CN103966163A - 增强型dcik细胞制备方法及其细胞制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强型DCIK细胞制备方法以及细胞制剂，该方法从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中培养，得到浓度1～3×106/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中培养24h；然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养3～5后控制细胞密度在1～6×106/ml，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型CIK细胞。该增强型DCIK细胞制剂包括增强型DCIK细胞、人血白蛋白、IL-2、氨基酸、维生素和无机盐。DCIK制剂在保存时间上较上述专利中的制剂有显著提高。在室温情况下从6小时提高到36小时。在临床应用中可靠性更高，安全性得到有效保障。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞体外培养领域，具体地指一种增强型DCIK细胞制备方法以及细胞制剂。
背景技术
过继性细胞免疫治疗是指通过输注自身或同种特异性、非特异性抗肿瘤免疫效应细胞，直接杀伤肿瘤细胞或病毒的治疗方法。过继性细胞免疫治疗己进入临床应用，并成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗方法。此类免疫细胞的种类包括了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)等，在众多的免疫细胞中，树突状细胞（DC）作为新一代肿瘤疫苗的研究和应用成为近年来主动免疫治疗研究中的热点。在机体免疫反应中，DC是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原和向T淋巴细胞提呈抗原分子、表达共刺激分子、释放细胞因子和白细胞介素等特性。因此，DC在肿瘤细胞免疫应答中其主要免疫调节作用，是肿瘤主动特异性免疫最重要的免疫辅助细胞。
当DC与CIK共培养时，彼此能够互相作用诱导出比CIK细胞有更强的增殖活性、更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞群。但是这种细胞对恶性细胞的攻击与CIK细胞一样缺乏抗原特异性。当细胞经用肿瘤相关抗原冲击后用肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共培养时，诱导出的效应细胞具有明显的对恶性细胞的特异性攻击的能力，但这种免疫效应细胞扩增能力有限，且TIL来源困难。
与其它免疫细胞相比，DCIK细胞是己知的对肿瘤细胞杀 伤活性最强的效应细胞之一。它是通过多种细胞因子的联合作用，由外周血单个核细胞培养而来的一群异质细胞。DCIK细胞的数量和细胞毒活性直接决定了其在临床治疗中的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种制备增强型DCIK的方法，所述增强型DCIK细胞为经由外周血单个核细胞（PBMC)通过体外诱导、扩增培养成细胞因子诱导的杀伤细胞。
本发明还同时提供了基于此种增强型DCIK细胞的制剂，将该制剂施予单个核细胞来源的人体，达到增强免疫力，治疗肝炎、癌症、感染等疾病的作用。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种增强型DCIK细胞的制备方法，包括以下步骤：
1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×106/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，得到浓度1～3×106/ml的单个核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：100～2000u/ml，PHA的浓度：10ng～50μg/ml，PGE2的浓度：1ng～50μg/ml；
2）然后加入CD3单抗，IL-2和IL-1α，继续培养；其中，CD3单抗的浓度：1ng～20μg/ml，IL-2的浓度：10～10000IU/ml，IL-1α的浓度：1ng～50μg/ml；
3）培养3～5天后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1～6×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：10～10000IU/ml；
4）第7天开始每隔2-3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10～10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg～1mg/L。
进一步地，所述增强型DCIK细胞的浓度：1～6×106-8/ml
再进一步地，包括以下步骤：
1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×106/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，，得到浓度1×106/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：2000IU/ml，PHA的浓度：100ng/ml，PGE2的浓度：500μg/ml；
2）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：20μg/ml，IL-2的浓度：1000IU/ml，IL-1α的浓度：50ng/ml；
3）培养3～5后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：1000IU/ml；
4）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养 第14～21天后，离心收集得到增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为1000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为100μg/L。
本发明还提供了一种增强型DCIK细胞制剂，包括利用增强型DCIK细胞的制备方法得到的增强型DCIK细胞、人血白蛋白、IL-2、氨基酸、维生素和无机盐。进一步地，所述人血白蛋白浓度：1～300g/L、IL-2的浓度：l～9×105～7U/ml、氨基酸浓度：50mg～10g/L、维生素浓度：100ug～50mg/L、无机盐浓度：500mg～10g/L。
再进一步地，所述人血白蛋白浓度：50～200g/L、IL-2的浓度：l～9×105～6U/ml、氨基酸浓度：500mg～5g/L、维生素浓度：1～30mg/L、无机盐浓度：1g～7g/L。
再进一步地，所述人血白蛋白浓度：100g/L、IL-2的浓度：2×106U/ml、氨基酸浓度：3g/L、维生素浓度：15mg/L、无机盐浓度：4g/L。
再进一步地，所述氨基酸为L-精氨酸、L-门冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-门冬酰胺、L-胱氨酸二盐酸盐、甘氨酸、L-羟脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸和L-酪氨酸中任意五种或五种以上；
所述维生素为叶酸、核黄素、生物素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B12和烟酰胺中任意三种或三种以上；
所述无机盐为氯化钠、氯化钾、无水磷酸二氢钠、硝酸钙和碳酸氢钠中任意两种或两种以上。
本发明的有益效果在于：
1、本发明中用PHA替代部分IFN-γ以提高CIK细胞的增值倍数。
IFN-γ会让PBMC发生凋亡，影响了细胞的扩增。而PHA对 PBMC的诱导效果和IFN-γ相同，并且具有高效的促增殖作用，可作为T细胞的强激活剂，促进免疫活性细胞前体向免疫活性细胞转化。
2、用PGE2来增强活化DCIK细胞的效果。
PGE2可以抑制单个核细胞向CD4+CD25+Treg细胞分化。CD4+CD25+Treg细胞能抑制活化的T细胞的免疫功能。
3、使用亚硒酸钠提高DCIK细胞的毒性。
4、临床上应用的DCIK细胞制剂通常是DCIK细胞、人血白蛋白、IL-2和NaCl。整个体系并不适合DCIK细胞保持活力，制剂制备好后必须在6小时内回输到患者体内，否则DCIK细胞活力显著降低，失去治疗作用。本方法采用含有多种氨基酸、无机盐的营养液后，DCIK细胞得到有效保护，在室温放置36小时后，DCIK细胞活力依旧能达到90%
5、本发明的DCIK制剂在保存时间上较上述专利中的制剂有显著提高。在室温情况下从6小时提高到36小时。在临床应用中可靠性更高，安全性得到有效保障。
附图说明：
图1为本发明对肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX杀伤效果图
图中，A为空白对照，B为PEG2处理的DCIK细胞，C为IL-4+GM-CSF处理的DCIK细胞，D为PEG2+IL-4+GM-CSF处理的DCIK细胞，E为亚硒酸钠+PEG2+IL-4+GM-CSF处理的DCIK细胞，图中三个柱子代表1︰5、1︰10和1︰20三种比例。纵坐标代表的是杀伤率(％)。
图2为不同处理条件下细胞的增值情况对比图
图中，A为空白对照，B为PEG2处理的DCIK细胞，C为IL-4+GM-CSF处理的DCIK细胞，D为PEG2+IL-4+GM-CSF处理的DCIK细胞，E为亚硒酸钠+PEG2+IL-4+GM-CSF处理的DCIK细胞。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：
一增强型DCIK细胞的制备方法，包括以下步骤：
1）无菌条件下采集患者抗凝血，1500rpm/min离心6分钟吸取上层血浆，56℃灭活30分钟后离心备用，用与血细胞沉淀体积相同的复方生理盐水稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1︰1.5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心15分钟，小心抽取中间的白细胞层，用复方生理盐水清洗两次，低速离心后得到外周血单个核细胞（PBMC）；
2）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将 其置于无血培养基中调整细胞浓度3×106/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，得到1×106个/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：2000IU/ml，PHA的浓度：100ng/ml，PGE2的浓度：50μg/ml；
3）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：20μg/ml，IL-2的浓度：1000IU/ml，IL-1α的浓度：50ng/ml；IL-4的浓度：100ng/ml；GM-CSF的浓度为2000U/ml；
4）培养3～5后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：1000IU/ml；
5）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到细胞密度为1～6×106个/ml的增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为1000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为100μg/L。
二DCIK细胞的性质检测
1、DCIK细胞的形态学、细胞活力及免疫表型检测
加入PHA、IFN-γ后，大部分细胞仍呈悬浮状态；几天后细胞体积增大，细胞逐渐聚集成团，细胞透亮，胞质丰富；细胞开始大量增殖，细胞形态多样，细胞团明显增多；
取培养13天的细胞100μl，加入100μl0.4%台盼蓝染色液，活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色。本发明制备的细胞活力大于95%。
2、DCIK细胞纯度、增殖力及免疫表型检测
分别取培养7、8、9、10天100μl，浓度约106/ml的细胞，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC抗体10μl，室温环境下，避光孵育30min。之后用PBS洗涤两次，进行流式细胞检测。
本实施例制备的异质细胞群中DCIK细胞扩增近1000倍，CD3+阳性T细胞比率为(91.2±1.95)%，CD3+56+双阳性细胞从最初的(1.9±0.5)%增加到(45.5±3.5)%，CD3+56+细胞在培养第10天达到峰值。
3、DCIK细胞对肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX的杀伤作用检测
96孔板或16孔板内接种肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX并培养24小时，之后按效靶比例1︰5、1︰10和1︰20的比例加入本发明制备的增强型DCIK细胞，共同培养24小时后加入10μl新鲜配制的5mg/ml的MTT，共同培养4hr后，离心吸弃上清液，每孔加入100μl的DMSO振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。
如图1显示本实施例制备的DCIK细胞对肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX的杀伤活性是常规方法制备的细胞的6倍以上，证实IL-2联用PHA、PGE2、亚硒酸钠对增强DCIK细胞的抗肿瘤效应有协同作用。
4、不同处理条件下细胞的增值情况对比
处理步骤和方法如下：
1）将DCIK前期细胞分别置于含有B(500ug/ml PGE2)、C （100ng/ml IL-4、2000IU/ml GM-CSF）、D(500ug/ml PGE2、100ng/ml IL-4、2000IU/ml GM-CSF)、E（亚硒酸钠、500ug/mlPGE2、100ng/ml IL-4、2000IU/ml GM-CSF）的细胞培养液中培养24小时：
2）移至含有20ug/ml CD3单抗的培养瓶中，加入2000IU/mlIFN-γ继续培养，中间进行补液，连续培养至7-14天得到所需的DCIK细胞。
如2显示：用含有D、E的培养液，培养出的细胞量远远高于其他方法培养出的细胞总量。
实施例2
增强型DCIK细胞的制备方法，包括以下步骤：
1）无菌条件下采集患者抗凝血，1500rpm/min离心6分钟吸取上层血浆，56℃灭活30分钟后离心备用，用与血细胞沉淀体积相同的复方生理盐水稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1︰1.5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心15分钟，小心抽取中间的白细胞层，用复方生理盐水清洗两次，低速离心后得到外周血单个核细胞（PBMC）；
2）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×106/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，得到1×106个/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至 培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：100IU/ml，PHA的浓度：50μg/ml，PGE2的浓度：1ng/ml；
3）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：1ng/ml，IL-2的浓度：10IU/ml，IL-1α的浓度：1ng/ml；IL-4的浓度：1ng/ml；GM-CSF的浓度为100U/ml；
4）培养3～5后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：10IU/ml；
5）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到细胞密度为1～6×108个/ml的增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg/L。
实施例3
增强型DCIK细胞的制备方法，包括以下步骤：
1）无菌条件下采集患者抗凝血，1500rpm/min离心6分钟吸取上层血浆，56℃灭活30分钟后离心备用，用与血细胞沉淀体积相同的复方生理盐水稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1︰1.5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心15分钟，小心抽取中间的白细胞层，用复方生理盐水清洗两次，低速离心后得到外周血单个核细胞（PBMC）；
2）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×106/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中 用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，得到1×106个/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：1000IU/ml，PHA的浓度：10ng/ml，PGE2的浓度：20ng/ml；
3）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：100ng/ml，IL-2的浓度：10000IU/ml，IL-1α的浓度：50μg/ml；IL-4的浓度：1μg/ml；GM-CSF的浓度为10000U/ml；
4）培养3～5后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：10000IU/ml；
5）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到细胞密度为1～6×107个/ml的增强型CIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1mg/L。
实施例4
以实施例1的制备增强型DCIK细胞制剂
1、复合营养液的配制见表1
表1
2、增强型DCIK细胞的收集和制剂制备
收集6管培养14天的增强型DCIK细胞，每个管1-2L，1500rmp离心7min，弃上清，收集沉淀。用上述六个实施例制备的复合营养液分别重悬沉淀DCIK细胞，1500rmp离心7min，弃上清，收集沉淀。重复以上步骤一次。收集的DCIK细胞重悬于对应的150ml复方营养液中，由此制得六个增强型DCIK细胞制剂，其标号分别为1、2、3、4、5、6，对应六个实施例制备的复合营养液。
3、增强型DCIK细胞制剂活力检测
将以上所得6个细胞制剂置于室温，采集0、3、6、9、12、24、36、48小时样本，采用台盼蓝拒染法检测细胞活力。用普通DCIK制剂（由本法所得DCIK细胞、20g/L的人血白蛋白、2×105IU/ml的IL-2、9g/L的NaCl组成）做对照。由表2结果显示普通DCIK制剂置于室温6小时后活力显著下降，而本发明所制备的制剂可以保证DCIK细胞在室温放置36小时后，活力依旧保持在90%，是传统制剂的6倍，其中，实施例3的效果最好。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种增强型DCIK细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中调整细胞浓度3×106/ml的单核细胞，转移至培养瓶中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养2-3h后，轻轻吹打使之未贴壁的细胞重悬，并转移至新的培养瓶中用于CIK细胞的培养，原瓶加入含有IL-4和GM-CSF的培养液继续培养，第3天进行半量换液，第5天添加TNF-α诱导细胞成熟，第7天收货成熟的DC细胞加入CIK细胞的培养袋中进行混合培养；用无血清培养基重悬培养DC细胞时余下的细胞，，得到浓度1～3×106/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：100～2000u/ml，PHA的浓度：10ng～50μg/ml，PGE2的浓度：1ng～50μg/ml；
2）然后加入CD3单抗，IL-2和IL-1α，继续培养；其中，CD3单抗的浓度：1ng～20μg/ml，IL-2的浓度：10～10000IU/ml，IL-1α的浓度：1ng～50μg/ml；
3）培养3～5天后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1～6×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：10～10000IU/ml；
4）第7天开始每隔2-3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型DCIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为10～10000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为1μg～1mg/L。
2.根据权利要求1所述的增强型DCIK细胞的制备方法，其特征在于：所述增强型DCIK细胞的浓度：1～6×106-8/ml。
3.根据权利要求2所述的增强型DCIK细胞的制备方法，其特 征在于：包括以下步骤：
1）从采集患者的外周血中分离得到外周血单个核细胞；将其置于无血培养基中培养，得到浓度1×106/ml的核细胞，加入IFN-γ、植物血凝素和PGE2、并转移至培养瓶或培养袋中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h；其中：所述IFN-γ的浓度：2000IU/ml，PHA的浓度：100ng/ml，PGE2的浓度：500μg/ml；
2）然后加入CD3单抗，IL-2，IL-1α，IL-4和GM-CSF，继续培养；CD3单抗的浓度：20μg/ml，IL-2的浓度：1000IU/ml，IL-1α的浓度：50ng/ml；
3）培养3～5后，添加含有IL-2无血清培养基，控制细胞密度在1×106/ml，其中：所述IL-2的浓度：1000IU/ml；
4）第7天开始每隔2～3天对培养的细胞进行计数，并根据细胞浓度添加含有IL-2和亚硒酸钠的无血清培养基，连续培养第14～21天后，离心收集得到增强型DCIK细胞，其中：所述IL-2的浓度为1000IU/ml，亚硒酸钠的浓度为100μg/L。
4.一种增强型DCIK细胞制剂，包括利用权利要求1～3中任意一项所述的增强型DCIK细胞的制备方法得到的增强型DCIK细胞、人血白蛋白、IL-2、氨基酸、维生素和无机盐。
5.根据权利要求4所述的增强型DCIK细胞制剂，其特征在于：所述人血白蛋白浓度：1～300g/L、IL-2的浓度：l～9×105～7U/ml、氨基酸浓度：50mg～10g/L、维生素浓度：100ug～50mg/L、无机盐浓度：500mg～10g/L。
6.根据权利要求4或5所述的增强型DCIK细胞制剂，其特征在于：所述人血白蛋白浓度：50～200g/L、IL-2的浓度：l～9×105～6U/ml、氨基酸浓度：500mg～5g/L、维生素浓度：1～30mg/L、无机盐浓度：1g～7g/L。
7.根据权利要求4或5所述的增强型DCIK细胞制剂，其特征在于：所述人血白蛋白浓度：100g/L、IL-2的浓度：2×106U/ml、氨基酸浓度：3g/L、维生素浓度：15mg/L、无机盐浓度：4g/L。
8.根据权利要求4或5所述的增强型DCIK细胞制剂，其特征在于：所述氨基酸为L-精氨酸、L-门冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-门冬酰胺、L-胱氨酸二盐酸盐、甘氨酸、L-羟脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸和L-酪氨酸中任意五种或五种以上；
所述维生素为叶酸、核黄素、生物素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素B12和烟酰胺中任意三种或三种以上；
所述无机盐为氯化钠、氯化钾、无水磷酸二氢钠、硝酸钙和碳酸氢钠中任意两种或两种以上。
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