ES2336637A1 - Procedimiento parala expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordonumbilical, sangre periferica movilizada o medula osea. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la expansión indiferenciada u orientada a linaje mieloide de células madre hematopoyéticas (CMH). Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de expansión de CMH a partir de la sangre del cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada. Dicho procedimiento comprende las etapas de cultivo de expansión a volumen constante de las células CDS4+ purificadas, cultivo de expansión a volumen variable de dichas células y el acondicionamiento de las células CD34+ para el trasplante. Con este procedimiento se genera de forma reproducible, robusta y segura la dosis de CMH indiferenciadas u orientadas a linaje mieloide necesarias para su uso clínico.
Description
\global\parskip0.900000\baselineskip
Procedimiento para la expansión indiferenciada u
orientada a linaje mieloide de células madre hematopoyéticas
procedentes de sangre de cordón umbilical, sangre periférica
movilizada o médula ósea.
La presente invención se refiere a un
procedimiento aplicable para la expansión in vitro
indiferenciada u orientada a linaje mieloide de células madre
hematopoyéticas (CMH). Dicho procedimiento comprende las etapas de
expansión a volumen constante de las células madre purificadas,
expansión a volumen variable de dichas células y el
acondicionamiento de las células para el trasplante. Con este
procedimiento es posible expandir de forma reproducible y robusta
las CMH hasta alcanzar dosis clínicamente significativas o bien de
células inmaduras u orientadas a linaje mieloide de una manera
rápida y segura.
Las CMH son células multipotenciales capaces,
mediante un complejo proceso de autorenovación y diferenciación, de
mantener la homeostasis del órgano hematopoyético dando lugar, de
forma exquisitamente regulada, a todos los linajes celulares de la
sangre. Estos linajes se organizan en dos grandes grupos con
funcionalidades distintas: mieloides y linfoides. Los mieloides
agrupan a: monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos,
eosinófilos, que combaten las infecciones en el organismo; los
megacariocitos (plaquetas), que participan del proceso de
coagulación de la sangre, así como los eritrocitos, transportan el
oxígeno a los tejidos. El otro gran grupo de células sanguíneas son
las linfoides compuesto por: células B, células T y NK, que se
ocupan de la vigilancia inmunológica.
El trasplante autólogo o alogénico de CMH
representa una importante alternativa terapéutica para enfermedades
hematológicas como las neoplasias, inmunodeficiencias primarias y
desordenes metabólieos. Las principales fuentes para el trasplante
terapéutico de CMH son: la médula ósea (MO), la sangre periférica
movilizada (SPM) y la sangre de cordón umbilical (SCU).
Históricamente, la médula ósea ha representado la fuente principal
de células madre para el trasplante de pacientes pediátricos y
adultos. No obstante, la dificultad de encontrar donantes
compatibles y el riesgo de sufrir la enfermedad del injerto contra
el huésped asociado al trasplante alogénico, ha limitado su
aplicabilidad. Problemática que la MO comparte con la sangre
periférica movilizada. En respuesta a esta problemática, y como
fuentes alternativas a la MO y SPM, se pueden utilizar para
transplante hematopoyético las CMH procedentes de sangre de cordón
umbilical. Esta fuente de CMH presenta una serie de importantes
ventajas con respecto a la MO y SPM, tales como el menor grado de
correspondencia del complejo mayor histocompatibilidad de HLA
donante-receptor necesario, la menor incidencia de
la enfermedad del donante contra el huésped y la gran disponibilidad
de unidades almacenadas en los bancos de cordón de todo el mundo, lo
que facilita la rápida localización de potenciales donantes
(Barker y otros Searching for unrelated donor hematopoietic stem
cells: availability and speed of umbilical cord blood versus bone
marrow. Biol Blood Marrow Trasplant. 2002;
8:257-260).
La mayor desventaja en el trasplante de SCU es
la baja dosis celular disponible de CMH por unidad respecto a las
disponibles en SMP y MO. Esta particularidad se traduce en un mayor
riesgo de fallo del trasplante y elevados tiempos de aplasia
mieloide, que dejan al paciente expuesto a contraer infecciones
potencialmente mortales. Esta problemática limita la utilización de
las CMH de SCU básicamente al trasplante pediátrico. La cantidad de
CMH disponibles para el trasplante es, por tanto, un parámetro
crítico. El mejor parámetro de predicción para la supervivencia y
recuperación de los parámetros hematológicos normales en pacientes
pediátricos y adultos es la dosis celular (Barker y otros Serious
infections after unrelated donor trasplantation in 136 children:
impact of stem cell source. Biol Blood Marrow Trasplant. 2005;
11:362-370).
Diversos estudios realizados con CMH de SPM y MO
han permitido establecer una dosis mínima requerida en función de la
fuente celular que se ha fijado en 2x10^{6} células por kilo de
paciente en MO y de 3-5x10^{6} células por kilo de
paciente para SMP (Heimfeld y otros HLA-identical
stem cell transplantation: is there an optimal CD34 cell dose?. Bone
Marrow Transplantation 2003; 31:839-845).
Estos resultados sugieren que las metodologías
para expandir las células madre/progenitoras hematopoyéticas de SCU
supondrían una mejora notable en las alternativas terapéuticas
disponibles. Existen varias estrategias prometedoras disponibles
para la expansión in vitro de las CMH con diferentes sistemas
(Cabrita y otros, Hematopoietic stem cells from the bone to the
reactor. Trends in Biotechnology 2003;
21:223-240) pero de momento en ensayos clínicos
realizados estas metodologías no han demostrado mejoras destacables
en las recuperaciones hematológicas respecto a las unidades de SCU
no expandidas.
La principal limitación que presentan muchas de
las expansiones in vitro es la escasa dosis obtenida de
células madre/progenitoras con funcionalidad adecuada.
Uno de los principales problemas del cultivo
in vitro de las CMH es el bloqueo de la capacidad de
crecimiento de dichas células. Este bloqueo se produce como
consecuencia de la acumulación en el medio de cultivo de
biomoléculas liberadas por las propias CMH y las células maduras
presentes en el cultivo. Estas biomoléculas producen la detención
del ciclo de las CMH bloqueando la expansión o la diferenciación al
hacerlas entrar en quiescencia.
La presente invención da a conocer un
procedimiento de cultivo in vitro de CMH cuya estrategia se
fundamenta en mantener la concentración de las biomoléculas solubles
responsables de la detención del crecimiento de las CMH en la fase
G0/G1 por debajo de su nivel de acción, a base de realizar adiciones
puntuales de medio fresco. De esta forma, se puede inducir y
mantener el crecimiento de CMH de sangre de cordón umbilical a un
ritmo aproximadamente constante durante toda la duración del
cultivo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Esta particularidad permite controlar y
manipular el factor de expansión (células finales/células iniciales)
para la población de interés, lo que facilita adaptar dicho factor
de expansión en función de la dosis celular requerida para la
terapia.
Otro aspecto adicional del procedimiento de la
presente invención es que dicha expansión no se produce a costa de
agotar la subpoblación de CMH más primitivas, que son de gran
interés terapéutico, ya que su número se mantiene constante a lo
largo del procedimiento. Por otro lado, el procedimiento de la
presente invención, variando los factores de crecimiento empleados,
permite realizar una expansión madurativa de las CMH que facilita la
obtención de productos destinados a terapia celular en base a
células en distintos estadios de diferenciación de linajes mieloide.
Dichas células son aplicables en deficiencias del sistema
inmunológico.
Otras ventajas adicionales son que el
procedimiento es robusto, reproducible y que es extremadamente
sencillo, tanto en equipamiento como en manipulación. El
procedimiento de la presente invención es aplicable a la expansión
indiferenciada o madurativa de células CMH a partir de sangre del
cordón umbilical, médula ósea y de sangre periférica movilizada.
En consecuencia, un objetivo de la presente
invención es dar a conocer un procedimiento para la expansión in
vitro indiferenciada u orientada a linaje mieloide de CMH a
partir de sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre
periférica movilizada. Este procedimiento está caracterizado porque
comprende las etapas de:
- a)
- Expansión a volumen constante, en la que se siembran células CD34+, anteriormente purificadas por técnicas estándares conocidas en el estado de la técnica, tales como la selección positiva mediante perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD34+, en un medio de cultivo sintético adecuado disponible comercialmente en el mercado, suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF, IL-6 en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL3, G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide durante 4 días. El volumen inicial de la etapa a volumen constante es función de la disponibilidad de células procedentes de la purificación inicial de las células CD34+. El volumen final en la etapa de expansión a volumen constante también estará en dependencia de la densidad de siembra inicial.
- b)
- Expansión a volumen variable: en el día 4 del cultivo se añade medio fresco suplementario con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF y IL-6, en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL-3 y G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide a una concentración de entre 5 y 100 ng/ml a la bolsa de cultivo hasta duplicar el volumen anterior contenido en la bolsa. Se repite dicha operación los días 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18. El cultivo se detiene a los 20 días.
Preferentemente la concentración de células
CD34+ en la siembra de la etapa (a) es de 100.000 a 1.000.000 de
células CD34+ por ml de medio de cultivo.
También preferentemente la concentración de
factores de crecimiento TPO, FLT3, SCF, IL-6 en el
medio de cultivo es de entre 5 y 100 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Caso
1
En el caso de aplicar el procedimiento descrito
empleado como factores de crecimiento FLT3, SCF e
IL-6 con el objetivo de tener una expansión
indiferenciada de CMH, a los 20 días de cultivo se obtiene una tasa
de expansión de la población CMH de, como mínimo 200 veces,
generando por tanto una dosis de células indiferenciadas adecuada
para su uso clínico. Si el tratamiento requiere un mayor número de
células, se puede seguir repitiendo el procedimiento de duplicación
del volumen cada 2 días hasta obtener la cantidad de células
necesarias.
Además, las CMH obtenidas por el procedimiento
de la presente invención mantienen el fenotipo y la funcionalidad
característica de estas células: se expande el número de unidades
formadoras de colonias mixtas CFU-mix, las unidades
formadoras de colonias eritroides BFU-E y las
unidades formadoras de colonias de
granulocíticos-macrófagos CFU-GM. Se
mantiene el número de células con capacidad formadora de colonias a
largo plazo. Por otro lado, las células expandidas mostraron una
capacidad de injerto en modelos de ratón inmunodeficiente
(NOD-SCID). Además, el producto obtenido es adecuado
para su uso en terapia celular en el aspecto de la bioseguridad. Las
células obtenidas no presentan alteraciones cromosómicas y no
presentan señales de inducción de apoptosis temprana.
El procedimiento es robusto, ya que
independientemente de la pureza inicial de las células CD34+ se
consigue la tasa de expansión esperada. Además, el procedimiento de
la presente invención presenta una alta reproducibilidad lote a
lote.
La presente invención es descrita a continuación
en más detalle en referencia a un ejemplo y a un dibujo (figura 1).
Este ejemplo, sin embargo, no está destinado a limitar el alcance
técnico de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra un sistema adecuado para
llevar a cabo el procedimiento de la presente invención.
Se sembraron 500.000 células CD34+ por ml, que
fueron previamente descongeladas y purificadas, en una bolsa de
teflón permeable a gas (3) (biorreactor) que contenía 50 mi de medio
de cultivo GMP comercial sintético suplementado con factores de
crecimiento TPO, FLT3, SCF e IL6 a una concentración de 50 ng/ml. El
cultivo se mantuvo durante 4 días, en los que la concentración de
células aumentó hasta 800.000 células CD34+/ml. El día 4 se duplicó
el volumen de la bolsa de cultivo (3), ampliando la capacidad de la
bolsa con la presilla de bloqueo (4). El medio de cultivo fresco fue
almacenado en la bolsa de almacenamiento (1) y se transfirió a la
bolsa de cultivo abriendo la presilla reguladora de caudal (2) a
través del tubo de unión (5) con la bolsa de cultivo (3) hasta
duplicar el volumen inicial. Esta operación se repitió cada dos días
hasta el día 18. El día 20 se detuvo el cultivo.
Se obtuvo una ampliación del número de células
con capacidad formadora de colonias mixtas de 106 veces, eritroides
74 veces y granulocíticos/macrófagos 570 veces. Se mantuvo
prácticamente constante el número de células con capacidad formadora
de colonias a largo plazo, que tuvieron una tasa de expansión
cercana a 1. La expansión de las células CD34+ fue de 200 veces,
mientras que la expansión de las células mononucleares fue de 2.000
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Caso
2
En caso de aplicar el procedimiento descrito
anteriormente empleando como factores de crecimiento
G-CSF, SCF e IL-3 con el objetivo de
tener una expansión madurativa de CMH, a los 20 días de cultivo se
obtiene una tasa de expansión de la población de células con
capacidad formadora de colonias (UFC) de aproximadamente 1.600
veces, generándose por tanto una dosis celular adecuada para su uso
clínico. Si el tratamiento requiere un mayor número de células, se
puede seguir repitiendo el procedimiento de duplicación del volumen
cada 2 días hasta obtener la cantidad de células necesarias.
El producto obtenido por el procedimiento de la
presente invención y empleando como factores de crecimiento
IL-3, SCF, G-CSF consiste en un
conjunto celular heterogéneo en cuanto a estado madurativo dentro
del linaje hematopoyético mieloide. Las células obtenidas muestran
mayoritariamente un fenotipo caracterizado por la expresión
combinada de los marcadores CD34-, CD45+, CD11high, CD15+ y una
restricción de su capacidad multi-potencial hacia
linaje granulocítico/macrófago. Al inicio del cultivo el porcentaje
de unidades formadoras de colonias de linaje granulocítico/macrófago
supone un 35% del global la población de células con capacidad
formadora de colonias mientras que al finalizar la etapa de
expansión madurativa este porcentaje ha incrementado hasta el 91%.
Este dato muestra la efectividad del procedimiento descrito en
orientar a linaje mieloide/granulocítico las CMH.
Además el producto obtenido es adecuado para su
uso en terapia celular en el aspecto de la bioseguridad. Las células
obtenidas no presentan señales de inducción de apoptosis
temprana.
El procedimiento es robusto, ya que
independientemente de la pureza inicial de las células CD34+ se
consigue la tasa de expansión esperada. Además, el procedimiento de
la presente invención presenta una alta reproducibilidad lote a
lote.
La presente invención es descrita a continuación
en más detalle en referencia a un ejemplo y a un dibujo {figura 1).
Este ejemplo, sin embargo, no está destinado a limitar el alcance
técnico de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra un sistema adecuado para
llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Se
sembraron 10.000 células CD34+ por ml, que fueron previamente
descongeladas y purificadas, en una bolsa de teflón permeable a gas
(3) (biorreactor) que contenía 5 mi de medio de cultivo GMP
comercial sintético suplementado con factores de crecimiento IL3,
SCF y G-CSF a una concentración de 50 ng/ml. El
cultivo se mantuvo durante 4 días, en los que la concentración de
células aumentó hasta 50.000 células CD34+/ml. El día 4 se duplicó
el volumen de la bolsa de cultivo (3), ampliando la capacidad de la
bolsa con la presilla de bloqueo (4). El medio de cultivo fresco fue
almacenado en la bolsa de almacenamiento (1) y se transfirió a la
bolsa de cultivo abriendo la presilla reguladora de caudal (2) a
través del tubo de unión (5) con la bolsa de cultivo (3) hasta
duplicar el volumen inicial. Esta operación se repitió cada dos días
hasta el día 18. El día 20 se detuvo el cultivo.
Se obtuvo una ampliación del número de células
con capacidad formadora de colonias de granulocíticos/macrófagos
1.600 veces. La expansión de las células CD34+ fue de 200 veces,
mientras que la expansión de las células mononucleares fue de 2.000
veces.
Si bien la invención se ha descrito con respecto
a los ejemplos anteriores, éstos no se deben considerar limitativos
de la invención, que se definirá por la interpretación más amplia de
las siguientes reivindicaciones.
Claims (4)
1. Procedimiento para la expansión
indiferenciada u orientada a linaje mieloide de células madre
hematopoyéticas procedentes de sangre de cordón umbilical, sangre
periférica movilizada o médula ósea, caracterizado porque
comprende las etapas de:
- a)
- Expansión a volumen constante, en la que se siembran células CD34+, anteriormente purificadas por técnicas estándares conocidas en el estado de la técnica, tales como la selección positiva mediante perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos contra CD34+, en un medio de cultivo sintético adecuado disponible comercialmente en el mercado, suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF, IL-6 en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL3, G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide durante 4 días. El volumen inicial de la etapa a volumen constante es función de la disponibilidad de células procedentes de la purificación inicial de las células CD34+. El volumen final en la etapa de expansión a volumen constante también estará en dependencia de la densidad de siembra inicial.
- b)
- Expansión a volumen variable: en el día 4 del cultivo se añade medio fresco suplementado con factores de crecimiento: TPO, FLT3, SCF y IL-6, en caso de expansión indiferenciada de CMH o bien SCF, IL-3 y G-CSF en caso de expansión madurativa a linaje mieloide a una concentración de entre 5 y 100 ng/ml a la bolsa de cultivo hasta duplicar el volumen anterior contenido en la bolsa. Se repite dicha operación los días 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18. El cultivo se detiene a los 20 días.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que en la etapa de expansión a volumen constante se siembran de
100.000 a 1.000.000 de células CD34+ por mi de medio de cultivo.
3. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 y
2, en el que la concentración de factores de crecimiento TPO, FLT3,
SCF, IL-6 en el medio de cultivo es de entre 5 y 100
ng/ml.
4. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que a los 20 días de cultivo la
tasa de expansión de la población CD34+ es de, como mínimo, 200
veces.
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| ES200930939A ES2336637B1 (es) | 2009-11-02 | 2009-11-02 | Procedimiento parala expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordonumbilical, sangre periferica movilizada o medula osea. |
| EP10380136A EP2325297A3 (en) | 2009-11-02 | 2010-10-28 | Procedure for the undifferentiated or myeloid lineage biased expansion of haematopoietic stem cells from umbilical cord blood, mobilized peripheral blood or bone marrow |
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|---|---|---|---|
| ES200930939A ES2336637B1 (es) | 2009-11-02 | 2009-11-02 | Procedimiento parala expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordonumbilical, sangre periferica movilizada o medula osea. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| ES2336637A1 true ES2336637A1 (es) | 2010-04-14 |
| ES2336637B1 ES2336637B1 (es) | 2011-01-21 |
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| ES200930939A Expired - Fee Related ES2336637B1 (es) | 2009-11-02 | 2009-11-02 | Procedimiento parala expansion indiferenciada u orientada a linaje mieloide de celulas madre hematopoyeticas procedentes de sangre de cordonumbilical, sangre periferica movilizada o medula osea. |
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|---|---|
| US (1) | US20110104802A1 (es) |
| EP (1) | EP2325297A3 (es) |
| ES (1) | ES2336637B1 (es) |
| MX (1) | MX2010011891A (es) |
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