KR20170067751A - 저산소 및 정상산소 교대 조건에서 골수 침윤성 림프구의 활성화 - Google Patents

저산소 및 정상산소 교대 조건에서 골수 침윤성 림프구의 활성화 Download PDF

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이반 엠. 보렐로
킴벌리 에이. 누난
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

일부 양태에서, 본 발명은 골수 침윤성 림프구 ("MIL")를 포함하는 조성물에 관한 것이다. MIL은 활성 MIL일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션함을 포함하는 MIL을 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 활성 MIL을 포함하는 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

저산소 및 정상산소 교대 조건에서 골수 침윤성 림프구의 활성화{ACTIVATION OF MARROW INFILTRATING LYMPHOCYTES IN HYPOXIC ALTERNATING WITH NORMOXIC CONDITIONS}
우선권 주장
본 출원은 2014년 9월 4일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/045,782호, 및 2015년 6월 29일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/186,040호의 우선권을 주장하며, 상기 각각의 출원들은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
골수절제식 화학요법(myeloablative chemotherapy)은 장기간 치유에 대한 입증은 별로 없지만 다발성 골수종(multiple myeloma)을 포함한 다수의 혈액암에 대하여 용인되는 요법이다. 그러나, 골수절제식 요법은 또한 면역-기반 요법에 더해지는 이상적인 플랫폼을 제공한다. 특히, 고용량 화학요법(high dose chemotherapy)으로부터 생성된 림프구감소(lymphopenia)는 항상성 림프구 증식을 용이하게 하고, 관용성 항원 표출 세포(tolerogenic antigen presenting cell: APC)를 제거하고, 입양 T 세포 요법을 위한 더욱 바람직한 환경을 생성시키는 사이토카인 방출을 유도한다. 자가 줄기 세포 이식을 거치는 골수종, 림프종, 및 급성 골수성 백혈병을 앓고 있는 환자의 조기 림프구 회복으로 임상 결과가 개선됨으로써, 면역 체계가 고용량 화학요법의 임상적 이점에 기여할 수 있다는 간접적인 증거가 입증되었다. 추가로, 이는 아페러시스(apheresis) 제품으로부터 주입되는 자가 림프구의 용량과 직접적으로 연관되는 골수종의 결과를 개선시켰다. 종합하면, 이러한 데이터는 항-종양 면역이 임상적으로 측정가능한 이점을 지닐 수 있다는 가설을 뒷받침하고 있으며, 현재 이용가능한 요법의 효능을 증진시키기 위해 그러한 면역을 어떻게 이용할지에 대한 논의를 증가시킨다.
입양 T 세포 요법 (ACT)으로 측정가능한 질환을 퇴치하는 능력은 T 세포가 적절히 활성화되고 충분한 갯수로 존재하는 것을 필요로 하고, 상당한 항-종양 활성을 지니고, 종양 부위를 자각하며, 접하게 될 때 종양을 효과적으로 사멸시키며, 시간이 지남에 따라 지속된다. 항-CD3 및 CD28가 결합되는 상자성 비드(paramagnetic bead)를 포함한 어떠한 기술에 의한 T 세포의 시뮬레이션(simulation)은 무력 (내성) 상태를 효과적으로 역전시키고, 활성 T 세포를 생성시키고, 이들의 갯수를 유의하게 늘릴 수 있다. 비드-결합된 항-CD3 및 CD28은 간단하고 강력한 시험관내 T 세포 증폭을 제공하지만, 이러한 접근법의 주요 제한은 종양 특이적 T 세포의 강화 없이 전체 T 세포 레퍼토리(repertoire)를 비-특이적으로 시뮬레이션하는 것이다. ACT의 종양 특이성을 증가시키는 한 가지 전략은 더 큰 내생 종양 특이성을 지니는 T 세포 집단을 사용하는 것이다. 그러한 향상은 전이성 흑색종으로부터 종양 침윤성 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)를 사용하는 ACT의 상당한 항-종양 활성을 설명한다. 그러나, TIL은 전이성 흑색종(metastatic melanoma)이 있는 환자들 중 일부에만 존재하고, 이들 중 성공정인 TIL 제법은 채취가능한 종양이 있는 환자의 단지 60-70%에서만 달성되는데, 이는 그러한 접근법의 일반적인 적용가능성을 제한한다. 골수는 다발성 골수종과 같은 다수의 혈액암에 대한 종양 미세환경이고, 그에 따라서, 골수-침윤성 림프구(MIL)는 이러한 특이적 암에 대한 종양 특이적 T 세포 치료법을 형성시키는데 사용될 수 있다. TIL과 대조적으로, MIL은 모든 환자에게 존재하고, 간단한 베드-사이드 절차(bed-side procedure)로 얻어질 수 있으며, 모든 환자에서 신속하게 확장될 수 있다.
혈액암에서, 골수는 질환의 위치뿐만 아니라 독특한 미세환경으로 대표된다. 고형 종양에서도, MIL가 기억 또는 작동-기억 T 세포에서 풍부할 수 있다는 증거가 있다. 골수 내 면역 성분은 조기 단계의 유방암이 있는 숙주의 종양 특이적 T 세포뿐만 아니라 백신-프라이밍된 T 세포 둘 모두에 대해 항원 경험 T 세포의 수용체이다. 골수에서, 기억 CD4 세포는 간질 세포를 발현시키는 IL-7와의 상호작용을 통해 유지되고, CD8 세포는 항원 발현의 지속 및 효과적인 항원 표출을 통해 유지된다. 이로써, 이러한 환경에서 MIL의 고조된 종양 특이성은 항원의 공급원으로서 종양의 존재에서 기인될 수 있지만, 이들의 지속성은 간질 요소, 사이토카인, 및 이러한 환경에서 효과적인 항원 표출을 가능하게 하는 항원 표출 세포와의 독특한 면역 상호작용을 통해 유지된다.
생체외 활성 MIL은 입양 T 세포 치료법에 대한 여러 필수적인 특성을 지닌다. 활성화 시에, 이들은 이들의 말초 혈액 림프구 상대에 비해 유의한 종양 특이성으로 입증되고, 이들은 지속형 다발성 골수종 형질 세포뿐만 아니라 이들의 클론형성 전구체 둘 모두에 존재하는 광범위한 항원을 표적으로 하며, 다발성 골수종 형질 세포를 효과적으로 사멸시킨다. TIL과 유사하게, MIL은 말초 림프구보다 큰 내생 다클론성 항원 특이성을 지닌다. TIL과 대조적으로, MIL은 모든 환자에게 존재하며, 더 많은 면역 반응성 미세환경으로부터 얻어진다. 이로써, MIL은 골수가 관여된 혈액암을 위한 ACT에 대한 신규하고 유망한 종양-특이적 접근인 것으로 여겨진다.
일부 양태에서, 본 발명은 골수 침윤성 림프구(marrow infiltrating lymphocyte: "MIL")를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 CD3를 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 40%는 CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 MIL을 포함할 수 있고, 세포의 40%는 유세포 분석 개폐에 의해 측정하는 경우 CD3를 발현할 수 있고; 따라서, 조성물 중의 세포의 적어도 약 40%는 CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 것이다. 조성물은 인터페론 감마 (interferon gamma: "IFNγ")를 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 2%는 IFNγ를 발현하는 MIL의 집단의 MIL일 수 있다. 조성물은 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 98%는 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 조성물은 CD4를 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. 조성물은 CD8을 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. 조성물은 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 21%는 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션(incubation)함을 포함하여 골수 침윤성 림프구("MIL")를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 MIL을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 대상체로부터 골수 침윤성 림프구("MIL")를 제거하고; 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션함으로써 활성 MIL를 생성시킴을 포함한다.
도 1은 인터류킨 2를 포함하는 배지 (+IL2) 또는 인터류킨 2이 없는 배지 (IL2 없음)에서 정상산소 조건 또는 저산소 조건하에 증가된 MIL에 대한 유세포분석 결과를 도시한 것이다. 인터류킨 2를 포함하는 배지에서 정상산소 조건하에 성장된 개폐형 세포의 35.09%는 CD3에 대해 양성이었다. 인터류킨 2가 결핍된 배지에서 정상산소 조건하에 성장된 개폐형 세포의 30.98%는 CD3에 대해 양성이었다. 인터류킨 2를 포함하는 배지에서 저산소 조건하에 성장된 개폐형 세포의 89.01%는 CD3에 대해 양성이었다. 인터류킨 2가 결핍된 배지에서 저산소 조건하에 성장된 개폐형 세포의 89.96%는 CD3에 대해 양성이었다.
도 2는 정상산소 또는 저산소 조건하에 성장된 MIL 및 말초 혈액 림프구 (PBL)에 대한 CD3+ 세포의 증식을 보여주는 차트이다. 저산소 조건은 CD3+ PBL의 증식을 감소시키지만, CD3+ MIL의 증식을 증가시켰다.
도 3은 정상산소 또는 저산소 환경에서 다양한 인큐베이션 기간 후 CD3+ MIL의 증식을 비교하는 그래프이다. 유의한 증식은 정상산소와 비교하여 저산소 환경에서 인큐베이션 7일 후에 관찰되었고, CD3+ 증식은 인큐베이션 11일째에 최대였다.
도 4는 10일(D10) 또는 12일(D12) 동안 증식된 세포의 경우에 골수종 세포주(U266/H929) 또는 대조 세포주(SW780)에 대한 저산소 또는 정상산소 조건하에 증식된 MIL의 종양 특이성을 도시하는 그래프이다. 저산소 세포는 2% 산소를 포함하는 환경에서 3일 동안 성장했고, 정상산소 환경(21% 산소)에서 증식되었다. 10일 째에, CFSE가 낮고 종양 항원에 반응하여 인터페론 감마(IFNγ)를 생성시키는 총 T 세포의 퍼센트에 의해 측정하는 경우에, 정상산소 조건하에 증식된 세포의 4%는 저산소 조건하에 증식된 MIL의 25.1%와 비교해 볼 때 종양 특이적이었다.
도 5는 CD3 및 INFγ에 대한 개폐를 이용한 다양한 조건하에서 증식된 MIL의 종양 특이성에 대한 유세포분석 결과를 도시한 것이다. 증식 7일 후, 저산소 조건하에 성장된 MIL의 18.26%가 CD3와 인터페론 감마 둘 모두에 대해 양성이었다. 대조적으로, 정상산소 조건하에 성장된 MIL의 1.72%만이 CD3와 인터페론 감마 둘 모두에 대해 양성이었다.
도 6은 다양한 조건하에 성장된 MIL를 수용하는 대상체에서 림프구 자가 이식 후의 생체내 증식을 도시하는 그래프이다. x-축은 이식 후 날짜수에 상응하고, y-축은 대상체의 마이크로리터 당 평균 절대 림프구 계수에 상응한다. 그래프는 인간 대상체에서 저산소조건하에 성장된 MIL가 정상산소 조건하에서만 성장된 MIL보다 계속해서 많이 증식한다는 것을 시사한다.
도 7은 CXCR4 및 CD4 또는 CD8에 대한 개폐를 이용한 다양한 산소조건하에 증식된 MIL에 대한 유세포분석 결과를 도시한 것이다. 정상산소 조건하에 증식된 전체 MIL 집단의 28.38%는 3.9의 평균 형광 세기로 CXCR4에 대해 양성이고 또한 CD4에 대해 양성이었다. 저산소 조건하에 증식된 MIL의 68.91%는 5.4의 평균 형광 세기로 CXCR4에 대해 양성이고 또한 CD4에 대해 양성이었다. 정상산소 조건하에 증식된 MIL의 8.02%는 4.6의 평균 형광 세기로 CXCR4에 대해 양성이고 또한 CD8에 대해 양성이었다. 저산소 조건하에 증식된 MIL의 11.08%는 CXCR4에 대해 양성이고 또한 CD8에 대해 양성이었다. 이러한 결과는 저산소가 CXCR4를 발현하는 세포 수뿐만 아니라 세포당 발현 정도(degree of expression per cell: MFI)를 증가시켜 주입 시에 이러한 세포가 골수로 이동할 가능성을 증가시킨다는 것을 시사한다.
도 8은 세 개의 표시된 패널, 즉, 패널 (A), (B), 및 (C)로 구성되어 있다. 패널 A는 CD4, CD8, 및 4-1BB에 대한 개폐를 이용한 세포 증식 전 말초 혈액 림프구 (PBL) 및 MIL에 대한 유세포분석 결과를 도시한 것이다. 패널 B는 CD4, CD8, 및 4-1BB에 대한 개폐를 이용한 정상산소 조건하의 증식 후 PBL 및 MIL에 대한 유세포분석 결과를 도시한 것이다. 나타나 있는 바와 같이, PBL에서의 4-1BB 발현은 CD8 PBL를 11.34%에서 0.34%로 감소시켰고, MIL CD8은 15.1%에서 7.54%로의 감소를 나타냈다. 패널 C는 CD4, CD8, 및 4-1BB에 대한 개폐를 이용한 저산소 조건하의 증식 후 PBL 및 MIL에 대한 유세포분석 결과를 도시한 것이다. PBL은 저산소 조건하의 증식 후에 4-1BB을 하향조절하였고(CD8 PBL: 기준선 11.34%에서 0%로), MIL은 저산소 조건하의 증식 후에 4-1BB를 상향조절하였다(CD8 MIL: 기준선 15.1%에서 21.79%로).
도 9는 저산소 조건하의 MIL의 성장이 오로지 정상산소 조건하의 성장에 비해 CD3+ 세포의 수를 증가시킨다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 10은 저산소 조건하의 MIL의 증식이 저산소 조건하의 PBL의 증식이나 정상산소 조건하의 MIL의 증식보다 더 높은 비율의 CD4+/4-1BB+ 세포를 생성시킨다는 것을 나타내는 유세포분석 결과를 보여주는 것이다.
도 11은 MIL의 생체외 증식을 보여주는 그래프이다. 저산소 조건하에 증식된 MIL은 오로지 정상산소 조건하에 증식된 MIL에 비해 더 큰 선량을 생성시켰다.
입양 T 세포 치료법으로 달성하고자 하는 주요 목적은, 종양 특이적 T 세포를 최대 갯수로 성장시키고, 이를 후속적으로 또한 재주입 시에 생체내에서 증식시키고 시간이 지남에 따라 지속시키는 것을 가능하게 하는 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 골수 침윤성 림프구 ("MIL")의 고유의 특성을 이용하는 T 세포 증식에 대한 신규한 접근에 대한 것이다. 특히, MIL은 말초 림프구 (PBL)와 상당히 다르다. 예를 들어, MIL은 더 용이하게 증식되고, 활성화 마커(activation marker)를 PBL보다 더 큰 정도로 상향조절하고, 골수로의 이동인 Vβ 레퍼토리를 보다 편향되게 유지하며, 가장 중요하게는, 상당히 더 큰 종양 특이성을 지닌다. MIL 항-골수종 면역은 임상 반응과 직접적으로 연관되지만; 종래에 생체내 T 세포 증식 또는 지속적인 임상 반응은 주입 후에 관찰되지 않았다.
21% 미만의 산소, 예컨대, 약 1% 산소 내지 약 7% 산소 또는 약 1% 산소 내지 약 3% 산소, 예를 들어, 2% 산소(저산소 조건)의 O2 수준에서 MIL을 배양하는 것은 오로지 정상산소 조건에서 배양하는 것에 비해 전체 세포 증식뿐만 아니라 이들의 종양 세포를 인지 능력을 증가시킨다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 치료 용도를 위한 MIL의 제조 방법에 관한 것이다. 골수는 환자로부터 채취될 수 있다. 채취된 골수는, 예를 들어, 종양 특이적 MIL을 형성시키기 위해서 냉동되거나 즉시 사용될 수 있다. 골수가 냉동되면, 이는 바람직하게는 인큐베이션 전에 해동된다. 골수는 당업자에게 공지된 방법을 통해 MIL을 정제하도록 처리될 수 있다. MIL은, 예를 들어, 비드, 예를 들어, 항-CD3/ CD28 비드로 활성화될 수 있다. 용액 중의 비드 대 세포의 비율은 다양할 수 있고; 일부 바람직한 구체예에서, 비율은 3 대 1이다. 마찬가지로, MIL은 하나 이상의 항체, 항원, 및/또는 사이토카인의 존재하에서, 예를 들어, 항-CD3/ CD28 비드의 부재하에서 증식될 수 있다. 채취된 골수에 대한 세포 계수는, 예를 들어, MIL에 첨가되는 예를 들어 비드, 항체, 항원, 및/또는 사이토카인의 양을 조절하기 위해 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, MIL은 세포를 채취하도록 특이적으로 구성된 비드를 사용하여 포집된다.
채취된 MIL은 우선적으로, 예를 들어, 첫 번째 기간 동안 저산소 환경에서 성장된다. 일부 구체예에서, MIL은 2%의 AB 혈청 및 200U의 IL2가 보충된 X-VIVO™ 15 배지에서 조직 배양 백에 넣어질 수 있다. 당업자가 알고 있는 다른 배양 조건 및 요소가 이용될 수 있음이 고려된다. MIL은 약 1% 내지 약 7% 산소 (저산소; 저산소 조건), 바람직하게는 약 1% 내지 약 3% 산소, 예컨대, 약 2% 산소의 환경에서 약 3 내지 약 20 일 (즉, 첫 번째 기간), 예컨대, 약 3 내지 약 10 일, 예컨대, 4 일 동안 성장될 수 있다. 저산소 환경은, 예를 들어, 세포가 성장되는 용기(container)에 아산화질소를 첨가함으로써 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 저산소 환경은 저비중 챔버(hypobaric chamber)를 사용함으로써 형성될 수 있다. 저산소 성장 후, MIL은 정상산소 환경, 예를 들어, 21% 산소에서 성장될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, MIL은 정상산소 조건에서 추가 약 3 내지 약 7 일(즉, 두 번째 기간) 동안, 예를 들어, 총 약 3 내지 약 27 일의 성장, 예컨대, 약 3 내지 약 10 일의 성장 동안 성장된다. 성장된 세포는 이후 환자(예를 들어, 환자 또는 동종이계 수용체)에게 투여되거나 추후 사용을 위해 저장될 수 있다.
환자의 골수로부터 채취되고 본원에 기재된 방법에 따라, 즉, 저산소 조건하에 첫 번째 기간 동안 이후 정상산소 조건하에 두 번째 기간 동안 처리되는 MIL은 예기치 않게도 동일한 절차에 주어지는 말초 혈액 림프구 (PBL)보다 우수하게 수행되었다. 하기 나타나 있는 바와 같이, MIL의 향상된 능력은 시험관내와 생체내 둘 모두에서 뛰어난 증식, 생물학적 마커, 예컨대, 4-1BB의 발현 향상, 및 종양 특이성 증가를 포함한다.
당업자는 본 발명의 절차가 다수의 상이한 유형의 암, 예컨대, 골수종, 폐암, 및 유방암을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 알 것이다. 골수는 중심 기억 세포의 보유체이기 때문에, 임의의 다양한 암으로부터의 종양 특이적 T 세포는 환자의 골수에서 발견되었다. 본원에 개시된 바와 같이, 저산소 배양 조건은 증식 뿐만 아니라 종양 특이성 둘 모두를 증가시키고, 그에 따라서, 이러한 접근은 광범위한 암 환자로부터 MIL을 성장시키는데 이용될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 저산소 조건에서 첫 번째 기간 동안, 예를 들어, 약 1일 내지 약 20일 동안 증식된 후, 정상산소 조건에서 두 번째 기간 동안, 예를 들어, 약 3 일 내지 약 7 일 동안 증식된 환자의 MIL이 채취된다. 세포는 이후 치료를 위한 환자에게 제공되거나 추후 사용을 위해 저장될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 저산소 환경에서의 MIL의 증식이 주입 후 생체내 T 세포 증식을 가능하게 한다는 발견에 관한 것이다. 특히, MIL은 2% O2 (저산소)에서 3일 동안 이어서 21% O2 (정상산소)로의 전환으로 성장되어 거의 10배 더 큰 종양 특이성이 야기되었다(도 4). 종합하면, 이러한 데이터는 그러한 성장 조건이 오로지 정상산소 조건하에 성장된 MIL에 비해 동일한 공급원으로부터 얻어진 종양 특이적 MIL의 절대 갯수를 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다.
환자 샘플로부터 MIL 생성물을 사용하여 모든 실험을 수행하였다. 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 저산소 조건에서 실제 크기의 임상용 MIL 생성물의 증식은 T 세포 수를 상당히 증가시켰다. 정상산소 조건으로는 7일 후에 MIL를 증식시키는 것 어려웠음이 주지되어야 한다. 이러한 실험에서, 7일째 증식은 저산소에서 119배에 비해 정상산소에서는 36.3배였다. 게다가, 저산소 조건하에 성장된 세포는 12일째까지 계속 증식되고, 11일째에는 총 220배 증식에 도달되었다.
더 우수한 증식 및 더 큰 종양 특이성을 얻는 것에 더하여, 성장 조건은 T 세포 생존을 최대화시키도록 최적화되었다. 4-1BB의 발현은 다수의 이러한 특성들의 중요한 조절자인 것으로 밝혀졌다. 이는 T 세포 증식을 조절하고, 세포자멸(apoptosis)을 감소시키고, CD8 세포의 세포상해 활성을 증가시키고, 생존을 향상시킬 수 있다. 종합하면, 활성 MIL에 대한 4-1BB 발현은 고조된 생존 및 종양 특이성의 중요한 조절자일 수 있다. 따라서, 4-1BB 발현은 다양한 조건에서 성장된 MIL에 대하여 검사되고 PBL와 비교되었다. 도 8에 나타나 있는 바와 같이, 4-1BB의 기준선 발현은 PBL보다 MIL에서 더 컸다(18.2% 대 8.1%). 흥미롭게도, 정상산소에서의 T 세포 증식은 둘 모두의 집단에서 이의 발현을 감소시켰고((MIL 10.7%, PBL 2.8%), 반면에, 저산소에서의 증식은 MIL에서 4-1BB 발현을 유의하게 증가시키고(43.4%) PBL에서는 이의 발현이 완전히 없었다. 이러한 데이터는 다시, 4-1BB 상향 조절이 단순한 저산소 성장 조건보다 더 많은 양으로 좌우되기 때문에 PBL과 MIL 사이의 유의한 차이가 또한 입증되었음을 강조한다.
이러한 배양 조건을 임상 시험에 채택하였는데, 저산소 성장 조건은 총 T 세포 증식을 평균적으로 7.9E9에서 1.8E10로 증가시켰다. 게다가, 저산소 성장 조건에서 또한 생체내 T 세포 증식의 관찰이 가능했다(도 6, 모든 환자에 대하여 60일에 걸쳐 림프구 총 계수가 도시됨).
일부 양태에서, 본 발명은 골수 침윤성 림프구 ("MIL")를 포함하는 조성물에 관한 것이다. MIL은 활성 MIL일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 CD3를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. 즉, CD3를 발현하는 MIL의 집단에서 각각의 세포는, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, CD3를 발현하는 골수 침윤성 림프구이다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 40%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 심지어 적어도 약 89%는 CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 조성물 중의 세포의 적어도 약 80%는 CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 세포의 약 40% 내지 약 100%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 약 45% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 86% 내지 약 100%, 약 87% 내지 약 100%, 약 88% 내지 약 100%, 또는 심지어 약 89% 내지 약 100%는 CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, CD3를 발현하지 않는 MIL의 집단이거나 저수준, 즉, CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 비해 저수준의 CD3를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 인터페론 감마 ("IFNγ")를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. 즉, IFNγ를 발현하는 MIL의 집단에서 각각의 세포는, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, IFNγ를 발현하는 골수 침윤성 림프구이다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 2%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 또는 심지어 적어도 약 18%는 IFNγ를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 세포의 약 2% 내지 약 100%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 약 2% 내지 약 100%, 약 3% 내지 약 100%, 약 4% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 100%, 약 6% 내지 약 100%, 약 7% 내지 약 100%, 약 8% 내지 약 100%, 약 9% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 100%, 약 11% 내지 약 100%, 약 12% 내지 약 100%, 약 13% 내지 약 100%, 약 14% 내지 약 100%, 약 15% 내지 약 100%, 약 16% 내지 약 100%, 약 17% 내지 약 100%, 또는 심지어 약 18% 내지 약 100%는 IFNγ를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, IFNγ를 발현하지 않는 MIL의 집단이거나 저수준, 즉, IFNγ를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 비해 저수준의 IFNγ를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. 즉, CXCR4를 발현하는 MIL의 집단에서 각각의 세포는, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, CXCR4를 발현하는 골수 침윤성 림프구이다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 98%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 또는 심지어 적어도 약 99.7%는 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 세포의 약 98% 내지 약 100%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 98.1% 내지 약 100%, 약 98.2% 내지 약 100%, 약 98.3% 내지 약 100%, 약 98.4% 내지 약 100%, 약 98.5% 내지 약 100%, 약 98.6% 내지 약 100%, 약 98.7% 내지 약 100%, 약 98.8% 내지 약 100%, 약 98.9% 내지 약 100%, 약 99.0% 내지 약 100%, 약 99.1% 내지 약 100%, 약 99.2% 내지 약 100%, 약 99.3% 내지 약 100%, 약 99.4% 내지 약 100%, 약 99.5% 내지 약 100%, 약 99.6% 내지 약 100%, 또는 심지어 약 99.7% 내지 약 100%는 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, CXCR4를 발현하지 않는 MIL의 집단이거나 저수준, 즉, CXCR4를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 비해 저수준의 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 CD4를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. CD4를 발현하는 MIL의 집단은 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함할 수 있다.
CD4를 발현하는 MIL의 집단은 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 21%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 또는 심지어 적어도 약 43%는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 세포의 약 21% 내지 약 100%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 22% 내지 약 100%, 약 23% 내지 약 100%, 약 24% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 100%, 약 26% 내지 약 100%, 약 27% 내지 약 100%, 약 28% 내지 약 100%, 약 29% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 31% 내지 약 100%, 약 32% 내지 약 100%, 약 33% 내지 약 100%, 약 34% 내지 약 100%, 약 35% 내지 약 100%, 약 36% 내지 약 100%, 약 37% 내지 약 100%, 약 38% 내지 약 100%, 약 39% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 41% 내지 약 100%, 약 42% 내지 약 100%, 또는 심지어 약 43% 내지 약 100%는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있다.
조성물은 CD8을 발현하는 MIL의 집단을 포함할 수 있다. CD8을 발현하는 MIL의 집단은 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함할 수 있다.
CD8을 발현하는 MIL의 집단은 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 21%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 또는 심지어 적어도 약 21%는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 세포의 약 2% 내지 약 100%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 약 8% 내지 약 100%, 약 9% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 100%, 약 11% 내지 약 100%, 약 12% 내지 약 100%, 약 13% 내지 약 100%, 약 14% 내지 약 100%, 약 15% 내지 약 100%, 약 16% 내지 약 100%, 약 17% 내지 약 100%, 약 18% 내지 약 100%, 약 19% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 또는 심지어 약 21% 내지 약 100%는 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL일 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다. 예를 들어, 조성물 중의 세포의 적어도 약 21%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 적어도 약 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 또는 심지어 적어도 약 43%는 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 중의 세포의 약 21% 내지 100%, 예컨대, 조성물 중의 세포의 약 22% 내지 약 100%, 약 23% 내지 약 100%, 약 24% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 100%, 약 26% 내지 약 100%, 약 27% 내지 약 100%, 약 28% 내지 약 100%, 약 29% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 31% 내지 약 100%, 약 32% 내지 약 100%, 약 33% 내지 약 100%, 약 34% 내지 약 100%, 약 35% 내지 약 100%, 약 36% 내지 약 100%, 약 37% 내지 약 100%, 약 38% 내지 약 100%, 약 39% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 41% 내지 약 100%, 약 42% 내지 약 100%, 또는 심지어 약 43% 내지 약 100%는 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL일 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은, 예를 들어, 유세포분석에 의해 검출하는 경우에, 4-1BB를 발현하지 않는 MIL의 집단이거나 저수준, 즉, 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL의 발현 수준에 비해 저수준의 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 조성물들 중 임의의 하나를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 이러한 방법은 치료적-유효량의 본원에 기재된 조성물 중 임의의 하나를 대상체에게 투여함을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 방법은 치료적-유효량의 본원에 기재된 바와 같은 MIL, 예를 들어, 활성 MIL를 대상체에게 투여함을 포함한다. 대상체는 암과 같은 신생물을 지닐 수 있다. 예를 들어, 대상체는 다발성 골수종을 지닐 수 있다. 대상체는 인간 대상체일 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션함을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션함을 포함하는 골수 침윤성 림프구 ("MIL")를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체로부터 골수 침윤성 림프구 ("MIL")를 제거하고; 저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션함으로써 활성 MIL를 생성시키고; 대상체에게 활성 MIL를 투여함을 포함할 수 있다.
저산소 환경은 약 21% 미만의 산소, 예컨대, 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 미만, 또는 약 3% 미만의 산소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 저산소 환경은 약 0% 산소 내지 약 20% 산소, 예컨대, 약 0% 산소 내지 약 19% 산소, 약 0% 산소 내지 약 18% 산소, 약 0% 산소 내지 약 17% 산소, 약 0% 산소 내지 약 16% 산소, 약 0% 산소 내지 약 15% 산소, 약 0% 산소 내지 약 14% 산소, 약 0% 산소 내지 약 13% 산소, 약 0% 산소 내지 약 12% 산소, 약 0% 산소 내지 약 11% 산소, 약 0% 산소 내지 약 10% 산소, 약 0% 산소 내지 약 9% 산소, 약 0% 산소 내지 약 8% 산소, 약 0% 산소 내지 약 7% 산소, 약 0% 산소 내지 약 6% 산소, 약 0% 산소 내지 약 5% 산소, 약 0% 산소 내지 약 4% 산소, 또는 약 0% 산소 내지 약 3% 산소를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 저산소 환경은 약 1% 내지 약 7% 산소를 포함한다. 저산소 환경은 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 약 0% 산소를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 저산소 환경은 약 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 산소를 포함한다.
저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은 MIL을 예를 들어 조직 배양 배지에서 적어도 약 1시간, 예컨대, 적어도 약 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 60 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 심지어 적어도 약 14 일 동안 인큐베이션함을 포함한다. 인큐베이션하는 것은 MIL을 약 1 시간 내지 약 30 일, 예컨대, 약 1 일 내지 약 20 일, 약 1 일 내지 약 14 일, 또는 약 1 일 내지 약 12 일 동안 인큐베이션함을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 저산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은 MIL을 저산소 환경에서 약 2 일 내지 약 5 일 동안 인큐베이션함을 포함한다. 이러한 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 14 일 동안 인큐베이션함을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 이러한 방법은 MIL을 저산소 환경에서 약 3 일 동안 인큐베이션함을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이러한 방법은 추가로 예를 들어 MIL을 저산소 환경에서 인큐베이션한 후에 MIL을 정상산소 환경에서 인큐베이션함을 포함한다.
정상산소 환경은 적어도 약 21% 산소를 포함할 수 있다. 정상산소 환경은 약 5% 산소 내지 약 30% 산소, 예컨대, 약 10% 산소 내지 약 30% 산소, 약 15% 산소 내지 약 25% 산소, 약 18% 산소 내지 약 24% 산소, 약 19% 산소 내지 약 23% 산소, 또는 약 20% 산소 내지 약 22% 산소를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 정상산소 환경은 약 21% 산소를 포함한다.
정상산소 환경에서 MIL을 인큐베이션하는 것은 MIL을 예를 들어 조직 배양 배지에서 적어도 약 1 시간, 예컨대, 적어도 약 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 60 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 심지어 적어도 약 14 일 동안 배양함을 포함할 수 있다. 인큐베이션은 MIL을 약 1 시간 내지 약 30 일, 예컨대, 약 1 일 내지 약 20 일, 약 1 일 내지 약 14 일, 약 1 일 내지 약 12 일, 또는 약 2 일 내지 약 12 일 동안 인큐베이션함을 포함할 수 있다.
예시
실시예 1. 저산소 및 정상산소 환경에서 T 세포의 활성화 및 증식
유세포분석을 이용하여 골수 (BM) T 세포 수를 측정하였다. 항-CD3/항-CD28 비드를 소정 비율 (비드:CD3 세포)로 소정 농도의 재조합 인간 사이토카인과 함께 배지에 첨가하였다. 세포를 플레이트, 플라스크, 또는 백에 플레이팅하였다. 저산소 챔버나 세포 배양 백에서 95% 질소와 5% CO2 가스 혼합물과 3분 동안 플러싱(flushing)함으로써 저산소 조건을 달성하였다. 그 후에, 리셉터클(receptacle)에 상기 가스 혼합물을 30초 동안 충전시켰다. 이는 리셉터클에서 2% 또는 그 미만의 O2 가스를 야기하였다. 세포를 37℃에서 3일 이상 동안 배양하고, 저산소 공기를 방출하고 정상산소 (21% 대기 중 산소) 수준과 교체하였다.
실시예 2. 세포 유형의 표현형 측정
세포를 요망되는 측정을 위하여 형광색소 컨쥬게이션(conjugation)된 항체로 염색하였다. CD3, CD4, CD8, CXCR4, 41BB, CD27, CD28, CTLA-4, PD-1, CD45RO, CD62L, CD95, IFNg, IL17, 라이브(live)/데드(dead) 염료, 및/또는 형광색소에 직접 컨쥬게이션된 고려되는 다른 항체를 적절한 동종 대조군과 함께 사용하였다. 요약하면, 1 × 106 또는 그 미만의 세포를 원심분리기에서 방사함으로써 플레이트나 튜브에서 FACS 완충제 (1XHBSS/2%FBS/0.5% EDTA/0.5% NaAzide) 또는 유사한 세척 완충제로 세척하였다. 세척 완충제를 제거하고, 항체 및 동종 대조군을 소정 농도로 첨가하였다. 세포를 실온 또는 4℃에서 7-30분 동안 염색하였다. 세포를 세척 완충제로 2회 세척하고, 최소 세척 완충제에서 재현탁시켰다. 그 후에, 사용되는 형광염색을 위해 적절하게 보충되고 제조된 유세포분석기에서 작용시켰다. 10,000개 이상의 경우의 수를 각각의 샘플에서 채취하였다. 데이터를 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 형광색소 표지된 세포를 백그라운드 제거를 위해 동종 대조군과 비교하였다. 데이터를 %양성 -%백그라운드로서 그래프로 나타냈다.
실시예 3. 배수 증식 측정
골수 세포는 증식의 초반부에 열거되어 있다. CD3+ 세포의 비율을 유세포분석을 사용하여 측정하였다. CD3+ MIL의 총 갯수를 세포의 총 갯수에 CD3의 비율을 곱함으로써 측정하였다 = 배양 중의 CD3+ MIL의 총 갯수. 배양 마지막 날에, 세포를 채취하고 계수하였다(수동으로 그리고 자동 세포 계수기 둘 모두로). CD3+의 비율을 측정하였다. 배양 마지막 날에 CD3+ 세포의 총 갯수를 세포의 총 갯수에 CD+의 비율을 곱함으로써 측정하였다 = 채취된 CD3+ MIL의 총 갯수. 총 배수 증식 = 배양 마지막 날에 채취된 CD3+ MIL의 총 갯수를 배양 첫날에 CD3+ MIL의 총 갯수로 나눔.
실시예 4. 종양 특이성
MIL을 CFSE 또는 유사한 세포막 집적화 염료로 제조업체의 프로토콜에 따라 라벨링하였다. 자가 BM은 단독의 배지나 음성 대조군(독립된 단백질 또는 용해물)으로 또는 고려되는 단백질 또는 용해물로 펄스화시켰다. CFSE 라벨링된 세포를 이후 펄스화된 자가 BM과 2-7일 동안 함께 배양하였다. 조직 배양 플레이트 또는 플라스크로부터 세포를 채취한 후, CD3로 IFNg와 함께 세포외 및 세포내로 염색하였다. CFSE이 낮고(분리된 세포) IFNg을 생성시키는 CD3+ 세포에 대하여 게이팅함으로써 종양 특이성의 분석을 검사하였다.
실시예 5. 저산소 및 정상산소 환경에서 T 세포의 활성화 및 증식
IL-2의 존재 또는 부재하에 2% O2 (저산소)에서 3일 동안 이어서 21% O2 (정상산소)에서 추가 5일 동안으로의 전환으로 MIL을 성장시켰다. 도 9에 나타나 있는 바와 같이, 저산소 이어서 정상산소에서의 성장은 오로지 정상산소 조건에서 성장된 MIL에 비해 거의 10배로 증식을 증가시켰다. 종양 특이성이 또한 도 4에 나타나 있는 바와 같이 두드러지게 향상되었다. 10일째에, 저산소 조건에서 성장된 MIL에 대하여 25.1%와 대조적으로, CFSE-저 세포의 4%가 정상산소 조건에서 종양 특이적이었다. 종합하면, 이러한 데이터는 이러한 성장 조건이 활성화시에 종양 특이적인 절대 갯수를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
앞 단락에서의 실험을 작은 샘플에 대하여 수행하였다. 첫 번째 임상 연구에서 환자로부터의 MIL 생성물을 또한 이 방법을 이용하여 증식시켰다. 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 이러한 조건에서 MIL의 증식은 T 세포 수를 현저히 증가시켰다. 정상산소 조건에서의 성장은 7일 후 MIL을 거의 증식시킬 수 없었다. 실험에서 7일째 배수 증식은 저산소 조건에서 119배와 대조적으로 정상산소 조건에서는 36.3배였다. 게다가, 세포는 12일째까지 계속 증가되다가, 사멸되기 시작하기 전 11일째에 총 220배 증식에 도달되었다.
4-1BB의 발현은 다수의 이러한 특성의 중요한 조절자인 것으로 밝혀졌다. 이는 T 세포 증식을 조절하고, 세포자멸을 감소시키고, CD8 세포의 세포상해 활성을 증가시키고, 생존을 향상시킬 수 있다. 게다가, HIF1α는 항원-유래 T 세포의 생존을 조절한다. 4-1BB를 발현하는 벡터를 지니는 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor: CAR) 변형 T 세포는 유의한 생체내 증식을 나타냈다. 종합하면, 활성 MIL에 대한 4-1BB 발현은 고조된 생존 및 종양 특이성의 중요한 조절자일 수 있다. 본원에 개시된 방법의 한 가지 뚜렷한 이점은 4-1BB 향상된 발현을 달성하기 위해서 MIL을 변형시킬 필요가 없다는 것이다. 이러한 이점은 MIL 또는 PBL이 정상산소나 저산소 조건에서 성장된 도 10에 나타나 있다. 4-1BB의 기준선 발현을 MIL에서 평가하고, PBL와 비교하였다. 나타나 있는 바와 같이, 4-1BB 발현은 PBL보다 MIL에서 많았다(18.2% 대 8.1%). 흥미롭게도, 정상산소에서의 T 세포 발현은 둘 모두의 집단에서 이의 발현이 감소되었고(MIL 10.7%, PBL 2.8%), 반면에 저산소에서의 증식은 MIL에서 4-1BB 발현을 유의하게 증가시키고(43.4%), PBL에서는 이의 발현이 완전히 없었다(0%). 이러한 데이터는 다시, 4-1BB 상향 조절이 단순한 저산소 성장 조건보다 더 많은 양으로 좌우되기 때문에 PBL과 MIL 사이의 유의한 차이가 또한 입증되었음을 강조한다. 더 중요하게는, 4-1BB의 예기치 않은 상향조절은 본 발명의 방법이 저산소로 성장된 MIL을 사용한 환자의 치료에서 유의한 차이를 야기하는 것으로 입증되었다. 유사한 결과가 CD8 세포로 관찰되었다(도 8).
도 11은 임상 치료에 대한 투여량의 결과를 나타낸 것이다. J0770에서, MIL은 정상산소 조건에서 정치 배양(static culture)으로 성장되었다. J0997에서, MIL은 정상산소 조건에서 웨이브(WAVE)로 성장되었다. J1343에서, MIL은 저산소 조건 이어서 정상산소 조건에서 3일 동안 성장되었다. 도 6에서, 절대 림프구 계수는 자가 줄기 세포 이식 후 3회의 시험에 대하여 그래프로 나타나 있다. J1343는 환자에게 저산소 MIL을 제공하거나 이식 후 MIL을 주입하지 않은 무작위 시험이다.
도 11에 나타나 있는 바와 같이, 본 방법의 성장 조건은 총 T 세포 증식을 평균적으로 7.9E9에서 1.8E10로 증가시켰다. 게다가, 이는, 환자의 치료에서 방법의 효능과 직접적으로 관련된, 도 6에 나타나 있는 바와 같은 첫 번째 기간 동안 생체내 T 세포 발현을 나타낸 것이다. 환자의 첫 번째 구성에 대한 60일에 걸친 전체 림프구 계수가 그래프로 도시되어 있다.
등가물
당업자는 단지 전형적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수 등가물을 알거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (38)

  1. 골수 침윤성 림프구(marrow infiltrating lymphocyte: "MIL")를 포함하는 조성물로서,
    조성물이 CD3를 발현하는 MIL의 집단을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 40% 이상이 CD3를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL인 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    조성물이 인터페론 감마 (interferon gamma: "IFNγ")를 발현하는 MIL의 집단을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 2% 이상이 IFNγ를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    CD3를 발현하는 MIL의 집단이 인터페론 감마 ("IFNγ")를 발현하는 복수의 MIL을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 2% 이상이 IFNγ를 발현하는 복수의 MIL의 집단으로부터의 MIL인 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 98% 이상이 CXCR4를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL인 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 CD4를 발현하는 MIL의 집단을 포함하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    CD4를 발현하는 MIL의 집단이 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 98% 이상이 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL인 조성물.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
    CD4를 발현하는 MIL의 집단이 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 21% 이상이 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL인 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 CD8을 발현하는 MIL의 집단을 포함하는 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    CD8을 발현하는 MIL의 집단이 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 98% 이상이 CXCR4를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL인 조성물.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서,
    CD8을 발현하는 MIL의 집단이 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 21% 이상이 4-1BB를 발현하는 복수의 MIL로부터의 MIL인 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 6항, 제 8항, 및 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단을 포함하고;
    조성물 중의 세포의 약 21% 이상이 4-1BB를 발현하는 MIL의 집단으로부터의 MIL인 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로서, 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션(incubation)함을 포함하는 방법.
  13. 골수 침윤성 림프구 ("MIL")를 활성화시키는 방법으로서, 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션함을 포함하는 방법.
  14. 대상체의 암을 치료하는 방법으로서,
    대상체로부터 골수 침윤성 림프구 ("MIL")를 제거하고;
    21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션함으로써 활성 MIL를 생성시키고;
    활성 MIL을 대상체에 투여함을 포함하는 방법.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1% 산소 내지 약 7% 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션함을 포함하는 방법.
  16. 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, MIL이 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 약 24 시간 이상 동안 인큐베이션되는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, MIL이 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 약 1 일 내지 약 20 일 동안 인큐베이션되는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, MIL이 21% 미만의 산소를 포함하는 환경에서 약 3 일 내지 약 14 일 동안 인큐베이션되는 방법.
  19. 제 12항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 21% 산소를 포함하는 환경에서 MIL을 인큐베이션함을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, MIL이 약 21% 산소를 포함하는 환경에서 약 4 일 동안 인큐베이션되는 방법.
  21. 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는 방법.
  22. 골수 침윤성 림프구 (MIL)를 제조하는 방법으로서,
    저산소 조건하에 첫 번째 기간 동안 시험관내에서 MIL을 성장시키고;
    저산소 성장 후 정상산소 조건하에 두 번째 기간 동안 MIL을 성장시킴을 포함하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 저산소 조건이 21% 미만의 산소인 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 저산소 조건이 약 1% 산소 내지 약 7% 산소인 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 저산소 조건이 약 1% 내지 약 3% 산소인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 저산소 조건이 약 2% 산소인 방법.
  27. 제 22항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 기간이 약 1 일 내지 약 20 일인 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 첫 번째 기간이 약 3 일 내지 약 14 일인 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 첫 번째 기간이 약 3 일인 방법.
  30. 제 22항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 정상산소 조건이 약 21% 산소인 방법.
  31. 제 22항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두 번째 기간이 약 3 내지 약 7 일인 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 두 번째 기간이 약 4 일인 방법.
  33. 제 22항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 기간 및 두 번째 기간이 약 3 일 내지 약 24 일인 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 첫 번째 기간 및 두 번째 기간이 약 3 일 내지 약 10 일인 방법.
  35. 제 22항 내지 제 34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 MIL을 포함하는, 골수 침윤성 림프구 (MIL) 제형.
  36. 시험관내 저산소 조건하에 성장되는 치료적으로 효과적인 골수 침윤성 림프구 (MIL) 제형.
  37. 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 제 35항 또는 제 36항의 제형을 환자에게 투여함을 포함하는 방법.
  38. 환자의 암을 치료하는 방법으로서,
    환자로부터 골수 침윤성 림프구 (MIL)를 제거하고;
    저산소 조건하에 MIL을 성장시키고;
    정상산소 조건하에 MIL을 성장시키고;
    MIL을 환자에게 투여함을 포함하는 방법.
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