CN103525763A

CN103525763A - 一种高效cik细胞的培养方法

Info

Publication number: CN103525763A
Application number: CN201310452805.5A
Authority: CN
Inventors: 徐矫健; 孙威
Original assignee: QINGDAO MAIDI SAISI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: QINGDAO MAIDI SAISI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-28
Filing date: 2013-09-28
Publication date: 2014-01-22

Abstract

本发明目的是提供一种高效的CIK细胞培养方法，本发明所制备出的CIK细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高、对肿瘤细胞的杀伤能力高等特点。本发明的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对PBMC进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对CIK细胞增殖的促进作用；而抗CD28单克隆抗体的使用可以刺激CIK细胞中T细胞亚群的共刺激信号，促进CIK细胞的活化。到目前为止，仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体联合应用于CIK细胞制备的研究报道，本发明首次提供出一种在CIK细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。

Description

一种高效CIK细胞的培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种细胞因子诱导的杀伤细胞（CytokineInduced killer,CIK）的培养，即利用各种细胞因子的组合来刺激外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）获得大量高杀伤活性的杀伤细胞。

背景技术

恶性肿瘤，目前在全世界仍然是尚未攻克的疾病之一，并已经成为中国人口的首要死因，我国每年新增肿瘤患者已经超过280万人。手术、化疗和放疗是肿瘤治疗的常规手段，然而，许多肿瘤患者由于发现不及时，失去了进行手术的机会；化疗和放疗对患者的免疫系统的打击比较大，严重影响到患者的生存质量，另外，许多癌种对放化疗不敏感。因此，越来越需要一种低副作用，广谱性的新型肿瘤治疗手段。

1986年，Rosenberg教授首创过继细胞免疫治疗,体外应用白细胞介素2（Interleukin2,IL-2）活化、扩增并获得具有抗瘤活性的效应细胞，即LAK（Lymphokine Activated Killer,LAK）细胞。使用LAK细胞输注给肿瘤患者能产生一定的肿瘤杀伤活性。

过继细胞免疫治疗技术一经建立，其中细胞培养的方法也在不断改进。CD3AK疗法是在LAK细胞的基础上增加了抗CD3单克隆抗体来刺激肿瘤患者的外周血淋巴细胞，体外在与IL-2的共同作用下产生以CD3⁺CD8⁺T细胞为主的杀伤细胞群。

1991年，斯坦福大学的Schmidt等首先报道细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine Induced-Killer，CIK）。CIK是人外周血单个核细胞在体外经IFN-γ刺激一天，然后用IL-2和抗CD3单克隆抗体等诱导而成的具有杀伤多种肿瘤活性的细胞毒性T细胞。CIK细胞的增殖速度较LAK和CD3AK细胞有很大的提高，具备更强的杀瘤活性。

CIK细胞是目前抗肿瘤过继细胞免疫治疗中最有效的方案之一，也是现在应用最广泛的一种。2013年全球有超过30家的医疗机构在开展CIK相关的正式的临床试验，而我国也已经有大量的医院进行CIK的临床应用。因此，进一步提高CIK培养过程中的细胞增殖能力，以及对肿瘤细胞的杀伤活性，已经成为国内外科研人员的主要目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效CIK的培养方法，即在经传统CIK的基础之上，通过添加层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体的刺激作用，提高CIK细胞的增殖倍数和杀伤活性。

申请人在长期的研究中发现，层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被后的培养瓶在培养CIK细胞时，可以吸附细胞成半贴壁状态，并且极大的提高CIK细胞的增殖速度；而抗CD28单克隆抗体的添加可以有效的激活CIK细胞中T细胞亚群的共刺激信号，促进CIK细胞的活化，提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。申请人将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体三种因子共用引入到传统CIK细胞的培养中，从而促成了本发明。

本发明的CIK细胞的培养方法，包括如下步骤：

1）将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后，加入到细胞培养瓶中包被；

2）将外周血单核细胞PBMC接种到包被后的培养瓶中，在培养液中添加IFN-gamma、IL-2、抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体因子刺激培养细胞；

3）培养到第5天，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养；持续扩大培养至第15天时，完成高效CIK细胞的制备。

本发明步骤2）所述的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/L、氯化钾300mg/L、硫酸镁120mg/L、氯化钠5000mg/L、磷酸二氢钾300mg/L、碳酸氢钙1200mg/L、氨基酸1365mg/L、维生素21.4mg/L、微量元素0.93126mg/L、白蛋白450mg/L、胰岛素8mg/L、亚油酸0.4mg/L、油酸5mg/L、谷胱甘肽2.5mg/L、双甘氨肽mg/L、次黄嘌呤0.8mg/L、硫辛酸0.1mg/L、丙酮酸150mg/L、葡萄糖1500mg/L、胸腺嘧啶0.12mg/L。

其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。

维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。

微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。

为了获得更好的培养效果，在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子（Chlorella Growth Factor，CGF）。

本发明所制备出的CIK细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高、对肿瘤细胞的杀伤能力高等特点。本发明的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对PBMC进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对CIK细胞增殖的促进作用；而抗CD28单克隆抗体的使用可以刺激CIK细胞中T细胞亚群的共刺激信号，促进CIK细胞的活化。到目前为止，仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体联合应用于CIK细胞制备的研究报道，本发明首次提供出一种在CIK细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。

具体实施方法

本发明所用到的材料的描述如下，并给出了具体实施例中材料的出处。本领域的技术人员在本说明书的基础上，可选择不同来源的材料，而不限于本发明的具体记载。

抗CD3单克隆抗体：鼠抗人CD3单克隆抗体，IgG₁，购于安迪生物科技（上海）有限公司；

抗CD28单克隆抗体：鼠抗人CD28单克隆抗体，IgG₁，购于安迪生物科技（上海）有限公司；

K562细胞：人慢性髓细胞性白血病细胞系，购于中科院细胞库；

Raji细胞：人B细胞淋巴瘤细胞系，购于中科院细胞库；

769-P细胞：人肾腺癌细胞系，购于中科院细胞库；

HepG2细胞：人肝细胞癌细胞系，购于中科院细胞库；

小球藻生长因子（Chlorella Growth Factor，CGF）

本发明高效CIK的制备方法的步骤如下：

1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白各100微克，于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置3-5小时。

2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC，生理盐水洗涤2次，用60毫升的培养基重悬，取样计数后，接种到去包被液的培养瓶中。添加60000单位的IFN-gamma，60000单位的IL-2，1200纳克的抗CD3单克隆抗体和1200纳克的抗CD28单克隆抗体。

3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加80000单位的IL-2。

4）扩大培养：隔天添加无血清培养基，并按200单位/毫升的浓度添加IL-2，持续扩大培养。

5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计算CIK细胞的增殖倍数。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实验。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述.

实施例1

1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置4小时。

2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，缓慢加入到已加有15毫升淋巴细胞分离液的离心管中，每管25毫升。2000转/分钟，离心15分钟，取中间的白色PBMC层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数，细胞数为4.8×10⁷个。加细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加60000单位的IFN-gamma，60000单位的IL-2，1200ng的抗CD3单克隆抗体和1200ng的抗CD28单克隆抗体。其中无血清培养基的组份如下：氯化钙40mg/L、氯化钾300mg/L、硫酸镁120mg/L、氯化钠5000mg/L、磷酸二氢钾300mg/L、碳酸氢钙1200mg/L、氨基酸1365mg/L、维生素21.4mg/L、微量元素0.93126mg/L、白蛋白450mg/L、胰岛素8mg/L、亚油酸0.4mg/L、油酸5mg/L、谷胱甘肽2.5mg/L、双甘氨肽mg/L、次黄嘌呤0.8mg/L、硫辛酸0.1mg/L、丙酮酸150mg/L、葡萄糖1500mg/L、胸腺嘧啶0.12mg/L、25mg/L的小球藻生长因子。

上述的培养基是申请人长期优化获得的，在同样的培养时间内，本发明的培养液对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液，细胞增殖速度可以提高约12%，伽马干扰素的分泌量提高7.8%。

4）扩大培养：第7天，添加无血清培养基至800毫升，添加160000单位的IL-2;第9天，添加无血清培养基至1600毫升，添加320000单位的IL-2;第11天，添加无血清培养基至3200毫升，添加640000单位的IL-2;第13天，添加无血清培养基至6400毫升，添加1280000单位的IL-2。

5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计算得细胞总数为1.97×10¹⁰,增殖410倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实验。高效CIK细胞在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P和HepG2细胞系的杀伤分别达到14.1%、18.6%、25.7%、10.6%。

按照上述步骤，重复试验7次，高效CIK细胞增殖倍数的平均值为438倍，在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P和HepG2细胞系的杀伤平均值分别为15.2%、17.9%、26.2%和11.6%。

其中细胞计数方法具体如下：

1、将培养第15天取出的1毫升细胞悬液充分混匀。取出其中的50微升加入到1.5毫升离心管中，添加50微升0.4%的台盼蓝，充分混匀。

2、吸取混合液，滴加到细胞计数板。

3、倒置显微镜下，用手动细胞计数仪，记录细胞计数板上四个大方格中的细胞数。

4、计算细胞数：记录得到的细胞数乘以5000再乘以培养液的总体积，即是培养所得的细胞总数。

5、计算增殖倍数：用培养所得的细胞总数除以细胞接种当天所得的细胞数，即是CIK细胞的增殖倍数。

杀伤试验方法（Promega CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）具体操作如下：

1、取2个96孔细胞培养板，在试验孔和效应细胞自发释放对照孔中加入效应细胞，50μl/孔，细胞浓度为1×10⁵/50μl；

2、分别在试验孔、靶细胞自发释放对照孔和靶细胞最大释放对照孔中加入靶细胞(K562/Raji/769-P/Hep G2/)，50μl/孔，细胞浓度为1×10⁴/50μl；

3、分别在培养基对照孔和体积校正孔中加入培养基，100μl/孔；

4、分别在效应细胞自发释放对照孔、靶细胞自发释放对照孔及靶细胞最大释放对照孔分别再加入培养基，100μl/孔;

以上各孔均设置3个平行样；

5、将96孔细胞培养板在室温，250g，离心4分钟，然后置于37℃5％CO2培养箱中孵育4小时；

6、取出96孔细胞培养板，在靶细胞最大释放对照孔及体积校正孔中分别添加裂解液，10μl/孔；然后置于37℃5％CO2培养箱中孵育45分钟；

7、将96孔细胞培养板在室温，250g，离心4分钟，每孔吸出50μl上清转移至96孔酶标板相应位置；

8、用分析缓冲液溶解底物，在每个待测孔中加入50μl，室温避光放置30分钟；加入反应终止液，50μl/孔，测吸收值OD₄₉₀；计算效应细胞杀伤百分率数值校正：

a)试验孔、靶细胞自发释放孔和效应细胞自发释放孔的吸光度值分别减去培养基对照孔的吸光度值，并计算平均值；

b)靶细胞最大释放孔的吸光度值减去体积校正对照的吸光度值，并计均值。杀伤率计算（使用平均吸光度数值）：

实验例2

1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白80微克，于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置4小时。

2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，缓慢加入到已加有15毫升淋巴细胞分离液的离心管中，每管25毫升。2000转/分钟，离心15分钟，取中间的白色PBMC层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数，细胞数为4.2×10⁷个。加细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加无血清培养基至70毫升，然后添加70000单位的IFN-gamma，70000单位的IL-2，1400纳克的抗CD3单克隆抗体和1400纳克的抗CD28单克隆抗体。无血清培养基的成分与实施例1的一致。

3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加无血清培养基至450毫升，添加90000单位的IL-2。

4）扩大培养：第7天，添加无血清培养基至900毫升，添加180000单位的IL-2;第9天，添加无血清培养基至1800毫升，添加360000单位的IL-2;第11天，添加无血清培养基至3600毫升，添加720000单位的IL-2;第13天，添加无血清培养基至7200毫升，添加1440000单位的IL-2。

5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计算得细胞总数为1.86×10¹⁰,增殖443倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实验。高效CIK细胞在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P和HepG2细胞系的杀伤分别达到17.2%、18.8%、23.5%、11.6%。

实验例3

2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，缓慢加入到已加有15毫升淋巴细胞分离液的离心管中，每管25毫升。2000转/分钟，离心15分钟，取中间的白色PBMC层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数，细胞数为5.3×10⁷个。加细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加无血清培养基至80毫升，然后添加80000单位的IFN-gamma，80000单位的IL-2，1600纳克的抗CD3单克隆抗体和1600纳克的抗CD28单克隆抗体。

3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加无血清培养基至450毫升，添加67500单位的IL-2。

4）扩大培养：第7天，添加无血清培养基至900毫升，添加135000单位的IL-2;第9天，添加无血清培养基至1800毫升，添加270000单位的IL-2;第11天，添加无血清培养基至3600毫升，添加540000单位的IL-2;第13天，添加无血清培养基至7200毫升，添加1080000单位的IL-2。

5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计算得细胞总数为2.47×10¹⁰,增殖466倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实验。高效CIK细胞在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P和HepG2细胞系的杀伤分别达到11.2%、13.8%、21.1%、9.5%。

本发明所制备的高效CIK细胞在培养第15天时，增殖倍数超过400倍，比常规CIK培养方法提高超过400%，并且高效CIK细胞在较低的效靶比条件下，即可对常见的白血病、淋巴瘤、肾癌和肝癌细胞系产生较高的杀伤。

Claims

1.一种CIK细胞的培养方法，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的步骤2）中的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述的氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述的维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。

5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述的微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。

6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的步骤2）中的培养液添加有25mg/L的小球藻生长因子。