ES2233327T3 - Composicion celular que contiene macrofagos que presenta propiedades antiinfecciosas y hematopoyeticas, y un procedimiento para su preparacion. - Google Patents

Composicion celular que contiene macrofagos que presenta propiedades antiinfecciosas y hematopoyeticas, y un procedimiento para su preparacion.

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ES2233327T3 ES00901600T ES00901600T ES2233327T3 ES 2233327 T3 ES2233327 T3 ES 2233327T3 ES 00901600 T ES00901600 T ES 00901600T ES 00901600 T ES00901600 T ES 00901600T ES 2233327 T3 ES2233327 T3 ES 2233327T3
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Abstract

Composición celular que contiene macrófagos, que presenta unas propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas, estando presentes dichos macrófagos en una cantidad comprendida entre 10% y 70%, expresándose este porcentaje con respecto al número total de células.

Description

Composición celular que contiene macrófagos que presenta propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas, y un procedimiento para su preparación.
La invención se refiere a una composición de células que contiene macrófagos, que presenta unas propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas, y un procedimiento para la preparación de la misma.
La aféresis hematopoyética periférica en lugar de la punción y purificación de médula ósea es muy utilizada para recoger células progenitoras hematopoyéticas. Estas células se usan en los trasplantes alogénicos o autólogos para el tratamiento de enfermedades genéticas y principalmente de enfermedades neoplásicas, como apoyo de la quimioterapia en dosis altas o de la radioterapia.
La selección positiva entre los productos de la aféresis de células portadoras del antígeno CD34 (células germinales CD34^{+}) y crioconservación hasta su utilización es un procedimiento admitido.
No obstante, adolece de varios inconvenientes como el coste (el procedimiento de selección de células en cuentas recubiertas con el anticuerpo), la recuperación de cantidades limitadas de células progenitoras y el retraso de la reconstitución inmune (que da lugar a complicaciones infecciosas después del trasplante).
El número de células progenitoras presentes en sangre puede aumentar mediante la preparación antes de la aféresis del paciente tratado con factores estimulantes de las colonias GM-CSF y/o G-CSF y, en ocasiones, con quimioterapia por ejemplo con ciclofosfamida.
No obstante, los pacientes con cáncer a menudo recidivan debido a la presencia de células tumorales residuales resistentes a la pauta de quimioterapia (Bhatia M et al.: Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic repopulating cells after short-term ex vivo culture. J Exp Med. 186: 619-624, 1997, Bonnet D et al.: Cytokine treatment or accessory cells are required to initiate engrafment of purified primitive human hematopoietic cells transplanted at limiting doses into NOD/SCID mice, Bone Marrow Transplant. 23: 203-209, 1999, Breems DA et al.: Stroma-contact prevents loss of hematopoietic stem cell quality during ex vivo expansion of CD34+ mobilized peripheral blood stem cells. Blood. 91: 111-117, 1998, Civin et al.: Highly purified CD34-positive cells reconstitute hematopoiesis. J Clin Oncol. 14: 2224-2233, 1996, Morrison SJ et al.: The biology of hematopoietic stem cells. Annu Rec Cell Dev Biol. 11: 35-71, 1995, Traycoff C M et al.: Proliferation-induced decline of primitive hematopoietic progenitor cell activity is coupled with an increased in apoptosis of ex vivo expanded CD34+ cells. Exp Hematol. 26: 53-62, 1998).
Un objetivo de la invención es proporcionar una nueva composición celular que contiene macrófagos, que presenta unas interesantes propiedades para la inmunoterapia del cáncer y para el trasplante de células germinales.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento de procesamiento celular que permite, bajo procedimientos estandarizados mejorados, la expansión de células progenitoras y germinales a partir de la sangre periférica sin la costosa purificación de una población celular definida.
Los objetivos de la invención se consiguen mediante una composición de células que contiene macrófagos, células mieloides y células progenitoras, estando dichas células progenitoras presentes preferentemente en una relación media de al menos aproximadamente el 1%, preferentemente aproximadamente entre el 0,1% al 20%, estando dichas células mieloides preferentemente presentes en una cantidad de aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 30%, estando dichos macrófagos preferentemente presentes en una cantidad de aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 70%, expresándose estos porcentajes con respecto al número total de células.
Los macrófagos, células mieloides y células progenitoras se definen como células CD14^{+} y CD64^{+} (macrófagos), células CD33^{+} (células mieloides) y células CD34^{+} y/o GM-CFU (células progenitoras). Las células GM-CFU son células capaces de formar colonias de granulocitos macrófago en un medio de cultivo semisólido que contiene citocinas después de 14 días de cultivo.
Las células GEMM-CFU son células germinales mieloides, y pueden producir BFU-E, CFU-GM, CFU-M, CFU-EO, y CFU-B. Las células BFU-E son células progenitoras capaces de diferenciarse en eritrocitos.
Según una realización ventajosa, la composición de las células de la invención contiene linfocitos T, preferentemente en una relación comprendida entre aproximadamente 10% y el 60%, expresada con respecto al número total de células.
Según una realización ventajosa de la invención, las células progenitoras contienen entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 20% de células germinales, porcentaje expresado con respecto al número total de células progenitoras.
Las células germinales se definen como aquellas que expresan moléculas CD34 y/o por su capacidad de formar colonias en un medio de cultivo semisólido que contiene citocinas.
Según una realización ventajosa, las células progenitoras se generan a partir de células mononucleares de sangre periférica y posiblemente se incluyen en ellas, y en particular se eligen entre:
células progenitoras mieloeritroides, células progenitoras mieloides, células progenitoras linfoides o una mezcla de todas ellas.
La expresión "incluida en" significa que las células progenitoras están presentes en la composición de células.
La expresión "generada a partir de" significa que las células progenitoras se diferencian a partir de células germinales presentes originalmente en la composición de células.
En la composición de las células de la invención, los macrófagos, las células mieloides y los linfocitos en caso de que estuvieran presentes, se incluyen o se generan a partir de células mononucleares sanguíneas.
La composición de las células de la invención ha alcanzado una nueva combinación de actividades útiles en la inmunoterapia del cáncer y en el trasplante de células germinales. Estas propiedades consisten en:
1) purgar mediante macrófagos y células T/NK citotóxicas las células tumorales presentes finalmente en el injerto,
2) erradicar la enfermedad cancerosa residual del paciente mediante unos macrófagos y/o unas células presentadoras del antígeno (células dendríticas MAC-DC) presentes en el injerto autólogo o alogénico,
3) evitar la mayoría de los episodios infecciosos después de la inyección al comienzo del periodo de aplasia tras el tratamiento en el paciente, gracias a las propiedades antivíricas, antibacterianas y antiparasitarias de los macrófagos y, en último término, de las células polinucleares contaminantes y de sus precursores presentes en el producto,
4) facilitar el agarre del injerto al potenciar la cantidad de células germinales, de células hematopoyéticas, de progenitores de células mieloides, eritroides y linfoides, así como de las células en estadios intermedios de diferenciación presentes en el injerto,
5) disminuir significativamente el periodo de aplasia (que se correlaciona con la fiebre e infecciones en el paciente) al aumentar en gran medida la velocidad de recuperación de las distintas poblaciones sanguíneas.
La invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de una composición de células que contiene macrófagos, células mieloides y células progenitoras, estando dichas células progenitoras preferentemente presentes en una cantidad comprendida aproximadamente del 0,1% y aproximadamente el 10%, estando dichos macrófagos preferentemente presentes en una cantidad comprendida entre aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 60%, expresándose dichos porcentajes con respecto al número total de células, que comprende la etapa de movilización de las células progenitoras en la sangre de un paciente, por ejemplo mediante la premedicación de dicho paciente con G-CSF y/o GM-CSF, o G-CSF y ciclofosfamida, con lo que se aumenta la cantidad de células progenitoras en sangre periférica.
El término "movilización" significa la estimulación de las células de la médula ósea para liberar una mayor cantidad de células progenitoras en la sangre.
El procedimiento de la invención puede comprender una etapa adicional de cocultivo de células sanguíneas mononucleares y progenitoras, después de haber eliminado por lavado las plaquetas, los granulocitos y los eritrocitos, aproximadamente durante un periodo de tiempo de 4 a aproximadamente 10 días, en un medio que permite la diferenciación de monocitos en macrófagos y de los progenitores mieloides en células polinucleares.
Según una realización favorable del procedimiento, el cocultivo de las células sanguíneas mononucleares y progenitoras se realiza en presencia de citocinas o factores de crecimiento, por ejemplo: IL3, IL6, factores de células germinal, EPO, trombopoyetina, GM-CSF, G-CSF, ligando Flat-3, ligando c-kit o sus agonistas.
El procedimiento de la invención también puede comprender una etapa adicional de activación de macrófagos, al final del cocultivo, por ejemplo mediante la adición de \gamma-interferón o de péptido muramilo.
El objetivo de la activación de macrófagos consiste en obtener una actividad mayor antiinfecciosa y antitumoral.
El procedimiento de la invención puede comprender una etapa adicional de concentración de las células obtenidas al final del cocultivo, y la resuspensión en un vehículo adecuado para su administración a un paciente.
El procedimiento de la invención puede comprender una etapa de congelación de parte o toda la resuspensión.
Obsérvese que el producto celular obtenido después de la diferenciación y expansión ex vivo contiene células germinales, células progenitoras, células mieloides, linfocitos T y macrófagos diferenciados que se activan (por ejemplo, mediante \gamma-interferón) al final del procedimiento. El cocultivo durante un periodo de tiempo de 3 a 12 días realizado a 37ºC en bolsas adherentes y un medio definido (a partir de IMDM) permite aumentar la recuperación de células CD34 y/o de células progenitoras hematopoyéticas intermedias. Esto significa que las células progenitoras hematopoyéticas normales no sólo se conservan mediante los macrófagos activados, sino que también se estimulan hasta una mayor proliferación y diferenciación.
La invención también se refiere a una composición de células como la obtenida según el procedimiento definido anteriormente.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene, como principio activo, una composición celular definida anteriormente.
La invención también se refiere a un procedimiento para restaurar la hematopoyesis en un paciente con aplasia y/o la protección de los pacientes frente a enfermedades infecciosas o frente a tumores residuales, que comprende la utilización de una composición farmacéutica definida anteriormente.
La expresión "restauración de la hematopoyesis" significa el aumento de la concentración de células hematopoyéticas hasta alcanzar la funcionalidad normal similar a la de los sujetos sanos para conseguir la protección frente a infecciones (que se puede medir mediante la numeración e identificación de la sangre).
La invención también se refiere a un procedimiento para la disminución del periodo de aplasia en un paciente, por ejemplo de 11 días hasta 1 a 3 días, que comprende la utilización de la composición farmacéutica definida anteriormente.
El término "aplasia" se define como un descenso patológico de células hematopoyéticas en sangre.
La composición de células de la invención definida anteriormente se caracteriza por el hecho de que deriva de y/o se incluye en una composición de células mononucleares en sangre periférica que contiene:
-
entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 50% de monocitos,
-
entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 70% de linfocitos,
-
entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 20% de células progenitoras,
-
entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 50% de células polinucleares,
-
entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 20% de células germinales.
Leyendas de las figuras
En la Figura 1 se representa la inhibición del crecimiento de líneas celulares de mieloma mediante MAK activados.
El número de células viables (x 10^{4}/ml) se traza frente al tiempo (expresado en días).
Las líneas celulares de mieloma XG-1, XG-2 y XG-14 se cultivaron en RPMI 1640 con un 10% de FCS y 3 ng/ml de IL-6 en una concentración de 5 x 10^{5} células/ml. Las características de las líneas celulares XG-1 y XG-2 se describen en Blood 83: 3654-3663, 1994 y las de XG-14 en Journal of Immunology, 163: 514-524, 1999. Las células se cultivaron en pocillos de cultivo recubiertos de teflón. Las células de mieloma se cultivaron solas o con 5 x 10^{5} MAK activados. En un grupo sólo se cultivaron MAK. Cada día se determinó el número de células viables usando el procedimiento de exclusión con azul tripán. El porcentaje de las células de mieloma se determinó mediante la tinción con anticuerpos anti-CD38 y análisis FACS. Los resultados que se muestran son los de un experimento representativo de tres experimentos.
La curva con rombos corresponde a MAK.
La curva con cuadrados negros corresponde a XG-1
La curva con cuadrados blancos corresponde a MAK+XG-1.
La curva con triángulos negros corresponde a XG-2.
La curva con triángulos blancos corresponde a MAK+XG-2.
La curva con círculos negros corresponde a XG-14.
La curva con círculos blancos corresponde a MAK+XG-14.
En la Figura 2 se representa la inhibición del crecimiento de las células de mieloma mediante macrófagos activados que producen mediadores solubles.
El número de células viables (x 10^{4}/ml) se traza frente al tiempo (expresado en días).
Las células de mieloma XG-1, XG-2 y XG-14 se cultivaron en RPMI 1640, 10% FCS y 3 ng/ml de IL-6. En la cámara inferior de los pocillos de cultivo transwell que contenían o no 2 x 10^{5} MAK en la cámara superior se cultivaron 2 x 10^{5} células de mieloma. Cada día se determinó el número de células de mieloma viables usando el procedimiento de exclusión con azul tripán. Los resultados que se muestran son los de un experimento representativo de dos experimentos.
La curva con rombos negros corresponde a XG-1.
La curva con rombos blancos corresponde a MAK/XG-1.
La curva con triángulos negros corresponde a XG-2.
La curva con triángulos blancos corresponde a MAK/XG-2.
La curva con cuadrados negros corresponde a XG-14.
La curva con cuadrados blancos corresponde a MAK/XG-14.
En la Figura 3 se representa la estimulación de la generación de colonias hematopoyéticas mediante MAK activados.
Se cultivaron 2 x 10^{3} células CD34 purificadas (pureza >90%) en un medio de cultivo semisólido con metilcelulosa y citocinas hematopoyéticas solas o con 10^{5} de MAK activados. El número de GM-CFU, BFU-E y GEMM-CFU se determinó después de 14 días de cultivo. Los resultados que se muestran son los de un experimento representativo de tres experimentos.
En el eje Y se representa el número de colonias.
En el eje X, las columnas con líneas paralelas representan GEMM-CFU, las columnas con cuadrados blancos y negros representan GM-CFU y las columnas grises representan BFU-E.
En la Figura 4 se representa la estimulación del crecimiento de células CD34 mediante MAK activados.
Las células CD34 purificadas (pureza >90%) se cultivaron en RPMI 1640, 10% FCS y 50 ng/ml de IL-3 y SCF. El número de células CD34 se determinó cada día usando el marcado con anticuerpos anti-CD34 y análisis FACS. Las células CD34 se cultivaron solas o con 10^{5} MAK activados. Los resultados que se muestran son los de un experimento representativo de dos experimentos.
En el eje Y se representa el número de CD34 (x 10^{4}/ml) y en el eje X se representa el tiempo (expresado en días de cultivo).
La curva con rombos corresponde a CD34.
La curva con cuadrados corresponde a CD34/MAK.
La curva con triángulos corresponde a CD34/MAK (adhesión).
En la Figura 5 se representa la estimulación del crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas mediante MAK activados.
Las células CD34 purificadas se cultivaron como se describe en la Figura 4. Cada día se evaluó el número de células progenitoras hematopoyéticas mediante cultivo en un medio de cultivo semisólido con metilcelulosa y citocinas hematopoyéticas. El número de GM-CFU se determinó después de 14 días de cultivo.
En el eje Y se representa el número de colonias de granulocitos/macrófagos.
En el eje X se representan los días de cultivo de células CD34 con o sin MAK.
La curva con "B" corresponde a células CD34 y la curva con "J" corresponde a células CD34/MAK.
En los ejemplos siguientes, las abreviaturas utilizadas tienen los siguientes significados:
CD: grupo de diferenciación, DMSO: dimetilsulfóxido, RPMI: Rosewell Park Medical Institute, FCS: suero fetal bovino, FACS: clasificación celular activada por fluorescencia, SCF: factor de células germinales.
Ejemplo 1
Un paciente que tenía un mieloma múltiple recibió tratamiento con ciclofosfamida (4 g/m^{2}) y una inyección diaria de G-CSF (5 \mug/kg). Cada día se monitorizó el recuento en sangre periférica de células CD34 y la aféresis comenzó cuando dicho recuento de CD34 fue superior a 10/mm^{3}. Las células mononucleares (menos del 10% de células polinucleares) se recogieron mediante aféresis, se lavaron dos veces en PBS y se cultivaron durante 6 días en un procesador de células MAK TM hasta una concentración de 5 x 10^{6} células/ml en 2 bolsas de cultivo de 500 ml, a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El medio de cultivo contenía 500 U/ml de GM-CSF. En el día 6 se añadió IFN-gamma (250 U/ml) durante un día. Antes del cultivo y en los días 1, 2, 5, 6, 7 de cultivo y después de la decantación se obtuvo una muestra de células para determinar el recuento celular y los porcentajes de células CD34, CD14, CD33, CD64, HLA-DR, CD16 y CD3 y la concentración de unidades formadoras de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CFU). El fenotipo de la membrana celular de las células se determinó mediante el análisis FACS usando anticuerpos monoclonales de roedor marcados con FITC (Imnunotech, Marseilles, Francia) o anticuerpos isotipo de roedor como control. La concentración de GM-CFU se determinó usando un medio semisólido con metilcelulosa que contenía varias citocinas hematopoyéticas adquiridas en Stemgen (Villejuif, Francia).
Se ha observado un incremento progresivo de 3 veces el número de células CD34 y de GM-CFU. Estos datos indicaron que este sistema de cultivo apoyaba el crecimiento de precursores hematopoyéticos.
Las células de la aféresis (pacientes con mieloma movilizado) también se podían mantener congeladas. Después de la descongelación se podían sembrar 5,7 x 10^{9} células que contenían un 44% de células CD3 (linfocitos) y un 42% de células CD14^{+} (monocitos) y cultivar en un medio definido a 37ºC.
Los linfocitos (CD3^{+}) y las células CD14^{+} tendían a disminuir (ver la Tabla 1). Los macrófagos CD64 estaban bajos hasta la activación mediante IFN\gamma en el día 6, que aumentó en gran medida esta población. Esta última población estaba presente principalmente después de la purificación por decantación en el día 7.
Cuando se vigiló la subpoblación de células germinales CD34^{+} durante el cultivo, se observó un incremento del número y porcentaje de células con fenotipo CD34^{+}. Al comienzo del cultivo había 7 x 10^{7} células CD34^{+}, cifra que aumentó hasta 21 x 10^{7} células después de 6 días (Tabla 1).
La presencia de citocinas liberadas en el medio de cultivo y de un gran número de linfocitos T (57% en este experimento) pareció ser importante para la proliferación de células CD34^{+} y células progenitoras. La obtención de macrófagos fue reproducible, con una viabilidad buena después de la descongelación. En último término, se pudieron purificar hasta un 90% mediante decantación, con una media de 5 x 10^{9} macrófagos diferenciados a partir de una aféresis (60 pacientes analizados). La población total de células recuperadas después del cultivo se inyectó a los pacientes para permitir la recuperación más rápida de células progenitoras hematopoyéticas y disminuir el periodo de aplasia.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1
Ejemplo 2 Objetivos
En las Figuras y en el ejemplo siguiente se obtienen los macrófagos activados (MAK) según el procedimiento descrito en el documento PCT/EP93/01232.
Los macrófagos activados (MAK) pueden matar varias células tumorales humanas. Hemos investigado si los MAK generados a partir de las células de aféresis, recogidas durante la movilización de células germinales hematopoyéticas en sangre periférica mediante ciclofosfamida y factor estimulante de las colonias de los granulocitos (G-CSF), pueden matar las células plasmáticas malignas humanas. También hemos investigado su efecto sobre el crecimiento de células hematopoyéticas germinales CD34 humanas y sobre la capacidad de las células CD34 para generar colonias hematopoyéticas en un medio de cultivo semisólido.
Generación de MAK
Los MAK activados se obtuvieron usando los kits proporcionados por IDM (Paris, Francia). Los MAK se generaron a partir de células de aféresis procedentes de 2 pacientes, obtenidas durante la movilización de células hematopoyéticas germinales en sangre periférica usando ciclofosfamida y G-CSF. Las células de aféresis se cultivaron durante 6 días con 500 ng/ml de GM-CSF y después durante un día más con IFN-gamma (250 U/ml). En el día 7 se purificaron los MAK mediante contradecantación. Con anterioridad, nuestro grupo había demostrado que estas células comprenden más del 80%-90% de los MAK que expresan moléculas HLA-DR y CD64 (Patente depositada nº 99 400 239.2). Los MAK se congelaron con una solución fisiológica de NaCl, un 4% de albúmina y un 10% de DMSO. Para las manipulaciones que se describen a continuación los MAK se descongelaron y cultivaron durante un día con RPMI 1640, un 10% de FCS (Biowittaker, Bélgica) y 500 U/ml de GM-CSP antes de su utilización.
Efecto de los MAK sobre el crecimiento de líneas de células plasmáticas malignas
Se han obtenido tres líneas de células plasmáticas malignas en el laboratorio: XG-1, XG-2 y XG-14. La supervivencia y crecimiento de estas líneas celulares dependen de la adición de citocinas exógenas. Los cultivos se realizaron en placas de cultivo de 24 pocillos recubiertas con teflón (Polylabo Block, ref. 80776) para evitar la adherencia de los MAK. Las células se cultivaron en un medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con un 10% de FCS (Biowittaker, Bélgica) y 3 ng/ml de inteleucina 6 (Sandoz, Suiza). Se cultivaron 5 x 10^{5} células de mieloma solas o con 5 x 10^{5} MAK activados durante 3 días. En un grupo de cultivo se cultivaron solos 5 x 10^{5} MAK. En los días 1, 2 y 3 de cultivo se determinó el número de células viables usando el procedimiento de exclusión con azul tripán. Como se muestra en la Figura 1, la adición de MAK bloqueó el crecimiento de las 3 líneas celulares de mieloma. Investigamos si los MAK fagocitaban las células de mieloma o si segregaban un factor soluble capaz de bloquear el crecimiento del mieloma. Los cocultivos se realizaron usando pocillos de cultivo transwell con dos cámaras separadas mediante un filtro de 0,45 \mum. Se cultivaron 2 x 10^{5} MAK activados en 100 \mul de medio de cultivo en la cámara superior y en la cámara inferior se sembraron 2 x 10^{5} células de mieloma en 600 \mul de medio de cultivo que contenía 3 ng/ml de IL-6. El número de células de mieloma se determinó en los días 1, 2 y 3 de cultivo. Como se muestra en la Figura 2, la adición de los MAK activados redujo el crecimiento de las células de mieloma. Esta reducción fue inferior a la que se detectó cuando los MAK activados entraban en contacto con las células de mieloma. Estos datos indicaron que los MAK activados inhibían el crecimiento de las células de mieloma, en parte mediante la producción de un factor inhibidor soluble.
Efecto de los MAK activados sobre el crecimiento y diferenciación de las células hematopoyéticas germinales CD34
Se investigaron los efectos de los MAK activados sobre el crecimiento de células CD34 y sobre su capacidad de diferenciarse en células hematopoyéticas. En primer lugar, los MAK activados se cultivaron simultáneamente con células CD34 humanas purificadas (>90% células CD34) en un medio de cultivo semisólido con metilcelulosa que contenía una combinación de citocinas hematopoyéticas durante 14 días (Stemgem, Francia). En el día 14 se determinó el número de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CFU), de colonias eritroides (BFU-E) y de colonias mixtas (GEMM-CFU). Como se esboza en la Figura 3, la adición de los MAK activados aumentó el número de colonias hematopoyéticas, indicando que los MAK activados no tuvieron efecto sobre las células CD34 sino que, por el contrario, amplificaron su diferenciación en colonias hematopoyéticas. En otro experimento, se cultivaron los MAK activados con células CD34 purificadas durante varios días en presencia de interleucina-3 (IL-3) y factor de células germinales (SCF). Cada día se determinó el número de células CD34 mediante tinción con un anticuerpo monoclonal anti-CD34 y análisis FACS. El número de células progenitoras hematopoyéticas se determinó mediante el cultivo en un medio de cultivo semisólido con metilcelulosa que contiene citocinas hematopoyéticas. Como se muestra en las Figuras 4 y 5, los MAK activados aumentaron el crecimiento de las células CD34 así como de las células progenitoras hematopoyéticas.
En conclusión, los MAK activados no tienen un efecto inhibidor sobre el crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas CD34. Por el contrario, los MAK activados estimulan el crecimiento a corto plazo de células germinales CD34 y de células progenitoras hematopoyéticas.

Claims (16)

1. Composición celular que contiene macrófagos, que presenta unas propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas, estando presentes dichos macrófagos en una cantidad comprendida entre 10% y 70%, expresándose este porcentaje con respecto al número total de células.
2. Composición celular según la reivindicación 1, que comprende unas células mieloides en una cantidad comprendida entre 10% y 30%, expresándose este porcentaje con respecto al número total de células.
3. Composición celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que contiene unos linfocitos T, preferentemente en una relación del 10% al 60% expresada con respecto al número total de células.
4. Composición celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en la que las células progenitoras contienen entre el 0,1% y el 20% de células germinales, porcentaje expresado con respecto al número total de células progenitoras.
5. Composición celular según la reivindicación 4, en la que las células progenitoras se generan a partir de las células mononucleares de sangre periférica y posiblemente incluidas en las mismas, y en particular se seleccionan de entre células progenitoras mielo-eritroides, células progenitoras mieloides, células progenitoras linfoides o una mezcla de las mismas.
6. Composición celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los macrófagos, las células mieloides y los linfocitos, en caso de que estuvieran presentes, se incluyen en las células mononucleares sanguíneas o se generan a partir de las mismas.
7. Utilización de G-CSF y/o GM-CSF o G-CSF y ciclofosfamida para la preparación de una composición celular que contiene macrófagos, células mieloides y células progenitoras, estando dichas células progenitoras presentes preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,1% y 20%.
8. Procedimiento para la preparación de una composición celular que contiene macrófagos, células mieloides y células progenitoras, estando dichas células progenitoras presentes preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,1% y 20%, encontrándose dichos macrófagos presentes preferentemente en una cantidad comprendida entre 10% y 70%, expresándose estos porcentajes con respecto al número total de células, que comprende la etapa de aféresis para recoger las células mononucleares y las progenitoras, una etapa adicional de cocultivo de células sanguíneas mononucleares y progenitoras, después de haber eliminado las plaquetas por lavado las plaquetas, los granulocitos y los eritrocitos, durante un periodo de tiempo de 4 a 10 días, en un medio que permite la diferenciación de los monocitos en los macrófagos y de los progenitores mieloides en las células polinucleares.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el cocultivo se realiza en presencia de citocinas o factores de crecimiento, por ejemplo: IL3, IL6, factor de células progenitoras, EPO, trombopoyetina, GM-CSF, ligando Flat-3, ligando C-kit u otros agonistas.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, que comprende una etapa adicional de activación de los macrófagos, al final del cocultivo, por ejemplo mediante la adición de \gamma-interferón o de péptidos muramilo.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende una etapa adicional de concentración de las células obtenidas al final del cocultivo, y resuspensión en un vehículo adecuado para su administración al paciente.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, que comprende, después de la resuspensión del cocultivo, una etapa de congelación de una parte o la totalidad de la resuspensión.
13. Composición celular como la obtenida según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
14. Composición farmacéutica que contiene como sustancia activa, una composición celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13.
15. Composición celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13, que se caracteriza por el hecho de que deriva de una composición de células mononucleares sanguíneas y/o se incluye en la misma que contiene:
- entre el 10% y el 50% de monocitos,
- entre el 10% y el 70% de linfocitos,
- entre el 0,1% y el 20% de células progenitoras,
- entre el 1% y el 50% de células polinucleares,
- entre el 0,1% y el 20% de células germinales.
16. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13, para la preparación de un fármaco para la restauración de la hematopoyesis en un paciente con aplasia y/o la protección de pacientes frente a enfermedades infecciosas o frente a tumores residuales.
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