ES2877108T3 - Activación de linfocitos infiltrantes de médula en condiciones hipóxicas alternantes con normóxicas - Google Patents
Activación de linfocitos infiltrantes de médula en condiciones hipóxicas alternantes con normóxicas Download PDFInfo
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Abstract
Una composición que comprende una población celular de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia, expandidos en normoxia ex vivo, en donde aproximadamente del 60 % a aproximadamente 100 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan CD3 y al menos el 21 % de la población expresa 4-1BB, en donde la población celular se prepara mediante un proceso que comprende las etapas de: (a) recibir una muestra de médula ósea de un sujeto que tiene cáncer; (b) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula recolectados de la muestra de médula ósea con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en un ambiente hipóxico de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 5 días para producir linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia; y (c) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia en un ambiente normóxico de aproximadamente 21 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 12 días en presencia de IL-2 para producir la composición.
Description
DESCRIPCIÓN
Activación de linfocitos infiltrantes de médula en condiciones hipóxicas alternantes con normóxicas
Antecedentes
La quimioterapia mielosupresora es una terapia aceptada para muchas neoplasias malignas hematológicas, incluido el mieloma múltiple, aunque con evidencia mínima de curaciones a largo plazo. Sin embargo, la terapia mieloablativa también proporciona una plataforma ideal para la superposición de terapias de base inmunitaria. Específicamente, la linfopenia resultante de la quimioterapia de altas dosis facilita la proliferación linfocítica homeostática, elimina las células presentadoras de antígeno (APC) tolerogénicas e induce la liberación de citocinas que genera un ambiente más favorable para la terapia de células T adoptivas. Se demostró evidencia indirecta de que el sistema inmunológico puede contribuir a los beneficios clínicos de la quimioterapia de altas dosis con una recuperación linfoide temprana que da como resultado mejores resultados clínicos en pacientes con mieloma, linfoma y leucemia mieloide aguda que se someten a un autotrasplante de células madre. Además, estos resultados mejorados en el mieloma se correlacionaron directamente con la dosis de linfocitos autólogos infundidos del producto de aféresis. En conjunto, estos datos soportan la hipótesis de que la inmunidad antitumoral puede tener beneficios clínicamente medibles y avanza la cuestión de cómo aprovechar dicha inmunidad para aumentar la eficacia de las terapias actualmente disponibles.
La capacidad de erradicar una enfermedad medible con la terapia adoptiva de células T (ACT) requiere que las células T se activen adecuadamente y estén presentes en cantidades suficientes, posean una actividad antitumoral apreciable, migren hacia el sitio del tumor, eliminen efectivamente el tumor al encontrarse y persistan en el tiempo. La estimulación de las células T con cualquier técnica, incluidas las perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y CD28, puede revertir efectivamente un estado anérgico (tolerante), generar células T activadas y expandir significativamente su número. Mientras que los anti-CD3 y el CD28 unidos a perlas proporcionan una amplificación de células T sencilla y sólida in vitro, una limitación importante de este enfoque es la estimulación no específica de todo el repertorio de células T sin enriquecimiento de células T específicas de tumores. Una estrategia para aumentar la especificidad tumoral de ACT es usar una población de células T con mayor especificidad tumoral endógena. Tal enriquecimiento explica la considerable actividad antitumoral de ACT mediante el uso de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de melanoma metastásico. Sin embargo, los TIL están presentes solo en un subconjunto de pacientes con melanoma metastásico, y de ellos, las preparaciones de TIL exitosas se pueden lograr en solo el 60-70 % de los pacientes con tumores cosechables, lo que limita la aplicabilidad general de tal enfoque. La médula ósea es el microambiente tumoral para muchas neoplasias malignas hematológicas, como el mieloma múltiple, y por lo tanto, los linfocitos infiltrantes de médula (MIL) podrían aprovecharse para generar una terapia de células T específica del tumor para estos cánceres específicos. Por el contrario de los TIL, los MIL están presentes en todos los pacientes, pueden obtenerse con un procedimiento simple al lado de la cama y pueden expandirse rápidamente en todos los pacientes.
En las neoplasias hematológicas, la médula ósea representa no solo el sitio de la enfermedad, sino también un microambiente único. Incluso en tumores sólidos, existe evidencia de que las MIL pueden enriquecerse en células T de memoria o de memoria efectora. El componente inmunológico dentro de la médula ósea es un reservorio de células T experimentadas con antígenos tanto para las células T específicas del tumor en el huésped con cáncer de mama en etapa temprana así como también para las células T inducidas con vacuna. En la médula ósea, las células CD4 de memoria se mantienen mediante interacciones con células estromales que expresan IL-7 y las células CD8 se mantienen mediante la persistencia de la expresión de antígenos y la presentación efectiva de antígenos. Como tal, la mayor especificidad tumoral de los MIL en este entorno probablemente se deba a la presencia de un tumor como fuente de antígeno, mientras que su persistencia se mantiene a través de interacciones inmunológicas únicas con elementos estromales, citocinas y células presentadoras de antígenos capaces de presentar antígenos de manera efectiva en este ambiente.
Las MIL activadas ex vivo poseen varias propiedades esenciales para la terapia de células T adoptivas. Tras la activación, demuestran una especificidad tumoral significativa en comparación con sus homólogos de linfocitos de sangre periférica, y se dirigen aun amplio intervalo de antígenos presentes tanto en las células plasmáticas de mieloma múltiple maduras así como también en sus precursores clonogénicos y matan efectivamente las células plasmáticas de mieloma múltiple. Al igual que los TIL, los MIL tienen una mayor especificidad antigénica policlonal endógena que los linfocitos periféricos. Por el contrario de los TIL, los MIL están presentes en todos los pacientes y se obtienen de un microambiente con mayor respuesta inmunitaria. Como tal, las MIL representan un enfoque específico de tumor nuevo y prometedor para ACT de neoplasias malignas hematológicas con compromiso de la médula ósea.
Noonan y otros, (Cancer Res 2005; 65: (5). 1 de marzo de 2005) informa sobre la especificidad tumoral intrínseca de las MIL y describe un enfoque novedoso para la generación de poblaciones de células T específicas de tumores adecuadas para la inmunoterapia adoptiva del mieloma múltiple.
WO 2013/109759 A1describe métodos y composiciones para expandir células T reguladoras (células "Treg"), que dan como resultado "células Treg condicionadas", y métodos y composiciones útiles para modular una reacción
autoinmunitaria y para tratar o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con el sistema inmunológico mediante el uso de las células Treg acondicionadas.
US 2011/0223146 A1describe composiciones que comprenden linfocitos infiltrantes de médula activados, métodos para generar poblaciones de linfocitos infiltrantes de médula, usos de los linfocitos infiltrantes de médula de la invención y un dispositivo de cultivo para el uso en cultivo celular, por ejemplo para el uso en la generación de poblaciones de linfocitos infiltrantes de médula activados.
Caldwell y otros, (J Immunol 2001; 167: 6140-6149) describe efectos diferenciales de condiciones hipóxicas fisiológicamente relevantes sobre el desarrollo de los linfocitos T y sus funciones efectoras.
Noonan y otros (Cancer Microenvironment (2011) 4: 313-323) analiza los factores que contribuyen a la inmunidad en el microambiente de la médula ósea, sus interacciones y los mecanismos mediante los cuales la modulación inmunitaria puede traducirse en terapias con eficacia anti-mieloma.
WO 2014/085437 A2 informa que los linfocitos infiltrantes de médula (MIL) de pacientes tratados con ciclofosfamida postrasplante (PTCy) pueden aumentar la inmunidad antitumoral y analiza el problema de la recaída de la enfermedad después de un trasplante alogénico de médula ósea con células T altamente específicas por el tumor.
Resumen
La descripción se refiere a una composición que comprende linfocitos infiltrantes de médula ("MIL"). La composición puede comprender una población de MIL que expresa CD3. Por ejemplo, al menos aproximadamente 40 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresa CD3. Por ejemplo, la composición puede comprender MIL, y el 40 % de las células pueden expresar CD3 según se determina mediante una ventana de citometría de flujo; por lo tanto, al menos aproximadamente 40 % de las células en la composición serían de la población de MIL que expresa CD3. La composición puede comprender una población de MIL que expresa interferón gamma ("IFNy"). Por ejemplo, al menos aproximadamente el 2 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresa IFNy. La composición puede comprender una población de MIL que expresa CXCR4. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 98 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresa CXCR4. La composición puede comprender una población de MIL que expresa CD4. La composición puede comprender una población de MIL que expresa CD8. La composición puede comprender una población de MIL que expresa 4-1BB. Por ejemplo, al menos aproximadamente 21 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresa 4-1BB.
La descripción se refiere a un método para activar linfocitos infiltrantes de médula ("MIL"), que comprende incubar MIL en un ambiente que comprende menos 21 % de oxígeno.
La descripción se refiere a una composición para el uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto. El método puede comprender administrar al sujeto una composición que comprende MIL. En algunas descripciones en la presente descripción, el método comprende retirar los linfocitos infiltrantes de médula ("MIL") del sujeto; e incubar las MIL en un ambiente que comprende menos del 21 % de oxígeno, produciendo de esta manera MIL activadas.
La invención se describe en las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa resultados de citometría de flujo para MIL que se expandieron en condiciones normóxicas o hipóxicas en medios que comprenden interleucina 2 (+ IL2) o medios sin interleucina 2 (sin IL2). El 35,09 % de las células seleccionadas cultivadas en condiciones normóxicas en medios que comprenden interleucina 2 fueron positivas para CD3. El 30,98 % de las células seleccionadas cultivadas en condiciones normóxicas en medios que carecen de interleucina 2 fueron positivas para CD3. El 89,01 % de las células seleccionadas cultivadas en condiciones hipóxicas en medios que comprenden interleucina 2 fueron positivas para CD3. El 89,96 % de las células seleccionadas cultivadas en condiciones hipóxicas en medios que carecen de interleucina 2 fueron positivas para CD3.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la expansión de células CD3+ para linfocitos de sangre periférica (PBL) y MIL cultivados en condiciones normóxicas o hipóxicas. Las condiciones hipóxicas disminuyen la expansión de PBL CD3+ pero aumentan la expansión de MIL CD3+.
La Figura 3 es un gráfico que compara la expansión de MIL CD3+ después de varios períodos de incubación en ambientes normóxicos o hipóxicos. Se observó una expansión sustancial después de 7 días de incubación en un ambiente hipóxico en comparación con la normoxia, y la expansión de CD3+ alcanzó su punto máximo a los 11 días de incubación.
La Figura 4 es un gráfico que representa la especificidad tumoral de los MIL expandidos en condiciones hipóxicas o normóxicas para las líneas celulares de mieloma (U266/H929) o una línea celular de control (SW780), para las células que se expandieron durante 10 días (D10) o durante 12 días (D12). Se cultivaron células hipóxicas durante 3 días en un ambiente que comprende 2 % de oxígeno, seguido de expansión en un ambiente normóxico (21 % de oxígeno). El día 10, el 4 % de las células expandidas en condiciones normóxicas eran específicas del tumor en comparación con el 25,1 % de las MIL expandidas en condiciones hipóxicas, según lo determinado por el por ciento de células T totales que tenían un CFSe bajo y producían interferón gamma (IFNy) en respuesta a antígeno tumoral.
La Figura 5 representa los resultados de la citometría de flujo para la especificidad tumoral de los MIL expandidos en diversas condiciones mediante el uso de ventanas para CD3 e INFy. Después de siete días de expansión, el 18,26 % de los MIL cultivados en condiciones hipóxicas fueron positivos tanto para CD3 como para interferón gamma. Por el contrario, solo el 1,72 % de los MIL cultivados en condiciones normóxicas fueron positivos tanto para CD3 como para interferón gamma.
La Figura 6 es un gráfico que representa la expansión in vivo de linfocitos después del autotrasplante, incluso en sujetos que reciben MIL cultivados en diversas condiciones. El eje x corresponde al número de días después del trasplante y el eje y corresponde al recuento absoluto promedio de linfocitos por microlitro para los sujetos. El gráfico sugiere que los MIL cultivados en condiciones hipóxicas continúan expandiéndose en sujetos humanos más que los MIL cultivados solo en condiciones normóxicas.
La Figura 7 representa los resultados de la citometría de flujo para MIL expandidos bajo diversas condiciones de oxígeno mediante el uso de ventanas para CXCR4 y CD4 o CD8. El 28,38 % de la población total de MIL expandidos en condiciones normóxicas fueron tanto CXCR4 positivas como CD4 positivas, con una intensidad de fluorescencia media de 3,9. El 68,91 % de los MIL expandidos en condiciones hipóxicas fueron tanto CXCR4 positivos como CD4 positivos, con una intensidad de fluorescencia media de 5,4. El 8,02 % de los MIL expandidos en condiciones normóxicas fueron tanto CXCR4 positivo como CD8 positivo, con una intensidad de fluorescencia media de 4,6. El 11,08 % de los MIL expandidos en condiciones hipóxicas fueron tanto CXCR4 positivo como CD8 positivo. Estos resultados sugieren que la hipoxia aumenta tanto el número de células que expresan CXCR4 así como también el grado de expresión por célula (MFI), lo que aumenta la posibilidad de que estas células migren a la médula ósea tras la infusión.
La Figura 8 consiste en tres paneles, paneles marcados (A), (B) y (C). El panel A representa los resultados de la citometría de flujo para linfocitos de sangre periférica (PBL) y MIL antes de la expansión celular, mediante el uso de ventanas para CD4, CD8 y 4-1BB. El panel B representa los resultados de la citometría de flujo para PBL y MIL después de la expansión en condiciones normóxicas, mediante el uso de ventanas para CD4, c D8 y 4-1BB. Como se muestra, la expresión de 4-1BB en los PBL disminuyó en los PBL CD8, del 11,34 % al 0,34 %, y los MIL CD8 mostraron una disminución del 15,1 % al 7,54 %. El panel C representa los resultados de la citometría de flujo para PBL y MIL después de la expansión en condiciones hipóxicas, mediante el uso de ventanas para CD4, c D8 y 4-1BB. Los PBL regularon a la baja 4-1BB luego de la expansión en condiciones hipóxicas (PBL CD8: línea de base 11,34 % a 0 %), mientras que los MIL regularon al alza 4-1BB luego de la expansión en condiciones hipóxicas (MIL CD8: línea base 15,1 % a 21,79%).
La Figura 9 es un gráfico que muestra que el crecimiento de MIL en condiciones hipóxicas aumenta la cantidad de células CD3+ con relación al crecimiento sólo en condiciones normóxicas.
La Figura 10 muestra resultados de citometría de flujo que indican que la expansión de MIL en condiciones hipóxicas da como resultado un mayor porcentaje de células CD4+/4-1BB+ que la expansión de PBL en condiciones hipóxicas o la expansión de MIL en condiciones normóxicas.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la expansión ex vivo de MIL. Los MIL expandidos en condiciones hipóxicas dieron como resultado una dosis mayor con relación a los MIL expandidos solo en condiciones normóxicas.
Descripción detallada
Un objetivo importante que se debe lograr con la terapia de células T adoptivas es la capacidad de desarrollar la mayor cantidad de células T específicas de tumores que subsecuentemente también se expandirán in vivo tras la reinfusión y persisten en el tiempo. La descripción se refiere a un enfoque novedoso para la expansión de células T que aprovecha las propiedades intrínsecas de los linfocitos infiltrantes de médula ("MIL"). Específicamente, los MIL difieren significativamente de los linfocitos periféricos (PBL). Por ejemplo, los MIL se expanden más fácilmente, regulan al alza los marcadores de activación en mayor medida que los PBL, mantienen más que un repertorio Vp sesgado, migran hacia la médula ósea y, lo que es más importante, poseen una especificidad tumoral significativamente mayor. La inmunidad anti-mieloma MIL se correlaciona directamente con la respuesta clínica; sin embargo, no se ha observado previamente una expansión in vivo de células T o respuesta clínica persistente.
El cultivo de MIL en un nivel de O2 de menos del 21 % de oxígeno, como de aproximadamente 1 % de oxígeno a aproximadamente 7 % de oxígeno o de aproximadamente 1 % de oxígeno a aproximadamente 3 % de oxígeno, por ejemplo, el oxígeno al 2 % (condiciones hipóxicas) aumenta tanto la expansión general de las células así como también su capacidad para reconocer células tumorales con relación al cultivo solo en condiciones normóxicas. Por tanto, en algunas descripciones en la presente descripción, la descripción se refiere a un método para la preparación de MIL para el uso terapéutico que comprende uno o más de los siguientes. Se puede recolectar médula ósea de un paciente. La médula ósea recolectada puede congelarse o usarse inmediatamente, por ejemplo, para crear MIL específicas de tumores. Si la médula ósea está congelada, preferentemente se descongela antes de la incubación. La médula ósea puede tratarse para purificar MIL mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Las MIL pueden activarse, por ejemplo, con perlas, por ejemplo, perlas anti-CD3/CD28. La proporción de perlas a células en la solución puede variar; en algunas descripciones preferidas en la presente descripción, la relación es de 3 a 1. De manera similar, los MIL pueden expandirse en presencia de uno o más anticuerpos, antígenos y/o citocinas, por ejemplo, en ausencia de perlas anti-CD3/CD28. El recuento de células para la médula ósea recolectada puede determinarse, por ejemplo, para ajustar la cantidad de perlas, anticuerpos, antígenos y/o citocinas que se agregarán a las MIL. En algunas descripciones en la presente descripción, las MIL se capturan mediante el uso de perlas diseñadas específicamente para recolectar las células.
Las MIL recolectadas se cultivan preferentemente en un ambiente hipóxico, por ejemplo, por un primer período de tiempo. En algunas descripciones en la presente descripción, los MIL pueden colocarse en una bolsa de cultivo de tejidos en medio X-VIVO™ 15 complementado con suero AB al 2 % y 200 U de IL2. Se contempla que pueden usarse otras condiciones y elementos de cultivo como lo reconozca un experto en la técnica. Los MIL se pueden cultivar en un ambiente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 7 % de oxígeno (hipoxia; condiciones hipóxicas), preferentemente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 % de oxígeno, tal como aproximadamente 2 % de oxígeno, durante aproximadamente 3 a aproximadamente 20 días (es decir, un primer período de tiempo), como de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 días, como 4 días. El ambiente hipóxico puede crearse, por ejemplo, añadiendo óxido nitroso al contenedor en el que se cultivan las células. En algunas descripciones en la presente descripción, el ambiente hipóxico puede crearse mediante el uso de una cámara hipobárica. Después del crecimiento hipóxico, los MIL pueden cultivarse en un ambiente normóxico, por ejemplo, 21 % de oxígeno. En algunas descripciones preferidas en la presente descripción, los MIL se cultivan en condiciones normóxicas durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7 días adicionales (es decir, un segundo período de tiempo),por ejemplo para un total de aproximadamente 3 a aproximadamente 27 días de crecimiento, tal como aproximadamente 3 a aproximadamente 10 días de crecimiento. Las células cultivadas se pueden administrar a un paciente (por ejemplo, ya sea del paciente o de un receptor alogénico) o almacenarse para el uso futuro.
Los MIL recolectados de la médula ósea del paciente y tratados de acuerdo con un método descrito en la presente descripción, específicamente, en condiciones hipóxicas durante un primer período de tiempo seguido de condiciones normóxicas durante un segundo período de tiempo, funcionan inesperadamente mejor que los linfocitos de sangre periférica (PBL) sometidos al mismo procedimiento. Las capacidades mejoradas de las MIL, como se muestra más abajo, incluyen una marcada expansión tanto in vitro e in vivo, mayor expresión de marcadores biológicos como 4-1BB y mayor especificidad tumoral.
Un experto en la técnica reconocería que el procedimiento de la presente descripción se puede usar para tratar muchos tipos diferentes de cáncer, que incluyen mieloma, cáncer de pulmón y cáncer de mama. Como la médula ósea es un reservorio de células de memoria central, se han encontrado células T específicas de tumores de cualquier variedad de cánceres en la médula ósea de los pacientes. Como se describe en la presente descripción, las condiciones de cultivo hipóxicas aumentan la expansión así como también la especificidad tumoral y, por lo tanto, este enfoque puede usarse para cultivar MIL de un amplio intervalo de pacientes con cáncer. En algunas descripciones preferidas en la presente descripción, las MIL de un paciente se recopilan, se expanden en condiciones hipóxicas durante un primer período de tiempo, por ejemplo durante aproximadamente 1 día a aproximadamente 20 días, y luego se expanden en condiciones normóxicas durante un segundo período de tiempo, por ejemplo, de aproximadamente 3 días a aproximadamente 7 días. A continuación, las células pueden proporcionarse al paciente para su tratamiento o almacenarse para el uso futuro.
La descripción se relaciona con el hallazgo de que la expansión de las MIL en un ambiente hipóxico permite la expansión in vivo de células T después de la infusión. Específicamente, las MIL se cultivaron al 2 % de O2(hipoxia) durante 3 días seguido de un cambio a 21 % O2(normoxia), lo que resulta en una especificidad tumoral casi 10 veces mayor (Figura 4). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que tales condiciones de crecimiento son capaces de aumentar el número absoluto de MIL específicos de tumores obtenidos de la misma fuente con relación a los MIL que crecen solo en condiciones normóxicas.
Todos los experimentos se realizaron mediante el uso de productos MIL de muestras de pacientes. Como se muestra en la Figura 3, la expansión de productos MIL clínicos a escala completa en condiciones hipóxicas aumentó drásticamente el número de células T. Se debe señalar que con condiciones normóxicas, era difícil expandir las MIL más allá de los 7 días. En este experimento, la expansión del día 7 fue de 36,3 veces en normoxia frente a 119 veces en hipoxia. Además, las células cultivadas en condiciones hipóxicas continuaron expandiéndose hasta 12 días y alcanzaron una expansión total de 220 veces a los 11 días.
Además de obtener mejores expansiones y mayor especificidad tumoral, se optimizaron las condiciones de crecimiento para maximizar la supervivencia de las células T. Se ha demostrado que la expresión de 4-1BB es un regulador clave de muchas de estas propiedades. Puede regular la expansión de las células T, reducir la apoptosis, aumentar la actividad citotóxica de las células CD8 y mejorar la supervivencia. En conjunto, la expresión de 4-1Bb en MIL activadas puede ser un regulador importante de una mayor supervivencia y especificidad tumoral. Por tanto, la expresión de 4-1BB se examinó en MIL y se comparó con la de PBL cultivados en diversas condiciones. Como se muestra en la Figura 8, la expresión basal de 4-1BB fue mayor en MIL que en PBL (18,2 % frente a 8,1 %). Curiosamente, la expansión de células T en normoxia redujo su expresión en ambas poblaciones (MIL 10,7 %, PBL 2,8 %) mientras que la expansión en hipoxia aumentó significativamente la expresión de 4-1BB en MIL (43,4 %) y anuló por completo su expresión en PBL (0 %). Estos datos nuevamente subrayan las diferencias significativas entre los PBL y MIL, también demuestran que la regulación al alza de 4-1BB depende de más factores que las condiciones de crecimiento simplemente hipóxicas.
Estas condiciones de cultivo se han adoptado para un ensayo clínico, y las condiciones de crecimiento hipóxicas aumentaron la expansión total de células T de un promedio de 7,9E9 a 1,8E10. Además, las condiciones de crecimiento hipóxico también permitieron la observación de expansión in vivo de células T (Figura 6, que representa el recuento total de linfocitos hasta el día 60 para todos los pacientes).
La descripción se refiere a una composición que comprende linfocitos infiltrantes de médula ("MIL"). Las MIL pueden ser MIL activadas.
En descripciones preferidas en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que expresa CD3, es decir, en donde cada célula de la población de MIL que expresa c D3 es un linfocito infiltrante de médula que expresa CD3, por ejemplo detectado por citometría de flujo. Por ejemplo, al menos aproximadamente 40 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan CD3, como al menos aproximadamente el 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % o incluso al menos aproximadamente 89 % de las células en la composición. En una modalidad preferida, al menos aproximadamente el 80 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan CD3. En algunas descripciones en la presente descripción, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan CD3, como aproximadamente 45 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 55 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 65 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 75 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 85 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 86 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 87 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 88 % a aproximadamente 100 % o incluso aproximadamente 89 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que no expresan CD3, por ejemplo detectado por citometría de flujo, o una población de MIL que expresa niveles bajos de CD3, es decir, con relación al nivel de expresión de MIL de la población de MIL que expresan CD3.
En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que expresa interferón gamma ("IFNy"), es decir, en donde cada célula de la población de MIL que expresa IFNy es un linfocito infiltrante de médula que expresa IFNy, por ejemplo detectado por citometría de flujo. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 2 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan IFNy, como al menos aproximadamente el 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 % o incluso al menos aproximadamente 18 % de las células de la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, aproximadamente 2 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan IFNy, como aproximadamente 2 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 3 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 4 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 6 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 7 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 8 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 9 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 11 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 12 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 13 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 14 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 16 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 17 % a aproximadamente 100 % o incluso aproximadamente 18 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que no expresan IFNy, por ejemplo detectado por citometría de flujo, o una población de MIL que expresa niveles bajos de IFNy, es decir, con relación al nivel de expresión de MIL de la población de MIL que expresan IFNy.
En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que expresa CXCR4, es decir, en donde cada célula de la población de MIL que expresa CXCR4 es un linfocito infiltrante de médula que expresa CXCR4, por ejemplo detectado por citometría de flujo. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 98 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan CXCR4, como al menos aproximadamente 98,1 %, 98,2 %, 98,3 %, 98,4 %, 98,5 %, 98,6 %, 98,7 %, 98,8 %, 98,9 %, 99,0 %, 99,1 %, 99,2 %,
99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 % o incluso al menos aproximadamente 99,7 % de las células de la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, aproximadamente 98 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población de MIL que expresan CXCR4, como al menos aproximadamente
98,1 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,2 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,3 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,4 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,5 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,6 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,7 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,8 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 98,9 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,0 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,1 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,2 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,3 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,4 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,5 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 99,6 % a aproximadamente 100 % o incluso aproximadamente 99,7 % a aproximadamente 100 % de las células de la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que no expresan CXCR4, por ejemplo detectado por citometría de flujo, o una población de MIL que expresa niveles bajos de CXCR4, es decir, con relación al nivel de expresión de MIL de la población de MIL que expresan CXCR4.
En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que expresa CD4. La población de MIL que expresa CD4 puede comprender una pluralidad de MIL que expresa CXCR4.
La población de MIL que expresa CD4 puede comprender una pluralidad de MIL que expresa 4-1BB. Por ejemplo, al menos aproximadamente 21 % de las células en la composición pueden ser MIL de la pluralidad de MIL que expresan
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de las células de la composición.
La composición puede comprender una población de MIL que expresa CD8. La población de MIL que expresa CD8 puede comprender una pluralidad de MIL que expresa CXCR4.
La población de MIL que expresa CD8 puede comprender una pluralidad de MIL que expresa 4-1BB. Por ejemplo, al menos aproximadamente 21 % de las células en la composición pueden ser MIL de la pluralidad de MIL que expresan
4-1BB, como al menos aproximadamente el 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %,
20 % o incluso al menos aproximadamente 21 % de las células en la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, aproximadamente 2 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición pueden ser
MIL de la pluralidad de MIL que expresan 4-1BB, como aproximadamente 8 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 9 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 11 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 12 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 13 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 14 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 16 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 17 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 18 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 19 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 % o incluso aproximadamente 21 % a aproximadamente 100 % de las células en la composición.
En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que expresa
4-1BB. Por ejemplo, al menos aproximadamente 21 % de las células en la composición pueden ser MIL de la población
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aproximadamente 32 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 33 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 34 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 35 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 36 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 37 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 38 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 39 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 41 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 42 % a aproximadamente 100 % o incluso de aproximadamente 43 % a aproximadamente 100 % de las células de la composición. En algunas descripciones en la presente descripción, la composición comprende una población de MIL que no expresan 4-1BB, por ejemplo detectado por citometría de flujo, o una población de MIL que expresa niveles bajos de 4-1BB, es decir, con relación al nivel de expresión de MIL de la población de MIL que expresan 4-1BB.
La descripción se refiere a una composición para el uso en un método para prevenir o tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción. En las descripciones preferidas en la presente descripción, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción. En las descripciones preferidas en la presente descripción, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de MIL, por ejemplo, MIL activadas, como se describe en la presente descripción. El sujeto puede tener una neoplasia, como cáncer. Por ejemplo, el sujeto puede tener mieloma múltiple. El sujeto puede ser un sujeto humano.
La descripción se refiere a un método para preparar una composición como se describe en la presente descripción, que comprende incubar MIL en un ambiente hipóxico. En algunos aspectos, la descripción se refiere a un método para activar linfocitos infiltrantes de médula ("MIL"), que comprende incubar MIL en un ambiente hipóxico.
La descripción se refiere a una composición para el uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto. El método puede comprender retirar los linfocitos infiltrantes de médula ("MIL") del sujeto; incubar las MIL en un ambiente hipóxico, produciendo de esta manera MIL activadas; y administrar las MIL activadas al sujeto.
El ambiente hipóxico puede comprender menos de aproximadamente 21 % de oxígeno, tal como menos de aproximadamente 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 %, 5 %, 4 % o menos de aproximadamente 3 % de oxígeno. Por ejemplo, el ambiente hipóxico puede comprender aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 20 % de oxígeno, tal como aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 19 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 18 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 17 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 16 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 15 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 14 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 13 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 12 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 11 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 10 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 9 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 8 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 7 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 6 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 5 % de oxígeno, aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 4 % de oxígeno o aproximadamente 0 % de oxígeno a aproximadamente 3 % de oxígeno. En las descripciones preferidas en la presente descripción, el ambiente hipóxico comprende aproximadamente 1 % a aproximadamente 7 % de oxígeno. El ambiente hipóxico puede comprender aproximadamente el 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o aproximadamente 0 % de oxígeno. En las descripciones preferidas en la presente descripción, el ambiente hipóxico comprende aproximadamente el 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de oxígeno.
La incubación de MIL en un ambiente hipóxico puede comprender la incubación de MIL, por ejemplo en medio de cultivo de tejidos, durante al menos aproximadamente 1 hora, como al menos aproximadamente 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 60 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o incluso al menos unos 14 días. La incubación puede comprender incubar las MIL durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 días, tal como aproximadamente 1 día a aproximadamente 20 días, aproximadamente 1 día a aproximadamente 14 días, o aproximadamente 1 día a aproximadamente 12 días. En algunas descripciones preferidas en la presente descripción, la incubación de MIL en un ambiente hipóxico comprende incubar las MIL en un ambiente hipóxico durante aproximadamente 2 días a aproximadamente 5 días. El método puede comprender la incubación de MIL en un ambiente hipóxico durante aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, o 14 días. En algunas descripciones preferidas en la presente descripción, el método comprende incubar las MIL en un ambiente hipóxico durante aproximadamente 3 días.
En las descripciones preferidas en la presente descripción, el método comprende además incubar las MIL en un ambiente normóxico, por ejemplo, después de incubar las MIL en un ambiente hipóxico.
El ambiente normóxico puede comprender al menos aproximadamente 21 % de oxígeno. El ambiente normóxico puede comprender aproximadamente 5 % de oxígeno a aproximadamente 30 % de oxígeno, tal como aproximadamente 10 % de oxígeno a aproximadamente 30 % de oxígeno, aproximadamente 15 % de oxígeno a aproximadamente 25 % de oxígeno, aproximadamente 18 % de oxígeno a aproximadamente 24 % de oxígeno, aproximadamente 19 % oxígeno a aproximadamente 23 % de oxígeno, o aproximadamente 20 % de oxígeno a aproximadamente 22 % de oxígeno. En algunas descripciones en la presente descripción, el ambiente normóxico comprende aproximadamente 21 % de oxígeno.
La incubación de MIL en un ambiente normóxico puede comprender la incubación de MIL, por ejemplo en medio de cultivo de tejidos, durante al menos aproximadamente 1 hora, como al menos aproximadamente 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 60 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o incluso al menos aproximadamente 14 días. La incubación puede comprender incubar los MIL durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 días, tal como aproximadamente 1 día a aproximadamente 20 días, aproximadamente 1 día a aproximadamente 14 días, aproximadamente 1 día a aproximadamente 12 días o aproximadamente 2 días a aproximadamente 12 días.
Ejemplificación
Ejemplo 1. Activación y expansión de células T en ambientes hipóxicos y normóxicos.
El número de células T de la médula ósea (BM) se determina mediante el uso de citometría de flujo. Se añaden perlas anti-CD3/anti-CD28 en la relación predeterminada (perlas:célula CD3) en medio con citocinas humanas recombinantes a una concentración predeterminada. Las células se colocan en placas, matraces o bolsas. Las condiciones hipóxicas se logran mediante la infusión de la cámara hipóxica o la bolsa de cultivo celular durante 3 minutos con una mezcla de gases de un 95 % de nitrógeno y un 5 % de CO2. A continuación, el receptáculo es rellenado con esta mezcla de gases durante 30 segundos. Esto conduce a un 2 % o menos de gas O2 en el receptáculo. Las células se cultivan a 37 °C durante 3 o más días y el aire hipóxico se libera y se reemplaza con niveles normóxicos (21 % de oxígeno atmosférico).
Ejemplo 2. Determinación fenotípica de tipos celulares
Las células se tiñen con anticuerpos conjugados con flurocromo para la determinación deseada. CD3, CD4, CD8, CXCR4, 41BB, CD27, CD28, CTLA-4, PD-1, CD45RO, CD62L, CD95, IFNg, IL17, colorante de exclusión vivo/muerto y/u otros anticuerpos de interés que se conjugan directamente con los flurocromos se usan con controles de isotipo apropiados. Brevemente, 1 x 106células o menos se lavan con tampón FACS (1XHBSS/2 % FBS/0,5 % EDTA/0,5 % NaAzide) o tampón de lavado similar en una placa o en un tubo girando en una centrífuga. El tampón de lavado se elimina y los anticuerpos y los controles de isotipo se agregan a concentraciones predeterminadas. Las células se tiñen entre 7-30 minutos a temperatura ambiente o a 4 °C. Las células se lavan 2 veces con tampón de lavado y se resuspenden en un mínimo de tampón de lavado. Luego, las células se procesan en un citómetro de flujo que se ha compensado y preparado adecuadamente para los flurocromos que se están utilizando. Se recolectan 10000 o más números de eventos para cada muestra. Los datos se analizan utilizando el software de análisis FACS. Las células marcadas con flurocromo se comparan con los controles de isotipo para la eliminación del fondo. Los datos se grafican como % positivo - % de fondo.
Ejemplo 3. Determinación del número de expansiones
Las células de la médula ósea se enumeran al comienzo de la expansión. El porcentaje de células CD3+ se determina mediante el uso de citometría de flujo. El número total de MIL CD3+se determinan multiplicando el número total de células por el porcentaje de CD3 = número total de MIL CD3+ en cultivo. El último día de cultivo, las células se recogen y se cuentan (tanto manualmente como con un contador celular automático). Se determina el porcentaje de CD3+. El número total de células CD3+ en el último día de cultivo se determina multiplicando el número total de células con el porcentaje de CD+ = número total de MIL CD3+cosechadas. El Número total de expansiones = número total de MIL CD3+recolectados en el último día de cultivo dividido por el número total de MIL CD3+ en el día inicial de cultivo.
Ejemplo 4. Especificidad tumoral
Se marcan los MIL con CFSE o un tinte de integración de la membrana celular similar de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. La MO autóloga se pulsa con medio solo, un control negativo (proteína o lisado no relacionado) o con la proteína o lisado de interés. A continuación, las células marcadas con CFSE se cultivan conjuntamente con MO autóloga pulsada durante 2-7 días. Las células se recogen de la placa o matraz de cultivo de tejidos y luego se tiñen con CD3 extracelular e intracelularmente con IFNg. El análisis de la especificidad del tumor se determina mediante la activación de células CD3+ que tienen un CFSE bajo (células divididas) y que producen IFNg.
Ejemplo 5. Activación y expansión de células T en ambientes hipóxicos y normóxicos.
Las MIL se cultivaron en 2 % de O2(hipoxia) durante 3 días seguido de un cambio a 21 % de O2(normoxia) durante 5 días adicionales en presencia o ausencia de IL-2. Como se muestra en la Figura 9, el crecimiento en hipoxia seguido de normoxia dio como resultado un aumento de casi 10 veces en la expansión en comparación con los MIL cultivados exclusivamente en condiciones normóxicas. La especificidad del tumor también se incrementó notablemente como se muestra en la Figura 4. El día 10, el 4 % de las células con bajo nivel de CFSE eran específicas de tumor en condiciones normóxicas opuesto al 25,1 % de las MIL cultivadas en condiciones hipóxicas. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que estas condiciones de crecimiento son capaces de aumentar el número absoluto de células específicas de tumores tras la activación.
Los experimentos del párrafo anterior se realizaron en una pequeña muestra. El producto MIL de un paciente en un primer estudio clínico también se amplió mediante el uso de este método. Como se muestra en la Figura 3, la expansión de MIL en estas condiciones aumentó drásticamente el número de células T. El crecimiento en condiciones normóxicas rara vez fue capaz de expandir las MIL más allá de los 7 días. En este experimento, la expansión del día 7 fue 36,3 veces en condiciones normóxicas opuesto a 119 en condiciones hipóxicas. Además, las células continuaron expandiéndose hasta 12 días y alcanzaron una expansión total de 220 veces a los 11 días antes de comenzar a morir.
Se ha demostrado que la expresión de 4-1BB es un regulador clave de muchas de estas propiedades. Puede regular la expansión de las células T, reducir la apoptosis, aumentar la actividad citotóxica de las células CD8 y mejorar la supervivencia. Además, HIF1a regula la supervivencia de las células T dirigidas a antígenos. Las células T modificadas con el receptor de antígeno quimérico (CAR) con el vector que expresa 4-1BB han mostrado una expansión in vivo significativa. En conjunto, la expresión de 4-1BB en MIL activadas puede ser un regulador importante de una mayor supervivencia y especificidad tumoral. Una ventaja marcada del método descrito en la presente descripción es que no hay necesidad de modificar los MIL para lograr una expresión mejorada de 4-1BB. Esta ventaja se muestra en la Figura 10 donde se cultivaron MIL o PBL en condiciones normóxicas o hipóxicas. La expresión basal de 4-1BB se evaluó en MIL y se comparó con PBL. Como se muestra, la expresión de 4-1BB fue mayor en MIL que en PBL (18,2 % frente a 8,1 %). Curiosamente, la expansión de células T en normoxia redujo su expresión en ambas poblaciones (MIL 10,7 %, PBL 2,8 %) mientras que la expansión en hipoxia aumenta significativamente la expresión de 4-1BB en MIL (43,4 %) y anuló por completo su expresión en PBL (0 %). Estos datos nuevamente subrayan las diferencias significativas entre los PBL y MIL también demuestran que la regulación al alza de 4-1BB depende de más factores que las condiciones de crecimiento simplemente hipóxicas. Más importante aún, la regulación positiva inesperada de 4-1BB demuestra que el método de la presente descripción hace una diferencia significativa en el tratamiento de pacientes que usan MIL de crecimiento hipoxémico. Se observaron resultados similares con células CD8 (Figura 8).
La Figura 11 muestra los resultados de la dosificación para el tratamiento clínico. En J0770, se cultivaron MIL en cultivos estáticos en condiciones normóxicas. J0997 - Los MIL se cultivaron en WAVE en condiciones normóxicas. J1343 - Los MIL se cultivaron durante 3 días en condiciones hipóxicas seguidas de condiciones normóxicas. En la Figura 6, se grafican los recuentos absolutos de linfocitos para los 3 ensayos posteriores al trasplante de células madre autólogas. J1343 es un ensayo aleatorizado en el que los pacientes recibieron MIL hipóxicos o no recibieron MIL infundidos después del trasplante.
Como se muestra en la Figura 11, las condiciones de crecimiento del presente método han aumentado la expansión total de células T desde un promedio de 7,9E9 a 1,8E10. Además, muestra por primera vez la expansión de células T in vivo como se muestra en la Figura 6, que está directamente relacionada con la eficacia del método en el tratamiento de pacientes. En el gráfico se muestran los recuentos totales de linfocitos hasta el día 60 para un primer grupo de pacientes.
Claims (15)
- Reivindicacionesi. Una composición que comprende una población celular de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia, expandidos en normoxia ex vivo, en donde aproximadamente del 60 % a aproximadamente 100 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan CD3 y al menos el 21 % de la población expresa 4-1BB, en donde la población celular se prepara mediante un proceso que comprende las etapas de:(a) recibir una muestra de médula ósea de un sujeto que tiene cáncer;(b) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula recolectados de la muestra de médula ósea con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en un ambiente hipóxico de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 5 días para producir linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia; y(c) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia en un ambiente normóxico de aproximadamente 21 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 12 días en presencia de IL-2 para producir la composición.
- 2. Un método para preparar una composición que comprende una población celular de linfocitos infiltrantes de médula ósea activados en hipoxia, expandidos en normoxia ex vivo, en donde aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan CD3 y al menos el 21 % de la población expresa 4-1 BB, en donde el método comprende:(a) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula recolectados de una muestra de médula ósea con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en un ambiente hipóxico de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 5 días para producir linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia; y(b) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia en un ambiente normóxico de aproximadamente 21 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 12 días en presencia de IL-2 para producir la composición.
- 3. Una composición que comprende una población celular de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia, expandidos en normoxia ex vivo, en donde entre el 60 % a aproximadamente 100 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan CD3 y al menos el 21 % de la población expresa 4-1BB para el uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde los linfocitos se preparan de acuerdo con un método que comprende las etapas de:(a) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula recolectados de una muestra de médula ósea obtenida del sujeto que tiene cáncer con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en un ambiente hipóxico de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 5 días para producir linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia; (b) cultivar los linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia en un ambiente normóxico de aproximadamente 21 % de oxígeno durante aproximadamente 2 a aproximadamente 12 días en presencia de IL-2 para producir los linfocitos infiltrantes de médula activados terapéuticos; y(c) administrar los linfocitos infiltrantes de médula activados terapéuticos al sujeto que tiene cáncer.
- 4. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el cáncer es un cáncer hematológico, tal como mieloma múltiple o un tumor sólido, tal como un tumor de pulmón o un tumor de mama.
- 5. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4 o el método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la muestra de médula ósea se cultiva en el ambiente hipóxico durante aproximadamente 3 días.
- 6. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o el método de la reivindicación 2 o la reivindicación 5, en donde los linfocitos infiltrantes de médula ósea activados en hipoxia se cultivan en el ambiente normóxico durante aproximadamente 6 días.
- 7. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 o 6, en donde los linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia se cultivan en un ambiente normóxico durante aproximadamente 9 días.
- 8. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 7, que comprende además la etapa de retirar una muestra de médula ósea de un sujeto que tiene cáncer antes de la etapa (a).
- 9. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 8, en donde el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28 están unidos a una perla.
- 10. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, la composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 9, en donde aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan CD3.
- 11. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 10, la composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 10, en donde la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresa CD4.
- 12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1, 10 u 11, la composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 11, en donde la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresa CD8.
- 13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 10 a 12, la composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 12, en donde aproximadamente 21 % a aproximadamente 100 % de la de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan 4-1BB.
- 14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 10 a 13, la composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 13, en donde aproximadamente 25 % a aproximadamente 100 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan 4-1BB.
- 15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 10 a 14, la composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 5 a 14, en donde aproximadamente 35 % de la población de linfocitos infiltrantes de médula activados en hipoxia expresan 4-1BB.
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