ES2832608T3 - Método de expansión de linfocitos citolíticos naturales - Google Patents
Método de expansión de linfocitos citolíticos naturales Download PDFInfo
- Publication number
- ES2832608T3 ES2832608T3 ES16758177T ES16758177T ES2832608T3 ES 2832608 T3 ES2832608 T3 ES 2832608T3 ES 16758177 T ES16758177 T ES 16758177T ES 16758177 T ES16758177 T ES 16758177T ES 2832608 T3 ES2832608 T3 ES 2832608T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- cell
- expansion
- medium
- cell culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 102
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims abstract description 378
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 196
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 64
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 58
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 38
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 34
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 34
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 13
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 45
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 35
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 9
- QCAWEPFNJXQPAN-UHFFFAOYSA-N methoxyfenozide Chemical compound COC1=CC=CC(C(=O)NN(C(=O)C=2C=C(C)C=C(C)C=2)C(C)(C)C)=C1C QCAWEPFNJXQPAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 102000027581 NK cell receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000738335 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- -1 ICOS Proteins 0.000 description 1
- 101150083678 IL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100037906 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 241000566576 Tyto Species 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 101150059062 apln gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001754 blood buffy coat Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 101150028528 sop-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/1107—B cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Un método para cultivar y expandir in vitro linfocitos citolíticos naturales (NK) en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK, el método comprende a) agregar una concentración efectiva de interleucina-21 (IL-21) al inicio del proceso de cultivo a dicho medio b) agregar repetidamente una concentración efectiva de interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-(IL-15) a dicho medio c) agregar repetidamente células alimentadoras o partículas de membrana de las mismas a dicho medio, en el que dichas células alimentadoras son derivadas de células B que están inmortalizadas con EBV; y en el que dicha expansión de células NK en dicho medio de cultivo celular se mantiene durante al menos 3 semanas.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de expansión de linfocitos citolíticos naturales
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la multiplicación eficiente de las cifras de linfocitos citolíticos naturales (“célula NK”) en cultivo exvivo y, más particularmente, pero no exclusivamente mediante el tratamiento de las células con células alimentadoras y citoquinas.
Antecedentes de la invención
Los linfocitos citolíticos naturales (en los sucesivo también abreviadas como “células NK”) son una población única de linfocitos que es capaz de detectar y destruir células infectadas por virus y células degeneradas malignamente, también conocidas como células tumorales. Además, las células NK producen y secretan citocinas al entrar en contacto con las células tumorales. Esta característica funcional hace que las células NK sean un fármaco atractivo para el tratamiento del cáncer. Los ensayos clínicos han enfatizado el potencial del uso clínico de las células NK (Miller 2005, Rubnitz 2010, Miller 2013, Childs, Berg 2013).
El uso de células NK del donante para pacientes (“uso alogénico”) requiere métodos de separación de células para separar los efectos deseados de las células NK de los efectos contraindicadores no deseados de las células no NK, por ejemplo, las células T. Esos métodos están bien establecidos (Leung 2014) y pueden automatizarse dentro de sistemas cerrados y estériles (Apel 2013).
La dosis de células NK máxima que se puede obtener desde la cosecha de leucoféresis de un donante se limita a alrededor de 2 x 108 células NK purificadas. Los efectos beneficiosos de las infusiones de células NK en los pacientes dependen de la dosis y se espera un resultado clínico superior de los pacientes que reciben un mayor número de células NK. El número de células diana son 2 x 109 a 1 x 1011 células NK para maximizar los efectos beneficiosos de la infusión de células NK.
Receptores de antígenos quiméricos (en adelante, también abreviado como “CAR”) pueden dirigir a las células inmunitarias efectoras citotóxicas a las células tumorales. Los ensayos clínicos se realizan para evaluar las células CAR T derivadas del paciente (“autólogas”) en cuanto a seguridad y eficacia clínicas. La modificación de las células NK en lugar de las células T CAR permite el uso de células efectoras inmunitarias derivadas de donantes sanos (“alogénicas”) (Glienke 2015). El uso de células primarias de un paciente o donante permite la fabricación de una dosis de células clínicas para un solo paciente. La fabricación de productos celulares para múltiples pacientes requiere el uso de células que puedan proliferar sin limitación, por ejemplo, estirpes celulares derivadas de tumores. Las estirpes de células NK modificadas con CAR se utilizan en protocolos clínicos (NK-92, Klingemann, 2014). El uso de estirpes celulares para el tratamiento de pacientes requiere detener el crecimiento mediante irradiación para evitar el crecimiento continuo de la línea celular después de la transferencia al paciente. Esto también reduce la supervivencia y la funcionalidad de las células efectoras. Además, las estirpes celulares tienen un fenotipo y una función homogéneos, y no proporcionan una amplia reactividad contra las células tumorales como lo hacen las células efectoras inmunitarias primarias.
Varios protocolos se han descrito para inducir la proliferación de células NK in vitro para aumentar el número de células NK, en adelante también descritos como “la expansión de células NK” en otras fuentes también descrito como “multiplicación de células NK”.
Las células NK pueden expandirse in vitro cultivando con combinaciones de citocinas, complementando los medios de cultivo celular con moléculas pequeñas (por ejemplo, nicotinamida) y mediante combinaciones de citocinas, anticuerpos y células alimentadoras. Los cultivos de células NK basados en citocinas dan como resultado solo un aumento menor en el número de células que no son suficientes para fabricar productos de células NK para múltiples pacientes o de pequeñas subpoblaciones de células NK. Las células NK dejan de crecer en estos protocolos después de 3 semanas, un cultivo prolongado no da como resultado un mayor número de células NK. Los protocolos de expansión de células NK basados en células de alimentación generan números de células NK más altos. Los protocolos eficaces requieren el uso de células alimentadoras modificadas genéticamente (K562) o estirpes de células B inmortalizadas naturalmente por infección con el virus de Epstein-Barr. Las células NK expandidas en cocultivo con células K562 modificadas genéticamente (IL-15 unida a la membrana) se volvieron senescentes a las 4 semanas, el uso de células K562 diseñadas genéticamente para expresar IL-21 unida a la membrana continuó expandiéndose durante hasta 6 semanas. Las células B pueden inmortalizarse mediante la infección natural de las células B con el virus de Epstein-Barr. Estos EBVLCL se pueden usar para expandir de manera eficiente las células NK sin una modificación genética adicional de las células alimentadoras (Childs, Berg 2013, Denman 2012).
Los cultivos a largo plazo de las células NK co-cultivada con EBV-LCL sólo podía mantener un crecimiento continuo de hasta 6 meses en un pequeño subconjunto de células NK (Hercend, 1982), no mantienen la heterogeneidad inicial en el fenotipo y la función de la población de células NK de partida y proporcionando sólo un número limitado de células NK.
Por lo tanto, hay una necesidad de un método in vitro mejorado para la expansión de células NK que permite expandir las células NK a números muy altos, preferentemente a los números que son suficientes para servir a los ensayos clínicos para la aplicación clínica de las células NK expandido en los pacientes.
Resumen de la invención
Sorprendentemente, se encontró que las células NK se pueden expandir (proliferación) en sistemas de cultivo celular a números muy altos dentro de semanas de cultivo, por ejemplo, a una expansión multiplicadora de 1 x 1011 células NK en 7 semanas con una concentración de partida estándar de células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de 2.5 x 104 células NK/ml o 5.25 x 105 células totales/ml (que incluyen células alimentadoras). Las cantidades de células obtenidas por dicha expansión multiplicadora de 1 x 1011 células n K son suficientes para aplicaciones clínicas, tales como la terapia celular, por ejemplo, la inmunoterapia adoptiva, para la leucemia y otros cánceres. Inesperadamente, la adición de una concentración efectiva de interleucina-21 (IL-21) a un medio de cultivo celular adecuado para expandir las células NK al comienzo del proceso de cultivo de las células NK en combinación con la presencia de células alimentadoras que son células B derivadas y transformadas con EBV, como las estirpes celulares linfoblastoides transformadas con el virus de Epstein-Barr (EBV-LCL) y la adición repetida de células alimentadoras frescas que son derivadas de células B y transformadas con EBV, como EBV-LCL, durante todo el cultivo de células NK , dan como resultado un número muy elevado de células NK expandidas. Preferentemente se agregan células alimentadoras frescas para el medio una vez cada 5° al 16° día después de la adición anterior de dichas células alimentadoras, más preferentemente una vez cada 6° al 14° día después de la adición anterior de dichas células alimentadoras, más preferentemente cada 13° día después de la adición anterior de dichas células alimentadoras. Una adición repetida de IL-21 en momentos posteriores del proceso de cultivo o incluso la presencia permanente de IL-21 en dicho medio de cultivo celular es contraproducente para el proceso de expansión de las células NK.
Es sorprendente que en las condiciones divulgadas en este documento la expansión de las células NK se pueden proceder durante muchas semanas sin pérdida de aumento del número de células NK (existe una correlación del número de células NK durante la duración del tiempo). La duración de la expansión puede continuarse (mantenerse) durante, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30 o más semanas.
La concentración de partida de las células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK puede estar entre 1 célula/ml y 2 x 107 células/ml, preferentemente entre 20 células/ml y 2 x 107 células/ml. Más sorprendentemente, se encontró que el método divulgado en este documento da como resultado una expansión especialmente alta de células NK cuando la concentración inicial de células NK/ml en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK está entre 1 célula/ml y 2.5 x 104 células/ml, preferentemente entre 20 células/ml y 2.5 x 104 células/ml, es decir, la concentración inicial de células NK es menor que la concentración inicial estándar de células NK, que normalmente es superior a 7 x 104 células NK por ml en protocolos de expansión celular NK común. Esto es inesperado ya que generalmente se requiere una densidad celular crítica para permitir la expansión in vitro de las células NK porque las interacciones NK-a-NK aseguran la supervivencia, activación y proliferación de células NK (Kim 2014).
El proceso para la expansión de las células NK como se divulga en el presente documento se pueden implementar plenamente como un proceso automatizado, preferentemente en un sistema cerrado bajo condiciones GMP.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Impacto de la concentración de partida de células NK en la expansión de células NK en presencia de EBV-LCL
Figura 2: expansión mediada por alimentador celular de células NK en diferentes concentraciones IL-2 dependiendo de la proporción alimentador- a-células NK: Se muestra que la expansión de células NK en cocultivo con EBV-LCL se logró a diferentes concentraciones de IL-2. Además, mayores proporciones de EBV-LCL a células NK dieron como resultado una mayor expansión de células NK que prueba la inducción de la expansión de células NK por EBV-LCL de una manera dependiente de la dosis.
Figura 3: Efecto de diferentes combinaciones de citocinas sobre la expansión de células NK mediada por células alimentadoras: se muestra que IL-2 y/o IL-15 podrían aplicarse para expandir células NK en cocultivo con EBV-LCL. Además, la expansión de células NK mediada por EBV-LCL podría aumentarse significativamente mediante el uso adicional de IL-21.
Figura 4: Expansión de células NK mediada por células alimentadoras a diferentes concentraciones de IL-21: La expansión de células NK mediada por EBV-LCL podría incrementarse por IL-21 de una manera dependiente de la dosis.
Figura 5: Efecto de la adición de IL-21 permanente frente a corto plazo sobre la expansión de células NK en presencia de células alimentadoras derivadas de células B: para aumentar la expansión de células NK mediante el uso de IL-21, fue suficiente agregar IL-21 solo al comienzo del proceso de cultivo. Sorprendentemente, la adición permanente de IL-21 incluso contrarrestó, ya que condujo a una expansión inhibida de las células NK a largo plazo.
Figura 6: Expansión constante de células NK a largo plazo mediante la adición de IL-21 el día 0 y estimulación repetida con células alimentadoras derivadas de células b: fue posible mantener una expansión constante de células NK a un nivel muy alto durante mucho tiempo agregando IL 21 solo al comienzo del cultivo en combinación con la estimulación repetida de las células NK con células alimentadoras derivadas de células B.
Figura 7: Expansión de células NK dentro de un sistema cerrado usando un dispositivo para procesamiento celular automatizado: La producción eficiente de células NK podría realizarse dentro de un sistema cerrado y automatizado para procesamiento celular mediante la aplicación del método optimizado para la expansión de células n K, que se caracteriza por agregar IL-21 solo al comienzo del cultivo y estimulación de las células NK con células alimentadoras derivadas de células B.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto la presente invención proporciona un método para, cultivar in-vitro y expandir linfocitos citolíticos naturales (NK) en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK, el método comprende
a) agregar una concentración efectiva de interleucina-21 (IL-21) al inicio del proceso de cultivo a dicho medio
b) agregar repetidamente una concentración efectiva de interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15) a dicho medio
c) agregar repetidamente células alimentadoras o partículas de membrana de las mismas a dicho medio, en el que dichas células alimentadoras son derivadas de células B que están inmortalizadas con EBV; y
en el que dicha expansión de células NK en dicho medio de cultivo celular se mantiene durante al menos 3 semanas.
La adición de una concentración eficaz de IL-21 en el comienzo del proceso de cultivo tiene el efecto de que una larga duración de la expansión de las células NK es posible que resulte en números de células NK extremadamente altos. En contraste con esto, una adición repetida de IL-21 en puntos de tiempo posteriores o incluso la presencia permanente de IL-21 en el medio de cultivo celular durante el proceso de cultivo da como resultado una reducción de la velocidad de expansión (ver ejemplo 5 y Figura 5).
A largo plazo la expansión de células NK como se divulga en el presente documento se basa en el efecto sorprendente de que la adición de dicho IL-21 en el comienzo del proceso de cultivo y el uso de células B derivadas, células alimentadoras inmortalizado EBV tales como SMI-EBV-LCL que se agregan repetidamente a dicho medio dan como resultado tasas de expansión muy altas. Se requiere la adición repetida de las células alimentadoras ya que las células alimentadoras desaparecen rápidamente ya que se inactiva el crecimiento, por ejemplo, por irradiación. En lugar de las células de alimentación, también se pueden usar partículas de membrana de las mismas.
Il-2 y/o IL-15 son conocidos citocinas que estimulan la expansión de células NK en un cultivo celular. Deben estar presentes en el medio, pero pueden ser reemplazados por otras citocinas o factores de crecimiento que sean capaces de estimular las células NK en un cultivo celular in vitro hasta un nivel de expansión básico (por ejemplo, expansión de 10 a 50 veces en dos semanas). La adición de IL-21 y la presencia de células alimentadoras derivadas de células B en un medio de cultivo celular que de otro modo serían capaces de expandir las células NK a un nivel básico solo son principalmente relevantes para el efecto de la expansión de células NK a largo plazo como se divulga en este documento. Por tanto, el proceso divulgado en el presente documento debería funcionar también con otros estimulantes distintos de IL-2 y/o IL-15 para la expansión de células NK que son responsables de la expansión básica de células NK.
En una realización de la invención, la concentración eficaz de IL-21 en dicho medio de cultivo celular puede ser de entre 0.1 y 1,000 ng/ml, preferentemente entre 1 y 200 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 100 ng/ml.
En una realización de la invención, dicha IL-21 es IL-21 soluble o IL-21 unida a sustrato.
En una realización de la invención, la concentración eficaz de IL-2 en dicho medio de cultivo de células puede ser de entre 1 U/ml y 5000 U/ml, preferentemente entre 10 U/ml y 1000 U/ml, más preferentemente entre 50 y 500 U/ml.
En otra realización de la invención, la concentración eficaz de IL-15 en dicho medio de cultivo celular puede ser de entre 0.1 y 1,000 ng/ml, preferentemente entre 1 y 200 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 100 ng/ml.
En una realización adicional de la invención dicha IL-2 e IL-15 se agregan tanto a dicho medio de cultivo celular en dichas concentraciones eficaces.
En una realización de la invención, dicha adición de células alimentadoras repetidamente a dicho medio se puede realizar entre el día 5 y el día 16 después de la adición de células alimentadoras anteriores, preferentemente entre el día 6 y el día 14, más preferiblemente cada 13° días del cultivo proceso. La concentración de células alimentadoras puede estar entre 1 x 104/ml y 1 x 107/ml.
Preferiblemente, la proporción de células NK a dichas células alimentadoras está entre 1:100 y 1:1, más preferentemente entre 1:30 y 1:10, más preferentemente 1:20.
En una realización de la invención dicha expansión de las células NK en dicho medio de cultivo celular se puede mantener durante al menos 5 semanas, preferentemente durante al menos 7 semanas.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK purificadas. Las células NK se pueden purificar a partir de una muestra que comprende células NK y otras células, como, por ejemplo, PMBC o sangre entera, mediante métodos de separación magnética de células como MACS® (Miltenyi Biotec) o métodos de citometría de flujo como FACS ™. Estos y otros métodos para la purificación de células, por ejemplo, células NK, son bien conocidos en la técnica.
En una realización de la invención, la concentración de partida de dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK puede ser de entre 20 células/ml y 2 x 107 células/ml.
En una realización de la invención, la concentración de partida de dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser entre 20 células/ml y 2.5 x 104 células/ml.
En una realización de la invención, dichas células alimentadoras pueden ser células no modificadas genéticamente con excepción de la introducción del genoma del EBV como resultado de la inmortalización de dichas células alimentadoras.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser modificados genéticamente. Dichas células NK modificadas genéticamente pueden expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En una realización de la invención en dicho método se realiza en un proceso automatizado. Dicho proceso puede realizarse en un sistema cerrado.
En un aspecto adicional la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una población de células NK producidas de acuerdo con el método divulgado en el presente documento.
Dicha composición puede ser homogénea con respecto fenotipo y la función. El fenotipo y las características funcionales deseados pueden seleccionarse de la población de partida heterogénea mediante métodos de preselección o clonación.
En general, las células NK expandidas obtenidas con el método de la presente invención se pueden usar en aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas posteriores.
Las poblaciones de células diana, como las poblaciones de células NK obtenidas mediante la presente divulgación, pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes como IL-2 u otras citoquinas o poblaciones de células. Brevemente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender una población de células diana como se describe en este documento, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Una composición farmacéutica puede comprender
a) una población de células NK, en la que dichas células NK proliferan hasta cantidades terapéuticamente eficaces de acuerdo con la presente invención; y b) uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Las composiciones de la presente divulgación se formulan preferiblemente para administración intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar en una apropiada forma de la enfermedad a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administración vendrán determinadas por factores tales como la afección del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis apropiadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término “linfocitos citolíticos naturales (células NK)” se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen la tercera clase de células diferenciadas a partir del progenitor linfoide común generador de linfocitos B y T. Se sabe que las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo, las amígdalas y el timo, donde luego ingresan a la circulación. Las células NK se diferencian de los linfocitos T citotóxicos naturales (NKT) fenotípicamente, por su origen y por sus respectivas funciones efectoras; con frecuencia, la actividad de las células NKT promueve la actividad de las células NK al secretar IFNy. A diferencia de las células NKT, las células NK no expresan
receptores de antígenos de células T (TCR) o marcadores pan T CD3 o receptores de células B de inmunoglobulinas (Ig) de superficie, pero generalmente expresan los marcadores de superficie CD16 (FcyRIII) y CD56 en humanos. NK1.1 o NK1.2 en ratones C57BL/6. Hasta el 80 % de las células NK humanas también expresan CD8.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “cultivo” incluye proporcionar las condiciones químicas y físicas (por ejemplo, temperatura, gas) que se requieren para el mantenimiento de células NK, y factores de crecimiento. A menudo, cultivar las células NK incluye proporcionar a las células NK condiciones para la expansión (proliferación). Ejemplos de condiciones químicas que pueden favorecer la expansión de células NK incluyen, pero no se limitan a tampones, suero, nutrientes, vitaminas, antibióticos, citocinas y otros factores de crecimiento que se proporcionan regularmente en (o pueden administrarse manualmente) el medio de cultivo celular adecuado para Expansión de células NK. En una realización, el medio de cultivo de células NK incluye TexMACS Research Medium (Miltenyi Biotec GmbH) suplementado con 5 % de suero humano tipo AB (Life Technologies) y 500 U/ml de IL-2 (Proleukin S, Novartis). En otra realización, el medio de cultivo de células NK incluye medio de crecimiento de células madre SCGM (Cell Genix) complementado con suero humano tipo AB al 5 % (Life Technologies) y 500 U/ml de IL-2 (Proleukin S, Novartis). Otros medios adecuados para su uso para expandir células NK son bien conocidos en la técnica.
El término “medio de cultivo celular” como se usa en este documento incluye líquidos que proporcionan las condiciones químicas que se requieren para el mantenimiento de células NK. Ejemplos de condiciones químicas que pueden favorecer la expansión de las células NK incluyen, entre otras, soluciones, tampones, suero, componentes del suero, nutrientes, vitaminas, citocinas y otros factores de crecimiento que se proporcionan regularmente en (o se pueden administrar manualmente) al medio de cultivo celular. Los medios adecuados para su uso para cultivar células NK como se conoce en la técnica incluyen TexMACS (Miltenyi), CellGro SCGM (CellGenix), X-Vivo 10, X-Vivo 15, BINKIT NK Cell Initial Medium (Cosmo Bio USA), AIM-V (Invitrogen), DMEM/F12, medio de cultivo celular NK (tecnologías upcyte).
El término “concentración efectiva de IL-21” como se usa en el presente documento se define como esa concentración final de IL-21 o derivados de los mismos en el medio de cultivo celular que, cuando se proporciona a la población de células NK en el cultivo de células, preferentemente en el día 0 del proceso de cultivo, da como resultado una mayor expansión de las células NK, en comparación con las células NK cultivadas en condiciones idénticas pero sin la provisión de IL-21 a la población de células NK. Las concentraciones de IL-21 adecuadas para su uso en algunas realizaciones de la presente invención están típicamente en el intervalo entre 0.1 y 1,000 ng/ml, preferentemente entre 1 y 200 ng/ml, preferentemente entre 10 y 100 ng/ml. Los ejemplos siguientes demuestran concentraciones eficaces ejemplares de IL-21. Preferiblemente, la IL-21 es soluble o está unida al sustrato. Sería desfavorable si la IL-21 está unida a la membrana en las células alimentadoras (por ejemplo, en las células alimentadoras modificadas genéticamente que expresan IL-21 en la superficie celular) ya que ambos componentes, la IL-21 y las células alimentadoras no se podrían agregar por separado al cultivo celular que es un requisito previo para la realización del proceso de expansión como se describe en este documento.
Los términos “IL-2” y “ IL-15” como se usa en el presente documento se refiere a citocinas interleucina-2 y la interleucina-15 y sus derivados, por ejemplo, IL-2 superkine, la proteína IL-2 toxina de difteria de fusión o de sushi de IL-15Ra.
El término IL2 y/o IL15 se refiere en general a miembros de la familia paquete 4a-hélice de citocinas que se unen a los receptores heterotriméricos para IL2 e IL15 que comparten la cadena gamma común y IL2/IL15RP (también conocido como aRIL2p, CD122).
El término “agregando repetidamente una concentración eficaz de IL-2 y/o IL-15”, como se usa aquí se refiere a las concentraciones de IL-2 en dicho medio de cultivo celular entre 1 U/ml y 5000 U/ml, preferentemente entre 10 U/ml y 1000 U/ml, más preferentemente entre 50 y 500 U/ml, y/o se refiere a concentraciones de IL-15 en dicho medio de cultivo celular entre 0.1 y 1,000 ng/ml, preferentemente entre 1 y 200 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 100 ng/ml. Los ejemplos siguientes demuestran concentraciones eficaces ejemplares de IL-2 y/o IL-15. Normalmente, la concentración de IL-2 y/o IL-15 disminuye con el tiempo durante el proceso de cultivo, por lo tanto, IL-2 y/o IL-15 se agregan repetidamente al medio de cultivo celular para mantener los niveles de citocina(s). a la concentración o concentraciones efectivas. Regularmente, IL-2 y/o IL-15 se agregan nuevamente al cultivo celular mediante un cambio de medio de cultivo celular. En este contexto, “repetidamente” significa al menos una repetición dentro de todo el proceso de cultivo. No es necesario agregar IL-2 y/o IL-15 al comienzo del proceso de cultivo, sino al menos en el primer cambio de medio, es decir, después de 7 días. Pero, no obstante, la adición de IL2 y/o IL-15 al comienzo del proceso de cultivo es ventajosa.
Tal como se utiliza aquí, el término “expansión” o “proliferación” se refiere a crecimiento celular y la multiplicación del número de células. La expansión o proliferación, como se usa en el presente documento, se refiere a un mayor número de células NK que se producen durante el proceso de cultivo como, por ejemplo, se divulga en el presente documento.
Los términos “proceso de cultivo” o “cultivo” tal como se usa en el presente documento se refiere al cultivo y la expansión de las células NK como se divulga en el presente documento, en el que el día de partida (punto de partida) del proceso de cultivo, es decir, la expansión de células NK, es definido como día 0. El proceso de cultivo puede durar todo el tiempo que desee el operador y puede realizarse siempre que el medio de cultivo celular tenga condiciones que permitan que las células sobrevivan y/o crezcan y/o proliferen.
El término “principio del proceso de cultivo” tal como se utiliza aquí se refiere al comienzo del proceso de expansión mediante la adición de factores de crecimiento tales como IL-2 y/o IL-15 al medio de cultivo celular, es decir, las células comienzan a iniciar su proceso de proliferación. La fase de inicio del proceso de cultivo comprende los primeros tres días desde la exposición de las células NK a dichos factores de crecimiento. Dentro de este período de tiempo, es decir, dentro de los primeros tres días, es ventajoso agregar la concentración eficaz de IL-21 a dicho medio. Los puntos de tiempo posteriores para la adición de IL-21 a dicho medio no tienen el efecto beneficioso en comparación con la adición en los puntos de tiempo anteriores. Por tanto, la adición de una concentración efectiva de interleucina-21 (IL-21) al inicio del proceso de cultivo a dicho medio significa que dicha IL-21 se añade dentro de los primeros tres días del proceso de cultivo, preferentemente en el día 0 del proceso de cultivo.
Preferiblemente, la concentración eficaz de IL-21 se añade una vez al medio de cultivo celular únicamente. Alternativamente, la concentración efectiva de IL-21 se agrega repetidamente, por ejemplo, dos veces o más frecuentemente, a dicho medio de cultivo celular pero dentro de los primeros tres días del proceso de cultivo (“al comienzo”). Dicha adición dos veces o más frecuentemente de IL-21 al medio también puede organizarse de tal manera que la concentración efectiva de IL-21 en el medio de cultivo celular alcance la concentración efectiva no antes de la suma de dichas diversas adiciones. Como se mencionó anteriormente, una adición de IL-21 a dicho medio de cultivo celular más tarde que en la fase inicial del proceso de cultivo es contraproducente para el resultado de la expansión multiplicadora de 1 x 1011 células NK obtenible en 7 semanas por el método de la presente invención. Especialmente contraproducente es la presencia permanente de IL-21 en el medio de cultivo celular durante el proceso de cultivo.
El término “células alimentadoras” se refiere a células que se agregan a un cultivo de células diana (es decir, en este documento los linfocitos citolíticos naturales) para apoyar su supervivencia y/o crecimiento. Las células alimentadoras proporcionan una matriz extracelular intacta y funcional y factores asociados a la matriz y secretan citocinas conocidas y desconocidas en el medio acondicionado. Las células alimentadoras suelen detener el crecimiento para evitar su proliferación en el cultivo, pero se mantiene su supervivencia. La detención del crecimiento se puede lograr mediante la irradiación con una dosis eficaz o el tratamiento con una dosis eficaz de productos químicos como la mitomicina C. Hay varios tipos de células alimentadoras, incluidas las Células Mononucleares de Sangre Periférica irradiadas (en lo sucesivo también abreviadas como “PBMC”), PBMC agotadas de Células NK, estirpes de células cancerosas, estirpes de células cancerosas manipuladas genéticamente y linfocitos inmortalizados por infección natural con el virus de Epstein-Barr (en lo sucesivo también abreviado como “EBV”).
El término “partículas de membrana de células alimentadoras” tal como se utiliza aquí se refiere a preparaciones de membrana de las células alimentadoras que contienen la célula NK estimulante de moléculas de la superficie de las células alimentadoras. Se pueden utilizar partículas de membrana de las células alimentadoras para evitar posibles desventajas de las células alimentadoras vivas. Las partículas de la membrana de las células alimentadoras se pueden producir mediante lisis y rotura de las células usando cavitación con nitrógeno seguido del aislamiento y purificación de la fracción de la membrana celular mediante centrifugación en gradiente de densidad, descrito a modo de ejemplo por Oyer et al. (Oyer 2015). Normalmente, en el método divulgado en el presente documento, las células alimentadoras pueden reemplazarse por partículas de membrana de dichas células alimentadoras. Preferiblemente, las partículas de la membrana deberían usarse en cantidades que sean comparables a estas cantidades que pueden obtenerse mediante las células alimentadoras vivas usadas. Preferiblemente, la concentración de partículas de membrana usadas puede estar entre 100 y 400 |ig/ml, más preferiblemente entre 150 y 250 |ig/ml. La adición de partículas de membrana puede realizarse con tanta frecuencia como la adición de células alimentadoras vivas.
El EBV-LCL, como se usa en este documento, se puede producir, por ejemplo, mediante inmortalización de células B por EBV. Las PBMC se cultivan con ciclosporina A y la cepa de laboratorio EBV B95-8. Las células se cultivan hasta que se pudo observar una clara proliferación. Después de mantener las células en un cultivo que contiene Aciclovir para evitar la liberación de virus infecciosos, se completa la generación de una línea celular linfoblastoide transformada por EBV. Otros protocolos para producir estirpes de células linfoblastoides transformadas por virus de Epstein-Barr (EBV-LCL) son bien conocidos en la técnica y se divulgan, por ejemplo, en Sili et al, 2012, Citoterapia, 14 (1): 7-11 (SOP 3 en material suplementario).
Los términos “célula manipulada” y “célula modificada genéticamente” como se usa en el presente documento se pueden utilizar indistintamente. Los términos significan contener y/o expresar un gen extraño o secuencia de ácido nucleico que a su vez modifica el genotipo o fenotipo de la célula o su progenie. Especialmente, los términos se refieren al hecho de que las células pueden manipularse mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica para expresar de manera estable o transitoria péptidos o proteínas que no se expresan en estas células en el estado natural. La modificación genética de las células puede incluir, entre otras, transfección, electroporación, nucleofección, transducción con vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores retrovirales o lentivirales no integrantes, transposones, nucleasas de diseño, incluidas nucleasas de dedos de zinc, TALEN o CRISPR/Cas.
El término “dichas células alimentadoras son células no modificadas genéticamente con excepción de la introducción del genoma del EBV como resultado de la inmortalización de dichas células alimentadoras” como se usa en el presente documento significa que las células alimentadoras sólo han sido manipulados por la infección por EBV natural se vuelven inmortalizado pero sin más ingeniería genética (modificación genética) ha estado involucrado células alimentadoras
resultantes que no portan información genética adicional con la excepción del material genético endógeno de las propias células alimentadoras y la información genética del virus de Epstein-Barr natural (EBV).
El término “sistema cerrado”, como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación del cultivo celular, mientras que la realización de los procesos de cultivo tales como la introducción de nuevo material y la realización de etapas de cultivo de células tales como proliferación, diferenciación, activación, y/o separación de células. Tal sistema permite operar bajo condiciones GMP o similares a GMP (“estériles”) dando como resultado composiciones de células que son clínicamente aplicables. En este caso, a modo de ejemplo, el CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) se utiliza como un sistema cerrado. Este sistema se divulga en el documento WO2009/072003. Pero no se pretende limitar el uso del método de la presente invención al CliniMACS® Prodigy.
Los términos “método automatizado” o “proceso automatizado” como se usa en el presente documento se refieren a cualquier proceso que se está automatizado mediante el uso de dispositivos y/u ordenadores y softwares de ordenador que de otro modo podría ser realizada manualmente por un operador. Los métodos (procesos) que se han automatizado requieren menos intervención humana y menos tiempo humano para entregar. En algunos casos, el método de la presente invención está automatizado si al menos una etapa del presente método se realiza sin ningún apoyo o intervención humana. Preferiblemente, el método de la presente invención está automatizado si todas las etapas del método que se divulgan en este documento se realizan sin apoyo o intervención humana. Preferiblemente, el proceso automatizado se implementa en un sistema cerrado como CliniMACS® Prodigy.
Los CAR comprenden un fragmento variable de cadena única (scFv) de un anticuerpo específico para un determinado antígeno diana acoplado mediante regiones bisagra y transmembrana a dominios citoplasmáticos de moléculas de señalización celular. Las fracciones de activación de linfocitos más comunes incluyen un dominio coestimulador celular (por ejemplo, CD28, CD137, OX40, ICOS y CD27) junto con una fracción de activación celular (por ejemplo, CD3Q. La inmunoterapia adoptiva mediada por CAR permite que las células injertadas con CAR reconozcan directamente el antígeno deseado en las células diana de una manera no restringida por HLA.
Modalidades
En una realización de la invención, las células NK se purifican a partir de una muestra de sangre humana tal como PBMC mediante separación celular magnética positiva. Las células NK se separan mediante el uso de perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo anti-CD56 o un fragmento del mismo. La fracción positiva que comprende una población enriquecida de células NK se añade luego a un medio de cultivo celular adecuado para la expansión de células NK, es decir, el medio comprende IL-2 y/o IL-15 y células alimentadoras derivadas de células B tales como EBV-LCL. Para comenzar el proceso de cultivo se añade IL-21 al medio en el día 0. Las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO2. Después de 5 o 7 días, se añade por primera vez medio fresco que comprende IL-2 y/o IL-15. A continuación, se añade medio fresco que comprende IL-2 y/o IL-15 cada segundo a quinto día. Cada 13 días del proceso de cultivo, se agregan al medio células alimentadoras derivadas de células B frescas.
Este proceso descrito anteriormente se realiza siempre que sea necesario para alcanzar la cantidad deseada de células NK expandidas y las células NK producidas se pueden recolectar.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican de una muestra de sangre humana mediante la eliminación de células T mediante el uso de perlas magnéticas acopladas a un anti- Anticuerpo CD3 o fragmento del mismo y purificación adicional mediante enriquecimiento de CD56.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican por depleción de CD3 y enriquecimiento de CD56 usando un separador de células a escala clínica (CliniMACS plus, Miltenyi Biotec, Alemania). En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden purificarse mediante depleción de CD3 y enriquecimiento de CD56, incluidas todas las etapas de marcado magnético en un sistema completamente cerrado (CliniMACS Prodigy®, Miltenyi Biotec, Alemania).
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican a partir de una muestra de sangre humana tal como PBMC mediante separación celular magnética negativa. Las células NK se separan mediante el uso de perlas magnéticas acopladas a un cóctel de anticuerpos o un fragmento de los mismos que se une a células no NK. La fracción negativa que comprende una población enriquecida de células NK se añade a un medio de cultivo celular adecuado para la expansión de células NK, es decir, el medio comprende 11-2 y/o IL-15 y células alimentadoras derivadas de células B como EBV-LCL.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican de sangre humana entera mediante separación de células magnéticas negativas y sedimentación de eritrocitos como se divulga, por ejemplo, en el documento WO2013076070A1 (MACSxpress® Kit de aislamiento de células NK, Miltenyi Biotec).
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones purificadas de células NK seleccionadas negativamente.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK positivas a NKG2C purificadas.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK adaptativas positivas para CD57 purificadas y positivas para NKG2C.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK purificadas positivas para moléculas KIR individuales.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK purificadas que son específicas para péptidos de virus.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que están enriquecidas para una subpoblación secretora de citoquinas.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones aisladas usando un clasificador de células activado por fluorescencia.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones aisladas usando un clasificador de células basado en microchip como MACSQuant Tyto® (Miltenyi Biotec GmbH).
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que están modificadas genéticamente. Dichas células NK modificadas genéticamente pueden expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que están modificadas genéticamente. Dichas células NK modificadas genéticamente pueden sobreexpresar uno o múltiples receptores de quimiocinas.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que están modificadas genéticamente. Dichas células NK modificadas genéticamente pueden expresar una versión de mayor afinidad de receptores de células NK que la que se produce de forma natural. Dichos receptores de células NK pueden seleccionarse del grupo de CD16, CD314/NKG2D, CD335/NKp46, NKp44, NKp30, CD226/DNAM-1 o receptores activadores de tipo inmunoglobulina citolítica.
En una realización de la invención, el método que consiste en el aislamiento de células NK y el cultivo de células NK se realiza en un sistema cerrado como es conocido por el experto en la técnica. En una realización adicional, el sistema cerrado es un juego de tubos desechables unido a un dispositivo de procesamiento de células. En una realización adicional, dicho dispositivo de procesamiento de células es un CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec).
En una realización de la invención, dicho proceso de cultivo se usa para la fabricación industrial de células NK en grandes biorreactores. En una realización adicional de la invención las células NK se aíslan de un producto de aféresis y se dice que alrededor de 2 x 108 células NK donantes se cultivan con dicho proceso de cultivar durante 3 semanas, lo que resulta en alrededor de 2 x 1013 células NK en un volumen de aproximadamente 200 a 1000 litros. En una realización adicional de la invención, esas aproximadamente 2 x 13 células NK se dividen en fracciones de 1 x 1011 células NK cada una, proporcionando productos de células NK clínicas para aproximadamente 200 pacientes.
En una realización adicional de la invención se aíslan las células NK a partir de 100 ml de una donación de sangre entera humana y estos dijeron que alrededor de 2 x 107 células NK de donantes se cultivan con dicho proceso de cultivar durante 4 semanas, lo que resulta en alrededor de 2 x 1014 células NK en un volumen de aproximadamente 2000 a 10000 litros. En una realización adicional de la invención, esas aproximadamente 2 x 1014 células NK se dividen en fracciones de 1 x 1011 células NK cada una, proporcionando productos de células NK clínicas para aproximadamente 2000 pacientes.
En una realización adicional de la invención se aíslan las células NK a partir de 1 ml de una donación de sangre entera humana y se dice que alrededor de 2 x 105 células NK de donantes se cultivan con dicho proceso de cultivar durante 6 semanas, lo que resulta en alrededor de 2 x 1014 células NK en un volumen de aproximadamente 3000 a 15000 litros. En
una realización adicional de la invención, esas aproximadamente 2 x 1014 células NK se dividen en fracciones de 1 x 1011 células NK cada una, proporcionando productos de células NK clínicas para aproximadamente 2000 pacientes.
En una realización adicional de la invención, se aísla una sola célula NK de una donación de sangre entera humana y dicha célula NK se cultiva con dicho proceso de cultivo durante 11 semanas, lo que da como resultado aproximadamente 1 x 1015 células NK en un volumen de aproximadamente 10000 a 50000 litros. En una realización adicional de la invención aquellas sobre 1 x 1015 células NK se dividen en fracciones de 1 x 1011 células NK cada uno, proporcionando productos de células NK clínicos durante aproximadamente 10.000 pacientes.
En una realización de la invención dichas células NK se cultivan en dicho proceso de cultivo durante 13 días, se cosecha el 99.9% del volumen de cultivo y se introduce adicionalmente el 0.1 % del volumen en dicho proceso de cultivo. Las células recogidas NK se utilizan para los propósitos deseados y dicho proceso de cultivo proporciona un suministro continuo de aproximadamente 1 x 109 células NK cada dos semanas. En una realización adicional de la invención, dichas células NK cultivadas se crioconservan después de dos semanas. Se descongelan alícuotas de células NK criopreservadas y se cultivan adicionalmente en dicho proceso de cultivo, lo que permite la producción de células NK a partir de un banco de células crioconservadas.
En una realización de la invención, dichas células NK se clonan mediante dilución limitante, a modo de ejemplo descrito por Morris et al. (Morris 2005) para aislar un fenotipo deseado de dichas células NK para su introducción en dicho proceso de cultivo.
En una realización de la invención, dichas células alimentadoras se seleccionan para un fenotipo HLA deseado para la modulación del repertorio KIR de las células NK en dicho proceso de cultivo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Impacto de la concentración inicial de células NK en la expansión de células NK en presencia de células alimentadoras derivadas de células B
Se necesitan métodos eficaces para la expansión de células NK para generar suficientes células NK para la inmunoterapia basada en células NK. En este contexto, se sabe que las células NK requieren interacciones homotípicas NK-a-NK en cultivo para una supervivencia, activación y proliferación óptimas (Kim 2014) y, de acuerdo con esta observación, es bien sabido que se requiere el mantenimiento de una densidad de célula crítica para la óptima expansión in vitro de células NK.
Sorprendentemente, se encontró que densidades de células NK muy bajas provocan una expansión mejorada de células NK en presencia de células alimentadoras derivadas de células B. Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de preparaciones de capa leucocitaria de sangre entera humana. Se utilizó la inmortalización de células B por EBV para generar células alimentadoras derivadas de células B. Se cultivaron PBMC con ciclosporina A y la cepa de laboratorio EBV B95-8. Las células se cultivaron hasta que se pudo observar una clara proliferación. Después de mantener las células en cultivo que contienen Aciclovir para prevenir la liberación de virus infecciosos, se completó la generación de la estirpe celular linfoblastoide transformada por EBV (EBV-LCL). La estirpe EBV-LCL utilizada en todos los ejemplos fue SMI-EBV-LCL. Se aislaron células NK de PBMC utilizando el kit de aislamiento de células NK (Miltenyi Biotec). Se cultivaron células NK de tres donantes diferentes en TexMACS Research Medium (Miltenyi Biotec) suplementado con suero humano tipo AB al 5 % (Life Technologies) y 500 U/ml de IL-2 (Proleukin S, Novartis), junto con 100 Gy de EBV-LCL irradiado (SMI-EBV-LCL) en una proporción de 1:20. Se investigaron diferentes concentraciones de células Nk para iniciar el cultivo, mientras que la proporción de células NK a alimentador se mantuvo constante cambiando no solo las concentraciones de células NK sino cambiando la concentración de las células totales. Las células fueron cultivadas a 37 °C y 5 % de CO2 y se determinó la expansión de células NK después de 7 días. La expansión multiplicadora de células nK se calcula como el número de células NK en el día 7 dividido por el número de células NK al comienzo del cultivo. Como se muestra en la figura 1, las concentraciones a partir células NK de 2.8 x 104 células NK/ml, 4.0 x104 células NK/ml y 7.0 x104 células NK/ml resultó en 26.4, 20.9 y 10.3 de expansión media multiplicadora de células NK, respectivamente. Las barras de error en la Figura 1 son para la desviación estándar de los diferentes donantes.
Se pudo demostrar claramente que las células NK se expandieron eficientemente en cocultivo con células alimentadoras derivadas de células B si el cultivo se iniciaba a concentraciones de células NK extremadamente bajas y, sorprendentemente, concentraciones de células NK iniciales más bajas conducían a una expansión significativamente mayor de células NK.
Ejemplo 2: Expansión de células NK mediada por células alimentadoras a diferentes concentraciones de IL-2 y el uso de diferentes proporciones de células alimentadoras a células NK
Para investigar el efecto de la proporción de células NK a células alimentadoras y diferentes concentraciones de IL-2 en la expansión de células NK, se cultivaron células NK humanas de tres donantes diferentes en medio de investigación TexMACS suplementado con suero humano tipo AB al 5 % junto con EBV-LCL irradiado con 100 Gy (SMI-EBV-LCL). La
concentración utilizada de células totales fue de 5.25 x 105/ml incluyendo las células NK y EBV-LCL. Se probaron diferentes proporciones de células NK a EBV-LCL y las proporciones de 1 a 2 y 1 a 20 se muestran en la Figura 2. Para cada proporción de NK a alimentador se usaron diferentes concentraciones de IL-2 en el medio y 50 U/ml y 500 U/ml se muestran en la Figura 2. Las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO2. En los días 5, 7, 10 y 12 se determinó la concentración de células NK y se diluyó la concentración de células NK 5 x 105/ml mediante la adición de medio fresco que contenía IL-2. La expansión multiplicadora de células NK se calcula como el número de células NK en el día de interés dividido por el número de células NK al comienzo del cultivo. Los valores medios para la expansión multiplicadora de células NK se muestran para el día 7 (Figura 2A) y el día 15 (Figura 2B). Las barras de error en la Figura 2 son para la desviación estándar de los diferentes donantes. En el día 7 de cultivo, el uso de 50 U/ml de IL-2 dio como resultado una expansión media multiplicadora de células NK de 4.0 y 7.9 para las proporciones de NK a alimentador 1: 2 y 1:20 mientras se usaba 500 U/ml de IL-2 resultó en una expansión media multiplicadora de 1.9 y 5.9 para las proporciones de NK a alimentador de 1:2 y 1:20. En el día 15 de cultivo, el uso de 50 U/ml de IL-2 dio como resultado una expansión media multiplicadora de células NK de 93.6 y 535.6 para las proporciones de NK a alimentador de 1:2 y 1:20 mientras se usaba 500 U/ml de IL-2 dio como resultado una expansión media multiplicadora de 94.4 y 726.1 para las relaciones de NK a alimentador de 1:2 y 1:20. En conclusión, para la expansión de células NK mediada por células alimentadoras fue posible usar diferentes concentraciones de IL-2, se podrían aplicar diferentes proporciones de células NK a EBV-LCL y un mayor número de EBV-LCL por célula NK condujo a una mayor expansión de las células NK que muestran que la inducción de una mayor expansión de células NK se basó en EBV-LCL de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 3: Efecto de diferentes combinaciones de citocinas sobre la expansión de células NK mediada por células alimentadoras
Se cultivaron células NK derivadas de donantes humanos en medio de investigación TexMACS complementado con suero humano tipo AB al 5 % junto con o sin EBV-LCL (SMI-EBV-LCL) irradiado con 100 Gy en una proporción de 1:20 y una concentración inicial de 5.25 x 105 células totales/ml. Además, se probaron 500 U/ml de IL-2 y/o 10 ng/ml de IL-15 (Miltenyi) como suplementos medianos junto con o sin la adición de 100 ng/ml de IL-21 (Miltenyi). Las células fueron cultivadas a 37 °C y 5 % de CO2 y se determinó la expansión de células NK después de 7 días. Para diferentes combinaciones de citocinas, el valor medio para la expansión multiplicadora de las células NK se muestra en la Figura 3. La expansión multiplicadora de las células NK se calcula como el número de células NK en el día 7 dividido por el número de células NK al comienzo del cultivo. Las barras de error en la Figura 3 son para la desviación estándar de diferentes donantes. Los resultados de ocho donantes diferentes se pueden ver en la Figura 3A.
Las células NK no se expandieron notablemente sin EBVLCL independientemente del uso de IL-2 e IL-21. Por el contrario, las células NK se expandieron significativamente en presencia de EBVLCL e IL-2, mostrado por una expansión media multiplicadora de 21.8 células NK después de 7 días. Sorprendentemente, adicionalmente la adición de IL-21 mejoró aún más la expansión de células NK mediada por EBV-LCL en presencia de IL-2 y dio como resultado una expansión media multiplicadora de células NK de 53.2 después de 7 días. En la Figura 3B se muestran los datos de seis donantes diferentes y el cocultivo de células NK con EBV-LCL y el uso de IL-2, IL-15 o una combinación de IL-2 e IL-15 dio como resultado una expansión media multiplicadora de 11.0, 6.9 y 12.6 de células NK respectivamente. Confirmando la observación de la Figura 3A, la adición de IL-21 mejoró aún más la expansión de células NK mediada por EBV-LCL y resultó en una expansión media multiplicadora de células NK de 41.4, 32.6 o 28.1 en presencia de IL-2, IL-15 o la combinación de IL-2 e IL-15. En conclusión, IL-2 e IL-15 o una combinación de ambas citoquinas permitieron la expansión de células NK en presencia de células alimentadoras derivadas de células B. Sorprendentemente, la suplementación de IL-21 aumentó aún más la expansión basada en EBV-LCL de las células NK mientras que la IL-21 no tuvo ningún efecto sobre la expansión de las células NK sin células alimentadoras.
Ejemplo 4: Expansión de células NK mediada por células alimentadoras a diferentes concentraciones de IL-21
Se cultivaron células NK de tres donantes diferentes en medio de investigación TexMACS suplementado con suero humano de tipo AB al 5 % y 500 U/ml de IL-2 junto con 100 Gy de EBV-LCL (SMI-EBV-LCL) irradiado en una proporción de 1:20 y una concentración de partida de 5.25 x 105 células totales/ml. Se añadieron diferentes concentraciones de IL-21 el día 0. Las células se cultivaron a 37 °C y 5 % CO2 al y se determinó la expansión multiplicadora de células NK después de 7 días. La expansión multiplicadora de células Nk se calcula como el número de células NK en el día 7 dividido por el número de células NK al comienzo del cultivo. En la Figura 4 se representa la expansión media multiplicadora de células NK para células NK de tres donantes diferentes y la barra de error es para la desviación estándar. El uso de 0, 10, 25, 50 y 100 ng/ml de IL-21 dio como resultado una expansión media multiplicadora de células NK de 10.1, 26.8, 34.9, 41.4 y 47.7, respectivamente, lo que demuestra que existe una correlación positiva de la expansión de células NK basada en EBV-LCL y la concentración de IL-21 aplicada.
Ejemplo 5: Efecto de la adición permanente frente a la adición de IL-21 a corto plazo sobre la expansión de células NK en presencia de células alimentadoras derivadas de células B
Se probó en condiciones meteorológicas manteniendo una concentración constante de IL-21 necesaria para asegurar un efecto positivo sostenido sobre la expansión de las células NK.
Se cultivaron células NK humanas de tres donantes diferentes en medio de investigación TexMACS suplementado con suero humano tipo AB al 5 % y 500 U/ml de IL-2 junto con 100 Gy de EBV-LCL (SMI-EBVLCL) irradiado en una proporción de 1:20 y una concentración de partida de 5.25 x 105 células totales/ml. Las células fueron cultivadas a 37 °C y 5 % de CO2. El día 7, 9, 11, 13, 16, 18, 20, 26 y 28 se determinó la concentración de células NK y la concentración de células NK se diluyó 5 x 105/ml agregando medio fresco que contenía IL-2. La IL-21 (100 ng/ml) se agregó solo al comienzo del proceso de cultivo o se complementó permanentemente como componente del medio, es decir, al comienzo del medio nuevo y siempre que se agregara. Los valores medios para las expansiones multiplicadoras de células NK de tres donantes diferentes en diferentes puntos de tiempo se muestran en la Figura 5 y las barras de error en la Figura 5 son para la desviación estándar. La expansión multiplicadora de células NK se calcula como el número de células NK en el día de interés dividido por el número de células NK al comienzo del cultivo. La adición de IL-21 sólo al comienzo del cultivo (puntos negros) o la adición de IL-21 de forma permanente (cuadrados abiertos) dio como resultado una expansión media multiplicadora de 18383 o 3473 células NK después de 28 días. En conclusión, agregar IL-21 solo al comienzo del proceso de cultivo fue suficiente para lograr la expansión mejorada de las células NK mediada por células alimentadoras, mientras que la adición permanente de IL-21 tuvo inesperadamente un efecto negativo demostrado por una expansión reducida de las células NK a largo plazo.
Ejemplo 6: Expansión constante de células NK a largo plazo mediante la adición de IL-21 el día 0 y estimulación repetida con células alimentadoras derivadas de células b
En conjunto, en el ejemplo 1-5 se muestra que el cultivo de células NK junto con células alimentadoras derivadas de células B en combinación con la adición de IL-21 solo al comienzo del cultivo permite la expansión de células NK con una eficacia sobresaliente. Sin embargo, dado que las células NK primarias en general solo se pueden expandir durante un período de tiempo limitado como se muestra en la Figura 5, se probó cómo mantener el nivel alto durante un período de tiempo más largo.
Se cultivaron células NK de seis donantes diferentes en medio de investigación TexMACS complementado con suero humano tipo AB al 5 % y 500 U/ml de IL-2. La IL-21 (100 ng/ml) se complementó solo en el día 0. Para la estimulación repetida de las células NK con células alimentadoras derivadas de células B, se añadieron nuevamente 100 Gy de EBV-LCL (SMI-EBV-LCL) irradiados después de varios días. Se muestra en la figura 6 es la adición de EBV-LCL en el día 0, 13, 26 y 39 a las células NK en una proporción de 20:1 mientras que la concentración total de células se ajustó a 5.25 x 105/ml mediante la adición de medio fresco que contiene IL-2. Las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 46 días y en los días 7, 9, 11, 18, 20, 23, 32 y/o 33 y 36 la concentración de células NK se diluyó a 5 x 105/ml al agregar medio fresco que contiene IL-2. La expansión multiplicadora de células NK se calculó como el número de células NK en el día de interés dividido por el número de células NK al inicio del cultivo. Los valores medios para la expansión multiplicadora de células NK de los diferentes donantes en los diferentes puntos de tiempo se muestran en la Figura 6. Es de destacar que las barras de error mostradas en la Figura 6 muestran el rango de los diferentes donantes y no son para la desviación estándar. Se logró una expansión eficiente y constante de las células NK durante un tiempo prolongado y, después de 46 días, 2.7 x 1011 se alcanzó una expansión media del pliegue de las células NK. En conclusión, la adición de IL-21 al comienzo del cultivo y la estimulación repetida con células alimentadoras derivadas de células b permitió la expansión permanente de células NK primarias con una eficacia sobresaliente.
Ejemplo 7: Aplicación de un sistema de procesamiento de células automatizado para la expansión de células NK mediante el uso de un método optimizado para la expansión de células NK
Para probar la producción de células NK de una manera clínicamente aplicable, se realizó la expansión de células NK en el CliniMACS Prodigy (Miltenyi), un sistema cerrado para el procesamiento celular automatizado (WO2009072003A2).
Se cultivaron células NK en medio de investigación TexMACS suplementado con suero humano tipo AB al 5 % y 500 U/ml de IL-2 junto con 100 Gy de EBVLCL irradiado (SMI-EBV-LcL) en una proporción de 1:20. La IL-21 (100 ng/ml) se complementó solo en el día 0. El proceso de expansión se realizó para tres donantes diferentes utilizando tres dispositivos CliniMACS Prodigy® diferentes. El número medio de células NK al inicio del cultivo fue 1.08 x 106 células NK y las células se suspendieron Nk en 60 ml dentro de la Unidad CentriCult del instrumento CliniMACs Prodigy®. Se utilizó la Unidad CentriCult para cultivar las células y un programa del dispositivo mantuvo las condiciones de cultivo a 37 °C y 5 % de CO2. La concentración de células se diluyó hasta 3-5 x 105 células NK/ml mediante la adición de 60 o 120 ml de medio fresco en el día 7. Se añadió medio fresco de nuevo en el día 9 a la Unidad de CentriCult hasta que el volumen de cultivo máximo de 300 ml se alcanzó. 230 ml del medio viejo se retiró y se reemplazó por 230 ml de medio fresco en el día 12. En el día 14 del cultivo se dio por terminado desde que se alcanzó la concentración celular máxima que se puede obtener mediante el uso del instrumento (alrededor de 1 x 107/ml). La concentración de células NK se midió en los días 0, 7, 9, 12 y 14 y se calculó el número total de células NK dentro de la Unidad CentriCult. Los números medios de células NK en los diferentes puntos de tiempo se muestran en la Figura 7. Las barras de error en la Figura 7 son para la desviación estándar. Un número medio de 3.2 x109 células NK podría ser producido en dos semanas por el uso del dispositivo CliniMACs Prodigy®.
En conclusión, es posible comenzar con un número bajo de células NK y producir una dosis terapéutica de células NK en dos semanas mediante el uso de un dispositivo de procesamiento de células. Además, en base a los resultados mostrados en el ejemplo 6, sería posible realizar un proceso de producción de células NK automatizado y en funcionamiento continuo
con la instrumentación utilizada mediante la recolección repetida de la mayoría de las células siempre que se alcance la densidad celular máxima y la reestimulación de las células NK restantes con células alimentadoras EBV-LCL.
Referencias
Apel M, et al. “ Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture” Chemie Ing Tech 2013. 85: 103e10.
Childs RW, Berg R “Bringing natural killer cells to the clinic: ex vivo manipulation.” Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2013. 2013:234-46
Denman CJ et al., 2012: “Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells”, PLoS ONE
Glienke W, et al. “Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells.” Front Pharmacol 2015. Feb 12;6:21 Hercend T, et al. “Generation of a cloned NK cell line derived from the «null cell” fraction of human peripheral blood” J Immunol 1982. 129(3): 1299-1305
Kim TJ, et al. “Homotypic NK cell-to-cell communication controls cytokine responsiveness of innate immune NK cells.” Sci Rep 2014. Dec 5;4:7157
Klingemann H “Are natural killer cells superior CAR drivers?” Oncoimmunology 2014. Apr 15;3:e28147
Leung W, “ Infusions of allogeneic natural killer cells as cancer therapy” Clin Cancer Res 2014. Jul 1;20(13):3390-400 Miller JS “Therapeutic applications: natural killer cells in the clinic” Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2013.
2013:247-53
Miller JS, et al. “Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidenticalNKcells in patients with cancer” Blood 2005. Apr 15;105(8):3051-7
Morris RJ, et al. “A high-efficiency system of natural killer cell cloning.” J Immunol Methods 2005. Dec 20;307(1-2):24-33 Oyer JL, et al. “Generation of highly cytotoxic natural killer cells for treatment of acute myelogenous leukemia using a feeder-free, particle-based approach” Biol Blood Marrow Transplant 2015. Apr;21(4):632-9
Rubnitz JE, et al. “NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia” J Clin Oncol 2010. 28:955e9.
Sili U, et al. “Production of good manufacturing practice- grade cytotoxic T lymphocytes specific for Epstein- Barr virus, cytomegalovirus and adenovirus to prevent or treat viral infections post-allogeneic hematopoietic stem cell transplant.” Cytotherapy 2012 Jan;14(1):7-11
Claims (13)
1. Un método para cultivar y expandir in vitro linfocitos citolíticos naturales (NK) en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK, el método comprende
a) agregar una concentración efectiva de interleucina-21 (IL-21) al inicio del proceso de cultivo a dicho medio b) agregar repetidamente una concentración efectiva de interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15) a dicho medio c) agregar repetidamente células alimentadoras o partículas de membrana de las mismas a dicho medio, en el que dichas células alimentadoras son derivadas de células B que están inmortalizadas con EBV; y
en el que dicha expansión de células NK en dicho medio de cultivo celular se mantiene durante al menos 3 semanas.
2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha concentración eficaz de IL-21 en dicho medio de cultivo celular está entre 0.1 y 1,000 ng/ml.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde dicha concentración efectiva de IL-2 en dicho sistema de cultivo celular está entre 1 U/ml y 5000 U/ml y/o dicha concentración efectiva de IL-15 en dicho sistema de cultivo celular. está entre 0.1 y 1,000 ng/ml.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha adición repetida de células alimentadoras a dicho medio se realiza entre el día 5 y el día 16 después de la anterior adición de células alimentadoras.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha expansión de células NK en dicho medio de cultivo celular se mantiene durante al menos 5 semanas.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK son células NK purificadas.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la concentración de partida de dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK es de entre 20 células/ml y 2 x 107 células/ml.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración inicial de dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK está entre 20 células/ml y 2.5 x 104 células/ml.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas células alimentadoras son células no modificadas genéticamente con excepción de la integración del genoma del EBV.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK están modificadas genéticamente.
11. EL método según la reivindicación 10, en el que dichas células NK modificadas genéticamente expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR).
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho método se realiza en un proceso automatizado.
13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho proceso se realiza en un sistema cerrado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15183968.5A EP3138905A1 (en) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Method for natural killer cell expansion |
| PCT/EP2016/070455 WO2017037083A1 (en) | 2015-09-04 | 2016-08-31 | Method for natural killer cell expansion |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2832608T3 true ES2832608T3 (es) | 2021-06-10 |
Family
ID=54065749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16758177T Active ES2832608T3 (es) | 2015-09-04 | 2016-08-31 | Método de expansión de linfocitos citolíticos naturales |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20180245044A1 (es) |
| EP (2) | EP3138905A1 (es) |
| KR (1) | KR102575976B1 (es) |
| CN (1) | CN107922925B (es) |
| ES (1) | ES2832608T3 (es) |
| WO (1) | WO2017037083A1 (es) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2948462A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | National University Of Singapore | Modified natural killer cells and uses thereof |
| WO2018182511A1 (en) | 2017-03-27 | 2018-10-04 | National University Of Singapore | Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells |
| CA3056439A1 (en) | 2017-03-27 | 2018-10-04 | National University Of Singapore | Truncated nkg2d chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy |
| MX2020003314A (es) * | 2017-10-02 | 2020-10-28 | Gamida Cell Ltd | Expansion y uso de fracciones de celulas nk ampliadas. |
| CN108220237B (zh) * | 2017-12-20 | 2020-11-06 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种人的nk/t细胞系 |
| WO2019152663A1 (en) * | 2018-02-01 | 2019-08-08 | Nkmax Co., Ltd. | Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer |
| CN111757745B (zh) | 2018-02-01 | 2022-11-04 | Nkmax有限公司 | 产生天然杀伤细胞的方法和用于治疗癌症的组合物 |
| WO2019165097A1 (en) * | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Board Of Regents,The University Of Taxas System | Universal antigen presenting cells and uses thereof |
| CN110438082B (zh) * | 2018-05-04 | 2024-03-08 | 恺兴生命科技(上海)有限公司 | 表达il-21r结合蛋白的免疫效应细胞 |
| KR20210132660A (ko) * | 2019-01-24 | 2021-11-04 | 유니버시티 오브 센트럴 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 | 천연 살해 세포를 자극하기 위한 조성물 및 방법 |
| WO2020180882A1 (en) | 2019-03-05 | 2020-09-10 | Nkarta, Inc. | Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy |
| KR20210149757A (ko) | 2019-04-09 | 2021-12-09 | 누릭스 테라퓨틱스 인코포레이티드 | Cbl-b 억제용의 3-치환된 피페리딘 화합물, 및 암 백신 및/또는 종양용해 바이러스와 조합된 cbl-b 억제제의 용도 |
| CN114206855A (zh) | 2019-05-17 | 2022-03-18 | 紐力克斯治疗公司 | 用于Cbl-b抑制的氰基环丁基类化合物及其用途 |
| AU2020303696A1 (en) | 2019-06-26 | 2022-01-06 | Nurix Therapeutics, Inc. | Substituted benzyl-triazole compounds for Cbl-b inhibition, and further uses thereof |
| JP2022542323A (ja) | 2019-07-30 | 2022-09-30 | ニューリックス セラピューティクス，インコーポレイテッド | Ｃｂｌ－ｂの阻害のための尿素、アミド、および置換されたヘテロアリール化合物 |
| KR20220119611A (ko) * | 2019-11-29 | 2022-08-30 | 주식회사 엔케이맥스 | 천연 살해 세포의 제조 방법 및 이의 조성물 |
| CN112430573B (zh) * | 2020-12-23 | 2023-03-14 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种nk细胞的培养体系及培养方法 |
| CN112553157B (zh) * | 2020-12-23 | 2023-07-07 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法 |
| CN112680415A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-04-20 | 杭州原生生物科技有限公司 | 一种nk培养基及其扩增培养方法 |
| CN112779161B (zh) * | 2021-02-08 | 2021-07-27 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种免疫细胞培养方法 |
| WO2023075346A1 (ko) * | 2021-10-25 | 2023-05-04 | 재단법인대구경북과학기술원 | 항산화 기전 조절을 통한 자연살해세포의 항암 기능 향상 |
| GB202115389D0 (en) * | 2021-10-26 | 2021-12-08 | XNK Therapeutics AB | Methods |
| WO2023096352A1 (ko) * | 2021-11-25 | 2023-06-01 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Hla-e를 발현하도록 유전적으로 조작된 배양보조세포주, 및 그의 용도 |
| CN117721079A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-19 | 广东壹加再生医学研究院有限公司 | 一种促进nk细胞抗肿瘤活性的培养基及培养方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5525689B2 (ja) * | 2004-11-02 | 2014-06-18 | ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | 過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法 |
| ES2640216T3 (es) | 2007-12-07 | 2017-11-02 | Miltenyi Biotec Gmbh | Sistemas y métodos para procesamiento de células |
| EP2597153B1 (en) | 2011-11-25 | 2016-10-05 | Miltenyi Biotec GmbH | Cell separation method |
| CN104204194B (zh) * | 2011-12-22 | 2018-08-03 | 财团法人牧岩生命工学研究所 | 生产自然杀伤细胞的方法、由该方法生产的自然杀伤细胞以及包含该自然杀伤细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的组合物 |
| US9938498B2 (en) * | 2012-05-07 | 2018-04-10 | Nkmax Co., Ltd. | Method for the induction and expansion of natural killer cells derived from peripheral blood mononuclear cells |
| SG11201408697QA (en) * | 2012-06-28 | 2015-02-27 | Univ Central Florida Res Found | Methods and compositions for natural killer cells |
| CN103484429A (zh) * | 2013-09-28 | 2014-01-01 | 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 | 一种nk细胞的制备方法 |
-
2015
- 2015-09-04 EP EP15183968.5A patent/EP3138905A1/en not_active Withdrawn
-
2016
- 2016-08-31 EP EP16758177.6A patent/EP3344759B1/en active Active
- 2016-08-31 KR KR1020187009438A patent/KR102575976B1/ko active IP Right Grant
- 2016-08-31 CN CN201680049224.9A patent/CN107922925B/zh active Active
- 2016-08-31 WO PCT/EP2016/070455 patent/WO2017037083A1/en active Application Filing
- 2016-08-31 US US15/756,955 patent/US20180245044A1/en not_active Abandoned
- 2016-08-31 ES ES16758177T patent/ES2832608T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102575976B1 (ko) | 2023-09-07 |
| EP3344759A1 (en) | 2018-07-11 |
| US20180245044A1 (en) | 2018-08-30 |
| CN107922925A (zh) | 2018-04-17 |
| CN107922925B (zh) | 2022-02-08 |
| KR20180057641A (ko) | 2018-05-30 |
| EP3138905A1 (en) | 2017-03-08 |
| EP3344759B1 (en) | 2020-10-21 |
| WO2017037083A1 (en) | 2017-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2832608T3 (es) | Método de expansión de linfocitos citolíticos naturales | |
| US10968431B2 (en) | Adoptive transfer of CD8+ T cell clones derived from central memory cells | |
| Lamers-Kok et al. | Natural killer cells in clinical development as non-engineered, engineered, and combination therapies | |
| KR101644984B1 (ko) | 자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물 | |
| JP2023065668A (ja) | 養子細胞療法のための改良型細胞培養方法 | |
| ES2763169T3 (es) | Expansión de células NK | |
| ES2877108T3 (es) | Activación de linfocitos infiltrantes de médula en condiciones hipóxicas alternantes con normóxicas | |
| US9670459B2 (en) | Production method for cell populations | |
| ES2956241T3 (es) | Método para la transducción de células NK | |
| JPWO2007040105A1 (ja) | Ｔ細胞集団の製造方法 | |
| US20200199532A1 (en) | Compositions and methods for expanding ex vivo natural killer cells and therapeutic uses thereof | |
| ES2910227T3 (es) | Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T | |
| ES2793025T3 (es) | Método de producción de citoblastos pluripotentes que tienen un gen receptor de linfocitos T específico de antígenos | |
| AU2019237832A1 (en) | Method for producing natural killer cells | |
| Shimasaki et al. | Engineering of natural killer cells for clinical application | |
| JP5485139B2 (ja) | 遺伝子導入細胞の製造方法 | |
| US20220233665A1 (en) | Medicinal composition | |
| Class et al. | Patent application title: METHOD FOR NATURAL KILLER CELL EXPANSION | |
| Ripoll Fiol | Development of a scalable and robust upstream process for the chemically-defined production of lentiviral vectors for gene-modified cellular immunotherapies | |
| Santos | Towards GMP Production of γðTCR Engineered T Cells | |
| WO2023200929A1 (en) | Tumor-infiltrating lymphocyte (til) compositions and uses thereof |