ES2233327T3 - Composicion celular que contiene macrofagos que presenta propiedades antiinfecciosas y hematopoyeticas, y un procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Composicion celular que contiene macrofagos que presenta propiedades antiinfecciosas y hematopoyeticas, y un procedimiento para su preparacion.Info
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Abstract
Composición celular que contiene macrófagos, que presenta unas propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas, estando presentes dichos macrófagos en una cantidad comprendida entre 10% y 70%, expresándose este porcentaje con respecto al número total de células.
Description
Composición celular que contiene macrófagos que
presenta propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas, y un
procedimiento para su preparación.
La invención se refiere a una composición de
células que contiene macrófagos, que presenta unas propiedades
antiinfecciosas y hematopoyéticas, y un procedimiento para la
preparación de la misma.
La aféresis hematopoyética periférica en lugar de
la punción y purificación de médula ósea es muy utilizada para
recoger células progenitoras hematopoyéticas. Estas células se usan
en los trasplantes alogénicos o autólogos para el tratamiento de
enfermedades genéticas y principalmente de enfermedades neoplásicas,
como apoyo de la quimioterapia en dosis altas o de la
radioterapia.
La selección positiva entre los productos de la
aféresis de células portadoras del antígeno CD34 (células germinales
CD34^{+}) y crioconservación hasta su utilización es un
procedimiento admitido.
No obstante, adolece de varios inconvenientes
como el coste (el procedimiento de selección de células en cuentas
recubiertas con el anticuerpo), la recuperación de cantidades
limitadas de células progenitoras y el retraso de la reconstitución
inmune (que da lugar a complicaciones infecciosas después del
trasplante).
El número de células progenitoras presentes en
sangre puede aumentar mediante la preparación antes de la aféresis
del paciente tratado con factores estimulantes de las colonias
GM-CSF y/o G-CSF y, en ocasiones,
con quimioterapia por ejemplo con ciclofosfamida.
No obstante, los pacientes con cáncer a menudo
recidivan debido a la presencia de células tumorales residuales
resistentes a la pauta de quimioterapia (Bhatia M et al.:
Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic
repopulating cells after short-term ex vivo
culture. J Exp Med. 186: 619-624, 1997, Bonnet D
et al.: Cytokine treatment or accessory cells are required to
initiate engrafment of purified primitive human hematopoietic cells
transplanted at limiting doses into NOD/SCID mice, Bone Marrow
Transplant. 23: 203-209, 1999, Breems DA et
al.: Stroma-contact prevents loss of
hematopoietic stem cell quality during ex vivo expansion of
CD34+ mobilized peripheral blood stem cells. Blood. 91:
111-117, 1998, Civin et al.: Highly purified
CD34-positive cells reconstitute hematopoiesis. J
Clin Oncol. 14: 2224-2233, 1996, Morrison SJ
et al.: The biology of hematopoietic stem cells. Annu Rec
Cell Dev Biol. 11: 35-71, 1995, Traycoff C M
et al.: Proliferation-induced decline of
primitive hematopoietic progenitor cell activity is coupled with an
increased in apoptosis of ex vivo expanded CD34+ cells.
Exp Hematol. 26: 53-62, 1998).
Un objetivo de la invención es proporcionar una
nueva composición celular que contiene macrófagos, que presenta unas
interesantes propiedades para la inmunoterapia del cáncer y para el
trasplante de células germinales.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar un nuevo procedimiento de procesamiento celular que
permite, bajo procedimientos estandarizados mejorados, la expansión
de células progenitoras y germinales a partir de la sangre
periférica sin la costosa purificación de una población celular
definida.
Los objetivos de la invención se consiguen
mediante una composición de células que contiene macrófagos, células
mieloides y células progenitoras, estando dichas células
progenitoras presentes preferentemente en una relación media de al
menos aproximadamente el 1%, preferentemente aproximadamente entre
el 0,1% al 20%, estando dichas células mieloides preferentemente
presentes en una cantidad de aproximadamente el 10% hasta
aproximadamente el 30%, estando dichos macrófagos preferentemente
presentes en una cantidad de aproximadamente el 10% hasta
aproximadamente el 70%, expresándose estos porcentajes con respecto
al número total de células.
Los macrófagos, células mieloides y células
progenitoras se definen como células CD14^{+} y CD64^{+}
(macrófagos), células CD33^{+} (células mieloides) y células
CD34^{+} y/o GM-CFU (células progenitoras). Las
células GM-CFU son células capaces de formar
colonias de granulocitos macrófago en un medio de cultivo semisólido
que contiene citocinas después de 14 días de cultivo.
Las células GEMM-CFU son células
germinales mieloides, y pueden producir BFU-E,
CFU-GM, CFU-M,
CFU-EO, y CFU-B. Las células
BFU-E son células progenitoras capaces de
diferenciarse en eritrocitos.
Según una realización ventajosa, la composición
de las células de la invención contiene linfocitos T,
preferentemente en una relación comprendida entre aproximadamente
10% y el 60%, expresada con respecto al número total de células.
Según una realización ventajosa de la invención,
las células progenitoras contienen entre aproximadamente el 0,1% y
aproximadamente el 20% de células germinales, porcentaje expresado
con respecto al número total de células progenitoras.
Las células germinales se definen como aquellas
que expresan moléculas CD34 y/o por su capacidad de formar colonias
en un medio de cultivo semisólido que contiene citocinas.
Según una realización ventajosa, las células
progenitoras se generan a partir de células mononucleares de sangre
periférica y posiblemente se incluyen en ellas, y en particular se
eligen entre:
células progenitoras mieloeritroides, células
progenitoras mieloides, células progenitoras linfoides o una mezcla
de todas ellas.
La expresión "incluida en" significa que las
células progenitoras están presentes en la composición de
células.
La expresión "generada a partir de"
significa que las células progenitoras se diferencian a partir de
células germinales presentes originalmente en la composición de
células.
En la composición de las células de la invención,
los macrófagos, las células mieloides y los linfocitos en caso de
que estuvieran presentes, se incluyen o se generan a partir de
células mononucleares sanguíneas.
La composición de las células de la invención ha
alcanzado una nueva combinación de actividades útiles en la
inmunoterapia del cáncer y en el trasplante de células germinales.
Estas propiedades consisten en:
1) purgar mediante macrófagos y células T/NK
citotóxicas las células tumorales presentes finalmente en el
injerto,
2) erradicar la enfermedad cancerosa residual del
paciente mediante unos macrófagos y/o unas células presentadoras del
antígeno (células dendríticas MAC-DC) presentes en
el injerto autólogo o alogénico,
3) evitar la mayoría de los episodios infecciosos
después de la inyección al comienzo del periodo de aplasia tras el
tratamiento en el paciente, gracias a las propiedades antivíricas,
antibacterianas y antiparasitarias de los macrófagos y, en último
término, de las células polinucleares contaminantes y de sus
precursores presentes en el producto,
4) facilitar el agarre del injerto al potenciar
la cantidad de células germinales, de células hematopoyéticas, de
progenitores de células mieloides, eritroides y linfoides, así como
de las células en estadios intermedios de diferenciación presentes
en el injerto,
5) disminuir significativamente el periodo de
aplasia (que se correlaciona con la fiebre e infecciones en el
paciente) al aumentar en gran medida la velocidad de recuperación de
las distintas poblaciones sanguíneas.
La invención también se refiere a un
procedimiento para la preparación de una composición de células que
contiene macrófagos, células mieloides y células progenitoras,
estando dichas células progenitoras preferentemente presentes en una
cantidad comprendida aproximadamente del 0,1% y aproximadamente el
10%, estando dichos macrófagos preferentemente presentes en una
cantidad comprendida entre aproximadamente el 10% hasta
aproximadamente el 60%, expresándose dichos porcentajes con respecto
al número total de células, que comprende la etapa de movilización
de las células progenitoras en la sangre de un paciente, por ejemplo
mediante la premedicación de dicho paciente con
G-CSF y/o GM-CSF, o
G-CSF y ciclofosfamida, con lo que se aumenta la
cantidad de células progenitoras en sangre periférica.
El término "movilización" significa la
estimulación de las células de la médula ósea para liberar una mayor
cantidad de células progenitoras en la sangre.
El procedimiento de la invención puede comprender
una etapa adicional de cocultivo de células sanguíneas mononucleares
y progenitoras, después de haber eliminado por lavado las plaquetas,
los granulocitos y los eritrocitos, aproximadamente durante un
periodo de tiempo de 4 a aproximadamente 10 días, en un medio que
permite la diferenciación de monocitos en macrófagos y de los
progenitores mieloides en células polinucleares.
Según una realización favorable del
procedimiento, el cocultivo de las células sanguíneas mononucleares
y progenitoras se realiza en presencia de citocinas o factores de
crecimiento, por ejemplo: IL3, IL6, factores de células germinal,
EPO, trombopoyetina, GM-CSF, G-CSF,
ligando Flat-3, ligando c-kit o sus
agonistas.
El procedimiento de la invención también puede
comprender una etapa adicional de activación de macrófagos, al final
del cocultivo, por ejemplo mediante la adición de
\gamma-interferón o de péptido muramilo.
El objetivo de la activación de macrófagos
consiste en obtener una actividad mayor antiinfecciosa y
antitumoral.
El procedimiento de la invención puede comprender
una etapa adicional de concentración de las células obtenidas al
final del cocultivo, y la resuspensión en un vehículo adecuado para
su administración a un paciente.
El procedimiento de la invención puede comprender
una etapa de congelación de parte o toda la resuspensión.
Obsérvese que el producto celular obtenido
después de la diferenciación y expansión ex vivo contiene
células germinales, células progenitoras, células mieloides,
linfocitos T y macrófagos diferenciados que se activan (por ejemplo,
mediante \gamma-interferón) al final del
procedimiento. El cocultivo durante un periodo de tiempo de 3 a 12
días realizado a 37ºC en bolsas adherentes y un medio definido (a
partir de IMDM) permite aumentar la recuperación de células CD34 y/o
de células progenitoras hematopoyéticas intermedias. Esto significa
que las células progenitoras hematopoyéticas normales no sólo se
conservan mediante los macrófagos activados, sino que también se
estimulan hasta una mayor proliferación y diferenciación.
La invención también se refiere a una composición
de células como la obtenida según el procedimiento definido
anteriormente.
La invención también se refiere a una composición
farmacéutica que contiene, como principio activo, una composición
celular definida anteriormente.
La invención también se refiere a un
procedimiento para restaurar la hematopoyesis en un paciente con
aplasia y/o la protección de los pacientes frente a enfermedades
infecciosas o frente a tumores residuales, que comprende la
utilización de una composición farmacéutica definida
anteriormente.
La expresión "restauración de la
hematopoyesis" significa el aumento de la concentración de
células hematopoyéticas hasta alcanzar la funcionalidad normal
similar a la de los sujetos sanos para conseguir la protección
frente a infecciones (que se puede medir mediante la numeración e
identificación de la sangre).
La invención también se refiere a un
procedimiento para la disminución del periodo de aplasia en un
paciente, por ejemplo de 11 días hasta 1 a 3 días, que comprende la
utilización de la composición farmacéutica definida
anteriormente.
El término "aplasia" se define como un
descenso patológico de células hematopoyéticas en sangre.
La composición de células de la invención
definida anteriormente se caracteriza por el hecho de que deriva de
y/o se incluye en una composición de células mononucleares en sangre
periférica que contiene:
- -
- entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 50% de monocitos,
- -
- entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 70% de linfocitos,
- -
- entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 20% de células progenitoras,
- -
- entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 50% de células polinucleares,
- -
- entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 20% de células germinales.
En la Figura 1 se representa la inhibición del
crecimiento de líneas celulares de mieloma mediante MAK
activados.
El número de células viables (x 10^{4}/ml) se
traza frente al tiempo (expresado en días).
Las líneas celulares de mieloma
XG-1, XG-2 y XG-14
se cultivaron en RPMI 1640 con un 10% de FCS y 3 ng/ml de
IL-6 en una concentración de 5 x 10^{5}
células/ml. Las características de las líneas celulares
XG-1 y XG-2 se describen en Blood
83: 3654-3663, 1994 y las de XG-14
en Journal of Immunology, 163: 514-524, 1999. Las
células se cultivaron en pocillos de cultivo recubiertos de teflón.
Las células de mieloma se cultivaron solas o con 5 x 10^{5} MAK
activados. En un grupo sólo se cultivaron MAK. Cada día se determinó
el número de células viables usando el procedimiento de exclusión
con azul tripán. El porcentaje de las células de mieloma se
determinó mediante la tinción con anticuerpos
anti-CD38 y análisis FACS. Los resultados que se
muestran son los de un experimento representativo de tres
experimentos.
La curva con rombos corresponde a MAK.
La curva con cuadrados negros corresponde a
XG-1
La curva con cuadrados blancos corresponde a
MAK+XG-1.
La curva con triángulos negros corresponde a
XG-2.
La curva con triángulos blancos corresponde a
MAK+XG-2.
La curva con círculos negros corresponde a
XG-14.
La curva con círculos blancos corresponde a
MAK+XG-14.
En la Figura 2 se representa la inhibición del
crecimiento de las células de mieloma mediante macrófagos activados
que producen mediadores solubles.
El número de células viables (x 10^{4}/ml) se
traza frente al tiempo (expresado en días).
Las células de mieloma XG-1,
XG-2 y XG-14 se cultivaron en RPMI
1640, 10% FCS y 3 ng/ml de IL-6. En la cámara
inferior de los pocillos de cultivo transwell que contenían o no 2 x
10^{5} MAK en la cámara superior se cultivaron 2 x 10^{5}
células de mieloma. Cada día se determinó el número de células de
mieloma viables usando el procedimiento de exclusión con azul
tripán. Los resultados que se muestran son los de un experimento
representativo de dos experimentos.
La curva con rombos negros corresponde a
XG-1.
La curva con rombos blancos corresponde a
MAK/XG-1.
La curva con triángulos negros corresponde a
XG-2.
La curva con triángulos blancos corresponde a
MAK/XG-2.
La curva con cuadrados negros corresponde a
XG-14.
La curva con cuadrados blancos corresponde a
MAK/XG-14.
En la Figura 3 se representa la estimulación de
la generación de colonias hematopoyéticas mediante MAK
activados.
Se cultivaron 2 x 10^{3} células CD34
purificadas (pureza >90%) en un medio de cultivo semisólido con
metilcelulosa y citocinas hematopoyéticas solas o con 10^{5} de
MAK activados. El número de GM-CFU,
BFU-E y GEMM-CFU se determinó
después de 14 días de cultivo. Los resultados que se muestran son
los de un experimento representativo de tres experimentos.
En el eje Y se representa el número de
colonias.
En el eje X, las columnas con líneas paralelas
representan GEMM-CFU, las columnas con cuadrados
blancos y negros representan GM-CFU y las columnas
grises representan BFU-E.
En la Figura 4 se representa la estimulación del
crecimiento de células CD34 mediante MAK activados.
Las células CD34 purificadas (pureza >90%) se
cultivaron en RPMI 1640, 10% FCS y 50 ng/ml de IL-3
y SCF. El número de células CD34 se determinó cada día usando el
marcado con anticuerpos anti-CD34 y análisis FACS.
Las células CD34 se cultivaron solas o con 10^{5} MAK activados.
Los resultados que se muestran son los de un experimento
representativo de dos experimentos.
En el eje Y se representa el número de CD34 (x
10^{4}/ml) y en el eje X se representa el tiempo (expresado en
días de cultivo).
La curva con rombos corresponde a CD34.
La curva con cuadrados corresponde a
CD34/MAK.
La curva con triángulos corresponde a CD34/MAK
(adhesión).
En la Figura 5 se representa la estimulación del
crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas mediante MAK
activados.
Las células CD34 purificadas se cultivaron como
se describe en la Figura 4. Cada día se evaluó el número de células
progenitoras hematopoyéticas mediante cultivo en un medio de cultivo
semisólido con metilcelulosa y citocinas hematopoyéticas. El número
de GM-CFU se determinó después de 14 días de
cultivo.
En el eje Y se representa el número de colonias
de granulocitos/macrófagos.
En el eje X se representan los días de cultivo de
células CD34 con o sin MAK.
La curva con "B" corresponde a células CD34
y la curva con "J" corresponde a células CD34/MAK.
En los ejemplos siguientes, las abreviaturas
utilizadas tienen los siguientes significados:
CD: grupo de diferenciación, DMSO:
dimetilsulfóxido, RPMI: Rosewell Park Medical Institute, FCS: suero
fetal bovino, FACS: clasificación celular activada por
fluorescencia, SCF: factor de células germinales.
Un paciente que tenía un mieloma múltiple recibió
tratamiento con ciclofosfamida (4 g/m^{2}) y una inyección diaria
de G-CSF (5 \mug/kg). Cada día se monitorizó el
recuento en sangre periférica de células CD34 y la aféresis comenzó
cuando dicho recuento de CD34 fue superior a 10/mm^{3}. Las
células mononucleares (menos del 10% de células polinucleares) se
recogieron mediante aféresis, se lavaron dos veces en PBS y se
cultivaron durante 6 días en un procesador de células MAK TM hasta
una concentración de 5 x 10^{6} células/ml en 2 bolsas de cultivo
de 500 ml, a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El medio de cultivo
contenía 500 U/ml de GM-CSF. En el día 6 se añadió
IFN-gamma (250 U/ml) durante un día. Antes del
cultivo y en los días 1, 2, 5, 6, 7 de cultivo y después de la
decantación se obtuvo una muestra de células para determinar el
recuento celular y los porcentajes de células CD34, CD14, CD33,
CD64, HLA-DR, CD16 y CD3 y la concentración de
unidades formadoras de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CFU). El
fenotipo de la membrana celular de las células se determinó mediante
el análisis FACS usando anticuerpos monoclonales de roedor marcados
con FITC (Imnunotech, Marseilles, Francia) o anticuerpos isotipo de
roedor como control. La concentración de GM-CFU se
determinó usando un medio semisólido con metilcelulosa que contenía
varias citocinas hematopoyéticas adquiridas en Stemgen (Villejuif,
Francia).
Se ha observado un incremento progresivo de 3
veces el número de células CD34 y de GM-CFU. Estos
datos indicaron que este sistema de cultivo apoyaba el crecimiento
de precursores hematopoyéticos.
Las células de la aféresis (pacientes con mieloma
movilizado) también se podían mantener congeladas. Después de la
descongelación se podían sembrar 5,7 x 10^{9} células que
contenían un 44% de células CD3 (linfocitos) y un 42% de células
CD14^{+} (monocitos) y cultivar en un medio definido a 37ºC.
Los linfocitos (CD3^{+}) y las células
CD14^{+} tendían a disminuir (ver la Tabla 1). Los macrófagos CD64
estaban bajos hasta la activación mediante IFN\gamma en el día 6,
que aumentó en gran medida esta población. Esta última población
estaba presente principalmente después de la purificación por
decantación en el día 7.
Cuando se vigiló la subpoblación de células
germinales CD34^{+} durante el cultivo, se observó un incremento
del número y porcentaje de células con fenotipo CD34^{+}. Al
comienzo del cultivo había 7 x 10^{7} células CD34^{+}, cifra
que aumentó hasta 21 x 10^{7} células después de 6 días (Tabla
1).
La presencia de citocinas liberadas en el medio
de cultivo y de un gran número de linfocitos T (57% en este
experimento) pareció ser importante para la proliferación de células
CD34^{+} y células progenitoras. La obtención de macrófagos fue
reproducible, con una viabilidad buena después de la descongelación.
En último término, se pudieron purificar hasta un 90% mediante
decantación, con una media de 5 x 10^{9} macrófagos diferenciados
a partir de una aféresis (60 pacientes analizados). La población
total de células recuperadas después del cultivo se inyectó a los
pacientes para permitir la recuperación más rápida de células
progenitoras hematopoyéticas y disminuir el periodo de aplasia.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En las Figuras y en el ejemplo siguiente se
obtienen los macrófagos activados (MAK) según el procedimiento
descrito en el documento PCT/EP93/01232.
Los macrófagos activados (MAK) pueden matar
varias células tumorales humanas. Hemos investigado si los MAK
generados a partir de las células de aféresis, recogidas durante la
movilización de células germinales hematopoyéticas en sangre
periférica mediante ciclofosfamida y factor estimulante de las
colonias de los granulocitos (G-CSF), pueden matar
las células plasmáticas malignas humanas. También hemos investigado
su efecto sobre el crecimiento de células hematopoyéticas germinales
CD34 humanas y sobre la capacidad de las células CD34 para generar
colonias hematopoyéticas en un medio de cultivo semisólido.
Los MAK activados se obtuvieron usando los kits
proporcionados por IDM (Paris, Francia). Los MAK se generaron a
partir de células de aféresis procedentes de 2 pacientes, obtenidas
durante la movilización de células hematopoyéticas germinales en
sangre periférica usando ciclofosfamida y G-CSF. Las
células de aféresis se cultivaron durante 6 días con 500 ng/ml de
GM-CSF y después durante un día más con
IFN-gamma (250 U/ml). En el día 7 se purificaron los
MAK mediante contradecantación. Con anterioridad, nuestro grupo
había demostrado que estas células comprenden más del 80%-90% de los
MAK que expresan moléculas HLA-DR y CD64 (Patente
depositada nº 99 400 239.2). Los MAK se congelaron con una solución
fisiológica de NaCl, un 4% de albúmina y un 10% de DMSO. Para las
manipulaciones que se describen a continuación los MAK se
descongelaron y cultivaron durante un día con RPMI 1640, un 10% de
FCS (Biowittaker, Bélgica) y 500 U/ml de GM-CSP
antes de su utilización.
Se han obtenido tres líneas de células
plasmáticas malignas en el laboratorio: XG-1,
XG-2 y XG-14. La supervivencia y
crecimiento de estas líneas celulares dependen de la adición de
citocinas exógenas. Los cultivos se realizaron en placas de cultivo
de 24 pocillos recubiertas con teflón (Polylabo Block, ref. 80776)
para evitar la adherencia de los MAK. Las células se cultivaron en
un medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con un 10% de FCS
(Biowittaker, Bélgica) y 3 ng/ml de inteleucina 6 (Sandoz, Suiza).
Se cultivaron 5 x 10^{5} células de mieloma solas o con 5 x
10^{5} MAK activados durante 3 días. En un grupo de cultivo se
cultivaron solos 5 x 10^{5} MAK. En los días 1, 2 y 3 de cultivo
se determinó el número de células viables usando el procedimiento de
exclusión con azul tripán. Como se muestra en la Figura 1, la
adición de MAK bloqueó el crecimiento de las 3 líneas celulares de
mieloma. Investigamos si los MAK fagocitaban las células de mieloma
o si segregaban un factor soluble capaz de bloquear el crecimiento
del mieloma. Los cocultivos se realizaron usando pocillos de cultivo
transwell con dos cámaras separadas mediante un filtro de 0,45
\mum. Se cultivaron 2 x 10^{5} MAK activados en 100 \mul de
medio de cultivo en la cámara superior y en la cámara inferior se
sembraron 2 x 10^{5} células de mieloma en 600 \mul de medio de
cultivo que contenía 3 ng/ml de IL-6. El número de
células de mieloma se determinó en los días 1, 2 y 3 de cultivo.
Como se muestra en la Figura 2, la adición de los MAK activados
redujo el crecimiento de las células de mieloma. Esta reducción fue
inferior a la que se detectó cuando los MAK activados entraban en
contacto con las células de mieloma. Estos datos indicaron que los
MAK activados inhibían el crecimiento de las células de mieloma, en
parte mediante la producción de un factor inhibidor soluble.
Se investigaron los efectos de los MAK activados
sobre el crecimiento de células CD34 y sobre su capacidad de
diferenciarse en células hematopoyéticas. En primer lugar, los MAK
activados se cultivaron simultáneamente con células CD34 humanas
purificadas (>90% células CD34) en un medio de cultivo semisólido
con metilcelulosa que contenía una combinación de citocinas
hematopoyéticas durante 14 días (Stemgem, Francia). En el día 14 se
determinó el número de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CFU), de
colonias eritroides (BFU-E) y de colonias mixtas
(GEMM-CFU). Como se esboza en la Figura 3, la
adición de los MAK activados aumentó el número de colonias
hematopoyéticas, indicando que los MAK activados no tuvieron efecto
sobre las células CD34 sino que, por el contrario, amplificaron su
diferenciación en colonias hematopoyéticas. En otro experimento, se
cultivaron los MAK activados con células CD34 purificadas durante
varios días en presencia de interleucina-3
(IL-3) y factor de células germinales (SCF). Cada
día se determinó el número de células CD34 mediante tinción con un
anticuerpo monoclonal anti-CD34 y análisis FACS. El
número de células progenitoras hematopoyéticas se determinó mediante
el cultivo en un medio de cultivo semisólido con metilcelulosa que
contiene citocinas hematopoyéticas. Como se muestra en las Figuras 4
y 5, los MAK activados aumentaron el crecimiento de las células CD34
así como de las células progenitoras hematopoyéticas.
En conclusión, los MAK activados no tienen un
efecto inhibidor sobre el crecimiento y diferenciación de células
hematopoyéticas CD34. Por el contrario, los MAK activados estimulan
el crecimiento a corto plazo de células germinales CD34 y de células
progenitoras hematopoyéticas.
Claims (16)
1. Composición celular que contiene macrófagos,
que presenta unas propiedades antiinfecciosas y hematopoyéticas,
estando presentes dichos macrófagos en una cantidad comprendida
entre 10% y 70%, expresándose este porcentaje con respecto al número
total de células.
2. Composición celular según la reivindicación 1,
que comprende unas células mieloides en una cantidad comprendida
entre 10% y 30%, expresándose este porcentaje con respecto al número
total de células.
3. Composición celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, que contiene unos linfocitos T,
preferentemente en una relación del 10% al 60% expresada con
respecto al número total de células.
4. Composición celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3, en la que las células progenitoras contienen
entre el 0,1% y el 20% de células germinales, porcentaje expresado
con respecto al número total de células progenitoras.
5. Composición celular según la reivindicación 4,
en la que las células progenitoras se generan a partir de las
células mononucleares de sangre periférica y posiblemente incluidas
en las mismas, y en particular se seleccionan de entre células
progenitoras mielo-eritroides, células progenitoras
mieloides, células progenitoras linfoides o una mezcla de las
mismas.
6. Composición celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que los macrófagos, las células
mieloides y los linfocitos, en caso de que estuvieran presentes, se
incluyen en las células mononucleares sanguíneas o se generan a
partir de las mismas.
7. Utilización de G-CSF y/o
GM-CSF o G-CSF y ciclofosfamida para
la preparación de una composición celular que contiene macrófagos,
células mieloides y células progenitoras, estando dichas células
progenitoras presentes preferentemente en una cantidad comprendida
entre 0,1% y 20%.
8. Procedimiento para la preparación de una
composición celular que contiene macrófagos, células mieloides y
células progenitoras, estando dichas células progenitoras presentes
preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,1% y 20%,
encontrándose dichos macrófagos presentes preferentemente en una
cantidad comprendida entre 10% y 70%, expresándose estos porcentajes
con respecto al número total de células, que comprende la etapa de
aféresis para recoger las células mononucleares y las progenitoras,
una etapa adicional de cocultivo de células sanguíneas mononucleares
y progenitoras, después de haber eliminado las plaquetas por lavado
las plaquetas, los granulocitos y los eritrocitos, durante un
periodo de tiempo de 4 a 10 días, en un medio que permite la
diferenciación de los monocitos en los macrófagos y de los
progenitores mieloides en las células polinucleares.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el
que el cocultivo se realiza en presencia de citocinas o factores de
crecimiento, por ejemplo: IL3, IL6, factor de células progenitoras,
EPO, trombopoyetina, GM-CSF, ligando
Flat-3, ligando C-kit u otros
agonistas.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9, que comprende una etapa adicional de
activación de los macrófagos, al final del cocultivo, por ejemplo
mediante la adición de \gamma-interferón o de
péptidos muramilo.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, que comprende una etapa adicional de
concentración de las células obtenidas al final del cocultivo, y
resuspensión en un vehículo adecuado para su administración al
paciente.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, que
comprende, después de la resuspensión del cocultivo, una etapa de
congelación de una parte o la totalidad de la resuspensión.
13. Composición celular como la obtenida según el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
14. Composición farmacéutica que contiene como
sustancia activa, una composición celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 ó 13.
15. Composición celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 ó 13, que se caracteriza por el hecho
de que deriva de una composición de células mononucleares sanguíneas
y/o se incluye en la misma que contiene:
- entre el 10% y el 50% de monocitos,
- entre el 10% y el 70% de linfocitos,
- entre el 0,1% y el 20% de células
progenitoras,
- entre el 1% y el 50% de células
polinucleares,
- entre el 0,1% y el 20% de células
germinales.
16. Utilización de una composición según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 13, para la preparación
de un fármaco para la restauración de la hematopoyesis en un
paciente con aplasia y/o la protección de pacientes frente a
enfermedades infecciosas o frente a tumores residuales.
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