ES2586295T3 - Los métodos para preparar las células T para la terapia celular - Google Patents

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Abstract

Un método para la activación de células T que comprende: proporcionar un soporte biodegradable, que comprende microesferas o nanoesferas, con un primer material adjunto capaz de reticular segundos materiales, los segundos materiales que son capaces de restos en la superficie de las células T de unión; proporcionar al menos un segundo material unido a restos en la superficie de las células T; mezclando el soporte con el primer material unido con al menos un segundo material unido a restos en la superficie de las células T de modo que el primer material reticula el segundo material y el segundo material entrega una señal a las células T para provocar la activación de las células T; y centrifugación de la mezcla para mejorar la reticulación.

Description

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Los metodos para preparar las celulas T para la terapia celular Descripcion
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0001] Esta invencion se refiere a metodos para la generacion de celulas T con capacidades inmunoestimulantes mejoradas para su uso en protocolos de tratamiento de terapia celular.
[0002] Los metodos de la terapia celular se han desarrollado con el fin de mejorar la respuesta inmune del huesped a los tumores, virus y patogenos bacterianos. Metodos de terapia celular a menudo implican la activacion ex vivo y expansion de celulas T. Ejemplos de este tipo de tratamientos incluyen el uso de celulas de linfocitos de infiltracion de tumores (TIL) (vease la Patente de EE.UU. n° 5.126.132 concedida a Rosenberg), las celulas T citotoxicas (vease Patente de Estados Unidos n° 6.255.073 expedida a Cai, et al.; y la patente de EE.UU. No. 5.846.827 expedida a Celis, et al.), celulas de nodulo linfatico expandidas de drenaje de tumor (ver patente de EE.UU. n° 6.251.385 expedida a Terman), y varias otras preparaciones de linfocitos (vease la Patente de EE.UU. n° 6.194.207, concedida a Bell, et al.; Patente de Estados Unidos n° 5.443.983 expedida a Ochoa, et al.; patente de Estados Unidos n° 6.040.177 expedida a Riddell, et al.; patente de EE.UU. n° 5.766.920 expedida a Babbitt, et al.).
[0003] Para obtener la maxima eficacia de las celulas T en los protocolos de terapia celular, la poblacion de celulas T activada ex vivo debe estar en un estado que puede orquestar al maximo una respuesta inmune al cancer, enfermedades infecciosas, o de otros estados de enfermedad. Para una respuesta eficaz de las celulas T, las celulas T se debe activar. Para la activacion, se requieren al menos dos senales para ser entregados a las celulas T. La primera senal se suministra normalmente a traves del receptor de celulas T (TCR) en la superficie de celulas T. La primera senal de TCR es normalmente activar en la interaccion del TCR con antlgenos peptldicos expresados conjuntamente con un complejo de MHC en la superficie de una celula presentadora de antlgeno (APC). La segunda senal se suministra normalmente a traves de receptores coestimuladores en la superficie de celulas-T. Los receptores coestimuladores son generalmente activados por ligandos correspondientes o citocinas expresadas en la superficie de las APC.
[0004] Debido a la dificultad del mantenimiento de un gran numero de APC natural en los cultivos de celulas T esta preparado para su uso en protocolos de terapia celular, metodos alternativos se han buscado para la activacion ex vivo de las celulas T. Un metodo es de evitar la necesidad de que el complejo de peptido-MHC en APCs naturales estimulando el TCR (primera senal) con activadores policlonales, tales como anticuerpos monoclonales anti-CD3 o anti-CD2 (mAbs) inmovilizados o reticulados o superantlgenos. El agente de coestimulacion mas investigado (segunda senal) se utiliza junto con mAbs anti-CD3 o anti-CD2 ha sido el uso de mAbs anti-CD28 inmovilizados o solubles.
[0005] La combinacion de mAb anti-CD3 (primera senal) y mAb anti-CD28 (segunda senal) inmovilizado sobre un soporte solido tal como microesferas paramagneticas (vease la patente de Estados Unidos n° 6.352.694 expedido a junio, et al.) se ha utilizado como sustituto por APCs naturales para inducir la activacion de celulas T ex vivo en protocolos de terapia celular (Levine, Bernstein et al 1997;. Garlie, LeFever et al. 1999;. Shibuya, Wei et al., 2000). Si bien estos metodos son capaces de alcanzar poblaciones terapeuticamente utiles de celulas T, el uso de microesferas paramagneticas hace que la facilidad de preparacion de celulas T sea menos que ideal. Los problemas incluyen el alto costo de las microesferas, el proceso de uso intensivo de mano de obra para la elimination de las microesferas anteriores a la celda de infusion, y la incapacidad de las microesferas para activar subconjuntos de CD8 de celulas T (Deeths, Kedl et al 1999;. Laux, Khoshnan et al. 2000). Ademas, las poblaciones de celulas T resultantes de este metodo, y otros metodos de la tecnica anterior de estimulacion de celulas T, la falta del tipo de robustez requerida para provocar la estimulacion inmunitaria eficaz cuando se infunde en los pacientes. Como consecuencia, no hay protocolos de terapia celular de la tecnica anterior que se han demostrado significativamente eficaz en entornos cllnicos.
[0006] Esto ha motivado la busqueda de metodos mas eficaces para la activacion de las celulas T para su uso en protocolos de terapia celular. Uno de tales metodos es el uso de llneas de celulas tumorales de APC que han sido modificadas geneticamente para expresar los receptores que unen mAbs. Estos APC modificados pueden ser cargados con mAb anti-CD3 y anti-CD28 (Thomas, Maus et al. 2002) o adicionalmente modificados para expresar el ligando para 4-1 BB (Maus, Thomas et al. 2002) y desupues se usa para activar celulas T para su uso en protocolos de terapia celular. Se encontro que estas APCs modificadas dieron como resultado una activacion mas eficaz de las poblaciones de celulas T que el uso de CD3/CD28 recubierta de microesferas paramagneticas. Sin embargo, el uso de llneas de celulas tumorales manipuladas geneticamente en los protocolos de terapia celular plantea problemas de seguridad que limitan la aplicacion comercial de esta tecnica. Otro metodo para la activacion de celulas T se da a conocer en el documento WO 94/12196 A, en el que las microesferas polimericas estan unidas directamente a anti- CD28 y anticuerpos monoclonales anti-CD3.
SUMARIO DE LA INVENCION
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[0007] En esta situacion, los soportes biodegradables que comprenden microesferas o nanoesferas recubiertas con un primer material que es capaz de reticular el segundo materiales con reactividad a restos en la superficie de las celulas T se utilizan. Los soportes biodegradables recubiertos se mezclan entonces con celulas T segundo material marcado. Las senales entregadas por los segundos materiales reticulados se han mejorado por centrifugacion de la mezcla. Las senales se pueden mejorar aun mas por la cultura de la mezcla a altas densidades celulares.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
[0008] Hay una necesidad de metodos de estimulacion de celulas T mejorados capaces de incrementar la robustez de las celulas T para su uso en protocolos de terapia de celulas que son mas adecuados para su uso en terapia humana.
[0009] Con el fin de mejorar la robustez de las celulas T, tambien es deseable que los metodos de estimulacion mejorados imiten lo mas cercanamente posible los efectos estimulantes de APCs naturales. La mejora en la activacion de celulas T observada con las llneas de CD3/CD28 recubiertas de APC de celulas discutidas anteriormente (Thomas, Maus et al. 2002), se atribuyo a la disponibilidad de ligandos a moleculas co-estimuladoras expresadas de forma natural en la llnea celular de APC que trabajaron en conjunto con la estimulacion CD3/CD28. Estos ligandos incluyen B7-H3, PD-L1, PD-L2 y EL-15.
[0010] Por lo tanto, se desea tener un metodo para la estimulacion de celulas T mejoradas capaces de presentar una multiplicidad de ligandos co-estimuladores sin el requisito para el uso de una llnea celular de tumor.
[0011] APCs naturales, sin embargo, no solo proporcionan multiples estlmulos simultaneos a las celulas T, que proporcionan diferentes conjuntos de multiples estlmulos en diferentes momentos y/o etapas en la respuesta de celulas T a la estimulacion de celulas T. Ningunos metodos de estimulacion de celulas T de tecnica anterior son capaces de imitar este proceso natural.
[0012] La capacidad de imitar este proceso natural proporcionarla un medio para controlar no solo la expansion de las celulas T, sino tambien la diferenciacion de celulas-T. En el proceso de diferenciacion de las celulas T en celulas efectoras o reguladoras, se requieren senales diferentes en diferentes momentos y/o etapas en la respuesta de celulas T a la estimulacion de APC. Por lo tanto, serla deseable ser capaz de crear condiciones ex-vivo que imitan este proceso natural con el fin de proporcionar una mayor variedad de celulas diferenciadas para su uso en la terapia de celulas, incluyendo las celulas que, o bien podrla estimular la inmunidad o suprimir la inmunidad.
[0013] El mantenimiento de los cultivos celulares de alta densidad utilizados en la presente invention requieren un cuidado especial, a la vez que la degradation de los soportes biologicos causa una calda en el pH de los medios y las densidades celulares mas altas producen una rapida acumulacion de productos metabolicos de desecho y el consumo de los nutrientes en el medio de cultivo. Por estas razones, se requieren cambios de los medios por lo menos diariamente y preferiblemente al menos dos veces al dla despues de que las celulas obtengan una densidad celular de mas de 1 millon por ml.
[0014] Cambios de medio frecuentes pueden eliminar las citoquinas endogenas que son importantes para el mantenimiento y el crecimiento de los cultivos de celulas T. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, los medios de cultivo retirados se filtran a traves de una membrana de dialisis con el fin de eliminar los productos de desecho metabolicos, pero retener citoquinas endogenas. Los medios retenidos entonces se suplementan con medios nutritivos frescos y se devuelven al cultivo mixto. Esto permite que las celulas se expongan a un medio nutritivo fresco sin dilution de las citoquinas endogenas.
[0015] A la vez que las celulas T crecen y maduran en los cultivos, diversas matrices de segundos materiales se pueden anadir a los cultivos en cualquier momento segun se requiera y posteriormente se reticulan mezclando con soportes biodegradables recubiertos adicionales. Alternativamente, los segundos materiales se pueden anadir a los soportes biodegradables y los soportes recubiertos se anaden en varias veces a los cultivos. La centrifugacion de la mezcla cada vez despues de anadir el segundo materiales adicionales y soportes biodegradables recubiertos proporciona un beneficio anadido. En realizaciones preferidas, la etapa de centrifugacion se lleva a cabo todos los dlas para coincidir con la etapa de dialisis de medios.
Esferas biodegradables
[0016] Materiales poliesteres alifaticos, tales como poli(acido lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA), se prefieren los copollmeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(caprolactona) (PCL), y polianhldridos para el uso como pollmeros biodegradables para los soportes. Los pollmeros pueden ser formulados como varias formas, tales como laminas, tiras, fibras, geles, nanoesferas o microesferas, y luego recubiertas con un primer material. Las microesferas son una formulation preferida, ya que pueden ser fabricados de forma reproducible en pequenos tamanos de partlculas de microesferas de 1 a 500 micras, preferentemente de 1 a 10 micrometres y lo mas preferiblemente 1 a 5 micras. Las microesferas de este intervalo de tamanos son capaces de inyeccion directa en el cuerpo por metodos convencionales. Se prefiere que las microesferas recubiertas pueden formular para degradarse en medios de cultivo
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o fluidos fisiologicos dentro de los 14 dlas, mas preferiblemente dentro de los 7 dlas, y mas preferiblemente dentro de los 3 dlas. En otros metodos preferidos, nanoesferas se formulan. Estos dispositivos se prefieren en aplicaciones en las que, por ejemplo se requiere la degradacion muy rapida 3 dlas o menos.
[0017] Un primer material preferido para el recubrimiento de las microesferas biodegradables es anticuerpos anti- raton policlonales de cabra (u oveja) policlonal. A modo de ejemplo, este primer material preferente se puede utilizar para los anticuerpos derivados de raton de reticulacion monoclonales, o fragmentos o derivados de ingenierla genetica de los mismos, que tienen especificidad para restos de superficie de celulas T. Asl, por ejemplo, la mezcla de microesferas de cabra anti-raton recubiertas (o nanoesferas), con celulas T humanas marcadas con el raton anti- 003 humano y mAbs 0D28 de raton anti-humano causara la reticulacion de los mAbs de raton en las celulas T humanas a traves de la union del anticuerpo policlonal anti-raton de cabra con los mAbs de raton. La reticulacion de la mAbs causara la activacion y proliferacion de las celulas T. Muchas combinaciones de primeros materiales y segundos materiales se pueden utilizar para lograr el objetivo de los segundos agentes de reticulacion unidos a restos de superficie de las celulas T con el fin de iniciar la transduccion de senales y la activacion de celulas T.
[0018] Las microesferas recubiertas biodegradables (o nanoesferas) utilizadas en la presente invencion proporcionan muchas ventajas para la preparation de las celulas T para su uso en protocolos de terapia celular sobre los metodos de la tecnica anterior donde los agentes mitogenicos se inmovilizan sobre una superficie solida, tal como microesferas paramagneticas:
En primer lugar, al ser los dispositivos biocompatibles y, naturalmente, se degradan en sustancias no toxicas, no hay necesidad de establecer un proceso de elimination de talon.
En segundo lugar, debido a que los dispositivos tienen una baja densidad, pueden ser utilizados con celulas que estan siendo sometidos a una fuerza centrlfuga. Dispositivos de la tecnica anterior, tales como microesferas paramagneticas, causa dano a las celulas cuando se sometieron a centrifugation. La capacidad para centrifugar las celulas con las microesferas permite el uso de la fuerza centrlfuga para mejorar la calidad de las senales proporcionadas a las celulas T por los ligandos estimuladores reticulados en la superficie de las celulas T y tambien proporciona un medio para lavar y procesar las celulas T para la preparacion de la infusion.
En tercer lugar, en un uso de la presente invencion, en lugar de inmovilizar las celulas T de ligandos estimuladores y co-estimuladoras a una superficie solida para presentar senales a las celulas T, el uso de microesferas biodegradables recubiertas (o nanoesferas) permite que los ligandos se apliquen primero a las celulas T y, a continuation las celulas T marcadas se mezclan con las microesferas biodegradables recubiertas (o nanoesferas). De esta manera, las microesferas recubiertas (o nanoesferas) actuan como un agente de reticulacion universal.
En cuarto lugar, como un agente de reticulacion universal, una multiplicidad de ligandos estimuladores y co- estimuladores se puede aplicar a las celulas T y se reticulan por las microesferas recubiertas y la composition de la multiplicidad de ligandos estimuladores y coestimuladores se reticulan se puede variar con el tiempo.
En quinto lugar, la capacidad de variar la composicion de la matriz de senales estimuladoras y coestimuladoras proporcionadas a las celulas T en el tiempo permite la practica de metodos disenados para imitar la presentation natural de la proliferacion de celulas T, la diferenciacion y senales funcionales.
En sexto lugar, la capacidad de imitar la presentacion de senal natural para las celulas T permite el desarrollo de las celulas T con una multitud de caracterlsticas funcionales para su uso en protocolos de terapia celular.
En septimo lugar, la capacidad de controlar la secuencia y la variedad de senales suministradas a las celulas T en el tiempo permite un medio para controlar las vlas de diferenciacion de las celulas T ex vivo. Esto permitira que la experimentation con nuevas combinaciones y secuencia de las senales entregadas a las celulas T. Tales metodos dara lugar a productos de celulas T con nuevas funciones efectoras tanto estimulantes y supresoras para su uso en protocolos de terapia celular.
[0019] Para los fines de la presente invencion, todas las referencias a las celulas T incluye una poblacion de celulas con al menos una parte de las celulas que contienen celulas T. Las celulas T son celulas que expresan TOR, incluyendo TOR a/p y y/S. Las celulas T incluyen todas las celulas que expresan 0D3, incluyendo subconjuntos de celulas T, que tambien expresan 0D4 y 0D8. Las celulas T incluyen incluyen tanto celulas ingenuas y de memoria y celulas efectoras tales como 0TL. Las celulas T tambien incluyen celulas reguladoras como celulas Th1, Tc1, Th2, Tc2, Th3, Treg, y Tr1. Las celulas T tambien incluyen celulas NKT y clases unicas similares del linaje de celulas T.
Transduccion de senales aumentadas
[0020] Un aspecto de la presente invencion proporciona metodos para la estimulacion mejorada de una poblacion de celulas T por la concentration de una mezcla de material de primeras microesferas biodegradables recubiertas (o nanoesferas) y segundas celulas T marcadas de material. 0on el fin de aumentar la eficacia de la senal transducida a las celulas T, es importante tanto para aumentar la cantidad de segundos agentes reticulados y la calidad de la reticulacion.
[0021] 0on el fin de asegurar la mas alta cantidad de segundos materiales que estan asociados con los correspondientes restos de superficie en la superficie de las celulas T, el etiquetado de las celulas T deberla llevarse a cabo con el segundo material en exceso. En una realization preferida en la que mAbs de raton a los antlgenos de superficie de celulas T humanas son los segundos materiales, los mAbs se mezclan preferiblemente con una
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suspension de celulas T mediante el cual las celulas T son a una concentracion de 1 x 106 a 1 x 107 por ml y cada mAb esta a una concentracion de 0,5 m/ml a 10 ml/ml, preferiblemente de 1 ml/ml. Las celulas T marcadas deben mezclarse con las esferas biodegradables recubiertas en una proporcion de al menos una esfera por celula, y preferiblemente en una proporcion de 3 esferas por celula.
[0022] Con el fin de asegurar la mas alta calidad de la reticulacion, las celulas marcadas y las esferas biodegradables recubiertas se mezclan primero a fondo y despues se concentro juntos bajo la fuerza centrlfuga. La centrifugacion preferiblemente se realiza cada 3 dlas, mas preferiblemente al menos una vez al dla. Tambien es preferiblemente que las celulas T se mantuvieron a 4°C desde el momento en que se anaden nuevos mAbs a traves de la terminacion de la centrifugacion. Mantener las celulas a temperatura de refrigeracion evita que la nivelacion y derramamiento de los receptores de superficie de celulas T ligadas antes de ser reticuladas.
Metodos de cultivo celular
[0023] Es preferible mantener transduccion de senales TCR procesiva y sostenida y co-simulacion con el fin de ofrecer las mas robustas celulas T para su uso en protocolos de terapia celular. Por esta razon, los metodos de la presente invencion funcionan mejor cuando se mantienen las celulas T cultivadas en altas densidades de celulas, tales como mayor que 106 celulas/ml, o mas preferiblemente mayor que 107 celulas/ml, o mas preferiblemente mayor que 108 celulas/ml. Las altas densidades de celulas aumentan la interaccion celula:celulas y la interaction con las esferas biodegradables.
[0024] El aumento de la interaccion de celulas:celulas tiene un efecto beneficioso que es independiente del efecto de reticulacion de las esferas biodegradables. El efecto beneficioso proviene de la expresion de los ligandos estimuladores que regulan al alza en la superficie de las celulas T en respuesta a las condiciones maximas de activation. Estos ligandos interaction con los receptores correspondientes en otras celulas T. Por ejemplo, las celulas T expresaran uno o mas de los ligandos co-estimuladores despues de TNFR tales como la LIGHT, CD70, OX40L, 4-1BBL y CD30L despues de la activacion maxima.
[0025] El mantenimiento de las celulas a altas densidades en cultivo con las esferas biodegradables requiere el cambio frecuente de los medios de cultivo. Las altas densidades de celulas dan lugar a una alta tasa de acumulacion de productos metabolicos de desecho y el consumo de los nutrientes disponibles. Ademas, la hidrolisis de las esferas biodegradables hace que el pH del medio de cultivo se convierta en acido. Demasiados medios rapidos de reemplazo, sin embargo, pueden ser perjudiciales para los cultivos en los que no se utilizan citoquinas exogenas. Es preferible no utilizar citoquinas exogenas en el tratamiento de las celulas para su uso en protocolos de terapia celular, como citoquinas exogenas pueden ser toxicas cuando se infunde en los seres humanos y puede hacer que las celulas cultivadas sean dependientes en la presencia de las citoquinas exogenas para la viabilidad. Por lo tanto, los metodos de la presente invencion incluyen una etapa de dialisis en el procesamiento celular.
[0026] La dialisis del medio de cultivo con un tamano de poro de la membrana de 10.000 dalton o menos permitira a la retention de citocinas endogenas, mientras que permite el paso de los desechos metabolicos. En realizaciones preferidas, la mitad del medio de cultivo de un cultivo se retira diariamente y 90% paso a traves de un filtro de dialisis. Los medios pasan a traves del filtro se desecha, mientras que los medios retenidos se alza hasta el volumen original con medio de cultivo fresco.
[0027] De acuerdo con el metodo de la presente invencion, se describe un procedimiento para la production de celulas T con la robustez y la funcion mejoradas para su uso en protocolos de terapia celular que implica: (1) el etiquetado de una poblacion de celulas T con uno o mas agentes que tienen reactividad a restos de la superficie celular; (2) de mezcla de la poblacion de celulas T marcadas con esferas biodegradables recubiertas capaces de reticular los agentes unidos a restos de la superficie celular en las celulas T que causan una senal que se transduce a las celulas T; (3) la concentracion de la mezcla por centrifugacion; (4) la continuation del cultivo de las celulas T en una alta densidad celular; y (5) la elimination de los medios de los cultivos al menos diariamente y la dialisis de los medios para la retencion de las citoquinas endogenas y reemplazo con medio fresco; y (6) la repetition del proceso segun sea necesario con los mismos o diferentes agentes para el etiquetado de las celulas T con el fin de generar tanto las cantidades de celulas T necesarias para la infusion y la funcion optima de las celulas T para el efecto cllnico.
Eleccion de los objetivos ligados de celulas T
[0028] La capacidad de disenar metodos de activacion de celulas T mas eficiente y eficaz, expansion y diferenciacion sera un resultado directo de la selection y el momento de aplicacion de segundos materiales. Segundos materiales son agentes que son capaces de ligar restos de superficie de celulas T y la entrega de una senal a la celula T sobre la reticulacion. Estos materiales son preferiblemente anticuerpos monoclonales, o fracciones o versiones manipuladas geneticamente de los mismos, tales como protelnas de fusion. La seleccion de los segundos materiales sera como resultado de la comprension de la activacion de celulas T, la expansion y el proceso de diferenciacion y los requisitos para el tipo y la duration de las senales en un momento de la vida de las celulas T de contestation.
5
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[0029] Se sabe que al menos dos tipos de receptores necesitan ser contratados para la activacion de celulas T, el TCR y un estimulador de cooperacion (Chambers y Allison 1999). En respuesta al acoplamiento natural de APC con el peptido antigenico y ligandos coestimuladores, el sitio de contacto de la APC y las formas de las celulas T de un "sinapsis inmunologica". La sinapsis se ensambla en las regiones topologicamente y espacialmente distintas. El acoplamiento inicial TCR se produce en la periferia de la sinapsis (Grakoui, Bromley et al. 1999) despues de lo cual el compromiso de ligando de moleculas co-simuladoras tales como CD28, CD2, CD48 y LFA-1 facilita la manipulacion y re-disposiciones de receptores en la sinapsis. El contenido de las moleculas en la sinapsis puede ser enriquecido especlficamente en un subconjunto de protelnas y puede excluir selectivamente protelnas. Este movimiento selectivo de las protelnas se ve facilitado por las estructuras conocidas como "balsas lipldicas".
[0030] Es conocido que la particion de membrana de balsa llpida es crucial para la optima transduccion de senales TCR (Moran y Miceli 1998; Janes, Ley et al., 1999) y co-estimuladores a la serialization TCR causan la formation de sinapsis y la re-organization y agrupacion de balsas de llpidos en la sinapsis. Estos eventos proporcionan un mecanismo natural para la integration de la information espacial y temporal proporcionadas a las celulas T del medio ambiente.
[0031] En consecuencia, el conocimiento de los tipos de receptores disponibles en la sinapsis en respuesta a estlmulos definidos puede proporcionar la informacion para decidir los diversos tipos de co-estimuladores para que se utilice durante un perlodo de tiempo. Las balsas de llpidos funcionan como plataformas para la concentration y la yuxtaposicion de transductores de senales TCR asociados y montaje de un complejo de senalizacion TCR organizada. Por lo tanto, por un proceso de proporcionar primero una matriz definida de senales a una poblacion de celulas T y despues el analisis de las protelnas ensambladas en las balsas de llpidos que fueron inducidas por la primera matriz, un segundo conjunto de posibles senales se puede determinar. El proceso se puede repetir con segundos estimuladores de matriz. Despues de la aplicacion de la segunda matriz, el proceso se puede repetir con una tercera matriz y as! sucesivamente. En cada paso en el proceso, la respuesta de las celulas T se puede controlar con el fin de optimizarse para la funcion deseada, tal como la proliferation, los tipos y las cantidades de la production de citoquinas seleccionadas, la expresion de moleculas efectoras y otras moleculas de superficie funcionales.
[0032] Por ejemplo, tanto CD2 y LFA-1 son protelnas asociadas a balsa que pueden estimular la activacion inicial de celulas T en el ausencia de CD28 (Yashiro-Ohtani, Zhou et al. 2000). Es conocido que el acoplamiento de estas moleculas por regulation al alza y el aumento de la avidez por los receptores de ICAM-1 que despues podrlan ser llamados a ejercer una segunda matriz. Se conoce que el acoplamiento CD2/LFA-1 facilita que la activacion de las celulas T aumente el numero de los TCR que participan en el tiempo, mientras que las funciones de CD28 mediante el aumento de la potencia de los TCR que se participan, reduciendo as! el numero de los TCR que necesitan ser dedicados con el fin de efectuar una respuesta (Bachmann, McKall-Faienza et al. 1997).
[0033] En realizaciones preferidas, una primera matriz incluyendo CD3 y otras moleculas co-estimuladoras seleccionadas de uno o mas de los siguientes: CD2, CD28, cD48, LFA-1, Cd43, CD45, CD4, CD8, CD7, GM1, LIGHT (protelna de fusion HVEM) se utiliza. Un segundo conjunto incluyendo CD3 y uno o mas de los coestimuladores de primer ensayo con las opciones adicionales de los siguientes ligandos inducibles co- estimuladores: CD27, OX40, 4-1BB y CD30.
[0034] Tambien en realizaciones preferidas, los receptores de contador de celulas T a diversas moleculas de adhesion se puede activar durante el proceso. Ejemplos de moleculas de adhesion en las celulas T son: CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina), y CD29/CD49d (VLA-4). Otros agentes de matriz segundos adecuados incluyen agentes no citocinas que se unen a los receptores de citoquinas y entregar una senal cuando se reticula. Ejemplos de este tipo de agentes son mAbs a receptores de citoquinas, incluyendo: IL-2R, IL-4R, IL-10R, Tipo II IFNR1 y R2, Tipo I IFNR, IL-12Rbeta1 y beta2, IL-15R, TNFR1 y TNFR2, y IL-1R tambien cualesquiera agentes capaces de unirse a los receptores de quimiocinas en las celulas T y la entrega de una senal cuando se reticula, incluidos en las categorlas C-C y C-X-C. Los ejemplos de receptores de quimioquinas asociadas con la funcion de las celulas T incluyen CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CXCR3 y
Ejemplo Metodos
[0035] Los ejemplos de procesos optimizados para la produccion de una poblacion de celulas T con una mayor capacidad de estimular el sistema inmunologico siguen. Todos los ejemplos utilizan microesferas biodegradables recubiertas de cabra anti-raton y las celulas T marcadas con mAbs de raton especlficos para los antlgenos de superficie de celulas T:
Ejemplo # 1:
[0036]
Ensamblaje (Dla 0)
5
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(1) coleccion de leucocitos por leucaferesis;
(2) purification de 108 CD4+ T-celulas por selection positiva;
(3) el etiquetado de las celulas CD4+ purificadas con anti-CD3, anti-CD28 y anti-IL-12Rbeta2 mAbs;
(4) mezclar las celulas marcadas con microesferas recubiertas en bolsas permeables de gas (3:1 esfera:celula);
(5) la suspension de la mezcla a una densidad celular de 1 x 106/ml en 100 ml;
(6) la centrifugation de la mezcla a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(7) resuspender suavemente la cultura en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2;
Dla 3
(8) retirar 80 ml de medio de cultivo por aspiration de la jeringa usando un filtro de 0,45 micras a fin de no eliminar cualquier celula;
(9) pasan 70 ml de los medios retirados a traves de un filtro de dialisis de 6.000 Dalton de tamano de corte;
(10) Agregar 70 ml de medio de cultivo fresco a los 10 ml retenidos y anadir de nuevo a la bolsa de cultivo;
(11) anadir 100 pg cada uno de anti-CD3, anti-CD28, anti-IL-12Rbeta2 y anti-de 4-1BB mAbs a la bolsa de cultivo;
(12) mezclar microesferas recubiertas en una relation de esfera:celulas de 1:1;
(13) mezcla centrlfuga a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(14) resuspender suavemente la cultura en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2;
Dla 4
(15) repita los pasos 8-10 Dla 5
(16) repita los pasos 8-10 Dla 6
(17) repita los pasos 8-14
(18) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 7
(19) repita los pasos 8-10
(20) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 8
(21) repita los pasos 8-10
(22) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 9
(23) cosecha la poblacion de celulas T y formula para infusion Resultados
[0037] Este metodo resulta en una poblacion de celulas T con una mayor proliferation y la production de IFN- gamma y TNF-alfa en comparacion con las celulas activadas con microesferas inmunomagneticas revestidas de CD3/CD28 independientemente. N = 6
Metodo
Expansion de pliegue IFN-gamma ng/ml TNF-alfa ng/ml IL-4 pg/ml
Ejemplo #1
830+/-77 970+/-160 180+/-38 < 20
3/28-beads + IL-2
80+/-20 3+/-2,2 0,5+/-.2 80+/-16
Ejemplo # 2
[0038]
Ensamblaje (Dla 0)
(4) coleccion de leucocitos por leucaferesis;
(5) purificacion de 108 CD4 + T-celulas por seleccion positiva;
5
10
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(6) el etiquetado de las celulas CD4+ purificadas con anti-CD3, anti-CD28 mAbs;
(4) mezclar las celulas marcadas con microesferas recubiertas en gas bolsas permeables (3:1 esfera:celula);
(5) la suspension de la mezcla a una densidad celular de 1 x 106/ml en 100 ml;
(6) la centrifugacion de la mezcla a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(7) resuspender y la cultura en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2 con cuidado;
Dla 3
(8) retirar 80 ml de medio de cultivo por aspiracion de la jeringa usando un filtro de 0,45 micras a fin de no eliminar cualquier celula;
(9) pasar 70 ml de los medios retirados a traves de un filtro de dialisis de 6.000 Dalton de tamano de corte;
(15) anadir 70 ml de medio de cultivo fresco a los 10 ml retenidos y anadir de nuevo a la bolsa de cultivo;
(16) anadir 100 mg cada una de anti-CD3 y anti-CD28, anticuerpos monoclonales a la bolsa de cultivo;
(17) mezcla de microesferas en una relacion de esfera:celulas revestida de 1:1;
(18) mezcla se centrifuga a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(19) Resuspender suavemente el cultivo en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2;
Dla 4
(15) repita los pasos 8-10 Dla 5
(16) repita los pasos 8-10 Dla 6
(24) repita los pasos 8-14
(25) despues de 12h repita los pasos 8-10
Dla 7
(26) repita los pasos 8-10
(27) despues de 12h repita los pasos 8-10
Dla 8
(28) repita los pasos 8-10
(29) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 9
(30) cosecha la poblacion de celulas T y formula para infusion Resultados
[0039] Este metodo resulta en una poblacion de celulas T con una mayor proliferacion y la produccion de IFN- gamma y TNF-alfa en comparacion con las celulas activadas con microesferas inmunomagneticas revestidas de CD3/CD28 solo, as! como una mayor expresion de CD40L. N = 6
Metodo
Expansion de pliegue IFN-gamma ng/ml TNF-alfa ng/ml CD40L%
Ejemplo #2
630+/-77 90+/- 16.7 8.8+/-1.3 78.5+/-10
3/28-microesferas + IL-2
80+/-20 3+/-2,2 0,5+/-.2 15+/-16
Ejemplo # 3
[0040]
Ensamblaje (Dla 0)
(7) coleccion de leucocitos por leucaferesis;
(8) purification de 108 CD4+ T-celulas por selection positiva;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(9) el etiquetado de celulas CD4+ purificadas con anti-CD3, anti-CD28 y anti-Hvem mAbs;
(4) mezclar las celulas marcadas con microesferas recubiertas en gas de bolsas permeables (3:1 esfera:celula);
(5) la suspension de la mezcla a una densidad celular de 1 x 106/ml en 100 ml;
(6) la centrifugacion de la mezcla a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(7) resuspender suavemente y el cultivo en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2;
Dla 3
(8) retirar 80 ml de medio de cultivo por aspiracion de la jeringa usando un filtro de 0,45 micras a fin de no eliminar cualquier celula;
(9) pasar 70 ml de los medios retirados a traves de un filtro de dialisis de 6.000 Dalton de tamano de corte;
(20) Agregar 70 ml de medio de cultivo fresco al retenido 10 ml y anadir de nuevo a la bolsa de cultivo;
(21) anadir 100 mg cada una de anti-CD3 y anti-CD28, anti-CD27 y anti-mAbs de 4-1BB a la bolsa de cultivo;
(22) mezcla microesferas revestidas en una relacion celulas:esfera de 1:1;
(23) mezcla se centrifuga a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(24) Resuspender suavemente y el cultivo en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2;
Dla 4
(15) repita los pasos 8-10 Dla 5
(16) repita los pasos 8-10 Dla 6
(31) repita los pasos 8-14
(32) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 7
(33) repita los pasos 8-10
(34) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 8
(35) repita los pasos 8-10
(36) despues de 12h, repita los pasos 8-10
Dla 9
(37) repita los pasos 8-10;
(38) despues de 12h, repita los pasos 8-10;
(39) anadir 100 pg cada una de anti-CD3 y anti-CD28, y HVEM-Fc a la bolsa de cultivo;
(40) mezcla de microesferas revestidas en una relacion de esfera:celulas de 1:1;
(41) mezcla se centrifuga a 500 x g durante 8 min a 4°C;
(42) Resuspender suavemente el cultivo en atmosfera humeda a 37°C con 5% de CO2;
Dla 10
(43) repita los pasos 8-10;
(44) despues de 12h, repita los pasos 8-10;
Dla 11
(45) cosecha la poblacion de celulas T y formula para infusion.
Resultados
[0041] Este metodo resulta en una poblacion de celulas T con una mayor proliferacion y la produccion de IFN- gamma LIGHT y FasL en comparacion con las celulas activadas con microesferas inmunomagneticas revestidas de CD3/CD28 solamente. N = 6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Metodo
Expansion de pliegue IFN-gamma ng/ml LIGHT (%) FasL %
Ejemplo #3
290+/-21 44+/- 6.2 38.4+/-3.3 61.4+/-10
3/28-microesferas + IL-2
80+/-20 3+/-2,2 6.1+/-5 4+/-1.3
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[0042]
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Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para la activacion de celulas T que comprende:
    proporcionar un soporte biodegradable, que comprende microesferas o nanoesferas, con un primer material adjunto capaz de reticular segundos materiales, los segundos materiales que son capaces de restos en la superficie de las celulas T de union; proporcionar al menos un segundo material unido a restos en la superficie de las celulas T; mezclando el soporte con el primer material unido con al menos un segundo material unido a restos en la superficie de las celulas T de modo que el primer material reticula el segundo material y el segundo material entrega una senal a las celulas T para provocar la activacion de las celulas T; y centrifugacion de la mezcla para mejorar la reticulacion.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1 en el que el primer material comprende anticuerpos policlonales.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en el que los segundos materiales incluyen protelnas mitogenicas, anticuerpos monoclonales, protelnas de fusion y agentes capaces de unirse a los receptores de quimiocinas.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3 en el que las protelnas mitogenicas incluyen anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD2.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la adicion de uno o mas segundos materiales en un momento posterior en las celulas T de respuesta para causar una mayor diferenciacion de las celulas T, en el que al menos uno de los segundos materiales anadidos es diferente que al menos uno de los segundos materiales en la etapa de mezcla.
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