JP2018513839A - 塩基性線維芽細胞増殖因子(fgf−2)および血小板由来増殖因子(pdgf)を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子を含む組成物、および、組織損傷を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進するためのその使用に関する。
Description
本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子を含む組成物、および、組織損傷を治療する、老化を阻害する、または発毛を促進するためのその使用に関する。
多種多様の負傷および病理学的プロセスが、組織内で生じ得る。損傷組織の修復は、組織再生、損傷組織を置き換えるための健康な隣接組織からの新たな組織の増殖に依存する。組織再生は、生理学的な細胞および分子レベルで厳重に制御され、増殖因子、炎症促進性および抗炎症性分子、およびプロテアーゼを含む、多くの因子の作用およびバランスを必要とする。これらの因子の調和された制御は、再生された組織が、その解剖学的および生理学的役割を満たす適切な構造、形状および機能を有することを確実にさせる。
損傷組織の修復は、以下の理由から、しばしば非効率である。(1)新たな組織の形成は、組織損傷の近くの細胞のアポトーシスによって打ち消される、(2)進行中の疾患プロセスは、組織再生に対して有害な作用を有する、および、(3)局所的な微小環境は、組織修復および再生の助けとならない。これらの制限は、しばしば、損傷組織または老化組織の準最適または部分的な修復をもたらす。
本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも1つの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)アイソフォームおよび少なくとも1つの血小板由来増殖因子(PDGF)アイソフォームを含む組成物は、損傷組織および老化組織の効果的な修復を促進することを見いだした。組成物は、したがって、治療的なものとして用いることができる。また、組成物は、発毛を促進するためにも用いられる。組成物は、治療的細胞を生産する方法において、さらに用いられる。
したがって、本発明は、少なくとも1つの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)アイソフォームおよび少なくとも1つの血小板由来増殖因子(PDGF)アイソフォームを含む、組成物を提供する。
また、本発明は、以下も提供する:
−治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における損傷組織を治療するステップを含む、患者における損傷組織を修復する方法;
−治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における老化を阻害するステップを含む、患者における老化を阻害する方法;
−治療的な量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における発毛を促進する方法;
−患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む;
−患者における老化を阻害する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む;
−患者における発毛を促進する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む;および
−損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法であって、当該方法は、
本発明の組成物の存在下で、単核細胞(MC)、中胚葉性系列の前駆細胞(PML)および/または免疫調節性前駆細胞(IMP)を培養するステップ、および、MC、PMLおよび/またはIMPの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む。
−治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における損傷組織を治療するステップを含む、患者における損傷組織を修復する方法;
−治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における老化を阻害するステップを含む、患者における老化を阻害する方法;
−治療的な量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における発毛を促進する方法;
−患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む;
−患者における老化を阻害する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む;
−患者における発毛を促進する方法での使用のための、本発明の組成物であって、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む;および
−損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法であって、当該方法は、
本発明の組成物の存在下で、単核細胞(MC)、中胚葉性系列の前駆細胞(PML)および/または免疫調節性前駆細胞(IMP)を培養するステップ、および、MC、PMLおよび/またはIMPの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む。
開示された産物および方法の異なる適用は、当該分野における特定のニーズに合わせられ得ることが理解されるよう。また、本明細書において用いられる専門用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためだけのものであり、限定されることを意図しないことも理解されよう。
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「a」、「an」、および「the」は、内容が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞(a cell)」との言及は2以上のそのような細胞(cells)を含み、「組織(a tissue)」との言及は2以上のそのような組織(tissues)を含み、「患者(a patient)」との言及は2以上のそのような患者(patients)を含むなどである。
上記であろうと下記であろうと、本明細書中に挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体で参照により本明細書に援用される。
[本発明の組成物]
本発明は、少なくとも1つの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)アイソフォームおよび少なくとも1つの血小板由来増殖因子(PDGF)アイソフォームを含む、組成物を提供する。組成物は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5つのbFGFアイソフォームを含んでよい。組成物は、少なくとも2、少なくとも3または少なくとも4つのPDGFアイソフォームを含んでよい。
本発明は、少なくとも1つの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)アイソフォームおよび少なくとも1つの血小板由来増殖因子(PDGF)アイソフォームを含む、組成物を提供する。組成物は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5つのbFGFアイソフォームを含んでよい。組成物は、少なくとも2、少なくとも3または少なくとも4つのPDGFアイソフォームを含んでよい。
組成物は、損傷組織を修復するのに適している。組成物は、損傷組織と接触されてよく、それに適用されてよく、またはそれに注入されてよい。また、組成物は、老化を阻害するのにも適している。組成物は、老化組織と接触されてよく、それに適用されてよく、またはそれに注入されてよい。また、組成物は、発毛を促進するのにも適している。
[塩基性線維芽細胞増殖因子]
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、FGF2またはFGF−βとしても知られる)は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。線維芽細胞増殖因子ファミリーは、分泌成長因子の大きなファミリーであり、そのメンバーは、創傷治癒、血管新生、エンドクリンシグナリングおよび多数の発生プロセスにおける機能を有する。それらは、数多くの細胞および組織の増殖および分化に重要である。全ての線維芽細胞増殖因子は、似た内部コアを共有し、ヘパリンに関して高い親和性を有する。線維芽細胞増殖因子は、3つの免疫グロブリン様ドメインおよびヘパリン結合配列を含むチロシンキナーゼ受容体である線維芽細胞増殖因子受容体の結合および活性化を通して作用する。また、細胞表面上のヘパランサルフェートプロテオグリカンも、線維芽細胞増殖因子シグナルの伝達において役割を果たす。
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、FGF2またはFGF−βとしても知られる)は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。線維芽細胞増殖因子ファミリーは、分泌成長因子の大きなファミリーであり、そのメンバーは、創傷治癒、血管新生、エンドクリンシグナリングおよび多数の発生プロセスにおける機能を有する。それらは、数多くの細胞および組織の増殖および分化に重要である。全ての線維芽細胞増殖因子は、似た内部コアを共有し、ヘパリンに関して高い親和性を有する。線維芽細胞増殖因子は、3つの免疫グロブリン様ドメインおよびヘパリン結合配列を含むチロシンキナーゼ受容体である線維芽細胞増殖因子受容体の結合および活性化を通して作用する。また、細胞表面上のヘパランサルフェートプロテオグリカンも、線維芽細胞増殖因子シグナルの伝達において役割を果たす。
多くの線維芽細胞増殖因子と同様に、bFGFは、多面的な生物学的役割を有する。それは特に、神経系における胚形成および形態形成、および骨形成に関与する。また、塩基性線維芽細胞増殖因子は、主な血管新生因子でもあり、創傷治癒において重要な役割を有する。塩基性線維芽細胞増殖因子は、基底膜内に、および、正常組織内の血管の内皮下の細胞外マトリックス内に存在する。創傷治癒の間、血管新生を開始するために、ヘパランサルフェート−分解酵素の作用がbFGFを活性化させると考えられている。
一部の例では、bFGFは、パラクリンまたはオートクリン様式で作用する。別の例では、bFGFは、イントラクリン活性を示す。換言すれば、bFGFは、分泌物の不存在下で、細胞内標的に対して直接的な効果を有することができる。
前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームは、典型的にヒトである。あるいは、前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームは、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来であってよい。
ヒトbFGFの作用の異なるモードは、5つの異なるbFGFアイソフォームが単一のFGF2遺伝子から形成され得るという事実に起因し得る。bFGFアイソフォームは全て、同一の機能を発揮する潜在性を有するが、異なる位置に見られる傾向がある。それぞれのアイソフォームは、異なるmRNA翻訳開始部位と関連する。AUG開始コドンは、18kDa(155アミノ酸)細胞質アイソフォームへ導き、それはオートクリンおよびパラクリン作用を担う。4つのCUG開始コドンは、22kDa(196アミノ酸)、22.5(201アミノ酸)、24kDa(210アミノ酸)、および34kDa(288アミノ酸)のbFGFアイソフォームを生じさせる。これらのアイソフォームは、核に局在し、bFGFのイントラクリン効果を担う。
本発明の組成物は、任意のbFGFアイソフォームを含んでよい。本発明の組成物は、好ましくは、(a)18kDa bFGF(配列番号1)またはその変異体、(b)22kDa bFGF(配列番号2)またはその変異体、(c)22.5kDa bFGFまたはその変異体、(d)24kDa bFGF(配列番号3)またはその変異体、および、(e)34kDa bFGF(配列番号4)またはその変異体の、少なくとも1つを含む。組成物は、任意の数および任意の組み合わせのbFGFアイソフォームを含んでよい。組成物は、全てのbFGFアイソフォームを含んでよい。
本発明の組成物は、(a);(b);(c);(d);(e);(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および(e);(b)および(c);(b)および(d);(b)および(e);(c)および(d);(c)および(e);(d)および(e);(a)、(b)および(c);(a)、(b)および(d);(a)、(b)および(e);(a)、(c)および(d);(a)、(c)および(e);(a)、(d)および(e);(b)、(c)および(d);(b)、(c)および(e);(b)、(d)および(e);(c)、(d)および(e);(a)、(b)、(c)および(d);(a)、(b)、(c)および(e);(a)、(b)、(d)および(e);(a)、(c)、(d)および(e);(b)、(c)、(d)および(e);または(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を含んでよい。(a)〜(e)のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
bFGFアイソフォームの変異体は、bFGFアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していて少なくとも部分的なbFGF活性を保持する、ポリペプチドである。変異体の活性は、それが由来するbFGFアイソフォームの活性と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%低減され得る。bFGFアイソフォームの変異体は、好ましくは、bFGFアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していてbFGF活性を保持する、ポリペプチドである。bFGF活性は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて決定することができる。例えば、bFGF変異体をインビトロ血管新生アッセイに加える効果を試験することができる。血管新生アッセイは、当技術分野で知られている(Auerback et al.,Clin Chem.2003 Jan;49(1):32−40)。
配列番号1、2、3または4のような、bFGFアイソフォームのアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、アミノ酸同一性に基づいて、好ましくは、その配列と少なくとも50%相同であり、例えば、その配列と50%同一である。より好ましくは、変異体は、配列全体にわたって、bFGFアイソフォームのアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、およびより好ましくは、少なくとも95%、97%または99%相同であってよく、または、配列全体にわたってbFGFアイソフォームのアミノ酸配列と同一であってよい。一続きの100またはそれよりも多い、例えば125、150、175または200またはそれよりも多い、連続するアミノ酸にわたって、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、90%または95%、アミノ酸同一性が存在してよい(「ハードホモロジー」)。
当技術分野における標準的な方法を用いてホモロジーを決定してよい。例えば、UWGCG Packageは、BESTFITプログラムを提供し、それを用いてホモロジーを計算することができ、例えば、そのデフォルト設定で用いられる(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12,p387−395)。例えば、Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290−300;Altschul,S.F et al(1990)J Mol Biol 215:403−10に記載されるように、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを用いて、ホモロジーを計算し、または、配列を整列させることができる(例えば、同等の残基または対応する配列を(典型的に、それらのデフォルト設定で)同定する)。BLAST分析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公に利用可能である。
アミノ酸置換は、bFGFアイソフォームのアミノ酸配列に対して、例えば、1、2、3、4、5、10、20または30置換までされ得る。保存的置換は、同様の化学構造、同様の化学特性または同様の側鎖ボリュームの他のアミノ酸によって、アミノ酸を置換する。導入されたアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と、同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有してよい。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の場所において、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してよい。保存的アミノ酸変更は、当技術分野でよく知られていて、以下の表1に定義される20個の主なアミノ酸の特性に従って選択してよい。アミノ酸が同様の極性を有する場合は、これは、表2におけるアミノ酸側鎖に関するハイドロパシースケールを参照して決定することもできる。
bFGFアイソフォームのアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基は、上述のポリペプチドからさらに欠失してよい。1、2、3、4、5、10、20または30個まで、またはそれよりも多くの残基が欠失してよい。
変異体は、bFGFアイソフォームのフラグメントを含んでよい。そのようなフラグメントは、少なくとも部分的なbFGF活性を保持する。フラグメントは、少なくとも50、100、150または200アミノ酸の長さであってよい。
これに代え又はこれに加えて、1つまたは複数のアミノ酸が、上述のポリペプチドに付加されてよい。伸長は、bFGFアイソフォームまたはその変異体のアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端に提供されてよい。伸長は、かなり短く、例えば、1〜10アミノ酸の長さであってよい。あるいは、伸長は、より長く、例えば、50または100アミノ酸までであってよい。
塩基性線維芽細胞増殖因子は、単量体として分泌されるが、細胞表面のヘパランサルフェートとの相互作用の際に、二量体を形成することができる。実際に、二量体bFGFは、線維芽細胞増殖因子受容体の活性化および二量体化が可能な、非共有の左右交互(side−to−side)構造を有する。
本発明の組成物は、上記に示したbFGFの少なくとも1つのアイソフォームを含む。前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームは、単量体であってよい。前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームは、二量体であってよい。組成物が少なくとも2つのbFGFアイソフォームを含む場合は、アイソフォームの全てが単量体であってよい。あるいは、アイソフォームの全てが二量体であってよい。組成物が少なくとも2つのbFGFアイソフォームを含む場合は、組成物は、単量体bFGFおよび二量体bFGFの両方を含んでよい。前記の少なくとも1つの二量体bFGFは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってよい。配列番号1〜5およびそれらの変異体は、(a)〜(e)として上述される。ホモ二量体bFGFは、(a)および(a)、(b)および(b)、(c)および(c)、(d)および(d)または(e)および(e)を含んでよい。ヘテロ二量体bFGFは、任意の2つの異なるbFGFアイソフォームまたはそれらの変異体を含んでよい。ヘテロ二量体bFGFは、(a)〜(e)として上述される、任意の2つの異なるbFGFアイソフォームまたはそれらの変異体を含んでよい。ヘテロ二量体bFGFは、好ましくは、(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および(e);(b)および(c);(b)および(d);(b)および(e);(c)および(d);(c)および(e);または(d)および(e)を含む。本発明の組成物は、(i)単量体bFGF、(ii)ホモ二量体bFGF、および(iii)ヘテロ二量体bFGFの少なくとも1つ、例えば、(i);(ii);(iii);(i)および(ii);(i)および(iii);(ii)および(iii);または(i)、(ii)および(iii)を含む。組成物は、単量体bFGF、ホモ二量体bFGF、およびヘテロ二量体bFGFの全てを含んでよい。組成物は、ヘテロ二量体FGFの1つよりも多い形態、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の形態のヘテロ二量体FGFを含んでよい。
前記の少なくとも1つのbFGFは、好ましくは組み換えbFGFである。組み換えタンパク質を生産する方法は、当技術分野でよく知られている。
組成物における、bFGFポリペプチドの合計濃度(すなわち、前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームの合計量)は、好ましくは、組成物のミリリットルあたり、約50pgおよび約500pgの範囲内である。例えば、bFGFポリペプチドの合計濃度(すなわち、前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームの合計量)は、組成物のミリリットルあたり、約75pg〜約475pg、約100pg〜約450pg、約125pg〜約425pg、約150pg〜約400pg、約175pg〜約375pg、約200pg〜350pg、約225pg〜約325pg、約250pg〜約300pg、または約275pgであってよい。
[血小板由来増殖因子]
bFGF同様に、血小板由来増殖因子(PDGF)は、細胞の増殖および分裂を制御する。それは、血小板によって生産され、それらのα顆粒内に保管され、そして、血小板活性化の際に放出される。また、PDGFは、平滑筋細胞、活性化マクロファージ、および内皮細胞を含む、多くの他の細胞によっても生産される。
bFGF同様に、血小板由来増殖因子(PDGF)は、細胞の増殖および分裂を制御する。それは、血小板によって生産され、それらのα顆粒内に保管され、そして、血小板活性化の際に放出される。また、PDGFは、平滑筋細胞、活性化マクロファージ、および内皮細胞を含む、多くの他の細胞によっても生産される。
PDGFは、間葉系細胞および特定の他の細胞型の、増殖、生存および運動性を刺激する。この増殖因子は、胚発生、および、成体における組織恒常性のために特に重要である。また、PDGFは、血管新生の制御においても重要な役割を果たす。PDGFアイソフォームは、α−およびβ−チロシンキナーゼ受容体(PDGFRαおよびPDGFRβ)に結合して、それらの細胞効果を発揮する。PDGFRαおよびPDGFRβは、5つの免疫グロブリン様ドメインを有する細胞外ドメイン、および、キナーゼドメインを保有する細胞内部分を含む、似た構造を共有する。
前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームは、典型的にヒトPDGFである。あるいは、前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームは、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来であってよい。
ヒトPDGFの5つの公知のアイソフォームが存在する。全てのアイソフォームは、ジスルフィド結合された二量体タンパク質である。PDGF−AA、PDGF−BB、PDGF−CCおよびPDGF−DDはホモ二量体であり、それぞれ、2つのA−(配列番号5)、B−(配列番号6)、C−(配列番号7)またはD−(配列番号8)ポリペプチド鎖からなる。また、PDGFは、ヘテロ二量体、PDGF−ABとして存在してもよい。PDGF−AおよびPDGF−Bは、細胞内で活性化されて、続いて分泌されるが、PDGF−CおよびPDGF−Dは、細胞外プロテアーゼによる活性化を必要とする潜伏性の因子として分泌される。機能の違いが、異なるアイソフォーム間に存在する。
本発明の組成物は、少なくとも1つのPDGFアイソフォームを含む。組成物は、好ましくは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの、PDGFのアイソフォームを含む。組成物は、好ましくは、少なくとも1つのホモ二量体PDGFを含む。ホモ二量体PDGFは、(a)2つのPDGF−Aサブユニット(配列番号5)またはその変異体、(b)2つのPDGF Bサブユニット(配列番号6)またはその変異体、(c)2つのPDGF−Cサブユニット(配列番号7)またはその変異体、または(d)2つのPDGF−Dサブユニット(配列番号8)またはその変異体を含んでよい。組成物は、好ましくは、少なくとも1つのヘテロ二量体のPDGFを含む。ヘテロ二量体のPDGFは、(e)1つのPDGF−Aサブユニット(配列番号5)またはその変異体および1つのPDGF−Bサブユニット(配列番号6)またはその変異体を含んでよい。
組成物は、任意の数のホモ二量体およびヘテロ二量体PDGFアイソフォームを、任意の組み合わせで含んでよい。組成物は、全てのホモ二量体およびヘテロ二量体のPGDFアイソフォームを含んでよい。換言すれば、本発明の組成物は、(a);(b);(c);(d);(e);(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および(e);(b)および(c);(b)および(d);(b)および(e);(c)および(d);(c)および(e);(d)および(e);(a)、(b)および(c);(a)、(b)および(d);(a)、(b)および(e);(a)、(c)および(d);(a)、(c)および(e);(a)、(d)および(e);(b)、(c)および(d);(b)、(c)および(e);(b)、(d)および(e);(c)、(d)および(e);(a)、(b)、(c)および(d);(a)、(b)、(c)および(e);(a)、(b)、(d)および(e);(a)、(c)、(d)および(e);(b)、(c)、(d)および(e);または(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を含んでよい。(a)〜(e)のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
PDGFアイソフォームの変異体は、PDGFアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していて少なくとも部分的なPDGF活性を保持する、ポリペプチドである。変異体の活性は、それが由来するPDGFアイソフォームの活性と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%低減され得る。PDGFアイソフォームの変異体は、好ましくは、PDGFアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有していてPDGF活性を保持する、ポリペプチドである。PDGF活性は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて決定することができる。例えば、PDGF変異体をインビトロ血管新生アッセイに加える効果を試験することができる。血管新生アッセイは、当技術分野で知られている(Auerback et al.,Clin Chem.2003 Jan;49(1):32−40)。
配列番号5、6、7または8のような、PDGFアイソフォームのアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、アミノ酸同一性に基づいて、好ましくは、その配列と少なくとも50%相同であり、例えば、その配列と50%同一である。より好ましくは、変異体は、配列全体にわたって、PDGFアイソフォームのアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、および、より好ましくは、少なくとも95%、97%または99%相同であってよく、または、配列全体にわたってPDGFアイソフォームのアミノ酸配列と同一であってよい。一続きの100またはそれよりも多い、例えば125、150、175または200またはそれよりも多い、連続するアミノ酸にわたって、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、90%または95%、アミノ酸同一性が存在してよい(「ハードホモロジー」)。
PDGFは、好ましくは、組み換えPDGFである。組み換えタンパク質を生産する方法は、当技術分野でよく知られている。
物本発明の組成物における、PDGFポリペプチドの合計濃度(すなわち、前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームの合計量)は、好ましくは、組成物のミリリットルあたり、約5000pgおよび約25000pgの範囲内である。例えば、PDGFポリペプチドの合計濃度(すなわち、前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームの合計量)は、組成物のミリリットルあたり、約6000pg〜約24000pg、約7000pg〜約23000pg、約8000pg〜約22000pg、約9000pg〜約21000pg、約10000pg〜約20000pg、約11000pg〜約19000pg、約12000pg〜約18000pg、約13000pg〜約17000pg、約14000pg〜約16000pg、約15000pgであってよい。
組成物における、合計PDGFポリペプチドに対する合計bFGFポリペプチドの比は、約1:10および約1:500の範囲内、例えば、約1:50〜約1:450、約1:100〜約1:400、約1:150〜約1:350、または、約1:200〜約1:300である。
[他の増殖因子および生体活性成分]
本発明の組成物におけるbFGFおよびPDGFは、損傷組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進する。また、それらは血管新生も促進する。したがって、本発明の組成物は、好ましくは、組織再生を増大または改善し、および/または、アポトーシスを低減または低下させる。組成物は、好ましくは、組成物の不存在と比較して、組織再生を増大または改善する。
本発明の組成物におけるbFGFおよびPDGFは、損傷組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進する。また、それらは血管新生も促進する。したがって、本発明の組成物は、好ましくは、組織再生を増大または改善し、および/または、アポトーシスを低減または低下させる。組成物は、好ましくは、組成物の不存在と比較して、組織再生を増大または改善する。
bFGFおよびPDGFに加えて、本発明の組成物は、検出可能なレベルの1つまたは複数の他の増殖因子または生体活性成分を含んでよい。前記の1つまたは複数の他の増殖因子または生体活性成分のレベルは、以下に記載のように、公知技術を用いて測定され得る。
上記のbFGFおよびPDGFに関しては、以下に述べる増殖因子または他の生体活性成分は、典型的にヒトである。あるいは、それらは、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来であってよい。
組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、アンジオポエチン、CXCL4、CXCL7、CXCL12、上皮増殖因子(EGF)、インターロイキン4(IL−4)、IL−8、IL−13、IL−17、インターフェロンα(IFNα)、リポキシンA4(LXA4)、プロテアーゼ−活性化受容体4(PAR4)、ケモカイン(C−Cモチーフリガンド)5(CCL5/RANTES)、PDGF−AA、PDGF−AB、形質転換増殖因子β1(TGF−β1)、TGF−β2、トロンボスポンジン、腫瘍壊死因子α(TNFα)および血管内皮増殖因子D(VEGF−D)の、少なくとも1つ、例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18または少なくとも19個を含む。組成物は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらの増殖因子または生体活性成分を含んでよい。組成物は、検出可能なレベルのこれらの成分の全てを含んでよい。
組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、(i)アンジオポエチン、(ii)CXCL4、(iii)CXCL7、(iv)CXCL12、(v)リポキシンA4(LXA4)、(vi)プロテアーゼ−活性化受容体4(PAR4)および(vii)トロンボスポンジンの、少なくとも1つを含む。組成物は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらの増殖因子または生体活性成分を含んでよい。組成物は、検出可能なレベルの全てのこれらの成分を含んでよい。具体的には、組成物は、検出可能なレベルの(i);(ii);(iii);(iv);(v);(vi);(vii);(i)および(ii);(i)および(iii);(i)および(iv);(i)および(v);(i)および(vi);(i)および(vii);(ii)および(iii);(ii)および(iv);(ii)および(v);(ii)および(vi);(ii)および(vii);(iii)および(iv);(iii)および(v);(iii)および(vi);(iii)および(vii);(iv)および(v);(iv)および(vi);(iv)および(vii);(v)および(vi);(v)および(vii);(vi)および(vii);(i)、(ii)および(iii);(i)、(ii)および(iv);(i)、(ii)および(v);(i)、(ii)および(vi);(i)、(ii)および(vii);(i、)、(iii)および(iv);(i)、(iii)および(v);(i)、(iii)および(vi);(i)、(iii)および(vii);(i)、(iv)および(v);(i)、(iv)および(vi);(i)、(iv)および(vii);(i)、(v)および(vi);(i)、(v)および(vii);(i)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)および(iv);(ii)、(iii)および(v);(ii)、(iii)および(vi);(ii)、(iii)および(vii);(ii)、(iv)および(v);(ii)、(iv)および(vi);(ii)、(iv)および(vii);(ii)、(v)および(vi);(ii)、(v)および(vii);(ii)、(vi)および(vii);(iii)、(iv)および(v);(iii)、(iv)および(vi);(iii)、(iv)および(vii);(iii)、(v)および(vi);(iii)、(v)および(vii);(iii)、(vi)および(vii);(iv)、(v)および(vi);(iv)、(v)および(vii);(iv)、(vi)および(vii);(v)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iii)および(iv);(i)、(ii)、(iii)および(v);(i)、(ii)、(iii)および(vi);(i)、(ii)、(iii)および(vii);(i)、(ii)、(iv)および(v);(i)、(ii)、(iv)および(vi);(i)、(ii)、(iv)および(vii);(i)、(ii)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(vi)および(vii);(i)、(iii)、(iv)および(v);(i)、(iii)、(iv)および(vi);(i)、(iii)、(iv)および(vii);(i)、(iii)、(v)および(vi);(i)、(iii)、(v)および(vii);(i)、(iii)、(vi)および(vii);(i)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(iv)、(vi)および(vii);(i)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)および(v);(ii)、(iii)、(iv)および(vi);(ii)、(iii)、(iv)および(vii);(ii)、(iii)、(v)および(vi);(ii)、(iii)、(v)および(vii);(ii)、(iii)、(vi)および(vii);(ii)、(iv)、(v)および(vi);(ii)、(iv)、(v)および(vii);(ii)、(iv)、(vi)および(vii);(ii)、(v)、(vi)および(vii);(iii)、(iv)、(v)および(vi);(iii)、(iv)、(v)および(vii);(iii)、(iv)、(vi)および(vii);(iii)、(v)、(vi)および(vii);(iv)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v);(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(vi);(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(iii)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(iv)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(iii)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(iii)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(iii)、(iv)、(vi)およびvii);(i)、(iii)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)、(v)および(vi);(ii)、iii)、(iv)、(v)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(iii)、(iv)、(v)、(vi)およびvii);(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);または(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii)を含んでよい。(i)〜(vii)のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
好ましくは、組成物は、検出可能なレベルのアンジオポエチンを含む。
本発明の組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、bFGFアイソフォーム、PDGF−ABおよびPDGF−BBの少なくとも1つを含む。より好ましくは、組成物は、(a)EGF、(b)TGF−β1、(c)TGF−β2、(d)インスリン様増殖因子(IGF)および(e)血管内皮増殖因子(VEGF)の任意または全てを含んでよい。換言すれば、本発明の組成物は、(a);(b);(c);(d);(e);(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および(e);(b)および(c);(b)および(d);(b)および(e);(c)および(d);(c)および(e);(d)および(e);(a)、(b)および(c);(a)、(b)および(d);(a)、(b)および(e);(a)、(c)および(d);(a)、(c)および(e);(a)、(d)および(e);(b)、(c)および(d);(b)、(c)および(e);(b)、(d)および(e);(c)、(d)および(e);(a)、(b)、(c)および(d);(a)、(b)、(c)および(e);(a)、(b)、(d)および(e);(a)、(c)、(d)および(e);(b)、(c)、(d)および(e);または(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を含んでよい。(a)〜(e)のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
IGFは、好ましくは、IGF−1である。IGF−1は、好ましくはヒトIGF−1である。組成物は、検出可能なレベルの、IGF−1アイソフォーム1(配列番号9)またはその変異体、IGF−1アイソフォーム2(配列番号10)またはその変異体、IGF−1アイソフォーム3(配列番号11)またはその変異体、またはIGF−1アイソフォーム4またはその変異体のいずれかまたは全てを含んでよい。IGFは、好ましくは、IGF−2である。IGFは、好ましくはヒトIGF−2である。組成物は、IGF−2アイソフォーム1(配列番号12)またはその変異体、IGF−2アイソフォーム2(配列番号13)またはその変異体、IGF−1アイソフォーム3のいずれかまたは全てを含んでよい。組成物は、検出可能なレベルの少なくとも1つのIGF−1アイソフォームおよび少なくとも1つのIGF−2アイソフォームを含んでよい。IGFアイソフォームの変異体は、IGFアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有して少なくとも部分的なIGF活性を保持する、ポリペプチドである。IGF活性を評価する方法は、当技術分野で知られている。変異体の特徴、例えば、ホモロジーまたは同一性の%は、bFGFおよびPDGFに関して上記に示され、IGFの変異体に等しく適用可能である。
VEGFは、好ましくは、ヒトVEGFである。VEGFは、VEGF121(配列番号14)またはその変異体、VEGF145(配列番号15)またはその変異体、VEGF165(配列番号16)またはその変異体、VEGF165b(配列番号17)またはその変異体、VEGF189(配列番号18)またはその変異体、または、VEGF206(配列番号19)またはその変異体であってよい。組成物は、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189またはVEGF206のいずれかまたは全てを含んでよい。VEGFアイソフォームの変異体は、VEGFアイソフォームのものとは異なるアミノ酸配列を有して少なくとも部分的なVEGF活性を保持する、ポリペプチドである。VEGF活性を評価する方法は、当技術分野で知られている。変異体の特徴、例えば、ホモロジーまたは同一性の%は、bFGFおよびPDGFに関して上記に示され、VEGFの変異体に等しく適用可能である。
組成物は、(A)形質転換増殖因子α(TGF−α)、(B)酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、(C)TGF−β3および(D)FGF−7のいずれかまたは全てを含んでよい。例えば、組成物は、(A);(B);(C);(D);(A)および(B);(A)および(C);(A)および(D);(B)および(C);(B)および(D);(C)および(D);(A)、(B)および(C);(A)、(B)および(D);(A)、(C)および(D);(B)、(C)および(D);または(A)、(B)、(C)および(D)を含んでよい。(A)〜(D)のそれぞれの定義に関する組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
組成物は、アンジオポエチン、CXCL4、CXCL7、CXCL12、EGF、IL−4、IL−8、IL−13、IL−17、IFNα、LXA4、PAR4、CCL5/RANTES、PDGF−AA、PDGF−AB、TGF−β1、TGF−β2、トロンボスポンジン、TNFα、VEGF−D、bFGFアイソフォーム、PDGF−BB、IGF、VEGF、TGF−α、aFGF)、TGF−β3およびFGF−7の全てを含んでよい。
本発明の組成物は、検出可能なレベルの、少なくとも1つの、他の増殖因子または生体活性成分(例えば、少なくとも2〜91個のいずれかの、他の増殖因子または生体活性成分を含める)が、欠けていてよい。例えば、本発明の組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの胎盤増殖因子(PlGF)を含まない。組成物は、好ましくは、検出可能なレベルの、アクチビンA、アクチビンC、アクチビンβ、アルテミン、脳由来神経栄養因子(BDNF)、骨形成タンパク質15(BMP−15)、BMP−2、BMP3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−7、BMP−8、β神経成長因子(b−NGF)、ベタセルリン(BTC)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、結合組織増殖因子(CTGF)、Dickkopf関連タンパク質1(Dkk−1)、エンドカン、エオタキシン、エピレグリン、線維芽細胞増殖因子10(FGF−10)、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−23、FGF−4、FGF−6、FGF−8、FGF−9、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、増殖分化因子1(GDF−1)、GDF−11、GDF−15、GDF−3、GDF−5、GDF−8、GDF−9、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、成長ホルモン1(GH−1)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド1(CXCL1)、CXCL2、CXCL3、ヘパリン−結合EGF様増殖因子(HB−EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターフェロンγ(IFNγ)、インスリン様増殖因子1(IGF−1)、IGF−11、インターロイキン10(IL−10)、IL−12、IL−15、IL−1a、IL−1b、IL−1RA、IL−1β、IL−2、IL−2R、IL−5、IL−6、IL−7、インヒビンA、インターフェロンγ−誘導タンパク質10(IP−10)、レフティA、白血病抑制因子(LIF)、単球走化性タンパク質1(MCP−1)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、乳脂肪球−EGF因子8タンパク質(MFG−E8)、MIG、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1a)、MIP−1b、ニュールツリン、腎芽腫過剰発現遺伝子(NOV)、ニューロトロフィン3(NT−3)、NT−4、血小板由来増殖因子C(PDGF−C)、パーセフィン、プログラニュリン、可溶性CD40リガンド(sCD40L)、Skp、Cullin、F−box含有複合体(SCF)および可溶性血管細胞接着分子1(sVCAM−1)の、少なくとも1つを含まない。任意の数および組み合わせのこれらの増殖因子または生体活性成分は、組成物に、検出可能なレベルで存在しなくてよい。組成物は、検出可能なレベルのこれらの成分の全てが欠けていてよい。
[薬学的に許容できるポリマー]
本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも1つの薬学的に許容できるポリマーを含む。組成物は、例えば、1、2、3、4、5、10またはそれよりも多くの、任意の数の薬学的に許容できるポリマーを含んでよい。
本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも1つの薬学的に許容できるポリマーを含む。組成物は、例えば、1、2、3、4、5、10またはそれよりも多くの、任意の数の薬学的に許容できるポリマーを含んでよい。
ポリマーは、治療での使用に適切であるならば、薬学的に許容できる。ポリマーは、好ましくは、損傷組織、例えば、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織への、局所投与に適切である。ポリマーは、好ましくは、発毛の促進または膣萎縮の治療のための、局所投与に適切である。
薬学的に許容できるポリマーは、当技術分野でよく知られている。任意のそのようなポリマーは、本発明に従って使用され得る。適切なポリマーは、限定されないが、アルギネートポリマー、エチリデンの二重エステルポリマー、共重合体ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、共重合体ポリペルフルオロオクチルオキシカルボニル−ポリ(乳酸)(PLA−PFO)、および、他のブロック共重合体を含む。ブロック共重合体は、一緒に重合される2以上の単量体サブユニットが単一のポリマー鎖を作る、ポリマー材料である。ブロック共重合体は、典型的に、それぞれの単量体サブユニットが寄与する特性を有する。しかしながら、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない独特な特性を有し得る。ブロック共重合体は、単量体サブユニットの一方は疎水性(すなわち親油性)であり、一方で、他方のサブユニット(単数または複数)は水性媒体中で親水性であるように、改変することができる。この場合では、ブロック共重合体は、両親媒性の特性を保有することができ、生物学的な膜を真似た構造を形成し得る。ブロック共重合体は、ジブロック(2つの単量体サブユニットからなる)であってよいが、2つよりも多い単量体サブユニットから構成されて、両親媒性物質(amphipile)として振舞う、より複雑な配列を形成してもよい。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であってよい。またブロック共重合体は、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構成されてもよく;例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作られてよい。また、ブロック共重合体の親水性サブセクションは、低いタンパク質結合特性を保有することができ、生の生物学的サンプルに曝された場合に耐性が高い膜の作製を可能にする。また、この頭部基ユニットは、非古典的な脂質頭部基に由来してもよい。
ポリマー濃度は、好ましくは、約15%(w/w)〜約30%(w/w)、例えば、約17%(w/w)〜約25%(w/w)、または、約20%(w/w)〜約23%(w/w)である。
ポリマーは、好ましくは、セルロースポリマーである。適切なセルロースポリマーは、当技術分野で知られている。セルロースポリマーは、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはメチルセルロースである。セルロースポリマー濃度は、好ましくは、約1.5%(w/w)〜約4.0%(w/w)、例えば、約2.0%(w/w)〜約3.0%(w/w)である。セルロースポリマーは、好ましくは、約450,000〜約4,000,000、例えば、約500,000〜約3,500,000、約500,000〜約3,000,000、または、約750,000〜約2,500,000、または、約1,000,000〜約2,000,000の分子量を有する。
ポリマーは、好ましくは、プルロニック酸、場合により、プルロニックF−127である。
ポリマーは、好ましくは、ゲルである。適切なゲルは、当技術分野で知られている。生体適合性ゲルは、天然または合成であってよい。好ましいゲルは、限定されないが、セルロースゲル、コラーゲンゲル、ゼラチンゲル、フィブリンゲル、キトサンゲル、スターチゲル、アルギネートゲル、ヒアルロン酸ゲル、アガロースゲル、ポロクサマー(poloaxmer)ゲル、またはそれらの組み合わせを含む。
ポリマーは、典型的に生体適合性である。ポリマーは、損傷組織と接触させたときにいかなる有害反応または副作用も引き起こさないならば、生体適合性である。
[粘度]
本発明の組成物は、好ましくは、上記に示したゲルである。本発明の組成物は、好ましくは、ヒドロゲルである。
本発明の組成物は、好ましくは、上記に示したゲルである。本発明の組成物は、好ましくは、ヒドロゲルである。
ゲルは、室温で、約1000〜約500,000マイクロパスカル−秒(mPa・s)(センチポイズ;cpsとしても知られる)の範囲の粘度を有する。粘度は、ゲルが剪断応力または引張応力のいずれかによって変形される耐性の尺度である。粘度は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて測定することができる。適切な方法は、限定されないが、粘度計またはレオメータの使用を含む。
室温は、典型的に、約18℃〜約25℃、例えば、約19℃〜約24℃、または約20℃〜約23℃、または約21℃〜約22℃である。室温は、好ましくは、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃および25℃のいずれかである。粘度は、最も好ましくは、25℃で測定される。
ゲルは、好ましくは、室温で約1000〜約500,000mPa・sの範囲、例えば、室温で約1500〜約450,000mPa・s、室温で約2000〜約400,000mPa・s、室温で約2500〜約350,000mPa・s、室温で約5000〜約300、000mPa・s、室温で約10,000〜約250,000mPa・s、室温で約50,000〜約200,000mPa・s、または、室温で約50,000〜約150,000mPa・sの粘度を有する。
ゲルは、最も好ましくは、25℃で約50,000〜約150,000mPa・s(cps)の範囲の粘度を有する。
[防腐剤]
本発明の組成物は、1つまたは複数の防腐剤をさらに含んでよい。適切な防腐剤は、当技術分野で知られている。適切な防腐剤は、限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンおよびm−クレゾールを含む。
本発明の組成物は、1つまたは複数の防腐剤をさらに含んでよい。適切な防腐剤は、当技術分野で知られている。適切な防腐剤は、限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンおよびm−クレゾールを含む。
[浸透圧]
本発明の組成物は、好ましくは、100〜500mOsmol/kg、例えば、150〜450mOsmol/kg、200〜400mOsmol/kg、または、250〜350mOsmol/kgの範囲の浸透圧を有する。組成物は、好ましくは、280〜320mOsmol/kgの範囲の浸透圧を有する。
本発明の組成物は、好ましくは、100〜500mOsmol/kg、例えば、150〜450mOsmol/kg、200〜400mOsmol/kg、または、250〜350mOsmol/kgの範囲の浸透圧を有する。組成物は、好ましくは、280〜320mOsmol/kgの範囲の浸透圧を有する。
[ゼノフリー(xeno−free)]
本発明の組成物は、好ましくはゼノフリーである。ゼノフリー組成物は、動物由来成分を含まないが、ヒト由来成分を含んでよい。また、組成物は、動物由来成分およびヒト由来成分の両方を欠いていてもよい。
本発明の組成物は、好ましくはゼノフリーである。ゼノフリー組成物は、動物由来成分を含まないが、ヒト由来成分を含んでよい。また、組成物は、動物由来成分およびヒト由来成分の両方を欠いていてもよい。
[治療的細胞]
組成物は、好ましくは、1つまたは複数の治療的細胞を含む。治療的細胞は、治療的効果を有することが可能な細胞である。治療的細胞は、典型的に、生細胞である。治療的細胞は、典型的に、損傷組織または老化組織を修復することが可能な細胞である。前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは自己由来である。換言すれば、前記の1つまたは複数の細胞は、好ましくは、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために細胞が投与される、患者から採取される。あるいは、前記の1つまたは複数の細胞は、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために細胞が投与される、患者と免疫学的に適合する患者から採取される。前記の1つまたは複数の細胞は、半−同種異系であってよい。半−同種異系の集団は、典型的に、細胞が投与される患者と免疫学的に適合する2以上の患者から生産される。換言すれば、前記の1つまたは複数の細胞の全ては、好ましくは、それらが投与される患者と遺伝学的に同一であり、または、それらが投与される患者と細胞が免疫学的に適合するように十分に遺伝学的に同一である。
組成物は、好ましくは、1つまたは複数の治療的細胞を含む。治療的細胞は、治療的効果を有することが可能な細胞である。治療的細胞は、典型的に、生細胞である。治療的細胞は、典型的に、損傷組織または老化組織を修復することが可能な細胞である。前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは自己由来である。換言すれば、前記の1つまたは複数の細胞は、好ましくは、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために細胞が投与される、患者から採取される。あるいは、前記の1つまたは複数の細胞は、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために細胞が投与される、患者と免疫学的に適合する患者から採取される。前記の1つまたは複数の細胞は、半−同種異系であってよい。半−同種異系の集団は、典型的に、細胞が投与される患者と免疫学的に適合する2以上の患者から生産される。換言すれば、前記の1つまたは複数の細胞の全ては、好ましくは、それらが投与される患者と遺伝学的に同一であり、または、それらが投与される患者と細胞が免疫学的に適合するように十分に遺伝学的に同一である。
任意の数の細胞が、組成物内に存在してよい。組成物は、たった1つの細胞を含んでよい。
組成物は、典型的に、1よりも多い細胞、例えば、少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2000、少なくとも5000、少なくとも10000、少なくとも50000、少なくとも100000、少なくとも5×105、少なくとも1×106、少なくとも2×106、少なくとも5×106、少なくとも1×107、少なくとも2×107、少なくとも5×107、少なくとも1×108または少なくとも2×108の細胞を含む。ある場合には、組成物は、少なくとも1.0×107、少なくとも1.0×108、少なくとも1.0×109、少なくとも1.0×1010、少なくとも1.0×1011または少なくとも1.0×1012の細胞、またはさらに多くの細胞を含んでよい。
1よりも多い細胞が組成物内に存在する場合、細胞の集団は、同種であってよい。換言すれば、集団内の全ての細胞は、同じタイプの細胞、例えば、間葉系幹細胞(MSC)であってよい。あるいは、細胞の集団は、異種であってよい。換言すれば、細胞の集団は、異なるタイプの細胞、例えば、MSCおよび中胚葉性系列の前駆細胞(PML)を含んでよい。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数のPMLである。PMLは、PCT/GB2012/051600(WO2013/005053として公開)に開示される。そこに開示される任意の細胞を用いてよい。PMLは、検出可能なレベルのCD29、CD44、CD73、CD90、CD105およびCD271を発現するが、検出可能なレベルのCD14、CD34およびCD45を発現しない。
PMLを有利に用いて、患者における損傷組織を修復し、老化を阻害し、または、発毛を促進し得る。PMLは、組織において抗−炎症性効果を効率的に発揮することが可能である。PMLの抗−炎症性効果は、損傷組織または老化組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進する。また、細胞は、血管新生、走化性および抗−アポトーシス因子の分泌のような、パラクリン作用を発揮することも可能である。
以下により詳細に述べるように、PMLは、ヒト個体のような個体から得られる単核細胞(MC)、例えば末梢MCから生産される。PMLはMCから生産されるので、それらは(例えば末梢血から)容易に生産され得て、処置される患者にとって自己由来であり得て、それにより、患者による免疫学的拒絶のリスクを回避する。
MCの様々なサンプル(すなわち、血液の様々なサンプル)を得ることができるので、原理的には、単一の個体または患者から無制限の数のPMLを生産することが可能である。非常に大きな数のPMLを単一の個体または患者から生産することが、確実に可能である。本発明のPMLは、したがって、大きな数で作ることができる。
PMLは、臨床関連の条件下で、例えば、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質ならびにウシ胎仔血清のような動物産物の不存在下で生産される。このことは、PMLを、患者への投与に特に適切にさせる。
PMLはMCから生産されるので、それらは実質的に同質であり、自己由来であり得る。またそれらは、MSCで頻繁に生じるドナー間の変動も避ける。PMLの非常に多くの集団は、化学療法または放射線療法のような任意の他の治療が始まる前に、患者から得られた単一のサンプルから生産することができる。したがって、PMLは、これらの治療の任意の有害な効果を回避することができる。
PMLは、迅速に作製することができる。PMLは、30日未満、例えば約22日で、MCから生産することができる。
MCからのPMLの生産は、ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来する間葉系幹細胞(MSC)の使用と関連する道徳的および倫理的影響を回避する。
PMLは、典型的に、ヒトMCから生産される。したがって、PMLは、典型的にヒトである。あるいは、IMP細胞は、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来のMCから生産され得る。
PMLは、系列限定マーカーの発現、構造的および機能的特徴を含む、当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、中胚葉性系列の前駆細胞として同定することができる。PMLは、検出可能なレベルの、中胚葉性系列の前駆細胞の特徴であることが知られる細胞表面マーカーを発現する。特に、以下により詳細に述べられるマーカーに加えて、PMLは、α−平滑筋アクチン、I型コラーゲンα−鎖、GATA6、Mohawk、およびビメンチンを発現し得る(Sagi B et al Stem Cells Dev.2012 Mar 20;21(5):814−28)。
PMLは、分化アッセイをインビトロでうまく完了させて、それらが中胚葉性系列であることを確認することが可能である。そのようなアッセイは、限定されないが、脂肪生成分化アッセイ、骨分化アッセイおよび神経分化アッセイを含む(Zaim M et al Ann Hematol.2012 Aug;91(8):1175−86)。
PMLは、幹細胞ではない。具体的には、それらはMSCではない。それらは最終分化している。それらは、インビトロで適切な条件下で、例えば軟骨または骨細胞へ分化させることができるが、インビボでは分化しない。PMLは、損傷組織においてパラクリンシグナリングを発揮することにより、それらの効果を有する。具体的には、PMLは、好ましくは、損傷組織において抗炎症性(anti−flammatory)効果を誘導することが可能である。このことは以下により詳細に述べられる。
PMLは典型的に、紡錘形の形態により特徴付けられる。PMLは典型的に、線維芽細胞様であり、すなわちそれらは、長細い多少の細胞突起を有する小さな細胞体を有する。細胞は典型的に、約10〜約20μmの直径である。
PMLは、それらのマーカー発現パターンを介して他の細胞から区別される。PMLは、検出可能なレベルの、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105およびCD271を発現する。PMLは、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105およびCD271の1つまたは複数、例えば全てを過剰発現し得る。PMLは、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105およびCD271の1つまたは複数を、それらが他のPMLおよび/またはMSCよりも多く発現する場合に過剰発現する。PMLは、検出可能なレベルの、CD14、CD34およびCD45を発現しない。PMLは、好ましくは、CD62E(E−セレクチン)および/またはCD62P(P−セレクチン)を発現する。
当該分野で知られている標準的な方法を用いて、上記(および以下)に述べる様々なマーカーの、検出可能な発現、低い発現、またはその欠如を判定し得る。適切な方法は、限定されないが、免疫細胞化学、免疫測定法、フローサイトメトリー、例えば蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、例えば逆転写PCR(RT−PCR)を含む。適切な免疫測定法は、限定されないが、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法(ELISA)、酵素結合免疫吸着スポット分析(ELISPOT分析)、競合的酵素免疫分析法、放射性アレルゲン吸着(RAST)試験、ラジオイムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイおよび免疫蛍光を含む。ウェスタンブロッティング、ELISAおよびRT−PCRは、全て定量的なので、存在するならば様々なマーカーの発現のレベルを測定するために用いることができる。FACSの使用が好ましい。本明細書において述べられる様々なマーカーの全てに関する抗体および蛍光標識抗体は市販される。
1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、UK出願GB 1410504.3に開示される1つまたは複数の免疫調節前駆(IMP)細胞である。IMP細胞は、検出可能なレベルの、MIC A/B、CD304(ニューロピリン1)、CD178(FASリガンド)、CD289(Toll様受容体9)、CD363(スフィンゴシン−1−リン酸受容体1)、CD99、CD181(C−X−Cケモカイン受容体タイプ1;CXCR1)、上皮増殖因子受容体(EGF−R)、CXCR2およびCD126を発現する。
IMP細胞は、患者における、損傷組織を修復するため、老化を阻害するため、または、発毛を促進するために、有利に用いられ得る。IMP細胞は、組織において、抗−炎症性効果を発揮することが可能である。IMP細胞の抗−炎症性効果は、損傷組織または老化組織における隣接細胞の、生存、修復および再生を促進する。また、細胞は、血管新生、走化性および抗−アポトーシス因子の分泌のような、パラクリン作用を発揮することも可能である。
IMP細胞は、典型的に、ヒトMCから生産される。本発明のIMP細胞は、したがって、典型的にヒトである。あるいは、IMP細胞は、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来のMCから生産され得る。
また、IMP細胞は、ヒト個体または患者のような個体または患者から得られる、末梢MCのようなMCからも生産される。それ故に、それらは、上述したPMLと同一の利点を有する。IMP細胞は、分化アッセイをインビトロでうまく完了して、それらが中胚葉性系列であることを確認することが可能である。そのようなアッセイは、限定されないが、脂肪生成分化アッセイ、骨分化アッセイ、および、神経分化アッセイを含む(Zaim M et al Ann Hematol.2012 Aug;91(8):1175−86)。
IMP細胞は、幹細胞ではない。具体的には、それらはMSCではない。それらは最終分化されている。それらは、インビトロで適切な条件下で、例えば軟骨または骨細胞へ分化させることができるが、典型的に、インビボでは分化しない。本発明のIMP細胞は、損傷組織においてパラクリンシグナリングを発揮することにより、それらの効果を有する。具体的には、IMP細胞は、好ましくは、損傷組織において抗−炎症性効果を誘導することが可能である。このことは以下により詳細に述べられる。
IMP細胞は典型的に、紡錘形の形態により特徴付けられる。IMP細胞は典型的に、線維芽細胞様であり、すなわちそれらは、長細い多少の細胞突起を有する小さな細胞体を有する。細胞は典型的に、約10〜約20μmの直径である。
本発明のIMP細胞は、それらのマーカー発現パターンを介して、MSCを含む公知の細胞から区別される。IMP細胞は、検出可能なレベルの、MIC A/B、CD304(ニューロピリン1)、CD178(FASリガンド)、CD289(Toll様受容体9)、CD363(スフィンゴシン−1−リン酸受容体1)、CD99、CD181(C−X−Cケモカイン受容体タイプ1;CXCR1)、上皮増殖因子受容体(EGF−R)、CXCR2およびCD126を発現する。IMP細胞は、好ましくは、MSCと比較して増加した量のこれらのマーカーを発現する。これは、同一の条件下で同一の技術を用いて、本発明のIMPでのマーカーの発現レベル/量を、MSCでの発現レベル/量と比較することにより判定することができる。適切なMSCは市販されている。比較に用いるMSCは、好ましくは、ヒトMSCである。ヒトMSCは、Mesoblast(登録商標)Ltd、Osiris Therapeutics(登録商標)Inc.またはLonza(登録商標)から市販される。ヒトMSCは、好ましくはLonza(登録商標)から得られる。そのような細胞を実施例で比較に用いた。MSCは、上記に述べた動物または哺乳類のいずれかから得てよい。
IMP細胞は、好ましくは、MSCと比較して増加した量の、MIC A/B、CD304(ニューロピリン1)、CD178(FASリガンド)、CD289(Toll様受容体9)、CD363(スフィンゴシン−1−リン酸受容体1)、CD99、CD181(C−X−Cケモカイン受容体タイプ1;CXCR1)、上皮増殖因子受容体(EGF−R)、CXCR2およびCD126の1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、好ましくは、MSCと比較して、増加した量の10個のマーカー全てを発現する
上記に開示した任意の方法を用いて、これらのマーカーの検出可能な発現または増加した発現を判定してよい。本明細書に開示される任意のマーカーの発現または増加した発現は、好ましくは、ハイスループットFACS(HT−FACS)を用いてなされる。
IMP細胞は、好ましくは、MIC A/Bに関して少なくとも330、例えば少なくとも350または少なくとも400の抗体平均蛍光強度(MFI)、CD304(ニューロピリン1)に関して少なくとも210、例えば少なくとも250または少なくとも300のMFI、CD178(FASリガンド)に関して少なくとも221、例えば少なくとも250または少なくとも300のMFI、CD289(Toll様受容体9)に関して少なくとも186、例えば少なくとも200または少なくとも250のMFI、CD363(スフィンゴシン−1−リン酸受容体1)に関して少なくとも181、例えば少なくとも200または少なくとも250のMFI、CD99に関して少なくとも184、例えば少なくとも200または少なくとも250のMFI、CD181(C−X−Cケモカイン受容体タイプ1;CXCR1)に関して少なくとも300、例えば少なくとも350または少なくとも400のMFI、上皮増殖因子受容体(EGF−R)に関して少なくとも173、例えば少なくとも200または少なくとも250のMFI、CXCR2に関して少なくとも236、例えば少なくとも250または少なくとも300のMFI、および、CD126に関して少なくとも160、例えば少なくとも200または少なくとも250のMFIを示す。平均蛍光強度(MFI)は、平方メートルあたりのワットで測定される、強度、時間平均エネルギー束の測定単位である。それはSI単位である。各マーカーに関するMFIは、典型的に、HT−FACSを用いて測定される。各マーカーに関するMFIは、好ましくは、本出願と同時に出願されるUK出願GB 1410504.3の実施例に記載のようにHT−FACSを用いて測定される。
上記に規定される10個のマーカーに加えて、IMP細胞は、典型的に、検出可能なレベルの、GB 1410504.3の表1に示される他のマーカーの1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。
IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、CD267、CD47、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD340、Notch2、CD49b、CD63、CD58、CD44、CD49c、CD105、CD166、HLA−ABC、CD13、CD29、CD49e、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、CD151およびCD276の1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、より好ましくは、検出可能なレベルの、CD10、CD111、CD267、CD47、CD273、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD55、CD340、CD91、Notch2、CD175s、CD82、CD49b、CD95、CD63、CD245、CD58、CD108、B2−ミクログロブリン、CD155、CD298、CD44、CD49c、CD105、CD166、CD230、HLA−ABC、CD13、CD29、CD49e、CD59、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、CD151およびCD276の1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、検出可能なレベルのこれらのマーカーの任意の数および組み合わせを発現し得る。IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのこれらのマーカーの全てを発現する。
IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、CD156b、CD61、CD202b、CD130、CD148、CD288、CD337、SSEA−4、CD349およびCD140bの1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、より好ましくは、検出可能なレベルの、CD156b、CD61、CD202b、CD130、CD148、CD288、CD337、SSEA−4、CD349、CD140b、CD10、CD111、CD267、CD47、CD273、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD55、CD340、CD91、Notch2、CD175s、CD82、CD49b、CD95、CD63、CD245、CD58、CD108、B2−ミクログロブリン、CD155、CD298、CD44、CD49c、CD105、CD166、CD230、HLA−ABC、CD13、CD29、CD49e、CD59、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、CD151およびCD276の1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、検出可能なレベルのこれらのマーカーの任意の数および組み合わせを発現し得る。IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのこれらのマーカーの全てを発現する。
IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、CD72、CD133、CD192、CD207、CD144、CD41b、FMC7、CD75、CD3e、CD37、CD158a、CD172b、CD282、CD100、CD94、CD39、CD66b、CD158b、CD40、CD35、CD15、PAC−1、CLIP、CD48、CD278、CD5、CD103、CD209、CD3、CD197、HLA−DM、CD20、CD74、CD87、CD129、CDw329、CD57、CD163、TPBG、CD206、CD243(BD)、CD19、CD8、CD52、CD184、CD107b、CD138、CD7、CD50、HLA−DR、CD158e2、CD64、DCIR、CD45、CLA、CD38、CD45RB、CD34、CD101、CD2、CD41a、CD69、CD136、CD62P、TCRαβ、CD16b、CD1a、ITGB7、CD154、CD70、CDw218a、CD137、CD43、CD27、CD62L、CD30、CD36、CD150、CD66、CD212、CD177、CD142、CD167、CD352、CD42a、CD336、CD244、CD23、CD45RO、CD229、CD200、CD22、CDH6、CD28、CD18、CD21、CD335、CD131、CD32、CD157、CD165、CD107a、CD1b、CD332、CD180、CD65およびCD24の1つまたは複数を発現する。IMP細胞は、検出可能なレベルのこれらのマーカーの任意の数および組み合わせを発現し得る。IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのこれらのマーカーの全てを発現する。
前記の1つまたは複数のIMP細胞は、GB 1410504.3に開示される任意の集団の一部であってよい。
IMP細胞は、好ましくは、患者における特定の損傷組織に付着することが可能である。付着および接着アッセイは、当該分野で知られている(Humphries,Methods Mol Biol.2009;522:203−10)。
IMP細胞は、好ましくは、患者における特定の損傷組織において、増殖することが可能である。細胞増殖アッセイは、当該分野でよく知られている。そのようなアッセイは、例えばLife Technologies(登録商標)から市販されている。
IMP細胞は、好ましくは、患者における特定の損傷組織において、血管新生を促進することが可能である。血管新生アッセイは、当該分野で知られている(Auerback et al.,Clin Chem.2003 Jan;49(1):32−40)。
IMP細胞は、好ましくは、患者の損傷組織において、抗−炎症性効果を有することが可能である。また、本発明のIMP細胞が抗−炎症性効果を有する能力は、当該分野で知られている標準的なアッセイを用いて測定してもよい。適切な方法は、限定されないが、サイトカインの分泌に関する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、増強された混合白血球反応、および、共刺激分子および成熟マーカーの上方制御(フローサイトメトリーにより測定される)を含む。測定されるサイトカインは、典型的に、インターロイキン、例えばインターロイキン−8(IL−8)、セレクチン、接着分子、例えば細胞間接着分子−1(ICAM−1)、および化学誘引物質タンパク質、例えば単球走化性タンパク質−1(MCP−1)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)である。これらのサイトカインに関するアッセイは市販されている。抗−炎症性因子は、好ましくは、Luminex(登録商標)アッセイを用いて検出および測定される。そのようなアッセイは、Life Technologies(登録商標)から市販される。
IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、インターロイキン−6(IL−6)、IL−8、C−X−Cモチーフケモカイン10(CXCL10;インターフェロンγ−誘導タンパク質10;IP−10)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド2(CCL2;単球走化性タンパク質−1;MCP−1)およびケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド5(CCL5;regulated on activation,normal T cell expressed and secreted;RANTES)の1つまたは複数を分泌する。IMP細胞は、これらの因子の任意の数および組み合わせを分泌し得る。IMP細胞は、好ましくは、これらの因子の全てを分泌する。
IMP細胞は、好ましくは、MSCと比較して増加した量の、IL−6、IL−8、IP−10、MCP−1およびRANTESの1つまたは複数を分泌する。IMP細胞は、増加した量のこれらの因子の任意の数および組み合わせを分泌し得る。IMP細胞は、好ましくは、増加した量のこれらのマーカーの全てを分泌する。
IMP細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞MSCと比較して減少した量の、インターロイキン−10(IL−10)および/またはIL−12を分泌する。IL−10およびIL−12は、炎症促進性サイトカインである。
IMP細胞は、上述のものに加えて、様々な異なる他のマーカーを発現する。これらの一部は、IMP細胞が、損傷組織において抗−炎症性効果を有するそれらの能力を助ける。本発明の任意のIMP細胞は、検出可能なレベルの、(i)インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、(ii)IGF−1受容体;(iii)C−Cケモカイン受容体タイプ1(CCR1)、(iv)ストロマ細胞由来因子−1(SDF−1)、(v)低酸素誘導因子−1α(HIF−1α)、(vi)Akt1および(vii)肝細胞増殖因子(HGF)および/または顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の1つまたは複数をさらに発現し得る。
IGF‐1受容体は、IGF−1勾配に向かう遊走能力を促進する。IGF−1が遊走を増大させるメカニズムの1つは、細胞の表面上のCXCR4の上方制御によるものであり、SDF−1シグナリングに対してそれらをより感受性にさせる。
CCR1は、CCL7(以前はMCP3として知られる)の受容体であり、MSCのホーミングおよび生着能力を高め(したがって、本発明のIMP細胞に関する同一の効果を有することが期待される)、および、パラクリンシグナリングを介して、負傷した心筋において毛管密度を増大させることができる。
HIF−1αは、酸素送達を増大させかつ適応性の生存促進性の応答を促進するパスウェイを活性化する。多くのHIF−1αの標的遺伝子の中には、エリスロポエチン(EPO)、エンドセリンおよびVEGF(その受容体Flk−1を有する)がある。HIF−1αを発現する、または増加した量のHIF−1αを発現するIMP細胞は、より治療的なサブタイプを促進し得る様々な血管原性の増殖因子などのパラクリン刺激の発現が上方制御される。以下により詳細に記載するように、本発明のIMP細胞は、低酸素(20%未満の酸素)、例えば、約2%または約0%の酸素の条件下でそれらを培養することにより、より治療的なサブタイプへ前もって調整することができる。
Akt1は、グルコース代謝、細胞増殖、アポトーシス、転写および細胞遊走などの複数の細胞のプロセスにおいて重要な役割を果たす、細胞内セリン/トレオニンタンパク質キナーゼである。Akt1の過剰発現は、ラットMSCがアポトーシスを受けるのを防ぐことが示されていて、本発明のIMP細胞において同一の効果を有するであろう。アポトーシスからの保護は、IMP細胞の治療効果を高める。
MSCによるHGFの過剰発現は、血管新生およびカルシニューリンが仲介するパスウェイを介したアポトーシスの阻害により、虚血後の心不全を防ぐことが示されている。HGFおよびG−CSFは、この点について相乗効果を示す。また、HGFおよびその受容体c−metが高発現であるMSCは、損傷組織への遊走能力も高い(ホルモンのパラクリンおよびオートクリンシグナリングを介して達成される)。HGFおよび/またはG−CSFを発現している本発明のIMP細胞についても同様である。
IMP細胞は、検出可能なレベルの、上記に定義した(i)〜(vii)の1または複数を発現し得る。本発明のIMP細胞は、好ましくは、MSCと比較して増加した量の(i)〜(vii)の1または複数を発現する。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定し得る。
任意のIMP細胞は、検出可能なレベルの、(i)血管内皮増殖因子(VEGF)、(ii)形質転換増殖因子β(TGF−β)、(iii)インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、(iv)線維芽細胞増殖因子(FGF)、(v)腫瘍壊死因子α(TNF−α)、(vi)インターフェロンγ(IFN−γ)および(vii)インターロイキン−1α(IL−1α)の1つまたは複数を発現し得る。VEGFを過剰発現している細胞由来の馴化培地は、ハムスターモデルにおいて心不全を緩和することが示されている。それ故に、VEGFを発現する、または増加した量のVEGFを発現する本発明のIMP細胞は、損傷した心臓の組織の同一効果を有する。
IMP細胞は、検出可能なレベルの(i)〜(vii)の1つまたは複数を発現し得る。IMP細胞は、MSCと比較して増加した量の(i)〜(vii)の1つまたは複数を発現し得る。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定し得る。
上記に示した(i)〜(vii)の定義の両方のセットにおいて、(i)〜(vii)の1つまたは複数の任意の組み合わせが発現され得て、または、増加した量で発現され得る。例えば、(i)〜(vii)の各定義に関して、IMP細胞は、検出可能なレベルの、または、増加した量の、(i);(ii);(iii);(iv);(v);(vi);(vii);(i)および(ii);(i)および(iii);(i)および(iv);(i)および(v);(i)および(vi);(i)および(vii);(ii)および(iii);(ii)および(iv);(ii)および(v);(ii)および(vi);(ii)および(vii);(iii)および(iv);(iii)および(v);(iii)および(vi);(iii)および(vii);(iv)および(v);(iv)および(vi);(iv)および(vii);(v)および(vi);(v)および(vii);(vi)および(vii);(i)、(ii)および(iii);(i)、(ii)および(iv);(i)、(ii)および(v);(i)、(ii)および(vi);(i)、(ii)および(vii);(i、)、(iii)および(iv);(i)、(iii)および(v);(i)、(iii)および(vi);(i)、(iii)および(vii);(i)、(iv)および(v);(i)、(iv)および(vi);(i)、(iv)および(vii);(i)、(v)および(vi);(i)、(v)および(vii);(i)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)および(iv);(ii)、(iii)および(v);(ii)、(iii)および(vi);(ii)、(iii)および(vii);(ii)、(iv)および(v);(ii)、(iv)および(vi);(ii)、(iv)および(vii);(ii)、(v)および(vi);(ii)、(v)および(vii);(ii)、(vi)および(vii);(iii)、(iv)および(v);(iii)、(iv)および(vi);(iii)、(iv)および(vii);(iii)、(v)および(vi);(iii)、(v)および(vii);(iii)、(vi)および(vii);(iv)、(v)および(vi);(iv)、(v)および(vii);(iv)、(vi)および(vii);(v)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iii)および(iv);(i)、(ii)、(iii)および(v);(i)、(ii)、(iii)および(vi);(i)、(ii)、(iii)および(vii);(i)、(ii)、(iv)および(v);(i)、(ii)、(iv)および(vi);(i)、(ii)、(iv)および(vii);(i)、(ii)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(vi)および(vii);(i)、(iii)、(iv)および(v);(i)、(iii)、(iv)および(vi);(i)、(iii)、(iv)および(vii);(i)、(iii)、(v)および(vi);(i)、(iii)、(v)および(vii);(i)、(iii)、(vi)および(vii);(i)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(iv)、(vi)および(vii);(i)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)および(v);(ii)、(iii)、(iv)および(vi);(ii)、(iii)、(iv)および(vii);(ii)、(iii)、(v)および(vi);(ii)、(iii)、(v)および(vii);(ii)、(iii)、(vi)および(vii);(ii)、(iv)、(v)および(vi);(ii)、(iv)、(v)および(vii);(ii)、(iv)、(vi)および(vii);(ii)、(v)、(vi)および(vii);(iii)、(iv)、(v)および(vi);(iii)、(iv)、(v)および(vii);(iii)、(iv)、(vi)および(vii);(iii)、(v)、(vi)および(vii);(iv)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(v);(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(vi);(i)、(ii)、(iii)、(iv)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(iii)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(iv)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(iii)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(iii)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(iii)、(iv)、(vi)およびvii);(i)、(iii)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)、(v)および(vi);(ii)、iii)、(iv)、(v)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(iii)、(iv)、(v)、(vi)およびvii);(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)および(vi);(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(ii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii);または(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)および(vii)を、発現し得る。(i)〜(vii)のそれぞれの定義の組み合わせは、このリストから独立に選択することができる。
上述の任意のマーカーに加えて、IMP細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、LIFおよび/またはPDGF受容体も発現する。本発明のIMP細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞と比較して増加した量の、LIFおよび/またはPDGF受容体を発現する。PDGF受容体は、好ましくは、PDGF−A受容体および/またはPDGF−B受容体である。これらの受容体が高発現であるMSCは、血小板が活性化されている領域、例えば創傷および血栓性血管へ、効率的に遊走することができる。当該受容体を発現または増加した量で発現しているIMP細胞についても同様である。
PMLおよび/またはIMP細胞は、好ましくは自己由来である。換言すれば、細胞は、好ましくは、細胞が投与される患者から採取される。あるいは、PMLおよび/またはIMP細胞は、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、細胞が投与される患者と免疫学的に適合する患者から採取される。
PMLおよび/またはIMP細胞は、抗体に基づく技術を含む様々な技術を用いて単離され得る。細胞は、PMLおよび/またはIMP細胞上に存在するこれらの表面マーカー(上記参照)に対するモノクローナル抗体の結合に基づくネガティブおよびポジティブ選択技術を用いて単離され得る。それ故に、PMLおよび/またはIMP細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)および磁気ビーズ分離を含む、任意の抗体に基づく技術を用いて分離され得る。
以下に述べるように、PMLおよび/またはIMP細胞は、エクスビボで処置され得る。したがって、細胞は、治療薬または診断薬がロードまたはトランスフェクトされ得て、その結果、本発明の方法において治療的に用いられる。
前記の1つまたは複数のPMLおよび/またはIMP細胞は、任意の公知の方法を用いて生産され得る。前記の1つまたは複数のPMLは、好ましくは、国際出願PCT/GB2012/051600(WO2013/005053として公開)に記載の方法を用いて生産される。前記の1つまたは複数のIMP細胞は、好ましくは、GB 1410504.3に開示の方法を用いて生産される。
これは典型的に、MCがPMLまたはIMP細胞へ分化するのを誘導する条件下でMCを培養するステップ、およびそれから、上述のマーカーを発現するPMLまたはIMP細胞を採取および培養するステップを含む。
単核細胞(MC)およびそれらを単離する方法は、当該分野で知られている。MCは、骨髄から単離される初期の(primary)MCであってよい。MCは、好ましくは末梢血MC(PBMC)、例えば、リンパ球、単球および/またはマクロファージである。PBMCは、Ficoll(登録商標)などの親水性多糖類を用いて、血液から単離することができる。例えば、PBMCは、Ficoll−Paque(登録商標)(市販の密度培地)を用いて血液から単離され得る。
培養する前に、MCを、間葉系幹細胞エンリッチメントカクテルに曝してよい。カクテルは、好ましくは、CD3、CD14、CD19、CD38、CD66b(不要な細胞上に存在する)を認識する抗体および赤血球の成分を含む。そのようなカクテルは、不要な細胞を赤血球と架橋させてイムノロゼット(immunorosette)を形成し、それは必要なMCから除去され得る。好ましいカクテルはRosetteSep(登録商標)である。
MCが間葉系細胞(主に中胚葉に由来する組織)へ分化するのを誘導する適切な条件は、当該分野で知られている。例えば、適切な条件は、Capelli,C.,et al.(Human platelet lysate allows expansion and clinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples of bone marrow aspirates or marrow filter washouts.Bone Marrow Transplantation,2007.40:p.785−791)に開示される。これらの条件を用いて、本発明に従ってMCがPML分化するのを誘導してもよい。
当該方法は、好ましくは、MCを血漿溶解物とともに培養して、MCがPMLまたはIMP細胞へ分化するのを誘導するステップを含む。血小板溶解物とは、血小板に含まれる天然の増殖因子の組み合わせ(これらの血小板の溶解により放出されたもの)をいう。溶解は、化学的手段(すなわちCaCl2)、浸透圧的手段(蒸留H2Oの使用)を介して、または、凍結/融解の手順を介して、達成することができる。血小板溶解物は、米国特許第5,198,357号に記載のとおりに、全血から得ることができる。血小板溶解物は、好ましくは、PCT/GB12/052911(WO2013/076507として公開)に記載のとおりに調製される。血漿溶解物は、好ましくはヒト血漿溶解物である。
例えば、MCは、血小板溶解物を含む培地中で、MCがPMLまたはIMP細胞へ分化するのを誘導するのに十分な時間、培養され得る。十分な時間は典型的に、約15〜約25日、好ましくは約22日である。培地は、好ましくは、約20体積%またはそれ未満の血小板溶解物、例えば約15体積%またはそれ未満、または約10体積%またはそれ未満を含む。培地は、好ましくは、約5体積%〜約20体積%の血小板溶解物、例えば約10体積%〜約15体積%を含む。培地は、好ましくは、約10体積%の血小板溶解物を含む。
あるいは、MCは、間葉性エンリッチメントカクテルに曝され、それから、MCがPMLまたはIMP細胞へ分化するのを誘導するのに十分な時間、血小板溶解物を含む培地中で培養され得る。十分な時間は、典型的に、約15〜約25日、好ましくは約22日である。
培地は、好ましくは最小必須培地(MEM)である。MEMは、Sigma−Aldrichを含む様々な供給源から市販される。培地は、好ましくは、ヘパリン、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトアビジン(P/S)の1つまたは複数をさらに含む。L−グルタミンは、GlutaMAX(登録商標)(Life Technologiesから市販される)と置き換えてよい。
MCは、典型的に、PMLまたはIMP細胞が付着するのを可能にする条件下で培養される。適切な条件は、上記により詳細に述べられている。
MCは、好ましくは、低酸素条件下で培養される。MCは、好ましくは、約20%未満の酸素(O2)、例えば約19%未満、約18%未満、約17%未満、約16%未満、約15%未満、約14%未満、約13%未満、約12%未満、約11%未満、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、または約1%未満の酸素(O2)において培養される。MCは、好ましくは、約0%〜約19%のO2、例えば約1%〜約15%のO2、約2%〜約10%のO2、または約5%〜約8%のO2において培養される。MCは、最も好ましくは、約0%のO2において培養される。上記で見積もられた酸素の%(またはO2の%)に関する数字は、例えば細胞インキュベーターにより、培養中に細胞に供給されるガス中の酸素の体積%に関連する。一部の酸素は、インキュベーター内に漏れ得て、または、ドアーが開いているときに入り得ることが可能である。
MCは、最も好ましくは、血小板溶解物の存在下および低酸素条件下で培養される。この組み合わせは、損傷組織内の自然な条件を模倣するので、より健康的かつより治療的に強力な細胞をもたらす。従来の細胞培養は、20%または21%酸素(およそ大気の含有量)で行われるが、ヒト体内に、この酸素レベルを有する場所はない。肺内の上皮細胞は、この酸素レベルを「見る」が、酸素が溶解して肺を去る時点で、17%付近に減少する。それから、組織の大部分でさらにいっそう約1〜2%まで減少するが、関節内の軟骨のような無血管組織では0.1%という低さになる。
また、1つまたは複数のPMLまたはIMP細胞を生産するステップは、上述の必須マーカー発現パターンを有するPMLまたはIMP細胞を採取および培養するステップも含む。必須マーカー発現パターンを有するPMLまたはIMP細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)および磁気ビーズ分離を含む任意の抗体に基づく技術を用いて採取してよい。FACSが好ましい。
上述から明らかなように、1つまたは複数のPMLまたはIMP細胞の生産は、臨床関連の条件、すなわち、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、例えば、リポ多糖、リポペプチドおよびペプチドグリカンなどの不存在下で行なわれる。このことは、PMLまたはIMP細胞を、患者への投与に特に適切にさせる。
MCは、好ましくは、患者または同種異系ドナーから得られる。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数の間葉系幹細胞(MSC)である。適切なMSCは、当該分野で知られている。上記に開示の任意のMSCを用いてよい。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数の間葉前駆細胞(MPC)である。前記の1つまたは複数の治療的細胞は、より好ましくは、1つまたは複数のヒトMPCである。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数の樹状細胞である。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数の血小板である。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数の線維芽細胞である。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、1つまたは複数の筋線維芽細胞である。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくはヒトである。前記の1つまたは複数の治療的細胞は、PMLおよびIMP細胞の由来に関して上述した任意の動物または哺乳類から採取してよい。
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、典型的に、組成物中の他の成分と組み合わせられる前に、インビトロで培養される。細胞を培養する技術は、当業者によく知られている。細胞は、血清を含まない培地中、37℃、5%CO2の標準的な条件下で培養され得る。細胞は、好ましくは、以下により詳細に述べる低酸素条件下で培養される。細胞は、標準的な6ウェルプレートのような平板のウェルを含む任意の適切なフラスコまたは容器内で培養してよい。そのようなプレートは、Fisher scientific、VWR suppliers、Nunc、StarstedtまたはFalconから市販される。ウェルは典型的に、約1ml〜約4mlの容量を有する。
フラスコ、容器またはウェル(その中に集団が含まれ、または培養される)は、細胞のハンドリングを促進するように改変され得る。例えば、フラスコ、容器またはウェルは、細胞の培養を促進するように、例えば、増殖マトリックスを含むことによって改変され得る。フラスコ、容器またはウェルは、細胞の付着を可能にするように、または表面上への細胞の固定化を可能にするように、改変され得る。1つまたは複数の表面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニンまたはコラーゲン、または、細胞に結合してそれらを表面(単数または複数)上に固定化または補足する任意の他の捕捉分子によりコーティングされ得る。
細胞は、本明細書に記載の任意の技術を用いて、エクスビボで改変され得る。例えば、集団は、治療薬または診断薬がトランスフェクトまたはロードされ得る。それから集団は、以下により詳細に述べる治療方法において用いられ得る。
[薬物、方法および治療的用途]
本発明の組成物は、ヒトまたは動物の体の治療の方法で用いられ得る。したがって、本発明は、患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、本発明の組成物を提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。
本発明の組成物は、ヒトまたは動物の体の治療の方法で用いられ得る。したがって、本発明は、患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、本発明の組成物を提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。
また、本発明は、それを必要とする患者における老化を阻害する方法での使用のための、本発明の組成物も提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。老化は、細胞およびこれらの細胞を含む生物の機能の徐々な悪化である。本発明は、したがって、患者における老化を阻害するステップに関し得る。本発明は、したがって、患者の1つまたは複数の組織における老化を阻害するステップに関し得る。前記の1つまたは複数の組織は、以下に述べられるもののいずれかであってよい。本発明の組成物は、典型的に、インビトロで細胞集団のヘイフリック限界を増大させる。ヘイフリック限界は、細胞分裂が止まるまでに正常の細胞集団(典型的に、正常のヒト細胞集団)が分裂する回数であり、Shay andWright,Nat Rev Mol Cell Biol.2000 Oct;1(1):72−6に述べられている。また、本発明は、加齢の阻害にも関する。
本発明は、患者における発毛を促進する方法での使用のための、本発明の組成物をさらに提供し、当該方法は、治療的有効量の組成物を患者に投与するステップを含む。
また、本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における損傷組織を治療するステップ、を含む、患者における損傷組織を修復する方法も提供する。損傷組織は、好ましくは負傷または疾患によって損傷されている。加えて、本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップ、およびそれにより、患者における老化を阻害するステップ、を含む、患者における老化を阻害する方法を提供する。また、本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における発毛を促進する方法も提供する。
損傷組織または老化組織は、好ましくは、中胚葉由来である。損傷組織または老化組織は、より好ましくは、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織である。当該方法は、したがって、患者における、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の疾患または負傷を治療するために用いられ得る。また、当該方法は、患者における、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の老化を阻害するためにも用いられ得る。
加えて、当該方法は、膣萎縮を治療するためのものであってよい。膣萎縮(萎縮性腟炎または泌尿生殖器萎縮としても知られる)は、組織のスリム化および縮小、ならびに、潤滑低減に起因する、膣(および、外側尿路)の炎症である。それは典型的に、ホルモンエストロゲンの分泌の低下によって引き起こされる。
心臓の負傷、疾患、または老化は、好ましくは、心筋梗塞(MI)、左室肥大、右室肥大、塞栓、心不全、先天性心臓欠損、心臓弁膜症、不整脈および心筋炎から選択される。
MIは、心筋によって放出されるVEGFおよびEPOのレベルを増大させる。さらに、MIは、炎症性反応と関連し、梗塞組織は、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、インターロイキン(IL‐6)およびKC/Gro‐αも放出する。CCL7(以前はMCP3として知られる)、CXCL1、CXCL2は、心筋梗塞(MI)の後に心臓内で著しく上方制御され、梗塞心筋へのMSCのホーミングおよび生着の制御に関与し得る。
心筋梗塞マウスモデルでは、IL‐8は、まず、MI後の最初の2日に遺伝子発現を高度に上方制御することが示された。驚くべきことに、IL‐8発現の増加は、主に、梗塞領域および境界域で生じ、残りの心筋ではよりいっそう低い程度であった。CXCR2を活性化することにより、MIFは、ケモカイン様の機能を示し、炎症性細胞動員およびアテローム発生の主なレギュレーターとして作用する。
骨の疾患または負傷は、好ましくは、骨折、Salter−Harris骨折、若木骨折、骨棘、頭蓋骨癒合症、コフィン−ローリー症候群、進行性骨化線維異形成症、線維性骨異形成症、Fong疾患(または爪膝蓋骨症候群)、低ホスファターゼ症、クリッペル・ファイル症候群、代謝性骨疾患、爪膝蓋骨症候群、変形性関節症、変形性骨炎(または骨パジェット病)、嚢胞性線維性骨炎(または線維性骨炎またはフォンレックリングハウゼン骨病)、恥骨骨炎、硬化性骨炎(condensing osteitis)(または硬化性骨炎(osteitis condensans))、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨炎、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨減少症、大理石骨病、骨粗鬆症、骨壊死、骨萎縮性骨化過剰症、原発性副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストロフィー、骨癌、転移性癌と関連する骨病変、Gorham Stout疾患、原発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、および、関節置換の無菌弛緩から選択される。骨癌は、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫(骨の巨大な腫瘍)、骨軟骨腫または破骨細胞腫であってよい。骨病変をもたらす転移性癌は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌および/または成人T細胞白血病であってよい。
本発明の方法に係る本発明の組成物の投与は、好ましくは、改善された組織再生をもたらす。さらに、本発明の方法に係る本発明の組成物の投与は、好ましくは、アポトーシスの低減をもたらす。
本発明は、治療的有効量の本発明の組成物を患者に投与するステップに関する。治療的有効量は、損傷組織または老化組織の症状の1つまたは複数を改善する、または、発毛を促進する量である。治療的有効量は、好ましくは、損傷組織または老化組織を修復する、または発毛をもたらす量である。
本発明の組成物は、任意の適切な患者に投与され得る。患者は、一般に、ヒトである。患者は、任意の哺乳類であってよい。そのような哺乳類は、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物、マウスまたはラットのような実験動物、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペットを含む。
患者は、幼児、子どもまたは成人であってよい。患者は、損傷組織または老化組織を有することが知られていてよく、または、損傷組織または老化組織を有する疑いがある。患者は、関連のある疾患、負傷または老化を起こしやすく、またはそのリスクがあってよい。例えば、患者は、遺伝学的に心不全に罹りやすくてよい。
本発明は、損傷組織を修復、老化を阻害、または、疼痛緩和を提供するための、他の手段および物質と組み合わせて用いてよい。ある場合には、本発明の組成物は、損傷組織を修復する、老化を阻害する、または、疼痛緩和を提供することを目的とする他の物質と、同時に、連続して、または別々に投与され得る。本発明の組成物は、損傷組織を修復する、または老化を阻害するための、既存の物質と組み合わせて用いてよく、および、例えば、そのような治療と単純にミックスしてよい。したがって、本発明を用いて、老化阻害または損傷組織のための既存の物質の有効性を増大させ得る。同様に、本発明の組成物は、発毛を促進するための他の手段および物質と組み合わせて用いてよい。
上記に示したように、本発明の組成物は、1つまたは複数の治療的細胞を含んでよい。全ての例において、前記の1つまたは複数の治療的細胞は、好ましくは、患者または同種異系ドナーから採取される。患者から細胞を採取することは、患者の免疫系によって細胞自身が拒絶されないことを確実にするはずである。ドナーおよびレシピエントの間の任意の違いは、細胞のクリアランスを最終的に引き起こすが、損傷組織または老化組織の少なくとも一部をそれらが修復する前ではない。
本発明の一態様は、患者に治療的に効果的な数の治療的細胞を患者へ投与するステップに関する。治療的に効果的な数は、損傷、疾患、負傷または老化の症状の1つまたは複数を改善する数である。治療的に効果的な数は、好ましくは、損傷組織を修復する、または、疾患、負傷または老化を治療する数である。
治療的細胞は、治療薬および/または診断薬がロードまたはトランスフェクトされ得る。治療薬は、損傷組織または老化組織を修復するのを助け得る。蛍光分子のような診断薬は、患者内での組成物の位置を特定するのを助け得る。細胞は、当技術分野で知られている任意の方法を用いてロードまたはトランスフェクトされ得る。細胞のロードは、インビトロまたはエクスビボで行なわれ得る。それぞれの場合において、細胞は、培養物中で薬剤と単純に接触され得る。あるいは、細胞は、リポソームのような送達ビヒクルを用いて、薬剤がロードされ得る。そのようなビヒクルは、当技術分野で知られている。
PMLまたはIMP細胞のような細胞のトランスフェクションは、インビトロまたはエクスビボで行なわれ得る。あるいは、安定したトランスフェクションは、MC段階で行なわれ得て、導入遺伝子を発現するPMLが、それらから分化するのを可能にする。細胞は典型的に、薬剤をコードする核酸によってトランスフェクトされる。例えば、薬剤をコードする、ウイルス粒子または他のベクターが用いられ得る。これを行なう方法は、当該分野で知られている。
核酸は、細胞内で薬剤の発現を生じさせる。核酸分子は、好ましくは、薬剤をコードする配列に動作可能に連結されて、およびPML内で活性であり、または細胞内で誘導され得る、プロモーターを含む。
特に好ましい実施態様では、薬剤をコードする核酸は、ウイルス粒子を介して送達され得る。ウイルス粒子は、標的化分子を含み、効率的なトランスフェクションを確実にし得る。標的化分子は典型的に、その分子がウイルスを細胞に対して標的化することができるように、ウイルスの表面上に全体的または部分的に与えられる。
任意の適切なウイルスを、そのような実施態様で用いてよい。ウイルスは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスであってよい。特に好ましい実施態様では、ウイルスは、レンチウイルスであってよい。レンチウイルスは、遺伝子を送達する使用に適切な改変HIVウイルスであってよい。レンチウイルスは、SIV、FIV、またはウマ伝染性貧血ウイルス(EQIA)に基づくベクターであってよい。ウイルスは、モロニーミューリン白血病ウイルス(MMLV)であってよい。本発明で用いられるウイルスは、好ましくは複製欠損型である。
ウイルス粒子を使用する必要はない。従来のプラスミドDNAまたはRNAトランスフェクションなど、細胞をトランスフェクトすることが可能な任意のベクターを用いてよい。
核酸構築物の取り込みは、トランスフェクション剤の使用を含むもののようないくつかの公知のトランスフェクション技術により増強され得る。これらの試薬の例は、カチオン剤、例えば、リン酸カルシウムおよびDEAE−デキストランおよびリポフェクタント(lipofectant)、例えば、リポフェクタミン、フュージーン(fugene)およびトランスフェクタム(transfectam)を含む。
細胞は、適切な条件下でロードまたはトランスフェクトされ得る。細胞および薬剤またはベクターは、例えば、5分〜10日、好ましくは1時間〜5日、より好ましくは5時間〜2日、さらにより好ましくは12時間〜1日の間、接触させてよい。
一部の実施態様では、MCは、患者から回収され、上述のようにPMLおよび/またはIMP細胞に変換され、インビトロでロードまたはトランスフェクトされ、およびそれから、同一患者に戻してよい。そのような例では、本発明で用いられるPMLおよび/またはIMP細胞は、自己由来の細胞であり、患者と完全に一致する。好ましい例では、本発明で用いられる細胞は、患者から回収され、エクスビボで使用され、その後に同一患者へ戻される。
[医薬組成物および投与]
本発明の組成物は、任意の適切な方法を用いて製剤化され得る。標準的な薬学的に許容できる担体および/または賦形剤を用いた細胞の製剤化は、調剤分野における常法を用いて行なわれ得る。製剤の厳密な性質は、投与される細胞および所望の投与経路を含むいくつかの因子に依存する。適切な製剤タイプは、Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Edition,Mack Publishing Company,Eastern Pennsylvania,USAに完全に記載されている。
本発明の組成物は、任意の適切な方法を用いて製剤化され得る。標準的な薬学的に許容できる担体および/または賦形剤を用いた細胞の製剤化は、調剤分野における常法を用いて行なわれ得る。製剤の厳密な性質は、投与される細胞および所望の投与経路を含むいくつかの因子に依存する。適切な製剤タイプは、Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Edition,Mack Publishing Company,Eastern Pennsylvania,USAに完全に記載されている。
本発明の組成物は、典型的に滅菌されている。
本発明の組成物は、任意の経路により投与され得る。適切な経路は、限定されないが、局所、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または他の適切な投与経路を含む。組成物は、好ましくは、損傷組織または老化組織に直接投与される。また、組成物は、組成物が投与される領域において発毛を促進するために、局所的に投与してもよい。膣萎縮は、本発明の組成物を局所的に適用することによって治療され得る。
本発明の組成物は、生理的に許容できる担体または希釈剤を一緒に用いて調製され得る。適切な担体または賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロールなど、およびそれらの組み合わせである。凍結乾燥された組成物は、典型的に、治療的使用の前に再水和される。
加えて、必要に応じて、本発明の医薬組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、および/または有効性を高めるアジュバントを含んでよい。そのような薬剤は、当技術分野で知られている。組成物は、好ましくは、ヒト血清アルブミンを含む。組成物は、好ましくはゼノフリーである。
適切な担体または希釈剤の1つは、Plasma−Lyte A(登録商標)である。これは、静脈内投与のための、滅菌の、非発熱性の等張液である。各100mLは、526mgの塩化ナトリウム、USP(NaCl);502mgのグルコン酸ナトリウム(C6H11NaO7);368mgの酢酸ナトリウム三水和物、USP(C2H3NaO2・3H2O);37mgの塩化カリウム、USP(KCl);および30mgの塩化マグネシウム、USP(MgCl2・6H2O)を含む。それは抗菌剤を含まない。pHは水酸化ナトリウムを用いて調整される。pHは7.4(6.5〜8.0)である。
本発明の組成物は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的であるような量で投与される。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系の能力、および、所望の修復または治療の程度に依存する。投与される必要がある正確な量は、熟練者の判断に依存し得て、および、それぞれの対象に特有であり得る。
任意の適切な量の本発明の組成物が、対象に投与され得る。例えば、投与される本発明の医薬組成物の量は、約0.1g〜100g、例えば、約0.5g〜約75g、約1g〜約50g、約2g〜約20g、または、約3g〜10gの範囲であり得る。
組成物が治療的細胞を含む場合、投与される治療的細胞の量は、治療される対象、対象の免疫系の能力、および、所望の修復の程度に依存する。投与される必要がある細胞の正確な量は、熟練者の判断に依存し得て、および、それぞれの対象に特有であり得る。
任意の適切な数の細胞が、対象に投与され得る。例えば、患者のkgあたり、少なくとも、または約、0.2×106、0.25×106、0.5×106、1.5×106、4.0×106または5.0×106の細胞が投与され得る。例えば、少なくとも、または約、105、106、107、108、109の細胞が投与され得る。目安として、投与される細胞の数は、105〜109、好ましくは、106〜108であり得る。典型的に、2×108までのIMP細胞が、それぞれの患者に投与される。上述の任意の特定の数が投与され得る。
本発明の組成物は、凍結乾燥された形態であってよい。凍結乾燥プロセスは、安定化された、凍結−乾燥された、増殖因子および潜在的に上述の他の生体活性成分を含む薬剤粉末を生産する。この凍結乾燥された組成物は、異なる温度でよりいっそう長期の安定性で、損傷組織または老化組織を有する患者、または発毛の促進を必要とする患者の効果的な治療のために、他の技術と組み合わせることができる。このことは、治療の輸送および製剤の物流プロセスを回避する。
一実施態様は、乾燥された、凍結乾燥された本発明の組成物である。治療の直前に水と組み合わせると、ゲル様の粘性が形成される。
他の実施態様では、本発明の医薬組成物または本発明の血小板溶解物は、代替的に、異なる以下のものと組み合わせることができる:
・以下のような製剤/送達方法:
‐ローション、シェイクローション、クリーム、軟膏、ジェル、フォーム、経皮パッチ、粉末、固体、スポンジ、テープ、ペースト、絆創膏、ガーゼ、シリンジ、スプレー
・以下のような処理:
‐間葉系幹細胞、造血性幹細胞、単核細胞、内皮前駆細胞、中胚葉性前駆細胞、抗生物質、鎮痛剤、銀、創傷清拭剤、医療機器
・以下のようなパッケージ方法:
‐滅菌パッケージ、ボトル、ボックス、缶
・保管方法
‐理想的に室温粉末;必要に応じて冷蔵または冷凍される。
‐ローション、シェイクローション、クリーム、軟膏、ジェル、フォーム、経皮パッチ、粉末、固体、スポンジ、テープ、ペースト、絆創膏、ガーゼ、シリンジ、スプレー
・以下のような処理:
‐間葉系幹細胞、造血性幹細胞、単核細胞、内皮前駆細胞、中胚葉性前駆細胞、抗生物質、鎮痛剤、銀、創傷清拭剤、医療機器
・以下のようなパッケージ方法:
‐滅菌パッケージ、ボトル、ボックス、缶
・保管方法
‐理想的に室温粉末;必要に応じて冷蔵または冷凍される。
[細胞の集団を生産する方法]
本発明は、損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法を提供する。当該方法は、MC、PMLおよび/またはIMPを、本発明の組成物の存在下で培養するステップ、および、MC、PMLおよび/またはIMPの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む。
本発明は、損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法を提供する。当該方法は、MC、PMLおよび/またはIMPを、本発明の組成物の存在下で培養するステップ、および、MC、PMLおよび/またはIMPの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む。
MCおよびそれらを単離する方法は、当技術分野で知られている。MCは、骨髄から単離される初期の(primary)MCであってよい。MCは、好ましくは、末梢血MC(PBMC)、例えば、リンパ球、単球および/またはマクロファージである。PBMCは、Ficoll(登録商標)のような親水性多糖類を用いて、血液から単離することができる。例えば、PBMCは、Ficoll−Paque(登録商標)(市販の密度培地)を用いて血液から単離され得る。
IMPおよび/またはPMLは、好ましくは、上記に定義されるとおりである。
本発明の方法は、臨床関連の条件下で、すなわち、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、例えば、リポ多糖類、リポペプチドおよびペプチドグリカンなどの不存在下で、行なわれ得る。このことは、生じる細胞の集団を、患者への投与に特に適切にさせる。
MC、PMLまたはIMPは、好ましくは、患者または同種異系ドナーから採取される。この場合、本発明の方法によって生産される細胞の集団は、患者と自己由来であり、したがって、患者への投与の際に拒絶されない。
また、MC、PMLまたはIMPは、細胞が最終的に投与される患者と免疫学的に適合する1または複数の異なる患者から採取してもよい。この場合、本発明の方法によって生産される細胞の集団は、患者と同種異系または半−同種異系である。したがって、患者への集団の投与の際の拒絶の機会は、低減される。
また、本発明は、患者への投与に適切であって本発明の方法を用いて生産される、細胞の集団も提供する。細胞の集団は、上記に定義したPML、MSCまたはIMPを含んでよい。
以下の実施例は、本発明を説明する。
実施例1−組成物の調製
本発明の組成物を、ヒト血小板から調製した。ヒト輸注のための血小板は、貯蔵寿命が短いので、Welsh Blood Serviceからすぐに利用可能である。
本発明の組成物を、ヒト血小板から調製した。ヒト輸注のための血小板は、貯蔵寿命が短いので、Welsh Blood Serviceからすぐに利用可能である。
血小板を凍結保存バッグ内に置いて、中身が完全に凍るまで、バッグを液体窒素に移した。それからバッグを、中身が完全に解凍するまで、37℃の水浴に移した。この凍結融解サイクルを4回繰り返して、血小板の溶解をもたらし、それらの中身の血漿相への放出をもたらした。溶解物を遠心分離菅へ移して、室温にて3200gで20分間、遠心分離して、血小板デブリをペレット化した。上清を未使用のチューブ中に集めて、細かい(40μm)メッシュを通して注ぎ、デブリを減らした。それから、組成物を、−80℃にてアリコートで保管した
実施例2−治療的ゲルの調製
実施例1の組成物をPBS中メチルセルロースと混合することによって、治療的ゲルを作製した。この場合、最終ゲルは、2.5%メチルセルロース、0.5×PBSおよび50%組成物であった。しかしながら、同様の方法を用いて任意のゲル製剤を調製することができる。
実施例1の組成物をPBS中メチルセルロースと混合することによって、治療的ゲルを作製した。この場合、最終ゲルは、2.5%メチルセルロース、0.5×PBSおよび50%組成物であった。しかしながら、同様の方法を用いて任意のゲル製剤を調製することができる。
実施例1で生産された組成物を、4℃にて一晩解凍して、室温にて20分間、3200gで遠心分離した。上清を未使用のチューブ中に集めて、細かい(40μm)メッシュを通して注ぎ、デブリを減らした。
メチルセルロースの必要な量を、パーチメントコーティングされたコイルの上に計量してその中にパッケージして、注意深く密封した。PBSの必要な量をボトル中に測定して、スターラーバーを加えた。それから、パッケージされたメチルセルロース、および、PBSのボトルを、オートクレーブした。
オートクレーブの後に、PBSを80℃の水浴中で温めた。安全キャビネット内で、メチルセルロースの封を開けて、熱いPBS中に分注して、勢いよく撹拌した。メチルセルロース懸濁液をそのまま撹拌して、手で触れる熱さ(hand hot)まで冷やした。
解凍された組成物を、それから、手で触れる熱さのメチルセルロース懸濁液に加えた。混合物を、さらに20分間撹拌した。最後に、生じたゲルを冷蔵庫に移して、そこで、メチルセルロースの完全な水和が、ゲルの濃縮および浄化をもたらした。
実施例3−ゲル製剤の最適化
組成物およびメチルセルロースまたはPF−127を含むゲル製剤を、ゲル化温度、ゲルの粘性、線維芽細胞の増殖を高めるその能力、および、長期保管に関するその適合性を調べることによって最適化した。
組成物およびメチルセルロースまたはPF−127を含むゲル製剤を、ゲル化温度、ゲルの粘性、線維芽細胞の増殖を高めるその能力、および、長期保管に関するその適合性を調べることによって最適化した。
方法
[ゲル製剤]
エンドトキシンフリーの試薬、および、滅菌された使い捨て、またはオートクレーブされた消耗品を用いて、クラスIIラミナーフローフード内でゲルを調製した。全ての試薬および消耗品は、70%v/vエタノールを用いて汚染除去した。
[ゲル製剤]
エンドトキシンフリーの試薬、および、滅菌された使い捨て、またはオートクレーブされた消耗品を用いて、クラスIIラミナーフローフード内でゲルを調製した。全ての試薬および消耗品は、70%v/vエタノールを用いて汚染除去した。
[プラセボゲル]
Stuartホットプレートマグネチックスターラー(Fisher scientific,UK)上で、ガラスボトル中で80℃にて、10mlの滅菌脱イオン水に、0.4g、0.5gまたは0.6gのメチルセルロース(2%溶液で、4000cP;Sigma−Aldrich,UK;滅菌のためにオートクレーブした)をゆっくり加えることによって、メチルセルロースゲルを2%、2.5%または3%で調製した。この溶液を、さらに撹拌しながら、37℃まで冷やされる前に15分間、撹拌した。さらに10mlの滅菌脱イオン水を加えて、マグネチックスターラーから取り除かれる前に、溶液を30分間撹拌して、4℃にて一晩保管した。
Stuartホットプレートマグネチックスターラー(Fisher scientific,UK)上で、ガラスボトル中で80℃にて、10mlの滅菌脱イオン水に、0.4g、0.5gまたは0.6gのメチルセルロース(2%溶液で、4000cP;Sigma−Aldrich,UK;滅菌のためにオートクレーブした)をゆっくり加えることによって、メチルセルロースゲルを2%、2.5%または3%で調製した。この溶液を、さらに撹拌しながら、37℃まで冷やされる前に15分間、撹拌した。さらに10mlの滅菌脱イオン水を加えて、マグネチックスターラーから取り除かれる前に、溶液を30分間撹拌して、4℃にて一晩保管した。
マグネチックスターラー上で、ガラスボトル中で、4℃にて20mlの脱イオン水に、4g、5gまたは6gのPF−127(Sigma−Aldrich,UK)をゆっくり加えることによって、PF−127ゲルを20%、25%および30%で調製した。マグネチックスターラーから取り除かれる前に4℃にて40分間、溶液を撹拌して、4℃にて一晩保管した。
[治療的ゲル]
治療的メチルセルロースゲルを、実施例2に従って調製した。
マグネチックスターラー上で、ガラスボトル中で4℃にて、15mlの組成物に、3.75gまたは4.5gのポリマー粉末をゆっくり加えることによって、治療的PF−127ゲルを25%および30%で調製した。マグネチックスターラーから取り除かれる前に4℃にて1時間、溶液を撹拌して、4℃にて一晩保管した。
治療的メチルセルロースゲルを、実施例2に従って調製した。
マグネチックスターラー上で、ガラスボトル中で4℃にて、15mlの組成物に、3.75gまたは4.5gのポリマー粉末をゆっくり加えることによって、治療的PF−127ゲルを25%および30%で調製した。マグネチックスターラーから取り除かれる前に4℃にて1時間、溶液を撹拌して、4℃にて一晩保管した。
[レオロジー測定]
プラセボゲルおよび治療的ゲル製剤のゾル−ゲル遷移温度を決定するために、レオロジー測定を行なった。
プラセボゲルおよび治療的ゲル製剤のゾル−ゲル遷移温度を決定するために、レオロジー測定を行なった。
[写真観察]
また、ゲル密度を写真でも観察した。吸収表面(Wypall blue roll;Fisher Scientific,UK)上に注入される前に、ゲルを、4℃、22℃または37℃にて30分間、2mlシリンジ中に保管した。写真は、Canon EOSカメラを用いて直ちに撮った。局所適用に適切なゲル密度を示すためのポジティブコントロールとしてNurofen(登録商標)イブプロフェンゲル(Reckitt Benckiser,UK)を用いて、液体を示すためのネガティブコントロールとして水を用いた。
また、ゲル密度を写真でも観察した。吸収表面(Wypall blue roll;Fisher Scientific,UK)上に注入される前に、ゲルを、4℃、22℃または37℃にて30分間、2mlシリンジ中に保管した。写真は、Canon EOSカメラを用いて直ちに撮った。局所適用に適切なゲル密度を示すためのポジティブコントロールとしてNurofen(登録商標)イブプロフェンゲル(Reckitt Benckiser,UK)を用いて、液体を示すためのネガティブコントロールとして水を用いた。
[線維芽細胞増殖アッセイ]
メチルセルロース治療的ゲルおよびPF−127治療的ゲルを、それぞれ2.5%および25%で調製した。alamarBlue(登録商標)アッセイのために96ウェルプレート中に蒔かれる前に、線維芽細胞(MRC 5CV1)を培養して採取した。FBS(2%)をコントロールとして用い、組成物(2%)をポジティブコントロールとして用い、および、15μMのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置(gel treatment)を、血清フリー培地に加えた(2%)。処置(treatment)を個々のウェルに加えて、それぞれのウェルにおいてゲルの均一な分散を確実にした。
メチルセルロース治療的ゲルおよびPF−127治療的ゲルを、それぞれ2.5%および25%で調製した。alamarBlue(登録商標)アッセイのために96ウェルプレート中に蒔かれる前に、線維芽細胞(MRC 5CV1)を培養して採取した。FBS(2%)をコントロールとして用い、組成物(2%)をポジティブコントロールとして用い、および、15μMのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置(gel treatment)を、血清フリー培地に加えた(2%)。処置(treatment)を個々のウェルに加えて、それぞれのウェルにおいてゲルの均一な分散を確実にした。
[組成物濃度の最適化]
メチルセルロースおよびPF−127ゲル中の組成物の最適濃度を決定するために、組成物の濃度が異なるゲルを調製した。均一な分散を確実にするためには、メチルセルロース粉末を液体に80℃で添加しなければならず、したがって、高温でのタンパク質変性のせいで、100%組成物でメチルセルロースゲルを調製することは不可能であった。したがって、メチルセルロースゲルは、50、37.5、25、12.5、および0%組成物で調製して、一方で、PF−127ゲルは、100、50、37.5、25、12.5、および0%組成物で調製した。alamarBlue(登録商標)アッセイを行なった。FBS(2%)をコントロールとして用い、組成物(2%)をポジティブコントロールとして用い、および、15μMのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置(gel treatment)を、血清フリー培地に加えた(2%)。
メチルセルロースおよびPF−127ゲル中の組成物の最適濃度を決定するために、組成物の濃度が異なるゲルを調製した。均一な分散を確実にするためには、メチルセルロース粉末を液体に80℃で添加しなければならず、したがって、高温でのタンパク質変性のせいで、100%組成物でメチルセルロースゲルを調製することは不可能であった。したがって、メチルセルロースゲルは、50、37.5、25、12.5、および0%組成物で調製して、一方で、PF−127ゲルは、100、50、37.5、25、12.5、および0%組成物で調製した。alamarBlue(登録商標)アッセイを行なった。FBS(2%)をコントロールとして用い、組成物(2%)をポジティブコントロールとして用い、および、15μMのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置(gel treatment)を、血清フリー培地に加えた(2%)。
[ゲル保管溶液]
治療的ゲルを室温および4℃で保管することができる時間の長さを決定するために、メチルセルロース治療的ゲルおよびPF−127治療的ゲルを、それぞれ、2.5%および25%で調製した。ゲルを室温または4℃で保管して、ゲルを作成するために用いた組成物の一部を等分して、アッセイまで−80℃にて保管した。0日、7日、14日、28日、2ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月に、alamarBlue(登録商標)アッセイを行なった。FBS(2%)をコントロールとして用い、組成物(2%)をポジティブコントロールとして用い、および、15μMのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置(gel treatment)を、血清フリー培地に加えた(2%)。
治療的ゲルを室温および4℃で保管することができる時間の長さを決定するために、メチルセルロース治療的ゲルおよびPF−127治療的ゲルを、それぞれ、2.5%および25%で調製した。ゲルを室温または4℃で保管して、ゲルを作成するために用いた組成物の一部を等分して、アッセイまで−80℃にて保管した。0日、7日、14日、28日、2ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月に、alamarBlue(登録商標)アッセイを行なった。FBS(2%)をコントロールとして用い、組成物(2%)をポジティブコントロールとして用い、および、15μMのシスプラチンをネガティブコントロールとして用いた。ゲル処置(gel treatment)を、血清フリー培地に加えた(2%)。
結果
[レオロジー測定およびプラセボゲルの写真]
メチルセルロースおよびPF−127プラセボのゾル−ゲル遷移温度を測定するために、振動温度傾斜をAR−G2レオメータで行なった。溶液は、損失弾性率G’’(粘性の尺度)よりも低い貯蔵弾性率G’(弾性の尺度)を有し、したがって、弾性であるよりも粘性である。対照的に、ゲルは、損失弾性率G’’よりも高い貯蔵弾性率G’を有し、したがって、粘性であるよりも弾性である。G’がG’’に等しい点は、ゾル−ゲル遷移温度として知られる。位相角δは、ゲル化点の別の示度である。溶液では、最低周波数は最高位相角δを有し、最高周波数は最低位相角δを有する。周波数がクロスオーバーする点は、ゾル−ゲル遷移温度である。
[レオロジー測定およびプラセボゲルの写真]
メチルセルロースおよびPF−127プラセボのゾル−ゲル遷移温度を測定するために、振動温度傾斜をAR−G2レオメータで行なった。溶液は、損失弾性率G’’(粘性の尺度)よりも低い貯蔵弾性率G’(弾性の尺度)を有し、したがって、弾性であるよりも粘性である。対照的に、ゲルは、損失弾性率G’’よりも高い貯蔵弾性率G’を有し、したがって、粘性であるよりも弾性である。G’がG’’に等しい点は、ゾル−ゲル遷移温度として知られる。位相角δは、ゲル化点の別の示度である。溶液では、最低周波数は最高位相角δを有し、最高周波数は最低位相角δを有する。周波数がクロスオーバーする点は、ゾル−ゲル遷移温度である。
室温(22℃)および体温(37℃)では、メチルセルロースプラセボ(2.0〜3.0%)は、弾性よりも粘性であることが分かり(図1A〜C)、したがって、それらは、ゲルであるように見た目上は見えるにもかかわらず、技術的には粘性の液体であった(図2)。PF−127プラセボ(20〜30%)は、体温でゲルであることが見られたが、室温でのそれらの状態は、ポリマー濃度に依存した(図1D〜F)。ポリマー濃度の増加は、メチルセルロースおよびPF−127プラセボの両方に関して、ゾル−ゲル遷移温度を低下させた(表3)。
写真を用いて、4℃、22℃および37℃でのゲル粘性の目視観察を提供した(図2)。メチルセルロースは、4℃と37℃との間で、粘性が変化しないようであった。このことは、50℃を超えるまで粘性の増加は無いことを示すレオロジー測定と一致する。PF−127は、温度上昇に伴って粘性が増加することを明らかに見ることができ、これもまた、レオロジーデータと一致する。これらの観察に続いて、メチルセルロースに関する最適濃度として2.5%を選択して、一方で、PF−127に関する最適濃度として25%および30%を選択した。
[治療的ゲルのレオロジー測定および写真]
メチルセルロースおよびPF−127に対する、組成物の効果を観察するために、振動温度傾斜および写真を、組成物によって調製されたゲルに関して繰り返した。ゲルに対する組成物の添加は、ゾル−ゲル遷移温度に効果を有した(表4)。組成物によって調製されたメチルセルロースは、20〜65℃の間でゲルを形成しなかった(図3A)。しかしながら、37℃では、組成物によるメチルセルロースの粘性は、ポジティブコントロールのものとなお同様である(図4)。対照的に、組成物は、PF−127がゲルを形成する能力を改善し、ゾル−ゲル遷移温度を低下させることが分かった(図3B〜C)。また、粘性の増加は、図4においても視覚的に観察することができる。PF−127 PL(30%)は、非常に濃く、その結果として、注入しにくいことが分かった。したがって、2.5%メチルセルロースおよび25% PF−127を、組成物ゲル形成に関する最適濃度として選択した。
メチルセルロースおよびPF−127に対する、組成物の効果を観察するために、振動温度傾斜および写真を、組成物によって調製されたゲルに関して繰り返した。ゲルに対する組成物の添加は、ゾル−ゲル遷移温度に効果を有した(表4)。組成物によって調製されたメチルセルロースは、20〜65℃の間でゲルを形成しなかった(図3A)。しかしながら、37℃では、組成物によるメチルセルロースの粘性は、ポジティブコントロールのものとなお同様である(図4)。対照的に、組成物は、PF−127がゲルを形成する能力を改善し、ゾル−ゲル遷移温度を低下させることが分かった(図3B〜C)。また、粘性の増加は、図4においても視覚的に観察することができる。PF−127 PL(30%)は、非常に濃く、その結果として、注入しにくいことが分かった。したがって、2.5%メチルセルロースおよび25% PF−127を、組成物ゲル形成に関する最適濃度として選択した。
[組成物濃度の最適化]
線維芽細胞上での治療的ゲルの増殖性能力を調べるために、線維芽細胞を、様々な濃度の組成物を含む治療的ゲルとともに48時間培養した。図5に示される結果は、メチルセルロース治療的ゲルが、FBSコントロールよりも有意に多くの線維芽細胞増殖を促進したことを示す。PF−127治療的ゲルとFBSコントロールとの間に有意差はなかった。組成物の濃度が増加すると細胞の数が増加する全般的な傾向があったが、これは有意でなかった。組成物の一番高い濃度をさらなる実験に選択した(メチルセルロースに関して50%、および、PF−127に関して100%)。
線維芽細胞上での治療的ゲルの増殖性能力を調べるために、線維芽細胞を、様々な濃度の組成物を含む治療的ゲルとともに48時間培養した。図5に示される結果は、メチルセルロース治療的ゲルが、FBSコントロールよりも有意に多くの線維芽細胞増殖を促進したことを示す。PF−127治療的ゲルとFBSコントロールとの間に有意差はなかった。組成物の濃度が増加すると細胞の数が増加する全般的な傾向があったが、これは有意でなかった。組成物の一番高い濃度をさらなる実験に選択した(メチルセルロースに関して50%、および、PF−127に関して100%)。
[治療的ゲルの保管]
治療的ゲルが線維芽細胞増殖に対するそれらの有益な効果を失わずに保管することができる時間の長さを決定するために、ゲルを、線維芽細胞を培養するために用いられてFBSおよび組成物コントロールと比較される前に、0日、7日、14日、28日、2ヶ月、3ヶ月または6ヶ月の期間のあいだ、室温または4℃で保管した。結果を図6に示す。3ヶ月までのあいだ4℃で保管されたメチルセルロース治療的ゲルは、FBSコントロールよりも有意に多い線維芽細胞増殖(P≦0.01)を生じた。このメチルセルロース治療的ゲルを室温で保管した場合、増殖の効果は、2ヶ月までのあいだのみ、FBSよりも有意に大きかった(P≦0.01)。4℃で保管されたPF−127治療的ゲルは、FBSと比較して、線維芽細胞増殖にいかなる有意差もなかった。しかしながら、PF−127治療的ゲルを、室温で28日を超えて保管した場合、FBSよりも有意に悪い、線維芽細胞に対する増殖効果を有した(P≦0.05)。期待されたとおり、4℃での保管は、室温での保管よりも長い間、治療的ゲルの生物学的特性を保持した。
治療的ゲルが線維芽細胞増殖に対するそれらの有益な効果を失わずに保管することができる時間の長さを決定するために、ゲルを、線維芽細胞を培養するために用いられてFBSおよび組成物コントロールと比較される前に、0日、7日、14日、28日、2ヶ月、3ヶ月または6ヶ月の期間のあいだ、室温または4℃で保管した。結果を図6に示す。3ヶ月までのあいだ4℃で保管されたメチルセルロース治療的ゲルは、FBSコントロールよりも有意に多い線維芽細胞増殖(P≦0.01)を生じた。このメチルセルロース治療的ゲルを室温で保管した場合、増殖の効果は、2ヶ月までのあいだのみ、FBSよりも有意に大きかった(P≦0.01)。4℃で保管されたPF−127治療的ゲルは、FBSと比較して、線維芽細胞増殖にいかなる有意差もなかった。しかしながら、PF−127治療的ゲルを、室温で28日を超えて保管した場合、FBSよりも有意に悪い、線維芽細胞に対する増殖効果を有した(P≦0.05)。期待されたとおり、4℃での保管は、室温での保管よりも長い間、治療的ゲルの生物学的特性を保持した。
[結論]
ゾル−ゲル遷移温度は、ゲル産物を定義するための重要なパラメーターである。メチルセルロースおよびPF−127ゲルの両方のレオロジー測定は、ポリマー濃度の増加に伴い、ゾル−ゲル遷移温度(G’=G’’)の低下を示した。その観察は、以前に報告されている。体温では、メチルセルロース(2.0〜3.0%)は粘性溶液であることが分かり、一方で、PF−127(20%〜30%)はゲルであった。PF−127への組成物の添加は、ゾル−ゲル遷移温度を2〜5℃低下させることが分かった。PF−127のゲル化は、温度の上昇に起因し得て、ミセルの形成を引き起こし、その後に、温度が上昇し続けるにつれて、これらのミセルを立方構造に秩序よく詰める。対照的に、メチルセルロースへの組成物の添加は、ゲル形成を防ぐことが分かった。低い温度では、メチルセルロースは、疎水性メチル基を取り囲む籠様構造の形成に起因して、水溶性である。温度の上昇は、これらの籠構造を破壊して、疎水性基を曝露させて、疎水性凝集体の形成をもたらし、ゲルを産生する。メチルセルロースへの、塩類の添加は、ゾル−ゲル遷移を補助するか、または抑制する(supress)かのいずれかであることが報告されている。塩類は、水に関してポリマーと競合し得て、籠様構造の一部を破壊し、および、温度の上昇を模倣する。一方で、塩類は、メチルセルロース鎖の間に存在し得て、その鎖から水を反発させて、疎水性凝集体が形成するのをより困難にさせる。ゾル−ゲル遷移が20〜65℃の間で観察されなかったので、組成物は、メチルセルロースに対してこの後者の効果を有していたかもしれない。
ゾル−ゲル遷移温度は、ゲル産物を定義するための重要なパラメーターである。メチルセルロースおよびPF−127ゲルの両方のレオロジー測定は、ポリマー濃度の増加に伴い、ゾル−ゲル遷移温度(G’=G’’)の低下を示した。その観察は、以前に報告されている。体温では、メチルセルロース(2.0〜3.0%)は粘性溶液であることが分かり、一方で、PF−127(20%〜30%)はゲルであった。PF−127への組成物の添加は、ゾル−ゲル遷移温度を2〜5℃低下させることが分かった。PF−127のゲル化は、温度の上昇に起因し得て、ミセルの形成を引き起こし、その後に、温度が上昇し続けるにつれて、これらのミセルを立方構造に秩序よく詰める。対照的に、メチルセルロースへの組成物の添加は、ゲル形成を防ぐことが分かった。低い温度では、メチルセルロースは、疎水性メチル基を取り囲む籠様構造の形成に起因して、水溶性である。温度の上昇は、これらの籠構造を破壊して、疎水性基を曝露させて、疎水性凝集体の形成をもたらし、ゲルを産生する。メチルセルロースへの、塩類の添加は、ゾル−ゲル遷移を補助するか、または抑制する(supress)かのいずれかであることが報告されている。塩類は、水に関してポリマーと競合し得て、籠様構造の一部を破壊し、および、温度の上昇を模倣する。一方で、塩類は、メチルセルロース鎖の間に存在し得て、その鎖から水を反発させて、疎水性凝集体が形成するのをより困難にさせる。ゾル−ゲル遷移が20〜65℃の間で観察されなかったので、組成物は、メチルセルロースに対してこの後者の効果を有していたかもしれない。
ゲルの目視検査を用いて、局所適用に所望の粘性を有するゲルを選択した。ゲルの粘性は、ポリマー濃度が増加するに伴って増加することを見ることができた。それは、レオロジー測定と一致する。これらの試験に続いて、2.5%メチルセルロースおよび25% PF−127を、治療的ゲルの調製に関する最適濃度として選択した。これらのポリマーは価格が同程度であるので、メチルセルロースの使用は、ポリマー粉末の費用を10倍低下させ、したがってこれは、PF−127よりも商業的に魅力的な選択肢である。
最大濃度の組成物(メチルセルロースに関して50%組成物、および、PF−127に関して100% PL)を含む、メチルセルロースおよびPF−127ゲルは、より低い濃度よりも大きな程度で、線維芽細胞増殖を誘導するようであった。メチルセルロース治療的ゲル(12.5〜50%組成物)は、FBSコントロールよりも有意に多い、および、組成物ポジティブコントロールと同様レベルの、細胞増殖を誘導することが分かった。対照的に、PF−127組成物ゲル(12.5〜100%)は、FBSコントロールと統計的に異ならなかった。これは、37℃でのPF−127のより高い粘性に起因し得て、ゲルの外への増殖因子の拡散を制限した。最大組成物濃度を、今後のゲル製剤のための最適として選択した。
最後に、治療的ゲルの貯蔵寿命を、室温および4℃で評価した。メチルセルロース治療的ゲルは、室温で2ヶ月までのあいだ、および、4℃で3ヶ月まで、その増殖性能力を保持した。PF−127治療的ゲルは、室温で28日後に、線維芽細胞に対する増殖性効果が有意により悪かったが、4℃で保管した場合、6ヶ月までのあいだ、その効果を維持することができた。しかしながら、PF−127治療的ゲルは、全ての時点において、メチルセルロース治療的ゲルよりも、増殖の誘導が低レベルであった。加えて、PF−127治療的ゲルは、4℃で溶液であり、ポリマーから組成物の分離を生じさせた。これは、短期間の保管後に、均一でない産物をもたらした。
要約すると、本実施例は、調製後3ヶ月までのあいだ、線維芽細胞増殖をうまく促進することが可能な治療的ゲルを開発した。最適ゲルは、50%組成物および2.5%メチルセルロースを担体マトリックスとして含んだ。このマトリックスは、血小板ゲルの貯蔵寿命を改善し得て、増殖因子の徐放性をサポートし得る。PF−127は、メチルセルロースのようには上手くしなかった。それは、このゲルからの増殖因子の拡散の低下に起因し得る。最適化ゲルは、3ヶ月までの間、4℃で保管することができる。
実施例4−Luminex 7plex Angiogenesis Panelを用いた、組成物中の増殖因子のスクリーニング
方法
実施例1に従って、21個の異なる血小板サンプルから組成物を調製した。生じた組成物を用いて、実施例2に従った治療的ゲルを調製した。それぞれの最終的なゲルは、2.5%メチルセルロース、0.5×PBSおよび50%組成物を含んだ。
方法
実施例1に従って、21個の異なる血小板サンプルから組成物を調製した。生じた組成物を用いて、実施例2に従った治療的ゲルを調製した。それぞれの最終的なゲルは、2.5%メチルセルロース、0.5×PBSおよび50%組成物を含んだ。
それぞれの治療的ゲルの増殖因子含有量を、Luminex 7plex Angiogenesis Panelキット(パート#893605;ロット#311544)を用いて分析した。100μlの治療的ゲルを、トリプリケートで希釈チューブに分注して、400μlの希釈剤を加えて、そして、サンプルを注意深く混合した。100μlのそれぞれの希釈サンプルを、96ウェルのアッセイプレートに移した。それぞれの21個の治療的ゲルの過剰分を、今後の使用のために−80℃で保管した(実施例5を参照)。
スタンダードカクテルを希釈剤で再構成して、キットの説明書のとおりに、検量線を作成するために用いた。100μlのそれぞれのスタンダードを、96ウェルプレートのカラム1および2に移した。
50μlのそれぞれの微粒子のカクテルを5mlの微粒子希釈剤中に懸濁することによって、微粒子懸濁液を調製した。懸濁液を、ボルテックスによって完全に混合して、50μlを96ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、プレートシーラーホイルによって密封して、800rpmで、水平シェーカー上で室温にて2時間インキュベートした。
50μlの各ビオチン−コンジュゲート抗体を、ビオチン抗体希釈剤のバイアルに添加した。20mlの25×ウォッシュバッファー濃縮物を480mlのH2Oに添加することによって、Luminexウォッシュバッファーを調製した。アッセイプレートを、ウォッシュバッファー中で3回洗浄して、50μlの希釈されたビオチン−コンジュゲート抗体を各ウェルに添加した。プレートをホイルで密封して、800rpmで、水平シェーカー上で室温にて1時間インキュベートした。そのあいだに、Luminexマシンのレーザーを温めて、マシンをキャリブレーションした。分析物のパラメーターを、表5に示すように入力した。マシンに関するサンプルテンプレートを設定した。
ストレプアミジン(Strepavidin)−PEを、キットの説明書に従って作製した。プレートを前のとおりに洗浄して、ストレプトアビジン−PEを各ウェルに。プレートをホイルシーラーで覆って、800rpmで、水平シェーカー上で室温にて30分間インキュベートした。プレートを前のとおりに洗浄して、100μlのウォッシュバッファー中にサンプルを再懸濁した。サンプルを、それから、Luminexマシンにロードした。
5パラメーターロジスティック(5−PL)カーブフィットを用いて検量線を作った(図7)。
結果
結果を図8に示す。図8Aは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、bFGF、PDGF−BB、VEGF、PDGF−AA、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。VEGF−Dのレベルは、検出限界よりも低かったので示さない。図8Bは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、およびSEMを要約する。図8Cは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示し、図8Dは、この情報を箱髭図として示す。
結果を図8に示す。図8Aは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、bFGF、PDGF−BB、VEGF、PDGF−AA、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。VEGF−Dのレベルは、検出限界よりも低かったので示さない。図8Bは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、およびSEMを要約する。図8Cは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示し、図8Dは、この情報を箱髭図として示す。
結論
分析した増殖因子のうち、アンジオポエチンが最も豊富な因子であり、次がPDGF−BBであった。VEGF−Dは検出されなかった。
分析した増殖因子のうち、アンジオポエチンが最も豊富な因子であり、次がPDGF−BBであった。VEGF−Dは検出されなかった。
実施例5−増殖因子濃度に対する、保管の効果
方法
実施例4で調製されたそれぞれの21個の治療的ゲルの過剰分を、4℃にて2週間保管した。ゲルのチューブ内で、タンパク質の層化の明らかな兆候はなかった。この実施例で使用する前に、それぞれのチューブを転がすことによって穏やかに混合した。
方法
実施例4で調製されたそれぞれの21個の治療的ゲルの過剰分を、4℃にて2週間保管した。ゲルのチューブ内で、タンパク質の層化の明らかな兆候はなかった。この実施例で使用する前に、それぞれのチューブを転がすことによって穏やかに混合した。
それぞれの治療的ゲルの増殖因子含有量を、Luminex 7plex Angiogenesis Panelキット(パート#893605;ロット#311544)を用いて分析した。50μlの治療的ゲルを、希釈チューブにトリプリケートで分注して、200μlの希釈剤を加えて、そして、サンプルを注意深く混合した。100μlのそれぞれの希釈されたサンプルを、96ウェルアッセイプレートに移した。
スタンダードカクテルを希釈剤で再構成して、キットの説明書のとおりに、検量線を作成するために用いた。100μlのそれぞれのスタンダードを、96ウェルプレートのカラム1および2に移した。
50μlのそれぞれの微粒子のカクテルを5mlの微粒子希釈剤中に懸濁することによって、微粒子懸濁液を調製した。懸濁液を、ボルテックスによって完全に混合して、50μlを96ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、プレートシーラーホイルによって密封して、800rpmで、水平シェーカー上で室温にて2時間インキュベートした。
50μlの各ビオチン−コンジュゲート抗体を、ビオチン抗体希釈剤のバイアルに添加した。20mlの25×ウォッシュバッファー濃縮物を480mlのH2Oに添加することによって、Luminexウォッシュバッファーを調製した。アッセイプレートを、ウォッシュバッファー中で3回洗浄して、50μlの希釈されたビオチン−コンジュゲート抗体を各ウェルに添加した。プレートをホイルで密封して、800rpmで、水平シェーカー上で室温にて1時間インキュベートした。そのあいだに、Luminexマシンのレーザーを温めて、マシンをキャリブレーションした。分析物のパラメーターを、表6に示すように入力した。マシンに関するサンプルテンプレートを設定した。
ストレプアミジン(Strepavidin)−PEを、キットの説明書に従って作製した。プレートを前のとおりに洗浄して、ストレプトアビジン−PEを各ウェルに。プレートをホイルシーラーで覆って、800rpmで、水平シェーカー上で室温にて30分間インキュベートした。プレートを前のとおりに洗浄して、100μlのウォッシュバッファー中にサンプルを再懸濁した。サンプルを、それから、Luminexマシンにロードした。
5パラメーターロジスティック(5−PL)カーブフィットを用いて検量線を作った(図9)。
結果
結果を図10に示す。図10Bは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、bFGF、PDGF−BB、PDGF−AA、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。図10Aは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、SDおよびSEMを要約する。図10Cは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示す。VEGFおよびVEGF−Dは、検出不可能であった。
結果を図10に示す。図10Bは、分析されたそれぞれの治療的ゲルにおける、bFGF、PDGF−BB、PDGF−AA、トロンボスポンジンおよびアンジオポエチンの濃度を示す。図10Aは、サンプルセットにわたって計算された、それぞれの増殖因子に関する、最小、最大、メジアン、平均、SDおよびSEMを要約する。図10Cは、それぞれの増殖因子のメジアン濃度を示す。VEGFおよびVEGF−Dは、検出不可能であった。
図11は、フレッシュおよび2週間保管されたゲルの、増殖因子含有量を比較する。図11Aは、フレッシュおよび2週間保管されたゲルの両方の、メジアン増殖因子濃度を示す。図11Bは、2週間の保管後の、フレッシュな治療的ゲルからの増殖因子の平均損失パーセントを示す。
結論
保管の2週後、PDGF−BBが治療的ゲル中で最も豊富な増殖因子であり、アンジオポエチンが後に続いた。しかしながら、PDGF−BBおよびPDGF−AAを除く全ての増殖因子は、保管の2週後、それらの活性の80%よりも多くを失った。
保管の2週後、PDGF−BBが治療的ゲル中で最も豊富な増殖因子であり、アンジオポエチンが後に続いた。しかしながら、PDGF−BBおよびPDGF−AAを除く全ての増殖因子は、保管の2週後、それらの活性の80%よりも多くを失った。
配列リストの説明
配列番号1は、ヒトbFGFの18kDaアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、ヒトbFGFの22kDaアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、ヒトbFGFの24kDaアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、ヒトbFGF34kDaのアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、ヒトPDGFサブユニットAのアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、ヒトPDGFサブユニットBのアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、ヒトPDGFサブユニットCのアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、ヒトPDGFサブユニットDのアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、ヒトIGF−1アイソフォーム1のアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、ヒトIGF−1アイソフォーム2のアミノ酸配列を示す。
配列番号11は、ヒトIGF−1アイソフォーム3のアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、ヒトIGF−2アイソフォーム1のアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、ヒトIGF−2アイソフォーム2のアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、ヒトVEGF121のアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、ヒトVEGF145のアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、ヒトVEGF165のアミノ酸配列を示す。
配列番号17は、ヒトVEGF165bのアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、ヒトVEGF189のアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、ヒトVEGF206のアミノ酸配列を示す。
配列番号1は、ヒトbFGFの18kDaアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、ヒトbFGFの22kDaアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、ヒトbFGFの24kDaアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、ヒトbFGF34kDaのアイソフォームのアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、ヒトPDGFサブユニットAのアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、ヒトPDGFサブユニットBのアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、ヒトPDGFサブユニットCのアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、ヒトPDGFサブユニットDのアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、ヒトIGF−1アイソフォーム1のアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、ヒトIGF−1アイソフォーム2のアミノ酸配列を示す。
配列番号11は、ヒトIGF−1アイソフォーム3のアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、ヒトIGF−2アイソフォーム1のアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、ヒトIGF−2アイソフォーム2のアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、ヒトVEGF121のアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、ヒトVEGF145のアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、ヒトVEGF165のアミノ酸配列を示す。
配列番号17は、ヒトVEGF165bのアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、ヒトVEGF189のアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、ヒトVEGF206のアミノ酸配列を示す。
Claims (57)
- 組成物であって、
少なくとも1つの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)アイソフォーム、および、少なくとも1つの血小板由来増殖因子(PDGF)アイソフォームを含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームは、単量体または二量体である、
組成物。 - 請求項1または2に記載の組成物であって、
前記bFGFアイソフォームは、ホモ二量体である、
組成物。 - 請求項1または2に記載の組成物であって、
前記bFGFアイソフォームは、ヘテロ二量体である、
組成物。 - 請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の少なくとも1つのbFGFアイソフォームは、18kDa bFGF(配列番号1)またはその変異体、22kDa bFGF(配列番号2)またはその変異体、22.5kDa bFGFまたはその変異体、24kDa bFGF(配列番号3)またはその変異体および34Da bFGF(配列番号4)またはその変異体、の1つである、
組成物。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームは、ホモ二量体である、
組成物。 - 請求項6に記載の組成物であって、
前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームは、2つのPDGF−Aサブユニット(配列番号5)またはその変異体、2つのPDGF Bサブユニット(配列番号6)またはその変異体、2つのPDGF−Cサブユニット(配列番号7)またはその変異体、または2つのPDGF−Dサブユニット(配列番号8)またはその変異体を含む、
組成物。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームは、ヘテロ二量体である、
組成物。 - 請求項8に記載の組成物であって、
前記の少なくとも1つのPDGFアイソフォームは、1つのPDGF−Aサブユニット(配列番号5)またはその変異体、および、1つのPDGF−Bサブユニット(配列番号6)またはその変異体を含む、
組成物。 - 請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記bFGFは、組み換えbFGFであり、および/または、前記PDGFアイソフォームは、組み換えPDGFアイソフォームである、
組成物。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの胎盤増殖因子(PlGF)を含まない、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、アクチビンA、アクチビンC、アクチビンβ、アルテミン、脳由来神経栄養因子(BDNF)、骨形成タンパク質15(BMP−15)、BMP−2、BMP3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−7、BMP−8、β神経成長因子(b−NGF)、ベタセルリン(BTC)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、結合組織増殖因子(CTGF)、Dickkopf関連タンパク質1(Dkk−1)、エンドカン、エオタキシン、エピレグリン、線維芽細胞増殖因子10(FGF−10)、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−23、FGF−4、FGF−6、FGF−8、FGF−9、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、増殖分化因子1(GDF−1)、GDF−11、GDF−15、GDF−3、GDF−5、GDF−8、GDF−9、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、成長ホルモン1(GH−1)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド1(CXCL1)、CXCL2、CXCL3、ヘパリン−結合EGF様増殖因子(HB−EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターフェロンγ(IFNγ)、インスリン様増殖因子1(IGF−1)、IGF−11、インターロイキン10(IL−10)、IL−12、IL−15、IL−1a、IL−1b、IL−1RA、IL−1β、IL−2、IL−2R、IL−5、IL−6、IL−7、インヒビンA、インターフェロンγ−誘導タンパク質10(IP−10)、レフティA、白血病抑制因子(LIF)、単球走化性タンパク質1(MCP−1)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、乳脂肪球−EGF因子8タンパク質(MFG−E8)、MIG、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1a)、MIP−1b、ニュールツリン、腎芽腫過剰発現遺伝子(NOV)、ニューロトロフィン3(NT−3)、NT−4、血小板由来増殖因子C(PDGF−C)、パーセフィン、プログラニュリン、可溶性CD40リガンド(sCD40L)、Skp、Cullin、F−box含有複合体(SCF)、および、可溶性血管細胞接着分子1(sVCAM−1)の少なくとも1つを含まない、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、アンジオポエチン、CXCL4、CXCL7、CXCL12、上皮増殖因子(EGF)、インターロイキン4(IL−4)、IL−8、IL−13、IL−17、インターフェロンα(IFNα)、リポキシンA4(LXA4)、プロテアーゼ−活性化受容体4(PAR4)、ケモカイン(C−Cモチーフリガンド)5(CCL5/RANTES)、血小板由来増殖因子AA(PDGF−AA)、PDGF−AB、形質転換増殖因子β1(TGF−β1)、TGF−β2、トロンボスポンジン、腫瘍壊死因子α(TNFα)および血管内皮増殖因子D(VEGF−D)の少なくとも1つを含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、アンジオポエチン、CXCL4、CXCL7、CXCL12、リポキシンA4(LXA4)、プロテアーゼ−活性化受容体4(PAR4)およびトロンボスポンジンの少なくとも1つを含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルのアンジオポエチンを含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、検出可能なレベルの、bFGFアイソフォーム、PDGF−ABおよびPDGF−BBの少なくとも1つを含む、
組成物。 - 請求項16に記載の組成物であって、
前記組成物は、EGF、TGF−β1、TGF−β2、IGFおよびVEGFのいずれかまたは全てを含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、形質転換増殖因子α(TGF−α)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、TGF−β3およびFGF−7のいずれかまたは全てを含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
bFGFの濃度は、組成物のミリリットルあたり、約50pg〜約500pgの範囲内である、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
PDGFの合計濃度は、組成物のミリリットルあたり、約5000pg〜約25000pgである、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
合計PDGFに対するbFGFの比は、約1:10〜約1:500である、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容できるポリマーをさらに含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、ゲルを含む、
組成物。 - 請求項22または23に記載の組成物であって、
前記ポリマーは、アルギネートポリマー、エチリデンの二重エステルポリマー、ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリペルフルオロオクチルオキシカルボニル−ポリ(乳酸)(PLA−PFO)、または別のブロック共重合体である、
組成物。 - 請求項22または23に記載の組成物であって、
前記ポリマーは、セルロースポリマーである、
組成物。 - 請求項25に記載の組成物であって、
前記セルロースポリマーは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはメチルセルロースである、
組成物。 - 請求項25または26に記載の組成物であって、
前記セルロースポリマーの濃度は、1.5%(w/w)〜4.0%(w/w)であり、前記ポリマーは、450,000〜4,000,000の分子量を有する、
組成物。 - 請求項22から27のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、室温で1000〜500,000mPa・s(cps)の範囲の粘度を有する、
組成物。 - 請求項28に記載の組成物であって、
前記粘度は、室温で50,000〜150,000mPa・s(cps)の範囲である、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
メチルパラベン、プロピルパラベンおよびm−クレゾールからなる群より選択される防腐剤をさらに含む、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、280〜320mOsmol/kgの範囲の浸透圧を有する、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、ゼノフリー(xeno−free)である、
組成物。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記組成物は、1つまたは複数の治療的細胞を含む、
組成物。 - 請求項33に記載の組成物であって、
前記の1つまたは複数の治療的細胞は、1つまたは複数の中胚葉性系列の前駆細胞(PML)、1つまたは複数の免疫調節前駆(IMP)細胞、1つまたは複数の間葉系幹細胞、1つまたは複数の樹状細胞、1つまたは複数の血小板、1つまたは複数の線維芽細胞、1つまたは複数の筋線維芽細胞、またはそれらの組み合わせを含む、
組成物。 - 請求項34に記載の組成物であって、
前記の1つまたは複数のPMLは、(a)検出可能なレベルの、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105およびCD271を発現し、および、(b)検出可能なレベルの、CD14、CD34およびCD45を発現しない、
組成物。 - 請求項35に記載の組成物であって、
前記の1つまたは複数のPMLは、検出可能なレベルの、CD62P(P−セレクチン)および/またはCD62E(E−セレクチン)を発現する、
組成物。 - 請求項34に記載の組成物であって、
前記の1つまたは複数のIMP細胞は、検出可能なレベルの、MIC A/B、CD304(ニューロピリン1)、CD178(FASリガンド)、CD289(Toll様受容体9)、CD363(スフィンゴシン−1−リン酸受容体1)、CD99、CD181(C−X−Cケモカイン受容体タイプ1;CXCR1)、上皮増殖因子受容体(EGF−R)、CXCR2およびCD126を発現する、
組成物。 - 請求項34または37に記載の組成物であって、
前記の1つまたは複数のIMP細胞は、検出可能なレベルの、CD10、CD111、CD267、CD47、CD273、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD55、CD340、CD91、Notch2、CD175s、CD82、CD49b、CD95、CD63、CD245、CD58、CD108、B2−ミクログロブリン、CD155、CD298、CD44、CD49c、CD105、CD166、CD230、HLA−ABC、CD13、CD29、CD49e、CD59、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、CD151およびCD276の1つまたは複数を発現する、
組成物。 - 請求項33、36または37のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記の1つまたは複数のIMP細胞は、
(a)検出可能なレベルの、CD156b、CD61、CD202b、CD130、CD148、CD288、CD337、SSEA−4、CD349、CD140b、CD10、CD111、CD267、CD47、CD273、CD51/CD61、CD49f、CD49d、CD146、CD55、CD340、CD91、Notch2、CD175s、CD82、CD49b、CD95、CD63、CD245、CD58、CD108、B2−ミクログロブリン、CD155、CD298、CD44、CD49c、CD105、CD166、CD230、HLA−ABC、CD13、CD29、CD49e、CD59、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、CD151およびCD276の1つまたは複数;および/または
(b)検出可能なレベルの、CD72、CD133、CD192、CD207、CD144、CD41b、FMC7、CD75、CD3e、CD37、CD158a、CD172b、CD282、CD100、CD94、CD39、CD66b、CD158b、CD40、CD35、CD15、PAC−1、CLIP、CD48、CD278、CD5、CD103、CD209、CD3、CD197、HLA−DM、CD20、CD74、CD87、CD129、CDw329、CD57、CD163、TPBG、CD206、CD243(BD)、CD19、CD8、CD52、CD184、CD107b、CD138、CD7、CD50、HLA−DR、CD158e2、CD64、DCIR、CD45、CLA、CD38、CD45RB、CD34、CD101、CD2、CD41a、CD69、CD136、CD62P、TCRαβ、CD16b、CD1a、ITGB7、CD154、CD70、CDw218a、CD137、CD43、CD27、CD62L、CD30、CD36、CD150、CD66、CD212、CD177、CD142、CD167、CD352、CD42a、CD336、CD244、CD23、CD45RO、CD229、CD200、CD22、CDH6、CD28、CD18、CD21、CD335、CD131、CD32、CD157、CD165、CD107a、CD1b、CD332、CD180、CD65およびCD24の1つまたは複数
を発現する、
組成物。 - 患者における損傷組織を修復する方法であって、
治療的有効量の先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップ、および、
それにより、前記患者における前記損傷組織を治療するステップ、
を含む、方法。 - 請求項40に記載の方法であって、
前記組織は、負傷または疾患によって損傷されている、
方法。 - 患者における老化を阻害する方法であって、
治療的有効量の先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップ、および、
それにより、前記患者における老化組織を治療するステップ、
を含む、
方法。 - 請求項40から42のいずれか一項に記載の方法であって、
前記組織は、中胚葉由来である、
方法。 - 請求項43に記載の方法であって、
前記組織は、腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織である、
方法。 - 請求項44に記載の方法であって、
前記方法は、前記患者における腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の負傷または疾患の治療のためのものである、
方法。 - 請求項44に記載の方法であって、
前記方法は、前記患者における腱、靭帯、心臓、骨、軟骨、肝臓、腎臓、肺組織または膣組織の老化を阻害するためのものである、
方法。 - 請求項45または46に記載の方法であって、
前記方法は、膣萎縮を治療するためのものである、
方法。 - 患者における発毛を促進する方法であって、
治療的有効量の請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与するステップを含む、
方法。 - 請求項40から48のいずれか一項に記載の方法であって、
前記組成物の投与は、組織再生を改善し、および/または、アポトーシスを低減させる、
方法。 - 患者における損傷組織を修復する方法での使用のための、請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法は、治療的有効量の前記組成物を、前記患者に投与するステップを含む、
組成物。 - それを必要とする患者における老化を阻害する方法での使用のための、請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法は、治療的有効量の前記組成物を、前記患者に投与するステップを含む、
組成物。 - 患者における発毛を促進する方法での使用のための、請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記方法は、治療的有効量の前記組成物を、前記患者に投与するステップを含む、
組成物。 - 損傷組織を治療する、または老化を阻害する、または発毛を促進する方法での使用のための、細胞の集団を生産する方法であって、
前記方法は、請求項1から32に定義される組成物の存在下で、単核細胞(MC)、PMLおよび/またはIMPを培養するステップ、および、
前記のMC、PMLおよび/またはIMPの少なくとも一部が増殖するのを可能にするステップ、を含む、
方法。 - 請求項53に記載の方法であって、
前記MCは、末梢血単核細胞(PBMC)である、
方法。 - 請求項53に記載の方法であって、
前記PMLは、請求項35または36に定義される、
方法。 - 請求項53に記載の方法であって、
前記IMPは、請求項37から39に定義される、
方法。 - 請求項53から56のいずれか一項に記載の方法であって、
前記方法は、前記の増殖された細胞を単離するステップをさらに含む、
方法。
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