DE60210623T2

DE60210623T2 - Ex-vivo isolierte cd25+cd4+ t zellen mit immunsuppressiver aktivität und deren anwendungen

Info

Publication number: DE60210623T2
Application number: DE60210623T
Authority: DE
Inventors: Grazia Maria RONCAROLO; Megan Levings
Original assignee: Fondazione Telethon
Current assignee: Fondazione Telethon
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2022-05-30
Also published as: US20090010950A1; EP1409650A1; US20040173778A1; ATE323151T1; WO2002097070A1; DE60210623D1; EP1409650B1; JP2004527263A

Description

Die vorliegende Erfindung stellt bereit ex vivo isolierte humane regulatorische CD25⁺CD4⁺-T-Zellen (Tr-Zellen), davon abgeleitete homogene klonale Populationen mit erhöhter suppressiver Aktivität und deren Verwendung bei der Regulierung von Immunreaktionen und zur Identifizierung und Charakterisierung von für Suppressor-T-Zellen spezifischen Molekülen. Spezieller betrifft die Erfindung die Verwendung von polyklonalen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen oder von homogenen klonalen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, welche ex vivo erzeugt wurden, zur Verhütung oder Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen eine Herunterregulierung/Suppression der Immunreaktion erforderlich ist, wie z.B. Transplantat-Wirt-Abstoßung („graft-vs-host disease"; GvHD), Organabstoßung, Gentherapie und Autoimmunerkrankungen, oder für die Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen, die an der Regulierung der Immunreaktion beteiligt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Regulatorische T-Zellen (Tr-Zellen) haben eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz gegenüber sowohl Autoantigenen als auch harmlosen Fremdantigenen. Viele Untergruppen von Tr-Zellen wurden beschrieben und in jüngerer Zeit wurden große Fortschritte beim Verständnis ihrer Ontogenese, Funktion und Wirkungsmechanismen gemacht (im Überblick in (1) dargestellt)). Einige Tr-Zellen bilden keine Zytokine und supprimieren T-Zell-Reaktionen über einen Mechanismus, der einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert (2, 3). Andere Untergruppen von Tr-Zellen produzieren immunregulatorische Zytokine, z.B. IL-10, TGF-β, und üben ihre suppressiven Funktionen mindestens teilweise über die Wirkungen dieser Zytokine aus (4-8).
CD4⁺-Tr-Zellen, welche konstitutiv die IL-2R-α-Kette (CD25) exprimieren, wurden in der Maus identifiziert (im Überblick dargestellt in (2, 3)). Diese CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zeigen eine bemerkenswerte suppressive Kapazität sowohl in vitro als auch in vivo. Die Übertragung dieser Tr-Zellen verringert die Pathologie von experimentell induzierten Autoimmunerkrankungen wie Thyroiditis, Gastritis, insulinabhängiger Diabetes mellitus und Colitis (9-12) und von experimentell induzierter GvHD (31), wohingegen eine Verarmung an CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen führt (11, 13, 14).
Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen sind anerg, wenn sie in vitro mit Anti-CD3-mAbs stimuliert werden, proliferieren jedoch nach Zugabe von exogenem IL-2 (15, 16). Nach TCR-vermittelter Stimulation supprimieren CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die Aktivierung und Proliferation anderer CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen in einer bezüglich des Antigens unspezifischen Weise (16, 17) über einen Mechanismus, welcher Zell-Zell-Kontakt erfordert und in den meisten Systemen von der Bildung immunsuppressiver Zytokine unabhängig ist (15, 16). Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen exprimieren konstitutiv zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Antigen 4 (CTLA-4) (9), ein negativer Regulator der T-Zellaktivierung, und die Expression dieses Moleküls ist für das Vermögen dieser Zellen zur Suppression von Immunreaktionen in vivo erforderlich (10, 18). Darüber hinaus könnten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen durch Herunterregulierung der Expression von CD80 und CD86 auf APCs Wirkung entfalten (19), obwohl einige Berichte nahe legen, dass APCs für deren suppressive Aktivität nicht erforderlich sind, und andeuten, dass eine direkte T-T-Zell-Wechselwirkung beteiligt ist (17).
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung basiert auf den Befunden, dass humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen mit immunsuppressiven Wirkungen aus peripherem Blut isoliert und in vitro ohne Funktionsverlust expandiert werden können und dass humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen eine heterogene Population darstellen, aus der verschiedene Zellklone, die suppressive oder nicht-suppressive Aktivität aufweisen, erhalten und basierend auf der Expression von CD25 isoliert werden können. Isolierte humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen und CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone können als Immunsuppressiva für die Verhütung oder Behandlung von Pathologien eingesetzt werden, bei denen eine Verringerung der Immunreaktion erwünscht ist. Typischerweise werden sie zur Verhütung von GvHD, Organabstoßung, Immunreaktionen, welche sich gegen fremde Proteine richten, die während einer Gentherapie eingeführt wurden, und Autoimmunerkrankungen, insbesondere Typ 1-Diabetes, eingesetzt werden. CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, die aus peripherem Blut isoliert wurden, können stimuliert und in vitro kultiviert werden, was die Möglichkeit zur Selektion und Expansion von antigenspezifischen Suppressor-T-Zellen bietet. Expandierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen behalten ihre regulatorische Kapazität in vitro und können somit eingesetzt werden, um T-Zell-Reaktionen in vitro zu regulieren, während sowohl frisch isolierte als auch in vitro expandierte humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen bei einer Therapie in vivo eingesetzt werden können. Die Verfahren und Bedingungen zur Isolierung und in vitro-Expansion von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen werden detailliert im Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Im Wesentlichen können frisch isolierte humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen in vitro unter einer oder mehreren der folgenden Bedingungen expandiert werden: Cokultur mit einer Feederzell-Mischung, polyklonale Stimulation, antigenspezifische Stimulation, Zugabe von Zytokinen.
Die so erhaltenen T-Zellen können wieder in den Patienten eingeführt werden. Die bevorzugten Modalitäten, unter denen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen bei der Therapie oder Prophylaxe eingesetzt werden, werden von dem speziellen Zustand, der verhütet/behandelt werden soll, abhängen.
Beispielsweise können zur Verhütung/Behandlung von GvHD CD25⁺CD4⁺-Tr mittels Leukapherese des Knochenmarkspenders isoliert, erforderlichenfalls eingefroren, und dem Empfänger zum Zeitpunkt der Transplantation, vor der Transplantation oder in nachfolgenden Monaten verabreicht werden. Alternativ könnten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen aus dem Donor mit Wirts-APC in vitro stimuliert werden, um alloantigenspezifische CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zu bilden und expandieren, welche wirtsspezifische Reaktionen in vivo spezifisch supprimieren würden.
Zur Verhütung/Behandlung von Organabstoßung können CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen aus dem Empfänger isoliert, erforderlichenfalls eingefroren, und vor der Transplantation, zum Zeitpunkt der Transplantation oder in den nachfolgenden Monaten verabreicht werden. Alternativ könnten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen in vitro mit autologen APCs stimuliert werden, welche mit Gewebe aus dem fraglichen Organ cokultiviert wurden und deshalb fremde Antigene über den indirekten Weg präsentieren werden (32). Die resultierenden CD25⁺CD4⁺-Tr-Zelllinien wären spezifisch für Antigene, die von dem transplantierten Organ exprimiert werden, und könnten zur Supprimierung von organspezifischen Reaktionen in vivo eingesetzt werden.
Zur Verhütung von Autoimmunerkrankungen können Massenpopulationen von autologen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen isoliert und reinfundiert werden. Alternativ könnten antigenspezifische CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen in vitro durch Stimulation mit autologen APCs und Selbst-Antigenen, erhalten aus Geweben, welche Ziele für die Krankheit sind, expandiert werden. Nach erneuter Verabreichung der in vitro expandierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen werden sie Anti-Selbst-Reaktionen in vivo supprimieren.
Zur Verhütung einer Immunreaktion bei der Gentherapie können CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen aus dem Empfänger isoliert werden und Zellen, welche für Antigene spezifisch sind, die von dem therapeutischen Vektor codiert werden, könnten in vitro durch Stimulation mit transduzierten autologen APCs, welche das Transgen exprimieren, expandiert werden. Diese Zellen können erforderlichenfalls eingefroren werden und zum Zeitpunkt der Gentherapiebehandlung oder in den nachfolgenden Monaten verabreicht werden.
Vorteilhafterweise wird eine homogene klonale Population von suppressiven CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen für die oben angegebenen therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Das Verfahren zur Isolierung suppressiver CD25⁺CD4⁺-Tr-Klone umfasst im Wesentlichen die Schritte:

a) Reinigung von CD4⁺-T-Zellen aus PBMCs;
b) Abtrennung von CD25⁺- von CD25^–-T-Zellen;
c) Klonierung von CD25⁺CD4⁺-T-Zellen durch Grenzverdünnung;
d) Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) oder Anti-CD3-mAb in Gegenwart von IL-2;
e) Selektion der Zellklone, welche eine konstitutiv hohe Expression von CD25 zeigen.

Gemäß Schritt (a) können CD4⁺-Zellen durch positive Selektion mit an Anti-CD4 gekoppelten Mikroperlen gereinigt werden. Schritt (b) kann durchgeführt werden durch Markierung von CD25⁺-Zellen unter Verwendung markierter monoklonaler Anti-CD4/25-Antikörper und Reinigung von CD25⁺-Zellen durch FACS-Sortierung. Die aus Schritt (c) erhaltenen Klone, welche in X-vivo-15-Kulturmedium oder in anderen Zellmedien, ergänzt mit 5 % gepooltem oder autologem Humanserum, aufrechterhalten werden können, werden vorzugsweise durch Cokultur mit einer Feederzell-Mischung, durch Antigene oder Zytokine, bevorzugter durch eine allogene oder autologe Feederzell-Mischung, bestehend aus bestrahlten PBMCs mit oder ohne bestrahlte(n) autologe(n) oder allogene(n) EBV-transformierte(n) Zelllinien (zB. JY), restimuliert werden. Suppressive Klone, welche eine konstitutiv hohe Expression von CD25 zeigen, können gemäß Schritt (d) auf der Basis der folgenden charakteristischen Merkmale ausgewählt werden:

– 100 % konstante Positivität für CD25-Expression in der Ruhephase mindestens 10 Tage nach Stimulation mit Phytohämagglutinin oder Anti-CD3-mAb in Gegenwart von IL-2;
– Expression von CD25 auf einem signifikant höheren Niveau im Vergleich zu T-Zell-Klonen, die parallel aus CD25^–-CD4⁺-T-Zellen isoliert wurden, oder nicht-suppressiven Klonen, die aus CD25⁺CD4⁺-T-Zellen isoliert wurden.

Am Ende der Schritte (a)-(d) werden homogene CD25⁺CD4⁺-T-Zell-Klone isoliert, die konstitutiv CD25 exprimieren, anerg sind und eine hohe Suppressionskapazität aufweisen. Die suppressiven Klone sind im Gegensatz zu den nicht-suppressiven Klonen durch signifikante Produktion von TGF-β und keine Produktion von IL-2 charakterisiert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Immunsuppressivum bereit, das isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen und/oder CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone, die konstitutiv CD25 exprimieren, und gegebenenfalls andere aktive Substanzen, z.B. Zytokine oder andere immunsuppressive Proteine, enthält. Vorzugsweise wird das Immunsuppressivum in Form einer stabilisierten Zellpräparation vorliegen.
Neben den betrachteten klinischen Anwendungen können die suppressiven CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone dazu verwendet werden, um Systeme in vitro zur Identifizierung von Molekülen zu entwickeln, welche die Immunreaktion modulieren, insbesondere von für Suppressor-T-Zellen spezifischen Molekülen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden solche CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone in Genexpressions-Arrays in großem Maßstab, bei differentiellen proteonomischen Screenings und zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit Spezifität für Tr-Zellen, die konstitutiv CD25 exprimieren, verwendet werden. Diese Anwendungen werden stark erleichtert durch die Homogenität von Vergleichsproben, wie z.B. den von Zellpopulationen des klonalen Ursprungs bereitgestellten.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Isolierung und Zelloberflächen-Phänotyp von humanen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. CD4⁺-T-Zellen wurden aus PBMCs isoliert und in CD25⁺- und CD25^–-Fraktionen aufgetrennt. Reinheit (A) und Expression von CD45RO, HLA-DR (B), IL-2Rβ, IL-2Rγ und CD62L (C) wurden mittels FACS bestimmt. CD25⁺CD4⁺- und CD25^– CD4⁺-T-Zellen wurden entweder in Medium allein kultiviert oder mit immobilisierten Anti-CD3-mAbs oder PMA und Calcium-Ionophor für 6 Stunden (D) oder 24 Stunden (E) aktiviert. Zellen wurden hinsichtlich Oberflächenexpression von CD40L und CD69 (D) und hinsichtlich intrazytoplasmatischer Expression von CTLA-4 (E) analysiert. Die Resultate sind repräsentativ für sechs unabhängige Experimente.
2. CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen sind anerg und supprimieren die Proliferation bei Alloantigenen. Gereinigte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (100.000 Zellen/Mulde) wurden hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf immobilisierte Anti-CD3-mAbs (αCD3) (10 μg/ml) in Abwesenheit oder Anwesenheit von löslichen Anti-CD28-mAbs (αCD28) (1 μg/ml), sekundären Antimaus-Kaninchen-Abs (αCD28 CL) (10 μg/ml) und/oder IL-2 (100 E/ml) getestet. Nach 72 Stunden Kultur wurde ³H-Thymidin für weitere 16 Stunden zugegeben (A). CD25^–CD4⁺-T-Zellen (50.000 Zellen/Mulde) wurden hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf allogene APCs in Abwesenheit oder Anwesenheit einer zunehmender Anzahl autologer CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen getestet (B). CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden aktiviert, um die CD25-Expression zu induzieren. Nach 48 Stunden wurden T-Zellen, die CD25⁺ wurden (CD25⁺ⁱ), gereinigt und hinsichtlich ihres Vermögens zur Suppression der Proliferation von CD25^–-T-Zellen als Reaktion auf Alloantigene getestet (C). CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden durch Alloantigene mit oder ohne CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (Verhältnis 1:1) in Gegenwart der angegebenen mAbs (10 μg/ml) aktiviert. Die Zahlen repräsentieren die prozentuale Verringerung der Proliferation im Vergleich zur Kultur in Abwesenheit von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (D). Für B-D wurde nach 96 Stunden ³H-Thymidin für weitere 16 Stunden zugegeben. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 6 unabhängige Experimente für A, 9 für B und 3 für C & D.
3. Expansion und Zelloberflächen-Phänotyp von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. CD25⁺- und CD25^–-CD4⁺-T-Zellen wurden gereinigt und mit Anti-CD3-mAbs, einer allogenen Feederzell-Mischung und exogenem IL-2 aktiviert. Zellen wurden erforderlichenfalls aufgeteilt und nach 2 Wochen mittels FACS hinsichtlich Expression von CD25 und CD4 analysiert (A). Parallel dazu wurden Zellen hinsichtlich Zelloberflächenexpression von CD40L und CD69 nach Aktivierung für 6 Stunden mit immobilisierten Anti-CD3-mAbs oder PMA und Calcium-Ionophor analysiert (B). Konstitutive Niveaus an CTLA-4-Expression wurden mittels intrazytoplasmatischer Anfärbung bestimmt (C). Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
4. Kultivierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen behalten ihre suppressive Kapazität. CD25⁺- und CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden gereinigt und mit Anti-CD3-mAbs, einer allogenen Feederzell-Mischung und exogenem IL-2 aktiviert. Nach 14 Tagen Kultur wurden T-Zellen hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf Anti-CD3-mAbs (10 μg/ml) in Anwesenheit oder Abwesenheit von löslichen Anti-CD28-mAbs (1 μg/ml) und/oder IL-2 (100 E/ml) getestet (A). Kultivierte CD25^–CD4⁺-T-Zellen (50.000 Zellen/Mulde) wurden hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf Alloantigene in Anwesenheit oder Abwesenheit einer zunehmender Anzahl in vitro kultivierter autologer CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen getestet (B). Kultivierte CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden durch allogene APCs (von einem anderen Donor als dem für die Expansion verwendeten) mit oder ohne CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (1:1-Verhältnis) in Gegenwart der angegebenen mAbs (10 μg/ml) aktiviert. Die Zahlen repräsentieren die prozentuale Verringerung der Proliferation im Vergleich zur Kultur in Abwesenheit von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (C). Für alle Kulturen wurde nach 48 Stunden ³H-Thymidin für weitere 16 Stunden zugegeben. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
5. Isolierung von humanen CD25⁺CD4⁺-T-Zellen auf der klonalen Ebene. CD4⁺-T-Zellen wurden aus peripherem Blut isoliert, mit Anti-CD4- und Anti-CD25-mAbs angefärbt und durch FACS-Sortierung in CD25⁺CD4⁺- und CD25^–CD4⁺-T-Zellen mit einer größeren Reinheit als 98 bzw. 99 % aufgetrennt.
6. CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone sind bezüglich ihrer Expression von CD25 in der Ruhephase heterogen. Ruhende T-Zell-Klone wurden mit Anti-CD4- und Anti-CD25-mAbs 12-14 Tage nach der letzten Restimulation angefärbt. Die Nummer (#) des T-Zell-Klons ist auf der oberen linken Seite angezeigt und die MFI und der Prozentsatz an CD25-positiven Zellen ist auf der oberen rechten Seite angezeigt.
7. CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone sind bezüglich ihrer Proliferationsreaktion auf eine Aktivierung durch die TCR heterogen. Ruhende T-Zellklone wurden hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf Anti-CD3-mAbs (10 μg/ml) in Abwesenheit oder Anwesenheit von IL-2 (100 E/ml) getestet. Nach 48 Stunden Kultur wurde ³H-Thymidin für weitere 16 Stunden zugegeben.
8. Suppression nativer T-Zell-Reaktionen durch CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone. Autologe CD4⁺-T-Zellen wurden gereinigt und hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf Anti-CD3-mAbs und bestrahlte CD3-verarmte APCs (A) oder auf Kunststoff immobilisierte Anti-CD3-mAbs (B) zu testen. Nach 72 (A) oder 48 Stunden (B) Kultur wurde ³H-Thymidin für weitere 16 Stunden zugegeben. Die Zahlen zeigen die prozentuale Verringerung der Proliferation im Vergleich zu den nativen CD4⁺-T-Zellen allein an.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Isolierung und Zelloberflächen-Phänotyp humaner CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen
CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen liegen in humanen PBMCs vor. Im Mittel repräsentieren sie 3,0 % (Bereich 1,6-4,4 %, n = 6) der Gesamt-PMBCs und 12,8 % (Bereich 9,8-18,1 %, n = 6) der CD4⁺-T-Zellen. Diese Zellen konnten unschwer mit Reinheiten von mehr als 90 % isoliert werden (1A). Die Mehrheit (82 ± 5,1 %) von frisch isolierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen exprimierten auch CD45RO und der Prozentsatz an CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, der HLA-DR exprimierte, war signifikant höher als in der CD25 CD4⁺-Population (17,3 ± 4,9 % gegenüber 6,4 ± 2,9 %, n = 6) (1B). Darüber hinaus exprimierten humane CD25⁺CD4⁺-Tr- Zellen höhere Nivaus des IL-2Rβ im Vergleich zu CD25^–CD4⁺-T-Zellen (61,9 ± 2,6 % gegenüber 33,1 ± 2,5 %, n = 5) (1C) und eine Untergruppe frisch isolierter CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen exprimierte CTLA-4 (8,4 ± 1,6 %, n = 6) (1E). Im Gegensatz dazu war die Expression des IL-2Rγ und CD62L bei beiden Populationen von T-Zellen äquivalent. CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen und CD25^–CD4⁺-T-Zellen waren CD3⁺TCRαβ⁺. Somit exprimieren humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen Marker, welche charakteristisch für Gedächtnis-T-Zellen sind, und niedrige konstitutive Niveaus an CTLA-4, ähnlich wie Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (9, 10, 15, 17, 18).
Nach der TCR-vermittelten Stimulation exprimierten humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen niedrigere Niveaus an Aktivierungsmarkern im Vergleich zu CD25^–CD4⁺-T-Zellen. Der Anteil der CD40L⁺-Zellen war 17,3 ± 2,3 % in CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen gegenüber 28,4 ± 1,8 % in der CD25^–CD4⁺-T-Zell-Untergruppe (p 0,005); wohingegen 30,9 ± 7,0 % der CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen gegenüber 54 ± 9,1 der CD25^–CD4⁺-T-Zellen CD69 exprimierten (p 0,006) (1D). Zeitverlaufsexperimente demonstrierten, dass die verringerten Niveaus an CD40L und CD69 auf CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen nicht auf eine veränderte Expressionskinetik zurückzuführen waren. Nach Aktivierung mit PMA und Calcium-Ionophor gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Expression von CD69 oder CD40L auf CD25⁺CD4⁺- oder CD25^–CD4⁺-T-Zellen, obwohl im Allgemeinen weniger CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen CD40L exprimierten.
Nach der Aktivierung mit Anti-CD3-mAbs oder PMA und Calcium-Ionophor war der Prozentsatz an CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, die CTLA-4 exprimierten, höher als der von CD25^–CD4⁺-T-Zellen. Darüber hinaus waren die CTLA-4-Expressionsniveaus auf CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen etwa dreimal höher (1E). Zusammen demonstrieren diese Daten, dass nach TCR-Aktivierung humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen ein Oberflächenmolekül-Expressionsprofil aufweisen, welches einzigartig und verschieden von denen anderer CD4⁺-T-Zell-Untergruppen ist.
Proliferation und Zytokin-Produktion durch humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen
Frisch isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen proliferierten als Reaktion auf immobilisierte Anti-CD3-mAbs nicht und die Zugabe von löslichen Anti-CD28-mAbs führte zu einer mäßigen und variablen Erhöhung der Proliferation. Im Gegensatz dazu machten vernetzte Anti-CD28-mAbs das fehlende Reaktionsvermögen von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen auf die TCR-Aktivierung vollständig rückgängig. Die Zugabe von exogenem IL-2 stellte die Proliferation von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen als Reaktion auf Anti-CD3-mAbs teilweise wieder her und die Proliferation wurde durch lösliche Anti-CD28-mAbs weiter erhöht (2A). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen einen spezifischen Defekt bezüglich ihres Vermögens zur Proliferation nach TCR-vermittelter Aktivierung aufweisen (15, 16).
Humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen wurden hinsichtlich ihres Vermögens zur Produktion von Zytokinen analysiert. Nach einer Stimulation mit immobilisierten Anti-CD3-mAbs mit oder ohne lösliche(n) Anti-CD28-mAbs konnten keine nachweisbaren Niveaus an IL-2, IL-10, IL-4, TGF-β oder IFN-γ gemessen werden. Im Gegensatz dazu produzierten bei Stimulation mit Anti-CD3- und löslichen Anti-CD28-mAbs in Gegenwart von exogenem IL-2 CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen signifikante Nivaus an IL-4, IL-10, IFN-γ und TGF-β (Tabelle 1). Unter diesen Stimulationsbedingungen hatten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen ein Zytokin-Profil, das mit demjenigen von CD25^–CD4⁺-T-Zellen vergleichbar war. Im Gegensatz dazu wurden Unterschiede in der Zytokin-Produktion nach Aktivierung mit allogenen APCs beobachtet. Sowohl CD25⁺CD4⁺- als auch CD25^–CD4⁺-T-Zellen produzierten IL-10, TGF-β und IFN-γ, jedoch kein IL-4. Jedoch ist der auffallendste Unterschied zwischen den CD25⁺CD4⁺- und CD25^–CD4⁺-T-Zellpopulationen die Tatsache, dass die CD25⁺-Zellen nicht in der Lage waren, IL-2 zu sekretieren, was anzeigt, dass diese Zellen einen spezifischen Defekt bei der Produktion von IL-2 aufweisen. Interessanterweise produzierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen einheitlich weniger IFN-γ nach Alloantigen-Stimulierung als CD25^–CD4⁺-T-Zellen.
Humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen supprimieren die proliferativen Reaktionen von nativen CD25^–CD4⁺-T-Zellen auf Alloantigene
Wir untersuchten die regulatorischen Eigenschaften von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen durch Testen ihres Vermögens zur Suppression der proliferativen Reaktionen von nativen CD25^–CD4⁺-T-Zellen auf Alloantigene. CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden mit allogenen APCs stimuliert und eine zunehmende Anzahl an autologen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen wurde zugegeben. Die Addition von so wenig wie 2.500 CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zu 50.000 CD25^–CD4⁺-T-Zellen resultierte in einer verminderten Proliferation von CD25-CD4⁺-T-Zellen. Bei einem Verhältnis von 1:1 inhibierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die Proliferation von nativen CD25^–CD4⁺-T-Zellen um im Mittel 75,0 ± 2,9 % (n = 9) (2B). Die CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen waren selbst nicht in der Lage, als Reaktion auf Alloantigene zu proliferieren. Ferner supprimierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die Proliferation von CD25^–CD4⁺-T-Zellen als Reaktion auf PHA in Gegenwart von APCs (um im Mittel 81,2 ± 5,0 %, n = 6) und auf immobilisiertes Anti-CD3 allein (um im Mittel 79,4 ± 14,6 %, n = 3). Diese letzteren Daten weisen darauf hin, dass CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen eine direkte suppressive Wirkung auf T-Zellen haben, die unabhängig von APCs ist, ähnlich wie Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (17). Darüber hinaus supprimierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die Produktion von IFN-γ und IL-2 durch CD25^–CD4⁺-T-Zellen, die mit Anti-CD3-mAbs oder allogenen APCs aktiviert worden waren.
Zur Demonstration, dass diese suppressive Kapazität eine inhärente Eigenschaft von T-Zellen war, die konstitutiv CD25 in vivo exprimierten, testeten wir, ob CD25^–CD4⁺-T-Zellen, welche CD25 nach Aktivierung in vitro exprimierten, regulatorische Wirkungen zeigten. Diesbezüglich wurden CD25^–CD4⁺-T-Zellen mit Anti-CD3- und Anti-CD28-mAbs aktiviert und nach 48 Stunden wurden die CD25⁺-T-Zellen isoliert und hinsichtlich ihres Vermögens zur Suppression von frisch isolierten autologen CD25^–-T-Zellen getestet. Wie in 2C gezeigt, proliferierten T-Zellen, welche nach in vitro-Aktivierung CD25⁺ wurden, als Reaktion auf Alloantigene und erhöhten die Reaktion von CD25^–CD4⁺-T-Zellen eher als sie zu supprimieren. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Inhibierung der T-Zell-Proliferation eine einzigartige Eigenschaft von Zellen ist, welche konstitutiv CD25 in vivo exprimieren.
Mehrere Studien zeigen, dass einige Untergruppen von Tr-Zellen, wie zum Beispiel Typ 1-Tr-(Tr1) und Th3-Zellen, IL-10 und/oder TGF-β produzieren und Immunreaktionen durch Produktion dieser Zytokine supprimieren (4-8). Nachdem CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen sowohl IL-10 als auch TGF-β nach Stimulation mit allogenen APCs produzierten (Tabelle 1), wurde die Rolle dieser Zytokine hinsichtlich der Inhibierung von allogenen Reaktionen durch humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen untersucht. Wie in 2D gezeigt, hatte die Zugabe von neutralisierenden Anti-IL-10R- oder Anti-TGF-β-mAbs keine signifikante Auswirkung auf das Vermögen von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, die Proliferation von CD25^–CD4⁺-T-Zellen als Reaktion auf Alloantigene zu supprimieren. In drei unabhängigen Experimenten wurde ein Mittel von 67,2 ± 6,0 % Suppression in Anwesenheit von 10 μg/ml Kontroll-IgG, 63,8 ± 5,8 % mit 10 μg/ml Anti-IL-10R- und 69,0 ± 3,4 % mit 10 μg/ml Anti-TGF-β-mAbs beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer fünffach höheren Konzentration an Anti-TGF-β-mAbs erhalten. Die Zugabe von sowohl Anti-IL-10R- als auch Anti-TGF-β-mAbs führte zu einer leichten, jedoch nicht statistisch signifikanten Reversion der Suppression, welche durch CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen vermittelt wurde (von 67,2 ± 6,0 % auf 52,4 ± 5,7 %, p 0,06).
Von F(ab')₂-Fragmenten aus Antikörpern, welche spezifisch das Vermögen von CTLA-4 zur Bindung an CD80/86 blockieren, ohne Signale über CD28 zu beeinflussen, wurde bereits gezeigt, dass sie die Produktion von TGF-β durch Tr1-Zellen inhibieren (20). Die Zugabe derselben blockierenden Anti-CTLA-4-mAbs hatte keine signifikante Auswirkung auf die suppressive Aktivität von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. Diese Daten legen nahe, dass trotz der Tatsache, dass CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen hohe Niveaus an CTLA-4 exprimieren (1E), dieses Molekül für ihre suppressive Aktivität nicht erforderlich ist.
Humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen können in vitro expandiert werden
Wir haben bereits gezeigt, dass humane Tr1-Zellen, welche kloniert und in vitro expandiert wurden, ihre regulatorische Aktivität behalten (6). Unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls wie dem für Tr1-Zellen beschriebenen stellten wir fest, ob CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen expandiert werden konnten. CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen proliferierten nicht als Reaktion auf Anti-CD3 alleine (2A), jedoch wurde bei Aktivierung mit Anti-CD3-mAbs in Gegenwart einer allogenen Feederzell-Mischung und von exogenem IL-2 eine Expansion erhalten, welche der von CD25^–CD4⁺-T-Zellen ähnlich war (20-30-fache Erhöhung am Tag 14). In vitro expandierte humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen blieben selbst nach einer Kultivierung für mehr als einen Monat positiv für CD25 (3A). Im Gegensatz dazu exprimierten alle CD25^–CD4⁺-T-Zellen CD25 nach einer Aktivie rung, jedoch nahm die Expression mit der Zeit allmählich ab. Eine dauerhafte Expression von CD25 wurde auch in Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen beobachtet, die in vivo aktiviert worden waren (21).
Ähnlich wie bei frisch isolierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, war der Anteil von in vitro expandierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, die CD40L nach Aktivierung mit Anti-CD3-mAbs exprimierten, im Vergleich zu CD25^–CD4⁺-T-Zellen einheitlich niedriger (12,7 ± 3,3 % gegenüber 36,9 ± 8,3 %, p 0,01). Im Gegensatz zu frisch isolierten Zellen exprimierten jedoch kultivierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen nach einer durch polyklonale TCR vermittelten Aktivierung normale Nivaus an CD69 (3B). Somit ist eine verringerte Hochregulation von CD40L ebenfalls ein Charakteristikum von expandierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. Wie erwartet, exprimierten kultivierte CD25⁺CD4⁺- und CD25^–CD4⁺-T-Zellen ähnliche Nivaus von sowohl CD40L als auch CD69 nach Aktivierung mit PMA und Calcium-Ionophor. Die in vitro-Expansion von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen veränderte deren konstitutive Expression von CTLA-4 nicht und sie fuhren fort, dieses inhibitorische Molekül auf signifikant höheren Niveaus als ihre CD25^–CD4⁺-Gegenstücke zu exprimieren (3C).
In vitro expandierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen bleiben anerg und behalten ihre suppressive Kapazität
In vitro expandierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen waren nicht in der Lage, als Reaktion auf Anti-CD3-mAbs alleine zu proliferieren, und die Proliferation konnte nur durch Zugabe von exogenem IL-2 vollständig wiederhergestellt werden (4A). Darüber hinaus waren kultivierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen nicht in der Lage, als Reaktion auf Alloantigene zu proliferieren, und behielten ihr Vermögen zur Suppression der Proliferation von autologen CD25^–CD4⁺-T-Zellen (bei einem Verhältnis von 1:1 wurde eine mittlere Suppression von 64 ± 3,8 % (n = 3) beo bachtet) (4B). Diese Daten zeigen an, dass CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die in vitro expandiert wurden, ihre regulatorischen Funktionen behalten und sich ähnlich wie frisch isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen verhalten. Nachdem in diesem Experiment die CD25^–CD4⁺-Responder-T-Zellen zuvor aktiviert und in vitro expandiert worden waren, demonstrieren diese Daten, dass CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen nicht nur die Reaktion von frisch isolierten nativen CD25^–CD4⁺-T-Zellen supprimieren, sondern auch die von zuvor aktivierten CD25^–CD4⁺-Gedächtnis-T-Zellen (4B). Schließlich wurde, ähnlich zu Beobachtungen mit frisch isolierten CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, die Suppression, welche durch in vitro expandierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen vermittelt wurde, durch die Zugabe von neutralisierenden Anti-IL-10R-, Anti-TGF-β- oder Anti-CTLA-4-mAbs nicht rückgängig gemacht (4C).
In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass humane CD4⁺-T-Zellen, welche CD25 in vivo exprimieren, eine einzigartige Untergruppe von Tr-Zellen darstellen. Humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen sind anerg, nicht in der Lage, IL-2 zu produzieren, exprimieren CTLA-4 konstitutiv und supprimieren die Proliferation von nativen CD4⁺-T-Zellen, wie beschrieben für Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (2, 3). Darüber hinaus regulieren humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen nach einer durch polyklonale TCR vermittelten Aktivierung CTLA-4 stark nach oben, zeigen eine verringerte Expression von CD40L und produzieren Zytokine. CD25 und CTLA-4 bleiben auf in vitro expandierten humanen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen konstitutiv exprimiert, während nach der Aktivierung die Hochregulation von CD40L immer noch mangelhaft ist. Interessanter ist, dass in vitro expandierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen ihre starke suppressive Aktivität sogar gegenüber zuvor aktivierten Gedächtnis-T-Zellen behalten. Die Beobachtung, dass funktionelle Tr-Zellen in vitro expandiert werden können und Reaktionen von Gedächtnis-T-Zellen regulie ren können, ist von großer klinischer Bedeutung für die Verwendung von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen als zelluläre Therapie bei T-Zell-vermittelten Krankheiten.
Die Rolle von immunregulatorischen Zytokinen bei der Suppression, welche durch CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen vermittelt wird, bleibt eine offene Frage. Alloantigen-aktivierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen proliferierten nicht, sondern produzierten IL-10, IFN-γ und TGF-β und besaßen in der Tat ein Profil der Zytokin-Produktion, welches mit demjenigen von Tr1-Zellen vergleichbar ist (d.h. IL-10+IFN-γ+TGF-β+IL-4-IL-2-/niedrig) (6). Wir beobachteten jedoch nur eine leichte Umkehrung der Suppression in Gegenwart von sowohl neutralisierenden Anti-IL-10R- als auch Anti-TGF-β-mAbs, welches mit früheren Beobachtungen übereinstimmt, dass die Produktion von IL-10 und TGF-β für die regulatorische Funktion von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen entbehrlich ist (15, 16). Andererseits wurden in einem Maus-Modell von experimentell induzierter Colitis sowohl IL-10 als auch TGF-β befunden, für die Suppression, welche durch CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen vermittelt wurde, erforderlich zu sein (5, 10). Der Grund für diese Diskrepanz bei der Beteiligung von IL-10 und TGF-β ist unklar. CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen besitzen die Kapazität zur Produktion von IL-10 und TGF-β, jedoch mag die Produktion dieser Zytokine von ihrem Reifungszustand und dem Umweltkontext, in dem sie aktiviert werden, abhängen.
Frühere Berichte demonstrierten, dass ein direkter Zell-Zell-Kontakt für Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen erforderlich ist, um deren suppressive Wirkungen zu entfalten (15, 16). Trotz konstitutiver und persistenter Expression von CTLA-4 waren Anti-CTLA-4-mAbs nicht in der Lage, die suppressive Aktivität von humanen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zu eliminieren. Diese Daten stimmen mit einer Studie überein, welche anzeigt, dass Signale über CTLA-4 für die Suppression durch Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr- Zellen in vitro entbehrlich waren (15). Jedoch weisen jüngere Berichte darauf hin, dass die Expression von CTLA-4 für die Suppression, welche durch diese Zellen vermittelt wird, essenziell ist (10, 18). Es ist möglich, dass die Suppression der Proliferation über Mechanismen abläuft, welche sich in Abhängigkeit von den Stimuli und der Mikroumgebung unterscheiden, oder dass Human- und Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen über verschiedene Mechanismen wirken. Schließlich ist die Suppression nicht einfach auf einen Verbrauch von IL-2 zurückzuführen, da Maus-CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die IL-2-Produktion auf der Ebene der Transkription supprimierten (15). Darüber hinaus supprimierten humane CD4⁺-T-Zellen, welche CD25 nach Aktivierung in vitro exprimierten, die Reaktionen von CD25^–CD4⁺-T-Zellen nicht, was anzeigt, dass eine hohe Expression von CD25 nicht einfach im Einfang von IL-2 resultiert.
Humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen expandieren in vitro und behalten ihr einzigartiges Zelloberflächen-Markerprofil und ihre suppressiven Funktionen. Nach unserer Kenntnis repräsentieren diese Daten den ersten Bericht einer in vitro-Expansion von humanen T-Suppressor-Zelllinien.
Die klinische Verwendung von regulatorischen CD25⁺CD4⁺-T-Zellen (Tr-Zellen) kann zur Herunterregulierung unerwünschter Immunreaktionen in einer Reihe pathologischer Zustände in Betracht kommen. Wir haben gezeigt, dass CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen mit suppressiver Funktion unschwer aus peripherem Blut isoliert werden können. Es ist von Bedeutung, dass diese Zellen in vitro stimuliert und kultiviert werden können, was die Möglichkeit gestattet, antigenspezifische Suppressor-T-Zellen zu selektionieren und expandieren. Expandierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen behalten ihre regulatorische Kapazität in vitro und könnten somit zur Regulation von T-Zellreaktionen in vitro verwendet werden.
Isolierung und Charakterisierung humaner CD25⁺CD4⁺-T-Zellen mit suppressiver Kapazität auf der klonalen Ebene
Zur Feststellung des Verhältnisses zwischen IL-10 produzierenden Tr1-Zellen (22) und CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen (23, 24) versuchten wir CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen auf der klonalen Ebene zu isolieren. Es wurde bereits beschrieben, dass nur etwa 0,8 der peripheren mononukleären Blutzellen, welche CD4⁺ sind und ein hohes CD25⁺-Niveau aufweisen, eine suppressive Kapazität in vitro besitzen (25). Wir reinigten deshalb CD4⁺-T-Zellen aus dem peripheren Blut und reinigten durch FACS-Sortierung CD25^hellCD4⁺-Tr-Zellen, welche etwa 2,9 % der CD4⁺-T-Zellen (0,6 % des gesamten peripheren Bluts in diesem Spender) repräsentieren. Die resultierenden CD25^–- und CD25^hell-Populationen waren zu 99 bzw. 98 % rein (5). Die gereinigten Zellen wurden anschließend durch Grenzverdünnung mit 1 Zelle/Mulde kloniert und mit PHA und einer allogenen Feederzell-Mischung wie in den Materialien und Methoden beschrieben und früher beschrieben (26) stimuliert. Nach 8 Tagen wurde eine 96-Mulden-Platte aus jeder Klonierung über Nacht mit Thymidin gepulst, um die Anzahl proliferierender Mulden (die Klonierungseffizienz) zu bestimmen. Die CD25^–CD4⁺-T-Zellen hatten eine Klonierungseffizienz von 42 %, wohingegen die CD25⁺CD4⁺-T-Zellen eine signifikant niedrigere Effizienz von nur 10,2 % aufwiesen. Nach 14 Tagen wurden 120 CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone gepickt, erneut stimuliert und für die Analyse expandiert.
Nachdem eines der definierenden charakteristischen Merkmale von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen die konstitutive und hohe Expression von CD25 ist, screenten wir die CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone hinsichtlich Expression von CD25 mindestens 10 Tage nach der erneuten Stimulation (in der Ruhephase). Wie in 6 gezeigt, zeigten die Klone eine heterogene Expression von CD25. Etwa die Hälfte der Klone blieb zu 99-100 % positiv für CD25 und besaß eine relativ hohe mittlere Fluoreszenzintensität (MFI). Andere Klone enthielten eine signifikante Anzahl an CD25^–-Zellen und eine niedrigere MFI. T-Zell-Klone, von denen die CD25^–CD4⁺-T-Zellen abgeleitet waren, zeigten einen niedrigen Prozentsatz an CD25⁺-Zellen in der Ruhephase und folglich auch eine niedrige MFI.
Die Klone wurden anschließend hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation als Reaktion auf eine Aktivierung über die TCR in Anwesenheit oder Abwesenheit von exogenem IL-2 getestet. Es ist wohl etabliert, dass sowohl Maus- als auch Human-CD25⁺CD4⁺-T-Zellen nicht in der Lage sind, als Reaktion auf αCD3-mABs in Abwesenheit einer Costimulation über CD28 und/oder Zugabe von IL-2 zu proliferieren (23, 24, 26). Um festzustellen, ob dies auch auf der klonalen Ebene zutraf, testeten wir die CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone hinsichtlich ihres Vermögens zur Proliferation in Anwesenheit oder Abwesenheit von IL-2. Ähnlich der Heterogenität, die bezüglich der Expression von CD25 beobachtet wurde, waren die Klone auch bezüglich der Proliferation heterogen. Die Mehrheit der Klone (58/72, 80 %) waren anerg und nicht in der Lage, als Reaktion auf αCD3-mAbs zu proliferieren, proliferierten jedoch gut in Anwesenheit von IL-2. Die verbleibenden Klone (14/72, 20 %) proliferierten gut als Reaktion auf αCD3-mAbs, sogar in Abwesenheit von IL-2. Eine repräsentative Untergruppe der 72 getesteten Klone ist in 7 gezeigt. Im Gegensatz dazu proliferierte von den getesteten CD25^–CD4⁺-T-Zellklonen die Mehrheit (14/22, 65 %) gut als Reaktion auf αCD3-mAbs allein.
Die Heterogenität der CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone bezüglich Expression von CD25 und Proliferation legte nahe, dass sogar innerhalb der 0,6%igen CD25^hellCD4⁺-Tr-Zellpopulation von PBMCs nicht alle Zellen Suppressorzellen sein könnten und dass ein Anteil aktivierte T-Helferzellen sein könnte. Zur Überprüfung dieser Hypothese führten wir Suppressionsassays in vitro durch. Wie in 8 gezeigt, war in der Tat nur eine Untergruppe der CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone in der Lage, die proliferative Reaktion autologer CD4⁺-T-Zellen als Reaktion auf αCD3-mAbs, vernetzt mit T-Zell-verarmten PBMCs (8A) oder immobilisiert auf Kunststoff (8B), zu supprimieren. Interessanterweise hatten nur diejenigen Klone, welche anerg waren und eine konstitutiv hohe Expression von CD25 aufwiesen, einen suppressiven Phänotyp. Wenn die Daten von allen getesteten CD25⁺CD4⁺-T-Zellklonen zusammengenommen und die Klone in suppressive und nicht-suppressive Gruppen aufgeteilt wurden, wurde die Expression von CD25 in der Gruppe mit suppressiver Aktivität als signifikant höher befunden (p < 0,000007) (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu war die Proliferation als Reaktion auf αCD3-mAbs ein weniger zuverlässiger Indikator der suppressiven Kapazität, da mehrere Klone innerhalb der nicht-suppressiven Kategorie anerg waren. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine konstitutiv hohe Expression von CD25 ein Marker für regulatorische CD4⁺-T-Zellen auf der klonalen Ebene ist.
Wir bestimmten auch das Zytokin-Produktionsprofil der CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone. Wie in Tabelle 3 gezeigt, tendierten nicht-suppressive Klone dazu, ein Th0-Muster der Zytokin-Produktion aufzuweisen, und produzierten mäßige Niveaus der meisten getesteten Zytokine. Im Gegensatz dazu produzierten alle CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone, die eine suppressive Aktivität besaßen, signifikante Mengen an TGF-β, kleine und variable Mengen an IL-4, IL-5 und IFN-γ, waren jedoch nicht in der Lage, nachweisbare Niveaus an IL-2 oder IL-10 zu produzieren. Diese Daten weisen darauf hin, dass sich regulatorische CD25⁺CD4⁺-T-Zellen wahrscheinlich von IL-10-produzierenden Tr1-Zellen unterscheiden, obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass sie dieselben Zellen in unterschiedlichen Diffe renzierungsstadien repräsentieren. Die Tatsache, dass das einzige Zytokin, welches einheitlich in den Überständen aller suppressiven CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone nachgewiesen wurde, TGF-β war, legt nahe, dass sie wahrscheinlicher mit den TGF-β-produzierenden Th3-Zellen verwandt sind, welche ursprünglich in Modellen oraler Toleranz beschrieben wurden (27, 28).
TABELLEN
Tabelle 1. Zytokin-Produktion durch CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. Gereinigte Zellen wurden wie angegeben stimuliert und Überstände nach 24 (für IL-2) oder 72 Stunden gewonnen. Die Menge an Zytokinen wurde mittels ELISA bestimmt. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (pg/ml) vereinigter Daten von 4 unabhängigen Experimenten. Die Zytokin-Produktion durch allogene APCs alleine wurde subtrahiert.
Tabelle 2. Suppressive CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone haben einen von nicht-suppressiven Klonen unterscheidbaren Phänotyp. Zusammenfassung des Phänotyps aller CD25⁺CD4⁺-T-Zellklone, welche ausführlich charakterisiert wurden. Die prozentuale Suppression repräsentiert die mittlere Verringerung der Proliferation autologer CD4⁺-T-Zellen nach Akivierung mit αCD3-mAbs, immobilisiert auf Kunststoff oder T-Zell-verarmten APCs, in Gegenwart der angezeigten T-Zellklone. Die Zahlenwerte repräsentieren die mittlere Suppression, die bei 2-6 unabhängigen Experimenten beobachtet wurden. MFI repräsentiert die mittlere Expression von CD25, wie in 2-6 unabhängigen Tests be stimmt. CpM repräsentiert die Menge an Thymidin, die nach Aktivierung mit αCD3-mAbs, immobilisiert auf Kunststoff, inkorporiert wurde. Die Zahlenwerte repräsentieren das Mittel von Duplikaten in einem einzigen Test und sind repräsentativ für die Ergebnisse, die in mehreren aufeinanderfolgenden Tests erhalten wurden.

n.t.: nicht getestet

Tabelle 3. Zytokin-Produktionsprofil von CD25⁺CD4⁺-T-Zellklonen. T-Zellklone wurden mit αCD3- und αCD28-mAbs aktiviert und Überstände wurden nach 24 (für IL-2) oder 48 Stunden gewonnen. Die Mengen der Zytokine in den Überständen wurden durch Einfang-ELISA und/oder CBA-Assay wie in den Materialien und Methoden beschrieben bestimmt. n.t.: nicht getestet.
MATERIALIEN UND METHODEN
1. Isolierung und Charakterisierung haumaner CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen
Reinigung von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. Humanes peripheres Blut wurde aus gesunden Spendern mit der Zustimmung des örtlichen ethischen Komitees erhalten. PBMCs wurden mittels Zentrifugation über Ficoll-Hypaque-Gradienten (Nycomed Amersham, Uppsala, Schweden) präpariert und CD4⁺-T-Zellen wurden durch positive oder negative Selektion (durch Abreicherung von CD8-, CD11b-, CD16-, CD19-, CD36- und CD56-positiven Zellen) mit dem CD4⁺-Multisort-Kit bzw. dem „Untouched CD4⁺-T-Cell Isolation"-Kit (Miltenyi Biotech, Gladbach, Deutschland) aufgereinigt. Nach der Isolierung von CD4⁺-T-Zellen wurden CD25⁺-Zellen mit PE-gekoppelten Anti-CD25-mAbs angefärbt und nach der Zugabe von an Anti-PE gekoppelten Magnetperlen (Miltenyi Biotech) aufgereinigt. Alternativ wurden CD4⁺-T-Zellen mit Magnetperlen aufgereinigt, die direkt an Anti-CD25 gekoppelt waren (Miltenyi Biotech), um die FACS-Analyse zu erleichtern. Die erhaltenen Ergebnisse mit CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen, welche durch negative oder positive Selektion isoliert worden waren, und mit direkt oder indirekt gekoppelten CD25-mAbs waren identisch. Ausgehend von 2 × 10⁸ PBMCs wurden typischerweise 2-3 × 10⁶ CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen mit einer Reinheit im Bereich von 90-95 % isoliert. CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden ebenfalls gewonnen, mit einer Reinheit im Bereich von 70-90 %. Zur Reinigung von CD25⁺-Zellen nach in vitro-Aktivierung von CD25^–-Zellen wurden CD25^–CD4⁺-T-Zellen 48 Stunden lang mit immobilisierten Anti-CD3- (10 μg/ml) und löslichen Anti-CD28-mAbs (1 μg/ml) aktiviert und CD25⁺-Zellen wurden wie oben beschrieben aufgereinigt.
In vitro Expansion von T-Zelllinien. CD25⁺CD4⁺- oder CD25 CD4⁺-T-Zellen wurden wie beschrieben isoliert. T-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml) wurden mit Anti-CD3 (1 μg/ml) (OKT33, Ortho clone Jansen Cilag, Italien) in Gegenwart einer allogenen Feederzell-Mischung, bestehend aus 1 × 10⁶ PBMCs/ml (bestrahlt mit 6.000 RAD) und 1 × 10⁵ JY-Zellen/ml (bestrahlt mit 10.000 RAD) einer EBV-LCL, welche hohe Niveaus an HLA und costimulatorischen Molekülen sowie Zytokinen exprimiert, wie bereits beschrieben (29, 30), stimuliert. Alle Kulturen wurden in X-Vivo-15-Medium (BioWhittaker, Bergamo, Italien), ergänzt mit 10 % FCS (Mascia Brunelli, Mailand, Italien), 1 % gepooltem Humanserum, 100 E/ml Penicillin/Streptomycin (Bristol-Myers Squibb, Sermoneta, Italien) und 2 mM Glutamin (GibcoBRL, Mailand, Italien) (hier im Folgenden als vollständiges Medium bezeichnet), durchgeführt. Drei Tage nach der Aktivierung wurden 40 E/ml rIL-2 (Chiron Italia, Mailand, Italien) zugegeben. Die Zellen wurden erforderlichenfalls aufgeteilt und frisches Medium mit IL-2 wurde zugegeben. T-Zelllinien wurden alle 14 Tage restimuliert. Alle Experimente mit expandierten Zellen wurden mindestens 10 Tage nach der Aktivierung durchgeführt.
Proliferation und Suppression von T-Zellen. Zur Analyse der Proliferation als Reaktion auf eine polyklonale Aktivierung wurden 96-Mulden-Rundbodenplatten (Costar) über Nacht bei 4°C mit Anti-CD3-mAbs (10 μg/ml) in 0,1 M Tris, pH 9,5, überschichtet und dreimal mit PBS gewaschen. T-Zellen wurden mit einer Ausgangsdichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml (100.000 Zellen/Mulde) in einem Endvolumen von 200 μl vollständigem Medium in Abwesenheit oder Anwesenheit von löslichen Anti-CD28-mAbs (1 μg/ml) (Pharmingen, San Diego, CA), löslichen sekundären Antimaus-Kaninchen-Abs (10 μg/ml) (Sigma, Mailand, Italien) und/oder IL-2 (100 E/ml) ausplattiert.
Zum Testen der antigenspezifischen T-Zellproliferation wurden frisch isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr- oder CD25^–CD4⁺-T-Zellen (2,5 × 10⁵ Zellen/ml) mit bestrahlten (6.000 RAD) allogenen PBMCs (2,5 × 105 Zellen/ml), welche durch negative Selektion hinsichtlich CD3⁺-Zellen abgereichert worden waren (Dynal, Oxoid), stimuliert. Zur Suppression wurden eine zunehmende Anzahl (bis zu 2,5 × 10⁵ Zellen/ml) von frisch isolierten autologen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zugegeben. Die Zellen wurden in einem Endvolumen von 200 μl vollständigem Medium in 96-Mulden-Rundbodenplatten cokultiviert. Kontroll-IgG (10 μg/ml) (Pharmingen), neutralisierende monoklonale Anti-IL-10R- (10 μg/ml) (3F9, Pharmingen) und/oder Anti-TGF-β_1,2,3- (10 μg/ml oder 50 μg/ml) (R&D) oder F(ab')₂-Anti-CTLA-4-Antikörper (10 μg/ml) (Ancell, Bayport, MN) wurden wie angegeben zugegeben. Zur Suppression von Gedächtnis-T-Zellen wurden Zellen von expandierten CD25^–CD4⁺-T-Zelllinien mit allogenen APCs (von einem anderen Donor als dem bei der allogenen Feederzell-Mischung verwendeten) kultiviert und zunehmende Anzahlen expandierter autologer CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen wurden wie oben beschrieben zugegeben. Für Kontrollexperimente wurden CD25⁺CD4⁺-T-Zellen, die von in vitro-aktivierten CD25^–CD4⁺-T-Zellen gereinigt worden waren, in zunehmenden Anzahlen zu frisch isolierten autologen CD25^–CD4⁺-T-Zellen und allogenen APCs zugegeben.
Nach der angegebenen Zeit wurden die Mulden 16 Stunden lang mit 1 μgCi/Mulde ³H-Thymidin (Amersham, Uppsala, Schweden) gepulst. Die Zellen wurden geerntet und in einem Szintillationszähler gezählt.
ELISAs. Für den Nachweis von IL-10, IL-4, IL-2, IFN-γ und TGF-β wurden Einfang-ELISAs mit Überständen von Zellen (1 × 10⁶ T-Zellen/ml), die mit imobilisierten Anti-CD3-mAbs (10 μg/ml) mit oder ohne Anti-CD28 (1 μg/ml) und IL-2 (100 E/ml) oder bestrahlten, CD3-abgereicherten allogenen PBMCs (1 × 10⁶ Zellen/ml) für 24 (für IL-2) oder 72 Stunden stimuliert worden waren, durchgeführt. ELISAs wurden nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Alle Einfang- und Nachweis-mAbs wurden von Pharmingen bezogen. Die Nachweisgrenzen waren wie folgt: IL-2: 19 pg/ml; IL-4: 9,4 pg/ml; IL-10: 15,6 pg/ml; IFN-γ: 62,5 pg/ml; TGF-β: 62,5 pg/ml.
FACS-Analyse. Anti-CD4-, -CD25-, -HLA-DR-, -CD45RO-, -CD62L-, -CD69- und -CD40L-mAbs wurden von Beckton Dickinson (Mountain View, CA) bezogen und waren direkt an FITC oder PE gekoppelt. Die Expression von IL-2Rβ (CD122) und IL-2Rγ (CD132) wurde durch Anfärbung mit den relevanten biotinylierten mAbs (Phar-Mingen) und Straptavidin-gekoppeltem Tricolor (Caltag) bestimmt. Zellen, die sich in der Ruhephase befanden oder mit immobilisiertem Anti-CD3 (10 μg/ml) oder PMA (10 ng/ml, Sigma) und Calcium-Ionophor (A23187, 500 ng/ml, Sigma) aktiviert worden waren, wurden mit den angegebenen mAbs 20 Minuten lang bei 4°C in PBS, 2 % FCS, inkubiert, einmal gewaschen und mit einem FACScan^®-Durchflusszytometer unter Verwendung von Cellquest-Software (Beckton Dickinson) analysiert. Die Expression von CTLA-4 wurde mittels intrazytoplasmatischer Anfärbung mit biotinyliertem Anti-CTLA-4 (PharMingen), gefolgt von Streptavidin-gekoppeltem PE (Caltag) bestimmt. Ruhende oder aktivierte Zellen wurden mit 2 % Formaldehyd fixiert und Membranen wurden durch Inkubation in Saponin-Puffer (PBS, 2 % BSA und 0,5 % Saponin (Sigma)) für 10 Minuten permeabilisiert. Das Anfärben und Waschen wurde in Saponin-Puffer durchgeführt und die Zellen wurden einmal in PBS, 2 % BSA, vor der Analyse gewaschen.
2. Isolierung und Charakterisierung von humanen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklonen
Reinigung und Klonierung von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen. CD4⁺-T-Zellen aus PBMCs wurden wie oben beschrieben erhalten. CD4⁺-T-Zellen wurden mit FITC-gekoppelten Anti-CD4- und PE-gekoppelten Anti-CD25-mAbs (Beckton-Dickinson) angefärbt und CD25⁺- und CD25^–-Zellen wurden durch FACS-Sortierung auf einem FACStar (Beckton-Dickinson) aufgereinigt. CD25⁺CD4⁺- und CD25^–CD4⁺-T-Zellen wurden anschließend mit 1 Zelle/Mulde in 96-Mulden-Rundbodenplatten durch Grenzverdünnung in Gegenwart einer allogenen Feederzell-Mischung, die aus 5 × 10⁵ PBMCs/ml, 5 × 10⁴ JY-Zellen/ml und 0,05 μg/ml PHA bestand, kloniert. Nach 3 Tagen wurde IL-2 (40 E/ml) zugegeben. T-Zellklone wurden in X-Vivo 15 mit 5 % Humanserum kultiviert. Am Tag 14 wurden die Mulden mit Wachstum gepickt und erneut mit einer allogenen Feederzell-Mischung wie oben beschrieben stimuliert. Die Klone wurden erforderlichenfalls aufgeteilt und wie oben alle 14 Tage restimuliert. Das Medium wurde alle 3-5 Tage ersetzt. Klone wurden für Experimente zwischen den Tagen 10 und 14 der vorhergehenden Restimulation (d.h. in der Ruhephase) verwendet.
Proliferation und Suppression von T-Zellen. Zur Analyse der Proliferationskapazität von T-Zellklonen als Reaktion auf eine polyklonale Aktivierung wurden 96-Mulden-Rundbodenplatten (Costar) über Nacht bei 4°C mit Anti-CD3-mAbs (10 μg/ml) in 0,1 M Tris, pH 9,5, beschichtet und dreimal mit PBS gewaschen. T-Zellklone wurden mit einer Ausgangsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml (40.0000 Zellen/Mulde) in einem Endvolumen von 200 μl vollständigem Medium in Abwesenheit oder Anwesenheit von IL-2 (100 E/ml) ausplattiert. Zum Testen hinsichtlich der Kapazität von T-Zellklonen zur Suppression der Proliferation von autologen CD4⁺-T-Zellen wurden frische CD4⁺-T-Zellen durch positive Selektion (Miltenyi Biotech) aufgereinigt und mit Anti-CD3-mAbs, welche auf Kunststoff immobilisiert worden waren (wie oben beschrieben), oder an allogene CD3-abgereicherte PBMCs (mit 6.000 RAD bestrahlt) gebunden worden waren, stimuliert. CD4⁺-T-Zellen (40.000 Zellen/Mulde) wurden alleine oder in Gegenwart eines 1:1-Verhältnisses von T-Zellklonen in einem Endvolumen von 200 μl vollständigem Medium in 96-Mulden-Rundbodenplatten kultiviert.
Nach der angegebenen Zeit wurden die Mulden 16 Stunden lang mit 1 μCi/Mulde ³H-Thymidin (Amersham, Uppsala, Schweden) gepulst. Die Zellen wurden geerntet und in einem Szintillationszähler gezählt.
ELISAs. T-Zell-Klone (1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden mit immobilisierten Anti-CD3-mAbs (10 μg/ml) und Anti-CD28 (1 μg/ml) stimuliert und Überstände wurden nach 24 Stunden für IL-2 und nach 48 Stunden für alle anderen Zytokine gewonnen. Die Niveaus an TGF-β in angesäuerten Überständen wurden mittels Einfang-ELISA wie oben beschrieben bestimmt. Die Nivaus an IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 und IFN-γ wurden entweder mittels Einfang-ELISA (BD Biosciences) wie oben beschrieben oder mit dem „Cytometric Bead Array Kit" (CBA) (BD Biosciences) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Ein direkter Vergleich von Einfang-ELISA und CBA demonstrierte, dass die beiden Methoden bezüglich der im Überstand nachgewiesenen Menge an Zytokin sehr gut vergleichbar waren.
Statistische Analyse. Alle Analysen hinsichtlich statistisch signifikanter Differenzen wurden mit dem gepaarten Student's t-Test durchgeführt. p-Werte von weniger als 0,05 wurden als signifikant betrachtet. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt.
Abkürzungen

CD

Cluster der Differenzierung

IL

Interleukin

TGF

Transformierender Wachstumsfaktor

APC

Antigen-präsentierende Zelle

mAb

monoklonaler Antikörper

FRCS

fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

PHA

Phytohämagglutinin

PBMC

Periphere mononukleäre Blutzellen

MFI

Mittlere Fluoreszenzintensität

EBV

Ebstein-Barr-Virus

REFERENZEN

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Claims

Verwendung von ex vivo isolierten und expandierten humanen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen zur Herstellung von Immunmodulatoren oder Immunsuppressiva.
Verwendung von ex vivo isolierten humanen CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklonen, welche konstitutiv CD25 exprimieren, zur Herstellung von Immunmodulatoren oder Immunsuppressiva.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Verhütung oder Therapie von Transplantat-Wirt-Abstoßung, Organabstoßung, Autoimmunerkrankungen und zur Verhütung negativer Immunreaktionen auf Transgene und Vektor-abgeleitete Proteine nach einer Gentherapie.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen in vitro unter einer oder mehreren der folgenden Bedingungen expandiert werden: Cokultur mit einer Feederzell-Mischung, polyklonale Stimulation, antigenspezifische Stimulation, Zugabe von Zytokinen.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone, die konstitutiv CD25 exprimieren, ex vivo mit den folgenden Schritten isoliert werden: a) Reinigung von CD4⁺-T-Zellen aus PBMCs; b) Abtrennen von CD25⁺- von CD25^–-T-Zellen; c) Klonierung von CD25⁺CD4⁺-T-Zellen durch Grenzverdünnung; d) Stimulation mit Phytohämagglutinin oder Anti-CD3-mAb, in Gegenwart von IL-2; e) Selektion der suppressiven Klone, welche eine konstitutiv hohe Expression von CD25 zeigen.
Immunsuppressivum, enthaltend ex vivo expandierte humane CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellen oder isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone, die konstitutiv CD25 exprimieren.
Immunsuppressivum nach Anspruch 6, ferner enthaltend Zytokine oder zusätzliche Immunsuppressiva.
Immunsuppressivum nach den Ansprüchen 6-7, welches in Form einer stabilisierten Zellpräparation vorliegt.
Verfahren zur Isolierung von immunsuppressiven CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklonen, umfassend die Schritte: a) Reinigung von CD4⁺-T-Zellen aus PBMCs; b) Abtrennen von CD25⁺- von CD25^–-T-Zellen; c) Klonierung von CD25⁺CD4⁺-T-Zellen durch Grenzverdünnung; d) Stimulation mit Phytohämagglutinin oder Anti-CD3-mAb, in Gegenwart von IL-2; e) Selektion der suppressiven Klone, welche eine konstitutiv hohe Expression von CD25 zeigen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Stimulation gemäß Schritt (d) in Gegenwart einer allogenen oder autologen Feederzell-Mischung, bestehend aus bestrahlten PBMCs, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, welches mit bestrahlten autologen oder allogenen EBV-transformierten Zelllinien durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt (d) die suppressiven Klone auf Basis der folgenden charakteristischen Merkmale ausgewählt werden: – 100 % konstante Positivität für CD25-Expression in der Ruhephase mindestens 10 Tage nach Stimulation mit Phytohämagglutinin oder Anti-CD3-mAb in Gegenwart von IL-2; – Expression von CD25 auf einem signifikant höheren Niveau im Vergleich zu T-Zellklonen, die parallel aus CD25^–CD4⁺-T-Zellen isoliert wurden, oder nicht-suppressiven Klonen, die aus CD25⁺CD4⁺-T-Zellen isoliert wurden.
Isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklone, erhältlich mit dem Verfahren der Ansprüche 9–11.
Isolierte CD25⁺CD4⁺-Tr-Klone nach Anspruch 12, welche kein IL-2 produzieren.
Verwendung von CD25⁺CD4⁺-Tr-Zellklonen nach den Ansprüchen 12-13 zur Herstellung von in vitro-Systemen für die Identifizierung von Molekülen, welche die Immunreaktion modulieren.
Verwendung nach Anspruch 15 in Genexpressions-Arrays in großem Maßstab, differentiellen proteonomischen Screenings und zur Herstellung monoklonaler Antikörper.