用されるように、用語「ＣＤ」又は「分化クラスター」又は「共通の決定要因」は、抗体により識別される細胞表面分子を指す。

本発明の一実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団は休止しており、且つ、細胞は、低レベルのＦｏｘＰ３を発現する。一実施形態において、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞亜集団は休止しており、且つ、細胞は低レベルのＦｏｘＰ３を発現する。

本発明の別の実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団は活性化され、細胞は、中程度のレベルのＦｏｘＰ３を発現する。一実施形態において、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞亜集団は活性化され、且つ、細胞は、中程度のレベルのＦｏｘＰ３を発現する。

本明細書で使用されるように、用語「ＦｏｘＰ３」は、転写因子として作用すると考えられている核タンパク質ＦｏｘＰ３を指す（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｙａｓａｙｋｏ， Ｊ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２７：６８−７３ （２００１）； Ｆｏｎｔｅｎｏｔ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：３３０−３３６ （２００３）； Ｋｈａｔｔｒｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：３３７−３４２ （２００３））。細胞内に配置されると、Ｆｏｘｐ３発現はラベルされた抗Ｆｏｘｐ３の抗体を用いた細胞内フローサイトメトリーにより評価することができる（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎｃ ｏｒ ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

本発明の別の目的は、単離されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を含む組成物、単離されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞から本質的に成る又は成る組成物である。

本発明の別の目的は、単離されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を含む組成物、単離されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞から本質的に成る又は成る組成物である。

本発明の一実施形態において、Ｔｒ１細胞又はＴｒ１−様細胞の亜集団は、抗原に特異的であるか、複数の抗原に特異的である。

それに対してＴｒ１細胞又はＴｒ１−様細胞の亜集団が特異的である可能性がある抗原の例は、自己抗原；一般的なヒトの食餌からの食物抗原；多発性硬化症関連抗原又は関節関連抗原などの炎症性抗原；及びアレルゲンを含むが、これらに限定されない。

用語「一般的なヒトの食餌からの食物抗原」は、免疫原性ペプチドを指し、これは、以下の非限定的なリストの食物抗原など、ヒトに一般的な食品に由来する：リポカリンなどのウシ抗原、Ｃａ結合Ｓ１００、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンなどのラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、カゼイン。食物抗原はまた、パルブアルブミンなどの大西洋サケ抗原；オボムコイド、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチーム又はニワトリ血清アルブミンなどのニワトリ抗原；ピーナッツ；トロポミオシンなどのエビ抗原；アグルチニン又はグリアジンなどのコムギ抗原、セロリプロフィリンなどのセロリ抗原；ニンジンプロフィリンなどのニンジン抗原；ソーマチン、リンゴ脂質転送蛋白質、リンゴプロフィリンなどのリンゴ抗原；ナシプロフィリン、イソフラボンレダクターゼなどのナシ抗原；エンドキチナーゼなどのアボカド抗原；アプリコット脂質転移タンパク質などのアプリコット抗原；モモ脂質転移タンパク質又はモモプロフィリンなどのモモ抗原；ＨＰＳ、ダイズプロフィリン又は（ＳＡＭ２２）ＰＲ−Ｉ０ｐｒｏｔなどのダイズ抗原であり得る。

用語「自己抗原」は、前記個々のタンパク質由来の免疫原性ペプチドを指す。それは、例示として、以下の非限定なリストの自己抗原であり得る：アセチルコリン受容体、アクチン、アデニンヌクレオチド輸送体、アドレナリン受容体、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、アシアロ糖タンパク質受容体、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、カルシウム感知受容体、コレステロール側鎖切断酵素、コラーゲンＩＶ型鎖、シトクロムＰ４５０ ２Ｄ６、デスミン、デスモグレイン１、デスモグレイン−３、Ｆ−アクチン、ＧＭ−ガングリオシド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、グルタミン酸受容体、Ｈ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、１７−ヒドロキシラーゼ、２１−ヒドロキシラーゼ、ＩＡ−２（ＩＣＡＳ１２）、インスリン、インスリン受容体、内因性因子１型、白血球機能抗原１、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、ミオシン、Ｐ８０−ｃｏｉｌｉｎ、ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体Ｅ２（ＰＤＣ−Ｅ２）、ヨウ化ナトリウム共輸送体、ＳＯＸ−１０、甲状腺及び目の筋肉共有タンパク質、サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、甲状腺刺激ホルモン受容体、組織トランスグルタミナーゼ、転写コアクチＰ７５、トリプトファン水酸化酵素、チロシナーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＣＴＨ、アミノアシル−ｔＲＮＡ−ヒスチジル−合成酵素、カルジオリピン、炭酸脱水酵素ＩＩ、セントロメア関連タンパク質、ＤＮＡ依存性ヌクレオソーム刺激ＡＴＰアーゼ、フィブリラリン、フィブロネクチン、グルコース６リン酸イソメラーゼ、β２−グリコプロテインＩ、ｇｏｌｇｉｎ（９５、９７、１６０、１８０）、熱ショックタンパク質、タンパク質半接着斑性ｌ１８０、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、ケラチン、ＩｇＥ受容体、ＫＵ−ＤＮＡタンパク質キナーゼ、Ｋｕ核タンパク質、Ｌａリン酸化、ミエロパーオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、ＲＮＡポリメラーゼＩ〜ＩＩＩ、シグナル認識タンパク質、トポイソメラーゼＩ、チューブリン、ビメンチン、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１１）、環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ＢＰの抗原１（ＢＰＡＧ１−ｅ）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、ヒトミトコンドリア自己抗原ＰＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ１及び２）、ＯＧＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ ３）、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ ４）、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）１８０、ラミニン５（ＬＮ５）、ＤＥＡＤ−ボックスタンパク質４８（ＤＤＸ４８）又はインスリノーマ関連抗原−２。

用語「多発性硬化症関連抗原」は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイトオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／Ｃｌａｕｄｉｎｌ１）、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ＮＯＧＯ Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリン蛋白質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’−環状ヌクレオチド３”−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、フラグメント、それらの変異体及び混合物を指す。

用語「関節関連抗原」は、シトルリン置換環状及び線状フィラグリンペプチド、コラーゲンＩＩ型ペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ Ｂｌ、ｈｎＲＮＰ Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＨＳＰ６０、６５、７０、９０、ＢＩＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ型ペプチド、アネキシンＶ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、アセチル−カルバスタチン、ピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、アニオン性カルジオリピン及びホスファチジルセリンを含むリン脂質抗原、中立的に荷電したホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリン、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリリン、アグリカンを指す。

用語「アレルゲン」は、吸入されたアレルゲン、摂取されたアレルゲン又は接触したアレルゲンを指す。アレルゲンの例は、花粉（Ｃｕｐ、Ｊｕｎ）、室内塵性ダニ類（Ｄｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｐ）、イヌ、ネコ及びげっ歯類（Ｃａｎ、Ｆｅｌ、Ｍｕｓ、Ｒａｔ）由来の吸入されたアレルゲンを含むがそれらに限定されない。接触したアレルゲンの例は、重金属（例えば、ニッケル、クロム、金など）、ラテックス、ハロタンやヒドララジンなどのハプテンを含むがそれらに限定されない。

本発明の一実施形態において、それに対してＴｒ１細胞の亜集団又はＴｒ１−様細胞集団が特異的である抗原はＨＳＰであり、好ましくはＨＳＰ６０である。

本発明の別の目的は、
細胞集団上において、ＣＤ４の細胞表面発現とＣＤ１２７およびＣＤ６２Ｌの内の一つの細胞表面発現とを検出することと、
例えば試験Ａの条件において、ＩＬ−１３の産生を検出することと、
（ここで、ＣＤ４（即ち、ＣＤ４^＋である）及び低レベルのＣＤ１２７及び／又は低レベルのＣＤ６２Ｌ（即ち、ＣＤ１２７^ｌｏ／−及びＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−）を発現する細胞であってＩＬ−１３を産生する細胞が、ＩＬ−１３産生Ｔｒ−１様細胞である）
前記細胞を同定／単離／定量することと、
を含む、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団を同定／単離／定量する方法である。

本発明の別の目的は、
細胞集団上において、ＣＤ４の細胞表面発現とＣＤ１２７およびＣＤ６２Ｌの内の一つの細胞表面発現とを検出することと、
例えば試験Ａの条件において、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生を検出することと、
（ここで、ＣＤ４（即ち、ＣＤ４^＋である）及び低レベルのＣＤ１２７及び／又は低レベルのＣＤ６２Ｌ（即ち、ＣＤ１２７^ｌｏ／−及びＣＤ６２Ｌ^ｌｏ／−）を発現し、かつＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生する細胞が、Ｔｒ−１細胞の亜集団である）
前記細胞を同定／単離／定量することと、
を含む、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の亜集団を同定／単離／定量する方法である。

本明細書で上述したように、ＣＤ４、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの細胞表面発現は、抗体である、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ６２Ｌ、及び抗−ＣＤ１２７を使用して検出され得る。

ＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生の検出は、当業者に公知の他の手段によって実施され得る。

例えば、ＩＬ−１３又はＩＬ−１０産生を検出するための第一の方法は、事前に透過処理を行ったＴ細胞の細胞内染色について、その染色をＦＡＣＳによって読み取らせるために、ラベルされた抗ＩＬ−１３抗体又は抗ＩＬ−１０の使用に依存している。

ＩＬ−１３又はＩＬ−１０産生を検出するための方法の他の例は、ラベルされた抗−ＩＬ１３又は抗−ＩＬ−１０抗体を用いて実施されるＥＬＩＳＡ試験に依存する。

最後に、ＩＬ−１３の産生を検出するための別の例は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社により商品化されたＩＬ−１３分泌アッセイキット（１３０−０９３−４８０）又はその等価物の使用に依存する。この方法は、透過処理することなくＩＬ−１３産生細胞の検出及び富化を可能にするため、特に興味深い。ＩＬ１０の産生を検出するための方法の別の例は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社により商品化されたＩＬ−１０分泌アッセイキット（１３０−０９０−４３４）又はその等価物の使用に依存する。この方法は、透過処理することなくＩＬ−１０産生細胞の検出及び富化を可能にするため、特に興味深い。

Ｔ細胞を含有する任意の細胞源を、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞、又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団を単離するために使用することができる。有用な供給源は、末梢血、関節液、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、パイエル板、及び扁桃腺を含むがそれらに限定されない。

細胞を分離、単離又は選択するための方法は、抗体で被覆された磁気ビーズを用いた磁気分離（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許番号第５，７５９，７９３号明細書）及びアフィニティクロマトグラフィー又は個体マトリックス（例えばプレート）に結合した抗体を使用する「パニング」を含むがそれらに限定されない。正確な分離を提供する更なる技術は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を含み、これは、複数のカラーチャンネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャンネル又はインピーダンスチャンネルを有するなど、様々な程度のソフィスティケーションを有することができる。死細胞は、死細胞に関連つけられた染料（例えば、ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ）を用いて選択することによって除去することができる。赤血球は、例えば、水簸、溶血、又はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配により除去することができる。選択した細胞の生存率に角に有害ではない任意の技術を使用することができる。

便利なことに、抗体は、例えば、Ｔｒ１細胞の分離を容易にするための磁性ビーズ；アビジン又はストレプトアビジンに高い親和性で結合するビオチン；蛍光活性化セルソーターで使用できる蛍光色素；ハプテンなど、多数の異なる目的のラベルを使用して結合することができる：。マルチカラー分析は、ＦＡＣＳで用いることができるか又は、免疫磁気分離法及びフローサイトメトリーを組み合わせて用いることができる。マルチカラー分析は、以下のような複数の表面抗原に基づく細胞分離のために興味深い：例えば、非−ＣＤ４＋免疫細胞マーカー（ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δ及びグリコホリンＡ）、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌ。マルチカラー分析における使用を見出す蛍光色素は、フィコエリトリン及びアロフィコシアニンなどのフィコビリタンパク質；蛍光及びテキサスレットを含むがそれらに限定されない。

磁気分離は、磁場勾配において、選択的に遠心分離管又はカラムなどの容器内の磁性材料を保持するために使用されるプロセスである。Ｔｒ１細胞は、免疫親和性の相互作用を含む特定の相互作用を介して細胞表面へ磁性粒子を結合することにより磁気的にラベルすることができる。適切な容器内のＴｒ１細胞を含む懸濁液は、次に、懸濁液中の他の細胞からＴｒ１細胞を分離するのに十分な強さの磁場勾配へ曝す。容器を、次に、ラベルされていない細胞を除去するために適切な流体で洗浄し、Ｔｒ１細胞の精製された懸濁液を得られた。

磁気ラベルシステムの大部分は、モノクローナル抗体又はその表面と共有結合したストレプトアビジンを備える超常磁性粒子を使用する。細胞分離の用途において、これらの粒子は、目的の細胞が磁気的にラベル及び保持されている陽性選択又は、所望ではない細胞の大部分が磁気的にラベル及び保持されている陰性選択のいずれかについて使用することができる。使用される粒子の直径は、ＭＡＣＳ粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）及びＳｔｅｍｅｐ（商標）コロイド（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）については約５０〜１００ｎｍ、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＩｍａｇ粒子（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）については１５０〜４５０ｎｍ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）については４．２μｍ以下というように、幅広く変化する。使用される粒子の型は、ラベルされた細胞を分離するために用いられる磁石技術の影響を受ける。

磁気分離技術の二つの重要なクラスが存在し、その両方は、便宜的及び実用的な理由のために、電磁石とは対照的に、永久磁石を使用している。最初のクラスは、目的の標的をラベルするために、小さな弱磁性粒子を使用し、磁化マトリックスを重点したカラムにおいてこれらの標的物を分離する、カラムベースの高傾斜磁場分離技術である。磁場がカラムに適用される場合、非常に高い勾配が、マトリックス要素の表面近くに発生する。これらの比較的弱磁性の粒子を用いてラベルした標的物を分離するために、高い勾配が必要である。第二のクラスは、目的の標的物をラベルするために、より強い磁性粒子を使用するチューブベースの技術である。これらの目的の標的物を、次に、チューブの外側の磁石によって発生する磁場勾配により、遠心型チューブ内で分離する。この方法は、勾配を精製するために、磁化マトリックスに依存せず、従って、効果な使い捨てカラムも、不便な洗浄及び除染の手順を含む再利用可能なカラムも必要としないという利点を有する。

一旦磁石内に配置されると、標的細胞は、最高磁場強度の領域（単数又は複数）へ向かって移動し、ラベルされていない細胞が引き抜かれる一方、磁場内に保持される。標的細胞は、次に、磁場から取り除かれた後、収集され使用することができる。陰性の選択が必要とされる場合には、ラベルされていない細胞が保持され、様々な用途に利用されることができる。

ＦＡＣＳは、細胞の亜集団がレーザービームを通過する時に、それらの光散乱特性に基づくそれらの分離を可能にする。前方光散乱（ＦＡＬＳ）は、細胞サイズ及び直角光散乱に関連し、また、側方散乱特性（ＳＳＣ）として知られているのは、細胞密度、細胞内含有量及び、核−細胞質比、即ち、細胞の複雑性に関連する。細胞は、蛍光識別抗体でラベルすることができるので、それらは更に、抗体（蛍光）強度により特徴付けることができる。

特定の実施形態において、本発明のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞は、免疫−磁気クロマトグラフィーを使用して単離する。例えば、抗−ＣＤ４抗体は、磁性ビーズへ付着する。これらの抗体−ラベルされた磁性粒子は、アフィニティー精製の基礎として使用される。Ｔ細胞の抗体ラベルされた画分は、磁気親和性カラムへ適用される。非−付着細胞は廃棄され、接着細胞は、磁場を除去することによって磁気カラムから溶出される。別の実施形態において、細胞は、まず、抗体（例えば、抗−ＣＤ４）でラベルされ、次に、磁性粒子又は球を運ぶ二次抗体でラベルされる。

別の実施形態において、Ｔｒ１細胞と免疫反応性の二次抗体は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の集団を濃縮するために使用することができる。二次抗体の使用は、一般的に当該技術分野において知られている。典型的に、二次抗体は、第一の抗体の定常領域と免疫反応性である抗体である。好ましい二次抗体は、抗−ウサギ、抗−マウス、抗−ラット、抗−ヤギ及び抗−ウマ免疫グロブリンを含み、市販されている。市販のキットは、磁性粒子及び蛍光色素などであるが、それらに限定されない、ラベル化剤に結合させた二次抗体を提供する。

本発明の別の目的は、
ＣＤ４並びに低レベルのＣＤ１２７並びに／又はＣＤ６２Ｌを発現し、ＩＬ−１３を産生する細胞を同定することと、
前記細胞を選択することと
を含む、細胞集団においてＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を富化させるための方法であり、それによって、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞に富んだ細胞集団を得る。

本発明の別の目的は、
ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７並びに／又はＣＤ６２Ｌを発現し、ＩＬ−１３並びにＩＬ−１０を産生する細胞を同定することと、
前記細胞を選択することと
を含む、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団を細胞集団において富化させるための方法であり、それによって、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団に富んだ細胞集団を得る。

本発明の別の実施形態において、集団においてＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を富化させるための方法は、
細胞集団を、非ＣＤ４^＋細胞のマーカーに結合する少なくとも一種の試薬に接触させ、それにより非ＣＤ４^＋細胞を減少させることと、
本明細書で上述したように、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を同定し、それらを選択することと、
を含み得る。

本発明の別の実施形態において、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団を富化させるための方法は、
細胞集団を、非ＣＤ４^＋細胞のマーカーに結合する少なくとも一種の試薬に接触させ、それにより非ＣＤ４^＋細胞を減少させることと、
本明細書で上述したように、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団を同定し、それらを選択することと、
を含み得る。

非ＣＤ４^＋細胞に結合するマーカーの例は、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３及びグリコホリンＡを含むがそれらに限定されない。

前記マーカーに結合する好ましい試薬は抗体である。更なる実施形態において、抗体は、蛍光色素又は磁性粒子に結合している。別の実施形態において、細胞選択は、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気選別、アフィニティクロマトグラフィー又はパニング又はそれらの組み合わせによって実行される。

本発明の別の目的は、前記方法により得られたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の富化された集団である。本発明の別の目的は、前記方法により得られたＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団の富化された集団である。

本発明の別の目的は、富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団を含む組成物、富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団から本質的に成る又はから成る組成物である。

本発明の別の目的は、富化されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団を含む組成物、富化されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞亜集団から本質的に成る又はから成る組成物である。

本明細書で使用される場合、ＩＬ―１３産生Ｔｒ１−様細胞に富んだ組成物／集団は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合が、最初に得られた細胞集団におけるＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合よりも高いものである。可能ではあるが、富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団は、ＩＬ１３産生Ｔｒ１−様細胞の均一な集団を含む必要はない。特定の実施形態において、該組成物の前記細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％又は約９９％は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞である。別の実施形態において、富化された組成物／集団中のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合は、富化前のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の割合の、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍である。

本明細書で使用する場合、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞に富んだ組成物／集団は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の割合が、最初に得られた細胞集団におけるＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の割合よりも高いものである。可能ではあるが、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の富化された集団は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の均一な集団を含む必要はない。特定の実施形態において、該組成物の前記細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％又は約９９％は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞である。別の実施形態において、富化された組成物／集団中のＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の割合は、富化前のＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の割合の、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍である。

Ｔ細胞を含有する任意の細胞源を、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞を単離／富化するために使用することができる。有用な源は、末梢血、関節液、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、パイエル板、及び扁桃腺を含むがそれらに限定されない。

富化方法は、富化プロセスの各ステップに関連付けられた富化のレベルに応じて可変的である。ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生するＴｒ１細胞の富化レベル及びパーセント純度は、限定されるものではないが、ドナー、細胞／組織源及びドナーの疾患の状態を含む多くの要因に依存するであろう。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローンである。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンである。

本発明によると、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞は、本明細書で上述した方法により単離され、次に、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞は、当該技術分野で周知の方法によりクローニングされる。

本発明によると、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞は、本明細書で上述した方法により単離され、次に、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞は、当該技術分野で周知の方法によりクローニングされる。

別の実施形態において、当業者は、ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及び／又はＣＤ６２Ｌを発現する細胞を単離し、前記細胞をクローニングし、次に、活性化するとＩＬ−１３、あるいはＩＬ−１０及びＩＬ−１３、を産生するクローンを単離することができる。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンを含む組成物、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンから本質的に成る又は成る組成物である。

本発明の一実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンは、低レベルのＩＬ−４を産生する。

本発明の一実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンは、低レベルのＩＬ−２を産生する。

本発明の一実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンは、中程度のレベルのＩＦＮγを産生する。

本発明の一実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様クローン又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１クローンは、中程度のレベルのＴＧＦβを産生する。

本発明の方法により単離された、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の亜集団は、更に、ＷＯ２００６／１０８８８２に説明されたインビトロ法により増殖し得る。前記方法は、
ａ）３５℃未満の温度Ｔ１にて、培養培地Ｍｆ中で、昆虫フィーダー細胞などのフィーダー細胞を培養することと（前記温度Ｔ１は、フィーダー細胞の増殖を可能にし、前記フィーダー細胞は、以下の細胞表面タンパク質と相互作用する因子を発現する：
ＣＤ３／ＴＣＲ複合体
ＣＤ２８タンパク質
ＩＬ−２受容体
ＣＤ２タンパク質
ＩＬ−４受容体）
ｂ）Ｔｒ１細胞集団、フィーダー細胞、及び培養培地Ｍｐを含む混合物を得るために、それらの培養培地Ｍｆを取り除いたか又は取り除いていないステップａ）で得られたフィーダー細胞を、培養培地Ｍｐ中に含まれるＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の亜集団と接触させることと（前記培養培地Ｍｐは、ステップａ）に引用される因子を当初は含んでいない）
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物を、少なくとも３５℃である温度Ｔ２で培養することと（前記温度は、Ｔｒ１細胞集団が増殖し、且つ、フィーダー細胞は増殖しないように、選ばれる）
ｄ）そのようにして増殖させたＴｒ１細胞集団を回収することと
を含む。

上記の細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例としては、
・抗ＣＤ３抗体、好ましくは、修飾された抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインは、膜貫通ドメインと置換されている）
・ＣＤ８０又はＣＤ８６タンパク質
・フィーダー細胞から分泌されるＩＬ−２
・ＣＤ５８タンパク質
・ＩＬ−４及びＩＬ−１３を含む群から選択されるインターロイキン
が挙げられる。

Ｍｐ培地は、Ｔ細胞の培養に適応され、無血清培地であり得る。Ｍｐ培地の非限定的な例は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社のＸＶＩＶＯ１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＡＩＭ Ｖ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩなどの市販の無血清培地である。

Ｍｆ培地は、フィーダー細胞の培養に適応され、無血清培地であり得る。Ｍｆ培地の非限定的な例は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社の無血清シュナイダー培地、ＭＤ Ｇｉｂｃｏ社の無血清昆虫細胞培養培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳＦＭ又はＫｒａｃｋｅｌｅｒサイエンティフィック社のＩｎｓｅｃｔａｇｒｏなどの市販されている無血清培地である。

本発明の実施形態において、このようにして得られたＴｒ１細胞は、Ｔ細胞をクローニングするための従来の方法を使用することによってクローニングされ得る。

本発明の実施形態において、このようにして得られたＴｒ１細胞又はＴｒ１細胞クローンは、保存のために凍結され得る。

本発明の別の目的は、富化および増殖されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞亜集団を含む組成物、富化および増殖されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞亜集団から本質的に成る又は成る組成物である。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を細胞集団において減少させるための方法であり、以下の
ＣＤ４ならびに低レベルのＣＤ１２７及び／又はＣＤ６２Ｌを発現し、且つ、ＩＬ−１３、あるいはＩＬ−１０及びＩＬ−１３、を産生する細胞を同定することと、
前記細胞を減少させることと、
を含み、それによって、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の減少した細胞集団を得る。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を減少させた又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を減少させた細胞集団を含む組成物、それらから本質的に成る又はそれらから成る組成物である。

ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を減少させた組成物／集団又は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を減少させた組成物／集団は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の割合が、最初に得られた細胞集団におけるＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の割合よりも低いものである。

本発明の別の目的は、本明細書で上述した方法により得られたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を減少させた細胞集団である。本発明の別の目的は、本明細書で上述した方法により得られた、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を減少させた細胞集団である。

本明細書において前述したように、細胞を単離するための方法は、抗体で被覆された磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー又は個体マトリックス（例えばプレート）に結合した抗体を使用する「パニング」及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を含むがそれらに限定されず、選択される代わりに、Ｔｒ１細胞は減少されている。

一実施形態において、該減少させた組成物／集団中のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の割合は、減少前のＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の割合の、少なくとも０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２５倍、０．２倍、０．１５倍、０．１倍である。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞集団を同定若しくは単離するため、又は、細胞集団においてＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞を富化若しくは減少させるためのキットであり、前記キットは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの細胞表面発現を検出するための試薬及び、ＩＬ−１３産生を検出するための手段を含む。

本発明の別の目的は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞集団を同定若しくは単離するため、又は、細胞集団においてＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を富化若しくは減少させるためのキットであり、前記キットは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの細胞表面発現を検出するための試薬及び、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生を検出するための手段を含む。

好ましくは、前記試薬は抗体である。更に好ましくは、これらの抗体は、蛍光色素又は磁性粒子に結合している。

別の実施形態において、前記キットは更に、Ｆｏｘｐ３発現を検出するための試薬を含む。好ましくは、前記試薬は抗体である。より好ましくは、前記抗体は、蛍光色素と結合している。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において免疫反応を抑制するための方法であり、本発明による単離又は富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の効果的な量を、対象へ投与することを含む。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において免疫反応を抑制するための方法であり、本発明による単離又は富化されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の効果的な量を、対象へ投与することを含む。

一実施形態において、対象は、骨髄移植又は臓器移植などの移植を受けたか又は現在受けている。

別の実施形態において、対象はアレルギーを有する。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において炎症性症状を予防又は治療するための方法であり、本発明による、単離又は富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又は、単離又は富化されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の有効的な量を、対象へ投与することを含む。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において自己免疫症状を予防又は治療するための方法であり、本発明による、単離又は富化されたＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又は、単離又は富化されたＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の有効的な量を、対象へ投与することを含む。

本発明の一実施形態において、細胞集団を、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞富化組成物又はＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞富化組成物がその後導入される対象から得てよい。

本発明の一実施形態において、対象は、免疫応答の抑制が望ましい対象であり得る。

一実施形態において、対象は、炎症性症状又は疾患／障害の影響を受けたヒトであり、そのような疾患／障害は以下を含む任意の疾患／症状であるがそれらに限定されない：非自己免疫性炎症性腸疾患、術後癒着、冠動脈疾患、肝線維症、急性呼吸窮迫症候群、急性炎症性膵炎、内視鏡的逆行性胆道膵管造影誘発性膵炎、火傷、冠状動脈・脳及び末梢動脈のアテローム発生、虫垂炎、胆嚢炎、憩室炎、内臓の線維性疾患、創傷治癒、瘢痕皮膚疾患（ケロイド、汗腺膿瘍）、肉芽腫性疾患（サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変）、喘息、壊疽性膿皮症、スウィート症候群、ベーチェット病、原発性硬化性胆管炎、膿瘍。

別の実施形態において、対象は、自己免疫症状又は、以下を含むがそれらに限定されない疾患／障害の影響を受けたヒトである：紅斑性狼瘡、尋常性天疱瘡、甲状腺炎、血小板減少性紫斑病、バセドウ病、糖尿病、若年性糖尿病、自発的な自己免疫性糖尿病、重症筋無力症、アジソン病、関節リウマチ・強直性脊椎炎・若年性特発性関節炎・乾癬性関節炎などの関節炎、多発性硬化症、乾癬、ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己免疫性炎症性腸疾患・クローン病・大腸炎・食物アレルギーに関連した腸炎などの腸の炎症性疾患、シェーグレン病、橋本病、重症筋無力症、自己免疫性多腺性内分泌障害症候群、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤＭ）、自己免疫性胃炎、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、及び甲状腺炎、並びに、ヒト全身性エリテマトーデスに代表される自己免疫疾患。

本明細書で用いる「自己抗原」は、哺乳類に対して先天的であり、前記哺乳類の疾患において免疫原性であり、抗原又はエピトープを意味する。

本発明の細胞はまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び移植片拒絶反応などの移植反応を予防する又は治療するためにも使用することができる。

ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の患者への導入は、養子細胞移入などの当業者に公知の方法を使用して実施される。簡単に言うと、細胞の混合集団が標的ドナーから抽出される。用途に応じて、細胞は、寛解期の間、又は、進行中の疾患の間に抽出され得る。典型的に、これは、末梢血を採取し、白血球搬出法（白血球フェレーシス）により白血球を採取することによってなされる。例えば、大量の白血球搬出（ＬＶＬ）が、白血球収量を最大にすることが示されている。採取されたリンパ球は、本明細書中に記載したマーカーなどのＴｒ１−特異的細胞マーカーに基づく細胞分離法を使用して分離され得、その後、養子免疫抑制のため、典型的には細胞のドナー（ドナーとレシピエントが異なる、ＧＶＨＤの場合を除く）である患者へ輸血される。約１０^３〜１０^１１、好ましくは、１０^４〜１０^１０、好ましくは、１０^５〜１０^９、好ましくは、１０^６〜１０^９、更に好ましくは、１０^６〜１０^８のＴｒ１細胞が、患者に注入される。

本明細書で使用されるように、用語「効果的な量」は、障害又はその一つ以上の症状の低減する（任意の程度まで）又は重症度及び／若しくは継続時間を改善し、障害の進行を防ぎ、障害の寛解を生じさせ、再発、進行を防止するか、又は、別の治療（例えば、予防剤又は治療剤）の予防的もしくは治療的効果（単数又は複数）を促進若しくは改善するのに十分な、治療物質又は組成物の量を意味する。効果的な量は、被験者の年齢、性別、人種、手、全身状態など、治療される症状の重篤度、投与される特定の薬剤、治療期間、任意の併用治療の性質、薬学的に許容される使用される担体、及び、当業者の知識や経験における同様の要因により変化する。必要に応じて、任意の個々における「効果的な量」は、適切な文章及び文献を参照することにより、及び／又は、日常的な実験を使用することにより、当業者により決定することができる（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ． Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， （２０００）， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ； Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， （２００１）， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， ＮＹ； Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ． Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， （１９９２）， Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒａｈｗａｙ ＮＪ参照）。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本明細書において、障害の進行若しくは発症の抑制、又は、治療の投与（例えば、予防又は治療剤）による被験者における障害の一つ以上の症状の再発、発症又は進行の予防、又は、治療法の組み合わせ（例えば、予防剤又は治療剤の組み合わせ）の投与を指す。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、少なくとも、ホストにおいて障害に伴う症状の改善が達成されたことを意味し、ここで改善は、例えば、治療される状態に関連する症状など、少なくともパラメータの大きさによる低減を参照するために、広い意味で使用されている。このように、治療はまた、病的状態の状況又は少なくともそれに関連する症状の状況を含み、それは、被験者がもはや状態に苦しんでいないか、又は、少なくとも状況を特徴付ける症状に苦しんでいないような、例えば発症の防止などの完全に抑制された状況、又は完治などの停止した状況である。

本明細書で使用されるように、用語「対象」は動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトを指す。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において移植された細胞集団の免疫応答を強化する方法であり、本明細書で上述するように、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１‐様細胞を減少させた細胞集団の治療的に有効量を対象へ投与することを含む。

本発明の別の目的は、それを必要とする対象において移植された細胞集団の免疫応答を強化する方法であり、本明細書で上述するように、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞を減少させた細胞集団の治療的に有効量を対象へ投与することを含む。

一実施形態において、前記方法は、ガン治療を受けている対象の治療法である。

一実施形態において、移植された細胞集団は、抗原特異的なエフェクターＴ細胞集団である。好ましくは、前記Ｔ細胞集団は、黒色腫のＭＡＲＴ−１（ＭｅｌａｎＡ）又は、黒色腫のＭＡＧＥ１、２、３、甲状腺髄様、小細胞肺癌、結腸及び／又は気管支扁平上皮癌などの腫瘍抗原に特異的である。

別の実施形態において、前記方法は、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ感染症などの感染性疾患を治療するための方法である。

制御性Ｔ細胞の除去は、ガン患者においてワクチン媒介免疫を増強することが示されている（Ｄａｎｎｕｌｌら、２００５、１１５（１２）：３６２３〜３６３３）。従って、本発明の別の実施形態において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞又は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の除去は、ガン又は感染性疾患を治療するための細胞療法に使用し得ることを示しており、ここで、前記産生Ｔｒ１−様細胞又は、前記Ｉｌ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞は、治療のために悪影響又は有害であり得る。例えば、ガン治療において、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１‐様細胞又は、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０産生Ｔｒ１細胞の一時的な除去は、ワクチン接種／免疫療法プロトコルの前に興味深いかもしれず、前記一時的な除去は、本発明の除去法によるデバイスを用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで患者の血液から減少させることにより得られ、患者にすぐにそれを再注入する。

実験手順
ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の単離及び上澄み液の産生
ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞の単離のために、末梢血細胞をＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離によって分離し、抗原特異的Ｔｒ１−様細胞の増殖を可能にするために、特異的抗原の存在下で２×１０^６細胞／ｍｌで培養した。培養７日後、細胞を、三週間、限界希釈法によりクローニングした。成長しているクローンを次に、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激剤及びサイトカイン（ＩＬ−２及びＩＬ−４）を使用して増殖させた。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７が恒常的に同時に欠如しており、活性化された状態でのみＣＤ２５及びＦｏｘｐ３が発現していることを示すフローサイトメトリーにより表現型を評価することによってクローンのＴｒ１−様細胞のアイデンティティーを評価した。Ｔｒ１−様細胞の上澄み液の産生は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８で被覆された磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いて３７℃＋５％ＣＯ２にてＸ−ｖｉｖｏ培地中で二日間、細胞を刺激することにより得た。

フローサイトメトリー試験
ヒト細胞におけるフローサイトメトリー試験のために、以下の抗体を使用した：ＰＥ−結合抗−ＣＤ１２７（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製クローンＲ３４．３４）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦＩＴＣ−ラベル抗−ＣＤ４ Ａｂ（クローン番号ＲＰ４−Ｔ４）、ＰｅＣｙ５−ラベル抗−ＣＤ６２Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のクローンＤｒｅｇ５６）、及び、アロフィコシアニン結合抗−ＣＤ２５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のクローンＭ−Ａ２５１）。ヒトＦｏｘｐ３のための細胞質内染色は、製造元の指示に従って、ＰＥ結合抗−Ｆｏｘｐ３Ａｂ（ＢＤからのクローン２５９ Ｄ／Ｃ７）及び細胞質染色キット（ＢＤ）を使用して実施した。

サイトカインアッセイ
サイトカイン産生プロファイル（試験Ａの例）の決定のために、Ｔｒ１−様細胞クローンを、２ビーズ／細胞の濃度にて抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８被覆ビーズを用いて刺激し、上澄み液を４８時間後に回収した。ＥＬＩＺＡは、Ｄｉａｃｌｏｎｅ社製の市販のキット（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０及びＩＬ−４）及びｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の市販のキット（ＩＬ−１３）を使用して実施した。実験は、製造元の指示に従って行った。

阻害試験
阻害試験のために、末梢血単核細胞を、可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を用いて、ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞上澄み液、抗−ＩＬ１３（クローン３１６０６、Ｒ＆Ｄシステムズ）又は組換え型ヒトＩＬ−１３（６ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄシステムズ）の存在下又は非存在下で、二日間で活性化させた。インキュベートした細胞の増殖を、培養ウェル当たりの生存細胞数を評価できるＲｏｃｈｅ社製のＷＳＴ１キットを使用して測定した。
結果

ＩＬ−１３によるＴ−細胞増殖活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの阻害
第一に、我々は、組換え型ヒトＩＬ−１３が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖活性を、下方制御することができることを実証したかった。この目的のために、ＩＬ−１３を、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体で活性化したＰＢＭＣの培養へ加え、細胞の増殖は、培養三日後に測定した（図１）。結果は、ＩＬ−１３はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞増殖を阻害することができ、このサイトカインの免疫抑制の可能性を示すことを実証している。

ＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞による、Ｔ−細胞増殖活性のＩｎ ｖｉｔｒｏでの阻害
我々は、従って、抑制性サイトカインとしてＩＬ−１３を使用して、同種の実験設定においてＩＬ−１３産生Ｔｒ１−様細胞がバイスタンダーＴリンパ球の活性を阻害することが可能か否かを知りたかった。図２Ａは、ＩＬ−１３分泌は多いがＩＬ−４は全く分泌されない、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体により活性化したＩＬ−１３の調節性細胞のサイトカイン分泌パターンを示す。図２Ｂは、活性化したＩＬ−１３産生調節性細胞の上澄み液は、培養中のバイスタンダーＴ細胞の活性化を阻害することができることを示している。重要なことには、この上澄み液が媒介するＴ細胞増殖の抑制は、ＩＬ−１３阻止抗体を用いて阻害され（図２Ｃ）、これらのサイトカインが、これらの細胞から分泌される主要な抑制性の可溶性因子に相当することが示された。

ヒトＩＬ−１３産生制御性細胞の表現型
最後に、我々は、ＩＬ−１３調節性細胞によるいくつかの調節性細胞マーカーの発現を試験し、細胞が、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ及びＦｏｘＰ３分子を発現しないことを示した。更に、上記の三つのマーカーから、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５は、活性化後にアップレギュレートされる（図３）。

ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生することができるＴｒ１細胞の亜集団
図４は、試験Ａの条件におけるＴｒ１細胞は、二つの集団に分けることができることを示す：Ｔｒ１細胞の一方の亜集団は、ＩＬ−１０を産生することができるがＩＬ−１３を産生することができず、他方のＴｒ１細胞の亜集団は、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生することができる。

Claims (15)

1. ＩＬ−１３を産生可能な、単離されたヒトＴｒ１細胞集団。
2. 前記細胞がＩＬ−１０を産生する、請求項１に記載の単離されたヒトＴｒ１細胞集団。
3. 前記細胞が、
   ＣＤ４と、
   低レベルのＣＤ１２７と、
   低レベルのＣＤ６２Ｌと、
   を発現する、請求項１又は２に記載の単離されたヒトＴｒ１細胞集団。
4. 前記細胞が抗原に特異的であり、好ましくは、前記抗原がＩＩ型コラーゲン、オボアルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質又はＨＳＰである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたヒトＴｒ１細胞集団。
5. ＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生可能な、単離されたヒトＴｒ１クローン。
6. 前記クローンが、
   ＣＤ４と、
   低レベルのＣＤ１２７と、
   低レベルのＣＤ６２Ｌと、
   を発現する、請求項５に記載の単離されたヒトＴｒ１クローン。
7. 前記クローンが抗原に特異的であり、好ましくは、前記抗原がＩＩ型コラーゲン、オボアルブミン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質又はＨＳＰである、請求項５又は６に記載の単離されたヒトＴｒ１クローン。
8. 細胞集団上の、ＣＤ４の細胞表面発現とＣＤ１２７マーカーおよびＣＤ６２Ｌマーカーの内の少なくとも一つの細胞表面発現とを検出することと、
   ＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生を検出することと、
   を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトＴｒ１細胞集団を同定する方法であって、
   ＣＤ４と低レベルのＣＤ１２７及び／又は低レベルのＣＤ６２Ｌとを発現し且つＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生する細胞がＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団である、方法。
9. ＣＤ４と低レベルのＣＤ１２７及び／又は低レベルのＣＤ６２Ｌとを発現し且つＩＬ−１３及びＩＬ−１０を産生する細胞を同定することと、
   前記細胞を選択することと、
   を含み、それによって、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞の富化された細胞集団を取得し、前記ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞の割合が富化前のヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞の割合の少なくとも二倍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を細胞集団において富化させる方法。
10. 請求項９に従って得られた、富化されたヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団。
11. ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの細胞表面発現を検出する手段とＩＬ−１３及びＩＬ−１０の産生を検出する手段とを含む、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団を同定又は単離するためのキット。
12. 免疫反応、移植片対宿主病及び臓器拒絶反応、アレルギー疾患、炎症性疾患若しくは自己免疫状態を予防または治療するための、請求項１〜４若しくは１０のいずれか一項に記載の単離された及び／又は富化されたヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞集団、或いは請求項５〜７のいずれか一項に記載のヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１クローン。
13. 請求項８に従ってヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を同定することと、
    前記細胞を減少させることと、
    を含み、それによって、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞の減少した細胞集団を取得し、前記ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞の割合が減少前のヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞の割合の少なくとも０．５倍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を細胞集団において減少させる方法。
14. 請求項１３に従って得られた、ヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を減少させた細胞集団。
15. それを必要とする対象において免疫反応を増加させるための、請求項１４に記載のヒトＩＬ−１３産生Ｔｒ１細胞を減少させた細胞集団。

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