JPH04503607A

JPH04503607A - 固定化サイトカイン類

Info

Publication number: JPH04503607A
Application number: JP2505214A
Authority: JP
Inventors: ボジカ、ジェラルド・ジェー; コーニーリアス、デニス・エイ; ギルバート、カール・ダブリュ
Original assignee: イムノセラピューティックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1989-02-24
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1992-07-02
Also published as: CA2047730A1; EP0460101A4; WO1990009798A1; EP0460101A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】固　定　化　サ　イ　ト　カ　イ　ン　類技術分野本発明は、固体支持体に固定化されたサイトカイン類に関するものである。

発明の背景総括的にサイトカインと呼ばれる若干の生物活性伝達物質は、様々な細胞により産生される。サイトカイン類は、正常なホメオスタンスを維持するため、並びに病的刺激、例えば免疫学的、感染および炎症プロセスに応じて偏性的に産生される。リンパ球の産物として最初に報告されたサイトカインは、「リンホカイン」と称されることが多く、単核白血球の産物として最初に報告されたサイトカインは、「モノカイン」と呼ばれている。また、ある種のサイトカイン類は、細胞生長に対するそれらの作用に基づき、成長因子またはコロニー刺激因子と称される。

サイトカイン類の例としては、リンホカイン類インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン（ＩＬ−３）、モノカイン・ガンマ・インターフェロン並ヒに成長因子か数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣ５Ｆ）およびエリトロポエチン（ＥＰＯ）がある。

様々なサイトカインは、内在性調節物質（オートタリン）および／または細胞間シグナルとして機能する。単一生物活性によって最初に認識されｔ；これらのサイトカイン類の多くは、相互依存的に作用して生物学的応答を増幅させることが多い、多数の部分的に重複する生物活性を有することが示された。標的細胞に対する最終的な作用には、成長、移動性、分化および／または蛋白質合成の調節がある。

リンパ球活性化因子としても知られているインターロイキン−１（ＩＬ−１）は、ヒト単核白血球、リンパ球、内皮細胞および線維芽細胞により産生される。ＩＬ−１は、表現型細胞表面マーカーにおける変化が示す通り、リンパ球の分化を促す。さらに、ＩＬ−１は、Ｔ−リンパ球機能を刺激し、リンホカイン類、例えばＩ　Ｌ−２、コロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ）、Ｂ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）、ガンマ・インターフェロン（γ−ＩＦＮ）８よびりンパ球誘導走化性因子（ＬＤＣＦＸ各々それら自体の生物学的作用を有する）の産生を増加させる。またＩＬ− １は、８９７３球のインビトロ増殖、分化および抗体産生機能を増大させる。これらおよび他の生物学的活性を有することから、ＩＬ−１は、多様なインビボおよびインビトロ用途における貴重なリンホカインである。

インターロイキン−２ＣＩＬ−２）は、最初、１９２３球の増殖を誘導し得、正常な１９２３球を培養中で連続的に維持し得ることからＴ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）と呼ばれた。ＩＬ−１と同様、ＩＬ−２は、多様なインビボおよびインビトロ適用において有用であることが見出されｔ；。Ｉ　Ｌ−２は、ワクチンのアジュバントとして使用されｔ；場合、マラリア種虫ペプチドに対する遺伝学的非反応性を克服し、単純性はう疹および狂犬病ウィルスに対する防御力を向上させる。Ｍ、Ｆ　、グツド等、「ジャーナル・オブ・イムノロジーＪ、１４】、９７２（１９８８）およびＡ、バインバーブ等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４０．２９４（１９８８）参照。

インビトロＩＬ−２は、その生物学的活性の中で、薬剤として使用された場合、リンホカイン活性化キラー細胞、腫よう浸潤性リンパ球および細胞毒性Ｔ細胞として知られている一群のさらに選択性の高いＴ細胞集団の増殖および分化を誘発する。それらの細胞は、異聾的正常標的細胞並びに免疫原性および非免疫原性の？ｌｌ１ｌｌよう細胞に対して細胞毒性を示すことがインビトロで立証された。

Ｓ、Ａ。

ローゼンバーグ、「ジャーナル・オブ・ナシ璽ナル・キャンサー・インスティテユート」、７５．５９５（１９８５）、Ｓ、Ａ、ローゼンバーグ、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１２１％　１９５１（１９７８）およびＳ、Ａ、ローゼンバーグ等、「サイエンス」、２３３．１３１８（１９８６）参照。

インビトロ・リンホカイン活性化キラー細胞をインターロイキン−２のインビボ投与と組み合わせて使用することにより、抗腫よう作用の改良が達成された。インビトロＩ　Ｌ−２活性化キラー細胞の注入およびＩ　Ｌ−２の同時投与は、動物およびヒ□トの両方で抗腫よう活性を立証した。上記活性は、一般にＩ　Ｌ− ２またはりンホカイン活性化キラー細胞を個々に使用した場合に観察される活性を凌ぐ。

Ｊ、Ｊ、ムール等、「サイエンス」、２２５．１４８７（１９８４）、Ｒ，ラフレニアおよびＳ、Ａ、ローゼンバーグ、「キャンサー・リサーチ」、４５．３７３５（１９８５）、Ｓ、Ａ、ローゼンバーグ等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン」、３１６．８８９（１９８７）、Ｊ、Ｊ、ムール等、「ジャーナル・オプ・イムノロジー」、１３６．３８９９（１９８６）、Ｈ，Ｗ、ウェスト等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メデイシン」、３１６．８９８（１９８７）、Ｓ、Ａ、ローゼンバーグ等、「ニューイングランド・ −ジャーナル・オブ・メデイシン」、３１３．１４８５（１９８５）参照。

ヒト悪性腫ようから得られた腫よう浸潤性リンパ球の生長は、インビトロで６０日以下の期間インターロイキン−２により誘導されｔ；。これらのリンパ球は、肺癌患者においてインターロイキン−２の同時静脈内投与を伴わずに投与した場合にヒト抗腫よう活性を示した。Ｒ，Ｌ、クラディン等、Ｃａｎ、’１ｍｍｕｎｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、、２４．７６（１９８７）参照。

Ｔｍ胞ｌこより合成される追加的サイトカインｌＩ４二は、遊走阻止因子（マクロファージのランダムな移動を阻止する）、白血球阻止因子（好中球のランダムな移動を阻止する）、マクロファージ活性化因子（マクロファージの細胞溶解活性を増強する）、繊維芽細胞活性化因子（繊維芽細胞の増殖を刺激する）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３Ｘコロニー刺激因子と似た活性）がある。

サイトカイン活性に関する機構的詳細は確実には知られていないが、活性の全般的機構は、１）特異的細胞表面レセプターへのサイトカインの結合、２）ある種の「細胞表面活性化」事象の開始、および３）内部相互作用の結果、増殖、生長、分化および／または特殊細胞機能の発現が行なわれるサイトカインーレセプター複合体の内面化という段階を含むものと考えられている。

＾体的には、ＩＬ−２の場合、Ｉ　Ｌ−２とＴ細胞の相互作用では、低親和力レセプター、ＩＬ２Ｒｂとの最初の相互作用の結果、ＩＬ−２との高親和力複合体を形成する第２レセプター分子、ＩＬ２Ｒａが誘導されるものと考えられている。高親和力複合体と！Ｌ−２の会合の結果、増殖が行なわれる。活性化および増殖のこのプロセスでは、ＩＬ−２レセプター複合体の内面化および後続の表面ＩＬ−２レセプターの数の減少が存在する。Ｋ、Ａ、スミス、「サイエンス」、２４０、ｌ　１６９（１９８８）参照。

細胞表面会合事象は活性に充分なものであり、レセプター−リガンド複合体の内面化は少なくともある種の場合には要求されないことが示唆されている。臭化シアン活性化によりセファロースに結合させたブタインシュリンおよびネズミ・アルファ／ベータ・インターフェロンは、細胞表面会合事象を通して生物学的活性を有することが報告されている。Ｐ、クアトレカセス、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ」ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ユナイテッド・ファージ・オブ・アメリカＪ、６３．４５０（１９６９）、）ｆ、アンケル等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ画ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ユナイテツド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７０，２３６０（１９７３）およびＣ，チャニー等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ソサエティー・７オー・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディシン」、１４７．２９３（１９７４）。

特に形成された特定共有結合の不安定さが知られていることから、これらの報告の正確さは当業界では疑われている。Ｗ、Ｈ，スコウテン、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、クラウス・モスバッハ編、アカデミツク・プレス・バプリッシャー、１３５．３１（１９８７）参照。内面化の必要性の問題は、依然として論争点のままである。Ｅ、トメイヤーおよびＪ、ドメイヤー−ギブナンド、「インターフェロン・アンド・アザ−・レギュレイトリー・サイトカインズ」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・パブリッシャー、６７６７−９０（１９８参照。

サイトカイン類、例えばＩＬ−２のコスト、利用能および毒性は、生物活性剤としてのサイトカインの有用性における制限因子であり得る。従って、可能な限り毒性の低いサイトカインを再使用および／まｔ；はより少ない量を使用し、かつそれらの生物学的活性のかなりの量を保持できることが望ましい。

従って、対応する可溶性または遊離サイトカイン類と比べて同等または場合によっては改曹されｔ；生物学的活性を保持している修飾サイトカイン、すなわち再使用されても生物活性を刺激し得る、および／または著しく少量で使用され得る生物活性サイトカインの提供が永続的に要望されている。

発明の簡単な記載本発明は、固体、好ましくは生物学的融和性で不溶性の固定化支持体に堅固に結合させたサイトカインを含む固定化サイトカインを提供する。結合サイトカインは、支持体に結合されたとき遊離サイトカインの活性を実質的に保持している。

従って、結合したサイトカインは、生物活性の刺激に対して反復的に利用（再使用）および／または対応する可溶性または遊離サイトカインよりも著しく少ない総量で使用され得る。

本発明で有用なサイトカイン類には、ＩＬ−１％　ＩＬ−２、ＩＬ＝３、Ｉ　Ｌ −４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、腫よつ壊死因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ　）、ガンマ−インターフェロン、アルファーインターフェロン、ベーターインターフェロン、ユリトロボエチン（ＥＰＯ）、か数球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、ネズミか数球コロニー刺激因子（ＭｕＧ　ＣＳ　Ｆ　）、か数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳ　Ｆ）、ネズミか数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＭｕＧＭＣ３Ｆ）、インシュリン様成長因子Ｉ（Ｉ　ＬＧＦ−１）、インシュリン様成長因子１１（ＩＬＧＦ−１１）、腫よう増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、類表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）および線維芽細胞成長因子−ベーシック（ＦＧＦｂ）があるが、これらに限定されるわけではない。好ましいサイトカイン類には、実施例記載のもの、およびさらに好ましくはＩＬ−２、ＧＭＣ５Ｆ。

ＧＣＳＦ、ＥＰＯ％ＴＮＦ、ＦＧＦｂ、ＴＧＦｂ、ＥＧＦおよびＰＤＧＦがある。

サイトカインは、好ましくは共有結合、好ましくは結合アームにより生物学的融和性の粒子支持体に結合している。サイトカインは、好ましくは固定化によりサイトカインの活性を安定させ得る形で支持体へ堅固に結合している。すなわち、活性は耐久性があり再使用可能である。

この明細書で使用されている「実質的遊離サイトカインの活性」は、サイトカインの１つまたはそれ以上の活性部位の少なくとも１つが活性を保持しＩ；状態であり、結合サイトカインとして顕著な生物活性を生じることを意味する。言い替えれば、サイトカインは多数の部分的に重複することが多い生物学的または調節作用を有するため、本発明の結合サイトカインは、遊離サイトカインの活性と同一まｔ；は類似した１つまたはそれ以上の活性を示し得る。すなわち、本発明の固定化サイトカインの有効性を立証する場合、１つまたはそれ以上の生物活性は固定化により安定化され得る。すなわち、少なくとも１つの活性は結合状態で保存されており、場合によっては支持体へのサイトカインの結合により高められ得る。

結合アームの構造まｔ；は長さは、結合サイトカインの生物活性を最適化すべく変化し得る。好ましい結合アームは、（ａ）一般式ＮＨＩ−Ｒ’−ＮＨ，（式中、Ｒ１はｃ、−ｃ、。アルキル基である）を有するジアミン類、（ｂ）一般式Ｎ　Ｈ！　−Ｒ”　ＣＯ＊　Ｈ（式中、Ｒ１はＣｒ−Ｃｘ。

アルキル基である）を有するアミノ酸および（Ｃ）一般式０ＨＣ−Ｒ”−ＣＨｏ（式中　Ｒ１はＣｒ　−Ｃｔ。アルキル基である）を有するジアルデヒド類から成る群から選ばれた１つまｔ；はそれ以上の結合基を含む。

有用な支持体には、繊維、ミクロスフイア、ビーズ、粒子、膜、シートなどがあるが、これらに限定されるわけではない。

この明細書で使用されている「サイトカイン」は、サイトカインの天然または組換え形態、並びにサイトカインの修飾配列、生物活性７ラグメントまたは部分、サイトカインの遺伝学的または化学的修飾形態、生物学的に均等な合成リガンドまたはそれらの混合物（これらは、対生物活性の実質的に均等なプロフィールまたは対生物活性の原プロフィールの一部分を呈する）を包含する。

また、本発明は、サイトカイン依存セルライン、例えばＩＬ−２依存セルラインを本発明の固定化サイトカインの有効量と接触させることによりその成長を誘導することを含む、増殖、生長、分化および／または特殊細胞機能の発現を目的とするインビトロおよびインビボの両方での固定化サイトカイン類の使用方法を提供する。

図面の要約図１は、ＩＬ−２のアミノ基により固定化したｒＬ−２の場合と比べた。ＩＬ− ２のカルボキシル基により固定化したＩＬ−２を用いた場合のＣＴＬＬ−２細胞（ＤＰＭＸＩＯ一つの生長をグラフで示しｔ二図である。

図２は、［”Ｈ］チミジン取り込みにより測定された（ＤＰＭＸＩＯ一つ、ＣＴＬＬ−２細胞、細胞毒性１９７３球セルラインの成長に、対する固定化ＩＬ−２の濃度依存性（初期カップリング反応におけるＩＬ−２のμｇ）をグラフで示した図である。

図３は、可溶性ＩＬ−２を用いた場合のＣＴＬＬ−２細胞の成長」；対する時間（時）の関数として、固定化ＩＬ−２を用いた場合のＣＴＬＬ−２細胞（ＤＭＰｘｌＯ−”）の生長をグラフで示した図である。

図４は、可溶性ＩＬ−２を用いた場合のＰＢＬの成長に対する時間（時）の関数として、固定化！Ｌ−２を用いた場合のヒト末梢血リンパ球ＣＤＰＭ中ＰＢＬＸＩＯ−”）の成長をグラフで示した図である。

図５Ａ８よび５Ｂは、可溶性（５Ａ）または固定化（５Ｂ）ＭｕＧＭＣ５Ｆを与えたマウスの白血球数の増加により測定された、か数球生成の刺激をグラフで示した図である。

図６は、可溶性または固定化組換えネズミＧ　Ｍ　ＣＳ　Ｆ　（ｒＭｕＧ　ＭＣ５Ｆ）を与えたシクロホスファミド装置マウスの白血球数の増加により測定された、か数球生成の刺激をグラフで示した図である。

図７は、ＳＤＳ洗浄後の吸着ｒＭｕＧＭＣＳＦと対比させｔ；その保持状態により測定された、共有結合ｒＭｕＧＭＣ５Ｆの安定性をグラフで示した図である。

発明の詳細な記載サイトカイン類インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ミズーリ、セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニーにより培養ラットひ臓細胞（ＴＤ８９２）から誘導され、Ｔ細胞成長因子（ヒト・インターロイキン−２組換え体、Ｔ３２６７）として市販されている。また、組換えＩＬ−２（、ａｌａ　−１２５類縁体および天然配列）は、カリフォルニア、サウザンド・オークスのアムゲンにより市販されている。

天然配列組換えインターロイキン−３（ＩＬ−３）、天然配列組換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）および天然配列組換えインターロイキン−６（Ｉ　Ｌ− ６）は、カリフォルニア、サウザンド・オークスのアムゲンにより市販されている。

組換えヒトか数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ｒＨｕＧＭＣ３Ｆ）、組換えヒトか数球コロニー刺激因子（ｒＨｕＧ　ＣＳ　Ｆ　）、組換えヒト・ユリトロボエチン（ｒＨｕＥＰＯ）、組換えネズミか数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ｒＭｕＧ　Ｍ　ＣＳ　Ｆ　）、組換えヒト・ガンマ・インターフェロン（ｒＨｕｌＦＮ−ガンマ）および組換えヒト類表皮成長因子（ｒＨｕＥ　Ｇ　Ｆ　）および繊維芽細胞成長因子−べ−シック（ＦＧＦｂ）は全て、カリフォルニア、サウザンド・オークスのアムゲンから入手され得る。組換えヒト血小板誘導成長因子（ｒＨｕＰＤＧＦ）、組換えヒトインシュリン様成長因子１（ｒＨｕｌＬＧＦ−１）、組換えヒトインシュリン様成長因子ＩＩ（ｒＨｕ　Ｉ　Ｌ　Ｇ　Ｆ　−ＩＩ）および腫よう増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）は、カリフォルニア、トランスのベイケムにより市販されている。ブタ腫よう増殖因子ベータ（ｐＴ　Ｇ　Ｆ−ベータ）は、ミネソタ、ミネアポリスのアール・アンド・ディー・システムにより市販されている。また、腫よう増殖因子ベータは、マサチューセッツ、ベッド７オードのコラポラティブ・リサーチにより市販されている。組換えインターフェロン・アルファは、ロンユ・ラボラトリーズから口７エロン（商標）として市販されている。

また、ある種のサイトカインの生物活性部分も単離された。本発明はま！；、適当な支持体へのサイトカインの生物活性部分の結合を含む。

ＩＬ−１は、多くのＴ細胞クローンに関するオートタリン成長因子としてのその機能を含め、リンパ球集団に対する多数の作用を有−１゜また１Ｌ−１は、胸腺細胞増殖、およびミトゲン、名目抗厚十抗厚１ａｖｃ厚またはアロ抗原刺激ヘルパーＴ細胞の強力な刺激物質である。ＩＬ−１は、インターロイキン−２レセプター発現および抗原−レセプター複合体に対するモノクローナル抗体の存在下におけるヒト末梢子細胞の！Ｌ−２分泌を高める。さらに、ＩＬ−１は、休止Ｔ細胞のＣｏｎＡ活性化に関するコファクターとして作用し、ＩＬ−１に対する高親和カレセプターを発現するリンパ球の増殖に必要とされる。ＩＬ−１は、炎症浸潤物の発生において機能すると考えられているヒト肺内皮により産生される。

゛まだ、ＩＬ−１は造血活性の調節物質である。ＩＬ−１は、内皮細胞によるか粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣ５Ｆ）およびか数球コロニー刺激因子（ＧＣ３Ｆ）の放出を誘導し、すなわちＩＬ−１が炎症中にか数球生産および機能を変調する機構を提供する。ＩＬ−１はまた、単核白血球からＧＭＣ５Ｆを放出させ、ヒト造血前駆体の成長因子依存性増殖を促進する。

ＩＬ−１は、その抗腫よう活性により、進行中のＴ細胞応答を増すことによる比較的大きな免疫原性ネズミ肉腫の完全な退行を誘発することを示した。ＩＬ−１は、ヒトＡ３７５メラノーマ細胞に対するインビトロ直接細胞毒性作用を有する。ＩＬ−１はまた、リンホカイン活性化キラー細胞の生産においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）との相乗作用を示した。

リンパ球機能、造血の調節物質としてのＩＬ−１のこの広い範囲の活性およびリンパ球抗腫よう活性故に、ＩＬ−１は、多様なインビボおよびインビトロ用途における貴重なサイトカインである。例えば、Ｔ、ホアング等、「ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシン」、１６８．４’６３（１９８８）、Ｒ，Ｊ、　ノース等、「ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メデイシンＪ、１６８．２０３１（１９８８）、Ｂ、タルタコフスキー等、「ジャーナル・才ブ・イムノロジー」、１４１，３８６３（１９８８）、Ａ、Ｈ，リヒトマン等、［プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．９６９９（１９８８）、Ｂ、Ｓ、ポホナー等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１３９．２２９７（１９８７）およびＶ、Ｃ，プラウディ等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１３９．４６４（１９８７）参照。

マルチコロニー幹細胞活性化因子またはマルチコロニー刺激因子としても知られているインターロイキン−３（ＩＬ−３）は、糖蛋白造血成長因子である。ＩＬ −３は、多くのを髄細胞系統に共通した初期幹細胞および始動細胞の両方を刺激し得るため、広い範囲の活性を有する。ＩＬ−３は、１４０キロダルトンの細胞表面燐蛋白質に結合する。霊長類では、ＩＬ−３の連続注入の結果、白血球数の遅延した適度な増加が生じる。しかしながら、ＩＬ−３は、低用量のか粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子による後続の処置に対する応答に対して著しい相乗作用を有し、これは、ＩＬ−３が、完全な発生に対して後続第２因子を必要とする初期系統細胞に対して作用することを示唆している。この仮定は、Ｉ　Ｌ −３が芽細胞によるコロニー形成の促進においてより有効であることを示す組織培養試験と矛盾しない。さらに、ＩＬ−３自体は、インビトロ・コロニー形成を助けないが、後期作用因子、例えば６ＭＣ５Ｆを必要とする。ｒＬ−３は、ＩＬ −６と相乗作用して初期弁ｍ胞コａニー形成を助け、か数球コロニー刺激因子（ｃｃｓＦ）と相乗作用して好中球形成を促進し、６ＭＣ５Ｆと相乗作用してか粗球およびマクロファージ・コロニー形成を促進する。造血性サイトカインとしてのこの広い範囲の活性故に、ＩＬ−３は造血性サイトカイン療法にとって貴重なアジュバントとなっている。

他のサイトカイン類と同様、ＩＬ−３はまた、リンホカイン活性化キラー細胞の阻止により立証されている通り、員の調節作用を有する。現在まで、ＩＬ−３は、ＢＪａ胞前駆体の特徴を示すネズミ胎児肝臓または成熟骨髄由来のＩＬ−３依存性クローンにより立証されている通り、初期Ｂ細胞発生の調節に関与する唯一のサイトカインであった。例えば、Ｒ，Ｅ、ドナヒユー等、「サイエンス」、２４１％　ｌ　８２０（１９８Ｂ）、Ｒ，Ｊ　、イスフォート等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ１ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．７９８２（１９８８）、Ｄ、レニツク等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４２．１８１（２９８９）およびＧ、ギヤラファー等、「クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー」、７４．１６６（１９８８）参照。

インターロイキン−４（Ｉ　Ｌ−４）は、Ｂ細胞刺激因子−１（Ｂ　５Ｆ−１）、Ｂ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）およびＢ細胞成長因子１（ＢＣＧＦ−１）としても知られている。ネズミ系では、ＩＬ−４は、リポ多糖類活性化細胞において免疫グロブリンＩｇＧ１およびＩｇＥ生産を促進し、Ｂ細胞における組織適合性抗原の発現を増加させ、抗’　ＩｇＭ活性活性化脳細胞殖に必要とされる。

ヒトに関する試験では、リンパ球機能に対してネズミ系で観察された作用と似た作用が報告されている。高親和カレセプターは、１Ｌ−４に関してヒト造血性および非造血性細胞の両方に存在する。

Ｉ　Ｌ−４は、非刺激胸腺細胞における増殖を誘導し得、応答はミトゲンにより強力に高められる。また、ｆＬ−４は、ＩＬ−２生産を阻止するデクサメタゾンの存在下でヒト末梢子細胞のミトゲン誘発刺激を増加させる。またＩＬ−４は、Ｉ　Ｌ−２誘発ヒトＢ細胞増殖をダウン変調し、ＩＬ−２１１ＪｉＮＫＪＩｍ！活性化および増殖を阻止する。しかしながら、ＩＬ−４はζ　Ｉ　Ｌ−２と共に、オートロガス・ヒト悪性メラノーマに対して腫よう浸潤性リンパ球の成長を増加させる。リンパ様細胞に対するその作用に加えて、ＩＬ−４は、６ＭＣ５ＦおよびＥＰＯと相互作用することにより、か数球−マクロ７アージおよび赤血球形成単位を増加させる。例えば、Ｈ，スピッツ等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１３９．１１４２（１９８７）、Ｙ、カワカミ等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン」、１６８．２１８３（１９８８）、Ａ、ナグラー等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４１，２３４９（１９８８）、Ａ、バスケス等、「ジャーナル・オプ・イムノロジーＪ、１４４２，９４（１９８９）、Ｔ、ドフランス等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」、１６８．１３２１（１９８８）並びにＢ、ブルツクスおよびＲ，Ｃ，リーズ、「クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー」、７４．１６２（１９８８）参照。

インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞刺激因子−２、インターフェロン・ベーター２およびハイプリドーマ−プラズマサイトーマ成長因子としても知られている。ＩＬ−６は、最初抗ウィルス活性を有するＴ細胞リンホカインとして報告された多機能サイトカインである。ＩＬ−６は、単核白血球、繊維芽細胞、肝細胞、心臓粘液腫、脳こう細胞および血管内皮を含む様々な細胞により産生されることが立証された。ＩＬ−８活性は、繊維芽細胞活性の調節、肝細胞による急性相蛋白質生成、ミトゲンの存在下におけるヒト胸腺細胞およびＴりンバ球の刺激、ネズミＴリンパ球の増殖および細胞毒性細胞への分化、骨髄腫誘導セルラインの維持、ヒト多発骨髄瞳に関するオートロガス・シグナル発生、並びに癌腫および白血病／リンパ腫セルラインの成長の阻止を含むものと考えられている。

例えば、Ｐ、Ｂ、セーガル等、「サイエンス」、２３５．７３１（１９８７）、Ｓ、シミズ等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」、１６９．３３９（１９８９）、Ｊ、Ｌ、チュツベンス勢、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４１．３８６８（１９８ｇ）、Ｇ、）サトおよびＳ、Ｅ、バイツ、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４１．１５５６（１９８８）、Ｍ、ロツツ等、「ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシンＪ、１６７．１２５３（１９８８）、およびり、チェン等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナシ２ナル・、アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．８０３７（１９８８）参照。

か数球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣ５Ｆ）、か数球コロニー刺ｆｆｉ因子（Ｇ　ＣＳ　Ｆ　）、マクロファージ・コロニー刺激因子（ＭＣ３Ｆ）およびマルチコロニー刺激因子（ＩＬ−３）は、インビボおよびインビトロの両方での造血細胞の増殖および分化プロセスの刺激および調節能力により認識された一群の糖蛋白質を構成する。

これらの個々のサイトカインは、細胞供給源として１９２３球、単核白血球、繊維芽細胞、上皮細胞まｔ；は内皮細胞の１つまたはそれ以上により産生される。

さらに、ヘモポエチン−１としても知られているＩＬ−１は、ＩＬ−３、ＭＣ３Ｆ、ＧＣ５ＦおよびＧＭＣＳＦの作用を高めることによりこの調節網に関与する。

動物試験は、ＧＭＣ５Ｆ、ＧＣ３ＦおよびＩ　Ｌ−３が機能的白血球の数を増加させること、およびこの作用はＩＬ−１により促進されることを示した。ＩＬ− ３およびＧＭＣ５Ｆを連続投与すると、同じく血小板の数も増加する。ヒト以外の霊長類においてサイトカインのこの群の構成員を使用すると、ウィルス誘発再生不良性貧血、化学療法および放射線療法誘発骨髄抑制、全身照射または高用量細胞毒性化学療法後の白血球減少およびオートロガス骨髄移植において有益であることが示された。

一ヒトにおいて、ＧＣ３Ｆおよび０ＭＣ３Ｆの両方を投与すると、好中球および好中球−好酸球が各々顕著に増加し、かつ骨髄細胞質が増加し、未成熟細胞が血液中に現れる。ヒトにおけるＧＭＣＳ　Ｆ使用後の臨床副作用には、発熱、発疹、筋肉痛、疲労感、胃腸痛、血栓静脈炎、骨癌、胸膜炎、胸膜しん出、心膜炎および肺塞栓が挙げられる。ＧＣ３Ｆについて注目される唯一の副作用は骨癌であつヒトにおいて立証されたＧＣ５Ｆおよび０ＭＣ３Ｆの利点には、骨髄抑制的細胞毒性化学療法後の造血の回復、オートロガス骨髄移植患者におけるか粗球の回復の加速および感染症の発生減少、並びに骨髄形成異常症候群および再生不良性貧血患者において循環している白血球、ヘモグロビンおよび血小板数の改善がある。エイズ関連白血球減少症患者にＧＭＣ５Ｆを投与すると、ウィルス生産の増加を伴わずにか粗球および単核白血球が顕著に増加した。

上記造血作用に加えて、ＧＭＣ５Ｆは、インビボで単核白血球を膜種よう状態に活性化することが立証されており、これはこのサイトカインについて別の潜在的臨床適用性を示唆している。ＧＭＣ５Ｆはまた、骨肉腫セルライン、胸部癌セルライン、さるウィルス５Ｖ−４０形質転換骨髄ストロマ・セルラインおよび正常骨髄繊維芽細胞前駆体のインビトロ増殖を刺激することが立証された。例えば、Ｓ、バドハンーラード等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン」、３１９．１６２８（１９８８）、Ｊ、Ｅ、グループマン等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン」、３１７．５９３（１９８７）、Ｋ、Ｈ，グラブスタイン等、「サイエンス」、２３２．５０６（１９８６）、Ｓ、デドハー等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５．９２５３（１９８８）、およびＡ、Ａ、ヤクボフスキー等、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシンＪ、３２０．３８（１９８９）参照。

エリトロポエチン（ＥＰＯ）は、成熟赤血球を生産する造血細胞の連続分化に必要とされる単一サイトカインである。インビトロ試験において、Ｉ　Ｌ−３、ＧＭＣ５ＦまたはＧＣ５ＦとＥＰＯの組み合わせは、赤血球生産に必要とされており、これらのサイトカインが赤血球前駆体の維持に関与し、ＥＰＯが末端分化および成熟に必要とされることを示唆している１例えば、Ｊ、スープ等、「ブラッド」、６７．１００２（１９８６）参照。

単核白血球−マクロ７アージにより生産される多機能サイトカインとしても知られている腫よう壊死因子（ＴＮＦ）は、炎症応答の特に重要な伝達物質である。

２形態、ＴＮＦ−アルファ（カケクチン）およびＴＮＦ−ベータが存在する。その作用の中でも、ＴＮＦは、グラム陰性エンドトキシン・シ厘ツクにおける主要因子であり、癌および慢性疾患患者において根深い衰弱（悪液質）症候群を誘発する。

活性範囲には、繊維芽細胞成長の刺激、遺骨細胞活性および骨再吸収の刺激、血管形成の促進、滑液細胞におけるコラゲナーゼおよびグロスタグランジンＥ、の刺激並びに内皮組織における凝血原および血小板活性化因子の刺激がある。

ＴＮＦは、マクロファージにより生産されるオートクリンである。

それは、マクロファージを活性化し、悪性細胞を特異的に認識し、殺す能力を高める免疫変調物質として機能する。ＴＮＦはマクロファージに対して走化的であり、炎症部位でのその生産がマクロファージを補充かつ活性化することを示す。

ＴＮＦは、サイトカイン網に参与し、ＩＬ−１，ＧＭＣ５Ｆ、血小板誘導成長因子およびベーター２インターフエロンの放出を誘導する。

ＴＮＦの主たる潜在的治療効果は、その抗腫よう活性である。ＴＮＦはエンドトキシン誘発腫よう退行の伝達物質である。Ｉ　Ｌ−２はヒト末梢血単被白血球においてＴＮＦを誘導するため、ＴＮＦは！Ｌ−２の抗腫よう活性に関与し得る。

ＴＮＦを全身的に与えると、マウスにおいて腫ようの退行が誘発される。ＴＮＦおよびＩＬ−１の直接的抗増殖性および踵よう細胞毒性作用は相乗的であると考えられている。

ヒトにおける最初の臨床試験は、静脈内および筋肉内注射を含ん・　だ。毒性には、発熱、悪寒、疲労、食欲不振、低血圧および頻脈が含まれた。幾つかの小さな踵よう応答は、現在までに注目されている。例えば、Ｂ、シェリーおよびＡ、セラミ、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、１０７．１２６９（１９８８）、１．Ｊ、ムール等、Ｃａｎｃｅｒ　ｌｅ＋ａｕｎｏ１．　Ｉ＋ｎｍｕｎｏｔｈｅｒ、、２６．２０２（１９８８）。

Ｙ、−ノ瀬等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ＋、２７．７（１９８８）、Ｐｌ、チャプマン等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー」、５．１９４２（１９８７）、Ｈ，Ｈ，ノ（ルチュ等、「モレキュラー・バイオセラビー」、１．２１（１９８８）およびＴ、スタインメツツ等、Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｍｏｄ、、７．４１７（１９８８）参照。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、本来、抗ウィルス活性を有する１９５０年代後期に発見された化合物の種類に割り当てられた語である。最初、３種類のインターフェロンは、アルファ、ベータおよびガンマとして呼ばれ、それらが各々白血球、繊維芽細胞およびリンパ様細胞から最初に同定および単離されたことを示した。１９８８年現在、アルファ・インターフェロンの構造的に関連した形態をコードする少な（とも２４の非対立遺伝子が報告されてし＼る。これらは、１６５ −１６６アミノ酸の蛋白質をコードするＩＦＮ−アルファｌ遺伝子、および１７２アミノ酸の蛋白質をコードするＩＦＮ−アルファｌ遺伝子と呼ばれる２つの亜群に分割された。「繊維芽細胞インターフェロン」と一般に呼ばれているものをコードする単一遺伝子は、ヒトにおいて充分に特性確認されている。しかしながら、繊維芽細胞は複数形態のインター７エａンを生産し得るｔ；め、繊維芽細胞インターフェロンに対するより正確な用語はヒト・インターフェロン・ベータ（ＨｕｌＦＮ−ベータ）である。ＨｕｌＦＮ−ベータは、Ｈ＋ｒｌＦＮ−アルファと約４０％のアミノ酸相同性を有する。

ヒト・インターフェロン・ガンマ遺伝子は、単一アミノ酸において何等かの個体間対立性または差異を伴う単一コピーとして存在する。

ガンマ−インターフェロンは、アルファまたはベーターインターフェロンに対する相同性をもたない。

インターフェロンまたは抗ウィルス活性を有するウィルス誘導蛋白質は、両性類以外の全を椎動物種の代表的なものから同定された。

様々なＩＦＮ−アルファ・サブタイプの生物活性は比較的類似している。ＩＦＮ −アルファおよびベータの生物活性もまた類似してし）るが、両方ともＩＦＮ− ガンマとは異なる。Ｅ、ドマイヤーおよびＪ、ドマイヤーーギグナード、「インターフェロン・アンド・アザ−・レギュレイトリー・サイトカインズ」、ジーン・ウィリー・アンド・サンプ、パブリッシャー、５−３８頁（１９８８）参照。

アルファおよびベータ・インターフェロンの主たる生物活性は、抗ウィルス作用、単核白血球による主たる組織適合性、複合体クラスＩ＋抗原およびインターロイキン−１の発現の誘導、抗増殖作用並びにヒト天然キラー細胞活性の調節である。

インターフェロン・アルファおよびベータは、特に抗増殖作用、分化の誘導、腫よう遺伝子発現の調節および免疫応答の刺激を含め、若干の機構を伴う抗腫よう作用を有する。

正確な生物学的作用は、アルファーインターフェロンの特定構造形態および検定セルラインの感受性により変化し得る。また、例えばヒト・インターフェロン・アルファまたはベータは単核白血球からマクロファージへの成熟を阻止し得るため、陽性および陰性の両方の調節を観察することが可能である。Ｅ、トメイヤーおよびＪ。

ドメイヤーーギドナンド、「インターフェロン・アンド・アザ−・レギュレイトリー・サイトカインズ」、ジョン・ウィリー・アンド・サンプ、パブリッシャー、１３４４−１５３頁（１９８８）参照。

成長因子とも呼ばれる一群のサイトカインは、それらの生物活性の中でも、走化的活性、上皮細胞および繊維芽細胞の増殖、成長および分化、マトリックス形成および軟骨形成の刺激並びに管形成（血管形成）を含む創傷治癒および組織修復に対する陽性または陰性調節作用を有する。多数の生物活性蛋白質がこの領域内で報告され、分類原則に従ってそれらの生物学的作用およびアミノ酸配列相同性に基づき群および種類に分類されている（下記表１に示されている通り）。この群のサイトカインは組織修復に関与するが、それらは他の生物学的作用を有する。さらに、他のサイトカイン類、例えば免疫応答を調節するインターロイキン− １およびインターロイキン−３もまた組織修復に対する作用を有する。

表皮成長因子（ＥＧＦ）は、Ｉよう増殖因子（ＴＧＦ）アルファ、アンフィレグリンおよびワタシニア成長因子を含む一群の構造的に関連した蛋白質の重要な代表的構成員である。ヒ）ＥＧＦは最初尿から単離され、それが胃液分泌を阻止し得ることからウロガストロンと命名された（Ｈ，グレゴリ−１「ネイチャー」、２５７．３２４（１９７５））。唾液腺から単離された不ズＥＥＧＦは、上皮細胞、繊維芽細胞および内皮細胞を含む多数の細胞型に対して細胞分裂誘起性を示す（Ｓ、中耕等、「ディフエレンシエーションＪ、２９．２８４（１９８５））。それは、新生マウスにおいて早発的まぶた開眼および歯牙はう出を刺激しくＳ、コーエン、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２３７．１５５５（１９６２））、上皮細胞に対して走化的である（Ｊ、プレイおよびに、Ｄ、ブラウン、「ジャーナル・オブ・セルラー・フイジオロジー」、１２４．１０７（１９８５））。ＥＧＦは、５３アミノ酸活性蛋白質ヘブロセツシングされる前駆体蛋白質として合成される。

腫よう増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）は、ＥＧＦと同じレセプターに結合し、似た生物活性を共有する。Ｇ、Ｊ、トダロ等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アクデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７７．５２５８（１９８０）参照。ＥＧＦと同様ＴＧＦ−アルファは、１６０アミノ酸前駆体として合成され、これは５０アミノ酸生物活性残基へ蛋白質分解的にプロ七ツシングされる。Ｒ，プリンク等、「セル」、３８．２８７（１，９８４）参照。ＴＧＦ−アルファは、最初、ＴＧＦ−ベータと相助して正常ラット腎臓線維芽細胞の固定依存性成長を誘導し得ることにより認識されＩ；。Ｍ、Ａ、アザノ等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８０．６２６４（１９８３）参照。

血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）は、ヒト血液血小板から精製される。Ｒ，ロスおよびＡ、フォーゲル、「セル」、１４．２０３（１９７８）参照。それは、２つのポリペプチド鋼、すなわちＡ鎖（１２４アミノ酸残基）およびＢ鎖（１４０アミノ酸残基）により構成される。

ＰＤＧＦは、間充組織由来の細胞（例、平滑筋および繊維芽細胞）にとっては強力なミトゲンであるが、ＰＤＧＦレセプターを欠く上皮または内皮細胞に対する作用はもたない。Ｒ，ロス、Ｅ、Ｗ、ライネスおよびり、Ｆ、ボーエン−ホープ、「セル」、４５、ｌ　５５（１９８６）参照。また、血小板誘導成長因子はブタ細胞から入手され得る。

腫よう増殖因子ベータ（複数もあり得る）は、最初、ＥＧＦまたはＴＧＦ−アルファと相乗作用してＮＲＫｍ胞の固定依存性成長を誘導と得ることｌこより同定された。Ｍ、Ａ、アンザノ等、「プロシーデインダス・オプ・ザ・ナシ厘ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ユナイテッドφステーツ・オブ・アメリカＪ、８０゜６２６４（１９８３）参照。続いて、それらは、存在する他の成長因子によって異なる化学走性、細胞分裂促進、成長阻害および分化の誘導または阻止を含む多数の生物学的作用を有することが示された。

Ｍ、Ｂ　、スポーフおよびＡ、Ｂ、ロバーツ等、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、１０５．１０３９（１９８７）参照。それらの成熟形態では、ＴＧＦ−ベータ類は、７０％の相同性を共有する１１２アミノ酸残基の酸および熱安定性ジスルフィド結合ホモ２量体蛋白質である。Ｒ，プリンクおよびＪ、Ａ、７アレツト等、「ネイチャー」、３１６．７０１（１９８５）参照。この群の別の構成員、ベーター３は、最近報告されている。Ｊ、Ｍ、つオズネイおよびＶ。

ローゼン等、「サイエンス」、２４２．１５８２（１９８８）参照。

それらは様々な生物活性を共有するが、ＴＧＦの異なる形態もまた選ばれた標的細胞に対して特有の生物活性を有する。Ｆ、ローザ［およびＡ、Ｂ、ロバーツ等、「サイエンス」、２３９．７８３（１９８−８）参照。ＴＧＦ−ベータ■は創傷治癒において主要な活性を示した。ＴＧＦ−ベータ群に含まれる他の生物活性蛋白質には、卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌をｌｌ４ｊ！ｉｙするインヒビンおよびアクチビンと呼ばれる性腺蛋白質、雄性胚芽の発生において雌性ミュラー菅の退行を誘発するミュラー阻止物質、並びに軟骨および硬骨形成の誘導に関与する一群のポリペプチドである骨形態形成蛋白質といった形態がある。Ｊ、Ｍ、ウォズネイおよびＶ、ローゼン等、「サイエンス」、２４２．１５２８（１９８８）参照。

繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、１４−１８キロダルトンの単鎖蛋白質である。２種の充分に特性確認された形態は、脳および下垂体から単離された塩基性ＦＧＦ、並びに脳および網膜から単離された酸性ＦＧＦである。塩基性ＦＧＦは、大部分の系において、酸性ＦＧＦよりも安定し、１０倍の効力を有する。ＦＧＦの両形態は、同じレセプターに結合し、中胚業起源の細胞、例えば繊維芽細胞、血管内皮ｗｉ胞、血管平滑筋、筋芽細胞、軟骨ｍ胞および骨芽細胞１；対して細胞分裂促進性を示す。Ｆ、エシュおよびＡ、ベアド等、ｒグロシーデインダス・オブ・ザ・ナシ−ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリカ」、８５．６５０７（１９８５）参照。１ｎｔ２およびｈｓｔプロト−腫よう遺伝子の生成物もまた、ＦＢＦ群の構成員として含まれる。

（Ｃ，ディクソンおよびＰ、Ｅ、ゴートン、「ネイチャー」、３２６．８３３（１９８７）参照）。

ソマトメディアＣとしても知られているインシュリン様成長因子１（ＩＬＧ−Ｉ）およびインシュリン様成長因子＋１（ＩＬ、Ｇ−１１）は、血清から最初に精製され、軟骨へのスルフェート取り込みの刺激、インシュリン様活性および増殖刺激活性の３つの生物活性を共有する若干の因子に関する現行の名称を代表する。肝臓および繊維芽細胞は循環性インシュリン様成長因子の主たる供給源であるが、本質的に全ての組織がそれらを生産することが示された。

また、インシュリン様成長因子は、それらの生物活性の中でも、グルコース代謝を刺激し、繊維芽細胞、セルトリ細胞、胎児脳細胞、筋芽細胞、レンズ上皮、すい臓ベータ細胞、レクチン刺激リンパ球、および血小板誘導成長因子と「反応能をもつ」状態になった後密度阻止されたＢａ１ｂ／ｃ　３　Ｔ　３細胞のＤＮＡ合成および細胞増殖を刺激することが示された。（Ｒ，Ｃ，バクスター、Ａｄｖ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、、２５．５０（１９８６）参照）。

サイトカイン類は、それら自体複合体であり、サブユニットを構成し得る細胞表面レセプターと反応する。サイトカインの一部分は、レセプターの様々なサブユニットへ優先的ｌ；結合することにより、相異なる生物学的／調節作用を生じ得る。本発明はまた、レセプターの特定サブユニットを指向し得る上記サイトカイン・フラグメントの固定化方法を提供する。

固定化支持体本発明に、おいて有用な支持体材料は、好ましくは生物学的適合性であり、所望に応じて非生物分解性または生物分解性であり得る。

結合したサイトカインがインビボで使用されるとき、支持体は生物分解性であることが望ましい場合もあり得るが、例えばバイオリアクターといった適用例では不溶性支持体材料が有用である。

適当な支持体には、繊維、シート、ミクロスフイア、粒子、ビーズ、膜などがある。

支持体は、好ましくはサイトカインの共有結合と化学的に融和性である表面を含む。従って、支持体は、好ましくはサイトカイン上の部位（例、アミンまたはカルボキシル部位）、またはサイトカモン上の部位に結合し得る適当な結合アームに共有結合し得る適当な官能基を有する表面を含む。意図した支持体がサイトカイン結合に適しｔ；官能基をもたない場合、上記基は、支持体表面の適当な化学的修飾により提供され得る。例えば、非官能化ポリスチレン支持体は、芳香族環の適当な官能化により（例、臭素化により）官能化された表面に提供され得る。

必ずしも全ての結合化学作用が、多くの様々なサイトカインの各々と等しく良好に働くとは限らない。使用される特定の結合化学作用の適合性は、部分的に、反応部位の利用能およびサイトカインの活性部位へのそれらの近さにより異なり得る。しかしながら、当業界の熟練者であれば、当然アミノ酸配列、反応性基の存在および活性部位から適当な方法を予測できるはずである。また、本発明を適用する場合、当業界の熟練者であれば、アミノ酸を非反応性アミノ酸と置き換えるかまたはその逆により、固定化部位の結合を標的とする遺伝子修飾サイトカインを作製し得ると考えられる。また、当業界の熟練者であれば、サイトカインのコドンを修飾して末端及応性基を有するものを生成することにより、高い確率で固定化部位の結合を指向させることができると考えられる。

官能化された表面は、（ａ）直接サイトカモン上の部位へ、または（ｂ）適当な結合アームへ結合する部位を提供する反応性官能基を含む。

上記官能基には、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−Ｎ　ＨＫまたは−ＮＨＲ（式中、Ｒはアルキルまたはアリールである））、カルボキシル基（−ＣＯ２Ｈ）、水硫基（−３Ｈ）およびハロゲン類（−Ｆ、−〇Ｌ−Ｂｒ、−１）がある。官能化された表面は、表面の化学的処理に加えて若干の手段により提供され得る。例えば、ポリサイエンシーズから得られる青色に染めたポリスチレン・ビーズは、ポリスチレン自体は反応に利用され得る官能基をもたないにも拘わらず、官能化された表面を提供する。青色色素は、ポリスチレンへ結合されか、吸着されるか、またはそれとコポリマー化され、遊離アミン基を提供する。適当な官能基を提供する広範な種類の他の方法も知られている。

適当な粒子支持体には、無機支持体、例えばガラス、石英、セラミック、沸石、金属および金属酸化物、ポリマー材料、例えば、明確な単位を含むモノマー単位、例えばスチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジェン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから誘導された、ホモポリマー、コポリマーおよびオリゴポリマー、炭水化物支持体、例えばアガロース、架橋アガロース、デキストラン、架橋デキストラン、イヌリン、ヒアルロン酸、セルロース、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、澱粉および澱粉誘導体（例、澱粉ミクロスフイア）および不溶性蛋白質材料、例えばゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンがある。

本発明の固定化支持体の表面は好ましくは非多孔質である。非多孔質表面を有する材料、例えば実質的に球形のポリマー・ビーズまたはミクロスフイアを用いると、支持体の外部表面へサイトカインを結合させることにより、サイトカインは生物学的に利用可能な非立体障害位置に配置され得る。材料における孔のサイズが充分に小さいため、球体内部へのサイトカインの移動が遮断または実質的に妨害される場合、表面は非多孔質であると考えられる。持続放出製生物分解性製剤として使用する場合、高い薬剤ローディングを可能にし、支持体が分解するに従い新しい活性部位を露出させるには、多孔質表面が好まれ得る。

支持体のサイズおよび形状は、特定サイトカインおよびその意図する用途により広範に変化し得る。約ｏ、５−ｓｏｏμｍ１特に約１−７５μｍの直径を有するポリマー球体は好ましい支持体である。

上記支持体は、例えば！Ｌ−２依存性リンパ球のインビトロ成長に好ましい。他の好ましい支持体は、約５−２００μｍの直径を有する短繊維がある。

サイトカイン結合基本発明の固定化サイトカインは、好ましくは直接または結合アームを介して支持体材料へ共有結合したサイトカインを含む。結合アームの長さは結合サイトカインの生物活性に関連し得ると考えられている。適当な結合アームは、１個またはそれ以上の２官能性結合基、例えば（１）式Ｎ　Ｈｘ　Ｒ’　−Ｎ　Ｈｓ　（式中、Ｒ１はＣｚＣｘ。アルキル基である）を有するジアミン類、（２）一般式Ｎ　Ｈ！　Ｒ”　−ＣＯ２Ｈ（式中　ＨｚはＣＩ−Ｃ！＊アルキル基である）を有するアミノ酸、および（３）弐〇ＨＣ−Ｒ”−ＣＨｏ（式中、Ｒ１はＣ，−Ｃ，。アルキル基である）を有するジアルデヒドを含む。２個またはそれ以上の結合基を結合させることにより、長さを追加することができる。適当な結合基の例としては、６−アミノカプロン酸、１．６−ジアミツヘキサン、１．１２−ジアミノドデカン、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物がある。

本発明の好ましい実施態様において、固体支持体は、複数の反応性の露出した官能基を有する官能化表面を含む。すなわち、サイトーカインは、表面上の官能基、または官能基へ共有結合した適当な長さの結合アームへ直接共有結合している。官能化表面を有する支持体を充分に洗浄後、生物活性部分（サイトカイン）は露出した官能基したアミド結合を形成すると考えられる、ポリマー支持体の官能化表面上のカルボキシル基およびサイトカモン上の遊離接近性アミノ基の反応における水溶性カルボジイミドの使用、（２）ポリマー支持体の表面上のアミノ基およびサイトカモン上の遊離接近性アミ７基を結合させ得る、結合アームとしての２官能性アルデヒド（例、グルタルアルデヒド）の使用、および（３）固体支持体上のヒドロキシル基と結合アームまたはサイトカモン上のアミノ基との反応における臭化シアンの使用がある。

固定化サイトカインの安定性は、固定化表面へ直接または結合アーム（存在する場合）を介したサイトーイン間の共有結合（複数もあり得る）の性質により異なる。安定した、堅固に結合したサイトカインは、反復的に使用しても終始所望の生物活性を示す・蛋白質を不溶性マトリックスに結合させる下記の結合の安定性はこの結合は、蛋白質上のアミノ基（主としてリジル側鎖アミン）と臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ｌ−シアノ−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン・ピリジニウム・テトラフルオロボラートなどといった試薬により活性化されたポリヒドロキシ性マトリックス（例、アガロース、セルこの結合もまた、上記イソ尿素と同様に、蛋白質上のアミノ基（主としてリジル側鎖）と上記要領で活性化されたポリヒドロキシ性マトリックスとの反応から形成される。

下記の蛋白質−不溶性マトリックス結合の安定性は比較的強いと考えられる。

この結合は、蛋白質上のアミノ基と、４−ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート・、カルボニルジイミダゾールなどといった試薬により活性化されたポリヒドロキシ性マトリックスとの反応から構成される装この結合は、蛋白質アミン基と、シアヌール酸塩化物といった試薬により活性化されたポリヒドロキシ性マトリックスとの反応から形成される。

下記の蛋白質−不溶性マトリックス結合の安定性は非常に強いと考えられている。

１、アミン（ポリマー−ＮＲ−蛋白質）この結合は、蛋白質アミノ基と、（１）トレシルクロリド、スルホニルクロリドなどといった試薬、オキシラン類（エポキシド類）、例えばビスオキシランおよびエビクロロヒドリンにより活性化されたポリヒドロキシ性マトリックス、および（２）グルタルアルデヒドといった試薬により活性化されたポリアミノマトリックスとの反応ｔ−含む様々な方法で形成される。

■ ２、アミド（ポリマー−Ｃ−ＮＨ−蛋白質またはポリマー−ＮＨ○ 薯 −Ｃ−蛋白質）この結合は、蛋白質アミノ基と不溶性マトリックス上の活性化カルボキシル基との反応を含む様々な方法で形成され得る。これらのカルボキシル基の活性化は、「活性」エステル（例、ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ｐ−二トロフェノールまたはペンタクロロフェノール）の形成まｔ；はカルボジイミドとの反応により達成され得る。

逆に、アミド結合はまｔ；、不溶性マトリックス上のアミノ基と、蛋白質上の適当に活性化された（例、水溶性カルボジイミド）カルボキシル基、特にアスパラギン酸およびグルタミン酸側鎖カルボキシル基との反応により形成され得る。

共有結合は、サイトカモン上の単一部位、好ましくは生物活性部位からの適当な距離を指向するのが好ましい。この考えにより、生−物活性を最適化するための結合アームの好ましい選択、および結合アーム、支持体およびサイトカインの結合において選択される特異的化学作用が指示され得る。

結合サイトカインの用途本発明の結合サイトカインを用いることにより、例えば（１）幹細胞および様々な分化段階での細胞、例えば赤血球、リンパ球、マクロ７アージおよび／または好中球を含む細胞血液成分のインビトロ成長および生産、（２）リンホカイン活性化キラー（Ｌ　Ａ　Ｋ）細胞、中性キラー細胞、リンホカイン活性化キラー細胞の亜集団、騰よう浸潤性リンパ球および／または細胞毒性Ｔ細胞を含む特殊エフェクター細胞のインビトロ成長および生産、（３）結合サイトカインのインビボ腹腔内および／または胸膜内投与による悪性疾患の処置、（４）結合サイトカインのインビボ静脈内投与による悪性疾患の処置、（５）好ましくは結合サイトカインの静脈内投与または体内設置による、難治性貧血、血小板減少症、および例えば腎臓透析患者での慢性腎不全および／または腎不全におけるエリトロポエチンの欠乏に起因する一次骨髄機能不全または二次骨髄機能不全に伴う好中球減少症の処置、（６）結合サイトカインの表面適用または結合サイトカインの体内設置による硬および軟組織損傷の処置、並びに（７）結合サイトカインのインビボ静脈内投与によるオステオポローシスの処置を含む様々な生物学的反応を誘導および調節することができる。Ｓ。

牛用およびＳ、書出等、「ディフェレンシェーク２ン」、２９．２８４（１９８５）並びにＪ、プレイおよびに、Ｄ、ブラウン、「ジャーナル・オブ・セルラー・フイジオロジー」、１２４．１０７（１９８５）参照。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１青色色素で染めｔ；ポリスチレン・ビーズ（９，６４μｍ）へのＩＬ−２の結合組換え体ＩＬ−２（アムジェン、サウザンド・オークス、ＣＡ。

ａｌａ−１２５類似体）を、青色色素で染めた９、６４μｍのポリスチレン・ビーズ（ポリサイエンシズ、ウォリントン、ＰＡ）へ下記の方法で２価性アルデヒドを使用して固定化しＩ；。青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μ ｍ）の２．５％水性懸濁液の０．２５ｍ１−アリコートを、リン酸塩で緩衝化した食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐ　Ｈ７，４０）１．Ｏｍｌで希釈し、微量遠心機で５分間遠心した。上溝を注意深く除いて捨てた。ビーズをＰＢＳｌ、Ｏｍｌずつで懸濁、遠心を繰り返して２ｒＭ洗浄した。ついでビーズを８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液０．７５ｍ１に懸濁した。緩やかな断続的な混合により活性化を室温で５時間進行させた。反応混合物を遠心し、上溝を捨てた。ペレット、即ち凝集したビーズをＰＢＳ　１．Ｏｍｌずつで２回洗浄した。ついでペレットをＰＢＳ　０．４ｍｌに懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２１００ｇｇ＝活性６０００００単位）Ｏ，１ｍｌで処理した。反応混合物を室温で１夜混合し、遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を這心した。上溝を取り、これを最初の上溝へ追加した。その後のＩＬ −２の残存活性測定のために、プールしたこの上溝液（約ｌ。

Ｏｍｌ）を４℃で保存した。

ついでビーズを次の方法で処理した。ビーズを０．５ＭエタノールアミンのＰＢＳ溶液Ｑ、５ｍｌに懸濁し、室温で３０分間混合した。

混合物を遠心して上溝を捨て、ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌで１回洗浄した。

ビーズを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ、セン、トルイス、Ｍ　ｏ　）のＰＢＳｏ、５ｍｌ溶液に懸濁し、室温で３０分間混合し、這心した。上滑を捨てた。ついでペレットをＢ　Ｓ　Ａ／Ｐ　ＢＳ溶液０．５ｍｌずつで２回洗浄し、最後に貯蔵用緩衝液［塩化ナトリウム（０，８８％）、ＢＳＡ（１％）、グリセリン（５％）、およびアジ化ナトリウム（０，１％）の０．０２Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７，４０）３０．５＋ｍｌに懸濁した。ビーズは使用時まで４℃で貯蔵した。

上溝液の！Ｌ−２活性検定で５０４００単位の活性（もとの溶液の活性の８．４％）が認められたので、ＩＬ−２の９１．６％がビーズに結合したことが判明した。

実施例２青色色素で染めたポリスチレンビーズ（０，９３μｍ）へのＩＬ−２の結合実施例１で報告した方法に従い、２価性アルデヒドを使用して、組換え体ＩＬ− ２（アムジエン、ａｌａ−１２５類似体、ＩＬ−２１ＯＯμｇ、活性６６００００単位）を青色色素で染めたポリスチレン・ビーズ（ポリサイエンシズ、０．９３μｌ１１）へ固定化した。ただしビーズのサイズが小さかったため、ビーズを上清から完全分離するのに一層長い遠心時間を要した（１０分間）。最終洗浄ののち、ビーズを実施例１で使用した貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で保った。上清液のＩ　Ｌ−２活性検定で１８０００単位の活性（もとの溶液の活性の２．７％）が認められたので、ＩＬ−２の９７．３％がビーズに結合したことが判明した。

実施例３青色色素で染めたポリスチレン粒子（４２１μｍ）へのＩＬ−２の結合組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を青色色素で染めたポリスチレン粒子（ポリサイエンシズ、４２１μｍ）へ下記の方法で２価性アルデヒドを使用して固定化した。青色色素で染めたポリスチレン粒子（１０ｍｇ）をＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）１．０ｍｌずつで３回洗浄した。ついで実施例１で報告した方法に従い、粒子をグルタルアルデヒドで活性化し、組換え体ＩＬ−２（ＩＬ−２水溶液０．２１１１１％　Ｉ　Ｌ　−２２００％ｇ−活性１．５Ｘ１０ ’単位）へ結合させた。実施例１で報告したように結合し、処理したのち、実施例１で使用した貯蔵用緩衝液１．Ｏｎ＋１で４℃で貯蔵した。上滑液のＩＬ−２活性検定で１７６０００単位の活性（もとの溶液の活性の１１．７％）が認められたので、ＩＬ−２の８８．３％が粒子に結合したことが判明した。

実施例４青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）　ヘノＩ　Ｌ　−２の結合：ＩＬ−２溶液濃度の効果固定化処理におけるＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）濃度の効果を下記の方法で検討した。青色色素で染めたビーズ（９，６４μＩＩ）の２，５％水性懸濁液の８個の０−２５ｍ１−アリツー）・から得られたベレットをＰＢＳで洗浄し、実施例１で報告したように、ｔ：だし反応を２分の１の規模で実施して、グルタルアルデヒドで活性化しｔ＝。ついで活性化したビーズを第２表に示したようにＰＢＳおよびＩＬ−２の量を種々に変えて懸濁し、室温で１夜反応を進行させｌ：。この結合反応のあと、実施例１で報告した方法に従ってビーズを処理し、貯蔵用緩衝液の０．２５ｍ１ずつに懸濁し、使用時まで４℃で保った。種々の結合反応から得られた上溝液に存在するＩＬ−２の残存活性を検定した。得られた成績を第２表に示す。

結合反応に使用したＩＬ−２溶液（結合前）および得られた上清から回収したＩ　Ｌ−２溶液（結合後）間の各活性の差から、組み込まれたＩＬ〜２の％値が得られた。

実施例５青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）へのＩＬ−２（組換え体：天然配列）の結合実施例１で報告した方法と同様の方法により、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、天然配列）を９．６４μｍの青色色素で染めたポリスチレンビーズへ固定化した。青色色素で染めたポリスチレンビーズの２．５％水性懸濁液の０−１２５＋ｌ１ｌ−アリコートから得られたベレットをＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄し、８％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ　Ｏ，５ｍｌで活性化し、組換え体ＩＬ−２溶液（ＩＬ−２の水−溶液０．０３２ｍＬ　Ｉ　Ｌ−２３２μｇ、活性６００００単位）のＰＢＳ（０，４ｍ１）溶液に懸濁した。室温で１夜混合することによって反応を進行させたのち、反応混合物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ベレットをＰＢＳ　０．５＋ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心しｌ；。上溝を取り、最初の上溝へ追加しＩ；。実施例１で報告した方法に従ってビーズを処理し、貯蔵用緩衝液０−２５ｍ１に懸濁し、使用時まで４℃で保った。上溝液のＩＬ−２活性検定で５７００単位の活性（もとの溶液の活性の９．５％）が認められたので、ＩＬ−２の９−０．５％がビーズに結合したことが判明しｊ；。

実施例６ポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へのＩＬ −２の結合組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を水溶性カルボジイミドを使用する下記の方法でポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（ポリサイエンシズ、カルボキシレート処理したポリスチレン）９．６７μｍへ固定化した。ポリビード・カルボキシレートミクロスフェアの２．５％水性懸濁液の０．２５ｍ１−アリコートから得られたベレットをＰＢＳ　１．ｏｍｌずつで３回洗浄した。ビーズをＰＢＳ　０．４ｍｌに懸濁し、１−エチル−３−（３ −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ　ＣＥＤＣＩ。

ピアス・ケミカルズ、ロック７オード、ＩＬ）３．Ｑａ＋ｇを加えて、これを溶解した。ついで組換え体Ｉ　Ｌ−２の水溶液（０，０５ｎ＋１、＋Ｌ−２５０μ ｇ１活性３７５０００単位）を加えた。室温で１夜混合しｌ；のち、反応混合物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ベレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついで実施例１で報告した方法に従ってビーズを処理し、貯蔵用緩衝液０−２５ｍ１に懸濁し、使用時まで４°Ｃで貯蔵しｌ；。上溝液のＩＬ−２活性検定で５７０単位の活性（もとの溶液の活性の０．２％）が認められたので、ＩＬ−２の９９．８％がビーズに結合したことが判明した。

実施例７ローアミノカプロン酸連結アームによるポリビード（商標）カルボキンレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へのＩＬ−２の結合下記の方法により、６−アミノカプロン酸連結アームで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジエン、ａｌａ−１２５類似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア９．６７μｍへ固定化した。実施例６で報告したように、カルボキシレートミクロスフェアの０．２５ｃａｌ−アリツー・トから得られたべレフトラ洗浄し、ＰＢＳ　０．５ｍｌに懸濁し、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨ５，ピアスーケミヵルズ、ロックフォード、ＩＬ）３．０ｍｇおよびＨＤＣＩ　３．０ｍｇで処理した。撹拌して試薬を溶解したのち、反応混合物を室温で緩やかに３０分間混合した。ついでスラリーを遠心し、上溝を捨てた。ペレットを０．５Ｍ６−アミノカプロン酸のＰＢＳ溶液０　、５　＋ｎｌに懸濁した。生じＩ；スラリーを室温で２０時間混合し、遠心した。上清を捨てた。

ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄し、ＰＢＳ　０．３５ｍ１に再懸濁し、ＩＬ−２の水溶液０．０５ａ＋１（ＩＬ−２５０ｊ１ｇ、活性３７５０００単位）およびＨＤＣＩ　２−０ｍｇで処理した。混合して試薬を溶解したのち、反応混合物を室温で緩やかに１夜混合しｔ；。ついでスラリーを遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．６ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを実施例１で報告したように処理し、貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ−２活性の測定で４６０単位の活性（もとの溶液の活性の０．１％）が認められｔ；ので、Ｉ　Ｌ−２の９９．９％がビーズに結合したことが判明した。

実施例８１．６−シアミツヘキサン／グルタルアルデヒド連結アームによるポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へのＩＬ−２の結合下記の方法により、１．６−シアミツヘキサン／グルタルアルデヒド連結アームで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５１１似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へ固定化した。カルボキシレートミクロスフェアの０．２５ｍ１−アリコートから得られたペレットを、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）１．Ｏｍｌずつで３回洗浄し、１．６−ジアミツヘキサンの０．５Ｍ　ＰＢＳ　（ｐＨ９，５０）溶液０．５＋ｏｌに懸濁し、ＥＤＣＩ　３．Ｑｍｇで処理した。スラリーを撹拌して試薬を溶解し、室温で２０時間混合した。この反応混合物を遠心し、上滑を捨て、ペレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）０．５ｗ＋１ずつで３回洗浄した。ついでペレットを８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液０．５ｍｌに懸濁し、室温で４時間混合した。スラリーを遠心し、上清を捨て、ペレットをもう一度ＰＢ５　０．５ｍｌずつで３回洗浄した。ついで得られたペレットをＰＢＳ　０．３５ｍ１に懸濁し、ＩＬ−２１７）水溶液（ＩＬ−２５０ｇｇ、活性３７５０００単位）０．０５ｍ１で処理した。スラリーを室温で１夜混合し、遠心し、上清を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．６ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを実施例１と同様に処理して、貯蔵用緩衝液０．５ａ＋１に懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上滑に存在するＩ　Ｌ−２活性の測定で５００００単位の活性（もとの活性の１３．３％）が認められたので、ｒＬ−２の８６．７％がビーズに結合したことが判明した。

実施例９１．１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アームによるポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μ＋ｍ）へのＩ　Ｌ−２の結合下記の方法により、１．１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アームで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ− １２５類似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へ固定化した。カルボキシレートミクロスフェアの０−２５ｍ１から得られたペレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．Ｏ＋ｍｌ）で洗浄し、０．２Ｍ　１．１２−ジアミノドデカンのＰＢＳ　（ｐＨ７−０）溶液０．７５■ｌに懸濁し、ＨＤＣＩ　５．０ｍｇで処理した。室温で１８時間混合したのち、反応混合物を遠心し、上清を捨てた。ペレットをＰＢＳ　（ｐ）１７゜４０．３　Ｘ　ｌ　、０ｍ１）で洗浄し、実施例８で報告したように８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液１．０＋ａｌで活性化した。活性化ののち、スラリーを遠心し、上滑を捨て、もう一度ベレットをＰＢＳｏ、５ｍｌずつで３回洗浄した。ついで得られたペレットをＰＢＳ　０゜４ｍｌに懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２１００１１ｇ、活性７５００００単位）０．１ｍｌで処理した。混合物を室温で１夜反応させた。スラリーを遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上清へ追加した。ついで実施例１で報告したようにビーズを処理し、貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。

上溝液に存在するＩ　Ｌ−２活性の測定で４２０００単位の活性（もとの活性の５，６％）が認められＩ；ので、ＩＬ−２の９４．４％がビーズに結合したことが判明した。

実施例１０１．１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アームによるポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（６５±２５μｍ）へのＩ　Ｌ−２の結合下記の方法により、１，１２−ジアミノドデカン／グルタルアルデヒド連結アームで水溶性カルボジイミドを使用し、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ− １２５類似体）をポリビード（商１）カルボキシレートミクロスフェア（６５± ２５μｍ）　（ポリサイエンシズ）へ固定化した。６５±２５μｍのカルボキシレートポリビーズの２．５％懸濁液０．５０ｍ１から得られたベレットを、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ　ｌ　、０ｍ１）　テ洗浄シ、０．２Ｍ　１．１２− ジアミノドデカンのＰＢＳ溶液（ｐＨ６，ｏＯ）１．Ｏｍｌに懸濁し、ＥＤＣ１１０＋ａｇで処理しｔ；。室温で２４時間混合したのち、反応混合物を遠心し、上清を捨てｔ；。ベレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、実施例８で報告したように８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液１．Ｏｍｌ１で活性化しＩ；。活性化ののち、スラリーを遠心し、上溝を捨て、ベレットをもう一度ＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄した。ついで得られたベレットをＰＢＳ　０．７５ｍ１に懸濁し、１Ｌ−２の水溶液（ＩＬ−２０，１０２５ｍｇ、活性９０００００単位）０．２５ｍ１で処理した。混合物を室温で１夜混合することによって反応させた。ビーズを実施例１と同様に処理し、貯蔵用緩衝液０゜５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ−２活性の測定で１４４４５０単位の活性（もとの活性の１６．０％）が認められたので、ＩＬ−２の８４％がビーズに結合しｌ；ことが判明しｌ；。

実施例１１サイトカインの遊離カルボキシル基を介する１、１２−ジアミノドデカン連結アームによるポリビード（商標）カルボキシレートミクロスクエア（９，６７μｍ）へのＩＬ−２の結合下記の方法により、サイトカインの遊離カルボキシル基を介する１、１２−ジアミノドデカン連結アームにより、水溶性カルボジイミドを使用して、組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｈａ−１２５類似体）をポリビード（商標）カルボキシレートミクロスクエア（９，６７μｍ）へ固定化しｔ；。

カルボキシレートミクロスフェア（９，６７ａｍ＞の０．２５ｍ１から得られたベレットを、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、実施例９で報告したように１．１２−ジアミノドデカン／ＥＤＣＩと反応した。室温で１８時間混合したのち、反応混合物を遠心し、上溝を捨てた。修飾したビーズをＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ　１．０ｍ１）で完全に洗浄し、ＰＢＳ　０．４ｍｌに再懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２４１μｇ１活性３６００００単位）０．１ｍｌ、ついでＥＤＣＩ　５．０ｍｇで処理し、１夜室温で混合した。反応混合物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。

ベレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ１、ｏ＋ｎｌに懸濁し、室温で３０分間混合した。混合物を遠心し、上溝を捨てた。ベレットをＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、最後に貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上溝に存在するＩＬ−２活性の測定で８３４単位の活性（もとの活性の０．２％）が認められたので、ＩＬ−２の９９．８％がビーズに結合したことが判明した。

実施例１２１．１２−ジアミノドデカン連結アームによるポリエチレングリコールで修飾したＩＬ−２のポリビード（商標）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μ ｍ）への結合組換え体ＩＬ−２（アムジエン、ａｌａ１２５類似体）をメトキンポリエチレングリコール−Ｎ−スクシンイミジルグルタレート（分子量４８００）［アブコアスキーら、キャンサー・）くイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス、１巻、１７５頁（１９８４年）〕の！θ倍モル過剰と、説明のため本明細書に包含させたカトレおよびナウフｌ二よって報告された方法ｌｆｆ１際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１２５２号（ｌ際特許公報番号ＷＯ８７１０ＯＯ５６号）］に従って反応した。修飾したＩＬ−２は、溶出液としてＰＢＳ　（ｐＨ７，４０）　を使用ｔ６ｚ＜イオー’ｆルＰ−１ｏカラＡ＋＝よるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。この実験に使用した精製カラム画分は緩衝液１ｍｌ当たり７６４０００単位のＩＬ−２活性を含有していた。

１．１２−ジアミノドデカン速結アームを使用して、下記の方法によりて、修飾したｒＬ−２をポリビード（商ＩＩ）カルボキシレートミクロスフェア（９，６７μｍ）へ固定化した。カルボキシレートミクロスクエアの０．１５ｍ１から得られたペレットを、実施例９で報告した方法に従いＥＤＣＩの存在で１．１２− ジアミノドデカンと反応させた。室温で１８時間混合したのち、反応混合物を遠心し、上溝を捨てた。ついで修飾したビーズをＰＢＳ　（ｐ）（７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で完全に洗浄し、ＰＢＳ　０．３ｍｌに再懸濁し、修飾したＩＬ− ２の溶液（活性２２９０００単位）　０．３ｍｌ、　ツい”ｃ’ｉ：Ｉ）Ｃ１０，０ｍｇで処理し、１夜室温で混合した。スラリーを遠心し、上滑を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心しｔ；。上溝を取り、最初の上溝へ追加した。ついでビーズを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ　１．ＯｍＨ：：懸濁し、室温で３０分間混合した。混合物を遠心し、上溝を捨てた。ペレットをＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、最後に貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁して、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ− ２活性の測定で５０９単位の活性（もとの活性の０．２％）が認められたので、ＩＬ−２の９９．８％がビーズ！＝結合したことが判明し−た。

実施例１３ポリビード（商標）アミノミクロスフェアへのＩ　Ｌ−２の結合組換え体ＩＬ− ２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を２価性アルデヒドを使用して、下記の方法により、５，２９μｍポリビード（商ＩＩ）アミノミクロスフェア（ポリサイエンシズ、アミノ官能化したポリスチレン）へ固定化した。ポリビードアミノミクロスフェアの０．２５ｍ１−アリコートから得られたペレットをＰＢＳ　（３ＸＯ、５ｍｌ）で洗浄し、実施例１で報告した方法に従い、８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液０．７ｍｌで活性化した。ビーズをＰＢＳ（３Ｘ０．５ｍ１）で洗浄したのち、ＰＢＳ　０．４ｍＪＪ二懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ −２１００μｇ、活性７５００００単位）０．１１１１１で処理した。混合物を室温で１夜温合した。ついで反応混合物を遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌに再懸濁し、混合物を遠心した。上溝を取り、最初の上清へ追加した。実施例１で報告したようにビーズを処理し、貯蔵用緩衝液０゜５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上溝に存在するＩＬ−２活性の測定で４４５０００単位の活性（もとの溶液の５．９％）が認められたので、ＩＬ−２の９４．１％がビーズに結合したことが判明した。

実施４Ｒ１４６−アミノカプロン酸スペーサーアームによるセファデックス（商標）−Ｇ−１０粒子（４０−１２０μ１ｍ）　へのＩＬ−２１７）ｍ６組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌｔ−１２５類似体）を、下記の方法により崩壊性セファデックス（商標）−Ｇ−１０樹脂粒子（７ｙ−マシ７．　ピＺヵタ９ニー、ＮＪ、架橋したデキストラン粒子、４０−１２０μｌ１１）へ６−アミノカプロンｒｓ逼結アームで固定化した。水７．５ｍｌに充填した湿潤セファデックス（商標）Ｇ−１゜樹脂の約７．５ｍｌのスラリーを、公開された方法［説明のため本明細書に包含させたＰ、キュアトレヵサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２４５巻、３ｏ５９頁（１９７０年）参照］に従い臭化シアン（ＣＮＢｒ）ｌ−５ｇで活性化した。活性化ののち、樹脂を速やかに濾過し、冷０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）１００＋ａｌで洗浄し、これを１．ＯＭ　６−アミノカプロン酸の０．２Ｍホウ酸ナナトリウム溶液ｐＨ９，０）５０ｍｌへ加えた。混合物を室温で２０時時間音した。濾過によつて樹脂を採取し、Ｈ□ Ｏ約２０１）＋１で洗浄し、高真空下で４８時間乾燥した。

乾燥樹脂のｌｏｎｇ部をＰＢＳ　１．０ｍｌで２４時間膨潤させた。ついで懸濁液を遠心し、上溝を捨て、ＰＢＳ　（３Ｘ　１．ｏｍ＋）で樹脂を洗浄した。ペレットをＰＢＳ　Ｏ，４ｎ＋１に懸濁し、ＩＬ−２の水溶液０．１ｍ１（ＩＬ　２　１００μｇ１活性７５００００単位）、ついでＥＤＣＩ　３．０ｍｇで処理し、室温で１夜混合した。実施例１で報告したように樹脂を処理し、貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上清に存在するＩＬ−２活性の測定で８５２１位の活性（もとの活性の０．１％）が認められたので、Ｉ　Ｌ−２の９９．９％が樹脂に結合したことが判明しｔ；。

実施例１５１．６−シアミツヘキサン／グルタルアルデヒド連結アームによるセファデックス（商標）−Ｇ−１０粒子へのＩＬ−２の結合組換え体ＩＬ−２（アムジェン、ａｌａ−１２５類似体）を、下記の方法により、崩壊性セファデックス（商標） −Ｇ−１０粒子へ１．６−ヘキサンジアミン／グルタルアルデヒド連結アームで固定化した。充填した湿潤セファデックス（商標）Ｇ−１０樹脂（約７゜５　ｍｌ）を、実施例１４で報告した方法に従いＣＮＢｒで活性化した。

ついで洗浄した活性化樹脂を、１．ＯＭ　１．６−ヘキサンジアミンの０．２Ｍホウ酸ナナトリウム溶液ｐＨ９，０）５０ｍｌへ加えた。スラリーを室温で２０時間混合した。濾過によって樹脂を採取し、Ｈ２Ｏ２００１１１１で洗浄し、高真空下に４８時間乾燥しＩ；。乾燥樹脂の１０ｍｇ部を実施例１２で報告したように膨潤させ、洗浄した。実施例８で報告したようにベレットを８％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液１．０ｍｌで活性化した。活性化ののち、スラリーを遠心し、上溝を捨て、もう一度ペレットをＰＢＳ　０．５ｍｌずつで３回洗浄しｔ；。

活性化しｆ：樹脂をＰＢＳ　０．４ｍｌに懸濁し、ＩＬ−２の水溶液（ＩＬ−２１００μｇ１活性７５００００単位）Ｏ，１ＩＩｌで処理しｔ；、混−金物を室温で１夜混合することにより反応させた。ついでスラリーを遠心し、上溝を注意深く取り、保存した。ペレットをＰＢＳ　０゜５ｍｌに再懸濁し、懸濁液を遠心した。上溝を取り、最初の上溝へ加えた。ついで実施例１と同様に樹脂を処理し、貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵した。上溝に残存しているＩＬ−２活性の測定で２９８００単位の活性（もとの活性の４．０％）が認められたので、ＩＬ−２の９６．０％が樹脂に結合したことが判明した。

実施例１６青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）　ヘノＩ　Ｌ　−４の結合組換え体ｒＬ−４（アムジェン、天然配列）を９．６４μｍの青色色素で染めたポリスチレンビーズへ下記の方法により固定化した。

青色色素で染めたビーズの２．５％懸濁液の０．２５ｍ１から得られｊ：ベレットをＰＢＳ　（ｐＨ７，４，３Ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、ついで実施例１で報告したようにグルタルアルデヒドで活性化した。ついでＩＬ−４１０，０μｇを含有する商業的なＩＬ−４製剤（活性２Ｘ１０Ｓ単位）および０．０２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）のＰＢＳ溶液１．０ｍｌにビーズを懸濁した。反応混合物を室温で１夜混合しｔ；。結合反応のあと、ビーズを実施例１と同様に処理し、ついで貯蔵用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、使用時まで４℃で保った。上記の結合反応から得られた上清に存在するＩＬ−４活性の測定は、定量化可能な検定方法がないため、測定できなかった。

実施例１７青色色素で染めたポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）へのＩＬ−６の結合組換え体ＩＬ−６（アムジェン、天然配列）を９．６４μｍの青色色素で染めたポリスチレンビーズへ下記の方法により固定化した。

青色色素で染めたビーズの２．５％懸濁液の０．２５ｍ１から得られたべＬ／７トをＰＢＳ　（ｐＨ７，４，３Ｘ　ｌ　、０ｍ１）で洗浄し、ついで実施例１で報告したようにグルタルアルデヒドで活性化した。ついでＩＬ−６１０，０μｇを含有する商業的なＩＬ−６製剤（活性１〜２Ｘ１０’単位）および０．０２５％Ｈ３ＡのＰＢＳ溶液１．０ｍｌにビーズを懸濁した。反応混合物を室温で１夜混合した。結合反応のあとビーズを実施例１と同様に処理し、ついで貯蔵用緩衝液０．５ＩＩｌに懸濁し、使用時まで４℃で保った。上記の結合反応からの上溝溶液のＩＬ−６活性の検定は、好適な指示細胞系がないため定量化できなかった。

実施例１８ネズミ顆粒球−マクロファージコロニー促進因子の青染色ポリスチレンビーズ（０，９３μｍ）への結合組換え型ネズミ顆粒球−マクロファージコロニー促進因子（ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ、アムゲン）を以下の方法で０．９３μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。

０．９２μｍ青染色ビーズの２゜５％懸濁液の０．２５ｍ１から得たペレットをＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１）で洗い次いでゲルタールアルデヒドで活性化し、以下、実施例２ｊ；記載した方法で処理した。次いでビーズを、５．０μｇの成長因子（活性５Ｘ１０”単位）及びＰＢＳ中、０．０２５％ＢＳＡを含む０．５ｍｌの市販ｒＭｕＧＭＣＳＦ処方中に懸濁した。反応混合物を一夜、室温で混合しｔ；。次いで、最終洗浄し、ビーズを０．５ｍｌの貯蔵緩衝液中に懸濁し、使用するまで４℃で保持した。上溝溶液のｒＭｕＧＭＣ５Ｆのアッセーは、指標細胞系が入手できないために定量化ができなかつに。

実施例１９ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子の青染色ポリスチレンビーズ（０，９３μｍ）への結合組換え箆ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子（ｒＨｕＧＭＣ３Ｆ、アムゲン）を以下の方法で０．９３μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。０．９３μｍ青染色ビーズの２．５％懸濁液の０．１２５ｍ１から得たペレットをＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３ｘ１．０ｍ１）で洗浄し、次いで実施例２に記載したようにタルメタルアルデヒドで活性化した。次いでビーズを、３．０μｇの成長因子（活性１２０゜０００単位）とＰＢＳ中０．０２５％Ｈ５Ａを含む０．６ｍｌの市販「ＨｕＧＭＣ５Ｆ処方に懸濁した。反応混合物を一夜、室温で混合した。

・次いで最終洗浄し、ビーズを０．５ｍｌの保存緩衝液に懸濁し、使用するまで４℃に保持した。上清溶液のＧＭＣ５Ｆアツセーは４６単位（元の０．０４％）を明らかにし、ヒトＧＭＣ５Ｆの９９．９％がビーズに結合したことを示した。

実施例２０Ｉ　Ｌ−３の青染色ポリスチレンピーズ（９，６４μｍ）への結合組換えｇｌＬ −３（アムゲン、天然配列）を以下の方法で９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。青染色ビーズの２．５％懸濁液の０．２５ｍ１から得たペレットをＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ１゜０ｍ１）で洗浄し、グルタルアルデヒドで活性化し、以下、実施例１に記載した手段で処理した。次いでビーズをＱ、４＋＋＋１のＰＢＳで懸濁し、２０μｇｌＬ−２（活性２Ｘ１０＠単位）及びＰＢＳ中０．０２５％）（ＳＡを含むＱ、１ｍｌの市販ＩＬ−３処方で処理しｔ；。反応混合物を一夜、室温で混合した。処理後、ビーズを０．５ｍｌの貯蔵緩衝液に懸濁し、使用するまで４℃で保持した。上溝液のＩＬ−３活性アツセーは１４．１４４単位（元の０．７０％）を明らかにし、９９゜３％の！Ｌ−３がビーズに結合したことＳ示した。

実施例２１９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズ、０．９３μｍ青染色ポリスチレンビーズ；９．６７μｍカルボキシレートポリスチレンビーズ；６−アミノカプロン酸、１．６−ジアミツヘキサン及び１．１２−ジアミノドデカン結合手をもつ９．６７μｌカルボキシレートポリスチレンビーズｉ１．１２−ジアミノドデカン結合手をもつ６５μｍカルボキシレートポリスチレンピーズ、５．２９μｍアミノポリスチレンビーズ；及びセファテックス（商標）Ｇ−１０ポリデキストランビーズ（実施例１．２．６．７．８．９．１３．１４及び１５参照）に固定化した組換え型ＩＬ−２（Ａｌａ−１２５同族体）の試料を、固定したＩＬ−２がＩＬ −２保存細胞系ＣＴＬＬ−２、細胞傷害性Ｔ−リンノく球細胞系のインビトロ成長を支持するか否かを測定するため試験しｔ二。

固定化ＩＬ−２を含むビーズの試料を、ベックマン・マイクロフェーダ中、４％抗生物質（ファンジーバクト・ソリューシ冒ン、アーヴイン・サイエンティフィック、サンタ、アナ、カリホルニア）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中、懸濁及び遠心により３回洗浄した。ＩＬ−２［！ｉ定化ビーズをＲＰＭＩ−１６４０培地中ｌ；再び懸濁し、インビボ生成試験に用いた。ビーズのアリコツトを９６−ウェル平底組織培養板（ファルコン＄３０７５、ベクトン・デイキンノン・アンド・コンパニイ、ラザフオード・二ニージャーシイ）の個々のウェルに加え、次いでｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＣＴＬＬ−２細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・フレクション、ロツクヴイル、メリーランドから得たＩＬ−２成長依存細胞系（ＴＩＢ−２１４））を添加しｔ；。固定化ＩＬ−２を伴うセファデックス（商標）Ｇ−１０ビーズは非常に不規則に形作られ、非常に速く沈澱するのでビーズ／細胞数を正確に測定することは不可能であった。従って、一定容量の新しくポルテックス処理したビーズを実験に用いた。ＩＬ−２固定化ビーズとＣＴＬＬ−２細胞を５％ＣＯ３雰囲気で３７℃インキュベーター中４８時間インキュベートした。４８時間後、１μＣ１の［３Ｈ］−ニミジン＜ＩＣＮ／＜イオメディカルス・インコーポレーション、アーヴイン、カリホルニア）を加えて、混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞をスカトロン細胞集器で集めて液体シンチシー／ヨン計数管で計数し、［３Ｈ］−チミジン結合により測定された通りに細胞成長の量が測定された。結果は表３に報告され、全ての上記固定化Ｉ　Ｌ −２組合わせはＣＴＬＬ−２細胞成長を支持することを示す。

実施例２２固定化ＩＬ−２（組換えを天然配列）を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した組換え型天然配列ＩＬ−２を、ＩＬ−２依存細胞系ＣＴＬＬ−２のインヒドロ成長を支持するかを測定するために試験した。組換え型天然配列ＩＬ−２を実施例５に記載しｔ；ように９．６４μｍビーズ固定した。ＩＬ−２固定化ビーズを実施例２１に記載したように洗浄しアッセーツした。結果は表４に報告され、固定化組換え型天然配列ＩＬ−２がＣＴＬＬ−２細胞系を支持することを示す。

実施例２３固定化Ｉ　Ｌ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長：カルボキシ基対アミン基付着カルボキシ基を経てＩＬ−２に付着した１、１２−ジアミノドデカンスペーサー腕で９．６７μｍカルボキンレートビーズに固定した組換え方ＩＬ−２（ａｌａ −１２５同族体）を、ＩＬ−２依存細胞系ＣＴＬＬ−２のインビトロ成長を支持するか否かを測定するために試験した。組換え型ＩＬ−２を、実施例１１に記載したようにＩＬ−２分子上のカルボニル基によって１．１２−ジアミノドデカンスペーサーをもつ９，６７μｍカルボキシレートビーズに固定した。固定化Ｉ　Ｌ−２ビーズを実施例２１に記載したように洗浄してアッセーした。ＩＬ−２上のカルボキシル基によって固定したＩＬ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長は、（実施例１に記載されるように）ＩＬ−２上のアミン基によって固定したＩＬ −２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長と比較した。結果は、表５に報告され、カルボキシル基によってビーズに着付したＩＬ−２はＣＴＬＬ−２成長を支持し、アミノ基によってビーズに付着したＩＬ−２よりも活性であることを示す（図１参照）。

実施例２４固定化ポリエチレングリコール修飾ＩＬ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長１．１２−ジアミノドデカンスペーサー基をもつ９．６７μｍカルボキシレートポリエチレンビーズに固定した化学的に修飾しｔ；（ポリエチレングリコール）組換え型Ｉ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）を、Ｉ　Ｌ−２依存細胞系ＣＴＬＬ−２のインビトロ成長を支持するか否かを測定するために試験した。ＩＬ− ２を実施例１２で略述した方法に従って化学的に修飾し、固定しＩ；。固定化、化学的修飾ＩＬ−２ビーズを実施例２１に記載されるように洗浄し、アツセーした。

細胞成長の結果は表６に示され、ＰＥＧ−ＩＬ−２ビーズがＣＴＬＬ−２成長を支持することを示す。

実施例２５ＣＴＬＬ−２細胞の成長に対する固定化組換え型］Ｌ−２の濃度依存ポリスチレンビーズに固定した組換えｆｆ１ｌ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）の濃度（単位／ｍｌ又はｍｇ／ｍｌ）の、ＣＴＬＬ−２細胞の成長に対する影響を試験した。組換えｑ■Ｌ−２を実施例４に記載されるように９．６４μｍ胃染色ポリスチレンビーズに固定した。これらのビーズを実施例２１に記載されるように洗浄し、固定した。細胞当リｌ及びｌＯビーズの濃度を用いた。これらの条件下、ＣＴＬＬ−２細胞の成長は濃度依存を測定した（図２参照）。

実施例２６固定化！Ｌ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長対時間固定化組換え型ＩＬ−２（ａｌａ−１２５同族体）に対するＣＴＬＬ−２細胞の成長を時間の関数として測定し、可溶性ＩＬ−２に対するＣＴＬＬ−２細胞の成長と比較した。組換え型ＩＬ−２を実施例１に記載したように９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。Ｉ　Ｌ−２固定化ビーズのアリコツト（１，５及び１０ビーズ／細胞）を、９６−ウェル平底組織培養板の各ウェルに加え、次いでｌＸＩ　Ｏ’ＣＴＬＬ−２細胞（ＩＬ−２成長保存細胞系）を添加した。

固定化Ｉ　Ｌ−２含有ビーズ及びＣＴＬＬ−２細胞を、５％ＣＯ，雰囲気で３７ ℃インキュベーターで種々の時間インキュベートした。

各時間の終りにｌμＣｉの［”Ｈ］−チミジンを加えて混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞をスカトロン細胞収集器を用いて集めて液体シンナレーション計数管で計数してｍ胞成長を測定した。

結果は、溶融Ｉ　Ｌ−２（１００単位／＋＋＋１及び１０００単位／ｍｌ）を用いる分析の結果と共に図３にグラフで示す。これらの結果は、固定化Ｉ　Ｌ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長は、対照、即ち可溶性ＩＬ−２を用いるＣＴＬＬ−２細胞の成長と匹敵するか、又はより優れていたことを示す。ｌビーズ／細胞で、成長は、２４ないし１２０時間帯で可溶性ＩＬ−２はど劇的でないが、成長は１６８時間まで安定を保つ。

実施例２７゜循環ＩＬ−２固定化ビーズに対するＣＴＬＬ−２細胞の成長９．６４μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した組換え２１Ｌ−−２を、実施例１に記載したように製造し、実施例２１に記載したように洗浄した。これらのＩＬ−２固定化ビーズは、再使用され、長期間細胞培養を維持する能力について試験した。ＩＬ−２固定化ビーズのアリコツトを無菌１．５ｍｌねじ込み口金マイクロ７ユーグ管（サーステッド・インコーホレーテッド、プリンストン、ニュージャーシイ）ニ加え、］ＸＩＯ’ＣＴＬＬ−２細胞とインキュベートし、５％ＣＯ！雰囲気で３７ ℃インキュベーターで７２時間インキュベートした。培地の幾つかにｌμＣｉの［３Ｈ］−チミジンを加えて、混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞をスカトロン細胞収集器によって集め液体シンチシーシｎン計数管で計数して細胞成長を測定した。残る培養物をベツクマンマイクロフユーグで５分遠心分離し、上清を除去した。次いでこれらの培養物を、４％抗生物質を含む１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０組織培地で５回洗浄し、激しくかき回し、遠心分離した（この操作は、９０％以上の細胞を除去する）。

５回目の洗浄後、Ｉ　Ｌ−２固定化ビーズを新しい培地に再び懸濁し、新しいＣＴＬＬ−２細胞を加えて２時間成長循環を繰り返した。この操作は数回繰り返した。結果は表７に示され、これは、ＩＬ−２固定化ビーズがＣＴＬＬ−２細胞の成長を４つの７２時間成長サイクルを支持したが、一方可溶性ＩＬ−２は２サイクルの有意なＣＴＬＬ−２成長を支持したにすぎなかったことを示す。

実施例２８固定化、ｍｅえ型ＩＬ−２１：対するヒト末梢血リンパ球の成長固定化組換え型Ｉ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）に対するヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ’ Ｓ）の成長を試験した。組換え型」Ｌ−２を実施例１に記載したように９．６４ μｍ青染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ＩＬ−２ビーズを実施例２１に記載したように製造して、以下の実験に用いた。ＰＢＬ″Ｓを以下の方法により健康なドナーから分離した。リンパ球を、Ｌｅｕｃｏ　ＰＲＥＰ（ベクトン・ディキンノン・アンド・コンパニー）細胞分離培地越えに遠心分離後、ヘパリン添加血液から分離した。粗リンパ球調整物を、４％抗生物質及び５％ヒトＡＢ血清（熱不活性化、ノース・アメリカン・バイオロジカルス、インコーホレイテッド　マイアミ、フロリダ）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地で遠心分離することにより３回洗浄した。２Ｘ１０５ＰＢＬ’Ｓを種々の濃度のＩＬ−２固定化ビーズに加えた。細胞を５％ＣＯ８雰囲気で３７℃インキュベーター中種々の時間でインキュベートした。各時間の終わりに、ｌμＣｉの［”Ｈ］−チミジンを加えて混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞をスカトロン細胞収集器により収集して液体シンチレ−シーン計数管で計数して細胞成長を測定した。

結果は図４にグラフで示す。本実施例は、固定化ＩＬ−２を用いるＰＢＬ’Ｓ成長、及びＰＢＬ’Ｓの成長が対照の可溶性ＩＬ−２と、特に７２時間培養後、等しいかより良好であることを示す。

実施例２９可溶性組み換え！Ｌ−２または固定化Ｉ　Ｌ−２により誘起されたＬＡＫ細胞活性固定化組み換えＩ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）上で成長させたヒトＰ　Ｂ　Ｌ’ｓを、それらがリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を示すかどうかにつき測定した。ヒトＰ　Ｂ　Ｌ’Ｓは実施例２８に記載されるとおりに単離し、実施例１記載のとおり調製したＩＬ−２固定化ビーズで９６時間活性化し、実施例２１記載のとおり洗浄した。ＬＡＫ細胞の死滅作用は、作用標的に５６２．ラジおよびダウディを用いて検定した。ＬＡＫ細胞死滅検定には、文献に報告され、ている４時間”Ｃｒ放出検定を用いた。Ｔ、Ｌ、ホワイトサイドら、キャンサー・イムツール、イム／セラ、２６巻１頁（１９８８年）；Ｈ，Ｆ、プロスら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロジ−１巻５１頁（１９８１年）参照。新鮮なＰＢＬ’ｓから単離された正常ＮＫ（ナチュラル・キラー）細胞はに６５２細胞を死滅するが、ラジまｔ；はダウディ細胞が活性化状態にある時はそれらを死滅しない。結果は表８に示す。ＩＬ−２固定化ビーズが活性化しｒ＝　Ｌ　Ａ　Ｋ細胞は、Ｋ２Ｏ２、ラジおよびダウディ細胞を死滅させた。死滅作用は可溶性Ｉ　Ｌ−２活性化ＬＡＫ細胞と同等であった。

実施例３０固定化ＩＬ−２により誘起されるＮ　Ｋ／Ｌ　Ａ　Ｋ活性９．６４μ「青色染色ポリスチレンビーズ（実施例１）および６５μｍポリスチレンビーズ（５！施例１０）上固定した組み換えＩＬ−２（ａｌａ−１２５同族体）を、エクソ・ビポ実験でそれらがネズミのリンノ（球を刺激し、標的セルラインのナチュラル・キリング（ＮＫ）またはリンホカイン活性化キリング（ＬＡＫ）を増加したかどうかにつき測定した。すなわち、エクソ・ビポ実験は、固定化ＩＬ−２ビーズが、可溶性ＩＬ−２がイン・ビボでＬＡＫ細胞の産生を活性化できるのと同じ方法で、宿主の免疫系を活性化できた場合に実施し測定しｔ；。

実験は以下のように行った：成熟Ｂａ１ｂ／ｃ雄マウス（３群、１７週齢）に、ＰＢ５２００μ１１可溶性組み換えＩＬ−２５００００単位、９．６４μｍ青色ビーズ（５！施例１）に固定したＩＬ−２２０００００単位または６５μｍビーズ（実施例１０）に固定しｆ：　Ｉ　Ｌ　−２１ｏｏｏｏｏ単位を腹腔内注射した。９６時間後、腹腔および牌臓から細胞を採取し、ＮＫ／ＬＡＫ細胞活性を検定した。牌細胞は、Ｍ。

Ｈ，ザローキアンら、イムツール、インペスト、１５巻８１３頁（１９８６年）およびＣ，Ｗ、ギルバートら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１４０巻２８２１頁（１９８８年）に報告されているように、新鮮な牌臓から調製した。ＮＫ／ＬＡＫ細胞活性は、”Ｃｒの４時間放出検定により検定したが、これも上記の参考文献に報告されている。エクソ・ビポ実験の結果は表９にまとめている。この結果より、可溶性ＩＬ−２は、予想通り、ネズミ牌細胞を活性化し、６５μｍビーズに固定したＩ　Ｌ−２は、腹腔内でＬＡＫ細胞を活性化することが示唆されている。腹腔内のＬＡＫ細胞活性は局在化してｌ／するようであり、癌の局部処置の治療に有効である。

実施例３１固定化組み換えＩＬ−４におけるヒト末梢血リンノく球の成長組み換えＩＬ−４は、実施例１６記載のとおり９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ＩＬ−４ビーズは実施例２１記載のとおり洗浄し、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）共刺激実験に用いてＴ細胞増殖を誘起した。末梢血リンパ球は、健常提供者より採取した。Ｔ細胞に富んだ分画を、ヘパリン他車から単離しフィコール・グラジェント（ＬＳＭ、　リンパ球分離用溶媒、オルガノン・テクニカ・コーボシーシ蔚ン、デュルハム、ＮＣ）から分離したリンパ球より単離した。

粗いリンパ球は、プラスチック製組織培養フラスコ中、３７℃で、加熱して不活性化した５％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０溶媒中で１時間加温し、単球およびその他の共刺激Ｔ細胞増殖検定に干渉する粘着性細胞を除去した。この段階は２回繰り返した。Ｔ細胞に富む非粘着性リンパ球は、ＰＨＡ共刺激増殖検定で使用した。各ウェルに１×１０″セルを加え、さらに可溶性ＩＬ−４Ｃ１００単位／ｍｆｆ）、ＰＨＡ（０，０５，ｐｇ／ｍＱ）、ＰＨ八へ可溶性ＩＬ−４（１００単位／ｍＱおよび１単位／ｄ）またはＰＨＡ＋ビーズに固定したＩＬ− ４（初期濃度０．５および１ビーズ／セル）を加えて３７℃で９６時間加温した。９６時間後、培養を［Ｈ”１−チミジンで４時間パルス化し、Ｔ−細胞増殖を測定した。結果は表１Ｏにまとめたが、固定化ＩＬ−４ビーズはＴセル増殖を刺激し、背景の準至適ＰＨＡ値を越すことが示唆される。

実施例３２固定化組み換えＩＬ−６におけるヒト末梢血リンパ球の成長組み換え！Ｌ−６は、実施例１７に記載のとおり、９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化Ｉ　Ｌ−６ビーズは、実施例２１に記載のとおり洗浄し、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）共刺激実験に用い、Ｔ細胞増殖を誘起した。末梢血りンバ球は健常提供者より採取した。Ｔ＃！１胞に富む分画は、ヘパリン他車から単離、しフィコール・グラジェント（Ｌ　Ｓ　Ｎ、　リンパ球分離溶媒）で分離したリンパ球より単離した。粗リンパ球は、プラスチック製培養フラスコの中で、加熱して不活化した５％ヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭｒ−１６４０中３７℃で１時間加温し、単球およびその他の共刺激Ｔ細胞増殖検定に干渉する粘着性細胞を除去した。この段階は２回繰り返した。Ｔ細胞に富む非粘着性リンパ球を、ＰＨＡ共刺激増殖検定に用いた。ｌＸｌ０’セルを各ウェルに加え、さらに無添加、可溶性ＩＬ−６（ｔｏｏ単位／ａ＋１２）、ＰＨＡ（０，０５ｍｇ／ｍ１２）、ＰＨＡ十可溶性ＩＬ−６（１００単位／ｍＱ８よびｌ単位／ｍ（２）、またはＰＨＡ＋ビーズに固定したＩＬ−６（初期濃度０．５および１ビーズ／セル）を加え、９６時間３７℃で加温した。９６時間後、培養は［３Ｈ］−チミジンで４時間パルス化し、Ｔ細胞増殖を測定した。結果は表１１にまとめたが、固定化ＩＬ−６ビーズはＴセル増殖を刺激し、背景の準至適ＰＨＡ値を越すことが示唆される。

実施例３３固定化組み換えヒトＧＭＣ５ＦにおけるＡＭＬ−１９３細胞の成長０．９３μ纜責色染色ポリスチレンピーズに固定した組み換えヒトＧＭＣ５Ｆ（ｒＨｕＧＭＣ５Ｆ）は、イン・ビトロでＧＭＣ５Ｆ依存性セルラインＡＭＬ−１９３の成長を保持するかどうかにつき、測定した。組み換えヒトＧＭＣ５Ｆは実施例１９記載のとおり０．９３μｍ青色染色ビーズに固定した。固定化組み換えヒトＧＭＣ５Ｆビーズは実施例２１記職のとおり洗浄した。ＡＭＬ−１９３セルラインの成長検定は以下のとおりであった：洗浄したビーズは、９６ウ工ル平底組織培養プレートの各ウェルに加え、続いて１Ｘｌｏ’ＡＭＬ−１９３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ謄ン、ロックビル、ＭＤから入手したＩＬ−３／ＧＭＣ５Ｆ依存性セルライン）を加えたｒＨｕＧＭＣ３Ｆを固定したビーズはＡＭＬ−１９３細胞と一緒に、５％Ｃ０２雰囲気下３７℃で１１６時間加温した。

１１６時間後、１μＣｉの［ＩＨ］−チミジンを加え、混合物をさらに４時間加温した。細胞は、実施例２１記載のとおりに収集した。結果は表１２にまとめｔ；が、固定化組み換えヒトＧＭＣ３ＦはＡＭＬ−１９３細胞の成長を保持することが示唆される。

実施例３４固定化１１１ｈ換工Ｉ　Ｌ　−３ニ＃ｌｔ６　ＡＭＬ　−１９３１ＨＭ１ｔｌ）成長９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−３は、イン・ビトロでＩＬ−３／ＧＭＣ３Ｆ依存性セルラインＡＭＬ−１９３の成長を保持するかどうかにつき、測定した。組み換えＩＬ−３は、実施例２０に記載のとおり、９．６４μ回責色染色ビーズに固定した。固定化！Ｌ−３ビーズを、実施例２１に記載のとおり洗浄し、実施例３３記載のとおり検定した。結果は表１３にまとめたが、固定化組み換えＩＬ−３はＡＭＬ−１９３細胞の成長を保持することが示唆される。

実施例３５ＩＬ−１−βの響き染色ポリスチレンビーズ（９，６４μ＋ｅ）への結合組み換えＩＬ−１−β（アムゲン）は、以下の方法で９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。置き染色ビーズの２．５％懸濁液０．１５＋Ｊから得られた塊を、ＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３×１゜０　ｍＱ）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで活性化した。次いでビーズをＰＢＳｏ、４６＋ｎ１２に懸濁し、ＰＢＳ中にＩＬ−１−β８．０℃ｇ（活性４ＸＩＯ’ 単位）および０．０２５％ＨＳＡを含有する市販のＩＬ−１−β調製物０−０４ｍ０処理した。

反応混合物を室温で２４時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液（Ｌ５ｍ（ｌに懸濁し、用時まで４℃ を維持した。

実施例３６ＩＬ−１−αの響き染色ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への付着ヒト配列ＩＬ−１−α（ＲアンドＤシステムズ）を、以下の方法で９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。胃色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２０−から得られた塊をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＸｐＨ７，４０，３Ｘ１．０ｍ１２）で洗浄し、次いで実施例１記載のとおり、ゲルタールアルデヒドで活性化した。活性化したビ゛　−ズはＰＥ５０．４２ｍ（２に懸濁し、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）　８　、　Ｏｐｇおよびヒト血清アルブミン（Ｈ５Ａ）２００ｐｇをＰＢＳ中に含有する調製物０．０８ｄで処理した。反応混合物を室温で２４時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを遠心にかけ、ＰＢＳ（０、５ｍ１２）で洗浄し、次いで、実施例１記載のとおりエタノールアミンで処理した。次に、ビーズを０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ＰＢＳ溶液で洗浄しく３Ｘ１．Ｏｍ（２）、共有結合していないサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の痕跡を残らず除去するよう努めた。このように洗浄した後、ビーズはさらに実施例１記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０．５ｄに懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例３７組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒＨｕＧＣＳＦ）の響き染色ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への結合以下の方法で組み換えヒトＧＣ５Ｆ（ｒＨｕＧＣＳＦ、アムゲン）を、９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２０ｍ１２から得た塊をＰ　Ｂ　５（ｐＨ７，４０，３ｘ］、０ｍ４）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりにゲルタールアルデヒドで活性化した。活性化したビーズはＰＢＳｏ、３ｍ（＋に懸濁し、０．５μｇ（活性ｌＸｌ０’単位）の成長因子および０．０２５％Ｈ３Ａを０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５、４）中に含有する市販のｒＨｕＧＣ３Ｆ調製物０．２−で処理しｔ；。懸濁液は室温で一晩混合した。

カップリング反応に続いて、ビーズは実施例１記載のとおりに処理し、貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍ１２に懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例３８組み換えネズミ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＭｕＧＭＣＳ　Ｆ）の青色染色ポリスチレンビーズ（０，９３μｍ）への結合組み換えネズミＧＭＣＳＦ（アムゲン）は、以下の方法で０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２゜５％懸濁液０−２５ｍＱから得られた塊は、ＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３×１．０ｍ１２）で洗浄は、次に実施例１および２記載の方法で８％ゲルタールアルデヒドにより活性化した。活性化したビーズは５．０℃ｇ（活性５Ｘ　Ｉ　Ｏ”単位）のｆｆ長因子８，１：びｏ、０２５％ＢＳＡをＰＢＳ中に含有する市販のｒＭｕＧＭＣ５Ｆ調製物０．５０−に懸濁した。懸濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に統いて、ビーズを実施例１および２記載の方法で処理し、貯蔵用緩衝液Ｑ、５ｍ１２に懸濁し、用時まで４ ℃を維持しｔ；。

実施例３９ｒＭｕＧＭＣ３Ｆの青色染色ポリスチレンビーズで（０，９３μｍ）への共有結合的結合／吸着０．９３μｍ青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２ｍ１２の分画２個から得られた塊をＰ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　１−Ｏｍｆｆ）で洗浄した。１つの塊（Ｃと標識する）を実施例１および２記載のとおり、８．０％ゲルタールアルデヒドのＰＢＳ溶液１．０ｍ４で、室温で２０時間活性化した。別の塊（Ａと標識する）は、ＰＢＳｌ、０ｍ＋２に懸濁し、これも２０時間混合した。両方の懸濁液を遠心にかけ、塊はＰ　Ｅ　Ｓ（３Ｘ　１　、Ｏ＋ｎ４）で洗浄した。各々の塊をＰＢＳの０　、１　ｔｎＱ部分に懸濁し、実施例３８で用いた市販のｒＭｕＧＭＣ３Ｆ調製物の０．４一部分（４，０μｇ、活性４０００単位）で処理した。次に懸濁液を室温で一晩混合し、遠心にかけ上澄を採り、貯えた。２個の塊を再度ＰＢ３０．５一部分に懸濁し、遠心にかけ、上澄を採り、最初の上澄に加えた（ＡＩおよびＣＩと標識する、両者約１　、０　ｍＱ）。次いで塊を、実施例１記載のとおり０．５Ｍエタノールアミンの１．Ｑｍ１２部分で処理した。上澄（Ａ２およびＣ２と標識する）を採り貯えた。塊は次いでＰＢＳのｌ。

Ｏ一部分に懸濁し、遠心にかけ、上澄（Ａ３およびＣ３と標識する）を採り貯えた。塊は０．１％ＳＤＳ／ＰＢＳの１．ＯｍＱ部分に３回懸濁し、１時間混合し、遠心にかけ、上澄（各々Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６と標識する）を採り、貯えた。塊をＰＢＳの１０ｍＭ部分で洗浄し、上澄（Ａ７およびＣ７と標識した）を採り、貯えた。塊は実施例１に記載のとおり１％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓで処理し、種々の上澄（各々Ａ８、Ａ９、Ａｌ０１Ｃ８、Ｃ９およびＣＩＯと標識する）を採り、貯えた。最後にビーズを貯蔵用緩衝液０．５ｄに懸濁し、上澄と一緒に用時まで４℃を維持した。

実施例４０組み換えヒトインスリン様成長因子Ｉ（ｒＨｕＩＬＧＦ−１）の胃色−染色ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への結合、組み換えヒトインスリン様成長因子Ｉ（ｒＨｕｌＬＧＦ−Ｉ、ツマトメディンＣ，バケムより入手）は、以下の方法で９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０　、２　ｍＱから得られた塊をＰＢＳ（ｐＨ７，４０，３Ｘ１．Ｏｒ＋＋１２）で洗浄し、実施例１記載のとおり８．０％ゲルタールアルデヒドのＰＢＳ溶液１．０１で活性化した。洗浄し活性化したビーズはＰＢＳＯ１４２＋ｎＱに懸濁し、無菌水中市販の成長因子２０．０μｇを含有する溶液０．０８− で処理した。懸濁液を室温で２０時間混合した。

カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、次いで貯蔵用緩衝液０　、５　ｍ（２に懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例４１組み換えヒトインスリン様成長因子１［（ｒＨｕＩ　ＬＧＦ−ＩＩ）の青色染色ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への結合組み換えヒトインスリン様成長因子１１（ｒＨｕｌ　ＬＧＦ−ＩＩ、バケムより入手）は、以下の方法で９．６４ μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２−から得られた塊をＰ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　１　、Ｏｄ）で洗浄し、実施例１記載のとおり８゜０ゲルタールアルデヒド／ＰＢ５１．ＯｍＱで活性化した。洗浄し、活性化したビーズはＰＢＳ０．４５−に懸濁し、無菌水中１２．５μｇのｒＲ長因子を含有する溶液Ｑ、Ｑ５ｍｆｆで処理した。懸濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、次に貯蔵用緩衝液０．５−に懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例４２組み換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−σ／カケクチン）の青色染色ポリスチレンビーズ（９，６４μｍ）への結合組み換えヒトＴＮＦ−α（アムゲン）は、以下の方法で９．６４μｍ青色染色スチレンビーズに固定しｔ；。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２ｍＱから得られｔ；塊はＰ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　ｌ　、ＯｍＱ）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで活性化した。活性化に続いて、洗浄ビーズをＰＢＳ０．４６ｍ１２に懸濁し、成長因子１９゜２ μｇ（活性１．９２Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｊｌｉ位）をｏ、０４Ｍ）　リス１０．１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，６０）中に含有する市販の組み換えヒトＴＮＦ− σ調製物で処理した。懸濁液を室温で２４時間混合した◇カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０　、５　ｍＱに懸濁し、用時まで４℃を維持した。

実施例４３線維芽細胞成長因子ベーシック（ＦＧＦｂ）の青色染色スチレンビーズ（２，８５μｍ）への結合繊維芽細胞成長因子ベーンツク（アムゲン）は、以下の方法で２゜８５μｍ青色染色ビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０　、２　ｍＱから得られた塊はＰＢＳ（３Ｘ１．０ｍ１２）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで活性化した。活性化に続イテ、洗浄ビー、（をＰＢｓｏ、４４ｍｆ２ｉ：懸濁Ｌ、０−０２　Ｍ　クエ７酸ナトリウム１０．１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）中成長因子３０μｇを含有する市販のＦＧＦｂ調製物０−０６ｍｆ２で処理した。

懸濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に統いて、ビーズを実施例３９記載のとおり処理し、次いで貯蔵用緩衝液０．５ｍＱに懸濁し、種々上澄と共に、用時まで４℃を維持した。

実施例４４形質転換成長因子−β−２（ＴＧＦ−β−２）の青色染色ポリスチレンビーズ（２，８５μｍ）への結合ＴＧＦ−β−２（ＲアンドＤシステムズ）は、以下の方法で２．８５μｍ青色染色ビーズに固定した。置き染色ビーズの２．５％懸濁液０．２−より得られた塊を、ＰＢＳ（３Ｘ１．０ｍ４）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで処理しｔ；。活性化に統いて、洗浄したビーズはＰＢＳｏ、３５ｍ２に懸濁し、０．０１％トライトンＸ−１００中成長因子７．５μｇを含有する溶液、０１５ｍｆｆで処理した。懸濁液を室温で１８時間混合しｔ；。カップリング反応に続いて、ビーズを実施例３９記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０゜５ｔｎＱに懸濁し、種々の上澄と一緒に、用時まで４℃を維持しｔ；。

実施例４５組り換しヒトインターフェロンーσ−２人（商標ロフエロン＝Ａ）の置き染色ポリスチレンビーズ（２，８５μｍ）への結合組ｈ　換、ｔヒトインターフェロン −α−２Ａ（商１［ロフェロンーＡ１０ツシュ・ラボラトリーズ）は、以下の方法で２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２ｍＱから得られた塊は、Ｐ　Ｂ　Ｓ（３Ｘ　１　、ＯｍＱ）で洗浄し、次に実施例】記載のとおりゲルタールアルデヒドで処理した。洗浄し、活性化したビーズは次いでＰＢＳ０．４ｍ１Ｂこ懸濁し、塩化ナトリウム０　、９　ｍｇ、ＨＳ　Ａ　Ｑ　、　５　ｒｔｒｙ８よびフェノール０　、３　ｒｉｇを含有する市販の組み換えヒトインターフェロン−α−２Ａ水性調製物０．１ｍ１２で処理した。懸濁液は室温で２４時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズは実施例３９記載のとおり処理し、貯蔵用緩衝液０゜５ｍ１２に懸濁し、種々上澄と共に、用時まで４℃を維持した。

実施例４６組み換えヒト表皮成長因子（ｒＨｕＥ　Ｇ　Ｆ　）の青色染色ポリスチレンビーズ（０，９３μＬｌ＋）への結合組み換えヒトＥＧＦ（ｒＨｕＥＧＦ、アムゲンより入手）は、以下の方法で０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２，５％スラリー〇　、　２　ｒｎＱから得られた塊をＰＢＳ（３Ｘ１　、　Ｏｍ＋２）で洗浄し、次に実施例１８よび２記載のとおりゲルタールアルデヒドで処理した。

洗浄し活性化したビーズをＰＢＳｏ、３５ｍＱに懸濁し、次にＰＢＳ（ｐＨ７，４０）中成長因子２５．０μｇを含有する溶液０．１５ｍＱで処理した。懸濁液を室温で１８時間混合した。

カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１および２記載のとおり処理し、次いで貯蔵用緩衝液Ｑ　、　５　ｌｌ１（ｌに懸濁し、用時まで４℃で維持した。

実施例４７組み換えヒト血小板由来成長因子（ｒＨｕＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　）の冑色染色ボリスチレンビーズ（２，８５μｍ）への結合組み換えヒトＰＤＧＦ（ｒＨｕＰＤＧＦ、バケムより入手）は、以下の方法で２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。青色染色ビーズの２．５％懸濁液０．２−より得られた塊を、ＰＢＳ（３Ｘ１．０ｍｌ２）で洗浄し、次に実施例１記載のとおりゲルタールアルデヒドで処理した。活性化に続いて、洗浄したビーズをＰＢＳ０．３５−に懸濁し、無菌水中成長因子１５，０μｇを含有する溶液０．１５ｍ１＋で処理した。懸濁液を室温で２０時間混合した。カップリング反応に続いて、ビーズを実施例１記載のとおり処理し、次いで貯蔵用緩衝液０　、５　ｍ（ｌに懸濁し、用時まで４℃で維持した。

実施例４８組み換えヒトエリトロポイエチン（ｒＨｕＥ　Ｐ　Ｏ）のコーバインドＭ・ウェル・ストリップスへの結合組み換えヒトエリトロポイエチン（ｒＨｕＥＰＯ）は、０．０２５ＭＨＥＰＥＳ緩衝液中５０％グリセロールから成る５００単位活性／ｍ１２の溶液を含有する液体調製物として、アムゲンより入手しｔ；。

Ｍコーバインド　・ウェル・ストリップスのストリップスは、表面を化学的に変化（すなわち活性化）させてタンパクと共有結合するようになっており、これはマイクロ・メンブランズ・インコーポシーティッド、ニューアーク、ニューシャーシー州より入手した。

８−ウェル・ストリップの４個のウェルは、以下のように充てんしたニストリップを被覆し、３５℃で３時間加温した。上澄Ａ−Ｄを採り、残存活性検定用に貯えた。ウェルは緩衝液（２ＸＯ，１ｍＱ）で洗浄し、次に用時調製した１％ＢＳＡ／ＦＢ３０．２ｄ部分で処理し、再度３５℃で１時間加温した。これらの上澄は捨てた。次にウェルは１％フンギゾーンを含有するＲＰＭＩ−７６４０組織培養溶媒で完全に洗浄（３Ｘ　０．２ｍｌ２）Ｌ、同じ液で充てんした。

ストリップは被覆は、用時まで４℃を維持しｔ；。

実施例４９固定化組み換えＩＬ−１−βポリスチレンビーズで刺激したＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞から産生じたＩＬ−２を用いたＣＴＬＬ−２細胞の成長９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−βは、ミズミリンパ腫セルラインＬＢＲＭ、ＴＧ６（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ薦ン・カンパニー、ロックビル、ＭＤ）のＩＬ−２合成を誘起し、そのＩＬ−２をＩＬ−２依存性セルライン中で検定した。固定化ＩＬ−１−βビーズは実施例２１記載のとおり、懸濁液で３回洗浄し、遠心にかけた。ＩＬ−１− βビーズは、準至適濃度のＰＨＡ［７（トヘマグルチニンＰ１ウェルカム・７アウンデーシＪン、ダンフォード、イングランド］（１０μｇ／ｍ（ｉ）と−緒に、イスコブのＭＥＭ（フィタッ力−Ｍ、Ａ、バイオプロダクツ、ワルカースビレ、ＭＤ）ｌｏｏｍ（＋中の５Ｘ１０’ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞に加え［Ｊ　、Ｗ、ラリツクら、Ｊ、イムツール・メソッズ、７９巻３９頁（１９８５年）］、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で４８時間加温した。反応は、ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞を４ ℃のところに２４時間置くことによって止めた。次にＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞上澄５０μＱ部分を採り、新鮮なＣＴＬＬ−２細胞５０μａに加えた。放出された可溶性ＩＬ−２は、それがＣＴＬＬ−２，細胞の成長を保持した場合に検定して測定した。ＣＴＬＬ−２細胞の成長は、Ｉ　Ｌ−２濃度に依存し、取り込み、およびテトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４゜５−ジメチルチアゾール−２−イル）− ２，５−ジフェニルテトラゾリウム・ブロマイド）の酸化により測定した［Ｔ、モスマン、ジャーナル・オブ・イムツール・メス、６５巻５５頁（１９８３年）；並びにＭ、Ｂ、ハンセン、Ｓ、Ｅ、二−ルノンおよびに、ベルブ、ジャーナル・オブ・イムツール・メス１１９巻２０３−２１０頁（１９８９年）］。結果は表１４にまとめたが、ＩＬ−１−βビーズがＬＢＲＭ。

ＴＧ６細胞から可溶性ＩＬ−２の放出を活性化し、ＬＢＲＭ、ＴＧ６により放出されたＩＬ−２がＩ　Ｌ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞の成長を保持することが示唆される。

実施例５０ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−ａがＬ　Ｂ　ＲＭ。

ＴＧ６のＩＬ−２産生を促す。

９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−、は、ネズミリンパ腫セルラインＬＢＲＭ、ＴＧ６（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシクン）にＩＬ−２合成を促し、そのＩＬ−２をＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２セルラインで検定した。

ヒト配列ＩＬ−１−σを、実施例３６記載のとおり９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ＩＬ−１−σビーズを実施例２１記載のとおり３回洗浄した。ＩＬ−１−αビーズを、ＰＨＡ［フィトヘマグルチニンＰ１ウェルカム・ファウンデーション、ダンフォード、イングランド］（１０μｇ／ｍのと共に、イスコブのＭＥＭ１００μ４中（７）５Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＬＢＲＭ、ＴＧ６４：加、ｔ、５　％　ＣＯ！雰囲気下３７℃で４８時間加温した。反応は、ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞を４℃のところへ２４時間置くことによって止めｆ：。次に、ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞上澄５０ｐＱを採り、新鮮なＣＴＬＬ−２細胞５０μＱに加えた。放出した可溶性ＩＬ−２を実施例４９記載のとおり検定した。結果は表１５にまとめるが、ＩＬ−１−αビーズがＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞から可溶性ＩＬ −２の放出を活性化し、ＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞により放出されたＩＬ−２はＩＬ −２依存性ＣＴＬＬ−２細胞の成長を保持することが示唆される。

実施例５１固定化組み換えヒ１−ＧＣ５ＦにおけるＡＭＬ−１９３細胞の成長９．６４μｍ責色染色ポリスチレンビーズに固定しｔ；組み換えヒトＧＣＳＦ（ｒＨｕＧＣＳＦ）は、イン・ビトロで成長因子（ＧＣ３Ｆ）依存性セルラインＡＭＬ−１９３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシラン）の成長を保持する場合に、測定した。組み換えヒトＧＣ３Ｆは実施例３７記載のとおり９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕＧＣ５Ｆビーズを実施例２１記載のとおり洗浄した。ＡＭＬ−１９３セルラインの成長検定は以下のとおりである。洗浄したビーズを実施例３３記載のとおり９６ウ工ル平底組織培養プレートの各ウェルに加え、続いてＡＭＬ−１９３細胞ｌＸｌ０’加えた。ｒＨｕＧＣＳＦを固定したビーズをＡＭＬ−１９３細胞と一緒に５％ＣＯ３雰囲気下３７℃で１１６時間加温した。次いで［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ）を各ウェルに加え、混合物をさらに４時間加温した。細胞を実施例２１記載のとおり収集した。

結果は表１６にまとめるが、固定化組み換えヒ！−ＧＣ９ＦがＡＭＬ−１９３細胞の成長を保持することが示唆される。

実施例５２０．９３μｍポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭｕＧＭＣＳＦ）がＢＤＦ１マウスの顆粒球形成を刺激する０、９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣＳＦ（ｒＭｕＧＭＣＳＦ）は、ＢＤＦ　ｌマウスの顆粒球形成を刺激する。組み換えネズミＧＭＣ３Ｆを、実施例３８記載のとおり０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒ　Ｍ　ｕ　ＧＭＣ３Ｆビーズは、可溶性ｒＭｕＧＭｃＳＦと同様、注射後のマウス末梢血の顆粒球形成を刺激する。イシダら、アクタ、ヘマトロジ力。

８巻１頁（１９８８年）は最近、可溶性ＧＭＣ３ＦＩ回注射の後、０ＭＣ３Ｆがマウス末梢血の顆粒球形成を刺激すると報告した。これらの実験を、固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆがイン・ビポで活性である場合に、固定化ｒＭｕＧＭＣ９Ｆを用いて繰り返した。ＢＤＦ　ｌマウスに可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ（２０単位、腹腔内注射）かまたは固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ（５０単位、血管内注射）のどちらかを注射した。末梢血はＢＤＦｌマウスの後部眼窩洞から、０．６．１２．２４．４８．７２および９６時間に採取し、全血球算定から好中球数（ＰＭＮ）／ｍＩ２を測定した。結果は図５に示したが、固定化ｒＭｕＧＭＣＳＦはイン・ビポで活性であることが示唆される。さらに、結果よりビーズはＰＭＮの産生を数（約２倍増加）および速度（１２時間で最高、以ｖｋ減少し２４〜４８時間以内に初期値に達する）において刺激し、可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆに匹敵することが示唆される。

実施例５３０．９３μｍポリスチレンビーズに固定しｔ；組み換えネズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ）がシクロホスファミド処理ＢＤＦ　ｌマウスの顆粒球形成を刺激する０、９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ３Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ９Ｆ）は、シクロホスファミド処理したマウスの顆粒球形成を刺激する。組み換えネズミＧＭＣ３Ｆを、実施例３８記載のとおり、０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定したｒＭｕＧＭＣ９Ｆビーズは可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ同様、注射後マウス末梢血の顆粒球形成を刺激する。イシダら、アクタ、ヘマトロジ力、８巻１頁（１９８８年）は最近、マウスにシクロホスファミド１回注射して、マウスのリンパ球を枯渇した後、ＧＭＣＳＦがマウスの末梢血で顆粒球形成を刺激することが報告されｔ；。

ＧＭＣＳＦを繰り返し投与することにより、これらのマウスのリンパ球数は、未処理マウスより２−３日早く回復することができる。

固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆはイン・ビボで活性を示す（実施例５２）ので、シクロホス７アミド処理マウスに可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆかまたは固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆのどちらかを投与し、ｒＭｕＧＭＣ５Ｆの好中球数に及ぼす効果を測定した。実験計画は以下のとおりである。０時に、ＢＤＦＩマウスにシクロホスファミド（２５０＋ｘｇ／ｋｇ体重）を注射し、好中球セル数を枯渇した。２４時間後、可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ（１２時間毎に６日間、２単位を腹腔内注射；または１．３および５日に２単位を血管内注射）または固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ（１，３および５日に２単位を血管内注射）を投与した。０．３．５．７および９日にＢＤＦ　１マウスの後部眼窩洞より末梢血を採取し、全血球算定から好中球数（ＰＭＮ）７ｍＩ２を測定しｔ；。結果は図６に示すが、固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆはイン・ビボで活性であることが示唆されるＯさらに、ｒＭｕＧＭＣ５ＦビーズはＰＭＮ産生を数および速度において刺激し、これは可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆに匹敵する。

実施例５４共有結合したｒＭｕＧＭＣ５Ｆポリスチレンビーズはサイトカイン活性を保持するが、吸収されたｒＭｕＧＭＣＳＦポリスチレンビーズはサイトカイン活性を保持しない０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに共有結合的に付着し！二組み換え不ズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ）は生物学的活性を保持する（すなわち、ＤＡＩ−Ｅ５細胞の成長を促進する）が、０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに吸収されｆ：ｒＭｕＧＭｃＳＦは生物学的活性を保持しない（すなわち、ＤＡ　ｌ　−Ｅ　５細胞が成長しない）。共有績した、および吸収されたｒＭｕＧＭＣＳＦ青色染色ポリスチレンビーズは実施例３９記載のとおり調製し、洗浄した。実施例２１記載の検定を行う前に、ビーズを３回洗浄した。ＩＬ−３／ＧＭＣ３Ｆ／ＥＰＯ依存性セルラインチあるＤＡＩ−Ｅ５細胞は、ドクター・ラリ− ・ギルバート、アルタ大学、エドモントン、アルペルタ、カナダから入手し、ｒＭｕＧＭＣ５Ｆの可溶性部分および（共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆビーズ部分の両方の検定に用いた。ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ検定は以下のとおりである。ＤＡｌ−Ｅ５細胞（ＩＸＩＯつを可溶性ｒＭｕＧＭＣ５Ｆまたは（共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕＧＭＣＳＦのどちらかを実施例２１記載のとおり４８時間加温した。Ｍ　Ｔ　Ｔ　ｔ　ｆ：、は［３Ｈ］−チミジンｌ μＣｉのどちらかを加えた。混合物をさらに４時間加温した。細胞は実施例２１記載のとおり回収した。ポリスチレンビーズをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄したとき、吸収されたｒＭｕＧＭＣ５Ｆをとり出した（ｒＭ７）。これらのビーズはもはや生物学的活性を保持しなかった。しかし共有結合したｒＭｕＧＭＣ５Ｆは、ＳＤＳで洗い流されなかった。これらのビーズは生物学的活性を保持した。

この結果は表１７にまとめる。

実施例５５９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定しＩ；組み換えヒトインスリン様成長因子−１（ｒＨｕｌＬＧＦ−１）は粗リンパ球調製物を刺激し血清無添加溶媒で増殖する組み換えヒ）ＩＬＧＦ−１は、実施例４０記載のとおり９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕｌＬＧＦ−１ビーズを実施例２１記載のとおり洗浄した。シムフら、アクタ・エンドクリノロシカ１０２巻２１頁（１９８３年）は、ＩＬＧＦ−１はレクチン共刺激と組み合わせると、血清無添加溶媒においてリンパ球の成長を促すことができると報告している。組み換えヒトＩＬＧＦ−１活性は以下のように検定した：ＲＰＭＩ−１６４０組織培養溶媒］　００ｔｔＱ、５μｇ／ｍ１２ＰＨＡｓ　Ｏ，２５％低内毒素ＢＳＡおよび可溶性ｒＨｕｌＬＧＦ−１かまたは固定化ｒＨｕｌＬＧＦ−１ビーズのどちらかを含む９６ウ工ル平底組織培養プレートの各ウェルにリンパ球ｌＸｌ０’を加えた。

混合物を３７℃で４８時間加温した。

次に［”Ｈ］−チミジンｌμＣｉ／ウェルを加え、混合物をさらに１８時間加温した。細胞は実施例２１記載のとおり回収しＩ；。結果は表１８にまとめる。これよりポリスチレンビーズに固定化されたｒＨｕＩＬＧＦ−１は、血清無添加溶媒中ＰＨＡ共刺激検定において、リンパ球の成長を誘起することが示唆される。

実施例５６９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えヒトインスリン様成長因子（ｒＨｕＩ　ＬＧＦ−ｎ）が血清無添加溶媒中粗リンパ球調製物を刺激して増殖する。

組み換えヒ）ＩＬＧＦ−Ｉｆは、実施例４１記載のとおり９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕＧ　Ｆ　−Ｉｆビーズを実施例２１記載のとおり洗浄した。実施した検定は実施例５５で記載しｔ；とおりである。結果は表１９にまとめるが、固定化ｒＨｕＩＬＧＦ−ｎビーズは血清無添加溶媒中のＰＨＡ共刺激検定において、リンパ球の成長を誘起することが示唆される。

実施例５７固定化組み換えヒトＩｌｌ瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａ）がネズミＬＭ細胞を死滅する９、６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換え腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−σ）は、７２時間死滅検定でネズミＬＭ細胞を死滅する。組み換えＴＮＦ−ｔを実施例４２記載のとおり９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ＴＮＦ−ａビーズを実施例２１記載のとおり３回洗浄した。ＴＮＦ−σ死滅をネズミＬＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を用いて検定した。検定は以下のとおりであった。可溶性ＴＮＦ−σか固定化ＴＮＦ−ａのどちらかを９６−ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに加え、ざらにｌＸｌ０’ＬＭ細胞を加えた。混合物を７２時間加温しｔ；。次に、死滅をｌμＣｉ［Ｈ’］−チミジンを各ウェルに加えるかまたはＭＴＴを加えることにより検定し、混合物をさらに４時間加温した。チミジン標識した細胞を実施例２１記載のとおり収集した。ＭＴＴ標識した細胞をイソプロピルアルコールＩ；固定し、ＭＴＴ取り込み量を５９Ｏｎ＋ｍでの吸収の読みにより、測定した。結果を表２０にまとめｔ；が、固定化ＴＮＦ−ａは、チミジンの取り込み、ＭＴＴの取り込みおよび酸化を阻害することを示唆し、このことは細胞死を示す。

実施例５８２．８５μｍポリスチレンビーズに固定した線繊芽細胞成長因子ベーシック（ＦＧＦｂ）が成長因子枯渇溶媒中ネズミ３Ｔ３細胞の成長を誘起する固定化ＦＧＦｂは成長因子枯渇溶媒中ネズミ３Ｔ３細胞の成長を刺激する。実施例４３により調製した固定化ＦＧＦｂビーズを、実施例２１記載のとおり懸濁液により３回洗浄し、遠心にかけた。ネズミ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジン）は、本明細書に参考として添付したゴスポダロウクッ、不一チャー２４９巻１２３頁（１９７４年）に−告されているとおり、抗生物質および１０％子ウシ血清（ａＳ）を含む１．２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）溶媒中成長した。３Ｔ３細胞はトリプシン化により単離し、１０％ｃｓ加ＤＥＭ溶媒中６００かまたは２０００セル／ウエル（９６−ウェルプレート）で置いた。３Ｔ３細胞を３７℃で一晩加温しｔ；。

翌朝ウェルを３回洗浄し、０．４％ａｓ含有ＤＥＭ溶媒中に再懸濁し、さらに２４時間加温して細胞および溶媒の成長因子を枯渇した。２４時間後、０．４％ｃｓ含有ＤＥＭ溶媒中、可溶性ＦＧＦｂ、固定化ＦＧＦｂまたは１０％ｃｓのいずれかを各ウェルＩ；加え、３Ｔ３細胞をさらに２４−４８時間加温した。次に細胞をＩμＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジンで標識し、さらに１６時間加温しｊ；。結果は表２１に示す。これより固定化ＦＧＦｂビーズは可溶性ＦＧＦｂに匹敵する値まで３７３細胞の成長を刺激することが示唆される。

実施例５９２．８５μｍポリスチレンビーズに固定しＩ；形質転移成長因子β−２（Ｔ　Ｇ　Ｆ−β−２）が成長因子枯渇溶媒中ＮＨＫ−４９Ｆ細胞の成長を誘起する。

固定化ＴＧＦ−β−２は、成長因子枯渇溶媒中ＮＨＫ−４９Ｆ細胞の成長を刺激する。実施例４４の方法により調製した固定化ＴＧ遠心にかけた。ＮＨＫ−４９ＦＭｉ胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジン）は、本明細書に参考として添付したアソインら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー２５８巻７１５２５頁（１９７３年）に報告されたとおり、抗生物質および１０％子ウシ血清（ｃｓ）を含むＤＥＭ溶媒中成長した。ＮＨＫ−４９Ｆ細胞をトリプシン化により単離し、１０％ｃｓ１Ｊｒ）ＤＥＭ溶媒中５Ｘ１０’セル／ウェル（９６ウエルプレート）の濃度で置いた。細胞は５％ｃｏ２雰囲気下３７℃ で一晩加温し、次に０．２％ｃｓ含有ＤＥＭ溶媒中２回洗浄した。溶媒は０．２％ｃｓ加ＤＥＭ１００ｐ１２で置き換え、細胞を上記のとおり３−４日間加温し、溶媒の成長因子を枯渇した。ＮＨＫ−４９Ｆ細胞が合わせて約７５％に達したとき、可溶性ＴＧＦ−β−２ａｓ固定化ＴＧＦ−β−２ａまたはｌＯ％ｃｓを各ウェルに加え、ＮＨＫ−４９Ｆ細胞をさらに１７時間加温した。次にｌμＣｉ［Ｈ１〕−チミジンをウェルに加え、細胞をさらに４時間加温した後、実施例２１記載のとおり回収した。結果は表２２にまとめる。固定化ＴＧＦ−β−２ビーズは成長因子枯渇溶媒中ＮＨＫ−４９Ｆ細胞の成長を刺激することが示唆される。

実施例６０固定組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａがインターフェロン感受性ヒーラＳ３セルラインを死滅させる固定組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａがインターフェロン感受性ヒーラＳ３セルラインを死滅させた。２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａ　（ＩＮＦ−アルファー２ａ）はヒト上皮がんセルラインヒーラＳ３中〔Ｈ３］−チミジンの取り込みを阻害する（すなわちヒーラＳ３を死滅させる）。組換え体ＩＮＦ−アルファー２ａを実施例４５に記載したように２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ＩＮＦＮチーファー２ａビーズを実施例２１に記載したように３回洗浄した。ＩＮＦ−アルファー２ａ死滅をヒト上皮がんセルラインヒトＳ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を使用して検定した。ＩＮＦ−アルファー２ａは［”Ｈ］−チミジンの取り込みを遮断し、細胞壊死を導く。検定は次の通りである。可溶性ＩＮＦ−アルファー２ａまたは固定ＩＮＦ−アルファー２ａのいずれかのアリコートを９６ −ウェル平底組織培養プレートに個々のウェルを加え、続いてｌＸｌ０’ヒーラＳ３細胞を加えた。ＩＮＦ−アルファー２ａまたは可溶性ＩＮＦ−アルファー２ａのビーズを４８または７２時間インキュベートし、この間に［３Ｈ］−チミジン１μＣｉを各ウェルに加え、混合物をさらに４時間インキュベートした。細胞を実施例２１に記載したように収集した。結果は第２３表に示され、固定ＩＮＦ −アルファー２ａがヒーラＳ３腫瘍細胞のチミジンの取り込みを阻害し、壊死を導くことを示している。

実施例６１０．９３μｍポリスチレンビーズをに固定した組換え体ヒト表皮成長因子はＮＲＫ−４９Ｆ細胞を血清なしで成長させる０　９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組換え体ヒト表皮成長因子（ｒＨｕＥＧＦ）はＮＲＫ−４９Ｆ細胞を血清なしで成長させる。組換え体ヒトＥＧＦを実施例４６に記載したように０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ｒＨｕＥＧＦビーズを試験例２１に記載したように３回洗浄した。血清はインビトロで細胞が成長するのに必要な多くの成長因子を含んでいる。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞の検定方法は、次の通りである。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞を１０％うし血清（ＣＳ）を加えたＤＭＥＭ　（ダルベコズ・モディファイド・イーグル培地、ホワイタカー・Ｍ、Ａ、パイコプロダクツ）培地で維持した。ＮＨＫ−４９Ｆ細胞を９６−ウェル平底組織培養プレートにウェルあたり５Ｘ１０３細胞で乗せ、１０％Ｏ８で２４時間インキュベートした。細胞を血清なしの培地で洗浄し、血清なしのＤＭＥＭを補充した。可溶性ｒＨｕＥＧＦまたは固定ｒＨｕＥＧＦのいずれかのアリコートを個々のウェルに加え−た。ｒＨｕＥＧＦのビーズまたは可溶性ｒＨｕＥＧＦを２４または４８時間インキュベートした。成長を各ウェルに１μＣｉを加えて測定し、混合物をさらに６時間インキュベートした。細胞を実施例２１に記載されたように収集した。結果は第２４表示され、固定ｒＨｕＥＧＦがマウスＮＨＫ−４９Ｆ成長を誘導することを示している。

実施例６２２．８５μｍポリスチレンビーズに固定した組換え住血小板誘導成長因子は血清なしで成長するマウス３Ｔ３細胞を誘導する２、８５μｍポリスチレンビーズに固定した組換え住血小板誘導成長因子（ｒＨｕＰＤＧＦ）は血清なしで成長するマウス３Ｔ３細胞を誘導する。組換え体ヒトＰＤＧＦを実施例４７に記載したように２．８７μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ｒＨｕＰＤＧＦビーズを試験例２１に記載したように３回洗浄した。血清は細胞がインビトロで成長するのに必要な多（の成長因子を含んでいる。はとんどの細胞はこれらの成長因子が枯渇すると成長しない。マウススイス３Ｔ３は上記セルラインであり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能である。検定方法は次の通りである。スイス３Ｔ３細胞を１０％うし血清（Ｃ８）を加えたＤＥＭＥ培地で維持した。３Ｔ３細胞を９６−ウェル平底組織培養プレート中ウェルあたりｌＸｌ０’細胞でプレートし、全面培養になるまで成長させた。培地を２％Ｃ８に変えると、３Ｔ３細胞は生育するが成長しなかった。成長因子を加える前に、細胞を血清なしのＤＭＥＭで２％Ｏ８がなくなるまで洗浄し、血清なしのＤＭＥＭを補充した。可溶性ｒＨｕＰＤＧＦまたは固定ｒＨｕＰＤＧＦを個々のウェルに加えた。成長を各ウェルに［３Ｈ］−チミジン１μＣ】を加えて測定し、混合物をさらに６時間インキュベートした。細胞を実施例２１に記載したように収集した。結果は第２５表に示され、固定ｒＨｕＰＤＧＦはマウス３Ｔ３細胞成長を誘導することを示している。

実施例６３Ｃｏ−Ｂｉｎｃｌ（商標）ポリスチレンプレートに固定した組換え体ヒトエリスロボイエチンによるＤＡｌ−Ｅ５細胞の成長Ｃｏ−Ｂｉｎｄ（商標）ポリスチレンプレートに固定した組換え体ヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥＰｏ）はＥＰＯ／ＩＬ−３依存ＤＡＤ、−Ｅ５細胞の成長を誘導する（実施例５４参照）。組換え体ヒｈＥＰ○を実施例４８に記載したようにＣｏ−Ｂｉｎｄ（商標）ポリスチレンプレートに固定した。固定ｒＨｕＥＰｏを含むつ工ルをＩＸ　ＰＢＳで５回洗浄し、続いて１０％熱−不活性化血清を含むイスコープのＭＥＭで５回洗浄し、その後１０％血清を含むＩＭＤＭｏ、０５０ｍ１で満たした。１ｘｌｏ’細胞を固定ｒＨｕＥＰＯまたは可溶性ｒＨｕＥＰｏを含むウェルに加えた。細胞を４８時間インキュベートした後、ＭＴＴまたは［３Ｈ］−チミジン１μＣ１を各ウェルに加え、混合物をさらに４時間インキュベートした。結果は第２６表に示され、固定ｒＨｕＥＰｏがＥＰＯ／ＩＬ−３依存ＤＡＩ−Ｅ５細胞に成長を誘導することが示されている。

実施例６４組換え体ヒトガンマーインターフェロンのＣｏ−Ｂｉｎｄ（商１ｊｌ）ウェルストリップへの結合組換え体ヒトガンマーインターフェロン（ｒＨｕ　Ｉ　ＦＮ−ガンマ）を、ｌＸ１０’Ｕ／ｍｌ　（２，５Ｘ１０”Ｕ／ｍｇ）を含む液体製剤としてマサチューセッツ州、ボストン、ゲンザイムから入手した。この溶液のアリ：＋　−ト（０，０２ｍ１．２Ｘ１０’Ｕ）をＰＢＳ２ｍ］で希釈して、貯蔵溶液をＩ　Ｘ　１０’Ｕ／ｍ　］にした。］８−ウェルストリップ４のウェルを以下に示すように満たした。

ｒＨｕ　ＩＦＮ−ガン７　ＰＢＳ、ｍｌウェル　ｍｌ　単位、Ａ　Ｏ，１１００００，１Ｂ　Ｏ，０５５０００，１５ＣＯ，０１１０００，１９Ｄ　０．００５　１０　鉤１９５ウェルを満たした後、ストリップを覆い、３７℃で３時間インキュベートし、正確に実施例４８に記載したように処理した。ＰＢＳで徹底的に洗浄し、ウェルをＰＢＳで満たし、ストリップを覆い、使２用するまで４℃で放置した。

実施例６５組換え体ヒトガンマーインターフェロンの生物学的活性ヒト末梢血液単球をヘパリン化シリンジへの採血から分離し、４６％バーコルにュージャージー州、ネワーク、ファルマシア社）で勾配遠心により単離した。単球を界面から単離し、りん酸緩衝食塩水で３回洗浄し、ｍ】あたりＩ　Ｘ　１０’細胞の濃度になるまで５％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中再懸濁した。実施例６７のように固定した４種のウェルガンマ−インターフェロンを含むＣｏ−ｂｉｎｄ（商標）ストリップをりん酸緩衝食塩水で３回洗浄し、２％フンギーバクトを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、無菌ガーゼで拭いた。各ウェルにＯ，１ｒｎｌ容量の１×１０５単球を加えた。可溶性ガンマ−インターフェロンを、固定ガンマ−インターフェロンを含まないウェルに加えた。培養物を２４時間インキュベートし、培地０．１ｍｌを取り除き、市販のエリザキットを使用して腫瘍壊死因子産生を検定した。第２７表に示された結果は、固定ガンマ−インターフェロンに生物学的活性があることを示している。

本発明を様々な具体的および好ましい態様および技術に基づいて記載した。しかしながら、多くの変更および修正を本発明の精神および範囲内においてなし得ることが明らかである。

第１表族　メンバー上皮成長因子（ＥＧＦ）　上皮成長因子腫瘍増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）ワクシニア成長因子（ＶＧＦ）うさぎ線維腫形成因子（ＳＦＧＦ）粘液層成長因子（ＭＧＦ）アンフィレグリン（ＡＲ）血小板由来成長因子　ＰＤＧＦ−ＡＡ（ＰＤＧＦ）　ＰＤＧＦ−ＡＢＰＤＧＦ−ＢＢ腫瘍増殖因子ベータ　ＴＧＦ−ベータ１（ＴＧＦ−ベータ）　ＴＧＦ−ベータ２ＴＧＦ−ベータ３ＴＧＦ−ベータ４インヒビンミュラー阻害物質（ＭＩＳ）骨形態蛋白（ＢＭＰ’ｓ）繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）　酸性ＦＧＦ塩基性ＦＧＦｈｓｔ遺伝子生成物１ｎｔ−２遺伝子生成物インスリン様成長因子（ＩＧＦ）　ＩＧＦ−Ｉレラキサン特表千４−５０３６０７　（４１）分あたりの分解率（ＤＰＭ’ｓｘ　１０−３）分あたりの分解率（Ｄ　ＰＭ’　ｓＸ　１０−３）分あたりの分解率（ＤＰＭ’５Ｘ１０−”）分あたりの分解率（ＤＰＭ’５Ｘ１０−リ時間（時）ＦＩＧ、　５Ａ “時間（時）ＦＩＧ、　５Ｂ末梢血液のＰＭＮ１μ青色ビーズと結合したｒＭｕＧＭＣ３Ｆ残余パーセント！２；０　−５ｃ′″ｌ　Ｊ′ｕ１　（７１−Ｊ　ロ　ロ　０ｏｏｏｏ　ロ　ｏｏｏｏ。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１ｏ３１、発明の名称固定化サイトカイン類３、特許出願人名称　イムノセラビューティックス・インコーホレイテッド４、代理人住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号ツイン２１ＭＩＤタワー内　電話（０６）９４９−１２６１１９９１年７月２６日６、添付書類の目録（１）補正書の翻訳文　１　過成長因子とも呼ばれる一群のサイトカインは、それらの生物活性の中でも、走化的活性、上皮細胞および線維芽細胞の増殖、成長および分化、マトリックス形成および軟骨形成の刺激並びに管形成（血管形成）を含む創傷治癒および組織修復に対する陽性または陰性調節作用を有する。多数の生物活性蛋白質がこの領域内で報告され、分類原則に従ってそれらの生物学的作用およびアミノ酸配列相同性に基づき群および種類に分類されている（下記表１に示されている通り）。この群のサイトカインは組織修復に関与するが、それらは他の生物学的作用を有する。さらに、他のサイトカイン類、例えば免疫応答を調節するインターロイキン− １およびインターロイキン−３もまた組織修復に対する作用を有する。

表皮成長因子（ＥＧＦ）は、腫よう増殖因子（ＴＧＦ）アルファ、アンフィレグリンおよびワクシニア成長因子を含む一群の構造的に関連した蛋白質の重要な代表的構成員である。ヒトＥＧＦは最初尿から単離され、それが胃液分泌を阻止し得ることからウロガストロンと命名された（Ｈ，グレゴリ−１「ネイチャー」、２５７．３２５（１態がある。Ｊ　、Ｍ、ウォズネイおよびＶ、ローゼン等、「サイエンス」、２４２．１５２８（１９８８）参照。

繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、１４−１８キロダルトンの単鎖蛋白質である。２種の充分に特性確認された形態は、脳および下垂体から単離された塩基性ＦＧＦ、並びに脳および網膜から単離された酸性ＦＧＦである。塩基性ＦＧＦは、大部分の系において、酸性ＦＧＦよりも安定し、１０倍の効力を有する。ＦＧＦの両形態は、同じレセプターに結合し、中胚葉起源の細胞、例えば線維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋、筋芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞に対して細胞分裂促進性を示す。Ｆ、エシュおよびＡ、ベアド等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８２．６５０７（１９８５）参照。１ｎｔ− ２およびｈｓｔプロト−騰よう遺伝子の生成物もまた、ＦＢＦ群の構成員として含まれる。

（Ｃ，ディクソンおよびＧ、ピータース、「ネイチャー」、３２６．８３３（１９８７）参照）。

ツマトメディンＣとしても知られているインシュリン様成長因子１（Ｉ　ＬＧ− １）およびインシュリン様成長因子１１（ＩＬＧ−１１）は、血清から最初に精製され、軟骨へのスルフェート取り込みの刺激、インシュリン様活性および増殖刺激活性の３つの生物活性を共有する若干の因子に関する現行の名称を代表する。肝臓および線維芽細胞は循環性インシュリン様成長因子の主たる供給源であるが、本質的に全ての組織がそれらを生産することが示された。

また、インシュリン様成長因子は、それらの生物活性の中でも、グルコース代謝を刺激し、線維芽細胞、セルトリ細胞、胎児脳細胞、筋芽細胞、レンズ上皮、すい臓ベータ細胞、レクチン刺激リンパ球、および血小板誘導成長因子と「反応能をもつ」状態になった後密度阻止されＩ：Ｂａ１ｂ／ｃ　３　Ｔ　３細胞のＤＮＡ合成および細胞増殖を刺激することが示された。（Ｒ，Ｃ，バクスター、Ａｄｖ、　ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、、２５．５０（１９８６）参照）。

サイトカイン類は、それら自体複合体であり、サブユニットを構成し得る細胞表面レセプターと反応する。サイトカインの一部分は、ンビーズ；１．１２−ジアミノドデカン結合手をもつ６５μｍカルボキシレートポリスチレンビーズ；５．２９μｍアミンポリスチレンビーズ；及びセファテックス（商標）Ｇ−１０ポリデキストランビーズ（実施例１，２．６．７．８．９．１３．１４及び１５参照）に固定化した組換え型Ｉ　Ｌ−２（Ａｌａ　−１２５同族体）の試料を、固定したＩＬ−２がＩ　Ｌ−２保存細胞系ＣＴＬＬ−２、マウス細胞傷害性Ｔ−リンパ球細胞系ＡＴＣＣ＃ＴＩ　Ｂ−２１４のインビトロ成長を支持するか否かを測定するため試験した。

固定化Ｉ　Ｌ−２を含むビーズの試料を、ベックマン・マイクロフェーダ中、４％抗生物質（ファンジーバクト・ソリューション、アーゲイン・サイエンティフィック、サンタ、アナ、カリホルニア）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中、懸濁及び遠心により３回洗浄した。！Ｌ−２固定化ビーズをＲＰＭＩ−１６４０培地中に再び懸濁し、インビボ生成試験に用いた。ビーズのアリコツトを９６−ウェル平底組織培養板（ファルコン＃３０７５、ペクトン・デイキンノン・アンド・コンバニイ、ラザ７オード拳ニュージャーシイ）実施例２９可溶性組み換えＩ　Ｌ−２または固定化ＩＬ−２により誘起されたＬＡＫ細胞活性固定化組み換えＩ　Ｌ−２（ａｌａ　−１２５同族体）上で成長させたヒトＰ　Ｂ　Ｌ’ｓを、それらがリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を示すかどうかにつき測定した。ヒトＰＢＬ″Ｓは実施例２８に記載されるとおりに単離し、実施例１記載のとおり調製したＩＬ−２固定化ビーズで９６時間活性化し、実施例２１記載のとおり洗浄した。ＬＡＫ細胞の死滅作用は、作用標的に５６２、ラジおよびダウディを用いて検定した。ＬＡＫ細胞死滅検定には、文献に報告されている４時間”Ｃｒ放出検定を用いた。Ｔ、Ｌ、ホワイトサイドら、キャンサー・イムツール、イム／セラ、２６巻１頁（１９８８年）；Ｈ，Ｆ、プロスら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロジ−１巻５１頁（１９８１年）参照。新鮮なＰＢＬ″Ｓかも単離された正常ＮＫ（ナチュナル・キラー）細胞はに６５２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４３ヒト慢性骨髄性白血病）を死滅するが、ラジ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８６ヒトバーキツトリンパｌ１ｌ）またはダウディ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２１３ヒトバーキツトリンパ腫）が活性化状態にある時はそれらを死滅しない。結果は再度３５℃で１時間加温した。これりの上澄は捨てた。次にウェルは１％フンギゾーンを含有するＲＰＭＩ−７６４０組織培養溶媒で完全に洗浄（３Ｘ　０．２ｍ４）Ｌ、同じ液で充てんした。ストリップは被覆は、用時まで４℃を維持した。

実施例４９固定化組み換えＩＬ−１−βポリスチレンビーズで刺激したＬＢＲＭ、ＴＧ６細胞から産生じたＩＬ−２を用いたＣＴＬＬ−２細胞の成長９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えＩＬ−１−βは、ミズミリンパ腫セルラインＬＢＲＭ、ＴＧ６（アメリー　カン・タイプ・カルチャー・コレクション・カンパニー、ロックビル、ＭＤＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７７８）のＩＬ−２合成を誘起し、そのＩ　Ｌ−２をＩＬ−２依存性セルライン中で検定した。固定化ＩＬ−１−βビーズは実施例２１記載のとおり、懸濁液で３回洗浄し、遠心にかけた。ＩＬ−１−βビーズは、準至適濃度のＰＨＡレイトヘマグルチニンＰ１ウェルカム・ファウンデーション、タンフ才激し、可溶性ｒＭｕＧＭｃｓＦに匹敵することが示唆される。

実施例５３０．９３μｍポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ３Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ）がシクロホス７アミド処理ＢＤＦＩＦウスの顆粒球形成を刺激する０、９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換えネズミＧＭＣ５Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ）は、シクロホスファミド処理したマウスの顆粒球形成を刺激する。組み換えネズミＧＭＣＳＦを、実施例３８記載のとおり、０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定しｔ：ｒＭｕＧＭｃＳＦビーズは可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ同様、注射後マウス末梢血の顆粒球形成を刺激する。イシダら、アクタ、ヘマトロジ力、８０巻１頁（１９８８年）は最近、マウスにシクロホスファミド１回注射して、マウスのリンパ球を枯渇した後、ＧＭＣＳＦがマウスの末梢血で顆粒球形成を刺激することが報告された。ＧＭＣＳＦを繰り返し投与することにより、これらのマウスのリンパ球数は、未処理マウスより２− ３日早く回復することができる。固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆはイン・ビポで活性を示す（実施例５２）ので、ズはサイトカイン活性を保持しない０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに共有結合的に付着した組み換えネズミＧＭＣ３Ｆ（ｒＭｕＧＭＣ３Ｆ）は生物学的活性を保持する（すなわち、ＤＡＩ−Ｅ５細胞の成長を促進する）が、０．９３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに吸収されたｒＭｕＧＭＣ３Ｆは生物学的活性を保持しない（すなわち、ＤＡ　１−Ｅ　５細胞が成長しない）。ＤＡ　１−Ｅ　５はマウス白血病ウィルス誘導ＤＡＩリンノく腫、カナダ国、アルバータ、エドモントン、アルタ大学のラリ− ・ギルバート博士〔ブランチ等、１９８７年、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　６９巻１７８２−１７８５頁〕のクローンである。共有結した、および吸収されたｒＭｕＧＭＣ５Ｆ青色染色ポリスチレンビーズは実施例３９記載のとおり調製し、洗浄した。実施例２１記載の検定を行う前に、ビーズを３回洗浄した。Ｉ　Ｌ−３／ＧＭＣ５Ｆ／ＥＰＯ依存性セルラインであるＤＡ　ｌ　−Ｅ　５細胞は、ドクター・ラリ−・ギルバート、アルタ大学、エドモントン、アルベルタ、カナダから入手し、ｒＭｕＧＭＣ３Ｆの可溶性部分および（共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕＧＭＣ３Ｆビーズ部分の両方の検定に用いた。ｒＭｕＧＭＣ５Ｆ検定は以下のとおりである。ＤＡ　１−Ｅ　５細胞（ＩＸＩＯつを可溶性ｒＭｕＧＭＣ３Ｆまたは（共有結合または吸収された）固定化ｒＭｕＧＭＣ５Ｆのどちらかを実施例２１組み換えヒ）　Ｉ　ＬＧＦ−ｎは、実施例４１記載のとおり９．６３μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ｒＨｕＧ　Ｆ　−１１ビーズを実施例２１記載のとおり洗浄した。実施した検定は実施例５５で記載したとおりである。結果は表１９にまとめるが、固定化ｒＨｕＩＬＧＦ−Ｉ［ビーズは血清無添加溶媒中のＰＨＡ共刺激検定において、リンパ球の成長を誘起することが示唆される。

実施例５７固定化組み換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）がネズミＬＭ細胞を死滅する９、６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組み換え腫瘍°　壊死因子ａ　（Ｔ　Ｎ　Ｆ−σ）は、７２時間死滅検定でネズミＬＭ　（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　１．２、Ｌ９２９結合組織のＮＣＴＣクローン）細胞を死滅する。組み換えＴＮＦ−αを実施例４２記載のとおり９．６４μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定化ＴＮＦ−σビーズを実施例２１記載のとおり３回洗浄した。

ＴＮＦ−σ死滅をネズミＬＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を用いて検定した。検定は以下のとおりであった。可溶性ＴＮＦ−実施例６０固定組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａがインターフェロン感受性ヒーラＳ３セルラインを死滅させる固定組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａがインターフェロン感受性ヒーラＳ３セルラインを死滅させた。２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した組換え体ヒトインターフェロンーアルファー２ａ　（ＩＮＦ−アルファー２ａ）はヒト上皮がんセルラインヒーラ５３ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２，２ヒト頚部上皮がん中［Ｈ３］−チミジンの取り込みを阻害する（すなわちヒーラＳ３を死滅させる）。組換え体ＩＮＦ−アルファー２ａを実施例４５に記載したように２．８５μｍ青色染色ポリスチレンビーズに固定した。固定ＩＮＦ−アルファー２ａビーズを実施例２１に記載したように３回洗浄した。ＩＮＦ−アルファー２ａ死滅をヒト上皮がんセルラインヒトＳ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を使用して検定した。ＩＮＦ−アルファー２ａは［３Ｈ］−チミジンの取り込みを遮断し、細胞壊死を導く。検定は次の通りである。可溶性ＩＮＦ−アルファー２ａ４たは固請求の範囲（１）細胞と固定化サイトカインとの接触段階を含む細胞における生物活性の刺激方法であり、上記固定化サイトカインは共有非臭化シアン結合により固体支持体に堅固かつ安定した状態で結合しており、固定化サイトカインが少なくとも実質的に遊離サイトカインの示す生物活性を有し、固定化サイトカインが再使用可能である方法。

（２）サイトカインが、ウレタン、トリアジンエーテル、アミンまたはアミド結合を用いて固体支持体に結合している、請求項１記載の方法。

（３）サイトカインがアミンまたはアミド結合を用いて固体支持体に結−合している、請求項２記載の方法。

（４）さらに結合アームを含み、サイトカインが結合アームにより固体支持体に結合している、請求項１記載の方法。

（５）結合アームが、（ａ）一般式ＮＨ＊　Ｒ’　ＮＨｚ（式中、Ｒ１はＣ＊　Ｃｔｏアルキル基である）を有するジアミン類、（ｂ）一般式Ｎ　Ｈｚ　Ｒ”　ＣＯ！　Ｈ（式中、Ｒ２はＣ，−Ｃ２゜アルキル基である）を有するアミノ酸、および（ｃ）一般式０ＨＣ−Ｒ”−ＣＨｏ（式中、ＲｓはＣＩ　Ｃ２０アルキル基である）を有するジアルデヒド類から成る群から選ばれた１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項４記載の方法。

（６）結合アームが、６−アミノカプロン酸、■、６−ジアミツヘキサン、１．１２−ジアミノドデカン、グルタルアルデヒドれらの混合物から成る群から選択された１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項５記戦の方法。

（７）サイトカインが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、腫よう壊死因子、ガンマ−インターフェロン、アル７アーインター７エａン、ベーターインターフェロン、エリトロポエチン、か数球コロニー刺激因子、ネズミか数球コロニー刺激因子、カ数球−マクロファージ・コロニー刺激因子、ネズミか数球ーマクロファージ・コロニー刺激因子、インシュリン様成長因子１１インシユリン様成長因子Ｉ＋，腫よう増殖因子ベータ、類表皮成長因子、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子ベーシックから成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。

（８）サイトカインが、インターロイキン−１１インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、か数球〜マクロファージ刺激因子、か数球コロニー刺激因子、エリトロポエチン、アルファーインターフェロン、腫よう壊死因子、インシュリン様成長因子！、インシュリン様成長因子ＩＩ、線維芽細胞成長因子ベーシック、腫よう増殖因子ベータ、類表皮成長因子および血小板由来成長因子から成る群から選ばれる、請求項７記載の方法。

（９）サイトカインが、インターロイキン−Ｉ−アルファ、インターロイキン− １−ベータ、組換えインターロイキン−２、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、ネズミか粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子、ヒトか粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子、ヒトか数球コロニー刺激因子、ヒト・エリトロポエチン、アル７アーインターフエロン、ガンマ−インターフェロン、腫よう［Ｉ［子−フルファ、ヒト・インシュリン様成長因子Ｉ、ヒト・インシュリン様成長因子Ｈ，線維芽細胞成長因子ベーシック、腫よう増殖因子ベーターＩＩ。

ヒト類表皮成長因子、ヒト血小板由来成長因子から成る群から選ばれる、請求項７記載の方法。

（ｌＯ）サイトカインが、インターロイキン−２、か粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子、か数球コロニー刺激因子、エリトロポエチン、腫よう壊死因子、線維芽細胞成長因子ベーシック、腫よう増殖因子ベータ、血小板由来成長因子から成る群から選ばれる、請求項７記載の方法。

（１１）サイトカインが、類表皮成長因子、血小板由来成長因子、腫よう増殖因子ベータ、線維芽細胞成長因子並びにインシュリン様成長因子Ｉおよびインシュリン様成長因子■１から成る群から選ばれる成長因子である、請求項１記載の方法。

（１２）サイトカインが、サイトカインの生物活性を有する、遺伝学的または化学的に得られた類縁体、誘導体またはフラグメント、または生物学的に均等な合成リガンドを含む、請求項１記載の方法。

（１３）サイトカインが、ポリエチレングリコール修飾インターロイキン−２またはａｌａ　−１２５インターロイキン−２類縁体である、請求項１２記載の方法。

（１４）固体支持体が生物学的融和性である、請求項１記載の方法。

（１５）固体支持体が生物分解性である、請求項１４記載の方法。

（１６）固体支持体が非多孔質である、請求項１記載の方法。

−（１７）固体支持体が、約０．５−５００μｍの直径を有する実質的に球形のビーズである、請求項１６記載の方法。

（１８）球形ビーズが約１−７５μｍの直径を有する、請求ＸＪ１７記載の方法。

（１９）固体支持体が約５−２００μｍの直径を有する短繊維である、請求項１６記載の方法。

（２の支持体が、無機支持体、例えばガラス、石英、セラミック、ゼオライト、金属および金属酸化物、ポリマー材料、例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジェン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから成る群から選ばれる七ツマ一単位から誘導されたホモポリマーおよびコポリマー、炭水化物支持体、例えばアガロース、架橋アガロース、デキストラン、インシュリン、ヒアルロン酸、セルロース、セルロース誘導体、澱粉および澱粉誘導体、および不溶性蛋白質材料、例えばゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンから成る群から選ばれる、請求項１６記載の方法。

（２１）支持体力、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジェン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルおよびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから成る群から選ばれる七ツマ一単位から誘導されたホモポリマーまたはコポリマーを含む、請求項２０記載の方法。

（２２）支持体が、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシルおよび水硫基から成る群から選ばれる複数の官能基を有する官能化表面を含む、請求項１６記載の方法。

（２３）サイトカイン依存性セルラインのインビトロ培養を含む方法であって、セルラインの生長に関する固定化サイトカインの有効量をセルラインと接触させることにより、その生長を誘導することを含む、請求項」記載の方法。

（２４）依存性セルラインがＣＴＴＬ−２（ＡＴＣＣ＃ＴＩ　Ｂ−７１４）であり、サイトカインがインターロイキン−２である、請求項２３記載の方法。

（２５）依存性セルラインがＡＭＬ−１９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−９５８９）であり、サイトカインが、ヒトか粗球−マクロファージ・コロニー刺激因子、ヒトか数球コロニー刺激因子およびインターロイキン−３から成る群から選ばれる、請求項２４記載の方法。

（２６）依存性セルラインがスイス３Ｔ３（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−９２）であり、サイトカインが血小板誘導成長因子または線維芽細胞成長因千−ベータである、請求項２３記載の方法。

（２７）依存性セルラインがＮＨＫ−４９Ｆ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７０）であり、サイトカインが腫よう増殖因子−ベータまたは類表皮ＩＲ長因子である、請求項２３記載の方法。

（２８）依存性セルラインがＤＡＩ−Ｅ５であり、サイトカインがエリトロポエチンである、請求項２３記載の方法。

（２９）細胞性血液成分のインビトロ培養方法であって、細胞性血液成分の成長に関する固定化サイトカインのを動量を前記成分と接触させることにより前記成分の成長を誘導することを含み、固定化サイトカインが共有非臭化シアン結合により固体支持体へ堅固かつ安定した状態で結合している場合、固定化サイトカインは少なくとも実質的に遊離サイトカインの示す生物活性を有し、固定化サイトカインが再使用可能である方法。

（３０）細胞性血液成分がヒト末梢血リンパ球である、請求項２９記載の方法。

（３１）リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、腫よう浸潤性リンパ球および細胞毒性Ｔ細胞から成る群から選ばれるエアエフター細胞のインビトロ培養方法であって、エアエフター細胞の成長に関する固定化サイトカインの有効量を前記細胞と接触させることにより前記細胞の生長を誘導することを含み、固定化サイトカインが共有非臭化シアン結合により固体支持体へ堅固かつ安定した状態で結合しており、前記固定化サイトカインが実質的に遊離サイトカインの示す生物活性を有し、前記固定化サイトカインが再使用可能である方法。

（３２）造血細胞の生長に関する固定化サイトカインの有効量を注射することを含む、宿主の造血細胞生長のインビボ刺激方法であって、固定化サイトカインが共有非臭化シアン結合により固体支持体へ堅固かつ安定した状態で結合しており、前記固定化サイトカインが実質的に少なくとも遊離サイトカインの示す生物活性を有し、前記固定化サイトカインが再使用可能である方法。

（３３）造血細胞がか数球マクロ７アージであり、サイトカインがか数球−マクロ７アージ・コロニー刺激因子である、請求項３２記載の方法。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）固体支持体に結合したサイトカインを含む固定化サイトカインであって、遊離サイトカインにより示された実質的生物活性を有し、さらに再使用可能な固定化サイトカイン。
（２）サイトカインが固体支持体に共有結合している、請求項１記載の固定化サイトカイン。
（３）サイトカインが、ウレタン、トリアジンエーテル、アシンまたはアミド結合を用いて固体支持体に共有結合している、請求項２記載の固定化サイトカイン。
（４）サイトカインがアミンまたはアミド結合を用いて固体支持体に共有結合している、請求項３記載の固定化サイトカイン。
（５）さらに結合アームを含み、サイトカインが前記結合アームにより固体支持体に結合し、前記結合アームが、（ａ）一般式ＮＨ２−Ｒ１−ＮＨ２（式中、Ｒ１はＣ２−Ｃ２０アルキル基である）を有するジアミン類、（ｂ）一般式ＮＨ２−Ｒ２−ＣＯ２Ｈ（式中、Ｒ２はＣ１−Ｃ２０アルキル基である）を有するアミノ酸、および（ｃ）一般式ＯＨＣ−Ｒ３−ＣＨＯ（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ２０アルキル基である）を有するジアルデヒド類から成る群から選ばれた１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項４記載の固定化サイトカイン。
（６）結合アームが、６−アミノカブロン酸、１，６−ジアミノヘキサン、１，１２−ジアミノドデカン、グルタルアルデヒドおよびそれらの混合物から成る群から選択された１個またはそれ以上の結合基を含む、請求項５記載の固定化サイトカイン。
（７）サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、腫よう壊死因子、ガンマーインターフェロン、アルファーインターフエロン、ベーターインターフェロン、エリトロポエチン、か粒球コロニー刺激因子、ネズミか粒球コロニー刺激因子、か粒球ーマクロファージ・コロニー刺激因子、ネズミか粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子、インシュリン様成員因子Ｉ、インシュリン様成員因子ＩＩ、腫よう増殖因子ベータ、類表皮成長因子、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子ベーシックから成る群から選ばれる、請求項１記載の固定化サイトカイン。
（８）サイトカインが、ＩＬ−２、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＮＦ、ＦＧＦｂ、ＴＧＦｂ、ＰＤＧＦから成る群から選ばれる、請求項７記載の固定化サイトカイン。
（９）サイトカインが、ポリエチレングリコール修飾ＩＬ−２または８１ａ１２５ＩＬ−２類縁体である、請求項８記載の固定化サイトカイン。
（１０）固体支持体が非多質である、請求項１記載の固定化サイトカイン。
（１１）固体支持体が、約０．５−５００μｍの直径を有する実質的に球形のビーズである、請求項１０記載の固定化サイトカイン。
（１２）球形ビーズが約１−７５μｍの直径を有する、請求項１１記載の固定化サイトカイン。
（１３）固体支持体が約５−２００μｍの直径を有する短繊維である、請求項１２記載の固定化サイトカイン。
（１４）支持体が、無機支持体、例えばガラス、石英、セラミック、ゼオライト、金金属および金属酸化物、ポリマー材料、例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジエン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから成る群から選ばれるモノマー単位から誘導されたホモポリマー、コポリマーおよびオリゴポリマー、炭水化物支持体、例えばアガロース、架橋アガロース、デキストラン、架橋デキストラン、イヌリン、ヒアルロン酸、セルロース、セルロース誘導体、澱粉および澱粉誘導体、および不溶性蛋白質材料、例えばゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンから成る群から選ばれる、請求項１０記載の固定化サイトカイン。
（１５）支持体が、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレン、ブタジエン、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルおよびメタクリル酸のエステル、酢酸ビニル、フルオロアルケン、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから成る群から選ばれるモノマー単位から誘導されたホモポリマー、コポリマーまたはオリゴポリマーを含む、請求項１４記載の固定化サイトカイン。
（１６）支持体が、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、水硫基およびハロゲンから成る群から選ばれる複数の官能基を有する官能化表面を含む、請求項１０記載の固定化サイトカイン。
（１７）サイトカイン依存性セルラインのインビトロ培養方法であり、固体支持体に結合させた有効量のサイトカインとセルラインを接触させることにより、その成長を誘導することを含む方法。
（１８）依存性セルラインがＣＴＴＬ−２であり、サイトカインがＩＬ−２である、請求項１７記載の方法。
（１９）依存性セルラインがＡＭＬ−１９３であり、サイトカインが、ＨｕＧＭＣＳＦ、ＨｕＧＣＳＦおよびＩＬ−３から成る群から選ばれる、請求項１７記載の方法。
（２０）依存性セルラインがＢａ１ｂ／３Ｔ３であり、サイトカインがＰＤＧＦまたはＦＧＦ−ベータである、請求項１７記載の方法。
（２１）依存性セルラインがＮＲＫ−４９Ｆであり、サイトカインがＴＦＧ−ベータまたはＥＧＦである、請求項１７記載の方法。
（２２）依存性セルラインがＤＡ１−Ｅ５であり、サイトカインがエリトロポエチンである、請求項１７記載の方法。
（２３）細胞血液成分のインビトロ培養方法であり、固体支持体に結合させたサイトカインの有効量を前記成分と接触させることにより前記成分の成員を誘導することを含む方法。
（２４）細胞血液成分がヒト末梢血リンパ球である、請求項２３記載の方法。
（２５）リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、腫よう浸潤性リンパ球および細胞毒性Ｔ細胞から成る群から選ばれるエフエクター細胞のインビトロ培養方法であり、固体支持体に結合させたサイトカインの有効量を前記細胞と接触させることにより前記細胞の成長を誘導することを含む方法。
（２６）固体支持体に結合させた有効量のサイトカイン注射することを含む、宿主の免疫系における天然キラーまたはリンホカイン活性化キラー細胞のインビボ刺激方法。
（２７）固体支持体に結合させた有効量のサイトカインを注射することを含む、宿主の造血細胞生長のインビボ刺激方法。
（２８）造血細胞がか粒球マクロファージであり、サイトカインがＧＭＣＳＦである、請求項２７記載の方法。
（２９）宿主への導入前に固体支持体へサイトカインを結合させることを含む、サイトカインを安定化させ、インビボ蛋白質分解的減成を実質的に低減化させる方法。
（３０）宿主への導入前に固体支持体へサイトカインを結合させることを含む、サイトカインの全身吸収およびサイトカインの吸収により誘発された毒性を阻止する方法。