DE69530980T2 - Population von mit myeloid-und/oder lymphoid-vorläufern angereicherten zellen und verfahren zur ihrer gewinnung und verwendung - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Vermehrung (Anreicherung) von hämatopoetischen Zellpopulationen, die angereichert sind an Myeloid- und/oder Lymphoid-Vorläufer (Progenitor)-Zellen auf der Basis von Zell-spezifischen Markern. Die Verfahren führen auch zu Zellpopulationen, die angereichert sind an Vorläufern (Progenitoren), die ein Lymphoid-Differenzierungsvermögen aufweisen. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die an diesen Zellen angereichert sind, sowie die Zellpopulationen, die dabei erhalten werden. Verfahren zur Verwendung der Zellen liegen ebenfalls innerhalb des Rahmens der Erfindung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die hämatopoetischen (Blut)-Zellen von Säugetieren weisen einen vielfältigen Bereich von physiologischen Aktivitäten auf. Hämatopoetische Zellen werden unterteilt in Lymphoid-, Myeloid- und Erythroid-Zelllinien. Die Lymphoid-Zelllinie, die umfasst B-, T- und natürliche Killer (NK)-Zellen, sorgt für die Bildung von Antikörpern, für die Regulierung des zellulären Immunsystems, für den Nachweis von fremden Agentien im Blut, für den Nachweis von wirtsfremden Zellen und dgl. Myeloid-Zelllinien, die Monozyten, Granulozyten, Megakaryozyten sowie andere Zellen umfasst, überwacht die Anwesenheit von Fremdkörpern, bietet einen Schutz gegen neoplastische Zellen, entfernt Fremdmaterialien, bildet Blutplättchen und dgl. Die Erythroid-Zelllinie ergibt die roten Blutkörperchen (Blutzellen), die als Sauerstoffträger fungieren.
  • Trotz der Vielfältigkeit der Natur, der Morphologie, der Eigenschaften und der Funktion der hämatopoetischen Zellen wird derzeit angenommen, dass diese Zellen von einer einzigen Zellpopulation stammen, den so genannten hämatopoetischen "Stammzellen". Anders als "reife" Blutzellen sind Stammzellen in der Lage, sich selbst zu regenerieren, sie können sich aber auch unterteilten in Vorläufer (Progenitor)-Zellen, die nicht mehr pluripotent sind und ein begrenztes Selbstregenerationsvermögen aufweisen. Diese Vorläufer (Progenitor)-Zellen teilen sich wiederholt unter Bildung von reiferen Zellen, die gegebenenfalls endgültig differenziert werden zur Bildung der verschiedenen reifen hämatopoetischen Zellen. Die große Anzahl von reifen hämatopoetischen Zellen leitet sich somit ab von einem kleinen Reservoir von Stammzellen durch einen Proliferations- und Differenzierungsprozess.
  • Vorläufer (Progenitor)-Zellen reifen zu bipotentiellen Zellen und werden dann auf eine Zelllinie festgelegt, d. h. sind nicht mehr in der Lage, zu mehr als einer Zelllinie auszureifen. Die Verwendung der Wörter Vorläufer (Progenitor) oder Vorläufer (Progenitor)-Zellen weist auf Zellpopulationen hin, die nicht mehr Stammzellen sind, die jedoch noch nicht endgültig differenziert sind. Die Verwendung des Wortes Lymphoid, Myeloid oder Erythroid in Verbindung mit dem Wort Vorläufer (Progenitor) weist auf die potentiellen Zellpopulationen hin, zu dem der Vorläufer (Progenitor) ausreifen kann.
  • Hochgereinigte Populationen von Stammzellen werden derzeit für die Repopulation des gesamten hämatopoetischen Systems verwendet. Gereinigte Vorläufer-Zellen der einzelnen Zelllinien können Verwendung finden bei der Repopulation oder Vermehrung der verschiedenen Zelllinien. Da Vorläufer, wie angenommen wird, nicht in großem Umfang selbstregenerierend sind, ist die Repopulation oder Vermehrung beschränkt.
  • Stammzellen und Vorläufer-Zellen stellen nur einen geringen Prozentsatz der Gesamtanzahl der hämatopoetischen Zellen dar. Hämatopoetischen Zellen sind identifizierbar durch die Anwesenheit einer Vielzahl von Zelloberflächen-Protein-"Markern". Diese Marker können entweder spezifisch für eine spezielle Zelllinie sein oder sie können auf mehr als einem Zelltyp vorhanden sein. Die Marker ändern sich auch mit den Stufen der Differenzierung. Derzeit ist nicht bekannt, wie viele der Marker, die mit differenzierten Zellen assoziiert sind, auch auf Stamm- und Vorläufer-Zellen vorhanden sind. Ein Marker, CD34, ist auf Stammzellen und auf einer großen Anzahl von Vorläufern Progenitoren zu finden. In dem US Patent Nr. 5 061 620 ist eine Zusammensetzung beschrieben, die Human-Stammzellen umfasst.
  • In der Tabelle 1 sind die wahrscheinlichen Phänotypen der Stammzellen in fetalem, adultem und mobilisiertem Peripher-Blut zusammengefasst. Die hier verwendeten Ausdrücke infra, supra und das Minuszeichen oder das hochgestellte Minuszeichen in der Tabelle 1 bedeuten, dass der Gehalt des angegebenen Markers durch die zytometrische Immunstrom-Analyse nicht nachweisbar ist oberhalb der Ig-Isotypen-Kontrollen und Zellen mit einer sehr niedrigen Expression des angegebenen Markers umfassen kann, die unterhalb des Empfindlichkeits-Schwellenwertes des Verfahrens liegen.
  • Figure 00030001
  • Die genaue Anzahl der Differenzierungsstufen, die auftritt von den Stammzellen zu der Zelllinien-Festlegung und zu der endgültigen Differenzierung ist unbekannt; auch sind die verschiedenen Subpopulationen der daran beteiligten Zellen bisher nicht gut charakterisiert.
  • Lymphozyten sind hoch spezialisierte hämatopoetische Zellen. Während der Entwicklung der B- und T-Lymphoid-Zelllinien führt die phänotypische und molekulare Differenzierung von primitiven Zellen zu reifen Stufen, in denen eine Umlagerung der Lymphozyten-Antigen-Rezeptoren auftritt, nämlich der Immunoglobulin (Ig)- oder T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Ketten (Van Noesel und Lier (1993) "Blood" 82: 363–373; und Godfrey und Zlotnik (1993) "Immunol. Today" 14: 547–553). Die Festlegung auf die B-Zellen-Linie, die Expression des B-Zellen-Rezeptor-Komplexes und die Ig-Gen-Umlagerungen laufen ab im Knochenmark oder in der fetalen Leber (Uckun (1990) "Blood" 76: 1908–1923 und Li et al. (1993) "J. Exp. Med." 178: 951–960).
  • Beim Menschen haben umfangreiche Analysen von Leukämien, fetaler Leber und Knochenmark gezeigt, dass die am frühesten erkennbare Population von Zellen, die auf die B-Zelllinie festgelegt werden, die Marker CD34, HLA-DR und CD10 exprimieren und eine intranukleare terminale Deoxynucleotidyltransferase-Aktivität in Verbindung mit Ig-Genen in der Keimlinien-Konfiguration aufweisen (Uckun (1990)). Der Marker CD19 wird anschließend exprimiert und bleibt während der meisten späteren Stufen der B-Zellen-Differenzierung exprimiert, wobei diese Stufen durch die Expression einer Anordnung (Reihe) von Markern einschließlich des Oberflächen Ig weiter identifiziert werden. Der Marker CD2 ist vorübergehend zu finden auf den frühen B-Zellen-Vorläufern zum Zeitpunkt der CD19-Expression, sodass der früheste B-Zellen-Vorläufer durch die Expression von CD34 und CD10 identifiziert werden kann, jedoch in Abwesenheit von CD19 und CD2 (Uckun (1990)). CD10 oder CALLA ist eine neutrale Endopeptidase, die von mehreren hämatopoetischen und nicht hämatopoetischen Zellen exprimiert wird (LeBien und McCormack (1989) "Blood" 73: 625).
  • Anderes als bei der B-Zellen-Differenzierung ist es bei der T-Zellen-Entwicklung erforderlich, dass die T-Vorläufer-Zellen die Thymusdrüse passieren, um eine wirksame T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Umlagerung und eine größere Histokompatibilitäts-Komplex (MHC)-Restriktion zu erzielen. In der Thymus-Stufe werden die unreifen T-Zellen als Thymozyten bezeichnet. Die Intrathymus-Stufen der T-Zellen-Entwicklung wurden bei Mäusen gründlich studiert und in einem geringeren Umfang auch beim Menschen (Godfrey und Zlotnik (1993); Galy et al. (1993) "J. Exp. Med." 178: 391–401; Terstappen et al. (1992) "Blood" 79: 666–677; und Sanchez et al. (1993) "J. Exp. Med." 178: 1857–1866). Durch die Anwendung von T-Zellen-Differenzierungs-Assays und die Multiparameter-Durchfluß-Zytometrie wurde gezeigt, dass CD34 auf den meisten unreifen Thymozyten exprimiert wird bei einer fehlenden Zell-Oberflächen-Expression von CD1-, CD4-, CD8- und CD3-Antigenen (Galy et al. (1993); und Terstappen et al. (1992)). Die CD34-Gehalte nehmen mit zunehmender T-Zellen-Reifung ab wie im Falle der Reifung zu Myeloid-, Erythroid- und B-Zellen-Linien (Terstappen et al. (1991) "Blood" 77: 1218–1227). Bei Tierversuchen unter Verwendung von Mäusen oder Wachtel/Küken-Chimären und bei Versuchen am Menschen mit Fetalleber-Konstrukten und einer in eine Leihmaus implantierten Thymusdrüse wurde ein schwerer kombinierter Immundefizit (SCID)-Zustand bei Mäusen festgestellt und gezeigt, dass eine konstante Zufuhr von hämatopoetischen Zellen erforderlich ist, um die Thymopoese aufrechtzuerhalten (Le Douarin und Jotereau (1973) "Nature New Biol." 246: 25–27; Scollay et al. (1986) "Immunol. Rev." 91: 129–157, und McCune et al. (1988) "Science" 241: 1632-1639).
  • Die Art des Pro-Thymozyten-Vorläufers ist jedoch schlecht definiert. Beim Menschen wurden Prä-Thymus-Zellen mit einem T-Zellen-Differenzierungsvermögen aus verschiedenen hämatopoetischen Geweben gewonnen. Nach der Injektion von CD34+ Zellen, die frei von Zelllinien-spezifischen Antigenen (Lin-) sind, die aus fetaler Leber (FL) isoliert wurden, wurde eine Intrathymus-T-Zellen-Neubildung (Rekonstitution) erzielt (Galy et al. (1993); und Péault et al. (1991) "J. Exp. Med." 174: 1283–1286). Eine weitere Fraktionierung der CD34+Lin- FL-Zellen hat gezeigt, dass sowohl in den CD7- als auch in den CD7dull-Untergruppen ein T-Lymphoidpotential vorhanden ist (Bárcena et al. (1993) "Blood" 82: 3401–3414). Die T-Zellen-Differenzierung kann initiiert werden mit CD34+Lin- Fetal-Knochenmarks (FBM)-Zellen und sie ist zu finden sowohl in den CD34+Thy-1+- als auch in den CD34+Thy-1--Abteilen (Baum et al. (1992) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 89: 2802–2804).
  • Die Differenzierung zu Thymozyten kann auch mit adulten Geweben erzielt werden. Vor kurzem wurde gezeigt, dass CD34+Lin- Zellen, die aus normalem adultem Knochenmark (ABM) oder aus apherisiertem Cytokinmobilisiertem Peripherblut (MPB) von Krebs-Patienten isoliert wurden, einer neuen Thymopoese und einer sich daran anschließenden fortschreitenden vollständigen Ausreifung zu TCRαβ+ und TCRγδ+ T-Zellen unterliegen (Galy et al. (1994) "Blood" 84: 104–110).
  • Vor kurzem wurde darüber berichtet, dass nach einer Uterus-Injektion in Schaf-Fetusse CD34+HLA-DR- Zellen, die aus Human-ABM isoliert wurden, eine Langzeit (7 Monate)-Multi-Zelllinien-Hämatopoese ergeben einschließlich der Bildung von reifen T-Zellen und B-Zellen (Srour et al. (1993) "Blood" 82: 3333–3342). Diese Berichte vermitteln einen vorläufigen Überblick über die Präthymus-T-Vorläufer Zellenaktivität, die phänotypische Zusammensetzung des T-Vorläufer-Zellen-Pools sowie die hierarchische Anordnung seiner Komponenten bleiben jedoch weitgehend unerforscht.
  • Im Gegensatz dazu wurde eine ausführliche phänotypische Fraktionierung von ABM CD34+ Zellen durchgeführt, um die Myelopoese und die Erythropoese zu untersuchen (Terstappen et al. (1991); Baum et al. (1992); Lansdorp und Dragowska (1992) "J. Exp. Med." 175: 1501–1509; Srour et al. (1991) "Blood Cells" 17: 287–295; Craig et al. (1993) "J. Exp. Med." 177: 1331–1342 und Udomsakdi et al. (1991) "Exp. Hematol." 19: 338–342). Insbesondere CD45-Isoformen haben sich als nützliche Marker erwiesen zur Unterscheidung von primitiven Zellen von festgelegten Myeloid-Zellen (Lansdorp et al. (1990) "J. Exp. Med." 172: 363–366 und US-A-5 061 620). CD45 Antigene sind Protein-Tyrosin-Phosphatasen, die in verschiedenen Isoformen vorliegen, die durch alternatives Spleissen erzeugt werden (Thomas (1989) "Ann. Rev. Immunol." 7: 339–369). Die hochmolekularen Isoformen (p205–p220) werden als CD45RA bezeichnet und werden auf der Zelloberfläche von primitiven ABM-Vorläuferzellen (Progenitoren), die eine Langzeit-Kulturinitiierungs-Zellaktivität (LTCIC) aufweisen, nicht exprimiert (Lansdorp und Dragowska (1992)). Im Gegensatz dazu wird CD45RA auf weniger primitiven Knochenmarks-Vorläuferzellen sowie auf Untergruppen von reifen T-Zellen gefunden, auf denen es, wie angenommen wird, in Korrelation steht zu spezifischen funktionellen Eigenschaften (naive T-Zellen) (Sanders et al. (1988) "Immunol. Today" 9: 195–199).
  • CD45RA wird auch exprimiert auf einer Fraktion von Thymozyten, insbesondere auf Zellen in einem sehr frühen Stadium der Intrathymus-Entwicklung (Deans et al. (1991) "J. Immunol." 147: 4060–4068). Bei Anwendung der Multiparameter-Durchfluss-Cytometrie wurde bisher angenommen, dass die direkten aus dem Knochenmark stammenden Präthymus-Vorläuferzellen CD45RA exprimiereren könnten, ein funktioneller Nachweis wurde bisher jedoch nicht gefunden (Terstappen et al. (1992)).
  • Der definitive T Zellen-Marker ist der T Zellen-Antigen-Rezeptor (TCR). Es gibt derzeit zwei definierte TCR-Typen: TCR-2 ist ein Heterodimer von 2 über ein Disulfid miteinander verknüpften Transmembranpolypeptiden (α- und β-Polypeptide), TCR-1 ist strukturell ähnlich, besteht jedoch aus γ- und δ-Polypeptiden. Die δ- und β- oder γ- und δ-Polypeptide bilden ein Heterodimer, das eine Antigen-Erkennungsstelle enthält. Diese Heterodimeren erkennen ein Antigen in Kombination mit MHC-Molekülen auf der Oberfläche von ein Antigen aufweisenden Zellen. Alle diese Proteine enthalten eine variable Region, die zu der Antigen-Erkennungsstelle beiträgt, sowie eine konstante Region, die den Großteil des Moleküls bildet und die Transmembran-Region und den Cytoplasma-Schwanz umfasst. Beide Rezeptoren sind mit einem Komplex von Polypeptiden assoziiert, die den CD3-Komplex bildet. Der CD3-Komplex umfasst die γ-, ζ- und ε-Transmembranpolypeptide. Der CD3-Komplex vermittelt die Signal-Transduktion, wenn T-Zellen durch eine Antigen-Bindung an den TCR aktiviert werden.
  • Etwa 95% der Blut-T-Zellen exprimieren TCR-2 und bis zu 5% weisen TCR-1 auf. Die TCR-2 tragenden Zellen können weiter unterteilt werden in zwei verschiedene, sich nicht überlappende Populationen: CD4+ T-Zellen, die im Allgemeinen Antigene in Assoziation mit MHC Klasse II-Molekülen erkennen, und CD8+ T-Zellen, die Antigene in Association mit MHC Klasse I-Molekülen erkennen. B-Zellen tragen eine Reihe von Markern, nicht jedoch ruhende T-Zellen. Die Mehrzahl der B-Zellen trägt MHC Klasse II-Antigene, die wichtig sind in Kooperation mit T-Zellen. Fc-Rezeptoren für IgG (FcRII, CDw32) sind ebenfalls vorhanden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Vermehrung (Anreicherung) von hämatopoetischen Zellpopulationen, die angereichert sind an Myeloid- und/oder Lymphoid- und dendritischen Vorläufer (Progenitor)-Zellen. Die Verfahren ergeben auch Zellpopulationen, die angereichert sind an Vorläufer (Progenitor)-Zellen, die eine Myeloid-, Lymphoid- und dendritische Zell (DC) oder ein Lymphoid- und DC-Differenzierungspotential aufweisen. Gegenstand der Erfindung sind außerdem Zusammensetzungen, die angereichert sind an den Zellen, und Populationen von Zellen, die dabei erhalten werden. Gegenstände der Erfindung sind ferner Verfahren und Zusammensetzungen für genetisch modifizierte Zellen sowie auch Zusammensetzungen von genetisch modifizierten Zellen und Verfahren zur Verwendung der Zellen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Schematisches Diagramm der Lymphoid-Reifung, wie sie durch die hier beschriebenen Versuche definiert ist. Zelllinien-spezifische Macker sind CD2, CD4, CD8, CD56, CD16, CD19, CD20 und Glycophorin A.
  • 2: Phänotypische Analysen von CD34+ ABM Zellen. Die Expression von CD45RA auf ABM Zellen ist auf der X-Achse aller Diagramm dargestellt. Auf den Y-Achsen befindet sich CD34 in dem Schaubild A auf den unterteilten Lin– Zellen, die Schaubilder B bis D zeigen jeweils die Expression von Thy-1, CD38 und HLA-DR auf CD34+Lin– Zellen (Zelllinie– = Lin–). Die Zelllinien-Marker waren mindestens CD2, 14, 16, 19, 15 und Glycophorin A und meisten umfassten sie auch CD4, CD8, CD56 und CD20. Die Schaubilder E-H zeigen eine erneute Anfärbung der sortierten CD34+Lin–CD45RA– Zellen (Schaubilder A und G) und der CD34+Lin–CD45RA+ Zellen (Schaubilder F und H) für CD33 (Schaubilder E und F) und c-kit-Zellen (Schaubilder G und H).
  • 3: Phänotypische Zusammensetzung von SCID-hu Knochen, die mit CD34+Lin–CD45RA– Zellen versetzt (rekonstituiert) sind. Das Schaubild A zeigt die HLA-Donor-Zellen, die mit CD19 gefärbt sind. Das Schaubild B zeigt HLA-Donor-Zellen, die mit CD33 gefärbt sind. Das Schaubild C zeigt HLA-Donor-Zellen, die mit CD34 gefärbt sind. Die Knochen wurden 8 Wochen nach der Injektion von 30 000 CD34+Lin–CD45RA– Zellen gewonnen. Die Zellen waren mit einem Antikörper gefärbt, der spezifisch ist für eine HLA-Dterminante des CD34+Lin–CD45RA– Donors in Kombination mit CD19, CD33 und CD34.
  • 4: Expression von CD34 und CD10 auf Lin– (Lin = CD2, CD4, CD8, CD56, CD16, CD19, CD20 und Glycophorin A) ABM Zellen. Die Zellen in dem oberen rechten Quadranten, der durch die gestrichtelten Linien abgegrenzt ist, waren 2% CD34+Lin– Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz der CD10+ Zellen in den CD34+Lin– ABM Zellen betrug 5,9±3,7% (n = 13 ABM-geprüft).
  • 5: Phänotypische Analyse einer AC6·21-Kultur. Es wurden Kulturen mit 100 Zellen pro Plattenvertiefung aus den CD34+Lin–CD10+ oder CD34+Lin–CD45RA– Populationen in Gegenwart von IL-3, IL-6 und LIF geimpft und nach 3 Wochen geerntet. Die Zellen wurden immungefärbt durch CL33 und CD19 oder durch CD34 und CD10. Die Schaubilder A und B zeigen die Expression von CD33/CD19 (A) und CD34/CD10 (B) auf CD10+ Zellen. Die Schaubilder C und D zeigen die Expression von CD33/CD19 (C) und D34/CD10 (D) auf RA+CD10– Zellen. Die Schaubilder E und F zeigen die Expression von CD33/CD19 (E) und CD34/CD10 (F) auf RA–CD10– Zellen.
  • 6: T-Zellen-Rekonstitution in einem SCID-hu-Thymus-Assay. Jeder Punkt repräsentiert ein Thymus-Transplantat, das 7 Wochen nach der Injektion variierender Anzahlen von CD34+Lin–CD45RA+ (leere Kreise) oder CD34+Lin–CD45RA– (ausgefüllte Rhomben)-Zellen analysiert wurde.
  • 7: Phänotypische Analyse eines SCID-hu Thymus-Transplantats, das mit CD34+Lin–CD10+ Zellen versetzt worden ist. Dieses repräsentative Transplantat wurde 6 Wochen nach der Injektion von 9 000 CD34+Lin– CD10+ Zellen analysiert. Das Schaubild A zeigt die Expression des HLA-Markers, der für Wirtszellen spezifisch ist, in Kombination mit einem pan-HLA-Marker (W6/32). Es sei darauf hingewiesen, dass die aus dem Wirt stammenden T-Zellen viele MHC Klasse I-Antigene exprimieren. Die Schaubilder B und C zeigen die Expression der HLA des Wirts bzw. von CD1a und CD3. Es sei darauf hingewiesen, dass die von einem Donor stammenden Thymozyten hohe Gehalte an CD1 und abgestufte Gehalte an CD3 exprimieren. Das Schaubild D zeigt die Expression von CD4 und CD8 auf Donor-Zellen.
  • 8: Qualitative Bewertung der Thymozyten-Rekonstitution in dem SCID-hu-Thymus-Assay in Abhängigkeit von der Zeit. 4, 8 und 11 Wochen nach der Injektion von 2 000 CD34+Lin–CD10+ Zellen (schraffierte Blöcke) und von 10 000 CD34+Lin–CD10– Zellen (leere Blöcke) wurden die Thymozyten durch eine Drei-Farben-Immunoanfärbung analysiert im Hinblick auf die Gegenwart von Donor-Zellen und auf die Expression von CD1a und CD3. Die Ergebnisse sind in % Donor-Zellen angegeben, die CD1a (Schaubild A) oder CD3 (Schaubild B) exprimieren ±SD (n = 4 für Transplantate zu jedem Zeitpunkt für jede Gruppe).
  • 9: Eine representative phänotypische Analyse von AC6.21 Kulturen, die durch CD34+Lin–CD45RA+ oder CD34+Lin–CD45RA– Zellen in Gegenwart von IL-2 initiiert wurden. Das Schaubild A zeigt die Progenie von RA+10+ Zellen, die im Hinblick CD56 und CD16 angefärbt sind. Das Schaubild B zeigt die Progenie von RA–10– Zellen, die für CD56 und CD16 gefärbt sind. Das Schaubild C zeigt die Progenie von RA+ Zellen, die für CD3 und CD56 gefärbt sind. Das Schaubild D zeigt die Progenie von RA– Zellen, die für CD56 und CD33 gefärbt sind. Nach 3 Wochen war es möglich, CD56+CD3–CD16– NK Zellen in den Kulturen von CD45RA+ zu identifizieren. Im Gegensatz dazu enthielten die mit CD45RA– Zellen initiierten Kulturen wenige CD56+ Zellen, bestanden jedoch meistens aus CD33+ Myeloid-Zellen.
  • 10: Die phänotypische Analyse einer AC6.21 Kultur, die mit CD34+Lin–CD10+ Zellen in Gegenwart von IL-2 in der Woche 4 initiiert worden ist. Das Schaubild A zeigt, ß die Mehrzahl der Zellen (in diesem Fall >90%) zu CD56+CD3– NK Zellen geworden sind. Das Schaubild B zeigt, dass die Kultur-Bedingungen die Differenzierung zu CD14+ Monozyten oder CD19+ B Zellen nicht unterstützen.
  • 11: Das Schaubild A zeigt eine repräsentative immunologische Analyse von NK Zellen, die stammen aus ABM CD34+Lin–CD10+ Zellkulturen auf AC6.21 Stroma + IL-2. Diese NK Zellen exprimieren an der Zelloberfläche CD56, nicht jedoch CD3. Das Schaubild B zeigt die Ergebnisse von zwei voneinander unabhängigen 51Cr-Freisetzungs-Assays unter Verwendung von K562 Target-Zellen, welche die mittlere dosisabhängige Zytotoxizität (±SD) von NK Zellen zeigt, die aus CD34+Lin–CD10+ ABM Zellkulturen stammen. Als Kontrollen wurden fetale Thymozyten verwendet, die in Gegenwart von IL-2 und Phytohämagglutinin kultiviert wurden. In dem Schaubild B repräsentieren die ausgefüllten Quadrate die ABM CD34+Lin–CD10+ Kulturen und die leeren Kreise repräsentieren die fetale Lymphozytenkultur. Das Schaubild C zeigt die Ergebnisse einer Grenzverdünnungs-Analyse von ABM CD10+ und CD10– Untergruppen auf AC6.21 Zellen + IL-2 für 7 Wochen. Die Plattenvertiefungen wurden immunogefärbt und bewertet im Hinblick auf die Anwesenheit von nachweisbaren (≥1% oberhalb des Hintergrundwertes) CD56+CD3– NK Zellen. In dem Schaubild C repräsentieren die leeren Kreise CD34+Lin–CD10– Kulturen und die ausgefüllten Quadrate repräsentieren CD34+Lin–CD10– Kulturen.
  • 12: Ein repräsentatives Beispiel für Durchfluss-Zytometrie- und Immunfärbungs-Analysen von Kulturen, die mit CD34+Lin–CD10+ ABM Zellen (Schaubilder A, B, C, D) und mit CD34+Lin–CD10– ABM Zellen (Schaubilder E, F, G, H) initiiert worden sind. Es wurde eine Zwei-Farben-Anfärbung durchgeführt, um die Expression von CD1a, HLA-DR, CD14 und CD15 auf lebenen Zellen zu identifizieren unter Ausschluss von Propidiumiodid.
  • 13: Mikrofotografie (Objektiv × 100 Öl) von kultivierten Zellen (Tag 12), die auf Objekträgern durch Cytospin abgeschieden und mit Wright-Giemsa angefärbt worden waren.
    A: Kultur, initiiert mit CD34+Lin–CD10+ ABM Zellen, welche die Anwesenheit von DC mit unterschiedlichen Morphologien zeigt;
    B: Kultur (Tag 12), die mit CD34+Lin–CD10– Zellen aus der gleichen ABM-Probe initiiert worden ist, welche die Anwesenheit einer großen Vielzahl von hämatopoetischen Zelllinien zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es wäre hilfreich, über ein System zur Untersuchung des Entwicklungsweges der Lymphoid-Zelllinien zu verfügen. Eine Voraussetzung wäre die Identifizierung einer auf Lymphoid-Zellen beschränkten Vorläuferzelle, die zur Bildung von B, T und NK Zellen führen könnte. Eine der praktischsten Anwendungen ist das Verständnis und die Therapie von Immunsuppressions-Erkrankungen, wie z. B. AIDS oder von anderen Erkrankungen des Lymphoidsystems, wie z. B. Leukämien und Lymphome. Da es keine bekannten Wachstumsfaktoren oder Transkriptionsfaktoren gibt, die an der Entwicklung, der Differenzierung und dem Wachstum von Lymphoid-Vorläuferzellen beteiligt sind, erlaubt ein solches System die Isolierung und Charakterisierung dieser Faktoren. Da außerdem das Verständnis der Lymphoidgen-Regulierung, insbesondere im Transkriptions-Bereich, begrenzt ist, erlaubt ein solches System die Analyse und Charakterisierung dieser Gen-Regulierung. Die Identifizierung dieser frühen Vorläufer-Populationen und ihres gesamten Myeloid- und Lymphoidpotentials ist extrem wichtig für die Erforschung neuer Zytokine, neuer Zytokin-Rezeptoren oder neuer Transkriptions-Faktoren. Die hier beschriebene Erfindung stellt einen Mechanismus vor, der diese Probleme löst.
  • Um die Stufen zur Festlegung von pluripotenten Stammzellen in Richtung auf Lymphoidzellen abzugrenzen, wurde das Thymusrekonstitutions-Potential in Beziehung gesetzt zu den Myeloid-, Erythroid- und B-Lymphoid- und NK-Vorläuferzellaktivitäten. Zuerst wurde CD45RA zur Fraktionierung von adulten (ausgewachsenen) CD34+Lin– Knochenmarks (ABM)-Zellen verwendet und die Analyse der Lymphoid-Festlegung wurde verfeiniert durch Überprüfung der T-Vorläuferzellen-Aktivität der frühesten identifizierbaren B-Zellen-Vorläuferpopulation. Dann wurde CD10 verwendet zur weiteren Reinigung der CD45RA+ Population und die resultierenden Zellpopulationen wurden im Hinblick auf ihren Lymphoid-Vorläufer (-Progenitor) und die DC-Aktivität bewertet.
  • Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es eine Lymphoid-, Myeloid-, natürliche Killer- und DC-Vorläufer-Aktivität bei primitiven und festgelegten Knochenmarks-Untergruppen gibt und dass es eine kleine Untergruppe gibt, die stark eingeschränkt ist auf die Lymphoid-Entwicklung. Die Lymphoid-Zelllinien und, ganz wichtig, die DC-Zelllinie können somit von den primitiveren multipotenten Stammzellen und von den Erythroid- und Myeloid-Vorläuferzellen segregiert werden.
  • Obgleich die Bedingungen, welche die Differenzierung von humanen CD34+ Zellen zu DC induzierten, identifiziert worden sind (Caux et al. (1994) "J. Exp. Med." 180: 1263), ist der Weg der Entwicklung und der Zelllinienaufteilung von DC bisher unbekannt geblieben. Tatsächlich sind DC Zellen seit langem anerkannt als Zell-Typ, der sich hinsichtlich seiner Funktion von Monozyten/Makrophagen unterscheidet. Diese Schlussfolgerung basierte auf der Morphology, der Phänotypie, der Phagozyten-Aktivität, der Fähigkeit, ein Antigen aufzuweisen, auf der Zytokin-Bildung und den Zellumsatzraten von DC und Monozyten/Makrophagen (Steinman (1991) "Ann. Rev. Immunol." 9: 271; Macatonia et al. (1993) "Int. Immunol." 5: 1119, und Kampinga (1990) "J. Immunol." 145: 1659). Es gibt einen indireten Nachweis, der DC-Zellen mit Lymphoid-Zellen verbindet, der basiert auf der Isolierung eines gemeinsamen Intrathymus-Vorläuferzellen-Pools bei der Maus und auf der Expression von mehreren Zelloberflächen-Antigenen, die DC- und T-Zellen gemeinsam haben (Ardavin et al. (1993), "Nature" 362: 761, und Winkel et al. (1994) "Immunol. Lett." 40: 93). Die hier angegebenen Daten stellen den ersten direkten Nachweis dar, dass die DC-Zelllinie aus Vorläuferzellen stammt, die von hämatopoetischen Vorläuferzellen verschieden ist, die Erythrozyten, Monozyten und Granulozyten ergeben. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass DC-Zellen entwickelbar sind, die näher verwandt sind mit Lymphoid-Zellen als mit Myeloid-Zellen.
  • Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen, die angereichert sind an Vorläufer (Progenitor)-Zellen, die zu Myeloid-Zellen, DC- und allen Klassen von Lymphoid-Zellen differenziert werden können, und an Vorläufer (Progenitor-Zellen), die zu DC- und allen Klassen von Lymphoid-Zellen differenziert werden können. Diese Vorläufer (Progenitor)-Zellpopulationen sind durch die folgenden Phänotypen charakterisiert: CD45RA+CD34+Lin– (nachstehend als RA+ bezeichnet) und CD45RA+CD10+Lin–CD34+ (nachstehend als "10+" bezeichnet). Die 10+ Zellen werden auch als "zentrale Lymphoid-Vorläuferzellen" bezeichnet. Andere Zellpopulationen mit den hier verwendeten Abkürzungen sind CD45RA–CD10–Lin–CD34+ (nachstehend als "RA–10–" bezeichnet); CD45RA+CD10–Lin–CD34+ (nachstehend als "RA+10–" bezeichnet) und CD45RA+CD34–Lin– (nachstehend als "RA–" bezeichnet). RA+ Zellen weisen eine Myeloid-, DC- und Lymphoid-Aktivität auf und können durch CD10 in RA+10+ und RA+10– aufgeteilt werden. Die RA+10+ Population ist eine kleine Untergruppe mit einem Differenzierungspotential, das auf alle Klassen von Lymphoid-Zellen und DC-Zellen beschränkt ist.
  • Die Erfindung umfasst somit Zusammensetzungen, die beträchtlich angereichert sind an verschiedenen Vorläuferzellen. Bei einer Ausführungsform sind die angereicherten Zellen RA+-, Myeloid-, DC- und Lymphoid-Vorläuferzellen. Bei einer anderen Ausführungsform sind die angereicherten Zellen 10+-, Lymphoid- und DC-Vorläuferzellen. Bei einer weiteren Ausführungsform sind die angereicherten Zellen RA+10– Myeloid- und Lymphoid-Vorläufer-Zellen. Die RA+10– Zellen können in Situationen nützlich sein, in denen beispielsweise 10+ Leukämiezellen vorliegen und anderweitig die RA+ Population kontaminieren würden. Hier werden Zusammensetzungen beschrieben, die mehr als 80%, in der Regel mehr als etwa 95% RA+ oder 10+ Zellen aufweisen. Die beträchtlich angereicherten Zellen sind somit zu etwa 80% angereichert mit solchen Zellen, welche den (die) angegebenen Marker exprimieren. Vorzugsweise sind die Zellen zu etwa 80% angereichert mit dem (den) angegebenen Marker(n). Ganz besonders bevorzugt sind die Zellen zu etwa 80 bis 90% angereichert mit dem (den) angegebenen Marker(n). Am meisten bevorzugt sind die Zellen zu 90% angereichert mit dem (den) angegebenen Marker(n).
  • Die hier beschriebenen Vorläufer (Progenitor)-Zellen können sich zu Lymphoid/Myeloid/DC-Zellinien und zu Lymphoid/DC-Zellinien differenzieren. Keine Population ist in der Lage, sich zu der Erythroid-Zelllinien zu differenzieren. Die 1 zeit ein Schema der Zelltypen und ihres Zelllinien-Potentials. Lin– Zellen beziehen sich allgemein auf Zellen, die keine Marker enthalten, die mit T-Zellen assoziiert sind (wie z. B. CD2, CD3, CD4 und CD8), mit B-Zellen assoziiert sind (z. B. CD19 und 20), mit Myeloid-Zellen assoziiert sind (z. B. CD14, 15 und 16), mit NK-Zellen assoziiert sind (z. B. CD56 und CD16) und mit Erythrozyten assoziiert sind (wie z. B. Glycophorin A). Vorzugsweise umfasst die Zelllinien-Schautafel mindestens CD19. Zu geeigneten Zelllinien-Markern für die Verwendung zusätzlich zu CD19 gehören CD2, CD4 und CD15. Andere Zelllinien-Marker können verwendet werden, um die Entfernung von differenzierteren Zellen zu gewährleisten, ihre Verwendung führt jedoch nicht zu einer noch höheren Anreicherung an der erhaltenen Vorläuferzellen-Population.
  • Ausführungsformen der Erfindung betreffen somit Verfahren zur Reinigung oder Anreicherung mit diesen Vorläuferzellen und die dabei erhaltenen Zusammensetzungen. Die Herkunft der Zellen kann irgendeine allgemein bekannte Herkunft sein, wie z. B. das Knochenmark, der Fetus, ein Neugeborenes oder ein Erwachsener oder ein anderes hämatopoetisches Zellenausgangsmaterial, wie z. B. eine fetale Leber, peripheres Blut oder Blut aus der Nabelschnur.
  • Die Selektion dieser Vorläuferzellen braucht nicht mit einem für die Zellen spezifischen Marker durchgeführt zu werden. Durch Anwendung einer Kombination von einer negativen Selektion (Entfernung anderer festgelegter Zellen) und einer positiven Selektion (Isolierung von Zellen) kann eine angereicherte Zellpopulation erhalten werden.
  • Es können verschiedene Methoden angewendet werden, um die Zellen abzutrennen durch Entfernung der festgelegten Zelllinie von Anfang an. Monoklonale Antikörper sind besonders geeignet zur Identifizierung von Markern, die mit speziellen Zelllinien und/oder Differenzierungsstufen assoziiert sind. Gewünschtenfalls kann ein großer Anteil von terminal differenzierten Zellen entfernt werden, indem man von Anfang an eine "verhältnismäßig grobe" Trennung anwendet. Beispielsweise können am Anfang Magnetperlen-Trennungen angewendet werden, um eine große Anzahl von Zellen mit festgelegtem Stammbaum zu entfernen. Zweckmäßig werden mindestens etwa 80%, in der Regel mindestens 70% der Gesamtmenge der hämatopoetischen Zellen entfernt.
  • Die Trennverfahren können umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die magnetische Trennung unter Verwendung von mit einem Antikörper beschichteten Magnetperlen, die Affinitätschromatographie, cytotoxische Agentien, die mit einem monoclonalen Antikörper verbunden sind oder in Konjunktion mit einem monoklonalen Antikörper verwendet werden, die umfassen, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Komplemente und Cytotoxine, und "das Panning", bei dem ein Antikörper an eine feste Matrix, beispielsweise eine Platte gebunden ist, das Elutrieren und irgendein anderes geeignetes Verfahren.
  • Verfahren, die eine genaue Trennung ergeben, umfassen, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, die Durchflusscytometrie, die verschiedene Grade der technischen Ausgestaltung aufweisen kann, wie z. B. eine Vielzahl von Farbkanälen, Nachweiskanäle für eine Streuung unter einem kleinen Winkel und unter einem stumpfen Winkel, Impedanzkanäle und dgl.
  • Bei einem Trennverfahren, das in der Regel startet von etwa 1 × 108– 9, vorzugsweise etwa 5 × 108–9 Zellen, kann der Antikörper für CD34 mit einem Fluorochrom assoziiert sein, während die Antikörper für die verschiedenen festgelegten Zelllinien mit anderen Fluorochromen belichtet werden können. Fluorochrome, die bei der Vielfarben-Analyse Verwendung finden, umfassen Phycobiliproteine, z. B. Phycoerythrin und Allophycocyanine; Fluorescein und Texas-Rot.
  • Obgleich jede der Zelllinien in einer getrennten Stufe abgetrennt. werden kann, werden die Zelllinien zweckmäßig gleichzeitig getrennt, wenn eine positiv ausgewählt wird für CD34 und CD45RA und/oder CD10. Im Allgemeinen führen die anfänglichen Massenreinigungsstufen zu etwa 1 × 108 Zellen. Die Verarmung an Zelllinienspezifischen Zellen aus dieser Population ergibt etwa 1 bis 3 × 107 Zellen, die etwa 10 bis 20 000 10+ Zellen und 1,5 × 105 10– Zellen enthält. In den 10– Zellen sind etwa 50 000 bis 1 × 105 RA+10– Zellen und 1 × 105 sind RA–10– Zellen.
  • Die Zellen können unter toten Zellen ausgewählt werden durch Verwendung von Farbstoffen, die mit den toten Zellen assoziiert sind, (z. B. Propidiumiodid). Vorzugsweise werden die Zellen in einem Medium gesammelt, das 2% fetales Kalbsserum (FCS) oder 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) umfasst.
  • Es können auch andere Verfahren zur positiven Selektion angewendet werden, welche die genaue Trennung ermöglichen, wie z. B. Affinitätskolonnen und dgl. Das Verfahren sollte die Entfernung bis zu einer Restmenge von weniger als etwa 20%, vorzugsweise von weniger als etwa 5% der Nicht-Vorläufer (Progenitor)-Zellpopulationen ermöglichen.
  • Obgleich angenommen wird, dass eine spezielle Reihenfolge der Trennung für die Erfindung nicht kritisch ist, ist die angegebene Reihenfolge bevorzugt. Vorzugsweise werden die Zellen am Anfang aufgetrennt durch eine grobe Trennung, gefolgt von einer Feintrennung mit einer positiven Selektion eines Markers, der mit den Target-Zellen assoziiert ist, und einer negativen Selektion von Markern, die nicht mit den Target-Zellen assoziiert sind. Es können Zellen selektioniert werden auf der Basis ihre Lichtstreuungs-Eigenschaften sowie ihrer Expression verschiedener Zelloberflächen-Antigene.
  • Wenn einmal die RA+ und/oder 10+ Zellen isoliert worden sind, können sie vermehrt werden durch Wachsenlassen in einem konditionierten Medium aus Stroma-Zellen, beispielsweise Stroma-Zellen, die aus Knochenmark, fetalem Thymus oder fetaler Leber erhalten werden können und für die gezeigt wurde, dass sie eine Sekretion von Wachstumsfaktoren ergeben, die mit der Aufrechterhaltung der Vorläuferzelle in Verbindung stehen, oder die gleichzeitige Kultivierung mit solchen Stroma-Zellen, wobei die Stroma-Zellen autolog, alogen oder xenogen sein können. Vor der Verwendung in der Cokultur können die gemischten Stroma-Zellen-Präparate von hämatopoetischen Zellen befreit werden unter Verwendung einer Bestrahlung, mit cytotoxischen Arzneimitteln oder mit geeigneten monoklonalen Antikörpern für die Entfernung der unerwünschten Zellen, beispielsweise mit Antikörper-Toxin-Konjugaten, Antikörper und Komplement und dgl.. Alternativ können geklonte Stroma-Zelllinien verwendet werden, in denen die Stroma-Zelllinien allogen oder xenogen sein können.
  • Das für die Kultivierung der Zellen verwendete Medium ist zweckmäßig ein definiertes angereichertes Medium, das enthält, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, IMDM (ein durch Iscove modifiziertes Dulbecco-Medium), eine 50 : 50-Mischung von IMDM und RPMI, das im Allgemeinen besteht aus Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, 5 × 10–5 M β-Mercaptoethanol (β-ME), Streptomycin/Penicillin und 10% FCS und das von Zeit zu Zeit ausgetauscht werden kann, im Allgemeinen mindestens etwa ein- bis zweimal pro Woche.
  • Die von RA+ und 10+ Zellen gebildeten Zellen führen bei den nach den nachstehend beschriebenen in vivo-Assays zu T-Zellen. Die Myeloid- und B-Zellenproduktion ist in vivo nur aus RA– Zellen zu erkennen; die Myeloid-Zellenproduktion ist in vitro aus RA– und RA+ insgesamt ersichtlich; 10+ Zellen weisen nahezu keine in vitro Myeloid-Aktivität auf. Die B Zellen-Produktion in Kurzzeit-in vitro-Assays ist sowohl aus RA+ als auch aus 10+ zu ersehen. RA+ und 10+ Zellen führen in vitro zu NK- und DC-Zellen. Außerdem ergeben die RA+10– Kulturen eine kleine Untergruppe von CD34+10+ Zellen.
  • Um die Differenzierung zu T-Zellen zu demonstrieren, wird ein fetaler Thymus isoliert und 4 bis 7 Tage lang bei etwa 25°C kultiviert, um so die Lymphoidzellen-Population im Wesentlichen zu entfernen. Die im Hinblick auf die T-Zellen-Aktivität zu testenden Vorläufer-Zellen werden dann durch Mikroinjektion in das Thymusgewebe eingeführt, in dem die HLA der Population, die injiziert wird, mit der HLA der Thymus-Zellen nicht zusammenpasst. Das Thymus-Gewebe kann dann in eine scid/scid-Maus transplantiert werden, wie in dem US-Patent Nr. 5 147 784 beschrieben, insbesondere durch Transplantation unter der Nieren-Kapsel.
  • Insbesondere kann die aussortierte Population in fehlangepasste HLA Thymus-Fragmente mikroinjiziert werden. Nach 6 bis 10 Wochen können Assays mit den Thymus-Fragmenten durchgeführt werden und es können die aus dem Donor stammenden T-Zellen bestimmt werden. Die Thymus-Fragmente, die zusammen mit Zellen injiziert werden, die ein T-Lymphoid-Potential aufweisen, bilden und unterhalten CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen zusammen mit ihren Vorläufern.
  • Eine weitere Demonstration des Differenzierungsvermögens der verschiedenen Zellpopulationen kann erzielt werden durch den Nachweis der Myeloid- und NK-Zellenproduktion in den Stromazellenassays, die in den weiter unten folgenden Beispielen beschrieben werden.
  • Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Verwendung der RA+ und/oder 10+ Zellpopulationen. Diese Verfahren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Wiederherstellung oder Vermehrung der Lymphoid- bzw. Myeloid- oder Lymphoid-Zellpopulationen; das Screening in Bezug auf die Wachstumsfaktoren, die für die Lymphoid- und Myeloid-Vorläuferzellen-Reifung verantwortlich sind, die Identifizierung von Markern für Vorläuferzellen-spezifische Antikörper (sowohl polyklonal als auch monoklonal); die Identifizierung von Lymphoid- oder Myeloid-spezifischen Genen; die Identifizierung von genetischen Regulations-Sequenzen, die spezifisch für die Lymphoid-Zelllinie sind, und die Verwendung in der Gentherapie.
  • Die Wiederherstellung oder Vermehrung der Lymphoid- und/oder Myeloid-Zellpopulationen ist nützlich für eine Vielzahl von medizinischen Ansätzen. Indikationen, die behandelt werden können, sind z. B. Immundefekte bzw. -defizite und Stammzellentransplantationen. Die Vorläufer-Zellen sind insbesondere verwendbar während der Stammzellentransplantation, um den Zeitverzug zwischen der Transplantation und der Repopulation der hämatopoetische Zellen zu verkürzen. Verfahren zur Gewinnung der Vorläufer-Zellen werden hier ebenfalls beschrieben und Verfahren zur Verabreichung von hämatopoetischen Zellen an Patienten liegen innerhalb des Fachwissens des Fachmannes auf diesem Gebiet.
  • Die Identifizierung einer 10+ Lymphoid-beschränkten Vorläufer-Zellpopulation erlaubt auch die Beurteilung dieser Population in bezug auf den Ursprung der Erkrankung, beispielsweise der Leukämie, und ist daher anwendbar zum Herausspülen solcher Zellen aus einem autologen Transplantat. Die Erfindung umfasst außerdem die Verwendung von RA+ oder 10+ Zellen als DC-Vorläufer für die verschiedensten Verwendungszwecke. DC-Zellen gehören zu den potentesten ein Antigen aufweisenden Zellen im Körper und sind in der Lage, eine primäre Immunanntwort zu induzieren. DC-Zellen kann daher nützlich sein als Zellen-Transplantat zur Erhöhung seiner Fähigkeit, eine Immunantwort zu geben. DC-Zellen oder DC-Vorläufer können bei einer Impfstrategie verwendet werden, bei der die Zellen mit einem Antigen beladen werden und injiziert werden, um eine spezifische Immunantwort zu induzieren. Alternativ können die injizierten Zellen dazu verwendet werden, eine Toleranz für ein spezifisches Antigen zu induzieren.
  • Die RA+ und 10+ Zellen können verwendet werden für die verschiedensten Gentherapie-Verfahren, bei denen eine Expression des exogenen Genbildungsvermögens bei Lymphoid- und/oder Myeloid-Zelllinien erwünscht ist. Die Verwendung der hier beschriebenen Vorläufer-Zellen stellt eine Alternative zu der Gentherapie auf Stammzellenbasis dar. Vorläufer-Zellen sind in den Fällen bevorzugt, in denen es erwünscht ist, eher vorübergehend als dauerhaft eine Expression des exogenen genetischen Vermögens zu erzielen. Außerdem erlaubt es die Verwendung von 10+ Zellen, die Expression auf Lymphoid-Zellen zu beschränken. Ferner ist auch der Gen-Transfer bei Vorläufer-Zellen wahrscheinlich wirksamer als bei Stammzellen, weil der Vorläuferzellen-Zyklus aktiver ist als der Stammzellen-Zyklus und Retroviren-Vektoren sind bekannt dafür, dass sie Zellen mit einem aktiven Zyklus erfordern für die wirksame Integration der rekombinanten DNA.
  • Außerdem wäre es vorteilhaft, für die Gentherapie Lymphoid-Vorläuferzellen anstelle von ausgereiften Lymphoid-Zellen zu verwenden. Derzeit erfordert die T-Zellen-Gentherapie die ex vivo-Vermehrung von T-Zellen mit Zytokinen. Nach der erneuten Infusion docken die modifizierten T-Zellen häufig nicht richtig an ihren Targetorganen an und werden in der Lunge, der Leber oder der Milz eingefangen (und dadurch ausgeschieden). Dieses unzureichende Andocken kann auf eine Veränderung der Membranen während der ex vivo-Bearbeitung, auf eine Herunterregulierung der Andock-Rezeptoren oder dgl. zurückzuführen sein. Eine ex vivo-Vermehrung von T- Zellen ist kostspielig, umständlich und zeitraubend und somit alles andere als ideal für die Behandlung. Die Verwendung von modifizierten Vorläufer-Zellen würde die Notwendigkeit der ex vivo-Vermehrung der Effektor-T-Zellen vermeiden und betrifft somit eine geänderte Stoffwechselbelastung und Persistenz in vivo. Außerdem erlaubt die Verwendung von modifizierten Vorläufern eine Amplifikation der Anzahl der Progenie-Zellen, wodurch die Notwendigkeit zur ex vivo-Vermehrung und zur Verminderung der Häufigkeit der Verabreichung reduziert würde.
  • Genetische Erkrankungen, die mit hämatopoetischen Zellen im Zusammenhang stehen, können durch genetische Modifikation von autologen oder allogenen Vorläufer-Zellen behandelt werden, um den genetischen Defekt zu korrigieren. Solche Erkrankungen umfassen beispielsweise, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, eine Adenosindeaminase-Defizienz, eine Rekombinase-Defizienz, eine Rekombinase-Regulatorgen-Defizienz, die korrigiert werden können durch Einführung eines Gens vom Wild-Typ in die Zellen entweder durch homologe oder durch Random-Rekombination. Andere Indikationen für die Genetherapie sind die Einführung von Arzneimittelresistenz-Genen, wodurch die normalen Vorläufer-Zellen einen Vorteil bieten und einem Selektionsdruck unterliegen, beispielsweise durch das Multiarzneimittel-Resistenz (MDR)-Gen.
  • Es können auch andere Erkrankungen als diejenigen, die im Zusammenhang mit hämatopoetischen Zellen stehen, behandelt werden, bei denen die Erkrankung im Zusammenhang steht mit dem Fehlen eines speziellen sekretierten Produkts, wie z. B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Hormone, Enzyme, Interferon, Faktoren oder dgl. Durch Verwendung einer geeigneten regulatorischen Initiierungsregion kann eine induzierbare Produktion des Mangel-Proteins erzielt werden, sodass die Produktion des Proteins parallel zur natürlichen Produktion verläuft, auch wenn die Produktion in einem anderen Zell-Typ abläuft als dem Zell-Typ, der normalerweise dieses Protein bildet. Es ist auch möglich, ein Ribozym, eine Antisense- oder eine andere Message zu inserieren, um spezielle Genprodukte oder die Anfälligkeit für Erkrankungen zu inhibieren, insbesondere für hämatolymphotrope Erkrankungen (wie z. B. HIV).
  • Die genetische Modifizierung der Zellen kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt während ihrer Aufrechterhaltung durch Transduktion einer im Wesentlichen homogenen Zell-Zusammensetzung mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt erfolgen. Vorzugsweise wird ein Retrovirus-Vektor für die Einführung des DNA-Konstrukts in die Zelle verwendet. Die resultierenden Zellen können dann unter Bedingungen gezüchtet werden, die ähnlich denjenigen sind für nicht-modifizierte Zellen, wodurch die modifizierten Zellen vermehrt und für die verschiedensten Verwendungszwecke eingesetzt werden können.
  • Für die genetische Modifizierung der Zellen wird in der Regel ein Retrovirus-Vektor verwendet, es können aber auch andere geeignete Vektor- oder Zuführungssysteme angewendet werden. Dazu gehören beispielsweise das Adenovirus, das Adeno-assoziierte Virus und künstliche Chromosomen, die aus Hefe stammen. Kombinationen von Retroviren und einer geeigneten Umhüllungs-Zelllinie sind ebenfalls geeignet, wobei Capsid-Proteine die Funktion haben, Humanzellen zu infizieren. Es sind verschiedene amphotrope Virus-bildende Zelllinien bekannt, wie z. B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, PA12 (Miller et al. (1985) "Mol. Zell. Biol." 5: 431–437); PA317 (Miller et al. (1986) "Mol. Zell. Biol." 6: 2895–2902) und CRIP (Danos et al. (1988) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 85: 6460–6464).
  • Mögliche Transduktions-Verfahren umfassen die direkte Cokultur der Zellen mit Produzenten-Zellen, beispielsweise nach dem Verfahren von Bregni et al. (1992) "Blood" 80: 1418–1422, oder die Kultivierung mit einem Virus-Überstand allein mit oder ohne geeignete Wachstumsfaktoren und Polykationen, beispielsweise nach dem Verfahren von Xu et al. (1994) "Exp. Hemat." 22: 223–230 und Hughes et al. (1992) "J. Clin. Invest." 89: 1817.
  • Beschrieben und bereitgestellt werden erfindungsgemäß auch rekombinante T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Konstrukte, die für die Verwendung bei der Transduktion der Zellen geeignet sind. Geeignete Konstrukte und deren Verwendungen sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. US94/10033 beschrieben. Der rekombinante TCR kann unter die Kontrolle eines T-Zellen-spezifischen Promotors gebracht werden, sodass er nur in T-Zellen exprimiert wird. Beispielsweise kann der Promotor Granzym A oder Granzym B sein, das bewirken würde, dass der rekombinante TCR überwiegend in NK-Zellen und cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) exprimiert wird. Cyto toxische Lymphozyten benötigen Granzym B für die schnelle Induktion einer DNA-Fragmentierung und für Apoptosis in allogenen Target-Zellen (Heusel et al. (1994) "Cell" 76: 977–987). Die von transduktierten Zellen stammenden T-Zellen sollten in geeigneter Weise andocken und zirkulieren, da sie in vivo gereift sind und nicht anschließend ex vivo direkt manipuliert worden sind. Sie können hinsichtlich ihrer Anzahl vermehrt werden durch in vivo-Verabreichung von Cytokinen. Da in erster Linie Antigen-aktivierte Zellen sich durch die Cytokine vermehren, sollten modifizierte T-Zellen, welche das Target-Antigen erkennen, relativ amplifiziert werden. Es ist auch möglich, eine stärkere Antwort von den T-Zellen, die aus den transduzierten Zellen stammen, zu erhalten. Wenn mehr reife T-Zellen mit dem rekombinanten TCR transduziert werden, können sie eine gedämpfte Antwort geben, wenn sie "Speicherzellen" (d. h. vorher den Antigenen ausgesetze Zellen) und daher "vorgespannt" sind.
  • Ein weiterer Vorteil der genetisch modifizierten Vorläufer-Zellen gegenüber reifen T-Zellen ist die Fähigkeit, den rekombinanten TCR in mehr als einer hämatopoetischen Zelllinie zu exprimieren. Da beispielsweise Makrophagen bekannt dafür sind, dass sie die Fähigkeit haben, Tumorzellen zu fressen, kann es nützlich sein, den rekombinanten TCR in Makrophagen zu exptrimieren.
  • Die Konstrukte können nach einer großen Vielzahl von konventionellen Wegen hergestellt werden. Heute stehen zahlreiche Vektoren zur Verfügung, welche die gewünschten Merkmale aufweisen, wie z. B. lange terminale Wiederholungen, Markergene und Restriktionsstellen (Schnittstellen), die durch allgemein bekannte Verfahren weiter modifiziert werden können. Die Konstrukte codieren für eine Signal-Peptidsequenz zusätzlich zu der Antigen-spezifischen Region und cytoplasmatischen Signal-Sequenz, um zu gewährleisten, dass der rekombinante TCR in geeigneter Weise nach der Translation verarbeitet und auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Vorzugsweise steht das Konstrukt unter der Kontrolle eines T-Zellen-spezifischen Promotors. Zu geeigneten T-Zellen-spezifischen Promotoren gehören, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Granzym A, Granzym B und CD8.
  • Bei einer Ausführungsform werden die Signal-Transduktions-Region und die Antigen-spezifische Region beide erhalten aus den TCRs ("klassischer TCR"). Bei einer anderen Ausführungsform codieren die Konstrukte für chimäre Polypeptide, welche die Signal-Transduktions-Region umfassen, die aus einem T-Zellen-spezifischen Rezeptor oder aus dem Fcγ-Rezeptor und einem Antigen-bindenden Abschnitt eines Immunglobulins oder eines NK-Rezeptors erhalten worden ist ("chimärer TCR").
  • Die rekombinanten klassischen TCRs sind funktionelle TCR-α- und -β- oder -γ- und -δ-Polypeptide, vorzugsweise mit voller Länge, die aus einer T-Zelle mit einer bekannten Antigen-Spezifität stammen. Zu geeigneten Quellen für Antigen-spezifische Rezeptoren gehören, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, cytotoxische T-Lymphozyten, T-Helferzellen und NK-Zellen. Bei einer anderen Ausführungsform können die Polypeptide rekombiniert sein zur Bildung eines Polypeptids mit einer einzigen Funktion mit den Vα– und Vβ-Regionen, welche die Antigen-bindende Stelle bilden. Bei einer anderen Ausführungsform können die Vα- und Vβ-Regionen aus verschiedenen TCRs rekombiniert sein, um den TCR mit einer anderen Spezifität zu versehen.
  • Die T-Zellen-Progenie der Zellen, welche die rekombinanten klassischen TCR-Polypeptide enthalten, sind "MHC-restricted", d. h. sie erkennen nur ein Antigen in Gegenwart von MHC. Bei Verwendung diese Zellen zum Behandeln eines Patienten müssen die TCRs daher in der Lage sein, den gleichen Haplo-Typ als denjenigen des Wirts zu erkennen. Es ist dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt, festzustellen, ob der Haplo-Typ des Wirts mit einem speziellen TCR kompatibel ist. Das klassische TCR-Verfahren ist vorteilhaft, wenn das Antigen als kurzes Peptid auf der Zelloberfläche exprimiert wird durch interne Verarbeitung und in der Rille eines MHC-Moleküls vorliegt.
  • Im Falle des chimären TCR enthält das Chimären-Molekül eine Antigen-Bindungssequenz aus einem Antikörper oder einem anderen Rezeptor, eine Transmembran-Sequenz und eine Sequenz, die ein Signal transduzieren und eine Funktion elizieren kann. Es wurden die verschiedensten dieser und verwandter Molekül geklont und in verschieden T-Zelllinien exprimiert (Kuwana et al. (1987) "Biochem. Biophys. Res. Comm." 149: 960–968; Gross et al. (1989) "Trans. Proc." 21: 127–130; Becker et al. (1989) "Cell" 58: 911–921; Gross et al. (1989) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 86: 10024–10028; und Goverman et al. (1990) "Cell" 60: 929–939). Es wurden verschiedene chimäre TCRs erzeugt und gefunden, dass sie aktiv sind in bezug auf das Anzielen von T-Zellen, sodass das Antigen erkannt wird durch die Antikörper-Bindungsstelle (Eshhar (1993) "Proc. Natl. Acad. Sci." USA 90: 720–724 und Hwu et al. (1993) "J. Exp. Med." 178: 361–366).
  • Geeignete Signaltransduktions-Regionen können aus Rezeptoren erhalten werden, die durch eine spezifische Kette, wie z. B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, die γ-Kette des FC-Rezeptors, die CD3 ζ-Kette, die IL-2-Rezeptor-γ-Kette, CD8 oder CD28, ein Aktivierungsvermögen aufweisen. Alternativ kann die Antigen-Bindungsdomäne mit konstanten TCR-α oder β-Ketten-Regionen assoziiert sein, die ein Signal transduzieren durch Assoziation mit der endogenen CD3 ζ-Kette. Vorzugsweise ist der funktionelle Abschnitt des chimären Moleküls die signalgebende Region eines Fcγ- oder ζ-Polypeptids und die Antigen-bindende Domäne ist eine variable Region eines Antikörpers. Die variable Region kann entweder die VH- oder die VL-Region sein oder vorzugsweise eine Einzelketten-Rekombinate davon sein.
  • Verfahren zur Rekombination bei Säugetierzellen sind zu finden im "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1989), Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor, NY.
  • Die T-Zellen-Prgogenie der die chimären TCR-Moleküle enthaltenden Zellen können ein Antigen in Abwesenheit von MHC erkennen, wenn die Antigen-Bindungsstelle von einem Antikörper stammt und somit nicht MHC-restricted ist. Diese Moleküle sind geeignet für die Verwendung in allen Wirten, unabhängig von dem Haplo-Typ.
  • Bei der Wiedereinführung der genetisch modifizierten Zellen in den Wirt und der anschließenden Differenzierung werden T Zellen gebildet wird, die spezifisch gegen das spezifische Antigen gerichtet sind. Im Allgemeinen gehören zu geeigneten Antigenen solche, die auf Virus-infizierten Zellen und spezifischen Krebszellen zu finden sind. Zu geeigneten Antigenen gehören insbesondere, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Virenhüllen-Proteine und spezifische Oberflächenproteine von Krebszellen.
  • In vielen Situationen umfasst die Zellen-Immuntherapie die Entnahme von Knochenmark oder einer anderen Quelle für hämatopoetische Zellen aus einem Human-Wirt, das Isolieren der Vorläuferzellen aus der Quelle und gegebenenfalls das Vermehren der isolierten Zellen. Inzwischen kann der Wirt behandelt werden, um teilweise, in beträchtlichem Umfang oder vollständig das native hämatopoetische Bildungsvermögen zu zerstören. Die isolierten Zellen können während dieses Zeitraums modifiziert werden, um Zellen mit der gewünschten genetischen Modifikation zu ergeben. Im Falle der vollständigen hämatopoetischen Ablatio ist auch eine Stammzellen-Vermehrung erforderlich. Nach Beendigung der Behandlung des Wirtes können die modifizierten Zellen dann in den Wirt wieder eingeführt werden, um ein neues Blutbildungsvermögen zu ergeben. Die Verfahren zur hämatopoetischen Zel lenentnahme, die Wirts-Ablatio und die Stammzellen/Vorläuferzellen-Repopulation sind allgemein bekannt. Erforderlichenfalls kann das Verfahren wiederholt werden, um eine beträchtliche Repopulation der modifizierten Zellen zu gewährleisten.
  • Die modifizierten Zellen können in einem physiologisch akzeptablen Vehiculum, normalerweise intravasculär, verabreicht werden, obgleich sie auch in den Knochen oder in eine andere geeignete Stelle eingeführt werden können, in der die Zellen eine geeignete Stelle für die Regeneration und die Differenzierung finden können (z. B. im Thymus). In der Regel werden mindestens 1 × 105 Zellen, vorzugsweise 1 × 106 Zellen oder mehr, verabreicht. Die Zellen können durch Injektion, mittels eines Katheters oder dgl. eingeführt werden. Gewünschtenfalls können auch Faktoren darin enthalten sein, wie z. B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Interleukine, z. B. IL-2, IL-3, IL-6 und IL-11 sowie andere Interleukine, die Kolonie stimulierende Faktoren, wie z. B. G-, M- und GM-CSF, Interferone, z. B. γ-Interferon, Erythropoietin.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken. In den nachstehend angegebenen Beispielen wurden die folgenden primären Ergebnisse erhalten. Zuerst wurde gezeigt, dass Populationen, die an einer primitiven hämatopoetischen Stammzellen-Aktivität angereicheret sind, T-Zellen bilden können, wenn sie in die Thymus-Stelle eingeführt werden. Zweitens scheint das T-Zellen-Rekonstruktions(Wiederherstellungs)potential in verschiedenen Untergruppen von CD34+ ABM-Zellen allgegenwärtig vorhanden zu sein, dies kann jedoch erklärt werden beispielsweise durch das Lymphoidpotential, das in dem CD45RA-Abteil vorliegt. Drittens können auch andere Zellen als hämatopoetische plurtpotente Stammzellen oder andere als Intrathymus-prä-T-Zellen zu T-Zellen differenzieren. Dass dies gefunden wurde, wurden oben noch nicht vollständig erwähnt. Viertens wurde eine kleiner Untergruppe von Zellen (etwa 5,9±3,7% der CD34+Lin– Zellen) gefunden, die ein begrenztes Myeloid-Potential, jedoch eine starke T- und B-Lymphoid-Vorläufer-Aktivität (10+ aufweist. Fünftens können die RA+10– und 10+ Zellen zu NK-Zellen differenzieren. Sechstens können die RA+10– und 10+ Zellen zu DC-Zellen differenzieren.
  • Beispiel 1
  • Behandlung und Anfärbung einer Probe für die Sortierung unter Anwendung der Durchfluss-Cytometrie
  • Adulte Knochenmarks (ABM)-Aspirate wurden erhalten aus dem hinteren Darmbeinkamm von gesunden erwachsenen Freiwilligen mit ihrer Zustimmung. Die durch Gradienten-Zentrifugieren erhaltenen monoklonalen Zellen (MNC) mit niedriger Dichte (<1,077 g/ml) (Lymphoprep, Nycomed Pharma) wurden in einem Anfärbungspuffer (SB), bestehend aus einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma), zweimal gewaschen und mit 1 mg/ml Hitze-inaktiviertem Human Gammaglobulin (Gamimune, Miles, Inc.) inkubiert, um die nicht-spezifische Fc-Rezeptor-Bindungsstelle von Maus-Antikörpern zu blockieren. Es wurden Granulozyten entnommen entweder durch Inkubation mit magnetischen Perlen (Dynal M450), die mit monoklonalen Anti-CD15-Antikörpern (MAbs) beschichtet waren (Medarex) oder durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff in Gegenwart von 10% DMSO (Sigma), 10% fetalem Kalbsserum (FCS) (Hyclone) und Auftauen. Dann wurden die Zellen mit den folgenden Zelllinien-spezifischen Phycoerythrin (PE)-konjugierten MAbs inkubiert: Anti-CD2, -CD4, -CD8, -CD56, -CD16, -CD19, -CD20 (Becton Dickinson) und Antiglycophorin A (Amac) (PE-Lin). Nach 2-maligem Waschen in SB wurden die Zellen inkubiert mit Schafs-Anti-Maus-Immunoglobulin-beschichteten Perlen (Dynal) und nach der Einwirkung eines Magnetfeldes wurden die an die Perlen gebundenen Zellen verworfen. Anti-CD34 MAbs (Tük-3; Dr. Ziegler, Universität Berlin, Berlin, Deutschland) oder IgG3 Kontroll-MAbs vom Isotyp wurden in einer Menge von 0,3 μg auf 106 Zellen in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml SB 20 min lang auf Eis zugegeben. Die Zellen wurden zweimal in SB gewaschen, dann mit Texas-Rot (TR)-konjugierten Ziegen-Anti-Maus IgG3 (GAMγ3)-Antikörpern (Southern Biotechnologies Associates) und FITC-markierten-Anti-CD45RA MAbs (Beeton Dickinson) inkubiert und anschließend 2-mal in SB gewaschen. Die Zellen wurden auf dem FACStar Plus-Zellensorter (Becton Dickinson), der mit dualen Argonionlasern ausgestattet war, sortiert, von denen der primäre Laser bei 488 nm emittierte und ein Farbstofflaser (Rhodamine 6G) bei 600 nm emittierte (Coherent Innova 90, Santa Clara, CA). Alle Zellen, die PE-Lin in Gehalten oberhalb des Wertes für die negative Kontrolle exprimierten, wurden durch elektronisches Aussortieren (Abtasten) ausgeschlossen und der Rest wurde auf der Basis von CD34 und CD45RA sortiert.
  • Für die CD38-Sorten wurden die Zellen mit Anti-CD34 (Tük-3) MAbs angefärbt, die erkannt werden von TR-Konjugat GAMγ3, FITC-Lin MAbs (Lin = CD2, CD14, CD15, CD16, CD19 und Glycophorin A) und PE Anti-CD38 MAbs (Becton Dickinson). Für die Thy-1-Sorten wurden die Zellen mit Anti-CD34 und Anti-Thy-1 MAbs (GM201) markiert, das jeweils erkannt werden von den spezifischen TR-GAMγ3-Antikörpern vom Isotyp (Southern Biotechnologies Associates) und den PE-Antimaus-IgG1-Antikörpern (Caltag, South San Francisco, CA), dann wurden nach dem gründlichen Blockieren mit Maus-IgG1 (Sigma), FITC-Lin MAbs (Lin = CD2, CD14, CD15, CD16, CD19 und Glycophorin A) zugegeben. Für die HLA-DR-Sorten wurde nur FITC-CD15 als Lin-Marker zusammen mit PE-Anti-HLA-DR MAbs verwendet (Becton Dickinson). Für die CD34/CD45RA/Thy-1-Isolationen wurden zwei aufeinanderfolgende Sortierungen durehgeführt. Die ersten Zellen wurden mit Anti-CD34, Anti-Thy-1 und FITC-Lin MAbs wie vorstehend beschrieben markiert. Die mit einer guten Reinheit (>90%) sortierten CD34+Lin– Zellen wurden erneut mit FITC-CD45RA MAbs angefärbt und es wurde eine zweite Sortierung auf der Basis der CD45RA- und Thy-1 Expression durchgeführt.
  • Für die CD10-Studie wurden die meisten getesteten ABM-Proben zuerst einer CD34-Positiv-Selektion unter Verwendung eines biotinylierten Anti-CD34- und eines Biotin-Konkurrenz-Systems unterworfen, wie in der Patentanmeldung WO 94/02016 beschrieben. Die positiv selektionierten CD34+ Zellen wurden mit Anti-CD34 Tük-3 MAbs angefärbt (zur Erkennung eines Epitops, das von demjenigen verschieden ist, das zur positiven Selektionierung der Zellen verwendet wurde) und mit TR Ziegen-Antimaus (GAM)-γ3, PE-Lin (CD2, CD4, CD8, CD56, CD16, CD19, CD20 und Glycophorin A) plus CD10-FITC oder relevanten Kontroll-MAbs, wie vorstehend beschrieben. Zur Gewinnung von CD45RA-Untergruppen, die frei von CD10+ Zellen sind, wurden zwei aufeinanderfolgende Sortierungen durchgeführt. Zuerst wurden CD34+CD10+Lin– und CD34+CD10–Lin– Zellen sortiert. Die zuletzt genannte Population wurde erneut angefärbt entweder mit FITC-Kontrollen vom Isotyp oder mit Anti-CD45RA FITC MAbs und die CD34+Lin–CD10–CD45RA– und CD34+Lin–CD10–CD45RA– Untergruppen wurden sortiert. Bei einigen Versuchen wurden die CD34 Mabs (Tük3) direkt mit Sulforhodamin konjugiert.
  • Beispiel 2
  • Phänotypische Analysen von CD34+ Zell-Untergruppen-Zellpulationen
  • Sortierte CD34+Lin– Zellen wurden mit PE-konjugiertem anti-CD38 und anti-HLA-DR MAbs (Becton Dickinson) wieder angefärbt. Sortierte CD34+Lin–CD45RA+ oder CD34+Lin–CD45RA– Zellen wurden mit PE-konjugiertem anti-CD33 MAbs (Becton Dickinson) oder mit anti-c-kit MAbs (Amac) wieder angefärbt, das von einem PE-konjugierten Ziegen-Anti-Maus IgM-Antikörper (Southern Biotechnologies Associates) erkannt wird.
  • Außerdem wurden geeignete Isotyp-Kontrollen verwendet, um die Spezifität der Anfärbungen sicherzustellen und den Hintergrund für die Sortierung zu bilden (weniger als 1% in dem PE-Kanal bei den geprüften Proben).
  • 1. Phänotypische Analysen
  • CD45RA-Antigene werden überwiegend auf den verschiedensten Knochenmarkzellen exprimiert (Lansdorp und Dragowska (1992) und Schwinzer (1989) in "Leukocyte Typing N. White Cell Differentiation Antigens" (Knapp et al. eds.), Oxford University Press, New York, Seiten 628–634). Die CD34+Lin– ABM Zellen in dem Lymphoblastoid-Schaubild (gate) sind klar unterteilt in zwei Populationen auf der Basis der CD45RA-Expression (Schaubild A der 2). Wie dargestellt, exprimieren die CD34+Lin–CD45RA+ Zellen einen mittleren Gehalt an CD45RA-Antigen, der niedriger ist als er bei einigen CD34– Zellen zu finden ist. CD34+Lin–CD45RA+ Zellen exprimierten negative bis matte Gehalte an Thy-1 (2, Schaubild B), hohe Gehalte an CD38 und HLA-DR (2, Schaubilder C und D) und sie enthielten Zellen mit entweder eindeutig positiven oder negativen Gehalten an CD33 und c-kit-Antigenen (2, Schaubilder E-H). Die CD34+Lin–CD45RA– Zellen exprimierten homogener niedrige Gehalte an c-kit und CD33, sie waren jedoch heterogen in bezug auf die Expression von Thy-1, CD38 und HLA-DR. Zellen mit negativen bis matten Gehalten an CD38 und HLA-DR wurden am meisten in der CD45RA– Population gefunden. Primitive hämatopoetische Stammzellen wurden von unabhängigen Laboratorien charakterisiert als Thy-1+, CD38low, c-kitlow, CD33low und HLA-DRlow, und die Integration dieser Parameter zeigte, dass sie in dem CD45RA– Abteil von CD34+ ABM Zellen gefunden wurden wie weiter oben angegeben (Terstappen et al. (1991); Baum et al. (1992); Lansdorp und Dragowska (1992); Srour et al. (1991); Craig et al. (1993); Gunji et al. (1993) "Blood" 82: 3283–3289, und Mayani und Lansdorp (1994) "Blood" 83: 2410–2417).
  • Keine nachweisbare Zelle erfüllte alle phänotypischen Kriterien für primitive hämatopoetische Stammzellen in dem CD34+Lin–CD45RA+ Abteil, das deshalb nur Vorläufer-Zellen zu enthalten scheint. Der CD45RA+CD10+ Zentral-Lymphoid-Vorläufer wurde ferner charakterisiert durch Überprüfung der Färbung mit einer Reihe von Antikörpern und er zeigte, dass diese Zellen CD38+HLA-DR+ und Thy1– Zellen sind, wie aus den in der 2 dargestellten Ergebnissen ersichtlich.
  • Marker von unreifen T-Zellen, wie z. B. CD7, CDS und CD25, wurden nicht in signifikantem Umfang auf CD34+Lin–CD10+ ABM-Zellen exprimiert und der c-kit-Rezeptor war nicht nachweisbar auf CD34+Lin–CD10+ Zellen (Tabelle 2). Es wurden die verschiedensten hämatopoetischen Assays angewendet zur Bestimmung des Differenzierungsvermögens dieser CD34+Lin–CD10+ Zellenpopulation, die 5,9±3,7% (n = 13) der CD34+Lin– ABM Zellen und etwa 0,09% der mononuklearen ABM-Zellen, die bei der Ficoll-Gradienten-Zentrifugierung isoliert wurden, darstellten.
  • Tabelle 2 Phänotypische Charakterisierung von CD34+Lin–CD10+ ABM Zellen
    Figure 00200001
  • Um die in der Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zu erhalten, wurden phänotypische Analysen mit CD34+Lin– Zellen durchgeführt, die durch Strömungs-Cytometrie isoliert wurden mit einer Sortenreinheit von >98%. Die aussortierten Zellen wurden mit Fluorescein oder PE-konjugiertem mAbs Anti-CD45RA, CD38, HLA-DR, CD7, CDS, CD25 (Becton Dickinson) und mAbs Anti-CD10, konjugiert mit Fluorescein (Becton Dickinson) oder PE (Amac), gefärbt. Bei einem indirekten Verfahren mit Isotyp-spezifischen PE-markierten sekundären Reagentien und einer geeigneten Blockierung wurden Mabs bis Thy-1 (Klon GM201) und c-kit (Amac) verwendet (Lin = CD2, CD4, CD8, CD16, CD56, CD19, CD20, CD14 und Glycophorin A). In der Tabelle 2 sind die Ergebnisse ausgedrückt in % positive Zellen nach der Subtraktion der Hintergrundfärbung mit der IgG1 + IgG2a-Kontrolle (für die direkte Färbung) und mit IgG1 + IgM (für die indirekte Färbung) ± Standardabweichung (SD) und die Anzahl der Versuche ist in Klammern angegeben.
  • Beispiel 3
  • Myelo-Erythroid-Vorläuferzellen-Gehalt, Vermehrungspotential und in vivo-Knochenmarksreponulationsvermögen von CD34+ Zell-Untergruppen
  • 1. Methylcellulose-Koloniebildungs-Assay
  • Die Zellen wurden miteinander gemischt in einer Konzentration von 500 CD34+ Zellen pro ml Iscove-Methylcellulose (Teny Fox Laboratory), ergänzt durch gereinigte rekombinante Human-Cytokine, c-kit-Ligand (KL) (10 ng/ml) (R & D Systems), GM-CSF und G-CSF (jeweils 25 ng/ml) (Amgen), IL-3 (10 ng/ml) (Sandoz Pharma) und Erythropoietin (1,2 U/ml) (R & D Systems). Wenn kultivierte Zellen getestet wurden, wurde die Anzahl der ausgestrichenen Zellen eingestellt auf 500 CD34+ Zellen pro ml, wie durch Immunfärbung mit PE-Anti-CD34 (HPCA-2, Becton Dickinson) errechnet. Für jeden getesteten Zell-Typ wurden Doppel- oder häufiger Quadrupel-Platten 2 Wochen lang in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C inkubiert. Burst-bildende Einheiten – Erythroid (BFU-E), Kolonien-bildende Einheiten (CFU), bestehend nur aus Monozyten (CFU-M) oder aus Monozyten und Ganulozyten CFU-GM) oder solche, die alle Klassen von Granulozyten- und Monozyten-Vorläufern enthielten (CFU-C), und Kolonien, die Granulozyten, Monozyten und Erythroid-Zellen umfassten (CFU-mix), wurden unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops (Nikon, Tokyo, Japan) bewertet.
  • 2. In vitro Co-Kultur auf AC6.21 Zellen für die Myeloid- und B-Zellen-Differenzierung
  • AC6.21 Stromazellen-Monoschichten wurden eine Woche vor dem Versuch durch Ausstreichen von 1 × 104 AC6.21 Zellen pro Vertiefung auf einer Tüpfelplatte mit 96 Vertiefungen und ebenem Boden in einem 100 μl-Medium, bestehend aus 50% IMDM (JRH Biosciences), 50% RPMI mit 10% FCS (Hyclone), 4 × 10–5 M (2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) (P/S) und 4 mM Glutamin (JRH Biosciences), hergestellt. Die sortierten Zellen wurden in einer Menge von 100 Zellen pro Vertiefung auf der vorher hergestellten AC6.21 Zellen-Monoschicht in einem Medium verteilt, das IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) und den Leukämie-Inhibierungs-Faktor (LIF) (50 ng/ml) (Sandoz Pharma) enthielt. Die Hälfte des Cytokin enthaltenden Mediums wurde wöchentlich ersetzt. Am Ende der dreiwöchigen-Kultivierung wurden die Zellen durch Pipettieren geerntet, ausgezählt, und in die nachfolgenden Assays überführt.
  • 3. SCID-hu Knochen-Assay
  • Für die Herstellung von SCID-hu-Knochen-Mäusen nach dem von Kyoizumi et al. (1992) in "Blood" 79: 1704–1711 beschriebenen Verfahren wurden 6 bis 8 Wochen alte C.B-17 scid/scid (SCID) Mäuse, die in den eigenen Labors gezüchtet wurden, verwendet. Kurz zusammengefasst wurden gespaltene fetale lange Knochen subcutan in Säugetier-Fettpolster von SCID-Mäusen unter Anästhesie subcutan implantiert. Die HLA Immunophänotypisierung des empfangenen fetalen Knochens und der Donor-ABM-Zellen wurde durchgeführt mit FITC-konjugierten MA2.1, BB7.2, GAP-A3 und W6/32 MAbs, abgeleitet von Hybridoma, die von der American Type Kulture Kollection (ATCC) erhalten wurden. Als Empfänger für HLA-fehlangepasste aussortierte Zellpopulationen wurden SCID-hu Knochenmäuse im Alter von 8 Wochen nach der Implantation verwendet und konditioniert durch Verabreichung einer einzigen Gesamtkörper-Bestrahlungsdosis (400 cGy aus einer 137Cs Quelle, Gamma-Zelle 40, J. L. Shepherd & Associates). Die aussortierten Zellen (3 × 104 in 10 μl) wurden dann direkt in den transplantierten Knochen unter Verwendung einer Hamilton-Spritze injiziert. Nach 8 Wochen wurden die Mäuse getötet und die Human-Knochen wurden entnommen. Die gespülten Knochenzellen wurden in einer roten Blutzellen-Lysier-Lösung wieder suspendiert, dann zweimal in SB gewaschen und ausgezählt, bevor sie gefärbt wurden für eine Zwei-Farben-Inununofluoreszenz mit FITC-markierten MAbs gegenüber dem spezifischen Donor HLA-Allotyp in Kombination mit PE Anti-CD19, -CD33 und -CD34. Als Negativkontrolle wurden FITC- und PE-konjugierte irrelevante Maus-Immunglobuline verwendet. Die Zellen wurden auf einem FAC-Abtast-Fluoreszenz-Zellenanalysator (Becton Dickinson) analysiert.
  • 4. Myeloid- und Erythroid-Potential von CD45RA-Untergruppen
  • In früheren Berichten ist angegeben, dass Erythroid-Vorläuferzellen und LTCIC-Aktivitäten angereichert sind an CD34+CD45RAlow ABM Zellen (Lansdorp und Dragowska (1992)). Weil hier eine Gruppe von Zelllinien-Markern verwendet wurde, war es erforderlich, die Myeloid-Vorläuferzellen-Aktivitäten der Populationen der Studie zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angegeben, in der die Ergebnisse als mittlere Anzahl der Kolonien auf eine Gesamtmenge von 1 000 ausgestrichenen Zellen angegeben sind.
  • Tabelle 3 Methylcellulose-Koloniebildungs-Assay
    Figure 00220001
  • Das Klon-bildende Potential in dem Methylcellulose-Assay zeigte, dass CFU-mix und BFU-E signifikant angereichert waren an RA– Zellen, was frühere Erkenntnisse bestätigte (Lansdorp und Dragowska (1992)).
  • Die Co-Kultivierung von ABM-Untergruppen auf der Maus-Knochenmarks-Stroma-Zelllinie AC6.21 wurde in Gegenwart von IL-3, IL-6 und LIF durchgeführt. Die Zugabe von Cytokinen zu der Co-Kultur war erforderlich, um ein optimales Wachstum der adulten Zellen zu erreichen. Nach drei Wochen vermehrten sich sowohl die RA– als auch die RA+ Zellen gut (jeweils auf das 100- bis 500-fache und das 70- bis 200-fache der eingesetzten Anzahl der Zellen in drei Versuchen) und beide Untergruppen bildeten sichtbar differenzierte Zellen; die Kulturen von RA– Zellen wiesen jedoch mehr Kluster von kleinen Anhäufungen auf, die Kopfsteinpflaster-Flächen ähnelten.
  • Um die Vorbelastung durch die Zugabe von Cytokinen und durch den gewählten verhältnismäßig frühen Zeitpunkt der Analyse zu umgehen, wurden Kulturen immunophänotypisiert in bezug auf die Anwesenheit von CD34+Lin– Zellen und ihre sekundäre CFU-Aktivität wurde bestimmt. RA– Kulturen enthielten eindeutig und stets mehr CD34+Lin– Zellen bei einer besseren Aufrechterhaltung eines sekundären Klonbildungspotentials als die RA+ Kulturen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 und in der Tabelle 3 nach der AC6.21 Kultivierung angegeben. In der Tabelle 4 waren die in den Versuchen 4 und 5 verwendeten Zellen ebenfalls CD10– Zellen. Außerdem wurde in den RA– Kulturen ständig ein Mengenanteil von CD34+CD45RA– Zellen aufrechterhalten während der Differenzierung zu CD34+CD45RA– Zellen. In den RA– Kulturen exprimierten alle CD34+ Progenie-Zellen CD45RA.
  • Figure 00230001
  • Die Hierarchie in Bezug auf die Primitivität dieser Untergruppen kann aus der Analyse abgeleitet werden, wonach die meisten RA– Zellen unreif sein und direkt zu einer RA+ Progenie differenzieren können.
  • Schließlich wurde das hämatopoetische Langzeit-Rekonstituitionspotential der CD45RA-Untergruppen in dem in vivo SCID-hu-Knochen-Assay geprüft, der die Langzeit-multi-Zellinien-Hämatopoese unterstützte (DiGiusto et al. (1994)). Dann wurden aussortierte Zellen in Fragmente von Humanknochen injiziert, die vorher in SCID-Leihmäuse implantiert worden waren. Nach 8 Wochen hatten sich die RA– Zellen aufgepfropft, was die Anwesenheit von aus dem Donor stammenden CD19+ B-Zellen, von CD33+ Myeloid-Zellen und CD34+ Vorläufer-Zellen (3) ergab. Es wurde keine Progenie aus der RA+ Untergruppe erhaltenen, obgleich die getestete Zellendosis bekannt dafür ist, dass sie eine stetige Aufpfropfung auf CD34+Lin– Zellen erlaubt. Deshalb fehlen dieser Population die primitiveren Stammzellen, die für die Aufpfropfung in den SCID-hu-Knochen-Assay erforderlich sind, obgleich RA+ Zellen eine Myeloid- und B-Lymphoid-Vorläufer-Aktivität aufweisen, bestimmt durch eine in vitro-Co-Kultur und die Methylcellulose-Assays.
  • Zusammengenommen bestätigen diese Daten frühere Beobachtungen, die zeigen, dass die primitivste hämatopoetische Aktivität unter den Myeloid-, Erythroid- und B-Lymphoid-Zellinien in der RA– Population zu finden ist. Gleichzeitig ist klar, dass die RA+ Zellen frei von Stammzellen und Erythroid-Vorläufer-Zellen sind, jedoch Myeloid-Vorläufer-Zellen enthalten.
  • 5. Fraktionierung der RA+ Untergruppe
  • Um das Verständnis für die stromabwärts gelegenen Stufen der hämatopoetischen Stammzellen-Differenzierung zu verfeinern, wurden frühe B-Zellen-Vorläufer auf ihr T-Zellen-Wiederherstellungspotential untersucht. Es wurde berichtet, dass der früheste B-Zellen-Vorläufer durch Membranexpression von CD34 und von CD10 identifizierbar ist, jedoch CD19 und CD2 nicht enthält (Uckun (1990)). Die hier präsentierten Daten bestätigen, dass eine kleine Untergruppe von CD34+Lin– Zellen (Lin umfasst unter anderen die Marker CD19 und CD2) CD10 exprimieren (4). Diese CD34+Lin–CD10+ Zellen (nachstehend als 10+ bezeichnet) liegen in der RA+ Population vor, weil die Sortierung für die CD10+ Zellen eine Verarmung des RA+-Abteils etwa um die Hälfte anzeigt, während die RA– Population nur um 10% vermindert ist. Das Klonbildungspotential von 10+ Zellen in dem Methylcellulose-Assay war nahezu nicht vorhanden, da keine Erythroid-Kolonien und nahezu keine Myeloid-Kolonien gebildet wurden mit Ausnahme von sehr wenigen CFU-C-Kolonien, die nur aus Makrophagen bestanden (Table 5). Eine Co-Kultivierung von 10+ Zellen auf AC6.21 Stroma in Gegenwart von IL-3, IL-6 und LIF für 3 Wochen zeigte nur ein bescheidenes Wachstum, jedoch eine starke Differenzierung zu CD19+ B-Zellen (Tabelle 5).
  • Tabelle 5 Differenzierungspotential von CD34+Lin–CD10+ Zellen
    Figure 00240001
  • Ein Versuch zeigte die Anwesenheit von mehr als 60% CD19+ B-Zellen nach einer 3-wöchigen Massenkultur mit Cytokinen. In bemerkenswerter Weise enthielten diese Kulturen auch CD33+ Zellen, obgleich in einem viel niedrigeren Mengenanteil als in den Kulturen, die mit RA+ Zellen initiiert worden waren (vgl. Tabelle 4).
  • Myeloid- und Erythroid-Vorläufer-Zellen sind in der CD34+Lin–CD10+ Zellpopulation praktisch nicht vorhanden (Tabelle 6). Es wurden Methylcellulose-Kulturen hergestellt in Gegenwart von rekombinantem Human-IL-3 (10 ng/ml) (Sandoz Pharma, Basel, Schweiz), des Granulozyten-Monozyten-Kolonie-Stimulierungsfaktors (GM-CSF) (25 ng/ml), des Granulozyten-CSF (G-CSF) (25 ng/ml), von Erythropoietin (EPO) (1,2 U/ml) und eines c-kit-Liganden (KL) (10 ng/ml) (R & D Systems, Minneapolis, MN). Die Kulturen wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5% CO2 und 95% Luft 2 Wochen lang bei 37°C inkubiert. Die Knochenmarks-Co-Kulturen wurden auf einem vorgebildeten AC6.21 Maus-Knochenmark-Stroma in Gegenwart von IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) und LIF (50 ng/ml) erstellt. 3 Wochen nach der Kultivierung wurden alle Zellen geerntet und ausgezählt, um die gesamte Zellenvermehrung zu errechnen. Die Zellen wurden mit Fluoreszein und mit PE-konjugiertem mAbs angefärbt und auf einem Fluoreszenz-aktivierten Zellscanner (Becton Dickinson) analysiert. Die spezifische Zellenfärbung wurde in dem lebenden Zell-Bereich anhand der Größe, der Granularität und des Propidiumiodid-Ausschlusses bestimmt. Die Ergebnisse sind in % positive Zellen nach der Subtraktion des Hintergrundwertes (Anfärbung mit irrelevanten Maus IgG1- und IgG2a-Antikörpern) ausgedrückt.
  • Es wurden gelegentlich Myeloid-Koloniebildungs-Einheiten (CFU), bestehend aus großen mononuklearen Zellen, beobachtet (2 auf 1000 Zellen). Die Anwesenheit dieser seltenen Kolonien als Folge einer Sortierungs-Kontamination der CD34+Lin–CD10– Zellen scheint unwahrscheinlich zu sein, da Erythroid-Kolonien niemals nachgewiesen wurden. Hochgereinigte CD34+Lin–CD10+ Zellen, die nach zwei Runden der Sortierung im Durchfluss-Zytometer erhaltenen wurden, zeigten keine derartige Koloniebildung, auch nicht nach längeren Kultivierungszeiten (3 und 4 Wochen). Wie erwartet, ergab die parallel getestete CD34+Lin–CD10– Population eine große Anzahl von Kolonien von entweder Myeloid-, Erythroid- oder gemischten (Erythroid- und Myeloid)-Zellinien (Tabelle 6).
  • CD34+Lin–CD10+ Zellen wurden außerdem in auf Stroma-Zellen aufgebrachten Knochenmarkskulturen bewertet. Aussortierte Zellen wurden auf Maus-AC6.21 Stroma-Zellen cokultiviert in Gegenwart von IL-3, IL-6 und des Leukämie-Inhibierungsfaktors (LIF), einer Zytokin-Kombination, die bekannt dafür ist, dass sie das Wachstum von adulten hämatopoetischen Zellen unterstützt, wie von Murray et (1994) beschrieben. Nach 3 Wochen hatten sich die CD34+Lin–CD10– Zellen beträchtlich vermehrt (gesamte Zellenvermehrung auf das 174- bis 500-fache) und es waren noch 3 bis 18% CD34+ Zellen in der Kultur vorhanden, was eine gewisse Retention von primitiven hämatopoetischen Zellen anzeigt. Es wurden morphologisch heterogenene Populationen von Myeloid-Zellen festgestellt. Die große Mehrheit der kultivierten Zellen (86–97%) exprimierte das Myeloid-Antigen CD33, jedoch keine nachweisbaren CD19+ Lymphoid-Zellen.
  • Im Gegensatz dazu zeigten unter identischen Versuchs-Bedingungen CD34+Lin–CD10+ Zellen ein begrenztes Vermehrungspotential (Gesamtmenge der Zellenvermehrung auf das 3- bis 42-fache). In der Kultur wurden nur wenige CD34+ Zellen (0,7 bis 3%) aufrechterhalten und die Zellen zeigten ein starkes Potential zur Differenzierung zu CD19+ Lymphoid-Zellen.
  • Ein Vorversuch zeigte, dass CD34+Lin–CD10+ Zellen keine hämatopoetische Langzeit (8 Wochen)-Rekonstitution von Human Knochen-Fragmenten, die in SCID-Mäuse implantiert worden waren, ergab. Außerdem verhinderte die Verarmung der CD34+Lin– Population an CD10 Zellen nicht eine hämatopoetische Repopulation von SCID-hu-Knochen. Somit waren die CD34+Lin–CD10+ Zellen von den Stammzellen funktionell und phänotypisch verschieden.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 6 dargestellt, in der N. T. für "nicht getestet" steht; die Ergebnisse der Methylcellulose-Kulturen sind ausgedrückt durch die Anzahl der Myeloid (CFU-G, M und GM)/Erythroid (BFU-E und CFU-E)/multipotenten (CFU-mix) Vorläufer-Zellen auf 1000 ausgestrichene Zellen. In den Versuchen 2 und 3 sind die CD10– Zellen auch CD45RA– Zellen, was ihren höheren CFU-mix-Gehalt erklärt. In den Versuchen 4 und 5 wurden die CD10+ Zellen nach zwei aufeinanderfolgenden Runden der Sortierung durch Durchfluss-Cytometrie hoch gereinigt. Die erneute Analyse der Sortenreinheit nach der ersten Runde betrug 91 und 98% für die Versuch 4 bzw. 5.
  • Figure 00270001
  • Beispiel 4
  • B-Lymphoidpotential von CD34+CD45RA-Untergruppen
  • Das Differenzierungspotential zu B-Zellen wurde nach der Co-Kultur von AC6.21-Maus-Knochenmarks-Stroma-Zellen, die bekannt dafür sind, dass sie die Human B-Zellen-Differenzierung von fetalen und adulten Knochenmarks CD34+Lin– Zellen unterstützen, analysiert (Baum et al. (1992); und DiGiusto et al. (1994)). Wie vorstehend beschrieben, wuchsen RA+ und RA– Zellen auf AC6.21 Zellen in Gegenwart von IL-3, IL-6 und LIF. Von RA+ und RA– Zellen abgeleitete Kulturen bestanden nahezu ausschließlich aus CD33+ Myeloid-Zellen (Tabelle 4).
  • Ein geringer, jedoch signifikanter Anteil der CD19+ Zellen (1 bis 2%) wurde häufig in den RA+ Kulturen beobachtet, nicht jedoch in der RA– Kultur. Die Vorwärts- und Seitwärts-Streuungs-Eigenschaften der CD19+ Zellen waren in Einklang mit ihrer B-Zellen-Natur und die RA+ Kulturen enthielten ebenfalls CD10+ Zellen. Unter diesen Vesuchsbedingungen wurde eine B-Zellenbildung in den RA– Kulturen auch nach dem Weglassen von IL-3 zur Verringerung der Vermehrung von Myeloid-Zellen nicht nachgewiesen. Das Fehlen einer CD19+ B-Zellenbildung in RA– Kulturen kann auf eine langsame Differenzskinetik zurückzuführen sein. Tatsächlich gibt es einen frühen B-Zellen-Vorläufer in der RA– Untergruppe, weil diese Untergruppe, wie weiter oben angegeben, zu einer Aufpfropfung in SCID-hu-Knochen mit anhaltender Bildung von aus dem Donor stammenden B-Zellen (3) fähig war. Im Gegensatz dazu scheinen RA+ Zellen einen späteren B-Zellen-Vorläufer zu enthalten, der leicht differenzierte und in vitro sich vermehrte, jedoch nicht in der Lage war zu einer Langzeit-Repopulation von Knochenmark.
  • Eine beträchtliche B-Lymphoid-Differenzierung wurde in mit IL-3, IL-6 und LIF stimulierten Knochenmarks-Kulturen festgestellt, die mit CD34+Lin–CD10+ Zellen initiiert worden waren (Tabelle 6). Nach 3 Wochen enthielten diese Kulturen 8 bis 76% CD19+ B-Zellen, die im übrigen kein CD34 enthielten, CD10 exprimierten und die Eigenschaften (Größe und Granularität) von Lymphoid-Zellen aufwiesen (Tabelle 6 und 5). Diese Daten bestätigen, dass CD34+Lin–CD10+ ABM-Zellen als B-Zellen-Vorläufer dienen können und sie zeigen an, dass ihr B-Zellen-Vorläufer-Potential ausgeprägter ist als dasjenige ihres CD10– Gegentücks.
  • Beispiel 5
  • T-Lymphoidpotential von CD45RA-Untergruppen
  • 1. SCID-hu Thymus-Assay
  • Eine HLA-Immunophänotypisierung des Empfänger-Thymus und der Donor ABM-Zellen wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Fragmente von fetalen Thymi wurden auf Nitrocellulose-Filter (0,8 μm, Costar Corp., Cambridge, MA) auf die Oberseite von Gelatine-Platten (Gelfoam, Upjohn) gelegt nach den von Galy et al. (1993) beschriebenen Verfahren. Nach 7- bis 13-tägiger Inkubation bei 25°C und mit 5% CO2 wurden die Thymus-Fragmente mit 250 cGy aus einer 137Cs Quelle bestrahlt (J. L. Shepherd & Associates), gewaschen und sofort mit den HLA-fehlangepassten aussortierten Zellen in einem 1 μl-Volumen mikroinjiziert unter Verwendung eines mit Öl gefüllten Mikroinjektors (Narishige) und unter Verwendung von Glas-Mikropipetten mit einem Durchmesser von 1 mm (World Precision Instruments). Fragmente wurden zurück auf die Filter gelegt und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert und dann unter die Nierenkapsel von anästhesierten 6 bis 8 Wochen alten, in den Anlagen der Erfinder gezüchteten SCID-Mäusen inseriert. Die Mäuse wurden 6 bis 7 Wochen nach der Transplantation getötet und die Thymus-Transplantate wurden entnommen, zerkleinert zur Bildung einer Einzelzellen-Suspension und einer Drei-Farben-Immunofluoreszenz-Analyse auf dem FACScan unterzogen. Es wurden die fol genden MAbs verwendet: FITC anti-HLA-Antikörper, -CD2 oder inelevante Maus-IgG1-Kontrolle, PE W6/32, Anti-CD1a (Coulter), Anti-CD4 oder Maus-IgG1-Kontrolle (Becton Dickinson) und Dreifarben (TC)-konjugierte Anti-CD45, -CD8, -CD3 oder inelevante Maus-IgG1 Kontrolle (Caltag).
  • Das T-Vorläufer-Zellenpotential wurde in dem SCID-hu Thymus-Assay getestet, von dem gezeigt wurde, dass er die intrathymale T-Zellen-Differenzierung von CD34+Lin– Zellen unterstützt, die aus fetalem und adultem Knochenmark sowie aus adultem mobilisiertem peripherem Blut isoliert worden waren (DiGiusto et al. (1994) und Galy et al. (1994)). Abnehmende Anzahlen von Zellen von entweder RA+ oder RA– Untergruppen wurden in Thymus-Transplantate injiziert, die gewonnen und 6 bis 7 Wochen nach der Transplantation in SCID-Mäuse analysiert wurden. In beiden Untergruppen wurden T-Zellen aufgepfropft und gebildet; es war jedoch klar, dass die RA+ Untergruppe erfolgreicher kontinuierlich aufgepfropft wurde, insbesondere bei niedrigen Zellenzahlen (2 bis 3000 Zellen pro Transplantat) (6). Die Qualität der aus dem Donor stammenden Thymopoese wurde in jedem Transplantat durch 3-Farben-Inununofärbung geprüft. Beide RA+ und RA– Untergruppen ergaben Donor-Thymozyten, die zum größten Teil hohe Gehalte an CD1 exprimierten, CD4 und CD8 gleichzeitig exprimierten und eine abgestufte Expression für CD3 aufwiesen. Reife T-Zellen, die den αβ- oder γδ-TCR trugen, konnten aus Thymus-Transplantaten, die mit RA+ Zellen wie beschrieben rekonstituiert worden waren, vermehrt werden (Galy et al. (1994)).
  • Die Thymus-Reifung steht im Zusammenhang mit einem Anstieg von CD3, einem Verlust von CD1 und der gemeinsamen Expression von CD4- und CD8-Antigenen (Galy et al. (1993) und Terstappen et al. (1992)). Eine sorgfältige Prüfung dieser Parameter zeigt keine signifikante Differenz in bezug auf den Phänotypus der aus RA+ oder RA– Untergruppen gebildeten Thymozyten. Deshalb erlaubte der SCID-hu Thymus-Assay, wie er derzeit konzipiert ist, keine Unterscheidung zwischen frühen und späten T-Vorläufer-Zellen innerhalb des geprüften Zeitrahmens (6 bis 7 Wochen nach der Injektion).
  • Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass RA+ Zellen späte Vorläufer für die Myeloid- und B-Zellinien enthalten und eine starke T-Vorläufer-Zellen-Aktivität aufweisen. Die RA– Untergruppe weist ein primitives Potential für die Erythroid-, Myeloid- und B-Zellen-Linien auf und enthält ebenfalls eine 7-Vorläufer-Zellen-Aktivität, wenn auch in einer geringen Häufigkeit, im Vergleich zu RA+ Zellen.
  • 2. Expression von Thy-1, CD38 oder HLA-DR und T-Vorläufer-Zellen-Aktivität
  • Eine praktische Konsequenz dieser Ergebnisse besteht darin, dass das Vorliegen einer T-Vorläufer-Zellen-Aktivität aus der in der 2 dargestellten Phänotypen-Analyse abgeleitet werden kann. Da RA+ Zellen eine T-Vorläufer-Zellen-Aktivität aufweisen und gleichzeitig nahezu vollständig positive CD38 und HLA-DR sind, kann daraus logisch abgeleitet werden, dass die Aktivität in den CD38+- oder HLA-DR+-Abteilen liegen sollte. Die Ergebnisse, die dies bestätigen, sind in der Tabelle 7 dargestellt. In der Tabelle 7 ist der Aufpfropfungs-Erfolg ausgedrückt als das Verhältnis zwischen den Transplantaten, die positiv für Donor-Zellen sind (>1%), und der Anzahl der analysierten Transplantate.
  • Tabelle 7
    Figure 00300001
  • Thy-1 ist ein Marker, der auf sehr primitiven hämatopoetischen Zellen in fetalem und adultem Knochenmark und im Nabelschnurblut exprimiert wird (Baum et al. (1992); Craig et al. (1994) und Mayani and Lansdorp (1994)) Sowohl CD34+Lin–Thy-1+- als auch CD34+Lin–Thy-1– ABM-Zellen können T-Zellen bilden. Das phänotyische Profil, das in der 2 dargestellt ist, zeigt, dass das T-Zellen-Rekonstitutionspotential von Thy-1– Zellen möglicherweise zurückzuführen ist auf die Anwesenheit von RA+ Zellen. Um diese Hypothese zu testen, wurden aussortierte CD34+Lin–CD45RA+Thy-1– Zellen in dem SCID-hu-Thymussystem untersucht und sie zeigten ein gutes T-Zellen-Rekonstitutionspotential, selbst wenn eine geringe Anzahl von Zellen verwendet wurde (Tabelle 7). Die T-Zellen-Rekonstitutionsaktivität der kleinen Untergruppe von Zellen, die CD45RA und Thy-1 tragen, wurde nicht getestet. Andererseits weisen CD34+Lin–CD45RA–Thy-1+ Zellen ein gutes T-Zellen-Rekonstitutionspotential auf. Diese Zellen sind auch sehr stark angereichert an primitiver hämatopoetischer Aktivität, wie gezeigt durch die Aufrechterhaltung von CD34+Lin– und CD34+CD45RA– Zellen in einer Kultur mit einem sekundären Klon-bildenden Potential CFU-mix und BFU-E (Tabelle 3). Bei allen getesteten Untergruppen (Thy-1+, Thy-1–, CD38+, HLA-DR+) war die Thymopoese qualitativ äquivalent zu derjenigen, die von RA+ Zellen gebildet wurde im Hinblick auf die CD1-, CD3-, CD4- und CD8-Expression nach 6 Wochen.
  • Wenn 10+ Zellen in Thymus-Fragmente injiziert wurden, wurde eine T-Zellen-Rekonstitution auch dann festgestellt, wenn eine geringe Anzahl von Zellen getestet wurde (2 000 Zellen). Nach 6 Wochen trat bei von einem Donor stammenden Thymozyten eine Coexpression von CD4 und CD8 mit einer hohen CD1a- und abgestuften Expression von CD3 auf, wie bei den Thymozyten ersichtlich, die von anderen Untergruppen stammten (7). Diese 10+ Population scheint daher am stärksten auf die Lymphoid-Zellinien festgelegt zu sein.
  • In dem SCID-hu-Thymus-Assay wurde das T-Zellenpotential in den RA–, RA+ und 10+ Untergruppen gefunden. Wie oben angegeben, konnte die hierarchische Beziehung zwischen RA–, RA+ und 10+ Zellen nicht abgeleitet werden von den qualitativen Unterschieden in bezug die T-Zellen-Progenie, weil nach 6 Wochen die rekonstituierten Thymus-Transplantate vergleichbare Anteile von CD1-, CD3- und doppelt positiven CD4/CD8 Zellen in dem von Donor stammenden Abteil aufwiesen.
  • Es wurden Kinetik-Untersuchungen durchgeführt, um das T-Zellen-Rekonstitutionspotential von 10+ Zellen und CD34+Lin–CD10– (10–) Zellen zu überprüfen. Es wurde gefunden, dass sowohl 10+ als auch 10– Zellen Thymus-Transplantate repopulieren konnten und unreife Thymozyten bilden konnten (Expression hoher Gehalte an CD1a) bis zu 8 Wochen nach der Zellinjektion. Es scheint jedoch, dass bei der Rekonstitution zwischen 8 und 11 Wochen die Transplantate mit injizierten 10+ Zellen aufhörten, unreife T Zellen zu bilden und nur phänotypisch reife Thymozyten enthielten (CD1–, CD4+ oder CD8+ und CD3hell)(8).
  • Zusammengenommen zeigen diese Daten eindeutig, dass 10+ Zellen die reifsten Zellen sind und stark festgelegt sind auf die Lymphoid-Differenzierung.
  • Beispiel 6
  • NK-Vorläuferzellen-Potential von CD45RA-Untergruppen
  • Es wurde vor kurzem gezeigt, dass NK-Zellen aus Knochenmarkszellen mit IL-2 und Stroma differenziert werden können (Miller et al. (1992) "Blood" 80: 2182–2187, und Lotzová et al. (1993) "J. Immunol." 150: 5263-5269). Die Fähigkeit der Maus-Stroma-Zelllinie AC6.21, die NK Zellen-Differenzierung zu unterstützen, wurde geprüft. Zellen, die wie in Beispiel 1 beschrieben zu CD34+Lin– Untergruppen sortiert worden waren, wurden wie nachstehend angegeben in bezug auf die NK Zellen-Differenzierung untersucht.
  • In vitro Co-Kultur von AC6.21 Zellen für die NK-Zellen-Differenzierung
  • Zur Durchführung von NK Zellen-Assays wurden sortierte Zellen auf vorher gebildeten AC6.21 Monoschichten in IMDM mit 10% FCS, 40 μg/ml Transferrin (Boehringer Mannheim), 5 μg/ml Insulin (Sigma), ergänzt durch 50 ng/ml rekombinantem Human IL-2 (Sandoz Pharma, Basel, Schweiz) ausgestrichen. Nach 1 Woche wurde die Hälfte des Mediums durch ein Medium ersetzt, das rhIL-2 (50 ng/ml) enthielt. Anschließend wurde das IL-2 enthaltende Medium zweimal pro Woche mindestens zwei Wochen lang ausgetauscht, um das Verschwinden der Stroma-Zellen zu ergänzen. Die Zellen wurden durch Pipettieren geerntet, ausgezählt und immun gefärbt mit PE-konjugiertem Anti-CD56 und FITC-konjugiertem Anti-CD3 MABs oder ihren geeigneten Negativ-Kontrollen (Becton Dickinson). Die Zellen wurden analysiert auf einem FACScan Fluoreszenz-Zellenanalysator (Becton Dickinson).
  • Unter diesen Bedingungen entwickelten sich innerhalb von 2 bis 3 Wochen die RA+ Zellen zu Lymphoblasten, die CD56, nicht jedoch CD3 exprimierten (9 und 10). Eine positive Expression für CD56 und ein Mangel an nachweisbarer Oberflächen-Expression von CD3 ist typisch für NK-Zellen (Lanier et al. (1992) "Immunology Today" 13: 392–395). RA+ Kulturen zerstörten im Allgemeinen ihre unterstützende Stromaschicht innerhalb der ersten zwei Wochen, wie von Miller et al. (1992) beschrieben. Außerdem kann die 10+ Untergruppe, die nahezu kein Myeloid-Potential, jedoch eine T- und B-Zellen-Vorläufer-Aktivität aufweist, wie in Beispiel 2 beschrieben, NK-Zellen bilden (11). Die in der Kultur gebildeten CD56+CD3– NK-Zellen zerstörten ebenfalls das Stroma.
  • Die RA– Untergruppe führte jedoch nicht zu einer sehr wirksamen Entstehung von NK-Zellen innerhalb der geprüften Zeitspanne (bis zu 7 Wochen). Nach 3 Wochen enthielten die Kulturen einen großen Mengenanteil (>90%) an CD33+ Myeloid-Zellen, die sich in den letzten 6 Wochen nicht sehr gut vermehrt hatten. Einige wenige NK-Zellen waren gelegentlich in der RA– Kultur zu erkennen, ihr Mengenanteil war jedoch stets sehr niedrig im Vergleich zu den RA+10– und 10+ Kulturen.
  • Es wurden Grenzverdünnungsversuche durchgeführt, um die Häufigkeit von Zellen, die in diesem Assay ansprechen, zu bestimmen. Wachstums-Plattenvertiefungen wurden visuell in der Woche 6 im Hinblick auf das Vorliegen von lymphoblastischen Zellen bewertet und die Bewertung wurde durch Immunfärbung der Zellen bestätigt, die CD56 exprimierten, nicht jedoch CD3 (Tabelle 8).
  • Tabelle 8 6 Woche alte NK Kultur
    Figure 00320001
  • In drei voneinander unabhängigen Versuchen wurde gezeigt, dass RA+ (10+ und 10–)-Zellen NK-Zellen bilden, während RA– Zellen dies sehr viel weniger wirksam taten. Die Differenzierung von NK-Zellen in diesem System wurde bestätigt, da die Ausgangs-RA+ Population CD56 nicht exprimierte. Außerdem schien die hohe Häufigkeit der NK-Vorläufer in der RA+ Population nicht mit der Vermehrung von reifen Zellen kompatibel zu sein angesichts der Reinheit der Sorten nach der erneuten Analyse (>90%). Außerdem wurden die RA+10– Zellen zwei Sortierungsdurchgängen unterzogen gegen positive Zelllinien-Zellen, die frei von reifen CD56+ NK-Zellen waren. Die geringere Häufigkeit der NK-Vorläufer in der RA– Untergruppe ist wahrscheinlcih zurückzuführen auf ihre Unreife sowie auf die Maskierung durch den hohen Anteil von Zellen, die nicht auf die Lymphoid-Zelllinie festgelegt waren. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden 3 Wochen alte AC6.21 Co-Kulturen, die mit RA– Zellen initiiert worden waren, immun gefärbt mit Anti-CD34 plus Anti-CD45RA Antikörpern und die kultivierten Zellen wurden zu CD34+Lin–CD45RA– und CD34+Lin–CD45RA+ Untergruppen sortiert. Die Anreicherung an BFU-E und CFU-mix-Aktivitäten waren begrenzt auf die sortierten CD34+CD45RA– Zellen und wiederum wurden überwiegend NK-Zellen von der sortieren CD34+CD45RA– Progenie gebildet.
  • Diese Ergebnisse zeigen eine gute Korrelation zwischen der Aufrechterhaltung des Phänotypus und der Funktion. Dies unterstützt das Faktum, das RA– Zellen unreifer und die unmittelbaren Vorläufer oder RA– Zellen-Untergruppen sind.
  • Bei allen durchgeführten Versuchen (n = 6) wurde innerhalb einer 1- bis 2-wöchigen Kultivierung auf der Maus-Knochenmarks-Stroma-Zelllinie AC6.21 in Gegenwart von IL-2 eine Differenzierung von ABM CD34+Lin– CD10+ Zellen zu CD34–CD56+CD3– NK Zellen erzielt. Das NK-Differenzierungspotential von CD34+Lin–CD10+ Zellen bestätigt durch hochgereinigte Zellen, die nach zwei aufeinanderfolgenden Sortierungsdurchgängen unter Anwendung der Durchfluss-Zytometrie erhalten wurden.
  • In den CD34+Lin–CD10+ Kulturen wurden keine monozytischen/Myeloid-Zellen festgestellt, obgleich diese Kultivierungs-Bedingungen die Bildung von monozytischen/Myeloid-Zellen in Kulturen von CD34+Lin–CD10– Zellen unterstützen. Die CD56+CD3– NK-Zellen, die von CD34+Lin–CD10+ Zellen abstammten (11, Schaubild A) waren funktionell, was durch die dosenabhängige Abtötung von NK-empfindlichen K562 Target-Zellen nach dem Verfahren, wie von Sanchez et al. (1994) in "J. Exp. Med." 180: 569 beschrieben, demonstriert wurde (11, Schaubild B). Durch eine Grenzverdünnungs-Analyse nach dem Verfahren von Taswell (1981), beschrieben in "J. Immunol." 126: 1614, einer ABM-Probe wurde eine höhere Häufigkeit von NK-Vorläufern mit CD34+Lin–CD10+ Zellen erhalten (1/75), verglichen mit CD34+Lin–CD10– Zellen (1/325) (11, Schaubild C). Kinetische Untersuchungen zeigen, dass CD56+CD3– NK-Zellen in Kulturen früher auftraten, die mit CD34+Lin–CD10+ Zellen entionisiert wurden (phänotypisch nachweisbar in der Kultur am Tag 9) als in Kulturen von CD34+Lin–CD10– Zellen (nicht phänotypisch nachweisbar in der Kultur vor dem Tag 16). CD34+Lin–CD10+ Zellen haben somit eine größere Fähigkeit, NK-Zellen zu bilden als der Rest der CD34+Lin–ABM Zellen.
  • Zusammenfassend wurden zwei neue Erkenntnisse im Hinblick auf NK-Zellen vorgestellt. Ersten wird gezeigt, dass eine AC6.21 Maus-Zellinie die Differenzierung von NK-Zellen aus adultem Human-Knochenmark in Gegenwart von IL-2 unterstützen kann. Zweitens weist die kleine Population von CD34+Lin–CD10+ Zellen ein NK-Differenzierungspotential zusätzlich zu einer B- and T-Zellen-Vorläufer-Aktivität auf, ist aber praktisch frei von einer Myeloid-Aktivität. Dies stimmt damit über ein, dass die Population ein Präthymus-Lymphoid-Vorläufer ist.
  • Beispiel 7
  • Hierarchie des Lymphoid-Vorläuferpotentials
  • Die hier angegebenen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass RA– Zellen unreifer sind als RA+ Zellen in den B-, Myeloid- und Erythroid-Zelllinien und dass RA+ Zellen direkt von RA– Zellen abstammen. Die Beziehung zwischen den 10+ und RA+ Untergruppen wurde dann untersucht, um ein hierarchisches Modell der Lymphoid-Entwicklung davon abzuleiten. Nach zwei aufeinanderfolgenden Sortierungen wurden drei Untergruppen CD34+Lin–CD10+, CD34+Lin–CD10– CD45RA+ und CD34+Lin–CD10–CD45RA– erhalten und in den B- und 7-Zellen-Differenzierungs-Assays getestet. Wie erwartet, bildeten die RA–CD10– Zellen keine nachweisbaren CD19+ B-Zellen nach dreiwöchiger Kultivierung mit AC6.21 Zellen und IL-3, IL-6 und LIF.
  • Andererseits differenzierten sowohl CD10+ Zellen als auch RA+CD10 – Zellen zu CD19+ und CD10+ B-Zellen (5). Außerdem wurde festgestellt, dass die RA+CD10– Kulturen eine kleine Untergruppe von CD34+CD10+ Zellen bilden, wodurch die direkte Beziehung zwischen diesen beiden Untergruppen gezeigt wurde.
  • Beispiel 8
  • Bestimmung der Anwesenheit von dendritischen Zellvorläufern
  • In den vorhergehenden Beispielen wurden stets größere Zellen, die CD33 exprimieren, beobachtet, selbst in den Knochenmarks-Kulturen, die mit hochgereinigten CD34+Lin–CD10+ Zellen initiiert wurden, die vollständig frei von Klon-bildenden Vorläuferzellen waren (Tabelle 9). In allen Versuchen war jedoch der Anteil an CD33+ Zellen beträchtlich geringer als in den Kulturen von CD34+Lin–CD10– Zellen. Um das Differenzierungspotential von CD34+Lin–CD10+ Zellen vollständig zu erforschen, wurden flüssige Kulturen mit 9 Cytokinen (IL-1, IL-3, IL-6, IL7, KL, GM-CSF, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), FLT3/FLK2-Ligand (FL) und EPO) initiiert, um die Entwick lung eines breites Spektrums von hämatopoetischen Zellen zu unterstützen. ABM CD34+Lin–CD10 (CD10+ und CD10–) Zellen-Untergruppen wurden bei 2 000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden in einem IMDM-Medium inkubiert, das ergänzt wurde durch rekombinantes Human-IL-3, IL-6, GM-CSF (jeweils in einer Menge von 25 ng/ml) (Sandoz Pharma), IL-7 (10 ng/ml) (Genzyme, Cambridge, MA), IL-1 (5 ng/ml), TNF (25 ng/ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), EPO (2 U/ml), KL (10 ng/ml) (R & D Systems), FL (10 ng/ml) (gereinigt nach der Expression in Pichia pastoris von Sequenzen, publiziert in Hannum et al. (1994) "Nature" 368: 643). Die Kulturen wurden bei 37°C, 5% CO2/95% Luft inkubiert und das Medium wurde zweimal pro Woche zur Hälfte entnommen. Die Kulturen wurden initiiert mit CD34+Lin–CD10 Untergruppen (CD10+ und CD10–) und nach 12 bis 20 Tagen wurden die kultivierten Zellen in einem direkten Zwei-Farben-Verfahren unter Verwendung von Fluorescein oder PE-konjugiertem mAbs angefärbt, wie in 12 dargestellt. Die Ergebnisse in der Tabelle 9 sind ausgedrückt als Prozentsatz der für den Marker positiven Zellen (nach der Subtraktion der Hintergrundfärbung mit einer irrelevanten IgG1 + IgG2a Kontrolle) und der mittleren Fluoreszenz-Intensität (mfi) der positiven Zellpopulation. Die Analyse wurde durchgeführt durch Anwendung eines identischen lebenden (Propidiumiodid negativ) oder Vorwärts/Streuungs-Gitters auf Kulturen von CD10+ und CD10– Zellen aus dem gleichen Versuch. In der Tabelle 9 steht N/A für nicht anwendbar und N. T. steht für nicht getestet.
  • Figure 00350001
  • In diesen Kulturen wuchsen CD34+Lin–CD10+ Zellen bescheiden (die gesamte Zellenvermehrung war um das 5- bis 10-fache geringer als bei den Kulturen, die mit CD34+Lin–CD10– Zellen initiiert worden waren) und in allen Fällen differenzierten sie ausschließlich zu Zellen mit den morphologischen (13A) und immunphänotyischen Merkmalen (Figur 12-A-B-C-D und Tabelle 9), die mit dendritischen Zellen (DC) verbunden sind (Steinman (1991) "Ann. Rev. Immunol." 9: 271). In 10+ Kulturen, die Zellen mit sehr hohen Vorwärts- und Seitwärts-Streuungseigenschaften enthielten (12A) exprimierten 40 bis 63% der Zellen sehr hohe Gehalte an HLA-DR, 23 bis 42% der Zellen wiesen eine helle Expression von CD1a auf, 18 bis 26% der Zellen ergaben niedrige Gehalt an CD15, während keine Expression des Monozyten-Antigens CD14 auftrat. Die Variabilität in bezug auf Größe und CD1a-Expression stand in Übereinstimmung mit der Mikroheterogenität innerhalb der DC-Populationen (Steinman (1991)).
  • Unter identischen Versuchsbedingungen wuchsen CD34+Lin–CD10– Zellen stark (Zellenvermehrung auf das 60- bis 95-fache innerhalb von 12 bis 15 Tagen) und differenzierten zu einer morphologisch heterogenen Mischung von Myelozyten, Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, Erythroblasten, DC- und Mastzellen (13B) mit verschiedenen Streuungseigenschaften (12E). Diese Beobachtungen bestätigen, dass die Kultivierungs-Bedingungen die Differenzierung zu einer breiten Gruppe von Zellen, die zu multiplen hämatopoetischen Zelllinien gehören, unterstützten. Eine immunphänotypische Analyse von CD34+Lin–CD10– Kulturen zeigte, dass 19 bis 24% der Zellen hohe Gehalte von CD14 exprimierten, 20 bis 30% der Zellen CD15 aufwiesen, 27 bis 51% der Zellen HLA-DR exprimierten, wenn auch in niedrigeren Gehalten als auf den Zellen in Kulturen von CD34+Lin– CD10+ Zellen und dass sehr wenige (0 bis 2%) Zellen CD1a exprimierten.
  • Beispiel 9
  • Die Differenzierung von Zellpopulationen in der megakaryozytischen Zelllinie wurde bewertet durch Ansetzen einer flüssigen Kultur, ergänzt durch Mpl-Liganden/Thrombopoietin und IL-3, beides starke Induktionsmittel für die Megakaryozyten-Entwicklung (Kaushansky et al. (1994) "Nature" 369: 568). ABM CD34+Lin–CD10 (CD10+ und CD10–) Zell-Untergruppen wurden 7 Tage lang in Gegenwart von gereinigtem rekombinantem Human-IL3 (10 ng/ml) und 10% Überstandsflüssigkeit von Cos-7-Zellen, die mit Mpl-Liganden cDNA-Sequenzen transfektiert waren, die von Bartley et al. (1994) in "Cell" 77: 1117, erhalten wurden, in IMDM mit 5% Humanplasma kultiviert. Das Medium wurde innerhalb von 7 Tagen zweimal ausgetauscht. Unter diesen Kultivierungs-Bedingungenen überlebten die meisten CD34+Lin–CD10+ Zellen nicht (Lebensfähigkeit 16% mit Trypan-Blau-Ausschluss), während die CD10– Gegenstücke (Lebensfähigkeit 98%) sich zu Megakaryoblasten differenzierten.
  • Zusammenfassend zeigen die Daten, dass CD34+Lin–CD10+ Zellen nicht in der Lage sind, Erythroid-, monocytische, granulozytische und megakaryozytische Zellen zu bilden, dass sie jedoch sich zu DC- und allen Klassen von Lymphoid-Zellen differenzieren können.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Erlangung einer Zusammensetzung, die sich aus hämatopoetischen Zellen zusammensetzt, welche auf lymphoide, dendritische und/oder myeloide Vorläuferzellen angereichert sind, worin die Zellen im wesentlichen unfähig sind zur Differenzierung in erythroide Zellen, gekennzeichnet durch Auftrennung eines Gemisches aus humanen hämatopoetischen Zellen in eine angereicherte Zellfraktion, die die Oberflächenmarker CD34 und CD45RA exprimiert, aber im wesentlichen nicht CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 und Glycophorin exprimiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die angereicherte Zellfraktion ferner CD10 exprimiert.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die angereicherte Zellfraktion nicht CD10 exprimiert.
  4. Zusammensetzung, die angereicherte humane hämatopoetische Vorläuferzellen umfaßt, die die Oberflächenmarker CD34 und CD45AR exprimieren, aber im wesentlichen nicht CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 und Glycophorin exprimieren.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Zellen ein rekombinantes DNA Molekül enthalten, das ein Polypeptid kodiert, das sich aus einer antigenspezifischen Region zusammensetzt und zur Transduktion eines Signals fähig ist, wenn es in einer reifen Zelle exprimiert wird.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das rekombinante DNA Molekül einen T-Zellrezeptor oder ein chimäres Protein kodiert, das eine funktionelle Signaltransduktionsregion und eine Antigenbindungsstelle umfaßt, die von einem Antikörper abgeleitet ist.
  7. Verfahren zur Erlangung von biologischen Reaktionsmodifikationsmitteln, die bei der myeloiden, lymphoiden und/oder denritischen Vorläuferzellproliferation und/oder -differenzierung beteiligt sind, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe eines biologischen Reaktionsmodifikationsmittels auf dessen Effekt auf die Proliferation und/oder Differenzierung von humanen hämatopoetischen Zellen getestet wird, die die Zelloberflächenmarker CD34 und CD45RA exprimieren, aber im wesentlichen nicht CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 und Glycophorin exprimieren.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die angereicherte Zellfraktion ferner CD10 exprimiert.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, worin die angereicherte Zellfraktion nicht CD10 exprimiert.
  10. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Zuständen, die eine vorübergehende Repopularisierung von lymphoiden, myeloiden und/oder dendritischen Zellen erfordert.
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