ES2201102T3

ES2201102T3 - Poblaciones de celulas enriquecidas en progenitores mieloides y/o linfoides y metodos de elaboracion y uso.

Info

Publication number: ES2201102T3
Application number: ES95914698T
Authority: ES
Inventors: Anne H. M. Galy; James J. Mule
Original assignee: Systemix Inc
Current assignee: Systemix Inc
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2015-03-09
Also published as: EP0765398A1; DE69530980T2; WO1995034676A1; DK0765398T3; PT765398E; EP0765398B1; ATE242335T1; AU2158295A; JP2006122054A; JP3957746B2; JPH10505483A; DE69530980D1; EP0765398A4

Abstract

LA INVENCION SE RELACIONA CON METODOS DE ENRIQUECIMIENTO PARA POBLACIONES CELULARES HEMATOPOYETICAS, ENRIQUECIDAS EN CELULAS PRECURSORAS LINFOIDES Y/O MIELOIDES, BASADOS EN MARCADORES CELULARES ESPECIFICOS. LOS METODOS PROPORCIONAN TAMBIEN UNA POBLACION ENRIQUECIDA EN PRECURSORES LINFOIDES PRETIMICOS, Y DESPROVISTA DE POTENCIAL DE RECONSTITUCION HEMATOPOYETICA A LARGO PLAZO. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA LAS COMPOSICIONES ENRIQUECIDAS EN DICHAS CELULAS, Y LAS POBLACIONES CELULARES OBTENIDAS A PARTIR DE LAS MISMAS. TAMBIEN ABARCA LOS METODOS DE UTILIZACION DE DICHAS CELULAS. SE PROPORCIONAN METODOS DE MODIFICACION GENETICA DE DICHAS CELULAS, Y LAS CELULAS ASI OBTENIDAS.

Description

Población de células enriquecidas en progenitores mieloides y/o linfoides y métodos de elaboración y uso.

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos de enriquecimiento para poblaciones de células hematopoyéticas enriquecidas en células progenitoras mieloides y/o linfoides basados en marcadores específicos para las células. Los métodos también proporcionan poblaciones de células enriquecidas en progenitores que tienen capacidad diferenciativa linfoide. También son proporcionadas por la invención composiciones enriquecidas en las células y poblaciones de células obtenidas a partir de las mismas. También se incluyen métodos de uso de las células.

Antecedentes de la invención

Las células hematopoyéticas (sanguíneas) de mamífero proporcionan una gama diversa de actividades biológicas. Las células hematopoyéticas se dividen en los linajes linfoide, mieloide y eritroide. El linaje linfoide, que comprende células B, T y asesinas naturales (NK), proporciona la producción de anticuerpos, la regulación del sistema inmunitario celular, la detección de agentes extraños en la sangre, la detección de células extrañas al huésped, y similares. El linaje mieloide, que incluye monocitos, granulocitos, megacariocitos, así como otras células, controla la presencia de cuerpos extraños, proporciona protección contra células neoplásticas, elimina materiales extraños, produce plaquetas, y similares. El linaje eritroide proporciona los glóbulos rojos, que actúan como portadores de oxígeno.

A pesar de la diversidad de la naturaleza, la morfología, las características y la función de las células hematopoyéticas, se cree actualmente que estas células se derivan de una sola población de células, denominada "células madre" hematopoyéticas. A diferencia de las células sanguíneas más "maduras", las células madre son capaces de autorregeneración pero además también pueden dividirse en células progenitoras que ya no son pluripotentes y tienen una autorregeneración limitada. Estas células progenitoras se dividen repetidamente para formar células más maduras que finalmente se diferencian terminalmente para formar las diversas células hematopoyéticas maduras. Así, el gran número de células hematopoyéticas maduras se deriva de una pequeña reserva de células madre mediante un proceso de proliferación y diferenciación.

Las células progenitoras maduran en células bipotenciales que a continuación se comprometen a un linaje, esto es, son incapaces de madurar en más de un linaje. El uso de las palabras progenitor o células progenitoras indica poblaciones de células que ya no son células madre pero que todavía no se han diferenciado terminalmente. El uso de la palabra linfoide, mieloide o eritroide junto con progenitor indica las poblaciones de células potenciales en las que el progenitor es capaz de madurar.

Las poblaciones altamente purificadas de células madre actualmente encuentran uso en la repoblación de todo el sistema hematopoyético. Las células progenitoras purificadas de linajes individuales encontrarían uso para repoblar o aumentar los diversos linajes. Como no se cree que los progenitores sean intensamente autorregenerativos, la repoblación o el aumento estaría limitado.

Las células madre y las células progenitoras constituyen sólo un pequeño porcentaje del número total de células hematopoyéticas. Las células hematopoyéticas son identificables por la presencia de una variedad de "marcadores" proteínicos de la superficie celular. Tales marcadores pueden ser específicos para un linaje particular o estar presentes en más de un tipo de célula. Los marcadores también cambian con las fases de la diferenciación. Actualmente, no se sabe cuantos de los marcadores asociados con células diferenciadas también están presentes en células madre y progenitoras. Un marcador, CD34, se encuentra en células madre y en un número significativo de progenitores. La Patente de EE.UU. Nº 5.061.620 describe una composición que comprende células madre humanas.

La Tabla 1 resume fenotipos probables de células madre en sangre fetal, de adulto y periférica movilizada. Según se usa aquí, tanto ulteriormente, previamente como en la Tabla 1, el signo negativo o el signo negativo como superíndice (^{-}) significa que el nivel del marcador específico es indetectable por encima de los controles del isotipo Ig mediante análisis de citometría de flujo, y puede incluir células con expresión muy baja del marcador especificado que estarán por debajo del umbral de sensibilidad de la técnica.

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La serie exacta de etapas de diferenciación que se produce a partir de células madre hasta el compromiso del linaje y hasta la diferenciación terminal es desconocida; asimismo, no se han caracterizado bien las diversas subpoblaciones de células implicadas.

Los linfocitos son células hematopoyéticas altamente especializadas. Durante el desarrollo de los linajes linfoides B y T, la diferenciación fenotípica y molecular de células primitivas conduce a fases maduras en las que se produce la reordenación de los receptores de antigenos linfocíticos, a saber las cadenas de inmunoglobulina (Ig) o receptores de células T (TCR). Van Noesel y Liere (1993) Blood 82:363-373; y Godfrey y Zlotnik (1993) Immunol. Today 14:547-553. El compromiso al linaje de células B, la expresión del complejo receptor de células B y la reordenación génica de Ig tienen lugar en la médula ósea o el hígado fetal. Uckun (1990) Blood 76:1908-1923; y Li y otros (1993) J. Exp. Med. 178:951-960.

En el hombre, los análisis intensivos de leucemias, hígado fetal y médula ósea han mostrado que la población reconocible más temprana de células comprometidas al linaje B expresa los marcadores CD34, HLA-DR y CD10 y tiene actividad de desoxinucleotidil transferasa terminal intranuclear con genes de Ig en la configuración de la línea germinal. Uckun (1990). El marcador CD19 se expresa subsiguientemente y permanece expresado a través de la mayoría de las fases tardías de la diferenciación de células B, fases que se identifican adicionalmente por la expresión de una ordenación de marcadores, incluyendo Ig superficial. El marcador CD2 se encuentra transitoriamente en precursores de células B primarios en el momento de la expresión de CD19, de modo que el precursor de células B más temprano puede identificarse mediante la expresión de CD34 y CD10 pero en ausencia de CD19 y CD2. Uckun (1990). CD10, o CALLA, es una endopeptidasa neutra expresada por varias células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. LeBien y McCormack (1989) Blood 73:625.

Al contrario que la diferenciación de células B, el desarrollo de células T requiere el paso de células progenitoras T a través de la glándula del timo para alcanzar una reordenación de receptores de células T (TCR) y una restricción del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) eficaces. En la fase tímica, las células T inmaduras se denomina timocitos. Las fases intratímicas del desarrollo de células T se ha estudiado intensivamente en ratones y hasta una extensión menor en el hombre. Godfrey y Zlotnik (1993); Galy y otros(1993) J. Exp. Med. 178:391-401; Terstappen y otros (1992) Blood 79:666-677 y Sánchez y otros (1993) J. Exp. Med. 178:1857-1866. Con el uso de ensayos de diferenciación de células T y la citometría de flujo de múltiples parámetros, se ha observado que el CD34 se expresa en la mayoría de los timocitos inmaduros que carecen de expresión superficial celular de antígenos CD1, CD4, CD8 y CD3. Galy y otros (1993) y Terstappen y otros (1992). Los niveles de CD34 disminuyen a medida que avanza la maduración de células T, como es el caso con la maduración junto con los linajes mieloide, eritroide y de células B. Terstappen y otros 19919 Blood 77:1218-1227. Estudios en animales que usan ratones o quimeras de codorniz/pollo y estudios en el hombre con constructos de hígado fetal y timo implantados en ratones con inmunodeficiencia combinada severa sustitutiva (SCID) han mostrado que se necesita una entrada constante de células hematopoyéticas para apoyar la timopoyesis. Le Douarin y Jotereau (1973) Nature New Biol. 246:25-27; Scollay y otros (1986) Immunol. Rev. 91:129-157 y McCune y otros (1988) Science 241:1632-1639.

La naturaleza del progenitor protimocítico está sin embargo mal definida. En el hombre, células pretímicas con capacidad diferenciadora de células T se han recuperado de diversos tejidos hematopoyéticos. La reconstrucción de células T intratímicas se alcanzan después de la inyección de células CD34^{+} carentes de antígenos específicos para el linaje (Lin^{-}) aislados de hígado fetal (FL). Galy y otros (1993) y Peault y otros (1991) J. Exp. Med. 174:1283-1286. La fraccionación adicional de las células de FL CD34^{+}Lin^{-} ha mostrado que el potencial linfoide T está presente en los subgrupos tanto CD7^{-} como CD7apagado. Bárcena y otros (1993) Blood 82:3401-3414. La diferenciación de células T puede iniciarse con células de la médula ósea fetal (FBM) CD34^{+}Lin^{-} y se encuentra en los compartimentos de CD34^{+}Thy-1^{+} y CD34^{+}Thy-1^{-}. Baum y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2802-2804.

La diferenciación en timocitos también puede alcanzarse con tejidos de adulto. Se ha observado recientemente que células CD34^{+}Lin^{-} aisladas de médula ósea de adulto (ABM) normal o de la sangre periférica movilizada (MPB) con citoquina sometida a aféresis de pacientes con cáncer sufren timopoyesis de novo y subsiguientemente avanzan hacia la maduración completa en células T TCR\alpha\beta^{+} y TCR\gamma\delta^{+}. Galy y otros (1994) Blood 84:104-110.

Se ha presentado recientemente que, después de la inyección en el útero en fetos de oveja, las células CD34^{+}HLA^{-}
Dr^{-} aisladas de ABM humana proporcionan hematopoyesis de múltiples linajes a largo plazo (7 meses), incluyendo la producción de células T y células B maduras. Srour y otros (1993) Blood 82:3333-3342. Estos informes proporcionan una cartografía preliminar de la actividad de células progenitoras T pretímicas, pero la composición fenotípica del conjunto de células progenitoras T así como el ordenamiento jerárquico de sus componentes permanecen en gran parte inexplorados.

En contraste, se ha realizado una fraccionación fenotípica intensiva de células CD34^{+} de ABM para estudiar la mielopoyesis y la eritropoyesis. Terstappen y otros (1991); Baum y otros (1992); Lansdorp y Dragowska (1992) J. Exp. Med. 175:1501-1509; Srour y otros (1991) Blood Cells 17:287-295; Craig y otros (1993) J. Exp. Med. 177:1331-1342 y Udomsakdi y otros (1991) Exp. Hematol. 19:338-342. En particular, las isoformas CD45 han sido marcadores útiles para distinguir las células primitivas de las mieloides comprometidas. Lansdorp y otros (1990) J. Exp. Med. 172:363-366 y US 5061620. Los antígenos CD45 son proteína tirosina fosfatasas que existen en diversas isoformas creadas mediante reparación ("splicing") alternativa. Thomas (1989) Ann. Rev. Immunol. 7:339-369. Las isoformas de alto peso molecular (p205-p220) se han denominado CD45RA y no se expresan en la superficie celular de progenitores primitivos de ABM que tienen actividad celular iniciadora de cultivos a largo plazo(LTCIC). Lansdorp y Dragowska (1992). En contraste, CD45RA se encuentra en progenitores de la médula ósea menos primitivos así como en subgrupos de células maduras que se cree que se correlacionan con propiedades funcionales específicas(células T simples). Sanders y otros (1988) Immunol. Today 9:195-199.

CD45RA también se expresa en una fracción de timocitos, particularmente células en una fase muy primaria de desarrollo intratímico. Deans y otros (1991) J. Immunol. 147:4060-4068. Se ha especulado realmente con el uso de la citometría de flujo de múltiples parámetros que las células progenitoras derivadas de la médula ósea pretímicas inmediatas podrían expresar CD45RA, pero no se ha proporcionado una evidencia funcional. Terstappen y otros (1992).

El marcador de células T definitivo es el receptor de antígeno de células T (TCR). Actualmente hay dos tipos definidos de TCR; TCR-2 es un heterodímero de 2 polipéptidos de transmembrana conectados por disulfuro (\alpha y \beta), TCR-1 es estructuralmente similar pero consiste en los polipéptidos \gamma y \delta. Los polipéptidos \alpha y \beta o \gamma y \delta forman un heterodímero que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno. Estos heterodímeros reconocen el antígeno en asociación con moléculas del MHC sobre la superficie de células que presentan antígenos. Todas estas proteínas contienen una región variable que contribuye al sitio de reconocimiento del antígeno y una región constante que forma el grueso de la molécula e incluye la región de transmembrana y la cola citoplásmica. Ambos receptores están asociados con un complejo de polipéptidos que constituyen el complejo CD3. El complejo CD3 comprende los polipéptidos de transmembrana \gamma, \zeta y \varepsilon. El complejo CD3 media la transducción de señales cuando las células T son activadas por la unión del antígeno al TCR.

Aproximadamente 95% de las células T sanguíneas expresan TCR-2 y hasta 5% tienen TCR-1. Las células que tienen TCR-2 pueden subdividirse además en dos poblaciones distintas que no se superponen, células T CD4^{+} que generalmente reconocen antígenos en asociación con moléculas del MHC clase II y células T CD8^{+} que reconocen antígenos en asociación con moléculas del MHC clase I.

Un número de marcadores es transportado por células B pero no por células T en reposo. La mayoría de las células B llevan antígenoS del MHC clase II que son importantes en la cooperación con células T. También están presentes receptores de Fc para IgG (FcRII, CDw32).

Sumario de la invención

La invención se refiere a métodos para enriquecer poblaciones de células hematopoyéticas enriquecidas en células progenitoras mieloides y/o linfoides y dendríticas. Los métodos también proporcionan poblaciones de células enriquecidas en células progenitoras que tienen potencial diferenciador de células mieloides, linfoides y dendríticas (DC) o linfoides y DC. Las composiciones enriquecidas en las células y las poblaciones de células obtenidas a partir de las mismas también son proporcionadas por la invención. También se proporcionan métodos y composiciones para células genéticamente modificadas. También se proporcionan composiciones de células genéticamente modificadas. También se incluyen métodos de uso de las células.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Diagrama esquemático de la maduración linfoide según se define por los experimento descritos aquí. Los marcadores específicos del linaje son CD2, CD4,CD8, CD56, CD16, CD19, CD20 y glicoforina A.

Figura 2: Análisis fenotípico de células de ABM CD34^{+}. La expresión de CD45RA en células de ABM se representa en el eje X de todas las gráficas. En los ejes Y, CD34 está en el cuadro A en células con compuerta ("gated") Lin^{-}, los cuadros B-D muestran respectivamente la expresión de Thy-1, CD38 y HLA-DR sobre células CD34^{+}Lin^{-}. Linaje^{-} = Lin^{-}. Los marcadores del linaje eran al menos CD2, 14, 16, 19, 15 y glicoforina A y lo más a menudo también incluían CD4, CD8, CD56 y CD7. Los cuadros E-H muestran la pre-tinción de células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-} (cuadros A y G) y células CD34^{+}Lin^{-} CD45RA^{+} (cuadros F y H) clasificadas para CD33 (cuadros E y F) y c-kit (cuadros G y H).

Figura 3: Composición fenotípica de huesos SCID-hu reconstituidos con células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-}. El cuadro A representa las células donantes de HLA teñidas con CD19. El cuadro B representa células donantes de HLA teñidas con CD33. El cuadro C representa células donantes de HLA teñidas con CD34. Los huesos se recuperaron 8 semanas después de la inyección de 30.000 células CD34^{+}Lin^{-} CD45RA^{-}. Las células se tiñeron con un anticuerpo específico para un determinante del HLA del donante CD34^{+}Lin^{-} CD45RA^{-} en combinación con CD19, CD33 y CD34.

Figura 4: Expresión de CD34 y CD10 en células de AMB Lin^{-} (Lin = CD2, CD4, CD8, CD56, CD16, CD19, CD20 y glicoforina A). Las células del cuadrante derecho superior delimitadas por las líneas quebradas eran 2% de células CD34^{+}Lin^{-}. El % medio de células CD10^{+} en células de ABM CD34^{+}Lin^{-} era 5,9 \pm 3,7% (n = 13 AMB examinadas).

Figura 5: Análisis fenotípico de cultivo de AC6.21. Los cultivos se sembraron con 10 células por pocillo a partir de las poblaciones CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} o CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-} en presencia de IL-3, IL-6 y LIF, y se recogieron después de 3 semanas. Las células se inmunotiñeron con CL33 y CD19 o CD34 y CD10. Los cuadros A y B representan la expresión de células CD10^{+} de CD33/CD19 (A) y CD34/CD10 (B). Los cuadros C y D representan la expresión en células RA^{+}CD10^{-} de CD33/CD19 (C) y CD34/CD10 (D). Los cuadros E y F representan la expresión en células RA^{-}CD10^{-} de CD33/CD19 (E) y CD34/CD10 (F).

Figura 6: Reconstitución de células T en ensayo de timo SCID-hu. Cada punto representa un injerto de timo, analizado 7 semanas después de la inyección de números variables de células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+} (círculos abiertos) o CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-} (diamantes cerrados).

Figura 7: Análisis fenotípico de un injerto de timo SCID-hu reconstituido con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}. Este injerto representativo se analizó 6 semanas después de la inyección en 9.000 células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}. El cuadro A muestra la expresión del marcador de HLA específico para células huésped en combinación con un marcador de pan-HLA (W6/32). Nótese que las células T derivadas del huésped expresan alto contenido de antígenos del MHC clase I. Los cuadros B y C muestran la expresión del HLA del huésped y de CD1a y CD3, respectivamente. Nótese que los timocitos derivados de donante expresan altos niveles de CD1 y niveles graduados de CD3. El cuadro D muestra la expresión de CD4 y CD8 con compuerta en células donantes.

Figura 8: Determinación cualitativa de la reconstitución de timocitos en el ensayo del timo SCID-hu a lo largo del tiempo. A las 4, 8 y 11 semanas después de la inyección celular de 2.000 células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (barras sombreadas) y de 10.000 células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} (barras abiertas). Los timocitos fueron analizados mediante inmunotinción tricromática con respecto a la presencia de células donantes y la expresión de CD1a y CD3. Los resultados se expresan como el % de células donantes que expresan CD1a (cuadro A) o CD3 (cuadro B) \pm DE (n = 4 injertos en cada punto temporal para cada grupo).

Figura 9: Un análisis fenotípico representativo de cultivos de AC6.21 iniciados por células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+} o CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-} en presencia de IL-2. El cuadro A representa la progenie de células RA^{+}10^{+} teñidas con respecto a CD56 y CD16. El cuadro B representa la progenie de células RA^{-}10^{-} teñidas con respecto a CD56 y CD16. El cuadro C representa la progenie de células RA^{+} teñidas con respecto a CD3 y CD56. El cuadro D representa la progenie de células RA^{-} teñidas con respecto a CD56 y CD33. Después de 3 semanas, era posible identificar células NK CD56^{+}CD3^{-}CD16^{-} en los cultivos de CD45RA^{+}. En contraste, los cultivos iniciados con células CD45RA^{-} contenían pocas células CD56^{+} pero estaban principalmente compuestos por células mieloides CD33^{+}.

Figura 10: El análisis fenotípico de un cultivo de AC6.21 iniciado con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} en presencia de IL-2 en la semana 4. El cuadro A muestra que la mayoría de las células (>90% en este caso) se han convertido en células NK CD56^{+}CD3^{-}. El cuadro B muestra que las condiciones de cultivo no apoyaban la diferenciación en monocitos CD14^{+} o células B CD19^{+}.

Figura 11: El cuadro A muestra un análisis inmunológico representativo de células NK derivadas de cultivos de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} de ABM en estroma AC6.21 + IL-2. Tales células NK expresan CD56 de la superficie celular pero no CD3. El cuadro B muestra los resultados de dos ensayos de liberación de ^{51}Cr independientes usando células diana K562 que demuestran la citotoxicidad dependiente de la dosis media (\pmDE) de células NK derivadas de cultivos de células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}. Se usaron como controles timocitos fetales cultivados en presencia de IL-2 y fitohemaglutinina. En el cuadro B, los cuadrados cerrados representan cultivos CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} de ABM y los círculos abiertos representan cultivo de linfocitos fetales. El cuadro C muestra los resultados de un análisis de dilución límite de los subgrupos CD10^{+} y CD10^{-} de ABM en células AC6.21 + IL-2 durante 7 semanas. Los pocillos se inmunotiñeron y se evaluaron con respecto a la presencia de células NK CD56^{+}CD3^{-} detectables (\geq1%) por encima del fondo. En el Cuadro C, los circulos abiertos representan cultivos CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} y los cuadrados cerrados representan cultivos CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}.

Figura 12: Ejemplo representativo de análisis de citometría de flujo e inmunotinción de cultivos iniciados con células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (cuadros A, B, C, D) y células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} (cuadros E, F, G, H). Se realizó tinción dicromática para identificar la expresión de CD1a, HLA-DR, CD14 y CD15 sobre células vivas excluyendo yoduro de propidio.

Figura 13: Fotomicrografía (objetivo x 100 aceite) de células cultivadas (día 12) depositadas sobre portaobjetos mediante citocentrifugación y teñidos con Wright-Giemsa. A: cultivo iniciado con células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} que señalan la presencia de DC con diferentes morfologías: B: cultivo (día 12) iniciado con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} a partir de la misma muestra de ABM que señala la presencia de una gran variedad de linajes hematopoyéticos.

Descripción detallada de la invención

Sería útil tener un sistema para estudiar la ruta de desarrollo de los linajes linfoides. Un requisito sería la identificación de un progenitor restringido al linaje linfoide que pudiera dar lugar a células B, T y NK. Una de las aplicaciones más prácticas es en la comprensión y la terapia de enfermedades inmunosupresoras tales como el SIDA o de otras enfermedades del sistema linfoide tales como leucemias y linfomas. Además, como no hay factores de crecimiento o factores de transcripción conocidos implicados en el desarrollo, la diferenciación y el crecimiento de progenitores linfoides, tal sistema permite el aislamiento y la caracterización de tales factores. Por otra parte, puesto que existe una comprensión limitada de la regulación de genes linfoides, particularmente al nivel de la transcripción, tal sistema permite el análisis y la caracterización de tal regulación génica. La identificación de estas poblaciones de progenitores primarios y de su potencial mieloide y linfoide total será extremadamente importante para investigar nuevas citoquinas, nuevos receptores de citoquinas o nuevos factores de transcripción. La invención descrita aquí proporciona un mecanismo para dirigirse a estos objetivos.

Para delimitar las etapas hacia el compromiso linfoide a partir de células madre pluripotentes, el potencial de reconstrucción del timo se correlacionó con actividades mieloide, eritroide y linfoide B y progenitora NK. CD45RA se usó en primer lugar para fraccionar células de médula ósea de adulto (ABM) CD34^{+}Lin^{-}, y el análisis del compromiso linfoide se refinó examinando la actividad de células progenitoras T de la población precursora de células B más temprana identificable. Se usó a continuación CD10 para purificar adicionalmente la población CD45RA^{+} y las poblaciones de células resultantes se determinaron con respecto a su actividad progenitora linfoide y DC.

Los resultados obtenidos muestran que existe actividad linfoide, mieloide, asesina natural y progenitora DC en subgrupos primitivos y de médula ósea comprometidos, y que existe un pequeño subgrupo fuertemente restringido al desarrollo linfoide. Así, los linajes linfoides y, de forma importante, el linaje DC pueden segregarse de células madre multipotentes más primitivas y de células progenitoras eritroides y mieloides.

Aunque se han identificado las condiciones que inducen la diferenciación de células CD34^{+} humanas en DC (Caux y otros (1994) J. Exp. Med. 180:1263), la ruta de desarrollo y la afiliación de linaje de DC han estado ocultas hasta ahora. En efecto, DC se ha reconocido durante mucho tiempo como un tipo de células funcionalmente distintas de los monocitos/macrófagos. Esta conclusión se basaba en la morfología, el fenotipo, la actividad fagocítica, la capacidad de presentación de antígenos, la producción de citoquinas y las velocidades de renovación celular de DC y monocitos/macrófagos. Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271; Macatonia y otros (1993) Int. Immunol. 5:1119 y Kampinga (1990) J. Immunol. 145:1659. Existe una evidencia indirecta que conecta DC a células linfoides, basada en el aislamiento en ratones de un conjunto progenitor intratímico común y por la expresión de varios antígenos de la superficie celular compartidos entre DC y células T. Ardavin y otros (1993) Nature 362:761 y WInkel y otros (1994) Immunol. Lett. 40:93. Los datos proporcionados aquí son la primera evidencia directa de que el linaje DC se origina a partir de células progenitoras distintas de progenitores hematopoyéticos que dan lugar a eritrocitos, monocitos y granulocitos. Estos resultados sugieren que las DC pueden estar relacionadas más estrechamente en cuanto al desarrollo con células linfoides que con células mieloides.

La invención abarca composiciones enriquecidas en células progenitoras capaces de diferenciación en células mieloides, DC y todas las clases de células linfoides, y células progenitoras capaces de diferenciación en DC y todas las clases de células linfoides. Estas poblaciones de células progenitoras se caracterizan por los siguientes fenotipos: CD45RA^{+}CD34^{+}Lin^{-} (en lo sucesivo aquí RA^{+}) y CD45RA^{+}CD10^{+}Lin^{-}CD34^{+} (en lo sucesivo aquí "10^{+}"), respectivamente. Las células 10^{+} también se denominan "progenitores linfoides centrales". Otras poblaciones de células abreviadas aquí son CD45RA^{-}CD10^{-}Lin^{-}CD34^{+} (en lo sucesivo aquí, "RA^{-}10^{-}"); CD45RA^{+}CD10^{-}Lin^{-}CD34^{+} (en lo sucesivo aquí, "RA^{+}10^{-}") y CD45RA^{-}CD34^{+}Lin^{-} (en lo sucesivo aquí, "RA^{-}"). Las células RA^{+} tienen actividad mieloide, DC y linfoide y pueden subdividirse por CD10 en RA^{+}10^{+} y RA^{+}10^{-}. La población RA^{+}10^{+} es un pequeño subgrupo con potencial diferenciador restringido a todas las clases de células linfoides y DC.

Así, la invención abarca composiciones sustancialmente enriquecidas en diversas células progenitoras. En una modalidad, las células enriquecidas son progenitores RA^{+}, mieloides, DC y linfoides. En otra modalidad, las células enriquecidas son células progenitoras 10^{+}, linfoides y DC. En otra modalidad, las células enriquecidas son células progenitoras RA^{+}10^{-}, mieloides y linfoides. Las células RA^{+}10^{-} pueden ser útiles en situaciones, por ejemplo, en las que están presentes células leucémicas 10^{+} y contaminarían de otro modo la población RA^{+}. Se describen aquí composiciones que tienen más de 80%, habitualmente más de aproximadamente 95% de células RA^{+} o 10^{+}. Así, las células sustancialmente enriquecidas están aproximadamente enriquecidas al 80% en aquellas células que expresan el marcador o los marcadores especificados. Preferiblemente, las células están aproximadamente 80% enriquecidas en el marcador o los marcadores especificados. Más preferiblemente, las células están aproximadamente 80-90% enriquecidas en los marcadores especificados. Lo más preferiblemente, las células están 90% enriquecidas en el marcador o los marcadores especificados.

Las células progenitoras descritas aquí son capaces de diferenciarse en linajes linfoide/mieloide/DC y linajes linfoides/DC. Ninguna población es capaz de diferenciarse en el linaje eritroide. La figura 1 proporciona un esquema de los tipos de células y su potencial de linaje. Las células Lin^{-} se refieren generalmente a células que carecen de marcadores asociados con células T (tales como CD2, CD3, CD4 y CD8), células B (tales como CD19 y CD20), células mieloides (tales como CD14, 15 y 16), células NK (tales como CD56 y CD16) y eritrocitos (tales como glicoforina A). Preferiblemente, el cuadro del linaje incluirá al menos CD19. Marcadores de linaje convenientes para usar además de CD19 incluyen CD2, CD4 y CD15. Otros marcadores de linaje pueden usarse para asegurar la retirada de células más diferenciadas, pero su uso no enriquece sustancialmente de forma adicional la población de células progenitoras obtenida.

Así, modalidades de la invención se dirigen a métodos para purificar o enriquecer en estas células progenitoras y a composiciones obtenidas de ese modo. La fuente de células puede ser cualquiera conocida en la especialidad, tal como la fuente de células de médula ósea, fetales, neonatales o de adulto u otras hematopoyéticas, por ejemplo, hígado fetal, sangre periférica o sangre de cordón umbilical.

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La selección de estas células progenitoras no necesita alcanzarse con un marcador específico para las células. Usando una combinación de selección negativa (retirada de otras células comprometidas) y selección positiva (aislamiento de células), pueden alcanzarse poblaciones de células enriquecidas.

Pueden emplearse diversas técnicas para separar las células retirando inicialmente células del linaje seleccionado. Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles para identificar marcadores asociados con linajes celulares y/o fases de diferenciación particulares.

Si se desea, una gran proporción de células terminalmente diferenciadas puede retirarse usando inicialmente una separación "relativamente en bruto". Por ejemplo, pueden usarse inicialmente separaciones con cuentas magnéticas para retirar grandes números de células de linaje comprometido. Deseablemente, al menos aproximadamente 80%, habitualmente al menos 70% de las células hematopoyéticas totales se retirarán.

Procedimientos para la separación pueden incluir, pero no se limitan a, separación magnética, usando cuentas magnéticas revestidas con anticuerpo, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados junto con un anticuerpo monoclonal, incluyendo, pero no limitados a, complemento y citotoxinas, y "lavado" ("panning") con un anticuerpo ligado a una matriz sólida, por ejemplo una placa, elutriación y cualquier otra técnica conveniente.

Técnicas que proporcionan una separación exacta incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, que puede tener grados variables de sofisticación, por ejemplo una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de luz de ángulo bajo y obtusos, canales de impedancia, etc.

En una separación, partiendo típicamente de aproximadamente 1 x 10^{8-9}, preferiblemente aproximadamente 5 x 10^{8-9} células, el anticuerpo para CD34 puede asociarse con un fluorocromo, mientras que los anticuerpos para los diversos linajes seleccionados pueden iluminarse mediante fluorocromos diferentes. Fluorocromos que pueden encontrar uso en un análisis multicromático incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo ficoeritrina y aloficocianinas; fluoresceína y rojo de Texas.

Aunque cada uno de los linajes puede separarse en una etapa separada, deseablemente los linajes se separan al mismo tiempo que uno se selecciona posiblemente para CD34 y CD45RA y/o CD10. Generalmente, las etapas de purificación en masa iniciales dan como resultado aproximadamente 1 x 10^{8} células. El agotamiento de células de linaje específico de esta población da aproximadamente 1-3 x 10^{7} células que contienen aproximadamente 10-20.000 células 10^{+} y 1,5 x 10`{5} células 10^{-}. En las células 10^{-}, aproximadamente 50.000 - 1 x 10^{5} son RA^{+}10^{-} y 1 x 10^{5} son RA^{-}10^{-}.

Las células pueden seleccionarse frente a células muertas, empleando colorantes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Preferiblemente, las células se recogen en un medio que comprende suero de ternero fetal (FCS) al 2% o albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2%.

Puede emplearse otra técnica para la selección positiva, que permite la separación exacta, tal como columnas de afinidad y similares. El método debe permitir la retirada hasta una cantidad residual de menos de aproximadamente 20%, preferiblemente menos de aproximadamente 5%, de las poblaciones de células no progenitoras.

Aunque se cree que el orden particular de separación no es crítico para esta invención, se prefiere el orden indicado. Preferiblemente, las células se separan inicialmente mediante una separación en bruto, seguida por una separación fina, con selección positiva de un marcador asociado con las células diana y selección negativa de marcadores no asociados con las células diana. Las células pueden seleccionarse basándose en propiedades de dispersión de luz así como su expresión de diversos antígenos de la superficie celular.

Una vez que se han aislado las células RA^{+} y/o 10^{+}, pueden propagarse mediante crecimiento en medio acondicionado a partir de células estromales, tales como células estromales que pueden obtenerse de médula ósea, timo fetal o hígado fetal, y se muestra que proporcionan la secreción de factores de crecimiento asociados con el mantenimiento de células progenitoras, o co-cultivando con tales células estromales, donde las células estromales pueden ser autólogas, alogeneicas o xenogeneicas. Antes de usar en el co-cultivo, las preparaciones de células estromales pueden liberarse de células hematopoyéticas empleando irradiación, fármacos citotóxicos o anticuerpos monoclonales apropiados para la retirada de las células no deseadas, por ejemplo con conjugados anticuerpo-toxina, anticuerpo y complemento, etc. Alternativamente, pueden usarse líneas de células estromales clonadas cuando las líneas estromales pueden ser alogeneicas o xenogeneicas.

El medio empleado para el cultivo de las células es convenientemente un medio enriquecido definido, incluyendo, pero no limitado a, IMDM (Medio de Dublecco Modificado de Iscove), una mezcla 50:50 de IMDM y RPMI, y generalmente estará compuesto por sales, aminoácidos, vitaminas, \beta-mercaptoetanol (\beta-ME) 5 x 10^{-5} M, estreptomicina/penicilina y FCS al 10%, y puede cambiarse de vez en cuando, generalmente al menos aproximadamente de 1 a 2 veces por semana.

Las células generadas a partir de células RA^{+} y 10^{+} dan lugar a células T en los ensayos in vivo descritos más adelante. La producción de células mieloides y B se observa in vivo sólo a partir de células RA^{-}; la producción mieloide se observa in vitro a partir de RA^{-} y RA^{+} como un todo; 10^{+} casi no tienen actividad mieloide in vitro. La producción de células B en ensayos in vitro a corto plazo se observa tanto en RA^{+} como en 10^{+}. Las células RA^{+} y 10^{+} dan lugar a células NK y DC in vitro. Además, los cultivos de RA^{+}10^{-} dan lugar a un pequeño subgrupo de células CD34^{+}10^{+}.

Para demostrar la diferenciación hasta células T, se aísla timo fetal y se cultiva durante de 4-7 días a aproximadamente 25ºC, a fin de agotar sustancialmente la población linfoide. Las células progenitoras que han de probarse con respecto a la actividad de células T se microinyectan a continuación en el tejido del timo, donde el HLA de la población que se inyecta se compara con el HLA de las células del timo. El tejido del timo se trasplanta a continuación a un ratón scid/scid según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.147.784, particularmente trasplantando bajo la cápsula renal.

Específicamente, la población clasificada puede microinyectarse en fragmentos de timo de HLA desigual. Después de 6-10 semanas, pueden realizarse ensayos de los fragmentos del timo y determinarse con respecto a las células T derivadas de donante. Los fragmentos de timo inyectados con células T que tienen potencial linfoide T generan y mantienen células T CD3^{+}, CD4^{+} y CD8^{+} junto con sus progenitores.

Una demostración adicional de la capacidad diferenciadora de las diversas poblaciones de células podría efectuarse mediante la detección de la producción de células mieloides y NK en los ensayos de células estromales descritos en los Ejemplos que siguen.

La invención también abarca métodos para el uso de las poblaciones de células RA^{+} y/o 10^{+}. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, restituir o aumentar las poblaciones de células linfoides y mieloides o linfoides, respectivamente; rastrear con respecto a factores de crecimiento responsables de la maduración de células progenitoras linfoides y mieloides; identificar marcadores para anticuerpos específicos para células progenitoras (tanto policlonales como monoclonales); la identificación de genes específicos de los linajes linfoide o mieloide; la identificación de secuencias reguladoras genéticas específicas para el linaje linfoide y el uso en la terapia génica.

La reconstitución o el aumento de poblaciones de células linfoides y/o mieloides es útil en una variedad de entornos médicos. Indicaciones que han de tratarse incluyen, por ejemplo, inmunodeficiencias y trasplantes de células madre. Las células progenitoras son particularmente útiles durante el trasplante de células madre para disminuir el tiempo de espera entre el trasplante y la repoblación de las células hematopoyéticas. Métodos para obtener las células progenitoras se describen aquí, los métodos para administrar células hematopoyéticas a pacientes están dentro de la experiencia de la especialidad.

La identificación de una población de células progenitoras restringida a linfoide 10^{+} permite la determinación de esta población como el origen de una enfermedad, por ejemplo leucemia, y por lo tanto es útil para purgar tales células de un injerto autólogo. La invención también abarca el uso de células RA^{+} o 10^{+} como progenitores de DC para una variedad de propósitos. Las DC están entre las células que presentan antígeno más potentes en el cuerpo y son capaces de inducir una respuesta inmune primaria. Por lo tanto, las DC pueden ser útiles como un injerto celular para incrementar la capacidad para montar una respuesta inmune. Las DC o los precursores de DC pueden usarse en una estrategia de vacunación por la que las células se cargan con antígeno y se inyectan para inducir una respuesta inmune específica. Alternativamente, las células inyectadas pueden usarse para inducir tolerancia a un antígeno específico.

Las células RA^{+} y 10^{+} pueden usarse para una variedad de sistemas de terapia génica en los que se desea la expresión de la capacidad genética exógena en linajes linfoide y/o mieloide. El uso de las células progenitoras descritas aquí proporciona una alternativa para terapia génica basada en células madre. Las células progenitoras se preferirán en casos en los que se desea tener una expresión temporal en lugar de permanente de la capacidad genética exógena. Además, el uso de células 10^{+} permite que la expresión se restrinja a células linfoides. Además, es probable que la transferencia génica sea más eficaz en progenitores que en células madre debido a que las células progenitoras sufren ciclos más activamente que las células madre y se sabe que los vectores retrovirales requieren células que sufren ciclos activamente para la integración eficaz del DNA recombinante.

Además, sería ventajoso usar progenitores linfoides en comparación con usar células linfoides maduras para la terapia génica. Actualmente, la terapia génica de células T requiere la expansión ex vivo de células T con citoquinas. Durante la re-infusión, las células T modificadas a menudo no se orientan apropiadamente a sus órganos diana y pueden atraparse en (y ser depuradas por) los pulmones, el hígado o el bazo. Esta orientación inapropiada puede deberse a la alteración de las membranas durante el procesamiento ex vivo, la regulación a la baja de receptores de orientación o similares. La expansión ex vivo de células T es costosa, engorrosa y consume mucho tiempo y así no es ideal para el tratamiento. El uso de células progenitoras modificadas obviaría la necesidad de la expansión en vivo de las células T efectoras y así los problemas de tráfico alterado y persistencia in vivo. Además, el uso de progenitores modificados permitiría la ampliación en los números de células de la progenie, reduciendo de ese modo la necesidad de la expansión ex vivo y reduciendo la frecuencia de la administración.

Enfermedades genéticas asociadas con células hematopoyéticas pueden tratarse mediante la modificación genética de células progenitoras autólogas o alogeneicas para corregir el defecto genético. Por ejemplo, enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de recombinasa, deficiencia de genes reguladores de recombinasa, pueden corregirse mediante la introducción de un gen de tipo salvaje en las células, mediante recombinación homóloga o aleatoria. Otras indicaciones de la terapia génica son la introducción de genes de resistencia a fármacos para permitir que las células progenitoras normales tengan ventaja y se sometan a presión selectiva, por ejemplo, el gen de resistencia a múltiples fármacos (MDR).

También pueden tratarse otras enfermedades distintas a las asociadas con células hematopoyéticas, en las que la enfermedad está relacionada con la falta de un producto secretado particular incluyendo, pero no limitado a, hormonas, enzimas, interferón, un factor o similares. Empleando una región de iniciación reguladora apropiada, puede alcanzarse la producción inducible de la proteína deficiente, de modo que la producción de la proteína será paralela a la producción natural, aún cuando la producción sea en un tipo de células diferente del tipo de célula que normalmente produce tal proteína. También es posible insertar una ribozima, un mensaje antisentido u otro para inhibir productos génicos particulares o la susceptibilidad a enfermedades, particularmente enfermedades hematolinfotrópicas (por ejemplo, HIV).

La modificación genética de las células puede efectuarse en cualquier punto durante su mantenimiento transduciendo una composición de células sustancialmente homogénea con un constructo de DNA recombinante. Preferiblemente, se emplea un vector retroviral para la introducción del constructo de DNA en la célula. Las células resultantes pueden hacerse crecer a continuación bajo condiciones similares a las de células no modificadas, por lo que las células modificadas pueden expandirse y usarse para una variedad de propósitos.

Para la modificación genética de las células, habitualmente se empleará un vector retroviral, sin embargo, puede usarse cualquier otro vector o sistema de aporte adecuado. Estos incluyen, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados y cromosomas artificiales derivados de levadura. También son adecuadas combinaciones de retrovirus y una línea de empaquetamiento apropiada, donde las proteínas de la cápsida serán funcionales para infectar células humanas. Se conocen diversas líneas celulares que producen virus anfotrópicos, incluyendo, pero no limitadas a, PA12 (Miller y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Míller y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902) y CRIP (Danos y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:6460-6464).)

Métodos de transducción posibles incluyen el co-cultivo directo de las células con células productoras, por ejemplo mediante el método de Bregni y otros (1992) Blood 80:1418-1422, o el cultivo con sobrenadante viral solo con o sin factores de crecimiento y policationes apropiados, por ejemplo, mediante el método de Xu y otros (1994) Exp. Hemat. 22:223-230 y Hughen y otros (1992) J. Clin. Invest. 89:1817.

También se describen y se proporcionan aquí constructos receptores de células T (TCR) recombinantes adecuados para usar al transducir las células. Constructos adecuados y usos de los mismos se describen en la solicitud internacional Nº US94/10033. El TCR recombinante puede ponerse bajo el control de un promotor específico para células T de modo que sólo se expresen células T. Por ejemplo, el promotor podría ser Granzyme A o Granzyme B, que podría hacer que el TCR recombinante se expresara predominantemente en células NK y linfocitos T citotóxicos (CTLs). Los linfocitos citotóxicos requieren Granzyme B para la inducción rápida de la fragmentación de DNA y la apoptosis en células diana alogeneicas. Heusel y otros (1994) Cell 76:977-987. Las células T derivadas de células transducidas deben orientarse y circular apropiadamente ya que han madurado in vivo y no se han manipulado directamente subsiguientemente ex vivo. Pueden expandirse a continuación en número administrando citoquinas in vivo. Puesto que las células principalmente activadas con antígenos proliferan en respuesta a citoquinas, las células T modificadas que reconocen el antígeno diana deben amplificarse relativamente. Además, es posible obtener una respuesta más fuerte de las células T derivadas de las células transducidas. Si se transducen más células T maduras con el TCR recombinante, pueden tener una respuesta amortiguada si son células de "memoria" (es decir expuestas previamente a antígenos) y, por lo tanto, "desviadas" ("biased").

Otra ventaja de las células progenitoras genéticamente modificadas sobre células T maduras sería la capacidad para expresar el TCR recombinante en más de un linaje hematopoyético. Por ejemplo, puesto que se sabe que los macrófagos tienen la capacidad de tragar células tumorales, puede ser útil expresar el TCR recombinante en macrófagos.

Los constructos pueden prepararse en una variedad de modos convencionales. Están ahora disponibles numerosos vectores que proporcionan las características deseadas, tales como repeticiones terminales largas, genes marcadores y sitios de restricción, que pueden modificarse adicionalmente mediante técnicas conocidas en la especialidad. Los constructos codificarán una secuencia de péptido de señal además de la región de especificidad antigénica y la secuencia de señalización citoplásmica, para asegurar que el TCR recombinante se procese apropiadamente post-traduccionalmente y se exprese sobre la superficie celular. Preferiblemente, el constructo está bajo el control de un promotor específico de células T. Promotores específicos de células T adecuados incluyen, pero no se limitan a, Granzyme A, Granzyme B y CD8.

En una modalidad, la región de transducción de señal y la región de especificidad antigénica se obtienen ambas a partir de TCRs ("TCR clásico"). En otra modalidad, los constructos codifican polipéptidos quiméricos que comprenden la región de transducción de señal obtenida a partir de un receptor específico de células T o el receptor Fc\gamma y una porción de unión a antígeno de una inmunoglobulina o de un receptor de NK ("TCR quimérico").

Los TCRs clásicos recombinantes son polipéptidos de TCR \alpha y \beta o \gamma y \delta funcionales, preferiblemente de longitud completa, que se han derivado de una célula T con especificidad antigéncia conocida. Fuentes adecuadas de receptores específicos para antígenos incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T citotóxicos, células auxiliares T y células NK. En otra modalidad, los polipéptidos pueden recombinarse a fin de formar un solo polipéptido funcional con las regiones V\alpha y V\beta formando el sitio de unión a antígeno. En otra modalidad, las regiones V\alpha y V\beta de diferentes TCRs pueden recombinarse para dotar al TCR de una especificidad diferente.

La progenie de células T de las células que contienen los polipéptidos de TCR clásico recombinantes está "restringida al MHC", esto es, solo reconocerán antígeno en presencia de MHC. Así, cuando se usan estas células para tratar a un paciente, los TCRs deben poder reconocer el mismo haplotipo que el del huésped. Está dentro de la experiencia de un experto determinar si el haplotipo del huésped será compatible con un TCR particular. El sistema del TCR clásico es ventajoso cuando el antígeno se expresa como un péptido corto sobre la superficie celular procesando internamente y se presenta en la hendidura de una molécula del MHC.

En el caso del TCR quimérico, la molécula quimérica contiene una secuencia que se une a antígeno procedente de un anticuerpo u otro receptor, una secuencia de transmembrana y una secuencia que puede transducir una señal y promover una función. Una variedad de estas moléculas y moléculas relacionadas se ha clonado y expresado en diversas líneas de células T. Kuwana y otros (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 149:960-968; Gross y otros (1989) Trans. Proc. 21:127-130; Becker y otros (1989) Cell 58:911-921; Gross y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10024-10028 y Goverman y otros (1990) Cell 60:929-939. Se han creado varios TCRs quiméricos y se ha encontrado que son activos para dirigir células T al antígeno reconocido por el sitio de unión a anticuerpo. Eshhar (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:720-724 y Hwu y otros (1993) J. Exp. Med. 178:361-366.

Pueden obtenerse regiones de transducción de señal adecuadas a partir de receptores que tienen capacidad de activación a través de una cadena específica, incluyendo, pero no limitada a, la cadena \gamma del receptor F_{o}, la cadena \zeta de CD3, la cadena \gamma del receptor de IL-2, CD8 o CD28. Alternativamente, el dominio que se une a antígeno puede asociarse con regiones constantes de las cadenas \alpha o \beta de TCR, que transducirán la señal a través de la asociación con la cadena \zeta de CD3 endógena. Preferiblemente, la porción funcional de la molécula quimérica es la región de señalización de un polipéptido de Fc\gamma o \zeta y el dominio que se une a antígeno es una región variable de un anticuerpo. La región variable puede ser cualquiera de las regiones V_{H} o V_{L} o, preferiblemente, un recombinante de cadena simple de las mismas.

Métodos para la recombinación en células de mamífero pueden encontrarse en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) Sambrook, Fritach y Maniatis, Cold Spring Harbor, NY.

La progenie de células T de las células que contienen las moléculas de TCR quiméricas pueden reconocer antígeno en ausencia de MHC cuando el sitio de unión a antígeno se deriva de un anticuerpo y así pueden no estar restringidas al MHC. Estas moléculas son adecuadas para usar en todos los huéspedes independientemente del haplotipo.

Durante la reintroducción de las células genéticamente modificadas en el huésped y la diferenciación subsiguiente, se producen células T que se dirigen específicamente contra el antígeno específico. Generalmente, antígenos adecuados incluyen los encontrados en células infectadas viralmente y células de cáncer específicas. Más específicamente, antígenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, proteínas de revestimiento virales y proteínas superficiales específicas de células cancerosas.

En muchas situaciones, la inmunoterapia celular implica la retirada de médula ósea u otra fuente de células hematopoyéticas de un huésped humano, aislar las células progenitoras de la fuente y opcionalmente expandir las células aisladas. Mientras tanto, el huésped puede tratarse para suprimir parcialmente, sustancialmente o completamente la capacidad hematopoyética natural. Las células aisladas pueden modificarse durante este período de tiempo, a fin de proporcionar células que tienen la modificación genética deseada. En el caso de la supresión hematopoyética completa, también se requerirá el aumento de células madre. Después de la terminación del tratamiento del huésped, las células modificadas pueden devolverse a continuación al huésped para proporcionar la nueva capacidad. Los métodos de retirada de células hematopoyéticas, supresión del huésped y repoblación de células madre/progenitoras son conocidos en la especialidad. Si es necesario, el procedimiento puede repetirse para asegurar la repoblación sustancial de las células modificadas.

Las células modificadas pueden administrarse en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable, normalmente intravascularmente, aunque también pueden introducirse en el hueso u otro sitio conveniente en el que las células puedan encontrar un sitio apropiado para la regeneración y la diferenciación (por ejemplo, el timo). Habitualmente, se administrarán al menos 1 x 10^{5} células, preferiblemente 1 x 10^{6} o más. Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similares. Si se desea, también pueden incluirse factores, incluyendo, pero no limitados a, interleuquinas, por ejemplo IL-2, IL-3, IL-6 e IL-11, así como las otras interleuquinas, los factores estimulantes de colonias, tales como G-, M- y GM-CSF, interferones, por ejemplo \gamma-interferón, eritropoyetina.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar pero no limitar la invención. En los ejemplos presentados más adelante, se obtuvieron los siguientes resultados primarios. En primer lugar, se observó que las poblaciones enriquecidas en actividad de células madre hematopoyéticas primitivas pueden generar células T si se introducen en el sitio tímico. En segundo lugar, el potencial de reconstitución de células T parece ubicuamente presente en diversos subgrupos de células de ABM CD34^{+}, pero puede explicarse, por ejemplo, por el potencial linfoide presente en el compartimento de CD45RA. En tercer lugar, células distintas a células madre pluripotentes hematopoyéticas o células pre-T diferentes a las intratímicas pueden diferenciarse en células T. Este es un hallazgo que no se ha apreciado completamente previamente. En cuarto lugar, se encontró que un pequeño subgrupo de células (aproximadamente 5,9 \pm 3,7% de células CD34^{+}Lin^{-}) tiene potencial mieloide limitado pero actividad progenitora linfoide T y B fuerte (10^{+}). En quinto lugar, las células RA^{+}10^{-} y 10^{+} pueden diferenciarse en células NK. En sexto lugar, las células RA^{+}10^{-} y 10^{+} pueden diferenciarse en células DC.

Ejemplo 1 Procesamiento y tinción de muestras para clasificación por citometría de flujo

Se obtuvieron aspirados de médula ósea de adulto (ABM) de la cresta ilíaca posterior de voluntarios adultos sanos con consentimiento. Células mononucleares (MNC) de baja densidad (<1,077 g/ml) obtenidas mediante centrifugación en gradiente (Lymphoprep, Nycomed Pharma) se lavaron dos veces en tampón de tinción (SB) que consistía en solución salina tamponada con fosfato y albúmina de suero bovino (BSA, Sigma) al 0,2% y se incubaron con 1 mg/ml de gamma-globulina inactivada térmicamente (Gamimune, Miles, Inc.) para bloquear la unión no específica al receptor Fc de anticuerpos de ratón. Los granulocitos se retiraron mediante incubación con cuentas magnéticas (Dynal M450) revestidas con anticuerpos monoclonales (MAbs) anti-CD15 (Medarex) o congelando en nitrógeno líquido en presencia de DMSO al 10% (Sigma), suero de ternero fetal (FCS) al 10% (Hyclone) y descongelando. Las células se incubaron con los siguientes MAbs conjugados a ficoeritrina (PE) específicos para un linaje: anti-CD2, -CD4, -CD8, -CD56, -CD16, -CD19, -CD20 (Becton Dickinson) y antiglicoforina A (Amac) (PE-Lin). Después de 2 lavados en SB, las células se incubaron con cuentas revestidas con anti-(inmunoglobulina de ratón) de oveja (Dynal), y, después de la exposición a un campo magnético, las células unidas a cuentas se descartaron. Se añadieron MAbs anti-CD34 (Tük-3; Dr. Ziegler, University of Berlín, Berlín, Alemania) o MAbs de control de isotipo IgG3 a 0,3 \mug x 10^{6} células en un volumen total de 0,5 ml de SB durante 20 minutos sobre hielo. Las células se lavaron dos veces en SB, a continuación se incubaron con anticuerpos anti-(IgG3 de ratón) de cabra (GAM\gamma3) conjugados a rojo de Texas (TR) (Southern Biotechnologies Associates) y MAbs anti-CD45RA marcados con FITC (Becton Dickinson) seguido por dos lavados en SB. Las células se clasificaron en el clasificador de células FACStar Plus (Becton Dickinson) equipado con láseres iónicos de argón dobles, emitiendo el primario a 488 nm, y emitiendo un láser de colorante (Rhodamine 6G) a 600 nm (Coherent Innova 90, Santa Clara, CA). Todas las células que expresan niveles de PE-Lin por encima del valor del control negativo se excluyeron mediante compuerta electrónica y el resto se clasificó sobre la base de CD34 y de CD45RA.

Para las clasificaciones de CD38, las células se tiñeron con MAbs antia- CD34(Tük-3) reconocidos por GAM\gamma-3 conjugado a TR, MAbs FITC-Lin (Lin=CD2, CD14, CD15, CD16, CD19 y glicoforina A) y PE-MAbs anti-CD38 (Becton Dickinson). Para las clases Thy-1, las células se marcaron con MAbs anti-CD34 y anti-Thy-1 (GM201) reconocidos respectivamente por anticuerpos TR-GAM\gamma3 específicos para el isotipo (Southern Biotechnologies Associates) y PE-anticuerpos anti-(IgG1 de ratón) (Caltag, South San Francisco, CA). A continuación, después del bloqueo extensivo con IgG1 de ratón (Sigma), se añadieron MAbs FITC-Lin (Lin=CD2, CD14, CD15, CD16, CD19 y glicoforina A). Para clases HLA-DR, solo se usó FITC-CD15 como marcador de Lin con PE-MAbs anti-HLA-DR (Becton Dickinson). Para los aislamientos CD24/CD45RA/Thy-1, se realizaron 2 clasificaciones consecutivas. Las primeras células se marcaron con MAbs anti-CD34, anti-Thy-1 y FITC-Lin según se describe previamente. Células CD34^{+}Lin^{-} clasificadas con buena pureza (>90%) se tiñeron de nuevo con MAbs FITC-CD45RA y se realizó una segunda clasificación sobre la base de la expresión de CE45RA y Thy-1.

Para el estudio de CD10, la mayoría de las muestras de ABM probadas se sometió en primer lugar a una selección positiva de CD34 usando un anti-CD34 biotinilado y un sistema de competición de biotina como el descrito en la solicitud de patente WO 9402016. Las células CD34^{+} seleccionadas positivamente se tiñeron con MAbs Tükk-3 anti-CD34 (que reconocen un epítopo diferente del usado para seleccionar positivamente las células) y TR-anti((GAM)-\gamma3 de ratón) de cabra, PE-Lin (CD2, CD4, CD8, CD56, CD16, CD19, CD20 y glicoforina A) más CD10^{-}FITC o MAbs de control pertinentes según se describen previamente. Para obtener subgrupos CD45RA carentes de células CD10^{+}, se realizaron dos clasificaciones consecutivas. En primer lugar, se clasificaron células CD34^{+}CD10^{+}Lin^{-} y CD34^{+}CD10^{-}Lin^{-}. La última población se volvió a teñir con controles de isotipo FITC o con FITC-MAbs anti-CD45RA, y los subgrupos CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-}CD45RA^{-} y CD34^{+}Lin^{- }CD10^{-}CD45RA^{+} se clasificaron. En algunos experimentos, MAbs CD34 (Tükk3) se conjugaron directamente con sulforrodamina.

Ejemplo 2 Análisis fenotípicos de subgrupos de células cd34^{+} Poblaciones de células

Células CD34^{+}Lin^{-} clasificadas se volvieron a teñir con MAbs anti-CD38 y anti-HLA-DR conjugados a PE (Becton Dickinson). Células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+} o CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-} clasificadas se volvieron a teñir con MAbs anti-CD33 conjugados a PE (Becton Dickinson) o con MAbs anti-c-kit (Amac) reconocidos por un anticuerpo anti-(IgM de ratón) de cabra conjugado a PE (Southern Biotechnologies Associates). También se usaron controles de isotipo apropiados para determinar la especificidad de las tinciones y establecer el fondo a partir de la clasificación (por debajo de 1% en el canal de PE en las muestras examinadas).

1. Análisis fenotípicos

Se expresan de forma prominente antígenos CD45RA sobre una variedad de células de la médula ósea. Lansdorp y Dragowska (1992); y Schwinzer (1989) en: Leukocyte Typing IV. White Cell Differentiation Antigens (Knapp y otros, eds.) Oxford University Press, Nueva York, pp. 628-634. Las células de ABM CD34^{+}Lin^{- } en la compuerta linfoblastoide se divide claramente en dos poblaciones basadas en la expresión de CD45RA (figura 2-cuadro A). Según se muestra, las células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+} expresan un nivel intermedio del antígeno CD45RA, inferior que el encontrado en algunas células CD34-. Las células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+} expresaban niveles de negativos a leves de Thy-1 (figura 2-cuadro B), altos niveles de CD38 y de HLA-DR (figura 2-cuadros C y D) y contenían células con niveles claramente positivos o negativos de CD33 y de antígenos para c-kit (figura 2-cuadros E-H). Las células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-} expresaban más homogéneamente niveles bajos de c-kit y CD33, pero eran heterogéneas para la expresión de Thy-1, CD38 y HLA-DR. Células con niveles de negativos a leves de CD38 y de HLA-DR se encontraron principalmente en la población de CD45RA^{-}. Ha sido caracterizado por laboratorios independientes que las células madre hematopoyéticas primitivas son Thy-1^{+}, CD38bajas, c-kitbajas, CD33bajas y HLA-DRbajas, y la integración de estos parámetros muestra que se encuentran en el compartimento CD45RA^{-} de células de ABM CD34^{+} según se presentó previamente. Terstappen y otros (1991); Baum y otros (1992); Lansdorp y Dragowska (1992); Srour y otros (1991); Craig y otros (1993); Gunji y otros (1993) Blood 82:3283-3289 y Mayani y Lansdorp (1994) Blood 83:2410-2417.

Ninguna célula detectable cumple todos los criterios fenotípicos para células madre hematopoyéticas primitivas en el compartimento CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+} que por lo tanto parece contener solo progenitores. El progenitor linfoide central CD45RA^{+}CD10^{+} se caracterizó adicionalmente por el examen de la tinción con un número de anticuerpos y se mostró que estas células son CD38^{+}HLA-DR+ y Thy-1^{-} según se indica a partir de los resultados presentados en la figura 2.

Marcadores de células T inmaduras tales como CD7, CD5 y CD25 no se expresaban significativamente en células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} y el receptor c-kit no era detectable sobre CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (Tabla 2). Se usó una variedad de ensayos hematopoyéticos para determinar la capacidad diferenciadora de esta población de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} que constituye 5,9 \pm 3,7% (n=13) de células de ABM CD34^{+}Lin^{-} y aproximadamente 0,09% de células mononucleares de ABM aisladas mediante centrifugación con gradiente de Ficoll.

TABLA 2 Caracterización fenotípica de células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}

Antígeno de la superficie celular	Expresión sobre células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}
	%\pmDE (n)
CD45RA	100\pm0 (2)
CD38	97\pm3 (2)
HLA-DR	99\pm1 (2)
Thy-1	11\pm9 (3)
c-Kit	1\pm1 (2)
CD7	12\pm4 (2)
CD5	1\pm2 (3)
CD25	0\pm0 (3)

Para obtener los resultados representados en la Tabla 2, se realizó un análisis fenotípico sobre células CD34^{+}Lin^{-} aisladas mediante citometría de flujo hasta una pureza de clasificación >98%. Las células clasificadas se tiñeron con mAbs conjugados a fluoresceína o PE anti-CD45RA, CD38, HLA-DR, CD7, CD5, CD25 (Becton Dickinson) y mAbs anti-CD10 conjugados a fluoresceína (Becton Dickinson) o PE (Amac). Se usaron mAbs para Thy-1 (clon GM201) y c-kit (Amac) en un método indirecto con reactivos secundarios marcados con PE específicos para el isotipo y un bloqueo apropiado. Lin = CD2, CD4, CD8, CD16, CD56, CD19, CD20, CD14 y glicoforina A. En la Tabla 2, los resultados se expresan como % de células positivas después de la sustracción de la tinción de fondo con control de IgG1^{+}IgG2a (para la tinción directa) e IgG1^{+}IgM (para la tinción indirecta) \pm desviación estándar (DE) y el número de experimentos que se indica entre paréntesis.

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Ejemplo 3 Contenido de células progenitoras mielo-eritroides, potencial proliferativo y capacidad de repoblación de la médula in vivo de subgrupos de células CD34^{+} 1. Ensayo de Formación de Colonias con Metilcelulosa

Se mezclaron células a una concentración de 500 células CD34^{+} por ml de metilcelulosa de Iscove (Terry Fox Laboratory) complementada con citoquinas humanas recombinantes purificadas, ligando c-kit (KL) (10 ng/ml) (R & D Systems), GM-CSF y G-CSF (cada uno en 25 ng/ml) (Amgen), IL-3 (10 ng/ml) (Sandoz Pharma) y eritropoyetina (1,2 U/ml) (R & D Systems). Cuando se probaban las células cultivadas, el número de células cultivado en placas se ajustó para ser equivalente a 500 células CD34^{+} por ml, según se calculaba mediante inmunotinción con PE-anti-CD34 (HPCA-2, Becton Dickinson). Para cada tipo de célula probado, se incubaron placas por duplicado o más a menudo cuadruplicado a 37ºC, CO-{2} al 5% en atmósfera humidificada durante 2 semanas. Unidades formadoras de estallidos eritroides (BFU-E), unidades formadoras de colonias (CFU) compuestas solo por monocitos (CFU-M) o por monocitos y granulocitos (CFU-GM) o que comprenden todas las clases de progenitores granulocíticos y monocíticos (CFU-C) y colonias que comprenden granulocitos, monocitos y células eritroides (mezcla de CFU) se clasificaron usando un microscopio invertido (Nikon, Tokio, Japón).

2. Co-cultivo in vitro sobre células AC6.21 para la diferenciación de células mieloides y B

Se establecieron monocapas de células estromales AC6.21 una semana antes del experimento cultivando en placa 1 x 10^{4} células AC6.21 por ml de una placa de fondo plano de 96 pocillos en 100 \mul de medio que consiste en IMDM al 50% (JRH Biosciences), RPMI al 50% con FCS al 10% (Hyclone), 2-mercaptoetanol 4 x 10^{5} M, HEPES 10 mM, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) (P/S) y glutamina 4 mM (JRH Biosciences). Las células clasificadas se distribuyeron en 100 células por pocillo sobre la monocapa de células AC6.21 preestablecida en medio que contenía IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) y factor inhibidor de leucemia (LIF) (50 ng/ml) (Sandoz Pharma). La mitad del medio que contenía citoquina se reemplazó semanalmente. Al final del cultivo de 3 semanas, las células se recogieron pipeteando, se contaron y se transfirieron a ensayos subsiguientes.

3. Ensayo óseo de SCID-hu

Se usaron ratones C.B-17 scid/scid (SCID) reproducidos en las propias instalaciones, de entre 6 y 8 semanas de edad, para la construcción de ratones con hueso SCID-hu de acuerdo con el método descrito por Kyoizumi y otros (1992) Blood 79:1704-1711. Brevemente, huesos largos fetales separados se implantaron subcutáneamente en las almohadillas grasas mamarias de ratones SCID bajo anestesia. Se realizó la inmunofenotipificación HLA del hueso fetal del receptor y de células de ABM donantes con MAbs MA2.1, BB7.2, GAP-A3 conjugados a FITC derivados de hibridomas obtenidos de the American Type Culture Collection (ATCC). Los ratones con huesos SCID-hu se usaron 8 semanas después de la implantación como receptores para poblaciones de células clasificadas de HLA desigual y se acondicionaron para recibir una sola dosis de irradiación en todo el cuerpo (400 cGy a partir de una fuente de ^{137}Cs, Gamma Cell 40, J.L. Shepherd & Associates). Las células clasificadas (3 x 10^{4} en 10 \mul) se inyectaron a continuación directamente en el hueso transplantado usando una jeringa de Hamilton. Después de 8 semanas, los ratones fueron sacrificados y los huesos humanos se retiraron. Las células óseas barridas se resuspendieron en una solución de lisis de glóbulos rojos, a continuación se lavaron dos veces en SB y se contaron antes de teñirse para inmunofluorescencia bicromática con MAbs marcados con FITC contra el alotipo HLA del donante específico en combinación con PE- anti-CD19, -CD33 y -CD34. Se usaron como controles negativos inmunoglobulinas de ratón irrelevantes conjugadas a FITC y PE. Las células se analizaron en un analizador de células fluorescente FACScan (Becton Dickinson).

4. Potencial mieloide y eritroide de subgrupos CD45RA

Informes previos han descrito que los progenitores eritroides y las actividades de LTCIC se enriquecen en células de ABM CD34^{+}CD45RAbajas. Lansdorp y Dragowska (1992). Debido a que se está usando un conjunto de marcadores de linaje, era necesario determinar las actividades de progenitores mieloides de las poblaciones de estudio. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3, en la que los resultados se expresan como el número medio de colonias por 1.000 células totales cultivadas en placa.

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TABLA 3 Ensayo de Formación de Colonias con Metilcelulosa

		CFU-C	BFU-E	Mezcla CFU
Pre-cultivo
Tejido 1	RA^{+}	102	2	0
	RA^{-}	70	82	3
Tejido 2	RA^{+}	48	0	0,5
	RA^{-}	49	58	7
Tejido 3	RA^{+}	80	0	0
	RA^{-}	129	78	6
Post-cultivo de AC6.21
Tejido 4	RA^{+}	3	0	0
	RA^{-}	12	0,2	0
Tejido 5	RA^{+}	1,5	0	0
	RA^{-}	7	0	0
Tejido 6	RA^{+}Thy-1^{-}	0,3	0	0
	RA^{-}Thy-1^{+}	9	1,5	0,3
Tejido 7	RA^{+}Thy-1^{-}	0,2	0	0
	RA^{-}Thy-1^{+}	11	14	0,5

El potencial clonogénico en el ensayo con metilcelulosa mostraba que la mezcla CFU y BFU-E estaban suficientemente enriquecidas en las células RA^{-}, confirmando hallazgos previos. Lansdorp y Dragowska (1992).

El co-cultivo de subgrupos de ABM en la línea de células etromales de médula ósea murina AC6.21 se realizó en presencia de IL-3, IL-6 y LIF. La adición de citoquinas al co-cultivo era necesaria para observar el crecimiento óptimo de células adultas. Después de 3 semanas, las células tanto RA^{-} como RA^{+} se expandían bien (respectivamente de 100 a 500 y de 70 a 200 veces el número de células de entrada en 3 experimentos) y ambos subgrupos producían células visiblemente diferenciadas; sin embargo, los cultivos de RA^{-} presentaban más aglomerados de blastos pequeños que se asemejaban a áreas de guijarros.

Para evitar la desviación procedente de la adición de citoquinas y del punto temporal relativamente temprano elegido para el análisis, los cultivos se inmunofenotipificaron con respecto a la presencia de células CD34^{+}Lin^{-} y se midió su actividad de CFU secundaria. Los cultivos RA^{-} contenían claramente y consistentemente más células CD34^{+}Lin^{-} con mejor mantenimiento del potencial clonogénico secundario que los cultivos RA^{+}. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4 y la Tabla 3, post-cultivo de AC6.21. En la Tabla 4, las células usadas en los Experimentos 4 y 5 también eran CD10^{-}. Además, los cultivos RA^{-} mantenían constantemente una proporción de células CD34^{+}CD45RA^{-} mientras se diferenciaban en células CD34^{+}CD45RA^{+}. En los cultivos RA^{+}, todas las células de la progenie CD34^{+} expresaban CD45RA.

TABLA 4

	% de CD34^{+}Lin^{-}	% de CD19^{+}	% de CD33^{+}
Experimento	RA^{+}	RA^{-}	RA^{+}	RA^{-}	RA^{+}	RA^{-}
1	3,5	13,6	1,2	0,1	93	95
2	0,5	4,0	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
3	0,5	1,7	0,4	0	94	97
4	0,6	2,0	0,4	0,1	91	97
5	3,0	12,5	3,0	0	83	90

La jerarquía en lo primitivo de estos subgrupos puede inferirse de ese análisis para deducir que las células RA^{-} son las más inmaduras y pueden diferenciarse directamente en la progenie RA^{+}.

Finalmente, el potencial de reconstrucción hematopoyética a largo plazo de los subgrupos CD45RA se examinó en el ensayo de hueso SCID-hu in vivo que apoya la hematopoyesis de múltiples linajes a largo plazo. DiGiusto y otros (1994). Se inyectaron células clasificadas en fragmentos de huesos humanos preimplantados en ratones SCID sustitutos. Después de 8 semanas, las células RA^{-} se habían injertado según se evidencia por la presencia de células B CD19^{+}, células mieloides CD33^{+} y células progenitoras CD34^{+} derivadas del donante (figura 3). No se recuperó progenie del subgrupo RA^{+} aunque se sabe que la dosis de células probada permite el injerto consistente de células CD34^{+}Lin^{-}. Por lo tanto, aunque las células RA^{+} contienen actividad progenitora mieloide y linfoide B, según se determina a partir de los ensayos de co-cultivo in vitro y de metilcelulosa, esta población carece de células madre más primitivas requeridas para el injerto en el ensayo de hueso SCID-hu.

Tomados en conjunto, estos datos confirman y amplían observaciones previas, que muestran que la actividad hematopoyética más primitiva entre los linajes mieloide, eritroide y linfoide B se encuentra en la población RA^{-}. Al mismo tiempo, está claro que las células RA^{+} carecen de células madre y progenitores eritroides pero contienen progenitores mieloides.

5. Fraccionación del subgrupo RA^{+}

Para afinar la comprensión de las fases aguas abajo de la diferenciación de células madre hematopoyéticas, se examinaron precursores de células B primarios con respecto a su potencial de reconstitución de células T. Se ha presentado que el precursor de células B más temprano es identificable por la expresión en membrana de CD34 y de CD10 pero ausencia de CD19 y CD2. Uckun (1990). Los datos presentados aquí confirman que existe un pequeño subgrupo de CD10 que expresan CD34^{+}Lin^{- } (Lin incluye entre otros marcadores CD19 y CD2) (figura 4). Estas células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (denominadas aquí en lo sucesivo 10^{+}) residen en la población RA^{+}, debido a que la clasificación de células CD10^{+} mostraba agotamiento del compartimento RA^{+} en aproximadamente la mitad mientras que sólo reducía la población RA^{-} en 10%. El potencial clonogénico de células 10^{+} en el ensayo de la metilcelulosa era casi inexistente sin colonias eritroides y casi no se producían colonias mieloides excepto por muy pocas CFU-C que estaban compuestas sólo por macrófagos (Tabla 5). El co-cultivo de células 10^{+} sobre estroma AC6.21 en presencia de IL-3, IL-6 y LIF durante 3 semanas mostraba sólo un crecimiento moderado pero una diferenciación fuerte en células B CD19^{+} (Tabla 5).

TABLA 5 Potencial Diferenciador de Células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}

	CFU por 1.000 células		Análisis de ensayo de AC6.21
Exp Nº	CFU-C	BFU-E	Mezcla CFU	% de CD33	% de CD19
1	2	0	0	83	8
2	2	0	0	17	61
3	N.R.	N.R.	N.R.	24	14
N.R. no realizado

Un experimento demostraba la presencia de más de 60% de células B CD19^{+} en el cultivo en masa con citoquinas después de 3 semanas. Notablemente, estos cultivos también contenían células CD33^{+}, aunque en una proporción muy inferior que los cultivos iniciados con células RA^{+} (véase la Tabla 4).

Las células progenitoras mieloides y eritroides eran virtualmente inexistentes en la población de células CD34^{+}Lin^{-}
CD10^{+} (Tabla 6). Se establecieron cultivos en metilcelulosa en presencia de IL-3 recombinante humana (19 ng/ml) (Sandoz Pharma, Basilea, Suiza), factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos (GM- CSF) (25 ng/ml), CSF de granulocitos (G-CSF) (25 ng/ml), eritropoyetina (EPO) (1,2 U/ml) y ligando c-kit (KL) (10 ng/ml) (R&D systems, Minneapolis, MN). Los cultivos se incubaron en atmósfera humidificada a 37ºC, CO_{2} al 5%, aire al 95%, durante 2 semanas. Se establecieron co-cultivos de médula ósea sobre estroma de médula ósea de ratón AC6.21 preformado, en presencia de IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) y LIF (50 ng/ml). Después de 3 semanas de cultivo, todas las células se recogieron y se contaron para calcular la expansión celular total. Las células se tiñeron con mAbs conjugados a fluoresceína y PE y se analizaron sobre un explorador de células activado por fluorescencia (Becton Dickinson). La tinción de células específica se realizó en la compuerta de células hepáticas según se determina por el tamaño, la granularidad y la exclusión con yoduro de propidio. Los resultados se expresan como % de células positivas después de la extracción del fondo (tinción con anticuerpos IgG1 e IgG2a de ratón irrelevante).

Se observaron unidades formadoras de colonias (CFU) mieloides ocasionales compuestas por células mononucleares grandes (2 x 1000 células). La presencia de tales colonias raras debida a la contaminación por clasificación de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} parece improbable ya que las colonias eritroides nunca fueron descartadas. Las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} altamente purificadas obtenidas después de dos rondas de clasificación por citometría de flujo no daban formación de tales colonias incluso después de períodos de cultivo prolongados (3 y 4 semanas). Según se anticipa, la población CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} probada en paralelo generaba un número grande de colonias de linajes mieloide, eritroide o mixto (eritroide y mieloide) (Tabla 6).

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También se evaluaron células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} en cultivos de médula ósea apoyados con estroma. Las células clasificadas se co-cultivaron sobre células estromales AC6.21 murinas en presencia de IL-3, IL-6 y factor inhibidor de leucemia (LIF), una combinación de citoquinas que se sabe que apoya el crecimiento de células hematopoyéticas adultas según se determina por Murray y otros (1994). Después de 3 semanas, las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} se expandían considerablemente (de 174 a 500 veces de expansión celular total) y 3-18% de células CD34^{+} todavía estaban presentes en el cultivo, indicando alguna retención de células hematopoyéticas primitivas. Se observaron poblaciones morfológicamente heterogéneas de células mieloides. La gran mayoría de células cultivadas (86-97%) expresaba el antígeno mieloide CD33, sin células linfoides CD19^{+} detectables.

En contraste, bajo condiciones experimentales idénticas, las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} demostraban un potencial proliferativo limitado (de 3 a 42 veces la expansión celular total). Se mantenían pocas células CD34^{+} (de 0,7 a 3%) en el cultivo y las células mostraban un potencial fuerte para diferenciarse en células linfoides CD19^{+}.

Un experimento preliminar indicaba que las células CD34^{+}Lin^{- }CD10^{+} no proporcionaban reconstitución hematopoyética a largo plazo (8 semanas) de fragmentos de hueso humano implantados en ratones SCID. Además, el agotamiento de CD10 de la población CD34^{+}Lin^{-} no evitaba la repoblación hematopoyética de huesos SCID-hu. Así, las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} eran funcionalmente y fenotípicamente distintas de células madre.

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 6, donde N.P. indica no probado; los resultados de los cultivos en metilcelulosa se expresan como números de progenitores mieloides (CFU-G, M y GM)/eritroides (BFU-E y CFU-E)/multipotentes (mezcla CFU) por 1000 células cultivadas en placa. En los Experimentos 2 y 3, las células CD10^{-} también eran CD45RA^{-}, lo que explica su contenido de mezcla CFU superior. En los Experimentos 4 y 5, las células CD10^{+} estaban altamente purificadas después de dos rondas consecutivas de clasificación por citometría de flujo. El nuevo análisis de la pureza de clasificación después de la primera ronda era 91% y 98% para los Experimentos 4 y 5, respectivamente.

(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 4 Potencial linfoide B de subgrupos CD34^{+}CD45RA

La capacidad para diferenciarse en células B se analizó después del co-culitvo sobre células estromales de médula ósea murina AC6.21 que se sabe que apoyan la diferenciación de células B desde células CD34^{+}Lin^{-} de médula ósea fetal y de adulto. Baum y otros (1992) y DiGiusto y otros (1994). Según se describe previamente, las células RA^{+} y RA^{-} crecían sobre células AC6.21 en presencia de IL-3, IL-6 y LIF. Los cultivos derivados de células RA^{+} y RA^{-} estaban casi exclusivamente compuestos por células mieloides CD33^{+} (Tabla 4).

A menudo se observó una proporción pequeña pero significativa de células CD19^{+} (de 1 a 2%) en los cultivos RA^{+} pero no en el cultivo RA^{-}. Las características de dispersión directa y lateral de las células CD19^{+} estaban de acuerdo con su naturaleza de células B y los cultivos RA^{+} también contenían células CD10^{+}. Bajo estas condiciones experimentales, la producción de células B a partir de los cultivos RA^{-} no se detectó incluso después de omitir
IL-3 para reducir la proliferación de células mieloides. La falta de producción de células B CD19^{+} en cultivos RA^{-} puede deberse a una cinética de diferenciación lenta. En efecto, existe un progenitor de células B temprano en el subgrupo RA^{-} debido a que, según se menciona previamente, este subgrupo era capaz de injerto en huesos SCID-hu con producción sostenida de células B derivadas del donante (Figura 3). En contraste, las células RA^{+} parecen contener un progenitor de células B tardío, fácilmente diferenciado y expandido in vivo pero incapaz de la repoblación a largo plazo de la médula ósea.

Se observó una diferenciación linfoide B considerable en cultivos de médula ósea estimulados con IL-3, IL-6 y LIF iniciados con células CD34^{+}Lin^{- }CD10^{+} (Tabla 6). Después de 3 semanas, tales cultivos contenían 8-76% de células B CD19^{+} que por lo demás carecían de CD34, expresaban CD10 y tenían las características (tamaño y granularidad) de células linfoides (Tabla 6 y figura 5). Estos datos confirman que las células de ABM CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} eran capaces de servir como precursores de células B e indican que su potencial progenitor de células B es más inmediato que el de su homólogo CD10^{-}.

Ejemplo 5 Potencial linfoide T de subgrupos CD45RA 1. Ensayo de timo SCID-hu

La inmunofenotipificación HLA del timo del receptor y de células de ABM del donante se realizó como se describe previamente. Fragmentos de timos fetales se pusieron sobre filtros de nitrocelulosa (0,8 \mum, Costar Corp., Cambridge, MA) sobre placas de gelatina (Gelfoam, Upjohn) de acuerdo con el método descrito por Galy y otros (1993). Después de 7-13 días de incubación a 25ºC y CO_{2} al 5%, los fragmentos de timo se irradiaron con 250 cGy de una fuente de ^{137}Cs (J.L. Shepherd & Associates), se lavaron e inmediatamente se microinyectaron con las células clasificadas de HLA desigual en un volumen de 1 \mul usando un microinyector relleno de aceite (Narishige) y micropipetas de vidrio de 1 mm de diámetro (World Precision Instruments). Los fragmentos se pusieron de nuevo sobre los filtros y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%, durante la noche y a continuación se insertaron bajo la cápsula renal de ratones SCID de 6-8 semanas de edad anestesiados reproducidos en las propias instalaciones. Los ratones fueron sacrificados de 6 a 7 semanas después del trasplante y los injertos de timo se recuperaron, se redujeron a una suspensión de células simples y se sometieron a análisis de inmunofluorescencia tricromático en el FACScan. Se usaron los siguientes MAbs: FITC-anticuerpos anti-HLA, -CD2 o control irrelevante de IgG1 de ratón, PE W6/32, anti-CD1a (Coulter), anti-CD4 o control de IgG1 de ratón (Becton Dickinson) y anti-CD45, -CD8, -CD3 conjugado a Tricolor (TC) o control irrelevante de IgG1 de ratón (Caltag).

El potencial de células progenitoras T se probó en el ensayo del timo SCID-hu, que se ha observado que apoya la diferenciación de células T intratímica de células CD34^{+}Lin^{-} aisladas de médula ósea fetal y de adulto así como de sangre periférica movilizada de adulto. DiGiusto y otros (1994) y Galy y otros (1994). Números de células decrecientes de los subgrupos RA^{+} o RA^{-} se inyectaron en injertos tímicos que se retiraron y se analizaron de 6 a 7 semanas después del trasplante en ratones SCID. Ambos subgrupos se injertaban y generaban células T; sin embargo, estaba claro que el subgrupo RA^{+} se injertaba consistentemente de modo más satisfactorio, particularmente en números de células bajos (de 2 a 3000 células por injerto) (figura 6). La calidad de la timopoyesis derivada de donante se examinó en cada injerto mediante inmunotinción tricromática. Los subgrupos tanto RA^{+} como RA^{-} daban lugar a timocitos de donante que en su mayor parte expresaban altos niveles de CD1, coexpresaban CD4 y CD8 y tenían una expresión graduada de CD3. Las células T maduras que tenían los TCR \alpha\beta o \gamma\delta podían expandirse a partir de injertos tímicos reconstituidos con células RA^{+} según se describe. Galy y otros (1994).

La maduración tímica se asocia con el incremento de CD3, la pérdida de CD1 y de la coexpresión de antígenos CD4 y CD8. Galy y otros (1993) y Terstappen y otros (1992). El examen cuidados de estos parámetros no mostraba diferencia significativa en el fenotipo de timocitos generados a partir de los subgrupos RA^{+} o RA^{- }. Por lo tanto, el ensayo del timo SCID-hu, según se diseña normalmente, no permitía distinguir entre células progenitoras T tempranas y tardías dentro del transcurso de tiempo examinado (de 6 a 7 semanas después de la inyección). Tomados en conjunto, estos datos indican que las células RA^{+} contienen progenitores tardíos para los linajes mieloide y B, y presentan actividad de células progenitoras T vigorosa. El subgrupo RA^{-} tiene potencial primitivo para los linajes eritroide, mieloide y de células B y también contiene actividad de células progenitoras T aunque en una frecuencia reducida en comparación con células RA^{+}.

2. Expresión de Thy-1, CD38 o HLA-DR y actividad de células progenitoras T

Una consecuencia práctica de estos resultados es que la presencia de la actividad de células progenitoras T puede deducirse del análisis fenotípico presentado en la figura 2. Debido a que las células RA^{+} tienen actividad de células progenitoras T y al mismo tiempo son casi totalmente positivas para CD38 y HLA-DR, puede deducirse lógicamente que la actividad debe retirarse en los compartimentos CD38^{+} o HLA-DR^{+}. Los resultados que verifican esto se muestran en la Tabla 7. En la Tabla 7, el éxito del injerto se expresa como la relación de injertos positivos para células donantes (>1%) al número de injertos analizados.

TABLA 7

Subgrupos	experimentos	célula probada	éxito del injerto
CD34^{+}Lin^{-}CD38^{+}	1	10.000	4/4
CD34^{+}CD15^{-}	1	10.000	3/6
HLA-DR^{+}
CD34^{+}Lin^{-}Thy-1^{+}	3	10.000	16/20
CD34^{+}Lin^{-}Thy-1^{-}	3	10.000	10/20
CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+}	2	2.000	7/8
Thy-1^{-}
CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-}	2	2.000	7/8
Thy-1^{+}

Thy-1 es un marcador expresado sobre células hematopoyéticas muy primitivas en médula ósea fetal y de adulto y sangre de cordón umbilical. Baum y otros (1992); Craig y otros (1994) y Mayani y Lansdorp (1994). Las células de ABM tanto CD34^{+}Lin^{-}Thy-1^{+} como CD34^{+}Lin^{-}Thy-1^{-} podrían generar células T. El perfil fenotípico mostrado en la figura 2 indica que el potencial de reconstitución de células T de células Thy-1^{-} podría deberse a la presencia de células RA^{+}. Para probar esta hipótesis, células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+}Thy-1^{-} clasificadas se ensayaron en el sistema de timo SCID-hu y presentaban buen potencial de reconstitución de células T aun cuando se usaran bajos números de células (Tabla 7). La actividad de reconstitución de células T del subgrupo pequeño de células que tienen CD45RA y Thy-1 no se ha probado. Por otra parte, las células CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{-}Thy-1^{+} presentan buen potencial de reconstitución de células T. Estas células también estaban muy fuertemente enriquecidas en actividad hematopoyética primitiva según se muestra por el mantenimiento de células CD34^{+}Lin^{-} y CD34^{+}CD45RA^{-} en cultivo con potencial clonógenico secundario de mezcla CFU y BFU-E (Tabla 3). Con todos los subgrupos examinados (Thy-1^{+}, Thy-1^{-}, CD38^{+}, HLA-DR+), la timopoyesis era cualitativamente equivalente a la generada a partir de células RA^{+} en términos de expresión de CD1, CD3, CD4 y CD8 después de 6 semanas.

Cuando se inyectaban células 10^{+} en fragmentos de timo, se observaba reconstitución de células T incluso cuando se probaban bajos números de células (2.000 células). Después de 6 semanas, los timocitos derivados de donante co-expresaban CD4 y CD8 con ato CD1a y expresión graduada de CD3, como se observa con timocitos derivados de otros subgrupos (figura 7). Esta población 10^{+} parece por lo tanto la más comprometida a los linajes linfoides.

En el ensayo del timo SCID-hu, se encontró potencial de células T en los subgrupos RA^{-}, RA^{+} y 10^{+}. Como se menciona previamente, la relación jerárquica entre las células RA^{-}, RA^{+} y 10^{+} no podía inferirse de diferencias cualitativas en la progenie de células T debido a que, a las 6 semanas, los injertos de timo reconstituidos tenían proporciones comparables de células positivas CD1, CD3 y CD4/CD8 dobles en el compartimento derivado del donante.

Se efectuaron estudios cinéticos para examinar el potencial de reconstitución de células T de células 10^{+} y células CD24+Lin^{-}CD10^{-} (10^{-}). Se encontró que las células tanto 10^{+} como 10^{-} podían repoblar injertos tímicos y generar timocitos inmaduros (que expresan altos niveles de CD1a) hasta 8 semanas después de la inyección de células. Entre las 8 y 11 semanas de reconstitución, sin embargo, parece que los injertos inyectados con células 10^{+} dejaban de producir células T inmaduras y sólo contenían timocitos fenotípicamente maduros (CD1^{-}, CD4^{+} o CD8^{+} y CD3^{brillante}) (Figura 8).

Tomados en conjunto, estos datos indican fuertemente que las células 10^{+} son las más maduras y están fuertemente comprometidas a la diferenciación linfoide.

Ejemplo 6 Potencial de células progenitoras NK de los subgrupos CD45RA

Se ha demostrado recientemente que las células NK pueden diferenciarse de células de la médula ósea CD34^{+} con IL-2 y estroma. Miller y otros (1992) Blood 80:2182-2187 y Lotzová y otros (1993) J. Immunol. 150:5263-5269. Se examinó la capacidad de la línea celular estromal murina AC6.21 para apoyar la diferenciación de células NK. Células clasificadas en los subgrupos CD34^{+}Lin^{-}, según se describe en el Ejemplo 1, se ensayaron con respecto a la diferenciación de células NK como sigue.

Co-cultivo in vitro sobre células AC6.21 para la diferenciación de células NK

Para ensayos de células NK, células clasificadas se cultivaron en placas sobre monocapas de AC6.21 preformadas en IMDM con FCS al 10%, 40 \mug/ml de transferrina (Boehringer Mannheim), 5 \mug/ml de insulina (Sigma) complementada con 50 mg/ml de IL-2 humana recombinante (Sandoz Pharma, Basilea, Suiza). Después de 1 semana, la mitad del medio se reemplazó por medio que contenía rhIL-2 (50 ng/ml). Subsiguientemente, medio que contenía IL-2 se cambió dos veces por semana durante al menos 2 semanas para complementar la desaparición de células estromales. Las células se recogieron pipeteando, se contaron y se inmunotiñeron con MABs anti-CD56 conjugado a PE y anti-CD3 conjugado a FITC o sus controles negativos apropiados (Becton Dickinson). Las células se analizaron en un analizador de células fluorescente FACScan (Becton Dickinson).

Bajo estas condiciones, en de 2 a 3 semanas, las células RA^{+} se desarrollaron en linfoblastos que expresaban CD56 pero no CD3 (figuras 9 y 10). Lo positivo para CD56 y la falta de expresión de CD3 superficial detectable es típico de células NK. Lanier y otros (1992) Immunology Today 13:392-395. Los cultivos RA^{+} generalmente destruían su capa estromal de apoyo en las primeras dos semanas según se describe por Miller y otros (1992). Por otra parte, el subgrupo 10^{+}, que no tiene casi potencial mieloide pero tiene actividad progenitora de células T y B descrita en el Ejemplo 2, puede generar células NK (figura 11). Las células NK CD56^{+}CD3^{-} producidas en el cultivo también destruían el estroma.

El subgrupo RA^{-}, sin embargo, no daba lugar a células NK muy eficazmente en el período de tiempo examinado (hasta 7 semanas). A las 3 semanas, los cultivos contenían una gran proporción (>90%) de células mieloides CD33^{+} que no se expandían muy bien después de 6 semanas. Unas pocas células NK podían observarse a veces en el cultivo RA^{-}, pero su proporción era siempre muy baja en comparación con cultivos RA^{+}10^{-} y 10^{+}.

Se llevaron a cabo experimentos de dilución limitativa para estimar la frecuencia de células sensibles en este ensayo. Los pocillos de crecimiento se evaluaron visualmente en la semana 6 con respecto a la presencia de células linfoblásticas y la puntuación se confirmó mediante inmunotinción para células que expresan CD56 pero no CD3 (Tabla 8).

TABLA 8 Cultivo de NK en la Semana 6

	células/pocillo	NK positivas
CD10^{+} (RA^{+})	500	4/6
RA^{+}10^{-}	2	2/96
	10	1/47
	50	0/26
	100	3/24
RA^{-}10^{-}	5000	3/12
	1000	0/24
	150	0/24
	10	0/36

En tres experimentos independientes, se observó que las células RA^{+} (10^{+} y 10^{-}) generaban células NK mientras que las células RA^{-} lo hacían mucho menos eficazmente. La diferenciación de células NK en este sistema se confirmó ya que la población RA^{+} de partida no expresaba CD56. Además, la alta frecuencia de progenitores NK en la población RA^{+} no parece compatible con la expansión de células maduras dada la pureza de las clasificaciones durante el reanálisis (>90%). Por otra parte, las células RA^{+}10^{-} se han pasado a través de dos rondas de clasificación contra células positivas para el linaje carentes de células NK maduras CD56^{+}. Es probable que la frecuencia inferior de progenitores NK en el subgrupo RA^{-} se deba a su inmadurez así como el enmascaramiento por la alta proporción de células no comprometidas al linaje linfoide. Para confirmar esta hipótesis, co-cultivos de AC6.21 de 3 semanas de edad iniciados con células RA^{-} se inmunotiñeron con anticuerpos anti-CD34 más anti-CD45RA y las células cultivadas se clasificaron en los subgrupos CD34^{+}Lin^{}CD45RA^{-} y CD34^{+}Lin^{-}CD45RA^{+}. El enriquecimiento en las actividades de BFU-E y mezcla CFU se confinó a las células CD34^{+}CD45RA^{-} clasificadas y, de nuevo, se generaron células NK predominantemente a partir de la progenie CD34^{+}CD45RA^{+} clasificada.

Estos resultados indican una buena correlación entre el mantenimiento del fenotipo y la función. Esto apoya el hecho de que las células RA^{-} son más inmaduras y son los precursores inmediatos o subgrupos de células RA^{+}.

La diferenciación de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} de ABM en células NK CD34-CD56^{+}CD3^{-} se obtuvo en de 1 a 2 semanas de cultivo en la línea celular estromal de médula ósea murina AC6.21 en presencia de IL-2 en todos los experimentos realizados (n=6). El potencial de diferenciación NK de células CD34^{+}Lin^{- }CD10^{+} se confirmó con células altamente purificadas obtenidas después de dos rondas consecutivas de clasificación por citometría de flujo.

No se observaron células monocíticas/mieloides en cultivos CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} aunque tales condiciones de cultivo apoyan la generación de células monocíticas/mieloides en cultivos de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-}. Las células NK CD56^{+}CD3^{-} derivadas de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (figura 11-cuadro A) eran funcionales según se demostraba por la destrucción dependiente de la dosis de células diana K562 sensibles a NK de acuerdo con el método descrito por Sánchez y otros (1994) J. Exp. Med. 180:569 (figura 11-cuadro B). Mediante análisis de dilución limitativa, de acuerdo con el método descrito por Taswell (1981) J. Immunol. 126:1614, de una muestra de ABM, se obtenía una frecuencia superior de progenitores NK con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (1/75) en comparación con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-} (1/325) (figura 11-cuadro C). Los estudios cinéticos indican que las células NK CD56^{+}CD3^{-} aparecían antes en cultivos iniciados con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} (fenotípicamente detectables en el cultivo el día 9) que en cultivos de CD34^{+}Lin^{- }CD10^{-} (no detectables fenotípicamente en el cultivo antes del día 16). Así, las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} tienen una capacidad mayor para generar células NK que el resto de las células de ABM CD34^{+}Lin^{-}.

En conclusión, se presentan dos nuevos hallazgos con respecto a las células NK. En primer lugar, se observó que AC6.21, una línea celular murina, puede apoyar la diferenciación de células NK de médula ósea de adulto humano en presencia de IL- 2. En segundo lugar, la pequeña población de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} tiene potencial de diferenciación NK además de actividad progenitora de células B y T, pero carece virtualmente de actividad mieloide. Esto está de acuerdo con que la población es un progenitor linfoide pretímico.

Ejemplo 7 Jerarquía del potencial de progenitores linfoides

Los resultados presentados aquí muestran claramente que las células RA^{- } son más inmaduras que las células RA^{+} en los linajes B, mieloide y eritroide, y que las células RA^{+} proceden directamente de células RA^{-}. La relación entre los subgrupos 10^{+} y RA^{+} se examinó a continuación para derivar un modelo jerárquico de desarrollo linfoide. Se obtuvieron tres subgrupos, CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}, CD34^{+}Lin^{- }CD10^{-}CD45RA^{+} y CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-}CD45RA^{-}, después de dos clasificaciones consecutivas y se probaron en los ensayos de diferenciación de células B y T. Según se esperaba, las células RA^{-}CD10^{-} no producían células B CD19^{+} detectables después de tres semanas de cultivo con células AC6.21 e IL-3, IL-6 y LIF.

Por otra parte, las células CD10^{+} así como RA^{+}CD10^{-} se diferenciaban en células B CD19^{+} y CD10^{+} (figura 5). Además, se observó que los cultivos RA^{+}CD10^{-} generaban un pequeño subgrupo de células CD34^{+}CD10^{+}, demostrando por lo tanto la relación directa entre estos dos subgrupos.

Ejemplo 8 Determinación de la presencia de propulsores de células dendríticas

En los ejemplos previos, siempre se observaban células más grandes que expresaban CD33, incluso en cultivos de médula ósea iniciados con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} altamente purificadas completamente carentes de células progenitoras clonogénicas (Tabla 9). Sin embargo, en todos los experimentos, la proporción de células CD33^{+} era considerablemente menor que en cultivos de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-}. Para explorar completamente el potencial diferenciador de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}, se iniciaron cultivos líquidos con 9 citoquinas (IL-1, IL-3, IL-6, IL-7, KL, GM- CSF, factor de necrosis tumoral (TNF), ligando FLT3/FLK2 (FL) y EPO) para apoyar el desarrollo de un amplio espectro de células hematopoyéticas. Se incubaron subgrupos de células CD34^{+}Lin^{-}CD10 (CD10^{+} y CD10^{-}) de ABM a 2.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo en medio IMDM complementado con IL-3, IL- 6, GM-CSF recombinantes humanos (cada uno en 25 ng/ml) (Sandoz Pharma), IL-7 (10 ng/ml) (Genzyme, Cambridge, MA), IL-1 (5 ng/ml), TNF (25 ng/ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), EPO (2 U/ml), KL (10 ng/ml) (R&D systems), FL (10 ng/ml) purificado después de la expresión en Pichia pastoris a partir de secuencias publicadas en Hannum y otros (1994) Nature 368:643. Los cultivos se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%, aire al 95%, y el medio se agotó en demi dos veces a la semana. Los cultivos se iniciaron con subgrupos CD34^{+}Lin^{-}CD10 (CD10^{+} y CD10^{-}) y, después de 12 a 20 días, las células cultivadas se tiñeron con un método bicromático directousando mAbs conjugados a fluoresceína o PE según se muestra en la figura 12. Los resultados de la Tabla 9 se expresan como porcentajes de células positivas para el marcador (después de la sustracción de la tinción de fondo con un control irrelevante de IgG1 + IgG2a) e intensidad de fluorescencia media (mfi) de la población de células positiva. El análisis se realizó aplicando una compuerta viva (negativa a yoduro de propidio) o directa/de dispersión a cultivos de células CD10^{+} y CD10^{-} del mismo experimento. En la Tabla 9, N/A indica no aplicable y NT indica no probado.

27

En estos cultivos, las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} crecían moderadamente (la expresión celular total era de 5 a 10 veces menor que los cultivos iniciados con células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{-}) y en todos los casos se diferenciaban exclusivamente en células con características morfológicas (figura 13-A) e inmunofenotípicas (figura 12-A-B-C- D y Tabla 9) asociadas con células dendríticas (DV). Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271. Los cultivos 10^{+} contenían células con características de dispersión directa y lateral altas (figura 12-A), de 40 a 63% de las células expresaban niveles muy altos de HLA-DR, de 23 a 42% de las células tenían expresión brillante de CD1a, de 18 a 26% de las células mostraban bajos niveles de CD15, mientras que ninguna expresaba el antígeno monocítico CD14. La variabilidad en el tamaño y la expresión de CD1a está de acuerdo con la microheterogeneidad dentro de poblaciones de DC. Steinman (1991).

Bajo condiciones experimentales idénticas, las células CD34^{+}Lin^{- }CD10^{-} crecían fuertemente (de 60 a 95 veces de expansión celular en de 12 a 15 días) y se diferenciaban en una mezcla morfológicamente heterogénea de mielocitos, granulocitos, monocitos, macrófagos, eritroblastos, DC y células cebadas (figura 13-B) con diversas características de dispersión (figura 12-E). Estas observaciones confirman que las condiciones de cultivo apoyaban la diferenciación en una serie amplia de células pertenecientes a múltiples linajes hematopoyéticos. El análisis inmunofenotípico de cultivos CD34^{+}Lin^{-}CD10 revelaba de 19 a 25% de células que expresaban altos niveles de CD14, de 20 a 30% de células que tenían CD15, de 27 a 51% de células que expresaban HLA-DR aunque con niveles inferiores que en células en cultivos de células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+}, y muy pocas células (de 0 a 2%) que expresaban CD1a.

Ejemplo 9

La diferenciación de poblaciones de células en el linaje megacariocítico se evaluó estableciendo un cultivo líquido complementado con ligando Mp1/trombopoyetina e IL-3, ambos potentes inductores del desarrollo de megacariocitos. Kaushansky y otros (1994) Nature 369:568. Se cultivaron subgrupos de células CD34^{+}Lin^{-}CD10 (CD10^{+} y CD10^{-}) de ABM durante 7 días en presencia de IL3 recombinante humana purificada (10 ng/ml) y 10% de fluido sobrenadante de células Cos-7 transfectadas con secuencias de cDNA en ligando Mp1, obtenidas de Bartley y otros (1994) Cell 77:1117, en IMDM con plasma humano al 5%. El medio se cambió dos veces en 7 días. Bajo estas condiciones de cultivo, la mayoría de las células CD34^{+}Lin^{-}CD10^{+} no sobrevivía (16% de viabilidad con exclusión con azul de tripano) mientras que las contrapartidas CD10^{-} (viables al 98%) se diferenciaban en megacarioblastos.

Tomados en conjunto, los datos muestran que las células CD34^{+}Lin^{- }CD10^{+} no eran capaces de generar células eritroides, monocíticas, granulocíticas y megacariocíticas, pero pueden diferenciarse DC y todas las clases de células linfoides.

Claims

1. Un método para obtener una composición que comprende células hematopoyéticas enriquecidas en células progenitoras linfoides, dendríticas y/o mieloides, en el que dichas células son sustancialmente incapaces de diferenciarse en células eritroides, caracterizado porque una mezcla de células hematopoyéticas humanas se separa en una fracción celular enriquecida que expresa marcadores superficiales CD34, CD45RA pero que sustancialmente no expresa CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 y glicoforina.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fracción celular enriquecida expresa además CD10.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fracción celular enriquecida no expresa CD10.

4. Una composición que comprende células progenitoras hematopoyéticas humanas enriquecidas que expresan marcadores superficiales CD34, CD45RA pero que sustancialmente no expresan CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 y glicoforina.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que las células contienen una molécula de DNA recombinante que codifica un polipéptido comprendido por una región de especificidad antigénica y capaz de transducir una señal cuando se expresa en una célula madura.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la molécula de DNA recombinante codifica un receptor de células T o una proteína quimérica que comprende una región de transducción de señal funcional y un sitio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo.

7. Un método para obtener modificadores de la respuesta biológica implicados en la proliferación y/o la diferenciación de células progenitoras mieloides, linfoides y/o dendríticas, caracterizado porque una muestra de modificador de la respuesta biológica se prueba con respecto a este efecto sobre la proliferación y/o la diferenciación de células hematopoyéticas humanas que expresan los marcadores de la superficie celular CD34, CD45RA pero que sustancialmente no expresan CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD15, CD16, CD56 y glicoforina.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la fracción celular enriquecida expresa además CD10.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la fracción celular enriquecida no expresa CD10.

10. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 4, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar estados que requieren la repoblación transitoria de células linfoides, mieloides y/o dendríticas.