CN111757745B - 产生天然杀伤细胞的方法和用于治疗癌症的组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于产生天然杀伤细胞的方法。方法包括从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞中的至少一种；和在细胞因子存在的情况下将CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养。还公开了用于治疗癌症的组合物。组合物包括由公开的方法产生的CD56+天然杀伤细胞和细胞因子。

Description

产生天然杀伤细胞的方法和用于治疗癌症的组合物
通过引用并入任何优先权申请
该申请要求2018年2月1日提交的韩国专利申请号KR-10-2018-0012938、2018年2月1日提交的韩国专利申请号KR-10-2018-0012942、2019年1月7日提交的韩国专利申请号KR-10-2019-0001981和2019年1月7日提交的韩国专利申请号KR-10-2019-0001983的权益，其公开内容通过引用以其全部并入本文。
背景
领域
本公开内容涉及用于高纯度天然杀伤细胞的制造方法。
相关领域的描述
人体通过由免疫系统协调的免疫应答被保护免受病原体影响，所述免疫系统包括许多免疫相关的细胞、化学介质(chemical mediator)如细胞因子等。白细胞，尤其是淋巴细胞，在这种免疫系统中起着重要的作用。淋巴细胞涉及先天和后天免疫。
天然杀伤细胞(NK细胞)是一类先天免疫细胞，其已知非特异性杀伤癌症，识别和杀伤病毒、细菌等，并且用酶如穿孔素和颗粒酶或通过Fas-FasL相互作用杀伤病原体。在癌症患者的情况中，已经报道这些NK细胞的癌细胞细胞毒性的降低与各种类型的癌症的发作有关，如肺癌(Carrega P等，Cancer，2008:112:863-875)、肝癌(Jinushi M等，J Hepatol.，2005:43；1013-1020)、乳腺癌(Bauernhofer T等，Eur J Immunol.，2003:33:119-124)、子宫癌(Mocchegiani E.等，Br j Cancer.，1999:79:244-250)、血液癌(Tajima F.等，Lekemia 1996:10:478-482)等。因此，对于癌症疗法，期望增加NK细胞的癌细胞细胞毒性。
为了获得癌细胞的NK-介导的杀伤的治疗效果，需要大量具有高纯度的NK细胞，但是从癌症患者获得大量血液并不容易，并且血液中NK细胞的比例很小，仅为约5％至20％。因此，很难使用NK细胞作为免疫治疗剂。
因此，期望仅NK细胞有效地扩增和增殖，但是在NK细胞增殖的常规方法中，需要以高浓度使用各种昂贵的细胞因子，因此相应的疗法仅可用于一些财务稳定的患者。此外，根据NK细胞增殖的常规方法，其他类型的免疫细胞(例如，T细胞、B细胞等)可以与NK细胞一起存在，并且包含T细胞的NK细胞的同种异体施用可引起移植物抗宿主病(GVHD)，并且将包含B细胞的NK细胞的同种异体施用给对血型不相容的受试者可导致过客B-淋巴细胞综合征，因此抗癌效果没有最大化。
此外，除了扩增和增殖NK细胞，期望高度维持NK细胞的功能，直到实际地使用扩增和增殖的NK细胞。因此，寻求开发这样的组合物，其能够促进NK细胞的增殖，增加衍生自NK细胞的细胞因子如TNF-、INF-和GM-CSF的产生和增加NK细胞的癌细胞细胞毒性。
概要
本申请涉及产生高纯度天然杀伤细胞的方法和用于治疗癌症的细胞治疗组合物，其包括高纯度天然杀伤细胞和细胞因子。本文公开的任何特征、结构或步骤可用本文公开的或省略的任何其他特征、结构或步骤替代或与其组合。此外，为了总结公开内容的目的，本文已经描述了发明的某些方面、优点和特征。应当理解，依照本文公开的发明的任何具体的实施方式，不一定实现任何或所有这种优点。该公开内容的各个方面都不是必不可少的或绝对必要的。
在一个实施方式中，公开了产生天然杀伤细胞的方法。方法包括：从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种；和在细胞因子存在的情况下将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养。
在某些实施方式中，从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种通过使用CD56微珠和CD3微珠中的至少一种进行。在某些实施方式中，细胞因子选自由IL-2、IL-21、IL-15、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、IGF 1及其组合组成的组。在某些实施方式中，细胞因子可以以50-1000IU/mL的浓度添加。
在某些实施方式中，饲养细胞的组合包括辐照的Jurkat细胞和辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞。在一个变型中，辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞的比例可为约1:0.1-5。辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞各自可通过50-500Gy的辐照获得。
在某些实施方式中，共培养可包括共培养1-50天。
在某些实施方式中，方法可进一步包括在第一细胞因子存在的情况下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养第一周期；并且随后在第二细胞因子存在的情况下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养第二周期。在一个变型中，在第二周期的第0-6天期间，第二细胞因子可添加一次或多次。在第二周期期间，在每个十四天循环的前六天期间，第二细胞因子可添加一次或多次。第一细胞因子可以为IL-2。第二细胞因子可以为IL-21。第二细胞因子可以以10-100ng/mL的浓度添加。
在某些实施方式中，CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种和饲养细胞的组合以CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞与饲养细胞的约1:1-100的比例共培养。
在某些实施方式中，公开了由该方法制造的组合物。
在一个实施方式中，公开了用于在需要其的患者中治疗癌症的组合物。组合物包括：有效量的衍生自外周血的CD56+天然杀伤细胞，其中有效量在每kg患者体重约1×106至5×108个细胞的范围内，并且其中CD56+天然杀伤细胞为至少约90％纯度；具有50-50,000IU/mL浓度的IL-2；和药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，细胞因子可选自由IL-2、IL-21、IL-15、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、IGF 1及其组合组成的组。在一个变型中，细胞因子可以为IL-2。细胞因子可具有50-50,000IU/mL的浓度。
在某些实施方式中，癌症选自由以下组成的组：血液癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌和神经母细胞瘤。
在某些实施方式中，组合物包括小于约1％的T细胞。
附图说明
为了示例性的目的，在附图中描绘了各种实施方式，并且决不应该被解释为限制实施方式的范围。此外，不同公开的实施方式的各种特征可被组合以形成另外的实施方式，其是该公开内容的部分。
图1A图示了示出由PBMC、CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞产生的NK细胞的细胞生长速率的图。
图1B图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下由PBMC和CD56+细胞产生的NK细胞的细胞生长速率的图。
图2图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下由PBMC或CD56+细胞产生的CD3-/CD56+ NK细胞的纯度的图。
图3图示了用于分析NK细胞的抗癌活性的平板设计(plate design)。
图4A图示了示出对各种效应细胞：靶细胞(E:T)比例从PBMC和CD56+细胞产生的NK细胞的短期细胞毒性的图。
图4B图示了示出从PBMC和CD56+细胞产生的NK细胞对AGS、A549和MDA-MB-231细胞的长期细胞毒性的图。
图5A-5B图示了示出在各种周期期间通过用IL-21处理产生的NK细胞的细胞生长速率的图。
图6图示了示出通过用具有各种浓度的IL-21处理产生的NK细胞的细胞生长速率的图。
图7A图示了示出对于各种E:T比例在各种周期期间通过用IL-21处理产生的NK细胞的短期细胞毒性的图。
图7B-7C图示了示出在各种周期期间通过用IL-21处理产生的NK细胞对AGS、A549和MDA-MB-231细胞的长期细胞毒性的图。
图8A图示了示出对于各种E:T比例通过用具有各种浓度的IL-21处理产生的NK细胞的短期细胞毒性的图。
图8B图示了示出用具有各种浓度的IL-21处理产生的NK细胞对AGS、A549和MDA-MB-231细胞的长期细胞毒性的图。
图9图示了示出用饲养细胞刺激的NK细胞的细胞生长速率的图。
图10A图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下从癌症患者的PBMC产生的NK细胞的细胞生长速率的图。
图10B图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下从癌症患者的PBMC产生的CD3-/CD56+ NK细胞的纯度的图。
图10C图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下从PBMC产生的NK细胞对K562细胞的短期细胞毒性的图。
图10D图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下从PBMC产生的NK细胞对AGS、A549和MDA-MB-231细胞的长期细胞毒性的图。
图11图示了示出用或不用IL-2处理的NK细胞的存活率的图。
图12图示了示出用或不用IL-2处理的NK细胞以各种E:T比例对各种癌细胞的细胞毒性的图。
图13图示了以用或不用IL-2处理的NK细胞处理的剩余NIH:OVCAR-3细胞的照片。
图14图示了以用或不用IL-2处理的NK细胞处理的剩余AGS细胞的照片。
详细的描述
发明人已经开发了在不使用昂贵的细胞因子的情况下生产高纯度NK细胞的方法。发明人发现，在从外周血单核细胞中分离CD56+细胞后，当在细胞因子存在的情况下从外周血单核细胞中分离的CD56+细胞与饲养细胞共培养时，可以产生高纯度CD56+ NK细胞。而且，本申请的发明人已经发开了用于治疗癌症的细胞治疗组合物，其包括有效地用于同种异体疗法的NK细胞。结果，发明人发现，当将特定的细胞因子添加至从外周血单核细胞中分离的CD56+ NK细胞时，展现出高存活率和高抗癌活性。因此，发明人寻求开发用于扩增NK细胞的方法并且提供包括扩增的外周血衍生的CD56+ NK细胞与细胞因子一起的用于癌症的治疗的细胞治疗组合物。
根据一些实施方式，用于产生高纯度NK细胞的方法可包括：从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)(“第一分离步骤”)；从外周血单核细胞中分离选自由CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞组成的组的细胞(“第二分离步骤”)；和在细胞因子存在的情况下，将选自由CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞组成的组的细胞与饲养细胞一起共培养(“培养步骤”)。每个步骤在本文中更详细地描述。与不具有分离的CD56+细胞的情况从外周血单核细胞产生的NK细胞相比，根据公开的方法产生的CD3-/CD56+细胞可不仅展现出更高的纯度和更高的抗癌活性，而且还展现出其他显著的特征，如具有不同表面标志物或活化的受体，例如，来自CD16、CD25、CD27、CD28、CD69、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、CD266、CD244、NKG2D、KIR2S、KIR3S、Ly94D、NCRs、IFN-a、IFN-b、CXCR3、CXCR4、CX3CR1、CD62L和CD57中的一种或多种。
第一分离步骤
在本说明书中，“血液样品”可以为但不限于外周血的全血或使用白细胞去除术从外周血分离的白细胞。此外，外周血可以从正常人、具有癌症风险的患者或癌症患者获得，但外周血的来源不限于此。
在本说明书中，术语“白细胞去除术”可指的是从收集的血液选择性地去除(分离的)白细胞，然后再次将血液给予患者的方法，并且在一些实施方式中，通过该方法分离的白细胞可在没有如Ficoll-Hypaque密度梯度法的另外的方法的情况下使用。
在本说明书中，术语“外周血单核细胞”可与“PBMC”、“单核细胞”(“mononuclearcell”)或“单核细胞”(“monocyte”)交换地使用，并且可以指的是从通常用于抗癌免疫疗法的外周血分离的单核细胞。外周血单核细胞可使用如Ficoll-Hypaque密度梯度法的已知方法从收集的人血获得。
在一些实施方式中，外周血单核细胞可为自体的，但是同种异体的外周血单核细胞还可根据本文所述的方法用于产生用于抗癌免疫疗法的高纯度NK细胞。此外，在一些实施方式中，外周血单核细胞可从正常人获得，但是外周血单核细胞还可从具有癌症风险的患者和/或癌症患者获得。
在本说明书中，术语“CD56+细胞”可与“CD56+ NK细胞”或“CD56+天然杀伤细胞”交换地使用，并且术语“CD3-/CD56+细胞”可与“CD3-/CD56+NK细胞”交换地使用。CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞可包括其中在细胞表面表达CD56糖蛋白的细胞，或进一步其中CD56糖蛋白表达时CD3糖蛋白不表达的细胞。甚至相同类型的免疫细胞可在附着在细胞表面的CD类型和表达率方面具有差异，因此其功能可为不同的。
第二分离步骤
在一些实施方式中，从血液样品中分离CD56+天然杀伤细胞可通过使用选自由CD56微珠和CD3微珠组成的组的至少一种的分离方法或使用如CliniMACS、流式细胞术细胞分选仪等设备的分离方法进行。
例如，使用CD56微珠和/或CD3微珠的分离方法可通过将CD56微珠添加至PBMC，然后去除非特异性结合进行，或通过将CD3微珠添加至PBMC以去除特异性结合，然后再添加CD56微珠以去除非特异性结合进行。在一些情况中，通过从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞，T细胞或其他非天然杀伤细胞可被去除。
培养步骤
在本说明书中，术语“细胞因子”可指的是可用于诱导外周血单核细胞分化为NK细胞的免疫活性化合物。
在一些实施方式中，细胞因子可以为白介素-2(IL-2)、IL-15、IL-21、FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胰岛素样生长因子1(IGF 1)，但不限于此。
在一些实施方式中，细胞因子可以以50-1,000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-550、100-550、150-550、200-550、250-550、300-550、350-550、400-550、450-550IU/mL的浓度使用。增殖NK细胞的常规方法利用高浓度的各种细胞因子。相反地，在本文所述的增殖NK细胞的方法的一些实施方式中，由于两种类型的饲养细胞可与高纯度CD56+细胞一起使用，具有高产率和高纯度的NK细胞可仅使用低浓度的一种细胞因子增殖。
在本说明书中，术语“饲养细胞”可指的是不分裂和增殖，但具有代谢活性以产生各种代谢物并因此有助于靶细胞增殖的细胞。
在一些实施方式中，饲养细胞可以为选自由辐照的Jurkat细胞、辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞和PBMC、HFWT、RPMI 1866、Daudi、MM-170、K562或通过靶向K562基因修饰的细胞(例如，K562-mbIL-15-41BB配体)组成的组中的至少一种。例如，在一个实施方式中，饲养细胞可为辐照的Jurkat细胞和EBV-LCL细胞。
在本说明书中，术语“Jurkat细胞”或“Jurkat细胞系”可指的是血液癌(永生化急性T细胞白血病(immortalized acute T cell leukemia))细胞系，其已经由在旧金山(SanFrancisco)的加利福尼亚大学(the University of California)的Arthur Weiss博士开发。通常不认为其中各种趋化因子受体被表达并且能够产生IL-2的Jurkat细胞为抗癌免疫疗法的饲养细胞的可能候选物，因为为天然杀伤细胞激活抑制剂的I类MHC在其细胞表面高度地表达。Jurkat细胞可从ATCC(ATCC TIB-152)获得。
在本说明书中，术语“EBV-LCL细胞”或“EBV-LCL细胞系”指的是Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)(D.M.Koelle等，J Clin Invest,1993:91:961-968)，其为通过在试管中用Epstein-Barr病毒感染人B细胞制造的B细胞系。EBV-LCL细胞可通过在PBMC中感染EBV的过程中添加环孢霉素A的方法直接地制备并且在普通实验室中使用。在一些实施方式中，EBV-LCL细胞可通过以下步骤制备。将30x106PBMC添加在9mL的培养基中，将混合物添加在T 25培养瓶中，然后添加9mL的EBV上清液。添加80μL的环孢霉素A(50μg/mL)，然后在37℃培养。在7天的培养后，去除一半上清液，添加新鲜的培养基，然后添加40μL的环孢霉素A。相同的过程可每7天重复一次，直到28天的培养。在28天的培养后，细胞系可为可用的，并且从这个时间，细胞系可在不添加环孢霉素A的培养基中培养。
Jurkat细胞和EBV-LCL细胞可在辐照后用作饲养细胞。
在一些实施方式中，辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞可以以1:0.1-5、1:0.1-4、1:0.1-3、1:0.1-2、1:0.1-1.5、1:0.5-1.5、1:0.75-1.25、0.1-5:1、0.1-4:1、0.1-3:1、0.1-2:1、0.1-1.5:1、0.5-1.5:1或0.75-1.25:1的含量比例被包括。例如，辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞可以以1:1的含量比例被包括。
在一些实施方式中，辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞可通过用50-500、50-400、50-300、50-200、50-150、70-130、80-120或90-110Gy的辐照处理来获得。例如，辐照的Jurkat细胞和/或辐照的EBV-LCL细胞可通过用100Gy的辐射处理Jurkat细胞和/或EBV-LCL细胞获得。
在一些实施方式中，培养可进行1-50、1-42、1-40、1-35、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15或1-14天。
在一些实施方式中，培养步骤可进一步包括以下步骤：用饲养细胞和第一细胞因子共培养(“第一培养步骤”)；和在添加第二细胞因子后进一步共培养(“第二培养步骤”)。
第二培养步骤可包括在培养的第0-6天之间添加第二细胞因子一次或多次。例如，第二培养步骤可包括在培养的第0天和第3天的每一天添加第二细胞因子一次。
第二培养步骤可包括在培养的14天的循环的前6天期间，添加第二细胞因子和饲养细胞。例如，第二培养步骤可包括在14天循环期间添加饲养细胞，并且在每个循环的第3天和第6天各自添加第二细胞因子一次。
在一些实施方式中，第一细胞因子可以为IL-2。在一些实施方式中，第二细胞因子可以为IL-21。在一些实施方式中，第二细胞因子可以以10-1000、10-500、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100或10-50ng/mL的浓度使用。在一些实施方式中，在第0-6天期间，以添加第二细胞因子一次或多次的培养可展现出优异的增殖和/或抗癌活性。在一些实施方式中，在14天的循环中以添加饲养细胞和第二细胞因子六天的培养可展现出优异的增殖和/或抗癌活性。
在一些实施方式中，共培养可通过包括以1:1-100、1:1-90、1:1-80、1:1-70、1:10-65、1:20-65、1:30-65、1:40-65、1:50-65或1:55-65的混合比例的外周血单核细胞和饲养细胞(例如，Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)进行。
共培养可在培养基中进行，并且可使用本领域中通常用于外周血单核细胞诱导和增殖为NK细胞的的任何合适的培养基，而不限制为这种培养基。例如，RPMI-1640、DMEM、x-vivo10、x-vivo20或cellgro SCGM培养基可被用作这种培养基。此外，培养条件如温度可遵循本领域已知的外周血单核细胞的任何合适的培养条件。
在一些实施方式中，在产生的NK细胞内，CD56+ NK细胞相对于全细胞的比例或纯度可以为85％或更大、90％或更大、或95％或更大或98％或更大。在一些实施方式中，在产生的NK细胞内，T细胞与全细胞的比例可以为15％或更小、10％或更小、5％或更小、2％或更小、1％或更小。用于治疗癌症的细胞治疗组合物
根据一些实施方式，用于癌症的治疗的细胞治疗组合物可包括外周血衍生的CD56+ NK细胞和细胞因子。
在本说明书中，术语“外周血衍生的”可意味着衍生自“外周血的全血”或“使用白细胞去除术从外周血分离的白细胞”的细胞。外周血衍生的CD56+ NK细胞可与外周血单核细胞(PBMC)衍生的CD56+ NK细胞交换地使用。
在一些实施方式中，细胞因子可以以18-180,000、20-100,000、50-50,000、50-1,000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-550、100-550、150-550、200-550、250-550、300-550、350-550、400-550、450-550IU/mL的浓度使用。当在这些范围中使用细胞因子时，它可以抑制癌症治疗组合物中包括的NK细胞的凋亡和增加NK细胞的抗癌活性。
在一些实施方式中，组合物可包括IL-2作为细胞因子。
在一些实施方式中，CD56+ NK细胞可如本文其他地方描述的获得。例如，CD56+ NK细胞可通过与饲养细胞(例如辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞)共培养获得。在一些实施方式中，CD56+ NK细胞与全细胞的比例(纯度)可以为85％或更大、90％或更大、95％或更大或98％或更大。
在一些实施方式中，癌症可以为血液癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌或神经母细胞瘤，但不限于此。
在一些实施方式中，组合物可不包括T细胞或可仅包括痕量的T细胞。例如，组合物中T细胞与全细胞的比例可以为小于15％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％或更小。
在本说明书中，术语“T细胞”指的是来源于胸腺的淋巴细胞，其可以“记忆”先前遇到的抗原并且向B细胞提供信息，从而促进抗体的产生并且在细胞免疫系统中发挥重要作用。由于这些T细胞可区分不同抗原之中很小的差异以诱导对同种异体抗原的免疫应答，因此自体疗法是可能的，但是可能被限制用于同种异体疗法。因此，没有T细胞的细胞治疗组合物可适合于同种异体移植。
在本说明书中，术语“细胞治疗剂”指的是通过一系列作用用于治疗、诊断和预防的药物，所述作用如在体外增殖和筛选自体的、同种异体的和异种的活细胞用于恢复细胞和组织的功能或通过其他方法改变细胞的生物学特性。自从美国1993年和韩国2002年，已经将细胞治疗剂调节为医疗产品。这些细胞治疗剂可大致被分类为两个领域，其为第一，用于组织再生或器官功能恢复的干细胞治疗剂，和第二，用于调节免疫应答如抑制免疫应答或增强体内免疫应答的免疫细胞治疗剂。
本文所述的细胞治疗组合物的施用途径可以为任何合适的途径，只要组合物到达靶组织。施用可以为肠胃外施用，例如，腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用或皮内施用，但不限于此。
本文所述的细胞治疗组合物可以以合适的形式与适合用于或通常用于细胞疗法的药学上可接受的载体一起配制。“药学上可接受的”指的是当向人体施用时，为生理学上可接受的并且通常不引起如胃肠道病症、头昏等的变态反应或其类似反应的组合物。药学上可接受的载体可包括，例如，肠胃外施用的载体，如水、合适的油、生理盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇等，并且进一步包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸、蔗糖、白蛋白等。合适的防腐剂包括DMSO、甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮等。
细胞治疗组合物还可通过任何设备施用，其中细胞治疗剂可移动至靶细胞。
细胞治疗组合物可包括治疗有效量的用于治疗疾病的细胞治疗剂。术语“治疗有效量”意味着研究人员、兽医、医师或其他临床医生认为在组织系统、动物或人中诱导生物学或医学应答的活性成分或细胞治疗组合物的量，并且包括诱导减轻待治疗的疾病或病症的症状的量。对于本领域技术人员显而易见的是，细胞治疗组合物中包括的细胞治疗剂可根据所需效果改变。因此，细胞治疗剂的最佳含量可由本领域技术人员容易地确定，并且可以根据各种因素调整，所述各种因素包括疾病的类型；疾病的严重程度；组合物中包含的其他成分的含量；制剂的类型；和患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；组合物的分泌比例；治疗时期；和同时使用的药物。重要的是，通过考虑所有因素，包括能够以最小量获得最大效果而没有副作用的量。例如，细胞治疗组合物可包含每kg体重1×106至5×108个细胞的细胞治疗剂。
用于预防或治疗癌症的方法
此外，根据发明的另一个方面，提供了用于预防或治疗癌症的方法，方法包括向受试者施用用于抗癌的包括外周血衍生的CD56+天然杀伤细胞和细胞因子的细胞治疗组合物。术语“受试者”指的是哺乳动物，其为用于治疗、观察或测试的受试者，并且优选地为人。受试者可为血液癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌或神经母细胞瘤的患者，但不限于此。
在一些实施方式中，在成人的情况下，细胞治疗组合物可以一天一次至几次施用。细胞治疗组合物可以每天或以2-180天间隔施用。组合物中包括的细胞治疗剂可包括1×106至1×1011个外周血衍生的CD56+天然杀伤细胞，例如，每kg体重约1×106至1×108个NK细胞。在一些实施方式中，细胞治疗组合物中的外周血衍生的CD56+天然杀伤细胞为至少约90％纯度。在一些实施方式中，细胞因子为以在约50–50,000IU/ml范围内的浓度的IL-2。
在一些实施方式中，本发明的细胞治疗组合物可通过任何合适的方法施用，例如通过直肠的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的、肌内的、胸骨内的、经皮的、局部的、眼内的或皮内途径施用。在一些实施方式中，在组合物中包括的NK细胞可为同种异体的，即从除了正治疗的受试者的人获得的。在一些实施方式中，人可以为正常人或癌症患者。在一些实施方式中，在组合物中包括的NK细胞可为自体的，即从正治疗的受试者中获得。
在一些实施方式中，本文公开的NK细胞和包括本文公开的NK细胞的细胞治疗组合物可用于治疗除了癌症以外的疾病或病症。据报道，NK细胞在调节免疫系统中发挥重要的作用，例如通过调节T细胞，因此可施用具有NK细胞的细胞治疗组合物以治疗与免疫系统有关的病症。例如，可施用细胞治疗组合物以治疗神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)或自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣、脊椎关节病、SLE、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、全身性硬化症)。
有利的效果
本发明的特征和优点总结如下：
(a)本发明涉及产生天然杀伤细胞的方法。
(b)根据生产天然杀伤细胞的方法，由于可以在不使用各种昂贵的细胞因子的情况下生产去除T细胞等的高纯度天然杀伤细胞，因此可以提高预防和治疗癌症的效果，特别地，使用天然杀伤细胞的同种异体疗法。
(c)本发明涉及用于抗癌的细胞治疗组合物，其包括外周血衍生的CD56+ NK细胞和细胞因子。
(d)本发明的组合物包括具有最少(例如，小于约1％)T细胞的高纯度天然杀伤细胞，因此组合物可有效地用于同种异体疗法以及自体疗法。
实施例
提供了以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些实施例不应被解释为将本公开内容限制为描述的特定特征或实施方式。
实施例1.CD56+天然杀伤(NK)细胞的产生
通过以下方法从PBMC中分离CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞。首先，使用Ficoll-Hypaque密度梯度法从血液中分离PBMC，然后细胞计数。
实施例1-1.用于产生CD56+细胞的准备
计数的PBMC添加了MACS缓冲液(1x PBS+0.5％HSA)并且悬浮，和添加了CD56微珠(Miltenyi Biotec)至每1.0x107PBMC 1至20μL，然后在2至8℃培养5至30分钟。在培养后，添加MACS缓冲液并且混合，然后混合物被离心分离(600xg)以沉淀细胞。在离心分离后，除去上清液，并且细胞通过添加MACS缓冲液悬浮且被添加在连接至MACS分离器的柱子中。MACS缓冲液经过柱子以去除非特异性结合。将柱子与MACS分离器分开并且被转移至15mL圆锥管中，然后添加了MACS缓冲液以分离附着至柱子的CD56+细胞。
实施例1-2.用于产生CD3-/CD56+细胞的准备
计数的PBMC添加了MACS缓冲液(1x PBS±0.5％HSA)并且悬浮，并且添加了CD3微珠(Miltenyi Biotec)至每1.0x107PBMC 1至20μL，然后在2至8℃培养5至30分钟。在培养后，添加MACS缓冲液并且混合，然后混合物被离心分离(600xg)以沉淀细胞。在离心分离后，除去上清液，并且细胞通过添加MACS缓冲液悬浮且被添加在连接至MACS分离器的柱子中。MACS缓冲液经过柱子以收集CD3-细胞。收集的CD3-细胞添加了MACS缓冲液(1x PBS+0.5％HSA)并且悬浮，并且添加了CD56微珠(Miltenyi Biotec)至每1.0x107CD3-细胞1至20μL，然后在2至8℃培养5至30分钟。在培养后，添加MACS缓冲液并且混合，然后混合物被离心分离(600xg)以沉淀细胞。在离心分离后，除去上清液，并且细胞通过添加MACS缓冲液悬浮且被添加在连接至MACS分离器的柱子中。MACS缓冲液经过柱子以去除非特异性结合。将柱子与MACS分离器分开并且被转移至15mL圆锥管中，然后添加了MACS缓冲液以分离附着至柱子的CD3-/CD56+细胞。
实施例1-3.使用CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞产生NK细胞
将如实施例1-1和1-2中从PBMC分离的CD56+细胞或CD3-/CD56+细胞连同制备的用100Gy辐射辐照的饲养细胞的组合(Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)一起添加至包含FBS 10％的RPMI-1640培养基中，所述RPMI-1640培养基添加了500IU/mL浓度的IL-2，然后在37℃和5％CO2的培养箱中共培养。(CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞):(Jurkat细胞):(EBV-LCL细胞)的比例为约1:30:30。
同时，Jurkat细胞可从ATCC(ATCC TIB-152)获得，并且EBV-LCL细胞通过以下方法制备：将30x106PBMC添加在9mL的培养基中，将混合物添加在T 25培养瓶中，然后添加9m的EBV上清液。添加80μL的环孢霉素A，然后在37℃培养。在7天的培养后，去除一半上清液，添加新鲜的培养基，然后添加40μL的环孢霉素A。与第7天相同的过程每7天重复一次直到28天的培养。在28天的培养后，细胞系可以为可用的，并且从这个时间，细胞系可在不添加环孢霉素A的培养基中培养。
实施例2.CD56+天然杀伤(NK)细胞的产生(IL-2/IL-21处理的)
除了添加IL-2(500IU/mL)和IL-21(50ng/mL)代替IL-2(500IU/mL)外，使用实施例1(1-1至1-3)的相同方法产生NK细胞。
比较实施例1.在没有CD56+细胞分离步骤的情况下天然杀伤(NK)细胞的产生(IL- 2处理的)
使用Ficoll-Hypaque密度梯度法从血液中分离PBMC。与用100Gy辐射辐照的制备的饲养细胞(Jurkat细胞和EBV-LCL细胞)一起，将PBMC添加在包含FBS 10％的RPMI-1640培养基中，所述RPMI-1640培养基添加了500IU/mL的浓度的IL-2，然后在37℃和5％CO2的培养箱中共培养。
比较实施例2.在没有CD56+细胞分离步骤的情况下天然杀伤(NK)细胞的产生(IL- 2/IL-21处理的)
除了添加IL-2(500IU/mL)和IL-21(50ng/mL)代替IL-2(500IU/mL)外，使用比较实施例1相同的方法产生NK细胞。
比较实施例3&4.在没有CD56+细胞分离步骤的情况下天然杀伤(NK)细胞的产生
除了PBMC:(Jurkat细胞):(EBV-LCL细胞)的比例为1:0.5:0.5外，分别使用比较实施例1&2的相似方法产生NK细胞。
实验性实施例1.NK细胞的增殖能力的确认
对于在根据实施例1、2和比较实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，在培养的第6天在T 25培养瓶中，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL的袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养3至6天。
图1A图示了在培养期间NK细胞的倍数增加。如图1A和以下表1中说明的，与第0天相比，在第17天实施例1的CD56+ NK细胞(CD56+和CD3-/CD56+)分别增殖了2675和1903倍，同时与第0天相比，在第17天比较实施例1的PBMC细胞增殖了1768倍。
表1
Figure BDA0002612346760000161
图1B图示了NK细胞的的倍数增加和群体倍增水平(PDL)。此外，如在图1B中说明的，与第0天相比，比较实施例1(PBMC w/o IL-21)和比较实施例2(PBMC w/IL-21)的PBMC分别增殖了243倍和1248倍，同时与第0天相比，实施例1(CD56 w/o IL-21)和实施例2(CD56w/IL-21)的CD56+ NK细胞分别增殖了2990和20434倍。
实验性实施例2.CD56+ NK细胞的纯度的确定
实施例1、2和比较实施例1、2的NK细胞用FACS染色缓冲液洗涤一次并且悬浮在100μL中，然后在与荧光(fluorescence)结合的单克隆抗体混合后，在黑暗条件下在2至8℃储存20至30分钟。在一次另外的洗涤后，将细胞悬浮在300μL至500μL的FACS染色缓冲液中，然后获得每管10,000至100,000个细胞并且通过使用流式细胞仪的CD56-FITC/CD3-PE/CD20-PerCP5/CD14-APC面板(panel)分析。CD56+ NK细胞的纯度被定义为在FSC/SSC门控后，引入CD3-/CD56+区域的细胞的比例，并且进一步确认CD3-/CD56+区域中的细胞中未表达CD20和CD14。
如图2中说明，比较实施例1(PBMC w/o IL-21)和比较实施例2(PBMCw/IL-21)的NK细胞的纯度分别为84.2％和84.7％，而实施例1(CD56 w/oIL-21)和实施例2(CD56 w/IL-21)的NK细胞的纯度分别为98.6％和99.2％。
实验性实施例3.NK细胞的癌细胞细胞毒性的确认
首先，确认对一种慢性髓细胞性性白血病细胞系的K562细胞(血液癌，
Figure BDA0002612346760000172
CCL-243TM)的细胞毒性。
在用于实验中之前，通过在37±1℃将悬浮在包含FBS 10％的RPMI1640培养基中的K562细胞以三天的间隔继代培养7天或更多天制备K562细胞。
将制备的K562细胞以1.0x106细胞/mL的浓度悬浮于RPMI-1640培养基中，并且添加了以4μM浓度的荧光材料(Calcein-AM)。在37±1℃将K562细染色胞30分钟，然后以十分钟的间隔倒置。用荧光材料染色的K562细胞以3,300rpm离心分离3分钟，洗涤三次，然后以1.0x106细胞/mL的比例悬浮于包含FBS 10％的SNK培养基中。将K562细胞以每孔1.0x104细胞的量接种到圆底微孔板(96孔)中。
在培养的第14至20天将实验性实施例1的NK细胞(效应细胞)悬浮并且分别以1.0x106细胞/mL、3.0x105细胞/mL、1.0x105细胞/mL和0.5x105细胞/mL的比例稀释在包含FBS 10％的RPMI-1640培养基中。
将稀释的效应细胞接种到用靶细胞(K562细胞)接种的平板中，浓度为每孔100μL，分别每个三孔(一式三份(triplication))。在这种情况中，效应细胞和靶细胞的比例在以下表2中示出。
表2
Figure BDA0002612346760000171
Figure BDA0002612346760000181
在本实验室中使用的平板设计在图3中示出，在阴性对照组(自发的)中，添加荧光染色的活K562细胞，并且在阳性对照组(最大释放)中，将K562细胞使用TX-100完全杀伤并且展现出最大荧光。
用靶细胞和效应细胞接种的平板以1000rpm离心分离5分钟，在37±1℃培养3至4小时，然后再次以1,000rpm离心分离5分钟。在离心分离后，将80μL的上清液转移至黑色平板(96孔)，然后使用荧光微板阅读仪测量荧光量，并且使用以下等式1计算对癌细胞的细胞毒性。
等式1
Figure BDA0002612346760000182
图4A和下表3示出以各种E:T比例的K562细胞的溶解％。如图4A和下表3中说明的，与比较实施例3(PBMCs w/o IL-21)和比较实施例4(PBMCs w/IL-21)相比，根据实施例1(CD56+ w/o IL-21)和实施例2(CD56+ w/IL-21)培养的CD56+细胞展现出较高的抗癌活性。
表3
Figure BDA0002612346760000183
接下来，确认了针对已知对NK细胞具有更大耐受性的实体瘤细胞的细胞毒性。将AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000184
CRL-1739TM)、A549(肺癌，
Figure BDA0002612346760000185
CRL-185TM)和MDA-MB0231(乳腺癌，
Figure BDA0002612346760000186
HTB-26TM)用作实体瘤细胞系。
使用
Figure BDA0002612346760000187
Green长期示踪试剂盒(Enzo Life Sciences Inc.)用绿色荧光标志物标记每个实体瘤细胞，接种在平板上，并且培养24小时。第二天，将NK细胞和癌细胞以0.5:1比例反应48小时。在48小时后，通过使用流式细胞仪测量展现出绿色荧光的细胞的量来确认细胞毒性。
如在图4B中说明的，与比较实施例1(PBMC w/o IL-21)和比较实施例2(PBMC w/IL-21)相比，根据实施例1(CD56+ w/o IL-21)和实施例2(CD56+ w/IL-21)培养的CD56+细胞展现出较高的抗癌活性。
实验性实施例4.取决于IL-21处理的时机和数量NK细胞的增殖能力的比较
为了评价根据IL-21处理的时机的NK细胞的增殖能力，进行了以下提出的实验。
CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生，但是在第0-6天(D0-6组)、第6-10天(D6-10组)、第10-14天(D10-14组)或第14-17天(D-14-17组)期间用IL-21(50ng/mL)处理，并且CD56+ NK细胞的增殖能力使用根据实验性实施例1的方法比较。
NK细胞用IL-21处理：对于D0-6组，在第0和3天两次；对于D6-10组，在第6天一次；对于D10-14组，在第10天一次；对于D14-17组，在第14天一次。对于对照组，NK细胞未用IL-21处理。
如图5A和表4中示出，与对照组相比，D10-14组和D14-17组在增殖能力方面未展现出显著的差异，而与对照组相比，D0-6组和D6-10组展现出增加的增殖能力。特别地，D0-6组展现出最大的扩增倍数增加。
表4
Figure BDA0002612346760000191
为了评价根据IL-21处理的数量的NK细胞的增殖能力，进行了以下提出的实验。
CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生，但是在第0-3天(D0-3组)、第3-6天(D3-6组)或第0-6天(D0-6组)期间用IL-21(50ng/mL)处理，并且CD56+ NK细胞的增殖能力使用根据实验性实施例1的方法比较。
NK细胞用IL-21处理：对于D0-3组，在第0天一次；对于D3-6组，在第3天一次；对于D0-6组，在第0和3天两次。对于对照组，NK细胞未用IL-21处理。
如图5B和表5中示出，与对照组相比，在培养的较早阶段期间用IL-21处理每组展现出增加的扩增倍数。特别地，D0-6组展现出最大的扩增倍数增加。
表5
Figure BDA0002612346760000201
实验性实施例5.取决于IL-21处理的浓度的NK细胞的增殖能力的比较
CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生，但是用具有0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL或100ng/mL浓度的IL-21处理两次，并且CD56+ NK细胞的增殖能力使用根据实验性实施例1的方法比较。
如在图6中示出，与未用IL-21处理的NK细胞相比，甚至当用具有10ng/mL浓度的IL-21处理时的NK细胞展现出更大的扩增倍数，并且随着IL-21的浓度在10ng/mL-50ng/mL之间增加，NK细胞的的扩增倍数增加。然而，当用具有100ng/mL浓度的IL-21处理时的NK细胞与以具有50ng/mL浓度的IL-21处理的NK细胞在扩增方面未展现出显著的差异。
实验性实施例6.取决于IL-21处理的时机和数量的NK细胞的细胞毒性的比较
为了评价根据IL-21处理的时机的NK细胞对癌细胞的细胞毒性，进行了以下提出的实验。
CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生，但是在第0-6天(D0-6组)、第6-10天(D6-10组)、第10-14天(D10-14组)或第14-17天(D-14-17组)期间用IL-21(50ng/mL)处理，并且CD56+ NK细胞对血液癌细胞(K562细胞，CCL-243)的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。
NK细胞用IL-21处理：对于D0-6组，在第0和3天两次；对于D6-10组，在第6天一次；对于D10-14组，在第10天一次；对于D14-17组，在第14天一次。对于对照组，NK细胞未用IL-21处理。
如图7A和表6中示出，与对照组相比，除了D4-17组的所有用IL-21处理的NK细胞的组展现出更高的抗癌活性。
表6
Figure BDA0002612346760000211
此外，对于每个CD56+ NK细胞的产生组，CD56+ NK细胞对实体瘤细胞的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000212
CRL-1739TM)、A549(肺癌，
Figure BDA0002612346760000213
CRL-185TM)和MDA-MB0231(乳腺癌，
Figure BDA0002612346760000214
HTB-26TM)被用作实体瘤细胞系。
如在图7B中示出，在培养的较早阶段(D0-6组)用IL-21处理的NK细胞展现出对所有三种类型的实体瘤细胞最大的抗癌活性。
为了评价根据IL-21处理的数量的NK细胞对癌细胞的细胞毒性，进行了以下列出的实验。
CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生，但是在第0-3天(D0-3组)、第3-6天(D3-6组)或第0-6天(D0-6组)期间用IL-21(50ng/mL)处理，并且CD56+ NK细胞对实体瘤细胞的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000215
CRL-1739TM)、A549(肺癌，
Figure BDA0002612346760000216
CRL-185TM)和MDA-MB0231(乳腺癌，
Figure BDA0002612346760000217
HTB-26TM)被用作实体瘤细胞系。
NK细胞用IL-21处理：对于D0-3组，在第0天一次；对于D3-6组，在第3天一次；对于D0-6组，在第0和3天两次。对于对照组，NK细胞未用IL-21处理。
如在图7C中示出，与对照组相比，在培养的较早阶段用IL-21处理的每组展现出更高的抗癌活性。
实验性实施例7.取决于IL-21处理的浓度的NK细胞的细胞毒性的比较
CD56+NK细胞根据实施例1的方法产生，但是用具有0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL或100ng/mL浓度的IL-21处理两次，并且CD56+ NK细胞对血液癌细胞(K562细胞，CCL-243TM)的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。
如在图8A中示出，与未用IL-21处理的NK细胞相比，大多数用IL-21处理的NK细胞展现出更高的细胞毒性，当用具有100ng/mL浓度的IL-21处理时的NK细胞与未用IL-21处理的NK细胞在扩增方面未展现出显著的差异。
CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生，但是用具有0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL或100ng/mL浓度的IL-21处理两次，并且CD56+ NK细胞对实体瘤细胞(K562细胞，CCL-243TM)的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000221
CRL-1739)、A549(肺癌，
Figure BDA0002612346760000222
CRL-185TM)和MDA-MB0231(乳腺癌，
Figure BDA0002612346760000223
HTB-26TM)被用作实体瘤细胞系。
如在图8B中示出，用具有50ng/mL浓度的IL-21处理的NK细胞展现出最大的抗癌活性。
实验性实施例8.取决于饲养细胞处理的数量的NK细胞的增殖活性的比较
为了分析是否用饲养细胞多次处理将维持NK细胞的增殖，在培养期间NK细胞以14天的间隔用饲养细胞处理，并且监控NK细胞的扩增42天。
为了进一步分析取决于IL-21处理的NK细胞扩增的增加，在从每次用饲养细胞处理的六天周期期间(第0-6、14-20、28-34天)，NK细胞以3天间隔用IL-21(50ng/mL)处理两次。
如在图9中示出，当用饲养细胞与IL-21一起处理两次或更多次时，NK细胞展现出显著增加的扩增倍数，并且与未用IL-21处理的NK细胞相比，在第42天用IL-21处理的NK细胞展现出更高的扩增倍数(大约3.4x1010与大约5.3x108)。
实验性实施例9.使用某些癌症患者的血液确认NK细胞的培养效果
除了使用结肠直肠癌患者的PBMC，CD56+ NK细胞根据实施例1的方法产生17天。产生的NK细胞的增殖能力和纯度使用根据实验性实施例1和2的方法测量。
对于一些组，用具有50ng/mL浓度的IL-21处理NK细胞两次(培养的第0天和第3天)，以确认IL-21处理的效果。
如在图10A中说明的，未用IL-21处理的NK细胞的数量从第0天增加了8倍，而当用IL-21处理时，NK细胞的数量从第0天增加了1461倍。
此外，如在图10B中说明的，未用IL-21处理的NK细胞的纯度仅为84.2％，而当用IL-21处理时，NK细胞的纯度为99.19％。
此外，用IL-21处理的NK细胞和未用IL-21处理的NK细胞对血液癌细胞(K562细胞，CCL-243)的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。如在图10C中说明，与未用IL-21处理的NK细胞相比，用IL-21处理的NK细胞展现出更高的抗癌活性。
另外，进一步的，对于用IL-21处理的NK细胞和未用IL-21处理的NK细胞中的每一种，NK细胞对实体瘤细胞的细胞毒性使用根据实验性实施例3的方法比较。AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000231
CRL-1739TM)、A549(肺癌，
Figure BDA0002612346760000232
CRL-185TM)和MDA-MB-231(乳腺癌，
Figure BDA0002612346760000233
HTB-26TM)被用作实体瘤细胞系。如在图10D中说明，与未用IL-21处理的NK细胞相比，用IL-21处理的NK细胞展现出更高的抗癌活性。
因此，通过使用本文提出的方法，即使对于通常未示出足够的NK细胞生长的某些癌症患者，也可产生NK细胞。
实验性实施例10.在治疗组合物中的NK细胞的存活率的确认
在培养的第6天，对于根据实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养3至6天。
在培养的第14天至第20天将CD56+ NK细胞洗涤三次，然后悬浮于包含1％白蛋白的基础化合物(生理盐水和Hartman溶液)中，达到2x107/mL。将细胞在4℃储存48小时，然后测量细胞存活率。
此外，为了比较IL-2的效果，洗涤CD56+ NK细胞并且悬浮于包含1％白蛋白的基础化合物(生理盐水和Hartman溶液或磷酸盐缓冲盐水)中，然后添加了500IU/mL浓度的IL-2。在4℃中保持48小时后，测量细胞存活率。
取100μL的每种组合物以获得总计2x106CD56+ NK细胞，用1mL的FACS染色缓冲液洗涤一次，离心分离并悬浮于100μL的膜联蛋白V结合缓冲液中。在悬液中添加5μL的膜联蛋白V-FITC和5μL的7-AAD(Biolegend)并充分混合，在黑暗条件下储存，并在室温反应15分钟，然后在流式细胞仪之前添加了400μL的膜联蛋白V结合缓冲液并混合5秒钟。此后，获得每试管10,000至100,000个细胞并分析。通过设置未用膜联蛋白V-FITC和7-AAD染色的试管作为阴性对照来确定临界值(cut-off)，通过膜联蛋白V-FITC或7-AAD为阴性的细胞部分的百分比表示存活率。
如在图11中说明的，当用IL-2(W/IL2)处理时，抑制CD56+ NK细胞的凋亡。
实验性实施例11.在治疗组合物中NK细胞的细胞毒性的确认
在培养的第6天，对于根据实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养3至6天。
在实验中使用之前，癌细胞系通过在以下条件下悬浮并以三天的间隔在37±1℃继代培养1周或更长时间来制备：
CCRF-SB(血液癌，
Figure BDA0002612346760000251
CCL-120TM)、AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000252
CRL-1739TM)和MIA-PACA2(胰腺癌，
Figure BDA0002612346760000253
CRL-1420TM)：RPMI培养基+10％FBS，
SNU245(胆管癌，KCLB No.00245)、HCT15(结肠癌，
Figure BDA0002612346760000254
CCL-225TM)和NIH:OVCAR-3(卵巢癌，
Figure BDA0002612346760000255
HTB-161TM)：RPMI培养基+10％FBS+25mM HEPES，和
MDA-MB-231(乳腺癌，
Figure BDA0002612346760000256
HTB-26TM)：DMEM培养基+10％FBS。
使用胰蛋白酶将培养期间的癌细胞系(除了血液癌细胞系)与培养皿分开，并且悬浮于培养基中，达到5×104/mL，然后按每孔1mL接种至24孔板中并附着一天。为了与NK细胞区别，血液癌细胞系(其为悬浮的培养细胞)用绿色荧光标记，悬浮于培养基中，达到5x104/mL，并且按每孔1mL接种至24孔板中。
首先，在癌细胞系之中，以AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000257
CRL-1739TM)、MIA-PACA2(胰腺癌，
Figure BDA0002612346760000258
CRL-1420TM)、SNU245(胆管癌，KCLB No.00245)、HCT15(结肠癌，
Figure BDA0002612346760000259
CCL-225TM)和MDA-MB-231(乳腺癌，
Figure BDA00026123467600002510
HTB-26TM)接种的24孔板中，在一天后添加CD56+ NK细胞以观察细胞毒性，并且效应细胞(CD56+ NK细胞)和靶细胞(癌细胞系)的比例在下表7中示出。
表7
效应器:靶 效应细胞 靶细胞
0:1 0 5x10<sup>4</sup>
1:1 5x10<sup>4</sup> 5x10<sup>4</sup>
1:10 5x10<sup>3</sup> 5x10<sup>4</sup>
1:20 2.5x10<sup>3</sup> 5x10<sup>4</sup>
将用效应细胞和靶细胞接种的平板在37±1℃培养1至3天，并且这时，为了观察是否抗癌活性因IL-2而增加，将500IU/ml的IL-2进一步添加至实验组。在阴性对照组中，未添加CD56+ NK细胞(效应细胞)，并且没有抗癌活性反应。
在培养1至3天后，将细胞用RPMI洗涤三次以除去以悬浮形式存在的CD56+ NK细胞，然后使用胰蛋白酶将孔中剩余的癌细胞系分开，用台盼蓝染色并且计数。随后，将用靶细胞和效应细胞接种的平板在37±1℃培养1至3天，然后将存在于24孔中的用绿色荧光标记的细胞使用流式细胞仪计数。
使用以下等式2计算对癌细胞系的细胞毒性。
等式2
Figure BDA0002612346760000261
结果，如在图12中说明的，与当仅处理CD56+ NK细胞(W/O IL2)时相比，当一起处理IL-2(W/IL2)时，确认癌细胞细胞毒性增加。
接下来，将CD56+ NK细胞添加在附着癌细胞之中的NIH:OVCAR-3(卵巢癌，
Figure BDA0002612346760000262
HTB-161TM)细胞的24孔板中，以观察细胞毒性，并且靶细胞(癌细胞系)和效应细胞(CD56+ NK细胞)的比例在以下表8中示出。
表8
效应器:靶 效应细胞 靶细胞
0:1 0 5x10<sup>4</sup>
1:1 5x10<sup>4</sup> 5x10<sup>4</sup>
0.1:1 5x10<sup>3</sup> 5x10<sup>4</sup>
0.05:1 2.5x10<sup>3</sup> 5x10<sup>4</sup>
将用效应细胞和靶细胞接种的平板在37±1℃培养1天，并且为了观察是否抗癌活性因IL-2而增加，将500IU/ml的IL-2进一步添加至实验组。在阴性对照组中，未添加CD56+NK细胞，并且没有抗癌活性反应。
在培养1天后，将细胞用RPMI洗涤三次以除去以悬浮形式存在的CD56+ NK细胞，然后使用照相机对孔中剩余的癌细胞系拍照。
结果，如在图13中说明的，与当仅用CD56+ NK细胞(-IL2)处理的癌细胞系相比，当将癌细胞系与IL-2(+IL2)一起处理时，癌细胞细胞毒性增加。
接下来，将CD56+ NK细胞添加在附着癌细胞系之中的AGS(胃癌，
Figure BDA0002612346760000263
CRL-1739TM)细胞的24孔板中，以观察细胞毒性。并且靶细胞(癌细胞系)和效应细胞(CD56+ NK细胞)的比例在以下表9中示出。
表9
效应器:靶 效应细胞 靶细胞
0:1 0 5x10<sup>4</sup>
1:1 5x10<sup>4</sup> 5x10<sup>4</sup>
0.1:1 5x10<sup>3</sup> 5x10<sup>4</sup>
0.05:1 2.5x10<sup>3</sup> 5x10<sup>4</sup>
将用效应细胞和靶细胞接种的平板在37±1℃培养1天，并且为了观察是否抗癌活性因IL-2而增加，将500IU/ml的IL-2进一步添加至实验组。在阴性对照组中，未添加CD56+NK细胞，并且没有抗癌活性反应。
在培养1天后，将细胞用RPMI洗涤三次，以除去以悬浮形式存在的CD56+ NK细胞，然后使用照相机对孔中剩余的癌细胞系拍照。
结果，如在图14中说明的，与当仅用CD56+ NK细胞(-IL2)处理的癌细胞系相比，当将癌细胞系与IL-2(+IL2)一起处理时，癌细胞细胞毒性增加。
实验性实施例12.在动物模型中NK细胞的抗癌效果的确认
除了使用结肠直肠癌患者的PBMC，CD56+ NK细胞根据实施例1、2和比较实施例1、2的方法产生17天。在T 25培养瓶中在培养的第6天，对于根据实施例1、2和比较实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋并且进一步培养3至6天。
人类癌症的动物模型通过将人类癌细胞系异种移植到小鼠中构建。使用以下人类癌细胞系：AGS(胃癌)、MIA-PACA2(胰腺癌)、SNU245(胆管癌)、HCT15(结肠癌)和NIH:OVCAR-3(卵巢癌)和MDA-MB-231(乳腺癌)。在癌症异种移植后，小鼠被随机地分组和标记。对照组向尾静脉注射200μL的哈特曼氏溶液(Hartmann’s solution)。从癌症异种移植后1周开始，NK细胞处理(+IL-2)组以2-3天间隔以1×107NK细胞/200μL和500IU/mL的IL-2向尾静脉注射五次。从癌症异种移植后1周开始，NK细胞处理(-IL-2)组以2-3天间隔以1×107NK细胞/200μL向尾静脉注射五次。
为了跟踪肿瘤生长，在研究时期期间，每周三次对小鼠测试体重和肿瘤体积。使用卡尺测量长轴和短轴的长度，并且根据以下等式(等式3)确定肿瘤体积。
等式3
肿瘤体积(mm3)＝(长轴的长度(mm))x(短轴的长度(mm))2x0.5
基于每种癌症类型的萤光素酶图像，与对照组相比，NK细胞处理(-IL-2)组展现出在8周处理后肿瘤生长减少了大约50％。对于每种癌症类型，与对照组相比，NK细胞处理(+IL-2)组展现出肿瘤生长进一步减少了大约60％。
实验性实施例13.癌症患者中NK细胞的抗癌效果的确认
除了使用结肠直肠癌患者的PBMC，CD56+ NK细胞根据实施例1、2和比较实施例1、2的方法产生18天。在T 25培养瓶中，在培养的第6天，对于根据实施例1、2和比较实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且进一步培养3至6天。
结肠直肠癌患者被随机分组和标记。对照组未用NK细胞注射。将NK细胞处理(+IL-2)组用每kg体重1-3×107NK细胞/和500IU/mL的IL-2以六周间隔静脉注射三次。NK细胞处理(-IL-2)组用每kg体重1-3×107NK细胞以六周间隔静脉注射/六次。
肿瘤生长在1、3、6、12个月监控。在12个月后，NK细胞处理(-IL-2)组展现出肿瘤尺寸的整体减小，并且NK细胞处理(+IL-2)组展现出肿瘤尺寸的进一步整体减小。
实验性实施例14.阿尔茨海默氏病患者中NK细胞的抗癌效果的确认
除了使用结肠直肠癌患者的PBMC，CD56+ NK细胞根据实施例1、2和比较实施例1、2的方法产生18天。在T 25培养瓶中，在培养的第6天，对于根据实施例1、2和比较实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养3至6天。
阿尔茨海默氏病患者被随机分组和标记。对照组未用NK细胞注射。NK细胞处理组以每kg体重1-3×107NK细胞和500IU/mL的IL-2以每周间隔静脉注射六次。
患者的认知功能在1、3、6、12个月监控。在12个月后，NK细胞处理组展现出改善的认知功能。
实验性实施例15.自身免疫性疾病患者中NK细胞的抗癌效果的确认
除了使用结肠直肠癌患者的PBMC，CD56+ NK细胞根据实施例1、2和比较实施例1、2的方法产生18天。在T 25培养瓶中，在培养的第6天，对于根据实施例1、2和比较实施例1、2在CO2培养箱中培养的每种NK细胞，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种到350mL袋中并且进一步培养4天。在培养的第10天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养4天。最终，在培养的第14天，将细胞基于1.0x105至2.0x106/mL的细胞数量接种至1L的袋中并且然后进一步培养3至6天。
多发性硬化患者被随机分组和标记。对照组未用NK细胞注射。NK细胞处理组以每kg体重1-3×107NK细胞和500IU/mL的IL-2以每周间隔静脉注射六次。
患者的认知功能在1、3、6、12个月监控。在12个月后，NK细胞处理组展现出改善的认知功能。
术语学
示例性实施方式的前述描述仅为了说明和描述的目的已提出，而并非旨在详尽的或限制发明为公开的精确形式。鉴于以上教导，许多修改和变化是可能的。可以预期，以上公开的实施方式的特定特征和方面的各种组合或子组合可被做出并且仍然落入发明的一个或多个内。此外，与实施方式有关的任何特定特征、方面、方法、性质、特性、质量、属性、元素等的本文公开内容可在本文提出的所有其他实施方式中使用。因此，应当理解，公开的实施方式的各种特征和方面可以彼此组合或取代，以便形成公开的发明的不同模式。因此，旨在本文公开的本发明的范围不应受到以上所述的特定公开的实施方式的限制。而且，尽管本发明易于进行各种修改和替代形式，但是其具体实施例已经在附图中示出并且在本文中详细地描述。然而，应当理解，本发明不限于公开的特定形式或方法，相反地，发明将覆盖落入描述的各种实施方式和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。本文公开的任何方法不需要以所叙述的顺序进行。本文公开的方法包括从业者采取的某些操作；然而，它们也可包括那些操作的任何第三方说明，无论是明示还是暗示。本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。
选择和描述实施方式为了解释本发明的原理及它们的实际应用，以便使得本领域的其他技术人员来利用本发明和各种实施方式和用适合于预期的特定用途的各种修改。替代的实施方式通过所附权利要求而不是前述说明和其中描述的示例性实施方式对本发明限定的本领域技术人员而言将变得显而易见。
除非另外特别的说明或使用在上下文内的另外理解，否则条件语言如“可”(“can”)、“可以”(“could”)、“可能”(“might”)或“可”(“may”)通常旨在传达某些实施方式包括，而其他实施方式不包括，某些特征、元素和/或步骤。因此，这种条件语言通常不旨在暗示特征、元素和/或步骤是以对一个或多个实施方式需要的任何方式。
术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“具有(having)”等是同义词，且以开放式方式包含地使用，并且不排除另外的元素、特征、动作、操作等。同样，术语“或”在其包含的含义中使用(和不是其排他的含义中使用)，以便当使用时，例如，连接元素的列表，术语“或”意味着列表中元素的一个、一些或所有。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”、“在...之间”等的语言包括所列举的数字。
如本文所用的数字之前的术语如“近似(approximately)”、“约(about)”和“基本上”的包括所列举的数字(例如，约10％＝10％)，并且还代表接近仍进行所需功能或达到所需结果的所述量的量。例如，术语“近似”、“约”和“基本上”可指的是所述量的小于10％内、小于5％内、小于1％内、小于0.1％内和小于0.01％内的量。
如本文所用的术语“通常地”代表主要地包括或趋向于特定值、量或特征的值、量或特征。作为实例，在某些实施方式中，术语“通常地均匀”指的是偏离完全地均匀小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％和小于0.01％的的值、量或特征。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及其组合。如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”、“在...之间”等的语言包括所列举的数字。数字之前的术语如“近似”或“约”包括所列举的数字。例如，“约5.0cm”包括“5.0cm”。
一些实施方式已经结合示意图描述。然而，应当理解，示意图不是按比例绘制的。距离仅是示例性的，不必要与说明的设备的实际尺寸和布局具有准确的关系。
为了该公开内容的目的，本文描述了某些方面、优点和新颖特征。应当理解，依照任何特定实施方式，不一定可以实现所有这种优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本公开内容可以以实现本文教导的一个优点或一组优点的方式来体现或进行，而不必实现本文教导或建议的其他优点。
此外，尽管本文已经描述了示例性实施方式，基于本公开内容本领域技术人员将理解，具有等同要素、修改、省略、组合(例如，跨越各个实施方式的方面的)、改编和/或替换的任何和所有实施方式的范围。权利要求中的限制应基于权利要求中应用的语言来广义地解释，并且不限于本说明书中或在本申请的审查期间描述的实施例，这些实施例应被解释为非排他性的。此外，公开的过程和方法的操作可以以任何方式修改，其包括通过对操作重新排序和/或插入其他操作和/或删除操作。因此，认为本说明书和实施例仅被认为是示例性的，真正的范围和精神由权利要求及它们等同的全部范围表示。

Claims (41)

1.一种扩增培养中的天然杀伤细胞的方法，其包括：
从血液样品中分离外周血单核细胞 (PBMC)；
从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种；和
在至少两种细胞因子的存在下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养；
其中所述饲养细胞的组合包括辐照的Jurkat细胞和辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞，
其中所述至少两种细胞因子包括IL-2和IL-21。
2.权利要求1所述的方法，其中从所述PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞的至少一种通过使用CD56微珠和CD3微珠中的至少一种进行。
3.权利要求1所述的方法，其中所述至少两种细胞因子进一步包括选自由IL-15、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、IGF 1及其组合组成的组的一种或多种细胞因子。
4.权利要求1所述的方法，其中IL-2以50-1000 lU/mL的浓度添加。
5.权利要求1所述的方法，其中IL-21以10-100 ng/mL的浓度添加。
6.权利要求1所述的方法，其中辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞的比例是1:0.1-5或0.1-5:1。
7.权利要求1所述的方法，其中所述共培养包括共培养1-50天。
8.权利要求1所述的方法，其进一步包括：
在IL-2的存在下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与所述饲养细胞的组合共培养第一周期；和
在IL-21的存在下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与所述饲养细胞的组合共培养第二周期。
9.权利要求8所述的方法，其中在所述第二周期的第0-6天期间添加IL-21不止一次。
10.权利要求8所述的方法，其中在所述第二周期的第0-6天期间添加IL-21和所述饲养细胞的组合不止一次。
11.权利要求8所述的方法，其中在所述第二周期期间在每个十四天循环的前六天期间添加IL-21不止一次。
12.权利要求1所述的方法，其中将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与所述饲养细胞的组合以CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞和饲养细胞1:1-100的比例共培养。
13.通过权利要求1所述的方法制备的组合物。
14.一种扩增培养中的天然杀伤细胞的方法，其包括：
从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；
从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种；和
在至少两种细胞因子的存在下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养；
其中所述饲养细胞的组合包括辐照的Jurkat细胞和辐照的Epstein Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞，
其中所述至少两种细胞因子包括IL-2和IL-21，和
其中在培养的扩增期间间隔补充所述饲养细胞和所述细胞因子两者。
15.权利要求14所述的方法，其中从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种通过使用CD56微珠和CD3微珠中的至少一种进行。
16.权利要求14所述的方法，其中以10-100 ng/mL的浓度添加IL-21。
17.权利要求14所述的方法，其中在下列周期中的每个期间添加IL-21一次或多次：第0-6天；第14-20天；和第28-34天。
18.权利要求14所述的方法，其中所述共培养包括共培养1-50天。
19.一种细胞治疗组合物，其包括：
治疗有效量的CD56+和/或CD3-/CD56+ NK细胞中的至少一种，其中所述细胞治疗组合物中NK细胞的纯度相对于所述细胞治疗组合物中的其它细胞为至少90%；
50-50,000 IU/mL浓度的IL-2；和
药学上可接受的载体；
其中所述细胞治疗组合物是以适于施用至需要NK细胞疗法的人患者的形式。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述治疗有效量是每kg所述人患者体重1 x 106至1x 1011的NK细胞。
21.权利要求20所述的组合物，其中所述组合物在4 ˚C。
22.一种包含细胞组合物的袋，所述组合物包括：
每kg人受试者体重1 x 106至1 x 1011的NK细胞，其中所述NK细胞是衍生自外周血单核细胞(PBMC)的CD56+和/或CD3-/CD56+细胞，其中所述NK细胞为至少90%纯度，其中在所述袋中的小于1% 的细胞是T细胞；
50-50,000 IU/mL 浓度的IL-2；和
药学上可接受的载体，其包括哈特曼氏溶液、白蛋白、DMSO和无IL-21。
23.权利要求19所述的细胞治疗组合物，其中IL-2以50-1,000 IU/mL存在。
24.权利要求23所述的细胞治疗组合物，其中所述细胞治疗组合物不包括IL-21。
25.权利要求24所述的细胞治疗组合物，其中所述细胞治疗组合物在2 ˚C和8 ˚C之间。
26.权利要求25所述的细胞治疗组合物，其中所述细胞治疗组合物在4˚C。
27.权利要求19所述的细胞治疗组合物，其中IL-2以500 IU/mL存在。
28.一种细胞组合物，其包括：
CD56+和/或CD3-/CD56+ NK细胞中的至少一种，其中在所述细胞组合物中所述NK细胞的纯度相对于所述细胞组合物中的其它细胞为至少90%；
50-50,000 IU/mL浓度的IL-2；
药学上可接受的载体，其包括：
DMSO，和
无IL-21,
其中所述细胞组合物是以适于施用至人患者的形式。
29.权利要求28所述的细胞组合物，其中IL-2以50-1,000 IU/mL存在。
30.权利要求29所述的细胞组合物，其进一步包括哈特曼氏溶液。
31.权利要求30所述的细胞组合物，其进一步包括白蛋白。
32.权利要求31所述的细胞组合物，其中所述白蛋白以1%存在。
33.权利要求31所述的细胞治疗组合物，其中IL-2以500 IU/mL存在。
34.权利要求31所述的细胞组合物，其中所述细胞组合物在2 ˚C和8 ˚C之间。
35.权利要求31所述的组合物，其中所述组合物在4 ˚C。
36.一种细胞组合物，其包括：
CD56+和/或CD3-/CD56+ NK细胞中的至少一种，其中所述细胞组合物中所述NK细胞的纯度相对于所述组合物中的其它细胞为至少90%；
500-50,000 IU/mL浓度的IL-2；
药学上可接受的载体，
其中所述细胞组合物是以适于施用至人患者的形式。
37.权利要求36所述的细胞组合物，其中所述细胞已储存至少24小时。
38.权利要求36所述的细胞组合物，其中所述细胞已储存至少48小时。
39.权利要求1-12或14-18中任一项所述的方法，其中IL-2是人IL-2和/或IL-21是人IL-21。
40.权利要求13所述的组合物，其中IL-2是人IL-2和/或IL-21是人IL-21。
41.权利要求19-21和23-38中任一项所述的组合物或权利要求22所述的袋，其中IL-2是人IL-2。
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