CN103372204A - 一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合dc-cik新技术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，利用肿瘤患者自体外周血，在100级GMP厂房分离纯化单核细胞，并在特定的培养条件下一部分单核细胞诱导分化成树突状(DC)细胞，并收集其上清液中的外包体(EXO)，另一部分诱导成细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，同时将DC与CIK共培养。质检合格后分别进行主动和被动免疫肿瘤患者。EXO作为一种新型的非细胞疫苗，安全、有效、稳定和实用，DC-CIK共培养具有协同抗瘤效应、促进DC的共刺激分子表达增加。因此，外包体疫苗联合DC-CIK治疗肿瘤是防止肿瘤复发转移的良好方法。

Description

一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术
技术领域
本发明是利用患者自身的树突状细胞(DC)分泌的外包体、DC细胞和单核细胞制备用于肿瘤治疗的外包体疫苗联合DC及相关细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，本发明涉及基础医学、生物制药和肿瘤治疗科学领域。
背景技术
癌症已成为人类的第一大杀手，据统计，全球每年约有1270万人新发病例，760人死亡，并且逐年增加。临床治疗都以手术、放疗及化疗为主，也取得了相当的治疗效果，使得肿瘤患者的生存率有了很大的提高，生存期也有所延长。但是，肿瘤患者的预后仍然较差，其5年生存率也仅50％左右，主要原因是由于治疗后残留的癌细胞引起的高复发率。近年临床研究和治疗证明，免疫生物治疗能进一步根除手术、化/放疗以及造血干细胞移植后体内残留的肿瘤细胞，减少和预防肿瘤治疗后的复发和转移。免疫生物治疗对延长肿瘤患者的生存期，提高患者的生活质量，具有重要意义。
胞外体(Exosome，EXO)是真核细胞释放的，含有多种细胞膜分子以及相关蛋白的小囊泡。系由细胞内的多泡体(multivesicular bodies，MVBs)膜与细胞膜融合后释放到细胞外环境中囊泡状结构。EXO除了从细胞培养的上清液中分离纯化外，还可从血液以及肿瘤患者的恶性渗出液(如胸水，腹水)中提取。从肿瘤患者胸、腹水分离的EXO携带有相关的肿瘤抗原，并能诱导出相关肿瘤抗原特异性的免疫反应。近年来的基础和临床研究表明，各种细胞包括肿瘤(tumour)细胞和树突状细胞(dendrocyte，DC)所分泌的EXO，负载有肿瘤相关抗原，且表达MHCI和II类抗原以及激发肿瘤特异性免疫应答反应的T细胞共刺激分子。其中，DC来源的胞外体(DC-derived exosomes，DEX)负载的肿瘤相关抗原引起更加强烈的免疫应答。因此，EXO作为一种新型的非细胞疫苗，其理化性质、生物学及免疫学特性方面符合作为疫苗应具备的基本要求：安全、有效、稳定和实用，并且其安全性、免疫原性和耐受性已经得到临床实验证实。
树突状细胞(Dendritic Cells，DC)由Steinman在1973年描述，是体内最活跃、功能最强大的专职抗原提呈细胞。在大多数组织中，DC以不成熟形式存在，在M-CSF、IL-4和TNF-a的作用下，产生成熟的树突状细胞，并能激发静息的T细胞，启动T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。树突状细胞通过下面三条信号转导途径来激活静息T淋巴细胞：DC的MHC分子与胞内加工处理后的抗原肽形成复合体，为激活静息的T淋巴细胞提供第一信号；共刺激分子及黏附分子(如：CD80/CD86)与T淋巴细胞膜表面的配体(如CD28等)结合，提供第二信号；DC合成和分泌一些重要的细胞因子(如IL-12和IFN-a)，提供第三信号。这三条已知的途径共同作用促进了T淋巴细胞的活化。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillers，CIK)是一群CD3+CD56+异质性细胞群，兼具有T细胞强大的抗瘤活性与NK细胞非MHC限制性杀瘤特点。DC-CIK共培养具有协同抗瘤效应，负载肿瘤抗原的DC能显著提升CIK的杀瘤特异性，同时CIK能促进DC的共刺激分子表达增加。DC联合相关细胞因子(M-CSF，IL-4等)诱导单核细胞产生的CIK在抗肿瘤免疫中有重要作用。DC-CIK细胞在抗肿瘤细胞中有互补作用，联合应用临床已经证明取得了协同疗效。
综上所说，主动免疫的外包体肿瘤疫苗联合被动免疫的DC-CIK细胞回输治疗肿瘤患者，具有比传统疗法适用面广、无毒副作用、采血量少、疗效更加明显等优点。尤其是肿瘤病人在手术、化疗和放疗后，运用外包体肿瘤疫苗联合DC-CIK治疗，肿瘤的复发和转移率大大降低，极大地提高了肿瘤患者的生活质量和生存率。
发明内容
本发明是一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术。外包体富含肿瘤相关抗原，作为肿瘤疫苗无毒、安全、可靠有效。利用肿瘤患者的造血干细胞诱导分化成DC，并培养后者收集上清液而获得富含肿瘤抗原的外包体。将肿瘤患者的造血干细胞诱导分化成CIK，并将其与DC共培养，产生更强大的杀伤作用和肿瘤抗原递呈作用。因此，外包体疫苗联合DC-CIK治疗肿瘤是防止肿瘤复发转移的良好方法，大大提供病人的生存质量。
具体实施方式
通过本实施例来具体说明本发明技术，利用患者自身DC分泌外包体制备的疫苗，联合DC及相关细胞因子诱导CIK细胞，回输或注射至病人体内，从而达到阻止肿瘤的复发和转移的目的。本发明操作步序如下：
(1)DC细胞的制备。肿瘤患者采血前检验肝炎(HAV、HBV、HCV、HDV和HEV)及病毒(HIV-1/2、梅毒螺旋体、巨细胞病毒及寄生虫)，同时排除自身免疫性疾病，利用血细胞分离机无菌条件下采集患者自体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclean cells，PBMC)，数量达到2.0X108以上。在GMP100级条件下，收集PBMC一半单核细胞于无血清培养基(含SCF、TPO、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-3、甲基纤维素、Flt3-L)中37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度培养2小时，移去上清液(留用作CIK制备)及去除非贴壁细胞。培养液中添加1000u/ml的rhGM-CSF和500u/ml的rhIL-4诱导DC，三天半量换液并补充营养因子继续培养直到6天，增加另外的细胞因子：IL-1b，IL-6和TNF-a促进DC成熟。培养的第7天收获DC，其数量应达到1X108个细胞以上。台酚蓝染色检测细胞活力应在80％以上，流式细胞仪检测成熟的DC细胞免疫表型：CDIlc，HLA-ABC，HLA-DR，CD40，CD80，CD83和CD86等的表达，苏木素-伊红染色和免疫细胞化学染色观察DC细胞形态及超微结构。
(2)外包体疫苗的制备。收集外周血单个核细胞诱导的DC细胞培养的上清液，低速离心(1000转/分钟)去除悬浮细胞等，然后超速离心浓缩DC分泌的外包体，并进行质检：细菌、真菌、支原体、内毒素。
(3)CIK细胞的制备。在GMP100级条件下，收集PBMC一半单核细胞于无血清培养基(含SCF、TP0、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-3、甲基纤维素、Flt3-L)中培养2小时，收集上清液，一并加入(1)DC细胞的制备获取的上清液，1200转/分钟，完全培养基悬浮细胞沉淀，并加入1000u/ml的IFN-r，放置于37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度培养。24小时后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和500u/ml的rhIL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖，每三天半量换液补充营养因子，第7天收集CIK细胞，数量应在1X109个细胞以上。台酚蓝染色检测细胞活力应在80％以上，流式细胞仪检测细胞免疫表型：HLA-DR，CD3，CD4，CD8，CD45和CD56等的表达，其中CD3+CD56+细胞应达到20％以上。
(4)DC-CIK细胞制备。收集培养第7天的DC细胞(用于外包体疫苗制备的DC细胞)和CIK细胞，按照1∶10比例共培养，继续培养7天。在培养结束前做无菌试验；第14天收集细胞，应达到1X1010个细胞以上。台酚蓝染色检测细胞活力应在80％以上，流式细胞仪检测细胞免疫表型：HLA-ABC，HLA-DR，CD3，CD4，CD8，CDIlc，CD40，CD45，CD56，CD80，CD83和CD86等的表达。在肿瘤患者使用前追加一次污染检测。此外，每批留样检测(同时也用于防止医疗事故的发生等)。
(5)疫苗的接种和细胞移植。外包体疫苗分别在上肢的肩胛骨下淋巴结和下肢大腿内侧淋巴结近处皮下和皮内注射，之后于2周、4周、3个月、半年注射以加强免疫，注射剂量为：1ml负载肿瘤抗原的DC源生外包体液注射在双侧上下肢的近端(腋窝和腹股沟淋巴结处)四个不同点(每个点0.25ml)，皮内注射。DC-CIK静脉回输，细胞数量为：3.0×107/kg/次。

Claims (6)

1.一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，其特征在于：
(1)DC细胞的制备，采集患者外周血并分离单个核细胞诱导分化成DC。
(2)外包体疫苗的制备，利用DC细胞培养的上清液离心获得外包体。
(3)CIK细胞的制备，采集患者外周血并分离单个核细胞诱导分化成CIK。
(4)DC-CIK细胞制备，将制备的DC与CIK共培养以获得DC-CIK。
(5)疫苗的接种和细胞移植，将外包体疫苗和DC-CIK分别注射和输注给患者。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，其特征是：(1)DC细胞的制备。利用血细胞分离机无菌条件下采集患者自体外周血单个核细胞，GMP100级条件下收集PBMC一半单核细胞于无血清培养基(含SCF、TPO、G-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-3、甲基纤维素、Flt3-L)中培养2小时，除去上清液并加完全培养液，添加1000u/ml的rhGM-CSF和500u/ml的rhIL-4诱导DC，6天后添加IL-1b，IL-6和TNF-a促进DC成熟，培养的第7天收获DC，质检(细胞活力、细胞表型及形态)。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，其特征是：(2)外包体疫苗的制备。收集外周血单个核细胞诱导的DC细胞培养的上清液，低速离心(1000转/分钟)去除悬浮细胞等，然后超速离心浓缩DC分泌的外包体，并进行质检(检测细菌、真菌、支原体、内毒素)。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，其特征是：(3)CIK细胞的制备。在GMP100级条件下，收集PBMC单核细胞于无血清培养基培养2小时，其上清液经1200转/分钟离心后用完全培养基悬浮，并加入1000u/ml的IFN-r，培养24小时后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和500u/ml的rhIL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖，第7天收集CIK细胞，用台酚蓝染色检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞免疫表型(CD3+CD56+细胞应达到20％以上)。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，其特征是：(4)DC-CIK细胞制备。收集培养第7天的DC细胞和CIK细胞，按照1∶10比例共培养，继续培养7天。在培养结束前做无菌试验；第14天收集细胞，台酚蓝染色检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞免疫表型。
6.根据权利要求1所述的一种肿瘤治疗用外包体疫苗联合DC-CIK新技术，其特征是：(5)疫苗的接种和细胞移植。外包体疫苗分别在上肢的肩胛骨下淋巴结和下肢大腿内侧淋巴结近处皮内注射，注射剂量为：1ml负载肿瘤抗原的DC源生外包体液注射在双侧上下肢的近端(腋窝和腹股沟淋巴结处)四个不同点(每个点0.25ml)，皮内注射。DC-CIK静脉回输，细胞数量为：3.0×107/kg/次。 
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966163A (zh) * 2014-04-08 2014-08-06 安德生细胞生物（湖北）有限公司 增强型dcik细胞制备方法及其细胞制剂
CN104651307A (zh) * 2013-11-21 2015-05-27 孙勇 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术
WO2015081741A1 (zh) * 2013-12-04 2015-06-11 深圳市合一康生物科技有限公司 免疫细胞制备方法及其制备试剂盒
CN105296425A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法
CN106635984A (zh) * 2016-11-16 2017-05-10 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种人脐带血免疫细胞库的构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1431298A (zh) * 2003-01-30 2003-07-23 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗肿瘤免疫活性细胞－dcik细胞、其制备方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1431298A (zh) * 2003-01-30 2003-07-23 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗肿瘤免疫活性细胞－dcik细胞、其制备方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIGUO HAO等: "Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumour immunity", 《IMMUNOLOGY》, vol. 120, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 90 - 102 *
任亚娜等: "树突状细胞外泌体免疫作用机制的初步研究", 《中国实验血液学杂志》, vol. 16, no. 3, 31 December 2008 (2008-12-31) *
张志伟等: "DC-CIK 细胞临床制备规范化研究", 《中国肿瘤》, vol. 20, no. 2, 31 December 2011 (2011-12-31) *
郝思国等: "Exosome一种新型的潜在的抗肿瘤疫苗", 《细胞与分子免疫学杂志》, vol. 24, no. 3, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 207 - 209 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104651307A (zh) * 2013-11-21 2015-05-27 孙勇 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术
WO2015081741A1 (zh) * 2013-12-04 2015-06-11 深圳市合一康生物科技有限公司 免疫细胞制备方法及其制备试剂盒
CN103966163A (zh) * 2014-04-08 2014-08-06 安德生细胞生物（湖北）有限公司 增强型dcik细胞制备方法及其细胞制剂
CN103966163B (zh) * 2014-04-08 2016-07-06 安德生细胞生物（湖北）有限公司 增强型dcik细胞制备方法及其细胞制剂
CN105296425A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法
CN106635984A (zh) * 2016-11-16 2017-05-10 沈阳细胞治疗工程技术研发中心有限公司 一种人脐带血免疫细胞库的构建方法

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