JP7254128B2 - ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの新しい亜集団およびその使用 - Google Patents

ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの新しい亜集団およびその使用 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの高度に抑制的な亜集団の同定を含む細胞療法の分野に関する。
発明の背景
免疫抑制レジメンは依然として、移植片の長期生存および移植患者の安寧にとって大きな障害であり、主に二次的影響および非特異的免疫抑制により、ここ数年は同種移植片の生存率の改善が停滞している（Ｆｅｎｇ ２００８）。ドナー抗原への優れた抑制能力および特異性を有する調節集団のヒトにおける同定は、ヒトの移植、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）／エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）調節不全を伴う多数の疾患において大きな関心が寄せられている。
実際に、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇをはじめとする制御性Ｔ細胞または「Ｔｒｅｇ」は、Ｔｒｅｇが他の免疫細胞の活性を急速に抑制し得るという点で、様々な免疫反応を制御する際の基礎をなす。特にＴｒｅｇは、自己および非自己抗原への望ましくない免疫反応をダウンレギュレートすることにより、免疫寛容を維持するのに不可欠である。例えばＴｒｅｇの欠損が、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、乾癬、重症筋無力症（ＭＧ）および他の自己免疫疾患の患者で発見された。類似のつながりが、アトピーおよびアレルギー性疾患にも存在し得る。これらの疾患報告全てで、患者のＴｒｅｇ細胞のインビトロ免疫抑制の低下を指摘する報告が存在する。これにより、自己免疫疾患、アレルギー、抗治療性タンパク質免疫反応（即ち、第ＶＩＩＩ因子）および移植関連の合併症を処置または予防する免疫療法においてＴｒｅｇを用いる可能性に関心が高まった。
こうして、単離されたＴｒｅｇ細胞の集団を得るために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を事実上含まない、高度の抑制性を有するＴｒｅｇ細胞の亜集団が、特に必要とされている。実際に、高度に抑制性の単離されたＴｒｅｇは、次には、抗原特異性免疫寛容を効率的に誘導するために、該当する抗原もしくは遺伝子改変された抗原で（例えば、ＣＡＲとも称される所与のキメラ抗体受容体を発現するため、またはキメラＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するため）、または他のタイプのキメラ抗原受容体で、増幅およびパルスされ得る。そのような増幅されたＴｒｅｇ細胞集団は、免疫系による自己分子または治療分子／組織の変性を回避するために、慢性炎症、自己免疫性、アレルギー、移植、治療性タンパク質での処置、および遺伝子療法の分野において特に関心が寄せられている。
発明の概要
第一の態様において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の単離集団に関する。
第二の態様において、本発明は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および／または単離するための方法であって、（ａ）ヒトＰＢＭＣまたはリンパ球の前記集団を、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段と接触させるステップと；（ｂ）ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の該単離集団を、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させるステップと、を含む、方法に関する。
第三の態様において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地と接触させるステップを含む、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を増幅させるための方法に関する。本発明はまた、（ｉ）ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離すること、場合によりヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、（ｉｉ）場合により該単離されたＴｒｅｇ細胞を凍結し、続いて解凍すること、および（ｉｉｉ）前記細胞を培養で増幅させること、を含む、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ細胞の集団を生成するための方法に関する。
第四の態様において、本発明は、増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
第五の態様において、本発明は、本発明による（増幅された、また増幅されていない）ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を含む医薬組成物に関する。
第六の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明による（増幅された、また増幅されていない）ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
第七の態様において、本発明は、必要とする患者における移植片拒絶、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、治療性タンパク質への望まない免疫反応、またはアレルギーを予防または処置するための方法で使用するための、本発明による（増幅された、また増幅されていない）ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
最後の態様において、本発明は、患者が移植片拒絶、ＧＶＨＤ、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、治療性タンパク質への望まない免疫反応、またはアレルギーのリスクがあるか否かを決定するインビトロ法であって、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の存在が、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、治療性タンパク質への望まない免疫反応、またはアレルギーのリスク低下の指標である、本発明の方法により前記患者から得られた生体試料中のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の存在を決定するステップを含む、インビトロ法に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、高度に抑制性のＣＤ８＋Ｔｒｅｇ亜集団の同定から得られる。詳細には本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌亜集団の高度に抑制性の亜集団を同定した。本発明者らは、抗ドナーＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞応答に対する古典的ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇに比較したそれらの優れた能力と、それらの抑制活性におけるＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４の役割を実証した。加えて本発明者らは、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの特異的増幅、ならびにヒト化マウスを用いてヒト皮膚移植片拒絶およびＧＶＨＤを阻害する移植での細胞療法としてのそれらの能力を記載した。
本発明のＴｒｅｇ細胞集団
第一の態様において、本発明は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の単離集団に関する。本発明はまた、ＧＩＴＲ＋および／またはＦｏｘｐ３＋であるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の単離集団に関する。
一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋ Ｔｒｅｇの単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋ Ｔｒｅｇの単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの単離集団に関する。
一実施形態において、本発明によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４のうちの少なくとも１種のサイトカインを分泌する。したがって一実施形態において、本発明によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、ＩＦＮγまたはＩＬ－１０またはＩＬ－３４を分泌する。
別の実施形態において、本発明によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４のうちの少なくとも２種のサイトカインを分泌する。したがって一実施形態において、本発明によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、ＩＦＮγとＩＬ－１０、またはＩＦＮγとＩＬ－３４、またはＩＬ－１０とＩＬ－３４を分泌する。
さらに別の実施形態において、本発明によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４を分泌する。
一実施形態において、本明細書の先に記載されたＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団はさらに、ＩＬ－２および／またはＴＧＦβ－１を分泌する。
詳細には、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性細胞のうち、本発明者らは、ＩＦＮγ、およびＩＬ－１０およびＩＬ－３４を分泌するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性細胞の亜集団を同定した。したがって一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４を分泌する。
一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４を分泌し、ＧＩＴＲを発現する。一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４を分泌し、Ｆｏｘｐ３を発現する。一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３４およびＴＧＦβ－１を分泌する。
別の実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４を分泌し、Ｆｏｘｐ３およびＧＩＴＲを発現する。一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３４およびＴＧＦβ－１を分泌し、Ｆｏｘｐ３を発現する。別の実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３４およびＴＧＦβ－１を分泌し、ＧＩＴＲを発現する。
さらに別の実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３４およびＴＧＦβ－１を分泌し、Ｆｏｘｐ３およびＧＩＴＲを発現する。
一実施形態において、本明細書の先に記載されたヒトＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＬ－２を分泌する。
本発明の一実施形態において、本明細書の先に記載されたＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、凍結されて貯蔵され得る。本発明の詳細な実施形態において、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの単離集団は、凍結されて貯蔵され得る。一実施形態において、本明細書の先に記載されたヒトＣＤ８＋Ｔｒｅｇの単離集団は、凍結されて解凍されている。詳細な実施形態において、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの単離集団は、凍結されて解凍されている。
本明細書で用いられる用語「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られ、免疫系を調整し、自己抗原への寛容性を維持し、自己免疫疾患を抑制する、Ｔ細胞の亜集団を指す。これらの細胞は一般に、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制またはダウンレギュレートする。
本明細書で用いられる用語「集団」は、細胞総数の大部分（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％）が該当する細胞の指定された特性を有し、該当するマーカーを発現する、細胞の集団を指す（例えば、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団は、高度に抑制性の機能を有し、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３４、Ｆｏｘｐ３、ＧＩＴＲまたはＴＧＦβ－１＋などの該当する特定のマーカーを発現する細胞を、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％含む）。本明細書で用いられる、数字に先行する用語「約」は、前記数字の値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
本明細書で用いられる「単離された」は、自然環境（末梢血など）から取り出されて、単離、精製または分離されており、天然に存在するが細胞を単離する基となる細胞表面マーカーを欠く他の細胞を、少なくとも約７５％含まない、８０％含まない、８５％含まない、好ましくは約９０％。９５％、９６％、９７％、９８％、９９％含まない、細胞または細胞集団を指す。
本明細書で用いられる用語「マーカー」は、細胞表面もしくは細胞内で発現されて、または細胞により分泌されて、細胞の同定を支援するのに用いられ得る、タンパク質、糖タンパク質、または任意の他の分子を指す。マーカーは一般に、従来の方法により検出され得る。細胞表面マーカーの検出に用いられ得る方法の特異的で非限定的な例は、免疫細胞化学的測定、蛍光活性化細胞分別法（ＦＡＣＳ）、および酵素分析だけでなく、該タンパク質のｍＲＮＡを検出するＲＴ－ＰＣＲおよび分子生物法もある。
本明細書で用いられる当該技術分野で周知の用語「ＣＤ８」（白血球分化抗原８）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体として働く膜貫通糖タンパク質を指す。ＣＤ８は、機能するために、一対のＣＤ８鎖からなる二量体を形成する。ＣＤ８の最も一般的な形態は、ＣＤ８－αおよびＣＤ８－β鎖で構成される。天然由来のヒトＣＤ８－αタンパク質は、アクセション番号Ｐ０１７３２としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供されるアミノ酸配列を有する。天然由来ヒトＣＤ８－βタンパク質は、アクセション番号Ｐ１０９６６としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供されるアミノ酸配列を有する。
本明細書で用いられる用語「ＣＤ４５」（ＬＣＡまたはＰＴＰＲＣとしても公知）は、Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６において過去に記載された異なるアイソフォーム内に存在する膜貫通糖タンパク質を指す。これらの異なるＣＤ４５アイソフォームは、ＣＤ４５細胞外領域の一部をコードする３つの可変性エキソンの選択的スプライシングから生じる細胞外ドメイン構造が異なる。様々なＣＤ４５アイソフォームが、異なる細胞外ドメインを有するが、およそ３００アミノ酸残基の２つの相同的で高度に保存されたホスファターゼドメインを有する同じ膜貫通セグメントおよび細胞質セグメントを有する。天然由来のヒトＣＤ４５タンパク質は、アクセション番号Ｐ０８５７５としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供されるアミノ酸配列を有する。本明細書で用いられる用語「ＣＤ４５ＲＣ」は、チロシンホスファターゼＣＤ４５のエキソン６スプライスバリアント（エキソンＣ）を指す。ＣＤ４５ＲＣアイソフォームは、Ｂ細胞上、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット上で発現される。
本明細書で用いられる用語「インターフェロンガンマ」または「ＩＦＮγ」または「ＩＦＮｇ」または「ＩＩ型インターフェロン」は、当該技術分野で周知であり、自然および獲得免疫に不可欠なサイトカインを指す。天然由来ヒトＩＦＮγタンパク質は、アクセション番号Ｐ０１５７９としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される１４６アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、本発明のＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγを分泌する。
本明細書で用いられる用語「インターロイキン－１０」または「ＩＬ－１０」は、当該技術分野で周知であり、抗炎症性サイトカインを指す。天然由来ヒトＩＬ－１０タンパク質は、アクセション番号Ｐ２２３０１としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される１７８アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、本発明のＩＬ－１０分泌ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、少なくとも約０．１、０．５、１、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１０を分泌する。
本明細書で用いられる用語「インターロイキン－３４」または「ＩＬ－３４」は、当該技術分野で周知であり、単球およびマクロファージの増殖、生存および分化を促進するサイトカインを指す。天然由来ヒトＩＬ－３４タンパク質は、アクセション番号Ｑ６ＺＭＪ４としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される２４２アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、本発明のＩＬ－３４分泌ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、少なくとも約０．１、０．５、１、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－３４を分泌する。
本明細書で用いられる用語「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質」または「ＧＩＴＲ」または「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８」または「ＴＮＦＲＳＦ１８」は、当該技術分野で周知であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの表面受容体分子を指す。天然由来ヒトＧＩＴＲは、アクセション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される２４１アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本明細書で用いられる用語「フォークヘッドボックスＰ３」または「Ｆｏｘｐ３」は、当該技術分野で周知であり、Ｔ制御性細胞のマーカーである転写因子として働くと考えられる核タンパク質を指す。天然由来ヒトＦｏｘｐ３は、アクセション番号Ｑ９ＢＺＳ１としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される４３１アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本明細書で用いられる用語「トランスフォーミング増殖因子β１」または「ＴＧＦβ－１」または「ＴＧＦｂ１」は、当該技術分野で周知であり、免疫系を制御する際に重要な役割を担うサイトカインを指す。天然由来ヒトＴＧＦβ－１は、アクセション番号Ｐ０１１３７としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される３９０アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、本発明のＴＧＦβ－１分泌ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、少なくとも約０．１、０．５、１、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ｐｇ／ｍｌのＴＧＦβ－１を分泌する。
本明細書で用いられる用語「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」は、当該技術分野で周知であり、免疫活性化およびホメオスタシスの両方を調節する際に重大な役割を担うサイトカインを指す。天然由来ヒトＩＬ－２は、アクセション番号Ｐ６０５６８としてＵｎｉＰｒｏｔデータベース内で提供される１５３アミノ酸のアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、本明細書の先に記載されたＩＬ－２分泌ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、少なくとも約０．１、０．５、１、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－２を分泌する。
本発明によれば、サイトカイン分泌は、典型的には少なくとも１種の刺激剤での活性化後の細胞培養物で評価される。刺激剤の例としては、抗原、細胞、ＭＨＣポリマー、抗体およびレクチンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、前記少なくとも１種の刺激剤は、同種抗原提示細胞、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ８抗体、ＩＬ－２、ＰＭＡ＋イオノマイシンを含む群から選択される。
一実施形態において、該サイトカイン分泌は、典型的には培養の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日後、好ましくは培養の１２、１３、１４、１５、１６または１７日後、より好ましくは培養の１４日後に評価される。別の実施形態において、該サイトカイン分泌は、典型的には約２×１０５細胞／ｍｌ、約３×１０５細胞／ｍｌ、または約４×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは約２．５×１０５細胞／ｍｌ、約３×１０５細胞／ｍｌ、または約３．５×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは約３×１０５細胞／ｍｌで開始された培養物で評価される。一実施形態において、該サイトカイン分泌は、約３．５×１０５細胞／ｍｌで開始された培養物で培養の１４日後に評価される。
本発明の一実施形態において、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞は、以下にさらに記載される通り、所望の発現生成物をコードするように遺伝子改変され得る。
用語「遺伝子改変された」は、細胞が本発明の非修飾ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ中に、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞中に天然には存在しない核酸分子、または本発明の前記ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ中に、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞中に非天然状態で（例えば増大されて）存在する核酸分子を含むことを示す。核酸分子は、前記細胞の中、またはその前身の中へ導入されている場合がある。
ウイルス介在性遺伝子送達、非ウイルス介在性遺伝子送達、裸のＤＮＡ、物理的処置などの複数のアプローチを用いて、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を遺伝子改変することができる。この目的で、核酸は通常、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、エピソーム、人工染色体などのベクターに組み込まれる。遺伝子を輸送する核酸を細胞内に導入し得る手段の例としては、マイクロインジェクション、電気穿孔、形質導入、もしくはＤＥＡＥ－デキストランを用いたトランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム、または当業者に公知の他の手順が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の詳細な実施形態において、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、ウイルスベクター（または組換えウイルス）またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのベクター粒子を用いて遺伝子改変される。この実施形態において、該異種核酸は、例えば組換えウイルスに導入され、その後、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を感染するために用いられる。異なる型の組換えウイルス、詳細には組換えレトロウイルスが用いられ得る。レトロウイルスの感染は細胞のゲノムへの安定した組み込みをもたらすため、レトロウイルスは好ましいベクターである。対象への注射後のインビトロまたはインビボのいずれかでのリンパ球増幅では、トランスジーンが各細胞分裂時に移送されるように分離の際に安定性を維持される必要があるため、前述のことは重要な特性である。用いられ得るレトロウイルスタイプの例は、オンコウイルス、レンチウイルスまたはスプマウイルスファミリーからレトロウイルスである。オンコウイルスファミリーの詳細な例は、ＭｏＭＬＶ、ＡＬＶ、ＢＬＶまたはＭＭＴＶなどの非発癌遺伝子キャリアであるスローオンコウイルス、およびＲＳＶなどのファストオンコウイルスである。レンチウイルスファミリーの例は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＣＡＥＶである。
欠損のある組換えレトロウイルスを構築するための技術は、文献に広範に記載されている（ＷＯ８９／０７１５０、ＷＯ９０／０２８０６、およびＷＯ９４／１９４７８）。これらの技術は通常、トランスジーンを含むレトロウイルスベクターを適当なパッケージング細胞株に導入し、その後、生成された、ゲノム内にトランスジーンを含むウイルスを回収することを含む。本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、ウイルス上清、精製ウイルスとのインキュベーションによる、前記Ｔｒｅｇ細胞とウイルスのパッケージング細胞との共培養による、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ技術によるなど、様々なプロトコルを利用して組換えウイルスで感染され得る。
本明細書で用いられる用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルス粒子に類似した構造を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの全てまたは一部を欠き、典型的かつ好ましくはウイルスゲノムの複製および感染成分の全てまたは一部を欠くため、非複製的である。本明細書で用いられる用語「非複製的」は、ＶＬＰ内に含まれる、または含まれないゲノムを複製し得ないことを指す。ＶＬＰは、当該技術分野で公知の技術により、例えばＷＯ０２／３４８９３として発表された国際特許出願に記載される通り、調製され得る。
本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を遺伝子改変するために用いられる核酸は、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチドなど）、ＲＮＡなどをはじめとする様々な生物活性生成物をコードし得る。詳細な実施形態において、該核酸は、免疫抑制活性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態において、該核酸は、細胞に対して毒性である、または条件つきで毒性であるポリペプチドをコードする。好ましい例としては、ＨＳＶ－１ ＴＫなどのチミジンキナーゼ（ヌクレオシド類似体の存在下で毒性を付与する）、シトシンデスアミナーゼなどが挙げられる。
核酸の別の好ましいカテゴリーは、該当する抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または自己抗原を含むキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）などのＴ細胞受容体またはそのサブユニットもしくは機能的均等物をコードするものである。例えば抗原に特異的な組換えＴＣＲまたはＣＡＲの発現は、必要とする患者において免疫反応を阻害するためにエフェクターＴ細胞上でより特異的かつ効率的に作用し得る本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を生成する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）設計の基本原理は、詳細に記載されている（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＣＡＲは、一般にはスペーサ／ヒンジおよび膜貫通ドメインを介して細胞内シグナル伝達ドメインに連結される、細胞外抗原認識部分を含む。「第一世代」のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化部分のみを含む。「第二世代」のＣＡＲの細胞内ドメインは、活性化部分、例えばＣＤ３ζとタンデムに、共刺激部分を含む。共刺激ドメインの例としては、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７およびＤＡＰ１０が挙げられるが、これらに限定されない。「第三の世代」のＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８の組み合わせなどの活性化部分、ＯＸＯ４０または４－１ＢＢなどの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ）、およびＣＤ３ζとタンデムに、２つの共刺激ドメインを含む。
ＣＡＲは一般に、生存および増殖シグナルを支持する共刺激性エンドドメインとタンデムに、細胞外抗原結合ドメインを、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζ鎖由来の細胞内シグナル伝達ドメインと融合することにより得られる。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、患者のＭＨＣと独立して機能し、臨床使用のために即座に作製し得るため、ＣＡＲに基づくアプローチでの以下に記載される病原性抗原の標的化は、有用である。
ＣＡＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインに融合された、自己免疫疾患に関与する自己抗原などの細胞外自己抗原を含む。ＣＡＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＣＤ１３７ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなどのＴまたはＮＫ受容体シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明のＣＤ８＋ Ｔｒｅｇは、遺伝子改変されており、細胞内シグナル伝達分子に連結された少なくとも１つのＣＡＲ、１つのＣＡＡＲおよび／または１つのネイティブ受容体を発現する。ＣＡＲの例としては、第一世代のＣＡＲ、第二世代のＣＡＲ、第三世代のＣＡＲ、３つよりも多くのシグナル伝達ドメイン（共刺激ドメインおよび活性化ドメイン）を含むＣＡＲ、および阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって一実施形態において、本発明は、キメラ抗原受容体を含む遺伝子改変されたＴｒｅｇ細胞である本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの単離集団、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
本発明によれば、該当する抗原を認識するＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片などの前記抗原に結合する受容体または受容体断片を含み得る。本発明によれば、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ヒト抗体または任意の他の種を起源とする抗体を含み得る。
本明細書で用いられる用語「抗体断片」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨドメインとＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多重特異性抗体、および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明のＣＤ８＋ Ｔｒｅｇは、遺伝子改変されており、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く。一実施形態において、機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを欠く本発明の遺伝子改変ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇは、同種Ｔｒｅｇである。
本発明のＴｒｅｇ細胞を捕捉する手段
本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの亜集団、詳細には本明細書の先に記載されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の亜集団は、細胞表面マーカーと、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４を生成するそれらの能力とによって操作的に特徴づけられ得る。
第二の態様において、本発明はしたがって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料から、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の亜集団を検出および／または単離する方法であって、以下のステップ：（ａ）ヒトＰＢＭＣまたはリンパ球の前記集団を、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させるステップ、を含む、方法に関する。
本発明はまた、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料から、場合によりＧＩＴＲ＋および／またはＦｏｘｐ３＋であるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および／または単離する方法であって、以下のステップ：（ａ）ヒトＰＢＭＣまたはリンパ球の前記集団を、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段と、場合によりＧＩＴＲ＋および／またはＦｏｘｐ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段と、接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させるステップ、を含む、方法に関する。
一実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、ＧＩＴＲ、Ｆｏｘｐ３およびＴＧＦβ－１のうちの少なくとも１つも発現するＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させることを含む。
別の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、Ｆｏｘｐ３とＧＩＴＲ、またはＦｏｘｐ３とＴＧＦβ－１、またはＧＩＴＲとＴＧＦβ－１も発現するＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させることを含む。
さらに別の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、ＧＩＴＲとＦｏｘｐ３とＴＧＦβ－１も発現するＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させることを含む。
一実施形態によれば、本発明の方法のステップ（ａ）でのヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団の単離は、本発明のＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞の活性化を必要としない。一実施形態によれば、本発明の方法のステップ（ｂ）での本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離は、ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を少なくとも１種の刺激剤で刺激した後に実施される。刺激剤の例は、本明細書の先に記載されている。
本明細書で用いられる用語「生体試料」は、末梢血単核細胞「ＰＢＭＣ」またはリンパ球を含有する任意の体液または組織を指す。本発明の状況において、「ＰＢＭＣまたはリンパ球を含有する液」は、血液（全血試料、血清試料、または血漿試料）および滑液を包含する。「リンパ球を含有する組織」は、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、パイエル板、および扁桃を包含する。
一実施形態において、本発明の方法は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞の培養物から得られた、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を獲得および／または単離するためのものである。本発明の状況において、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞の培養物は、例えばヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する生体試料から得ることができる。
ステップ（ａ）および（ｂ）では、該当するヒト細胞の集団の単離は、フローサイトメトリー法を用いたハイスループット細胞選別などの免疫選別技術、磁気ビーズ、生分解性ビーズ、非生分解性ビーズに標識された抗体でのアフィニティー法、およびそのような方法の組み合わせをはじめとする当業者に利用可能な特定の免疫細胞集団を検出する種々の方法によって実施され得る。
本明細書で用いられる用語「フローサイトメトリー法」は、該当する細胞を流体の流れに懸濁させて、それを電子検出装置に通すことによる、該当する細胞をカウントする技術を指す。フローサイトメトリー法は、蛍光パラメータなど、１秒あたり粒子数千個までの物理的および／または化学的パラメータの同時多パラメータ分析を可能にする。近代のフローサイトメトリー機器は通常、複数のレーザおよび蛍光検出器を有する。フローサイトメトリー技術の一般的バリエーションは、「蛍光活性化細胞選別」を利用して該当する集団を精製または検出するために、それらの特性に基づいて粒子を物理的に選別することである。
本明細書で用いられる「蛍光活性化細胞選別」（ＦＡＣＳ）は、各細胞の特異的光散乱および蛍光特性に基づいて、生体試料から得られた異種細胞混合物を１回で細胞１つずつ、２つ以上の容器に選別するフローサイトメトリー法を指す。ＦＡＣＳは、個々の細胞から得られた蛍光シグナルの迅速で客観的かつ定量的な記録、および特定の関心がある細胞の物理的分離を提供する。したがってＦＡＣＳを本明細書に記載された方法と共に用いて、例えばヒトＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞を単離することができる。
あるいは、本発明のヒトＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細には本発明によるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離は、磁気ビーズなどのビーズに基づく選別法を利用して実施され得る。
そのような方法を利用して、細胞は特定の細胞表面マーカーに関して陽性または陰性に分離および単離され得る。本明細書で定義される「陽性選択」は、特異的細胞表面マーカーを発現する細胞の単離および検出をもたらす技術を指し、「陰性選択」は、特異的細胞表面マーカーを発現しない細胞の単離および検出をもたらす技術を指す。幾つかの実施形態において、ビーズは、市販のビーズコンジュゲーションキットなどの当該技術分野で公知の標準的方法を利用して当業者により抗体でコーティングされ得る。幾つかの実施形態において、陰性選択ステップが、１種または複数の細胞系マーカーを発現する細胞を除去するために実施され、その後、該当するヒトＴｒｅｇ細胞（即ち、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ）を陽性選択する蛍光活性化細胞選別が実施される。
したがって一実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ヒトＰＢＭＣまたはリンパ球の集団を、非ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を除去するのに有用な手段と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で得られたヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用な手段と接触させるステップ、を含む。
典型的には、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団などの細胞集団を単離するのに有用な手段は、適切な細胞表面分子またはマーカーへの結合パートナー（抗体など）である。
特異的な結合パートナーとしては、捕捉部分および標識部分が挙げられる。捕捉部分は、直接的または間接的のいずれかで細胞と生成物の両方に結合するものである。標識部分は、生成物に付着し、直接的または間接的に標識され得るものである。特異的な結合パートナーは、生成物と結合パートナーの間に相対的に高い親和性および特異性が存在し、生成物：パートナー複合体が標識または細胞分離技術の際に検出されるように生成物：パートナー複合体の解離が相対的に遅い、任意の部分を含む。
捕捉部分は、場合により連結部分を通して、固定手段（アンカー部分）にカップリングし得、利用可能な捕捉部分の数を倍増させる連結部分も含み得、つまり例えば修飾デキストラン分子、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンをはじめとする分枝状ポリマーなどの生成物の捕捉能力を含み得る。
抗体などの捕捉部分にコンジュゲートされ得る標識部分は、当業者に周知である。例えば放射性同位体、例えば３２Ｐ、３５Ｓまたは３Ｈ；蛍光または発光マーカー、例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン、ペリジニン－クロロフィル－タンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（６－ＲＯＸ）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；抗体または抗体断片、例えばＦ（ａｂ）２断片；親和性標識、例えばビオチン、アビジン、アガロース、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、マトリックス結合体（ｍａｔｒｉｘ ｂｏｕｎｄ）、ハプテン；ならびに酵素または酵素基質、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）。
適切な細胞分子としては、ＣＤ３（Ｔ細胞（活性化））、ＣＤ８およびＣＤ４５ＲＣなどのヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の細胞表面マーカー、ならびにこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な他のＣＤマーカーまたは細胞接着分子が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段は、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な抗体である。
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段は、モノクローナル抗ヒトＣＤ３抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ８抗体およびモノクローナル抗ヒトＣＤ４５ＲＣ抗体からなり、場合により抗ヒトＧＩＴＲ抗体（好ましくはモノクローナル抗ヒトＧＩＴＲ抗体）をさらに含む、少なくとも３つの抗体の組み合わせである。
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段は、モノクローナル抗ヒトＣＤ３抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ８抗体およびモノクローナル抗ヒトＣＤ４５ＲＣ抗体からなり、場合により抗ヒトＧＩＴＲ抗体（好ましくはモノクローナル抗ヒトＧＩＴＲ抗体）および／または抗ヒトＦｏｘｐ３抗体（好ましくはモノクローナル抗ヒトＦｏｘｐ３抗体）をさらに含む、少なくとも３つの抗体の組み合わせである。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。本発明による「抗Ｘ抗体」または「Ｘ抗体」は、Ｘに特異的に結合し得る抗体である。
本発明の詳細な実施形態において、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な抗体は、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ８抗体および抗ヒトＣＤ４５ＲＣ抗体、好ましくはモノクローナル抗ヒトＣＤ３抗体、モノクローナル抗ヒトＣＤ８抗体およびモノクローナル抗ヒトＣＤ４５ＲＣ抗体である。本発明により企図されるヒトＣＤ３抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１、ＨＩＴ３ａ、Ｓ４．１およびＳＫ７が挙げられる。本発明により企図されるヒトＣＤ８抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体Ｃ８／１４４Ｂ、ＳＫ１、３Ｂ５、ＯＫＴ８、ＢＷ１３５／８０およびＲＰＡ－Ｔ８が挙げられる。本発明により企図されるヒトＣＤ４５ＲＣ抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＴ２およびＲＰ１／１２が挙げられる。
本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な抗体である。
より詳細には、ヒトＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な抗体は、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞により分泌されるサイトカイン（即ち、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４）の１種に結合し、そしてＴ細胞に特異的な、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な細胞表面分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５）に結合する二重特異性抗体である。本発明により企図される二重特異性抗体の例としては、ヒトＩＦＮγおよびヒトＣＤ４５に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＦＮγおよびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＦＮγおよびヒトＣＤ８に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＬ－１０およびヒトＣＤ４５に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＬ－１０およびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＬ－１０およびヒトＣＤ８に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＬ－３４およびヒトＣＤ４５に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＬ－３４およびヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体、ヒトＩＬ－３４およびヒトＣＤ８に結合する二重特異性抗体が挙げられる。例えば、ＩＦＮγまたはＩＬ－１０分泌アッセイ検出キットは、市販されている（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）。
一実施形態において、本明細書の先に記載されたヒトＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するために、本発明の方法のステップ（ｂ）は、ＩＦＮγとＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な細胞表面分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５）とに結合する二重特異性抗体、ＩＬ－１０とＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な細胞表面分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５）とに結合する二重特異性抗体、およびＩＬ－３４とＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的な細胞表面分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５）と、に結合する二重特異性抗体からなる群から選択される少なくとも２つの二重特異性抗体の組み合わせを含む。
ＩＦＮγ＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞のうち、１０％または２０％のみが、ＩＬ－１０＋である。本出願者により得られた結果によれば、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４は一般に、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞により共発現される。それゆえ一実施形態において、ステップ（ａ）で単離されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇから、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを単離するための二重特異性抗体の組み合わせは、ＩＦＮγとＴ細胞に特異的な細胞表面分子とに結合する二重特異性抗体、およびＩＬ－１０とＴ細胞に特異的な細胞表面分子とに結合する二重特異性抗体またはＩＬ－３４とＴ細胞に特異的な細胞表面分子とに結合する二重特異性抗体のいずれか、を少なくとも含む。
詳細な実施形態において、ＩＦＮγとＴ細胞に特異的な細胞表面分子とに結合する二重特異性抗体、ＩＬ－１０とＴ細胞に特異的な細胞表面分子とに結合する二重特異性抗体、およびＩＬ－３４とＴ細胞に特異的な細胞表面分子とに結合する二重特異性抗体が、該当する集団を単離するために用いられる。
二機能性抗体としても知られる二重特異性抗体は、第一の抗原のための少なくとも１つの抗原認識部位と、第二の抗原のための少なくとも１つの抗原認識部位と、を有する。そのような抗体は、組換えＤＮＡ法により、または当該技術分野で公知の方法により化学的に生成され得る。化学的に作製された二重特異性抗体としては、二価特性を保持するために還元および再形成された抗体、ならびに各抗原のための少なくとも２つの抗原認識部位を有するように化学的にカップリングされている抗体が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性抗体としては、全ての抗体もしくは抗体コンジュゲート、または２つの異なる抗原を認識することが可能な抗体のポリマー形態が挙げられる。抗体は、ポリマーまたは粒子上に固定され得る。
そのような二重特異性抗体を得るための技術は、国際特許出願ＷＯ９４／０９１１７に詳細に記載されている。
一実施形態において、本明細書の先に記載されたヒトＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するために、本発明の方法のステップ（ｂ）は、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、およびＴ細胞に特異的な細胞表面分子に結合する三重特異性抗体の使用を含む。
３つの抗原に同時結合する三重特異性抗体は、ＷＯ２０１６１０５４５０に記載されている。
本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段は、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な抗体、ならびにＧＩＴＲおよび／またはＦｏｘｐ３および／またはＴＧＦβ－１を検出するのに有用な抗体である。
より詳細には、ＧＩＴＲを検出するのに有用な抗体は、ヒト抗ＧＩＴＲ抗体である。ヒトＧＩＴＲ抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＡＢ６８９－１００、６２１、ｅＢｉｏＡＩＴＲ、１１０４１６が挙げられるが、これらに限定されない。
より詳細には、Ｆｏｘｐ３を検出するのに有用な抗体は、ヒト抗Ｆｏｘｐ３抗体である。ヒトＦｏｘｐ３抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＰＣＨ１０１、２５９Ｄ、２０６Ｄ、および２３６Ａ／Ｅ７が挙げられるが、これらに限定されない。
より詳細には、ＴＧＦβ－１を検出するのに有用な抗体は、ヒト抗ＴＧＦβ－１抗体である。ヒトＴＧＦβ－１抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＡＢ２４６３、ＴＷ４－６Ｈ１０、１９Ｄ８、およびｅＢｉｏ１６ＴＦＢが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段は、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な抗体、およびＩＬ－２を検出するのに有用な抗体である。
より詳細には、ＩＬ－２を検出するのに有用な抗体は、ヒト抗ＩＬ－２抗体である。ヒトＩＬ－２抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＱ１－１７Ｈ１２、および５３４４．１１１が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の方法のステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時に実施される。言い換えれば一実施形態において、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料から本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および／または単離するための本発明の方法は、ヒトＰＢＭＣまたはリンパ球の前記集団を、ヒトＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を単離するのに有用な手段と接触させることを含む。適切な手段の例は、本明細書の先に記載されている。
本発明はまた、樹状細胞、好ましくは形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の集団の存在下、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する単離されたペプチドまたはその機能的断片を含む培地で培養するステップを含む、本発明によるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団を作製するインビトロまたはエクスビボ法に関する。
一実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する単離されたペプチドは、５～４０アミノ酸の範囲内の長さを有し、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはその機能保存性変異体からの少なくとも５つの連続するアミノ酸を含む。好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する単離されたペプチドは、１５～４０アミノ酸の範囲内の長さを有し、アミノ酸配列：ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはその機能保存性変異体を含む。
別の実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する単離されたペプチドは、１１～１６アミノ酸の範囲内の長さを有し、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）またはその機能保存性変異体を含む。
本発明によれば、用語「機能保存性変異体」は、参照のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８など）と少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の同一性を含み、依然として機能的である、即ち、参照のペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２など）と実質的に同じ方法でＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団の作製を依然として誘導し得るペプチドを指す。
好ましくは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に由来する前記ペプチドは、
ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；
ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；
ＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
ＱＥＥＹＡＲＦＤ ＳＤ ＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
ＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＶＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；
ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＦＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
ＮＲＥＥＹＶＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ＮＱＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＶＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；
ＲＬＬＡＲＬＩＹＮＲＥＥＹＡＲＦＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰＳＡＥＹＲＮＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；
ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；
ＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；
ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；
ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；
ＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥＬＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；
ＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、
からなる群から選択される。
一実施形態において、前記方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を、先に記載されたＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培地で培養するステップを含む。
本発明によれば、用語「ＭＨＣ／ペプチド多量体」は、先に記載されたＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチドを装填された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質サブユニットで構成された安定した多量体複合体を指す。前記ＭＨＣ／ペプチド多量体（本明細書ではＭＨＣ／ペプチド複合体とも呼ばれる）としては、ＭＨＣ／ペプチド二量体、三量体、四量体または五量体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、四量体である。
記載されたＭＨＣクラスＩＩ分子に由来するペプチド、およびＭＨＣ／ペプチド多量体は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５１５０４９１およびＷＯ２０１５１５０４９２に記載されている。
濃縮方法／除去方法／キット
本発明はまた、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の細胞集団を濃縮する方法であって
－ 本明細書の先に記載された通りヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料中のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋を分泌する該ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出すること、
－ 前記細胞を選択し、
それによりＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が濃縮された細胞集団を得ること、
を含む、方法に関する。
したがって一実施形態において、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を濃縮する方法は、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料を、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を単離するのに有用な手段と接触させること、
－ 該ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞から該ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および選択し、
それによりＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮された細胞集団を得ること、
を含む。
ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋を分泌するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および／または選択する方法は、本明細書の先に記載されている。例えば細胞を分離、単離、または選択する方法としては、抗体コーティング磁気ビーズを用いた磁気分離（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ、米国特許第５，７５９，７９３号）、および固体マトリックス（例えば、プレート）へ付着された抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーまたは「パンニング」が挙げられるが、これらに限定されない。正確な分離を提供するさらなる技術としては、マルチカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、またはインピーダンスチャネルなどの様々な度合いの精巧化を有し得る、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられる。死亡細胞は、死亡細胞に関連する染色、例えば（ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ）での選択により排除され得る。赤血球細胞は、例えばエルトリエーション、溶血、またはＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配法により除去され得る。選択された細胞の生存性に過度の有害とならない当該技術分野で周知の任意技術が、用いられ得る。
本発明によれば、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を濃縮する方法は、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料を、非ＣＤ８＋細胞のマーカーに結合する少なくとも１種の試薬と接触させ、それにより非ＣＤ８＋細胞を除去すること、
－ 本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出し、それらを選択し、
それによりＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮された細胞集団を得ること、
を含み得る。
一実施形態において、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を濃縮する方法は、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料を、非ＣＤ８＋細胞のマーカーに結合する少なくとも１種の試薬と接触させ、それにより非ＣＤ８＋細胞を除去すること、
－ 本明細書の先に記載されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および単離すること、および
－ 該ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞から本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および選択し、
それによりＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮された細胞集団を得ること、
を含む。
非ＣＤ８＋細胞に結合するマーカーの例としては、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９が挙げられるが、これらに限定されない。
前記マーカーに結合する好ましい試薬は、抗体である。一実施形態において、該抗体は、蛍光色素または磁気粒子にコンジュゲートされる。別の実施形態において、該細胞選択は、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気選択、アフィニティークロマトグラフィーもしくはパンニング、またはそれらの組み合わせにより実施される。
別の態様において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮集団に関する。ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の前記濃縮集団は、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を濃縮する方法によって得ることができる。
本明細書で用いられる、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮集団は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％が本来得られる細胞集団中のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％よりも高いものである。ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮集団は、可能ではあるが、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の均質な集団を含有する必要はない。詳細な実施形態において、該組成物の前記細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％が、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞である。別の実施形態において、濃縮集団中のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％は、濃縮前のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍である。
濃縮方法は、濃縮工程の各ステップに関連した濃縮レベルに基づいて変動し得る。ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮レベルおよび純度％は、非限定的にドナー、細胞／組織供給源およびドナーの疾患状態をはじめとする多くの因子に依存するであろう。詳細な実施形態において、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１０５倍、約１１０倍、約１１５倍、約１２０倍、約１３０倍、約１４０倍、約１５０倍、または約２００倍濃縮される。
本発明はまた、
－ 本明細書の先に記載されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料において、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋を分泌する該ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出すること、
－ 前記細胞を除去すること、
－それによりＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が除去された細胞集団を得ること、
を含む、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の細胞集団を除去する方法に関する。
ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋を分泌するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を検出および／または選択する方法は、本明細書の先に記載されている。
別の態様において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が除去された集団に関する。前記ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が除去された集団は、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の細胞集団を除去する方法により得ることができる。
本明細書で用いられるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が除去された集団は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％が本来得られる細胞集団内のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％よりも低いものである。
一実施形態において、該除去された集団中のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％は、除去前のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合％の、多くとも０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２５倍、０．２倍、０．１５倍、０．１倍である。
制御性Ｔ細胞の除去は、癌患者においてワクチン介在性免疫を増強することが示されている（Ｄａｎｎｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５，１１５（１２）：３６２３－３６３３）。したがって、本発明の別の実施形態において、本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の除去は、前記Ｔｒｅｇ細胞が処置にとって有害である、または害を及ぼす可能性があるような、癌または感染性疾患を処置する細胞療法で用いられ得ることを提唱する。例えば癌処置において、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の一時的除去は、ワクチン処理／免疫療法プロトコルの前であれば興味が持たれる可能性があり、前記一時的除去は、本発明の除去方法により装置を通してエクスビボで患者の血液を除去すること、およびそれを直ちに該患者へ再注入すること、により得られる。したがって前記実施形態において、患者の血液からのＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の除去は、装置を通してエクスビボで実施される。
本発明はまた、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞集団を同定もしくは単離するための、またはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の細胞集団を濃縮もしくは除去するためのキットに関し、前記キットは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＣの細胞表面発現を検出するための試薬、ならびにＩＦＮγおよびＩＬ－１０および／またはＩＬ－３４の分泌を検出する手段を含む。
好ましくは、前記試薬は抗体である。より好ましくは、これらの抗体は、蛍光色素または磁気粒子にコンジュゲートされている。
１つの詳細な実施形態において、前記試薬は、微小管阻害薬、アルキル化剤およびＤＮＡ副溝結合剤などの細胞障害剤にコンジュゲートされた抗体である。細胞障害剤の例としては、マイトマイシン、アウリスタチン、およびメイタンシン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、前記試薬は、抗生物質への抗体コンジュゲートである。抗生物質の例としては、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、フシジン酸、ストレプトマイシン、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン、ポリミキシン、ホスホマイシン、バンコマイシン、リストセチン、バシトラシン、グラミシジン（ｇｒａｍａｃｉｄｉｎ）、ペニシリンおよびセファロスポリンが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、前記キットは、Ｆｏｘｐ３発現および／またはＧＩＴＲ発現および／またはＴＧＦβ－１発現および／またはＩＬ－２発現を検出する試薬をさらに含む。好ましくは、前記試薬は抗体である。より好ましくは、前記抗体は、蛍光色素にコンジュゲートされている。
本発明のＴｒｅｇ細胞を増幅させる手段
第三の態様において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を培養するステップ、好ましくはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地と接触させるステップを含む、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を増幅させる方法に関する。
一実施形態において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地と接触させるステップを含む、場合によりＧＩＴＲ＋および／またはＦｏｘｐ３＋であるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を増幅させる方法に関する。
一実施形態において、本発明は、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地と接触させるステップを含む、ＧＩＴＲ、Ｆｏｘｐ３およびＴＧＦβ－１のうちの少なくとも１つを発現するＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞を増幅させる方法に関する。
一実施形態において、本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団は、凍結され、続いて解凍された後、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地と接触される。本発明者らは、本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞がそのような解凍後でもより効率的に増幅し得ることを実証した。事実、本発明者らは、本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇが新たに分別された場合よりも解凍された場合に、より効率的に増殖することを観察した。
本明細書で用いられる用語「増幅させること」は、細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞）の所与の集団を変換および／または増大する工程を指す。Ｔ細胞の増幅は、好ましくは抗原、細胞（同種移植片の移植の状況ではドナー細胞など）、ＭＨＣポリマー、抗体（抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体など）、レクチン（ＰＨＡなど）などの抗原特異性刺激剤の存在下でＴ細胞を含む細胞集団を培養することにより実施される。増幅はまた、サイトカイン（ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＩＬ－３４および炎症促進性サイトカイン（例えばＩＬ－１（詳細にはＩＬ－１β）、ＩＬ－６およびＴＮＦαなど）など）の存在下でＴ細胞の培養を必要とし得る。
本明細書で用いられる用語「培地」は、細胞の生存性を維持して増殖を支援する栄養素を含有する細胞集団を維持するため、または細胞集団を培養するための媒体を指す。培地は、適切な組み合わせで、以下のもの：塩（複数可）、緩衝剤（複数可）、アミノ酸、グルコースまたは他の糖（複数可）、抗生物質、血清または代替血清、および他の成分、例えば増殖因子、サイトカインなど、のいずれかを含有し得る。特定の細胞型で通常用いられる培地は、当業者に公知である。本発明の培地は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＲＰＭＩ １６４０などの市販の媒体に基づき得る。
一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを増幅させるのに適した媒体は、少なくとも１種の刺激剤を含む。一実施形態において、前記少なくとも１種の刺激剤は、抗原、細胞、ＭＨＣポリマー、抗体およびレクチンを含む群から選択される。一実施形態において、前記少なくとも１種の刺激剤は、抗原特異性であり、抗原、細胞、ＭＨＣポリマー、および抗体からなる群から選択される。一実施形態において、前記少なくとも１種の刺激剤は、同種抗原提示細胞、抗ＣＤ３抗体、および／または抗ＣＤ８抗体、ＰＭＡ＋イオノマイシンを含む群から選択される。
一実施形態において、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを増幅させるのに適した媒体は、一定量の少なくとも１種のサイトカインを含む。Ｔｒｅｇを増幅させるのに適した媒体中に存在し得るサイトカインの例としては、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＩＬ－３４および炎症促進性サイトカイン（例えばＩＬ－１（詳細にはＩＬ－１β）、ＩＬ－６およびＴＮＦαなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地は、一定量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）および／または一定量のインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を含む。
詳細な実施形態において、ＩＬ－２は、ヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）、好ましくは組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２）である。ｒｈＩＬ－２が医薬的使用のために市販されていることが、さらに留意されなければならない。適切な商業形態としては、例えばＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、組換えヒトＩＬ－２組成物が挙げられる。
詳細な実施形態において、ＩＬ－１５は、ヒトインターロイキン－１５（ｈＩＬ－１５）、好ましくは組換えヒトインターロイキン－１５（ｒｈＩＬ－１５）である。
典型的にはＩＬ－２は、１００～１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５００～５０００Ｕ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは１０００Ｕ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－１５は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５～５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－１２は、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１～５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－４は、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１～２０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－７は、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５～５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＦＮγは、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－３４は、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－１は、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５～５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＩＬ－６は、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＴＮＦは、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的にはＴＧＦベータは、０．０１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～１０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌで、本発明の培地に添加される。
典型的には、該当する培地での本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の培養は、少なくとも６日間、例えば少なくとも６日から１５日以下までの間、または少なくとも６日から２０日以下までの間、または少なくとも６日から６～８週間以下までの間、好ましくは１４日間、実施されるであろう。一実施形態において、該当する培地での本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の培養は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日間実施される。一実施形態において、該当する培地での本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の培養は、１週間、２週間、３、４、５、６、７、８、９または１０週間またはより長く実施される。
一実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の培養０日目に、培地に添加される。別の実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５はさらに、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０日目に１回、２回、もしくは３回または４回以上、培地に添加される。一実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、本発明のヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の培養の０日目、および５、６、７、８または９日目、好ましくは０および７日目に培地に添加される。別の実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、３回、好ましくは０日目およびさらに２回、培地に添加される。別の実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、４回、好ましくは０日目およびさらに３回、培地に添加される。別の実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、５回、好ましくは０日目およびさらに４回、例えば０、６、１３、１６および１８日目に培地に添加される。一実施形態において、サイトカイン、好ましくはＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、０日目と、培養終了まで２、３、または４日ごとに添加される。
一実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地は、一定量の該当する少なくとも１種の抗原を含む。典型的には所与の抗原は、１μｇ／ｍｌの濃度で本発明の培地に添加される。
詳細な実施形態において、該増幅は、ポリクローナル増幅（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）である。ポリクローナル増幅は、抗ＣＤ３ Ａｂおよび抗ＣＤ２８ Ａｂならびに／または同種抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いることにより得ることができる。
一実施形態において、０．１～１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５～４μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および／または０．１～１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５～４μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体が、培地に添加される。
一実施形態において、１：１～１：１０、好ましくは１：２～１：６、より好ましくは１：４の範囲内のＴｒｅｇ：同種抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＡＰＣが、培地に添加される。
本発明の状況において、増幅された、または増幅されていない本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団はその後、抗原特異性ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を得るために、該当する抗原でパルスされ得るが、前記抗原は、本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を「プライミング」し、それにより前記抗原に特異的なＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を得るのに効果的な量で提供される。事実、そのような増幅された抗原特異性ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、自己免疫障害、治療性タンパク質への免疫反応、および／またはアレルギーに関与するものなど、望まない免疫反応の予防または処置に有用である。
したがって、処置される疾患に関連する抗原（病原性抗原）に特異的なＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団が、得られなければならない。それゆえ、該当する抗原は、自己抗原、同種抗原、一般的なヒトの食事からの食物抗原、炎症性抗原およびアレルゲンからなる群から選択される。
用語「自己抗原」は、個体のタンパク質に由来する免疫原性ペプチドを指す。例としては、以下の非限定的列挙の自己抗原であり得る：アセチルコリン受容体、アクチン、アデニンヌクレオチドトランスロケータ、アドレノレセプター、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ、アシアロ糖タンパク質受容体、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰｉ）、カルシウム感知受容体、コレステロール側鎖切断酵素、コラーゲンＩＶ型鎖、チトクロームＰ４５０ ２Ｄ６、デスミン、デスモグレイン－１、デスモグレイン－３、Ｆ－アクチン、ＧＭ－ガングリオシド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、グルタミン酸受容体、Ｈ／Ｋ ＡＴＰａｓｅ、１７－α－ヒドロキシラーゼ、２１－ヒドロキシラーゼ、ＩＡ－２（ＩＣＡＳ１２）、インスリン、インスリン受容体、１型内因子、白血球機能抗原１、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、ミオシン、Ｐ８０－コイリン（ｃｏｉｌｉｎ）、ピルビン酸脱水素酵素複合体Ｅ２（ＰＤＣ－Ｅ２）、ヨウ化ナトリウム共輸送体、ＳＯＸ－１０、甲状腺および眼筋共有タンパク質、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、チロトロピン受容体、組織トランスグルタミナーゼ、転写活性化補助因子ｐ７５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＣＴＨ、アミノアシル－ｔＲＮＡ－ヒスチジル合成酵素、カルジオリピン、炭酸脱水酵素ＩＩ、セントロメア関連タンパク質、ＤＮＡ依存ヌクレオソーム刺激ＡＴＰａｓｅ、フィブリラリン、フィブロネクチン、グルコース６リン酸イソメラーゼ、ベータ２－糖タンパク質Ｉ、ゴルジン（９５、９７、１６０、１８０）、ヒートショックタンパク質、半接着斑タンパク質１８０、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、ケラチン、ＩｇＥ受容体、Ｋｕ－ＤＮＡタンパク質キナーゼ、Ｋｕ－核タンパク質、Ｌａリンタンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、ＲＮＡポリメラーゼＩ～ＩＩＩ、シグナル認識タンパク質、トポイソメラーゼＩ、チューブリン、ビメンチン、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１１）、２’，３’－環状ヌクレオチド３－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ＢＰ抗原１（ＢＰＡＧ１－ｅ）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、ヒトミトコンドリア自己抗原ＰＤＣ－Ｅ２（Ｎｏｖｏ１および２）、ＯＧＤＣ－Ｅ２（Ｎｏｖｏ３）、およびＢＣＯＡＤＣ－Ｅ２（Ｎｏｖｏ４）、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）１８０、ラミニン５（ＬＮ５）、ＤＥＡＤ－ボックスタンパク質４８（ＤＤＸ４８）、またはインスリノーマ関連抗原－２。
用語「一般的なヒトの食事からの食物抗原」は、以下の非限定的列挙の食物抗原など、ヒトに共通する食料から得られる免疫原性ペプチドを指す：ウシ抗原、例えばリポカリン、Ｃａ結合Ｓ１００、アルファ－ラクトアルブミン、ベータ－ラクトグロブリンなどのラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、カゼイン。食物抗原はまた、タイセイヨウサケ抗原、例えばパルブアルブミン、トリ抗原、例えばオボムコイド、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチーム、またはトリ血清アルブミン、ピーナッツ、エビ抗原、例えばトロポミオシン、コムギ抗原、例えばアグルチニンまたはグリアジン、セロリ抗原、例えばセロリプロフィリン、ニンジン抗原、例えばニンジンプロフィリン、リンゴ抗原、例えば、タウマチン、リンゴ脂質輸送タンパク質、リンゴプロフィリン、洋ナシ抗原、例えば、洋ナシプロフィリン、イソフラボンレダクターゼ、アボカド抗原、例えばエンドキチナーゼ、アンズ抗原、例えばアンズ脂質輸送タンパク質、モモ抗原、例えばモモ脂質輸送タンパク質またはモモプロフィリン、ダイズ抗原、例えばＨＰＳ、ダイズプロフィリン、または（ＳＡＭ２２）ＰＲ－１０タンパク質であり得る。
用語「炎症性抗原」は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異性タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１）、ヒートショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異性タンパク質（ＯＳＰ）、ＮＯＧＯ Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’－環状ヌクレオチド３－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、シトルリン置換型の環状および直鎖状フィラグリンペプチド、ＩＩ型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、異種核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ Ｂ１、ｈｎＲＮＰ Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＨＳＰ６０、６５、７０および９０、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノーゲン、コラーゲンＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型ペプチド、アネキシンＶ、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル－カルパスタチン、ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ－７０、Ｓｃｌ－１００、アニオンカルジオリピンおよびホスファチジルセリンを含むリン脂質抗原、中性電荷のホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、フィブリリン、アグリカン（ａｇｇｒｅｃｃａｎ）を指す。
用語「アレルゲン」は、吸入アレルゲン、摂取アレルゲンまたは接触アレルゲンを指す。アレルゲンの例としては、花粉（Ｃｕｐ、Ｊｕｎ）、イエダニ類（Ｄｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｐ）、イヌ、ネコおよびげっ歯類（Ｃａｎ、Ｆｅｌ、Ｍｕｓ、Ｒａｔ）由来の吸入アレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。接触アレルゲンの例としては、重金属（ニッケル、クロム、金など）、ラテックス、ハロタンなどのハプテン、ヒドララジンが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって一実施形態において、自己免疫疾患が、多発性硬化症である場合、自己抗原は、ミエリン関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（例えば、ＭＢＰ８３－１０２ペプチド）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）（例えば、ＭＯＧ３５－５５ペプチド）およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（例えば、ＰＬＰ１３９－１５１ペプチド）からなる群から選択される。自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）である場合、自己抗原は、インスリン、インスリン前駆体プロインスリン（ＰｒｏＩｎｓ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、膵島特異性グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連抗原－２（ＩＡ－２）および亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）からなる群から選択される。自己免疫疾患が、関節リウマチである場合、自己抗原は、ＩＩ型コラーゲン（ＣＴＩＩ）である。
同じく同種抗原として、同種移植片、遺伝子療法の過程で発現されるタンパク質（用いられるウイルスベクターから発生したウイルス抗原も）および治療性タンパク質により発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されないものとする。同種抗原は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、マイナー抗原、例えばＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－８、ＨＢ－１、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＢＣＬ２Ａ１、ＨＹ Ｂ７、ＨＹ Ａ２、 ＨＹ Ａ１、ＨＹ Ｂ６０、ＨＹ Ｂ８、ＨＹ ＤＱ５、ＨＹ ＤＲＢ３、ならびに血液型抗原ＡおよびＢからなる群から選択される。
そのため「同種移植片」は、２つの遺伝子的に異なるＭＨＣハプロタイプだけでなくマイナー組織適合性抗原および血液型を有する同じ種の２つの個体間の移植体である。したがって、同種移植片拒絶を予防または処置するために、該ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、典型的には患者（またはレシピエント）から単離され、ドナーの細胞を利用することにより増幅される。あるいは該ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、ドナーから得られた抗原の混合物を用いることにより増幅され得る。
用語「治療性タンパク質」は、任意の所与の状態または疾病の治療におけるタンパク質またはペプチド、およびそれらの投与を指す。治療性タンパク質は、患者に投与される任意のタンパク質またはペプチド、例えば治療性抗体、サイトカイン、酵素または任意の他のタンパク質に関する。タンパク質療法の例は、血漿由来または組換え体凝固因子濃縮物（例えば、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子）の投与を介した血友病の処置、モノクローナル抗体を用いた癌もしくは心臓血管疾患の処置、または酵素補充療法による代謝もしくはリソゾーム疾患の処置に関する。
詳細な実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞を増幅させるのに適した培地は、一定量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）および／または一定量のインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、ならびに一定量の少なくとも１種の該当する抗原を含む。
別の態様において、本発明は、増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＦｏｘｐ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。一実施形態において、本発明は、増幅されたＴＧＦβ－１＋ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。別の実施形態において、本発明は、ＧＩＴＲ＋および／またはＦｏｘｐ３＋である、増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。別の実施形態において、本発明は、増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＦｏｘｐ３＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。別の実施形態において、本発明は、増幅されたＴＧＦβ－１＋ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＦｏｘｐ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。別の実施形態において、本発明は、増幅されたＴＧＦβ－１＋ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、増幅されたＴＧＦβ－１＋ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＦｏｘｐ３＋ＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
先に記載された増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の前記単離集団は、先に記載された本発明のＴｒｅｇ細胞を増幅させる方法によって得ることができる。詳細な実施形態において、前記ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、抗原特異性である。
本発明はまた、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、場合によりヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、
－ 場合により該単離されたＴｒｅｇ細胞を凍結し、続いて解凍すること、および
－ 前記細胞を培養で増幅させること、
を含む、本発明によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を生成する方法に関する。
一実施形態において、前記方法は、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料から、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞であるＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、
－ 場合により該単離されたＴｒｅｇ細胞を凍結し、続いて解凍すること、および
－ 前記細胞を培養で増幅させること、
を含む。
事実、本発明者らは、ＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の亜集団が、高度の抑制活性を有することを実証した。
一実施形態において、本発明はまた、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、場合によりヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料からＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、
－ 場合により該単離されたＴｒｅｇ細胞を凍結し、続いて解凍すること、および
－ 前記細胞を培養で増幅させること、
を含む、ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を生成する方法に関する。
一実施形態において、前記方法は、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料から、ＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、
場合により該単離されたＴｒｅｇ細胞を凍結し、続いて解凍すること、および
－ 前記細胞を培養で増幅させること、
を含む。
別の実施形態において、前記方法は、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料から、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を単離すること、
－ 場合により該単離されたＴｒｅｇ細胞を凍結し、続いて解凍すること、および
－ 前記細胞を培養で増幅させること、
を含む。
ヒトＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞を単離する方法、およびＴｒｅｇ細胞を増幅させる方法は、本明細書の先に記載されている。
一実施形態において、ＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＧＩＴＲを検出するのに有用な抗体で単離され得る。ヒトＧＩＴＲ抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＡＢ６８９－１００、６２１、ｅＢｉｏＡＩＴＲ、１１０４１６が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＧＩＴＲを検出するのに有用な抗体、およびＣＤ４５ＲＣを検出するのに有用な抗体で単離され得る。ヒトＧＩＴＲ抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＡＢ６８９－１００、６２１、ｅＢｉｏＡＩＴＲ、１１０４１６が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＣＤ４５ＲＣ抗原に結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体ＭＴ２およびＲＰ１／１２が挙げられる。
一実施形態において、ＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞またはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞は、少なくとも１種の刺激剤でのＰＢＭＣまたはリンパ球の活性化後に、本発明の方法により単離される。刺激剤の例は、本明細書の先に記載されている。
一実施形態において、本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞の培養物から誘導および単離される。本発明の状況において、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞の培養物は、例えばヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する生体試料から得ることができる。
本発明はまた、
－ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料において、ＣＤ８＋ＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を検出すること、場合によりヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球を含有する生体試料において、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＧＩＴＲ＋Ｔｒｅｇ細胞を検出すること、
－ 前記細胞を除去すること、
－ それによりＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が除去された細胞集団を得ること、
を含む、本発明のＣＤ８＋Ｔｒｅｇの集団を除去する方法に関する。
本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団、好ましくは本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を含む組成物を提供する。一実施形態において、本発明による組成物は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮集団を含む。一実施形態において、本発明による組成物は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇが除去された細胞集団、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が除去された集団を含む。別の実施形態において、本発明による組成物は、本発明の遺伝子改変ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの集団、詳細には遺伝子改変ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を含む。
別の実施形態において、本発明による組成物は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の増幅集団を含む。別の実施形態において、本発明による組成物は、本発明の抗原特異性ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの増幅集団、詳細には抗原特異性ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の増幅集団を含む。
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態において、該医薬組成物は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団と、医薬的に許容できる担体と、を含む。一実施形態において、該医薬組成物は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団と、医薬的に許容できる担体と、を含む。一実施形態において、該医薬組成物は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮集団と、医薬的に許容できる担体と、を含む。一実施形態において、該医薬組成物は、本発明の遺伝子改変ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載された遺伝子改変ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団と、医薬的に許容できる担体と、を含む。
別の実施形態において、該医薬組成物は、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載された増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団と、医薬的に許容できる担体と、を含む。詳細な実施形態において、該医薬組成物は、本発明の増幅された抗原特異性ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載された増幅された抗原特異性ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団と、医薬的に許容できる担体と、を含む。
該医薬組成物は一般に、１種または複数の医薬的に許容できる、そして／または認可された添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤および／または安定化剤を含み得る。そのような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであり得る。適切な担体は、典型的には大きく緩徐に代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体などである。この医薬組成物は、インビボ投与に適した追加の添加剤、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなど、または他の添加剤、例えば抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定化剤もしくは組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含有し得る。
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容できる」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与された時に、有害反応、アレルギー反応または他の望まない反応を生じない分子物質および組成物を指す。医薬的に許容できる担体または賦形剤は、非毒性で固形、半固形、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の配合補助剤を指す。
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を含む医薬を提供する。一実施形態において、本発明の医薬は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団を含む。一実施形態において、本発明の医薬は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の濃縮集団を含む。一実施形態において、本発明の医薬は、本発明の遺伝子改変されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明による遺伝子改変されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団を含む。
一実施形態において、本発明の医薬は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の増幅集団を含む。一実施形態において、本発明の医薬は、本発明の抗原特異性ＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの増幅集団、詳細には本発明による抗原特異性ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の増幅集団を含む。
本発明のＴｒｅｇ細胞の治療法および使用
上述の通り、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団は、免疫系による自己組織または治療性タンパク質の変性を回避するための自己免疫性、慢性炎症、アレルギー、移植（移植片拒絶またはＧＶＨＤを予防または処置するため、のいずれか）、遺伝子療法および治療性タンパク質での処置の分野で関心が寄せられている。本発明によるヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団は、事実、免疫寛容を誘導する能力、ならびに／または免疫反応、好ましくは処置される疾患に関与する抗原（複数可）に対する抗原特異性免疫反応（複数可）および／もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞により介在される望まない獲得免疫反応、好ましくは免疫Ｔ細胞寛容またはＴ細胞活性化の低減を抑制および／もしくは阻害する能力を示す。好ましくは本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団は、処置される患者から単離される（そしてエクスビボ増幅後に患者に再投与される）。
したがって、本発明の態様は、医薬として使用するための、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。本発明の別の態様は、医薬として使用するための、好ましくは抗原特異性の、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明の増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団（好ましくは増幅された抗原特異性集団）は、複数のアプローチにより患者に再導入され得る。好ましくは、それらは静脈内注射される。一実施形態において、約１×１０４～約１×１０８細胞が、患者に再導入される。別の実施形態において、約１×１０６～約１０×１０６細胞／ｋｇ患者体重が、患者に再導入される。
用語「予防する」、「予防すること」および「予防」は、本明細書において、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の投与から得られる、対象における障害の発生もしくは開始の阻害、または障害の１つもしくは複数の症状の再発、開始もしくは発生の予防を指す。
本明細書で用いられる用語「処置」は、治療的処置、ならびに防御的および予防的措置を指し、その目的は、標的とされる病理学的障害または状態を予防または緩徐化する（低減する、減弱する）ことである。処置を必要とするものとしては、既に障害を有するもの、および障害を有することが立証されたものが挙げられる。本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明によるＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の治療的量を受けた後、患者が以下の事柄の１つまたは複数において観察可能および／もしくは測定可能な減少、または非存在を示せば、患者は、望まない免疫反応について「処置」に成功している：病原性細胞の数の減少；全細胞のうちの病原性である割合の減少；および／または特異的疾患もしくは状態に関連する症状の１つもしくは複数のある程度の緩和；罹患率および致死率の減少、ならびに生活の質問題の改善。疾患における処置および改善の成功を評定する上記パラメータは、医師に熟知された日常的手順によって即座に測定可能である。
本明細書で用いられる用語「患者」は、医療ケアを待っている、もしくは受けているヒト、または医療的処置の対象であった／対象である／対象になる予定のヒト、または疾患の発生もしくは進行をモニタリングされるヒトを指す。一実施形態において、患者は、成人（例えば、１８歳を超える患者）である。別の実施形態において、患者は、小児（例えば、１８歳未満の患者）である。一実施形態において、患者は、男性である。別の実施形態において、患者は、女性である。
本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、標的への有意な負の作用または有害副作用を誘発せずに、（１）望まない免疫反応の開始を遅延もしくは予防すること；（２）望まない免疫反応の１つまたは複数の症状の進行、深刻化もしくは悪化を緩徐化もしくは停止させること；（３）望まない免疫反応の症状の緩和をもたらすこと；（４）望まない免疫反応の重症度もしくは発生率を低減すること；または（５）望まない免疫反応を治癒させること、を目的とする、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細にはＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の数を指す。治療有効量は、防御もしくは予防作用のために、望まない免疫反応の開始前に投与され得る。代わりまたは追加として、該治療有効量は、治療作用のために、望まない免疫反応の開始後に投与され得る。該有効量は、患者の年齢、性別、種族、一般的状態など、処置される病気の重症度、処置期間、任意の併用処置の性質、用いられる医薬的に許容できる担体、ならびに当業者の知識および専門技術内の類似の因子に応じて変動するであろう。適宜、任意の個体における「有効量」は、関連する教書および文献を参照することにより、そして／または日常的実験を利用することにより、当業者によって決定され得る（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ ＮＪ参照）。
一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を予防または処置する方法において使用するための、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を予防または処置する方法において使用するための、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明の増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団の治療有効量を、必要とする患者に投与するステップを含む、自己免疫疾患を予防または処置する方法に関する。
本明細書で用いられる用語「自己免疫疾患」は、免疫系が正常な宿主の一部である抗原（即ち自己抗原）に対して免疫反応（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞の応答）を生成し、結果的に組織の傷害を伴う疾患を指す。自己免疫疾患において、宿主の免疫系は、特定の抗原を「自己」と認識することができず、免疫反応が抗原を発現する宿主組織に対して開始される。
ヒトに影響を及ぼす模範的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン関節炎、アジュバント関節炎、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、１型糖尿病、非肥満型糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、後天性血友病、血栓性血小板減少性紫斑病などが挙げられる。
別の実施形態において、本発明は、慢性炎症性疾患を予防または処置する方法において使用するための、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
一実施形態において、本発明は、慢性炎症性疾患を予防または処置する方法において使用するための、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明の増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
ヒトに影響を及ぼす慢性炎症性疾患の例としては、非自己免疫性炎症性腸疾患、術後癒着、冠動脈疾患、肝線維症、急性呼吸促拍症候群、急性炎症性膵炎、内視鏡的逆行性胆道膵管造影誘発性膵炎、熱傷、冠動脈、大脳動脈および末梢動脈のアテローム形成、虫垂炎、胆嚢炎、憩室炎、内臓線維性障害（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、創傷治癒、皮膚瘢痕障害（ｓｋｉｎ ｓｃａｒｒｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ケロイド、汗腺膿瘍）、肉芽腫性疾患（サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変）、喘息、壊疽性膿皮症、スイート症候群、ベーチェット病、原発性硬化性胆管炎および膿瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明は、移植片拒絶を予防もしくは処置する（または移植体寛容性を誘導する）方法、またはＧＶＨＤを予防もしくは処置する方法において使用するための、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
別の実施形態において、本発明は、移植片拒絶を予防もしくは処置する（または移植体寛容性を誘導する）方法、またはＧＶＨＤを予防もしくは処置する方法において使用するための、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明の増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団の治療有効量を、必要とする患者に投与するステップを含む、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防もしくは処置する方法、または移植片拒絶を予防もしくは処置する（または移植体寛容性を誘導する）方法に関する。
本明細書で用いられる用語「移植片拒絶」は、急性および慢性移植片拒絶の両方を包含する。「急性拒絶」は、移植された組織が免疫学的に外来物である場合の、組織移植体レシピエントの免疫系による拒絶である。急性拒絶は、エフェクター機能を実施して、移植片組織を破壊する、レシピエントの免疫細胞による移植片組織の浸潤を特徴とする。急性拒絶の開始は急速であり、一般にはヒトにおいて、移植手術後２、３週間以内に起こる。一般に急性拒絶は、ラパマイシン、シクロスポリン、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体などの免疫抑制剤で阻害または抑制され得る。「慢性移植片拒絶」は、一般にはヒトにおいて、急性拒絶の免疫抑制が成功した場合でも、生着後数ヶ月～数年以内に起こる。線維症は、全てのタイプの臓器移植片の慢性拒絶における共通の要因である。
用語「移植」およびその変形例は、移植が同系間であるか（ドナーとレシピエントが遺伝子的に同一であるか）、同種間であるか（ドナーとレシピエントが異なる遺伝子起源であるが同じ種のものであるか）、または異種間であるか（ドナーとレシピエントが異なる種のものであるか）にかかわらず、レシピエントへの移植体（移植片とも呼ばれる）の挿入を指す。したがって典型的なシナリオにおいて、宿主はヒトであり、移植片は同一または異なる遺伝子起源のヒトに由来する同系移植片である。別のシナリオにおいて、移植片は、系統学的に広範囲に分別された種の動物をはじめとする、移植される種と異なる種に由来する（例えばヒト宿主へ移植されるヒヒの心臓）。
一実施形態において、移植片のドナーは、ヒトである。移植片のドナーは、生存するドナーまたは死去したドナー、即ち屍体のドナーであり得る。
一実施形態において、移植体は、臓器、組織または細胞である。
本明細書で用いられる用語「臓器」は、生物体内で特定の機能、または機能群を実施する固形の血管形成された臓器を指す。臓器という用語は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸または大腸、膀胱、脳、乳房、血管、食道、卵管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、上肢および下肢を含む四肢、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、輸尿管、尿道を包含するが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「組織」は、ヒトまたは動物における任意のタイプの組織を指し、脈管組織、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靱帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛膜組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔の組織、眼組織を包含するが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる用語「細胞」は、該当する細胞が濃縮された組成物、好ましくは少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％の前記細胞を含む組成物を指す。
特定の実施形態において、該細胞は、骨髄、末梢血、もしくは臍帯血に由来する多能性造血幹細胞；または多能性（即ち、胚性幹細胞（ＥＳ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））もしくはマルチポテント（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞に由来する異なる細胞系列、例えば心筋細胞、ベータ膵臓細胞、肝細胞、神経細胞などの分化細胞からなる群から選択される。
一実施形態において、該細胞組成物は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に用いられ、したがって通常は骨髄、末梢血または臍帯血に由来する、マルチポテント造血幹細胞を含む。
ＨＳＣＴは、白血病およびリンパ腫の患者に治癒性があり得る。しかし同種ＨＣＴの重要な限界は、この治療を受けたヒトの約３０～５０％に重度形態で起こる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症である。
別の実施形態において、本発明は、治療性タンパク質に対する任意の望まない免疫反応を予防または処置する方法において使用するための、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
別の実施形態において、本発明は、治療性タンパク質に対する任意の望まない免疫反応を予防または処置する方法において使用するための、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本発明の増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの集団、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団の治療有効量を、必要とする患者に投与するステップを含む、治療性タンパク質に対する任意の望まない免疫反応を予防または処置する方法に関する。
本明細書で用いられる用語「治療性タンパク質に対する望まない免疫反応」は、遺伝子療法の過程で発現されたタンパク質、および／または治療性タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）および他の凝固因子、酵素補充療法、モノクローナル抗体（例えば、ナタリズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ）、ポリクローナル抗体、酵素またはサイトカイン（例えば、ＩＦＮβ）に対する任意の望まない免疫反応を指す。
別の実施形態において、本発明は、アレルギーの予防または処置において使用するための、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの単離集団、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
別の実施形態において、本発明は、アレルギーの予防または処置において使用するための、本発明の増幅されたＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの単離集団、詳細には本発明の増幅されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の単離集団に関する。
本発明はまた、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの集団、詳細には本発明のＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の集団の治療有効量を、必要とする患者に投与するステップを含む、アレルギーを予防または処置する方法に関する。
本明細書で用いられる用語「アレルギー」または「アレルギー（複数）」は、免疫系の障害（または不適切な反応）を指す。アレルギー反応は、通常は無害の、アレルゲンとして知られる環境物質に発生するが、これらの反応は、獲得され、予測可能であり、かつ急速である。厳密にはアレルギーは、４形態の過敏のうちの１つであり、Ｉ型（または即時型）過敏と呼ばれる。それは、ＩｇＥとして知られる抗体タイプによる肥満細胞および好塩基球と呼ばれる特定の白血球の過剰な活性化により極度の炎症反応を生じることを特徴とする。一般のアレルギー反応としては、湿疹、蕁麻疹、花粉症、喘息、食物アレルギーならびにスズメバチおよびミツバチなどの刺咬昆虫の毒への反応が挙げられる。
一実施形態において、該対象は、患者である。
一実施形態において、該対象は、慢性炎症性疾患に罹患し、好ましくはそれと診断されている。
一実施形態において、該対象は、自己免疫疾患に罹患し、好ましくはそれと診断されている。
一実施形態において、該対象は、過去に移植されているか、または移植される予定である。
一実施形態において、該対象は、過去に治療性タンパク質を受けているか、または治療性タンパク質を受ける予定である。
一実施形態において、該対象は、アレルギーに罹患し、好ましくはそれと診断されている。
一実施形態において、該対象は、免疫抑制剤、例えばラパマイシン、シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、メチルプレドニゾロン、タクロリムスまたはそれらの組み合わせで処置される。別の実施形態において、該対象は、免疫抑制剤、例えばラパマイシン、シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、メチルプレドニゾロン、タクロリムスまたはそれらの組み合わせで処置されない。
本発明の予後診断法
別の態様において、本発明は、患者が移植片拒絶、ＧＶＨＤ、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、治療性タンパク質への望まない免疫反応またはアレルギー（上記定義）のリスクがあるか否かを決定するためのインビトロ法であって、本発明の方法により前記患者から得られた生体試料中の本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の存在を決定するステップを含み、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの存在、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の存在が、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、治療性タンパク質への望まない免疫反応またはアレルギーのリスク低減の指標である、インビトロ法に関する。
本明細書で用いられる用語「リスク」は、移植片拒絶の開始など、ある事象が特定の期間に起こる確率を指し、対象の「絶対」リスクまたは「相対」リスクを意味し得る。絶対リスクは、関連する時間コホートのための実際の測定後観測、または関連の期間に従った統計学的に正当な歴史的コホート研究から発生した指標値のいずれかを参照して測定され得る。相対リスクは、低リスクコホートの絶対リスクまたは平均人口リスクのいずれかと比較された患者の絶対リスクの比率を指し、臨床危険因子が評定される方法によって変動し得る。所与のテスト結果の負の事象に対する正の事象の割合であるオッズ比もまた、一般に用いられる（オッズは、式：ｐ／（１－ｐ）（式中、ｐは、事象の確率であり、（１－ｐ）は、事象がない確率である）に従う）。
本発明の状況における「リスクの決定」は、事象が起こり得る確率、オッズ、または尤度を予測することを包含する。リスクの決定は、絶対的用語、または過去に測定された母集団を参照した相対的用語のいずれかの、将来の臨床パラメータ、伝統的検査危険因子値、例えば年齢、性別の不適合、ＨＬＡ検査などの予測も含み得る。本発明の方法を用いて、移植片拒絶のリスクの分類測定を行い、これにより移植片拒絶のリスクがあると定義された移植患者の分類のリスク範囲を定義することができる。
本明細書で用いられる用語「存在を決定すること」は、対照値または所定の値を参照した、または参照しない定性的および／または定量的検出（即ち、存在の検出および／または測定）を包含する。本明細書で用いられる「検出すること」は、本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇ、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞が、生体試料中に存在するか否かを決定することを意味し、「測定すること」は、生体試料中の本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの量、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の量を決定することを意味する。
本明細書で用いられる用語「生体試料」は、当該技術分野における一般的意味を有し、インビトロ評価の目的で患者から得ることができる任意の試料を指す。好ましい生体試料は、血液試料（例えば、全血試料、血清試料、または血漿試料）、より詳細には移植患者、または自己免疫疾患もしくはアレルギーに罹患した患者から得られた血液試料である。
さらに別の態様において、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるか否かを決定するインビトロ法であって、本発明の方法により前記移植患者から得られた生体試料における本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の存在を決定するステップを含み、本発明の方法により前記移植患者から得られた生体試料中の本発明のＣＤ８＋ヒトＴｒｅｇの、詳細には本明細書の先に記載されたＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞の存在が、寛容性の指標である、インビトロ法に関する。
本明細書で用いられる用語「寛容」または「免疫寛容」は、免疫反応を誘発する能力を有する物質または組織への免疫系の非応答状態を指す。本明細書で用いられる用語「免疫反応」は、Ｔ細胞介在性および／またはＢ細胞介在性免疫反応を包含する。模範的免疫反応としては、Ｔ細胞反応、例えばサイトカイン生成および細胞内細胞障害性を包含し、加えて免疫反応という用語は、Ｔ細胞活性化により間接的に実行される免疫反応、例えば抗体生成（液性反応）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を包含する。免疫反応に関与する免疫細胞としては、リンパ球、例えばＢ細胞およびＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えばマクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球が挙げられる。
本発明を、以下の図および実施例によりさらに例示する。しかしこれらの実施例および図は、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇよりも効率的に抗ドナー免疫反応を抑制する。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞を、１６：１～１：４の範囲内のエフェクター：サプレッサー比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激された同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖への抑制活性について、古典的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇと比較した。二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ。増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。＊：ｐ＜０．０５。 ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制活性はｐＤＣとの相互作用により優先的に上昇する。選別されたＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂで１２時間刺激し、８：１～１：１の範囲内のエフェクター：サプレッサー比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣ（ＡＰＣ）、ｃＤＣまたはｐＤＣで刺激された同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖への抑制活性について分析した。二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ。増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。 ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団はＧＩＴＲを発現する。表面受容体ＧＩＴＲの発現を、単離されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよび単離されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈＴｒｅｇにおいてフローサイトメトリーによって分析した。結果を、ＧＩＴＲを発現する細胞の平均割合％（＋／－ＳＥＭ）として表す。 ＴＧＦβ－１、ＩＬ３４、ＩＦＮγおよびＧＩＴＲの発現をＦｏｘｐ３＋ヒトＣＤ８＋Ｔｒｅｇに濃縮する。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ勾配により健常な志願者の血液から単離して、１０μｇ／ｍｌ Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎｅ Ａの存在下、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌイオノマイシンで４時間刺激した。生存可能な細胞でのゲーティングの後、単離されたＣＤ８＋細胞集団を、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ－３４、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ－１およびＧＩＴＲの発現に関するＦＡＣＳ染色により分析した。１つの代表的な実験。Ａ．Ｆｏｘｐ３およびＣＤ４５ＲＣの発現を、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇで分析した。Ｂ．ＩＬ－３４、ＩＦＮγ、ＧＩＴＲおよびＴＧＦβ－１の発現を、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ、Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４５ＲＣｌｏｗおよびＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈＣＤ８＋細胞において決定した。 ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの特異的亜集団はインビトロで高い抑制能力を実証する。Ａ．選別されたＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂで２４時間刺激し、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－１０分泌について選別して、同系ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣにより刺激するＭＬＲアッセイにおいて、一定範囲のエフェクター：サプレッサー比で抑制活性についてテストした。選別されたＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、全ての抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂ刺激ＣＤ８＋Ｔｒｅｇと比較した。二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ。増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。＊＊：ｐ＜０．０１。Ｂ．選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂで１２時間刺激して、ＦＡＣＳ ＡｒｉａによりＧＩＴＲ発現について新たに選別した。ＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよびＧＩＴＲ－ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、３２：１～１：１の範囲内のエフェクター：サプレッサー比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激された同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖への抑制活性について分析した。二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ。増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。＊＊：ｐ＜０．０１。 ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ抑制の重要な介在物質である。５０μｇ／ｍｌ 抗ＩＬ－３４（α－ＩＬ－３４）、抗ＩＬ－１０（α－ＩＬ－１０）もしくは抗ＩＦＮγサイトカイン（α－ＩＦＮγ）、またはそれらの抗受容体抗ＩＬ－１０Ｒ（α－ＩＬ－１０Ｒ）もしくは抗ＩＦＮγＲ（α－ＩＦＮγＲ）精製ブロッキングＡｂを、選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞と、同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激された同系ＣＦＳＥ標識エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞と、を用いた共培養アッセイの０日目に添加した。Ｔｒｅｇの存在下での増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。ブロッキングＡｂの存在下での抑制を、アイソタイプ対照Ａｂの存在下での抑制に正規化した。 ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制活性は接触依存性である。トランスウェル実験を、以下の通り実施した：選別されたＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂで１２時間刺激して、ＩＬ－２の存在下で５日間培養した後、同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激された同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖への抑制活性について分析した。同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣを、上部ウェルと下部ウェルの両方に添加した。１：１～１：４の範囲内のエフェクター：サプレッサー比で、Ｔｒｅｇを上部ウェルに添加し、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を下部ウェルに添加した。二元配置ＲＭ ＡＮＯＶＡ。増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。＊：ｐ＜０．０５。 １４日間の刺激後の、新たに選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと解凍されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの両方の顕著な増幅。Ａ．選別されたＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、０日目に場合により抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（ポリ）と共に、同種ＡＰＣ（ＡＰＣ）で刺激し、同じＡＰＣ（ＡＰＣ）またはＡＰＣおよび抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（ポリ）で再度刺激した、または刺激しなかった（Ｘと記載）。グラフは、１４日間の培養で得られた細胞の倍率増幅を表す。Ｂ．新たに選別された（新鮮）または解凍されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ細胞を、０日目に１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣならびに１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂと共に完全培地に３．３×１０５細胞／ｍｌで播種した。７日目に、Ｔｒｅｇを１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で再度刺激した。０、７、１０および１２日目に、培地に１０００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５を補充した。１４日目に、Ｔｒｅｇを増幅収率について分析した。グラフは、１４日間の培養で得られた細胞の倍率増幅を表す。解凍された細胞は、有意に高い増幅を示している。マン・ホイットニーｔ検定 ＊＊＊：ｐ＜０．００１。 増幅されたＣＤ８＋ Ｔｒｅｇは免疫抑制剤の存在下で生存する。選別されたＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを、０日目に１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣならびに１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。７日目に、Ｔｒｅｇを１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で再度刺激した。０、７、１０および１２日目に、培地にヒトＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびヒトＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した。１４日目に、Ｔｒｅｇを免疫抑制剤（ＩＳ）：シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＰＡ）、メチルプレドニゾロン（ＭＰｒ）、ラパマイシン（Ｒａｐａ）、またはタクロリムス（Ｔａｃｒｏ）の存在下または非存在下で（非処置－ＮＴ）、そしてＩＬ－２／ＩＬ－１５の存在下または非存在下で、同種ＡＰＣで再度刺激した。Ｔｒｅｇの生存率を、６日後に分析した。グラフは、最後の６日間の培養後に得られた細胞生存率％を表す。生存率％を、免疫抑制剤（ＩＳ）の添加前１４日目の増殖に対して正規化した。 ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは同じ培養条件のＣＤ４＋Ｔｒｅｇよりも効率的に増殖する。選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ（ＣＤ８＋）およびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ（ＣＤ４＋）Ｔｒｅｇを、０日目に１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣならびに１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。７および１４日目に、Ｔｒｅｇを１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で再度刺激した。０、７、１０、１２、１４、１７および１９日目に、培地に１０００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５を補充した。Ｔｒｅｇ増幅収率を、７日ごとに分析した。二元配置ＲＭボンフェローニ事後検定。＊：ｐ＜０．０５。 増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは同種ＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞応答の抑制時に有意により効率的である。ＡＰＣまたは抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂ＋ＡＰＣで７日間増幅されたＴｒｅｇを、増幅に用いられた同種ＡＰＣで刺激された同系ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞（Ｔｒｅｇのドナーから選別）への抑制活性についてテストした。同じドナーからの解凍、選別および非増幅Ｔｒｅｇ（Ｘと記載）で、初期抑制活性を定義した。増殖は、Ｔｒｅｇの非存在下での増殖に正規化した。 増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４分泌Ｔｒｅｇに濃縮される。１４日間増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ（「増幅」）のサイトカイン発現（ＩＬ－１０、ＩＬ－３４およびＩＦＮγ）を分析して、増幅前のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ（「新鮮」）のそれに比較した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＩＦＮγの分泌増加はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの上清で検出することができる。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ細胞を、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで一晩刺激し、ＭＬＲアッセイに添加して同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を１：１のエフェクター：サプレッサー比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激するか、または１４日間の増幅のために１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣ、ならびに１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂを含む完全培地に３．３×１０５細胞／ｍｌで播種した。７日目に、Ｔｒｅｇを１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで再度刺激して、培地を交換した。０、７、１０、および１２日目に、培地に１０００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５を補充した。ＩＦＮγを、１４日目にＥＬＩＳＡにより培養上清中で測定した。 増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは同種ヒト皮膚拒絶を効率的に抑制する。Ａ．ヒト皮膚をＮＳＧマウスに移植して、受容（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ）のために１５日間放置した。移植片に対して同種のＰＢＭＣ ５×１０６個をその後、同系の１５日間増幅Ｔｒｅｇ（ｅＴｒｅｇ）と共に、またはそれを含まずに腹腔内に移した。Ｂ．移植片拒絶を評価して、スコアづけした。Ｃ．マウス生存率％を、評定した。 増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはヒト化マウスにおけるＧＶＨＤを効率的に抑制する。Ａ．異種ＧＶＨＤ実験のために、１．５×１０７個の同系ＰＢＭＣを、１２時間予備照射されたＮＳＧマウスに、１：１および１：２のＰＢＭＣ：増幅Ｔｒｅｇ比のポリクローナル増幅された（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｌｙ ｅｘｐａｎｄｅｄ）Ｔｒｅｇ（ｅＴｒｅｇ）と共に、またはそれを含まずに静脈内移入した。Ｂ．ヒトＰＢＭＣ生着を血中でモニタリングして、ＧＶＨ発生を重量減少により評価した。Ｃ．マウスの生存率％を、評定した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
実施例：ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの新しい集団は、移植片拒絶を効率的に抑制する
材料と方法
健常な志願者の血液採取およびＰＢＭＣ分離：
血液を、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（フランス、ナント所在）で、健常なドナーから採取した。この試験の認可を、当該協会の審査委員会から得た。記入されたインフォームドコンセントが、当該協会のガイドラインに従って提供された。血液をＰＢＳで二倍希釈した後、ＰＢＭＣを２０００ｒｐｍ、室温で２０のブレーキを用いないＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランスのコートアボフ所在）により単離した。採取されたＰＢＭＣを１８００ｒｐｍで１０分間、ＰＢＳ ５０ｍＬで洗浄して、残留する赤血球および血小板を、低浸透性溶液中、５分間のインキュベーションおよび１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後に排除した。指示されれば、ＰＢＭＣをＤＭＳＯ：ＳＶＦ １：９中に凍結し、解凍の間、培地－１０％ＳＶＦで２回洗浄した。
細胞の単離：
Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）および残りの単球（ＣＤ１４＋およびＣＤ１６＋細胞）のエルトリエーション（ＤＴＣ Ｐｌａｔｅｆｏｒｍｅ、ナント所在）および磁気除去（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による陰性選択と、その後のレスポンダー細胞としてのＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞、ＣＤ８＋ＴｒｅｇとしてのＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ、およびＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞としてのＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７ｌｏｗ細胞の選別により、Ｔ細胞をＰＢＭＣから得た。解凍されたＰＢＭＣから選別されたＴｒｅｇを、２５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂで２４時間刺激した後、播種した。ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－１０分泌細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの分泌アッセイ検出キットを用いたＴｒｅｇの２４時間ポリクローナル刺激の後、選別した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー所在）を用いて、細胞を選別した。
刺激細胞として用いられたＡＰＣを、ＣＤ３＋細胞の磁気除去および３５Ｇｙ照射により得た。ｐＤＣおよびｃＤＣを、それぞれＣＤ３、ＣＤ１４、およびＣＤ１６陽性細胞除去、ならびにＮｒｐ１＋またはＣＤ１ｃ＋細胞選別により得た。
モノクローナル抗体およびフローサイトメトリー：
インターロイキン、ＩＦＮγおよびＦｏｘｐ３の分析のために、ＰＢＭＣを、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で７時間、最後の４時間はＢｒｅｆｅｌｄｉｎｅ Ａ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で刺激した。
蛍光を、それぞれ表現型および機能分析のためにＬＳＲ ＩＩまたはＣａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー所在）で測定し、ＦＬＯＷＪＯソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．米国所在）を用いて、データを解析した。細胞を最初、生存可能な細胞を選択することで死亡細胞を除去する形態学的測定によりゲーティングした。
混合リンパ球の反応：
Ｔｒｅｇ抑制活性を、同種ＡＰＣで刺激された同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞（Ｔｒｅｇのドナーから得られた）で評価した。刺激物質：エフェクター比の範囲を、ＤＣで刺激された時にレスポンダー細胞の顕著な増殖に到達するようにテストして、他の実験はＡＰＣ：レスポンダー比 １：１で実行した。ブロッキングｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを、共培養の０日目に５０μｇ／ｍｌで添加した。トランスウェル膜（０．４μＭφ）を用いて、両者とも刺激細胞と接触させながら、Ｔｒｅｇをレスポンダー細胞から隔離した。１０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加して、Ｔｒｅｇによるサイトカイン損失を評定した。解凍されたＰＢＭＣから増幅されたＴｒｅｇの抑制活性を、増幅に用いられたものと同じドナーから得られた同種ＡＰＣで刺激された同系エフェクター細胞で評定し、解凍されたＰＢＭＣと同じドナーから選別された非刺激Ｔｒｅｇに比較した。５％ＡＢ血清培地での共培養の４．５日後に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋生存細胞（ＤＡＰＩ陰性）でゲーティングして、添加の際にＣＰＤ－Ｖ４５０標識ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを除去することにより、ＣＦＳＥ標識レスポンダー細胞の増殖をフローサイトメトリーで分析した。
Ｔｒｅｇの増幅：
Ｔｒｅｇを、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充された５％ＡＢ血清培地に約３×１０５個／ｍｌで播種して、１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比のコーティング抗ＣＤ３ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）、可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）および／または同種ＡＰＣで刺激した。７日目に、増幅された細胞を１×１０５個／ｍｌに希釈して、再度刺激した、または刺激しなかった。ＩＬ－２およびＩＬ－１５サイトカインを、０、７、１０および１２日目に新たに添加した。１４日目に、増幅されたＴｒｅｇを使用前にＰＢＳで洗浄した。
ヒト化マウスモデル：
８～１２週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγ－／－（ＮＳＧ）マウスを、ＳＰＦ条件の本発明者らの動物施設にて飼育した。この試験は、Ｐａｙｓ ｄｅ ｌａ Ｌｏｉｒｅ（承認番号ＣＥＥＡ．２０１２．１５５）のＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｔｈｉｃｓ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓにより認可されたプロトコルを厳密に遵守して実施した。
異種ＧＶＨＤ実験では、１．５×１０７個同系ＰＢＭＣを、１２時間予備照射されたＮＳＧマウスにおいて、１：１および１：２のＰＢＭＣ：増幅Ｔｒｅｇ比のポリクローナル増幅Ｔｒｅｇと共に、またはそれを含まずに静脈内移入した。ヒトＰＢＭＣ生着を血中でモニタリングして、ＧＶＨ発生を重量減少および肺、肝臓、腸、脾臓、腎臓の組織病理学的分析により評価した。
移植モデルでは、ヒト皮膚が健常な志願者から、ＣＨＵ Ｎａｎｔｅｓにより提供され、移植片がＮＳＧマウスにより１５日間受容された。移植片と同種の５×１０６個ＰＢＭＣを同系の１５日間増幅Ｔｒｅｇと共に、またはそれを含まずに腹腔内移入した。移植片拒絶のスコアを、評価した。
結果
ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇよりも効率的な抗ドナー免疫反応抑制物質である
過去の試験で、ＭＨＣミスマッチ心臓同種移植片ラットモデルにおけるＣＤ４０Ｉｇでの処置により誘導された移植片受容におけるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性細胞の関与が記載されている（Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。両方の試験で、ＣＤ４０Ｉｇ誘導性同種移植片受容におけるＩＦＮγの重要な役割が強調された。
健常な個体におけるＣＤ４５ＲＣマーカーの表現型分析から、ＣＤ４５ＲＣマーカーが複数の個体のオーバーレイにより明らかな通り健常個体で差示的に表されることが示された。この差示的表現は、年齢または性別に関係しなかった。
最初、全ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞サブセットの抑制活性を評定して、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣにより刺激するＭＬＲアッセイで、異なる比率で添加された場合の周知のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇの抑制活性に比較した（図１）。興味深いこととして、ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、全ての比率のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇに比較して、抗ドナーＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞増殖への有意に優れた抑制能力を示す。
ラットにおいて、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇとｐＤＣとの優先的相互作用を、最適な抑制活性を発揮するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇについて同定した。したがってヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗの抑制能力を、刺激物質としてのＴ細胞除去ＰＢＭＣに比較して、異なる比率のｃＤＣ（ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ１ｃ＋Ｎｒｐ－１－）、ｐＤＣ（ＣＤ３＋ＣＤ１９－ＣＤ１ｃ－Ｎｒｐ－１＋）の存在下でテストした（図２）。興味深いこととして、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのより低い抑制活性が、ｐＤＣおよびＴ細胞除去ＰＢＭＣに比較してｃＤＣの存在下で観察され、ヒトにおいては、ラットの場合と同様に、ｐＤＣがＣＤ４＋エフェクターＴ細胞へのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ抑制活性を介在するのに必須であることが示唆された。
結論として、ｐＤＣの存在下でのヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ Ｔｒｅｇよりも効率的に抗ドナーＣＤ４＋ＣＤ２５＋エフェクターＴ細胞応答を抑制する。
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団は、ＩＦＮγ、ＩＬ－３４およびＩＬ－１０を発現する
ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを特徴づけるために、詳細な表現型分析を、１３色フローサイトメトリーを利用して実施した。複数のマーカー、即ち、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲなどのＴｒｅｇ、またはＩＦＮγ、ＩＬ－３４もしくはＩＬ－１０などのサイトカインについて過去に記載されたマーカーに加え、ヒトＣＤ８＋Ｔｒｅｇの公知マーカー、即ちＣＤ２８およびＣＤ１２２を分析して、全ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇサブセット内の亜集団の存在を評定した。
マーカーのスクリーニングから、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈＴ細胞に比較してＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇで、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、Ｆｏｘｐ３、Ｔｂｅｔ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１５４、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＩＬ－３４発現の有意なアップレギュレーションおよびＣＤ３８発現の減少が明らかになり、総括すると活性化された免疫寛容原性促進性（ｐｒｏ－ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）細胞のプロファイルが示唆された。
ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ２８およびＣＤ１２２の共発現分析から、各亜集団がＣＤ４５ＲＣマーカーの内部に存在するが、ＣＤ８＋ＣＤ２８－ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔｒｅｇが全てではないがＣＤ４５ＲＣｌｏｗマーカー内に含まれることが明らかになり、これらのマーカーのそれぞれが異なるＴｒｅｇ亜集団を同定することが示唆される。
特に興味深いこととして、ＩＦＮγおよびＩＬ－３４の有意な発現が、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇで観察され（それぞれ約６０％および２０％）、ＩＬ－３４の大部分がＩＬ－１０分泌細胞により共発現された。
細胞表面受容体ＧＩＴＲの発現を、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈＴｒｅｇで評定した（図３）。フローサイトメトリー分析により、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈＴｒｅｇの集団（細胞の約５％がＧＩＴＲを発現）よりもＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの集団（細胞の約１５％がＧＩＴＲを発現）で、ＧＩＴＲが有意に多く発現されることが示された。したがって（Ｔｕｓ）、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの中に、ＧＩＴＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団が存在する。
最後に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、生存可能な細胞でのゲーティングの後に、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ－３４、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ－１およびＧＩＴＲの発現についてＦＡＣＳ染色することにより分析した（図４）。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、１０μｇ／ｍｌ Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎｅ Ａの存在下で、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌイオノマイシンで４時間刺激されたＰＢＭＣから得た。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのみが、ＧＩＴＲ、ＴＧＦｂ１およびＩＬ－３４を発現した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはまた、Ｆｏｘｐ３－ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇよりも高レベルのＩＦＮγを発現した。
結論として、ＩＬ－３４、ＴＧＦｂ１およびＧＩＴＲの発現は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現と緊密に相関する。
ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋ＩＦＮγ＋分泌ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団はインビトロで高い抑制能力を示す
ＩＦＮγおよびＩＬ－３４を発現するヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団の抑制能力を評定した。最初に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団を、ＩＦＮγ－またはＩＬ－１０－分泌アッセイ検出キットを用いて、ＩＦＮγおよびＩＬ－１０の発現に基づいて選別して、生存細胞の選別を可能にした。ＩＬ－３４の大部分がＩＬ－１０分泌細胞により共発現されるという観察から、ＩＬ－１０＋細胞がＩＬ－３４＋細胞でもあると仮定した。したがってＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの４つの亜集団：ＩＬ－１０－（ＩＬ－３４－）ＩＦＮγ－、ＩＬ－１０－（ＩＬ－３４－）ＩＦＮγ＋、ＩＬ－１０＋（ＩＬ－３４＋）ＩＦＮγ－、およびＩＬ－１０＋（ＩＬ－３４＋）ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを選別した。そのような選別された細胞をその後、先に記載された通りＭＬＲアッセイで添加した（図５Ａ）。重要なこととして、ＩＬ－１０＋（ＩＬ－３４＋）ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＩＬ－１０－（ＩＬ－３４－）ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇよりも有意に抑制性であり、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４の重要な役割が示唆された。
結論として、ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋ＩＦＮγ＋分泌ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの亜集団は、インビトロで高い抑制能力を示す。
ＧＩＴＲ＋選別ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはＧＩＴＲ－ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇよりも効率的な抑制物質である
全ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ集団を細胞表面マーカー：ＧＩＴＲ、ＣＤ３８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２５で細分することにより、類似のアッセイを実施した。抑制活性の小さな損失が、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ２８などの一部の他のマーカーで観察され得たが、有意差はなかった。１つの例外を含み、抑制活性の上昇はなく、これらのマーカーを用いて抑制活性を有するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇをさらに識別し得ないことが示唆された。
しかし最も興味深いこととして、ＧＩＴＲ＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇが、ＧＩＴＲ－ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇよりも効率的に抗ドナー免疫反応を抑制した（図５Ｂ）。結論として、ＧＩＴＲ発現は、同種エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞増殖に対してより高い抑制能力を有するＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの亜集団を同定する。
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ介在性抑制活性はＩＬ－３４、ＩＬ－１０およびＩＦＮγ分泌に依存する
その後、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制活性の基礎となり得る異なる作用機序を再考した。そのような作用機序としては、サイトカイン分泌、接触依存性活性、エフェクターＴ細胞増殖を抑制するＩＬ－２除去または殺傷が挙げられる。
最初に、ＩＦＮγ、ＩＬ－３４およびＩＬ－１０は、最良の制御活性を有するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ亜集団を識別するため、サイトカイン生成をＭＬＲ上清でテストした。５日目までのＭＬＲ上清中のサイトカイン生成の分析から、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在下では、Ｔｒｅｇ不含およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｈｉｇｈＴ細胞と対比してＩＦＮγの有意な生成が実証された（図１３）。
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ介在性抑制におけるＩＦＮγ、ＩＬ－３４およびＩＬ－１０の役割をさらに評定するために、以下のブロッキング抗体を、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在下で抑制ＭＬＲアッセイに添加した：抗ＩＬ－３４、抗ＩＬ－１０、抗ＩＬ－１０Ｒ、抗ＩＦＮγおよび抗ＩＦＮγＲ（図６）。興味深いこととして、ＩＬ－３４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＦＮγ、およびＩＦＮγＲのブロックは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞抗ドナー免疫反応へのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制活性の類似の損失をもたらした。
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ介在性抑制活性はまた接触依存性である
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ介在性抑制にとっての接触の重要性を決定するために、トランスウェル実験を実施した（図７）。下部チャンバーにおける同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激されたＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖を、下部または上部チャンバーにおいてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在下、または非存在下で評定した。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを上部チャンバー内で別個に添加した場合に、抑制活性の完全な損失が観察され、接触の必要性が実証された。
このことは、殺傷による抑制メカニズムを示唆し得るため、次に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ介在性細胞障害性の比率増加を、１５時間のインキュベーション後の同系ＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞または同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣに対してテストした。同系または同種の標的に対する壊死または後期アポトーシス誘導は存在しなかったが、小さな初期アポトーシス誘導が、高い標的：エフェクター比で両方の標的に対して観察された（データは示さない）。終末期アポトーシス誘導の非存在から、細胞障害性メカニズムが、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇにより介在された抑制効果においてほとんど役割を担わないことが示唆される。
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは解凍後でも効率的に増幅され得る
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを用いた細胞療法は、同種移植片の拒絶を予防するための有望な対策であり、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－Ｔｒｅｇよりも効率的にエクスビボでの抗ドナー免疫反応を阻害するため（図１）、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの増幅のプロトコルを設定した。
最初に、全ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの増幅のための最も効率的な条件を、異なる比率のＡＰＣ（１：１～１：１６ Ｔｒｅｇ：ＡＰＣ比）、異なる血清供給源（ＡＢ血清、自家血漿、Ｔｅｘ Ｍｅｃｓまたはアルブミン２％）および異なる刺激（ポリクローナル抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８対プールされた同種Ｔ細胞除去ＡＰＣ）を利用して同定した。
したがって、１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比が必須であり、効率的な７日間Ｔｒｅｇ増幅に十分であり、培地中のＡＢ血清の使用が、そのような比率で効率的なＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ増幅を導くことが見出された。次に、高用量のＩＬ－２およびＩＬ－１５の存在下でポリクローナル抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂを含み、または含まずに同種Ｔ細胞除去ＡＰＣで偏りなく培養０日目～７日目に刺激し、７日目～１４日目に再刺激した場合、解凍後であっても、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇが１４日間で１０００倍まで効率的に増幅され得ることが観察された（図８Ａ）。
新たに選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと、解凍されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの増幅を、培養の１４日後に比較した（図１８Ｂ）。０日目に、細胞を１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣ、およびポリクローナル抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。７日目に、細胞を再度、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。０、７、１０および１２日目に、培地にＩＬ－２およびＩＬ－１５を補充した。１４日後に、新たに選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇが、１３５倍増幅され、解凍されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、６１２倍増幅された。したがって解凍されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、新たに選別されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇよりも効率的に増殖した。
結論として、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、解凍後でもより効率的に増幅され得る。
さらに、免疫抑制剤の存在下で増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの生存を評定した（図９）。０日目に、細胞を１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣおよびポリクローナル抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂで刺激した。７日目に、細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂで再度刺激した。０、７、１０および１２日目に、培地にＩＬ－２およびＩＬ－１５を補充した。１４日目に、Ｔｒｅｇを免疫抑制剤（シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、メチルプレドニゾロン、ラパマイシンまたはタクロリムス）の存在下または非存在下、およびＩＬ－２／ＩＬ－１５の存在下または非存在下、同種ＡＰＣで再度刺激した。２０日目に、Ｔｒｅｇを生存について分析した。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの生存率は、免疫抑制剤の存在下で変化しなかった。さらにＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ミコフェノール酸モフェチルを除き、テストされた免疫抑制剤の存在下で増幅した。増幅は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５補充でより効率的になり、両方のサイトカインがＣＤ８＋Ｔｒｅｇの増幅を維持するためにＣＤ８＋Ｔｒｅｇの補充の際にインビボで添加され得ることが示唆される。
最後に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇの増幅を、同じ培養条件で比較した（図１０）。０日目に、両方のＴｒｅｇ亜集団を、１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣおよびポリクローナル抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂで２１日間刺激した。７および１４日目に、Ｔｒｅｇを抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ ｍＡｂで再度刺激した。０、７、１０、１２、１４および１９日目に、培地にＩＬ－２およびＩＬ－１５を補充した。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、ポリクローナル刺激に応答して３５４倍増幅したが、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇは、１１倍しか増幅しなかった。さらに、１４日目にプラトーに達したＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇの増幅と対照的に、効率的かつ指数関数的なＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ増殖が、少なくとも２１日目まで維持された。
１４日間増幅ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－３４をアップレギュレートして免疫拒絶を阻害する
重要なこととして、同種およびポリクローナル増幅ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの両方は、解凍された、選別された、および非増幅ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇよりも、同種ＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞応答の抑制が有意に効率的であった（図１１）。
加えて、そのような１４日間増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇは、非増幅または７日間増幅ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと同等の細胞障害活性を示しており、増幅により獲得された優れた抑制能力が、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの殺傷活性増大によらないことが実証された。
最も重要なこととして、そのような増幅プロトコルにより、ＩＦＮγ＋ＩＬ－３４＋ＩＬ－１０分泌ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの有意な濃縮をもたらした（図１２）。
ＩＦＮγはＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ機能において重大な役割を担う可能性がある
ＩＦＮγの検出を、異なるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ培養物の上清で評定した（図１３）。単離されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、ポリクローナル抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで一晩刺激し、ＭＬＲアッセイに添加して、同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を１：１のエフェクター：サプレッサー比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激するか、または０日目に１：４のＴｒｅｇ：ＡＰＣ比の同種Ｔ細胞除去ＰＢＭＣで刺激して１４日間の増幅でポリクローナル抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した。７日目に、細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ａｂで再度刺激した。０、７、１０および１２日目に、培地にＩＬ－２およびＩＬ－１５を補充した。ＩＦＮγを、１４日目にＥＬＩＳＡにより培養上清で測定した。ＩＦＮγ分泌は、エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞およびＡＰＣ（平均２．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で検出可能であったが、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ（平均３．９ｎｇ／ｍｌ）との６日間インキュベーション後、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂでのＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ（平均８．７ｎｇ／ｍｌ）の１４日間増幅後に増加した。
結論として、高レベルのＩＦＮγは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ培養物の上清で検出可能であり、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ機能におけるこのサイトカインの重大な役割が示唆される。
増幅ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇはインビボで治療効果を示す
最後に、そのような増幅ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制能力を、ＮＳＧマウスを用いた２つの異なる移植モデル、同種ＰＢＭＣの注射後のヒト皮膚の同種移植片拒絶モデル（図１４）およびヒトＰＢＭＣの注射後の異種ＧＶＨＤモデル（図１５）を用いて評定した。
これらのモデルにおいて、同系の増幅ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを、ＰＢＭＣと同時に注射して、生存、皮膚組織学的検査および重量減少の割合％を測定することにより抗ドナー免疫反応を阻害する際のそれらの能力を評定した。
興味深いこととして、両方の例において、増幅されたＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの共移入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、移植片拒絶を有意に阻害しており、細胞療法としてのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの能力が実証された。
参考資料：
本出願全体を通して、様々な参考資料に、本発明がかかわる技術分野の最新技術が記載されている。これらの参考資料の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
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Claims (3)

  1. ＩＦＮγ＋ＩＬ－１０＋ＩＬ－３４＋分泌ヒトＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の単離集団と少なくとも１種の医薬的に許容できる担体とを含む、必要とする患者において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または処置するための方法における使用のための医薬組成物であって、前記ＣＤ８ ＋ ＣＤ４５ＲＣ ｌｏｗ Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ－３４、ＩＬ－１０およびＩＦＮγの分泌に依存する抑制活性を媒介する、医薬組成物。
  2. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）を含む遺伝子改変されたＴｒｅｇ細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＧＩＴＲ＋Ｆｏｘｐ３＋である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
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