CN102925412A - 一种制备肿瘤特异性抗原致敏dc的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，该方法利用DC具有的高粘附性，并结合密度梯度离心的方法分离纯化外周血中DC的方法，用于后续的DC培养，并用患者肿瘤制备的特异性抗原致敏活化DC，本发明方法具有如下优点：操作方便，肿瘤抗原易于获取和制备，并且经肿瘤患者自身抗原致敏的DC特异性强、可激发抗肿瘤CTL有效的抗肿瘤免疫，并减小了感染其它外源性疾病的风险，有利于在临床推广应用，用于各类肿瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，是应用无血清培养基将单个核细胞贴壁富集并进而诱导培养为DC的方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresenting cells，APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
人树突状细胞起源于造血干细胞(hemopoieticstemcell)。DC的来源有两条途径：①髓样干细胞在GM-CSF的刺激下分化为DC，称为髓样DC(myeloid dendritic cells，MDC)，也称DCl，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞；包括朗格汉斯细胞(Langerhans cells，LCs)，间皮(或真皮)DCs以及单核细胞衍生的DCs等；②来源于淋巴样干细胞，称为淋巴样DC(Lymophiod dendritic cells，LDC)或浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells，piX；)，即DC2，与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞。树突状细胞(DC)尽管数量不足外周血单核细胞的1％，但其表面具有丰富的抗原递呈分子(MHC-I和MHC-II)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，是功能强大的专职抗原递呈细胞(APC)。DC自身具有免疫刺激能力，是目前发现的惟一能激活未致敏的初始型T细胞的APC。
人体内大部分DC处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟DC具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟DC，而成熟的DC表达高水平的共刺激因子和粘附因子。DC在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与T细胞接触并激发免疫应答。DC作为目前发现的功能最强的APC，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。近年来研究表明，应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，回输或免疫接种于载瘤宿主，可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。
DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。
自从Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell，DC)以来，人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入，认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC，DC的纯化方法包括两大类：(1)物理方法：①根据细胞的黏附性进行分离，有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法，各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞＞DC＝抗体产生细胞＞B细胞＞T细胞；②根据细胞的大小比重进行分离，包括聚蔗糖2泛影葡胺(Ficoll2 Paque)密度梯度离心、Percoll非连续性/连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离；(2)免疫分选：包括淘洗法(Pan2ning)、流式细胞术(fluid cytometry，FCM)、磁性细胞分离术(MACS)等。人外周血中DC含量很少，仅占单个核细胞的0.1％～1.0％。
传统的DC的纯化方法仅根据细胞的黏附性或细胞的大小比重进行DC的分离纯化，虽简便易行，但DC的得率较低；而采用免疫分选法，因DC在体外需与各类试剂和仪器管腔直接接触，存在细胞被污染的隐患、并有内毒素、支原体、衣原体感染的风险，存在一定的安全隐患，造成其在临床的推广应用受到很大的局限。要实现DC在临床的推广应用，必须提高DC细胞在体外纯化的得率，并解决好在纯化和培养过程中减少外源性污染这一安全性问题。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供了一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，该方法结合密度梯度离心和利用DC具高粘附性特点，应用贴壁的方法分离纯化并富集外周血中DC，用于后续的DC培养，并用患者自身肿瘤制备的特异性抗原致敏活化DC，在体外高效、安全地制备抗原致敏DC的方法。该方法克服了传统方法的缺点，使DC治疗的安全性得到保障，用该方法制备抗原致敏DC具有操作方便，肿瘤抗原易于获取和制备，经肿瘤患者自身抗原致敏的DC特异性强、可激发抗肿瘤CTL有效的抗肿瘤免疫的优点，有利于DC在临床推广应用，用于各类肿瘤的治疗。
本发明通过如下技术方案实现本发明目的：
1、患者肿瘤抗原的制备
1)取手术切除的无菌肿瘤组织，用质量百分比浓度为0.05％醋酸洗必泰溶液(溶液能将肿瘤组织完全淹没即可)浸泡20-40分钟；
2)无菌生理盐水冲洗2-4遍；
3)用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，按每克肿瘤组织添加10-15ml的RPMI-1640培养液的比例添加培养液，研磨，经200目钢网过滤单细胞，收集单细胞悬液于Falcon离心管中；
4)用RPMI-1640培养液重悬细胞，并调整细胞悬液浓度为0.5-2.5×107个/ml，细胞悬液经42℃水浴加热1-1.5小时后，60℃水浴继续加热1-1.5小时后，液氮速冻5-15分钟，取出室温融化，重复以上步骤4-6次；
5)300-500g离心15-25分钟后收集上清后，上清经0.22μ孔径的无菌滤器过滤除菌，即得该肿瘤抗原；
6)用BCA法测定蛋白质浓度，用该方法制备的肿瘤抗原，蛋白浓度可达500-2000ug/ml。
2、人外周血树突状细胞的培养
1)人外周血单个核细胞的采集
临床明确诊断为恶性肿瘤，且外周血白细胞在正常范围，不经药物动员即可经临床血细胞分离机上用淋巴细胞采集程序采集患者单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，采集50-100ml的单个核细胞自体血浆悬液，细胞总数为1.0-5.0×109，用于树突状细胞的体外培养；
2)用淋巴细胞分离液分离去除残留红细胞和粒细胞
将收集得到的单个核细胞血浆悬液(50-100ml)缓慢加入数个预加淋巴细胞分离液的Falcon离心管(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，离心管经严格配平后300-500g室温离心20-40分钟；
3)离心后用平口巴氏滴管吸取界面层的单个核细胞，加入到RPMI-1640培养基中，150-250g离心5-15分钟，洗涤2-5遍，收取细胞；
4)将经离心洗涤的单个核细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并调整细胞数为2.0-6.0×106个/ml，将所有细胞悬液转入若干培养瓶中；
5)将盛有细胞的培养瓶置37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养贴壁2-4小时；
6)将培养瓶取出，水平方向轻轻摇晃培养瓶5-10次后，使非贴壁细胞悬起，弃去含非贴壁细胞的培养液，再缓慢往瓶中加入10-20ml RPMI-1640培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞，此时，仍保留在培养瓶中的即为贴壁的DC；
7)往保留贴壁细胞的培养瓶中加入含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、30-100ng/ml重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、和5-25ng/ml重组人白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)的RPMI-1640培养基中，置37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养；
8)培养至第3-4天往培养瓶中补充新鲜的含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、30-100ng/mlrhGM-CSF、5-25ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，继续培养；
9)培养过程中每天观察细胞形态1-3次，在培养的第5-7天，可见细胞变为毛刺状，并聚集成团；
10)终止培养：在培养第7-14天，用10-20ml吸管轻轻吹打贴壁细胞，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，将培养液吸入50ml离心管，100-300g离心5-15分钟，收取细胞，经培养活化后得到的DC数占起始细胞(即PBMC)数的比例为6.0-22.5％(见表1)。
表1：经培养活化后得到的DC数占PBMC的百分比
| 经淋巴细胞分离液分离后得到的PBMC数 | 1.0-5.0×109 |
| 经培养活化后得到的DC数 | 0.8-5.3×108 |
| 获得DC占PBMC的％ | 6.0-22.5％ |
3、树突状细胞的抗原致敏
1)将收取的未致敏的树突状细胞用含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、rhGM-CSF30-100ng/ml、rhIL-45-25ng/ml的RPMI-1640培养基配成浓度为1.0-3.0×106个/ml的细胞悬液，加入制备的肿瘤抗原至终浓度20-100ug/ml，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养6-24小时；
2)用吸管吹打培养瓶使特异性抗体致敏的树突状细胞悬起，用50ml离心管收取经与肿瘤抗原孵育过夜的树突状细胞悬液，100-300g离心5-15分钟，收取细胞；再加入20-60ml无菌生理盐水，100-300g离心5-15分钟洗涤，连续2-5次，收集细胞，即得特异性肿瘤抗原致敏的人树突状细胞(Antigen Pulsed Human Dendritic Cells，APDC)。
4、树突状细胞的免疫表型测定
分别对不同肿瘤类型抗原致敏的树突状细胞进行免疫表型测定，测定的免疫表型包括：CD1a、CD14和HLA-DR。表2显示树突状细胞在抗原致敏前，及分别用人慢性粒细胞白血病细胞系K562或人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa制备的抗原致敏后的免疫表型改变。
表2：DC在抗原致敏前后的免疫表型
| DC表型 | CD14 | CD1a | HLA-DR |
| IM-DC | 1.16±0.19 | 40.65±1.91 | 2.87±0.89 |
| K562-DC | 0.25±0.22 | 41.25±1.48 | 95.65±2.89* |
| Namalwa-DC | 0.378±0.25 | 41.35±0.49 | 92.70±5.79* |
表中IM为未致敏的DC；K562为人慢性粒细胞白血病细胞系；Namalwa为人B细胞淋巴瘤细胞系；*显著性高于未致敏的DC(P＜0.001)
本发明相对于现有技术的优点和技术效果：
(1)本发明结合密度梯度离心和利用DC具高粘附性特点，应用贴壁的方法分离纯化并富集外周血中DC，方法简单易行、操作方便、DC得率较高，并克服了在采用免疫分选法分离纯化外周血DC时，因DC在体外需与各类试剂和仪器管腔直接接触所导致的外源性污染等一些安全隐患，有效的解决了DC在临床推广应用的安全性问题；
(2)本发明用患者自身肿瘤制备肿瘤单细胞悬液，再经反复冻融后获得肿瘤特异性抗原，并将其应用于随后的DC致敏。该方法具有肿瘤抗原易于获取和制备，制得的肿瘤抗原致敏DC操作方便，经肿瘤患者自身抗原致敏的DC特异性强、可激发抗肿瘤CTL有效的抗肿瘤免疫等优点，有利于DC在临床推广应用，用于各类肿瘤的治疗；
(3)经本发明中肿瘤特异性抗原致敏的DC，其免疫表型CD1a和HLA-DR较之肿瘤特异性抗原致敏前显著增高。
附图说明
图1是本发明未经抗原致敏的DC在显微镜下观察示意图，为400倍放大图；
图2是本发明经患者肿瘤特异性抗原致敏的DC在显微镜下观察示意图，为400倍放大图，可见细胞呈毛刺状，具有典型的树突状形态，并聚集成团。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的，均采用常规方法。
实施例1：胃癌术后患者的DC培养
1、临床资料
病例1，男，52岁，胃癌术后2月，为经手术后病理检查确诊病例。
2、主要材料
Hyclone RPMI-1640购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；重组人白细胞介素-4购自上海科肽生物工程有限公司；重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子购自哈药集团生物工程有限公司；流式细胞术标记抗体购自BD公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、培养板均为Corning公司(美国)产品；Forma CO2培养箱(美国)；Nikon倒置显微镜(日本)；细胞培养操作均在达到药品生产质量管理规范(GMP)的细胞操作间进行。
3、患者肿瘤抗原的制备
1)取手术切除的无菌胃肿瘤组织2g，用200ml质量百分比浓度为0.05％醋酸洗必泰溶液于无菌器皿中浸泡20分钟；
2)无菌生理盐水冲洗肿瘤组织2次；
3)用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，按每克肿瘤组织添加10ml的RPMI-1640培养液的比例添加培养液，共添加20ml的RPMI-1640培养液，研磨，经200目钢网过滤单细胞，收集单细胞悬液20ml于50ml Falcon离心管中；
4)加入RPMI-1640培养基液调整细胞悬液浓度至0.5×107个/ml，装入1支50ml Falcon离心管中；
5)细胞悬液经42℃水浴加热1小时后，60℃水浴继续加热1小时；
6)将50ml Falcon离心管迅速浸入液氮速冻，5分钟后取出，于室温融化；
7)重复步骤5)和6)4次；
8)300g离心15分钟，收集上清；
9)上清经0.22μ孔径的无菌滤器过滤除菌后，即得患者肿瘤特异性抗原；
10)用BCA法测定蛋白质浓度为500ug/ml。
4、人外周血树突状细胞的培养
1)单个核细胞的采集
在血细胞分离机上用淋巴细胞采集程序采集患者单个核细胞，即50ml的单个核细胞自体血浆悬液，细胞总数为1.0×109，用于树突状细胞的体外培养；
2)用淋巴细胞分离液分离去除残留红细胞和粒细胞
将收集得到的50ml单个核细胞血浆悬浮液缓慢加入3个预加17ml淋巴细胞分离液的50mlFalcon离心管(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，离心管经严格配平后300g室温离心20分钟；
3)用平口巴氏滴管吸取界面层的单个核细胞，加入到20ml的RPMI-1640培养基中，150离心5分钟，重复该步骤2遍，收集细胞；
4)将经离心洗涤的单个核细胞悬浮于含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并调整细胞数为2.0×106个/ml，按20ml细胞悬液转入一个750ml无菌Falcon培养瓶的比例将所有细胞悬液转入共4个培养瓶中；
5)培养瓶静置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中贴壁培养2小时；
6)取出培养瓶，水平方向轻轻摇晃培养瓶5次后，使非贴壁细胞悬起，弃去含非贴壁细胞的培养基；
7)再次缓缓加入10ml RPMI-1640培养基至培养瓶中，重复步骤6)1次，此时，仍保留在培养瓶中的即为贴壁的DC；
8)往保留有贴壁细胞的培养瓶中每瓶加入20ml含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、30ng/mlrhGM-CSF、5ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，置37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养；
8)培养至第3天，往每个培养瓶中补充10ml新鲜的含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、30ng/ml rhGM-CSF、5ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，继续培养；
9)培养过程中每天观察细胞的形态1次，在培养的第5天，可见细胞为毛刺状，具有典型的树突状形态，并聚集成团(见图1)；
10)终止培养：在培养的第7天，用10ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使部分半贴壁的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，100g离心5分钟，收取细胞，即得到未致敏的树突状细胞。
5、树突状细胞的抗原致敏
1)将收集的未致敏的树突状细胞用含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、30ng/ml rhGM-CSF、5ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基配成浓度为1.0×106个/ml的细胞悬液，加入制备的肿瘤抗原至终浓度20ug/ml，过夜培养6小时，此时可观察到细胞变为毛刺状，具有典型的树突状形态，并聚集成团(见图2)；
2)用10ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使已经过患者肿瘤特异性抗体致敏的树突状细胞悬起，收集细胞悬液于50ml离心管中，100g离心5分钟，收取细胞；
3)再加入20ml无菌生理盐水，100g离心5分钟洗涤，连续2次，收集细胞即为患者肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞(APDC)。
6、树突状细胞的免疫表型测定
1)在培养的第6天收集部分未经肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞，备用；
2)其余未经肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞用含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、30ng/mlrhGM-CSF、5ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基配成浓度为1.0×106个/ml的细胞悬液，加入已制备好的肿瘤抗原至终浓度20ug/ml，过夜培养14小时后收集细胞，此时得到的细胞即为经肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞；
3)对以上两组细胞进行免疫表型测定，测定的免疫表型包括：CD1a、CD14和HLA-DR。其中，imDC为未经肿瘤特异性抗原致敏的DC、mDC为经肿瘤特异性抗原致敏的DC，测定结果见表3，从表中可看出：DC经肿瘤特异性抗原致敏后，DC的免疫表型CD1a和HLA-DR较之肿瘤特异性抗原致敏前显著增高。
表3：培养第7天的树突状细胞免疫表型测定结果
| CD1a+ | CD14+ | HLA-DR+ | |
| imDC | 42.5 | 3.83 | 50.7 |
| mDC | 63.9* | 1.16 | 95.7* |
表中：imDC为未致敏的DC，mDC为致敏的DC；*显著性高于未致敏的DC(P＜0.001)
实施例2：结肠癌术后患者的DC制备方法，具体操作如下：
1、临床资料
病例2，男，62岁，结肠癌术后3月，为经手术后病理检查确诊病例。
2、主要材料
Hyclone RPMI-1640购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；重组人白细胞介素-4购自上海科肽生物工程有限公司；重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子购自哈药集团生物工程有限公司；流式细胞术标记抗体购自BD公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、培养板均为Corning公司(美国)产品。Forma CO2培养箱(美国)；Nikon倒置显微镜(日本)；细胞培养操作均在达到药品生产质量管理规范(GMP)的细胞操作间进行。
3、患者肿瘤抗原的制备
1)取手术切除的无菌结肠癌组织6g，用300ml质量百分比浓度为0.05％醋酸洗必泰溶液于无菌器皿中浸泡30分钟；
2)无菌生理盐水冲洗肿瘤组织3次；
3)用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，按每克肿瘤组织添加12.5ml的RPMI-1640培养液的比例添加培养液，共添加75ml的RPMI-1640培养液，研磨，经200目钢网过滤单细胞，收集单细胞悬液75ml于50ml Falcon离心管中；
4)加入RPMI-1640培养基液调整细胞悬液浓度至1.5×107个/ml，装入2支50ml Falcon离心管中；
5)细胞悬液经42℃水浴加热1.25小时后，60℃水浴继续加热1.25小时；
6)将50ml Falcon离心管迅速浸入液氮速冻，10分钟后取出，于室温融化；
7)重复步骤5)和6)5次；
8)400g离心20分钟，收集上清；
9)上清经0.22μ孔径的无菌滤器过滤除菌后，即得患者肿瘤特异性抗原；
10)用BCA法测定蛋白质浓度为1250ug/ml。
4、患者外周血树突状细胞的培养
1)单个核细胞的采集
在血细胞分离机上用淋巴细胞采集程序采集患者单个核细胞，75ml的单个核细胞自体血浆悬液，细胞总数为3.0×109，用于树突状细胞的体外培养；
2)用淋巴细胞分离液分离去除残留红细胞和粒细胞
将收集得到的75ml单个核细胞血浆悬浮液缓慢加入3个预加25ml淋巴细胞分离液的50mlFalcon离心管(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，离心管经严格配平后400g室温离心30分钟；
3)用平口巴氏滴管吸取界面层的单个核细胞，加入到30ml的RPMI-1640培养基中，200离心10分钟，重复该步骤3遍，收集细胞；
4)将经离心洗涤的单个核细胞悬浮于含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并调整细胞数为4.0×106个/ml，按25ml细胞悬液转入一个750ml无菌Falcon培养瓶的比例将所有细胞悬液转入共4个培养瓶中；
5)培养瓶静置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中贴壁培养3小时；
6)取出培养瓶，水平方向轻轻摇晃培养瓶7次后，使非贴壁细胞悬起，弃去含非贴壁细胞的培养基；
7)再次缓缓加入20ml RPMI-1640培养基至培养瓶中，重复步骤6)1次，此时，仍保留在培养瓶中的即为贴壁的DC；
8)往保留有贴壁细胞的培养瓶中每瓶加入30ml含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清，65ng/mlrhGM-CSF，15ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，置37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养；
8)培养至第3天，往每个培养瓶中补充20ml新鲜的含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、75ng/ml rhGM-CSF、15ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，继续培养；
9)培养过程中每天观察细胞的形态2次，在培养的第6天，可见细胞变为毛刺状，具有典型的树突状形态，并聚集成团；
10)终止培养：在培养的第10天，用10ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使部分半贴壁的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，200g离心10分钟，收取细胞，即得到未致敏的树突状细胞。
5、树突状细胞的抗原致敏
1)将收取的未致敏的树突状细胞用含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、75ng/ml rhGM-CSF、15ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基配成2.0×106/ml的细胞悬液，加入制备的肿瘤抗原至终浓度60ug/ml，过夜培养15小时，此时可观察到细胞变为毛刺状，并聚集成团块状；
2)用10ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使已经过患者肿瘤特异性抗体致敏的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，200g离心10分钟，收取细胞；
3)再加入40ml无菌生理盐水，200g离心10分钟洗涤，连续3次，收集细胞即为患者肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞(APDC)。
6、经肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞的免疫表型测定
方法同实施例1，收集经肿瘤特异性抗原致敏的树突细胞进行免疫表型测定，免疫表型测定结果：CD1a+为69.2％、CD14+为1.02％和HLA-DR+为96.8％。
实施例3：直肠癌术后患者的DC培养
1、临床资料
病例3，女，58岁，直肠癌术后2月，为经手术后病理检查确诊病例。
2、主要材料
Hyclone RPMI-1640购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；重组人白细胞介素-4购自上海科肽生物工程有限公司；重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子购自哈药集团生物工程有限公司；流式细胞术标记抗体购自BD公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、培养板均为Corning公司(美国)产品。Forma CO2培养箱(美国)；Nikon倒置显微镜(日本)；细胞培养操作均在达到药品生产质量管理规范(GMP)的细胞操作间进行。
3、患者肿瘤抗原的制备
1)取手术切除的无菌直肠肿瘤组织10g，用300ml质量百分比浓度为0.05％醋酸洗必泰溶液于无菌器皿中浸泡40分钟；
2)无菌生理盐水冲洗肿瘤组织4次；
3)用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，按每克肿瘤组织添加15ml的RPMI-1640培养液的比例添加培养液，共添加150ml的RPMI-1640培养液，研磨，经200目钢网过滤单细胞，收集单细胞悬液150ml于离心管中；
4)加入RPMI-1640培养基液调整细胞悬液浓度至2.5×107个/ml，装入3支50ml离心管中；
5)细胞悬液经42℃水浴加热1.5小时后，60℃水浴继续加热1.5小时；
6)将50ml Falcon离心管迅速浸入液氮速冻，15分钟后取出，于室温融化；
7)重复步骤5)和6)6次；
8)500g离心25分钟，收集上清；
9)上清经0.22μ孔径的无菌滤器过滤除菌后，即得患者肿瘤特异性抗原；
10)用BCA法测定蛋白质浓度为2000ug/ml。
4、患者外周血树突状细胞的培养
1)单个核细胞的采集
在血细胞分离机上用淋巴细胞采集程序采集患者单个核细胞，100ml的单个核细胞自体血浆悬液，细胞总数为5.0×109，用于树突状细胞的体外培养；
2)用淋巴细胞分离液分离去除残留红细胞和粒细胞
将收集得到的100ml单个核细胞血浆悬浮液缓慢加入4个预加25ml淋巴细胞分离液的50mlFalcon离心管(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，离心管经严格配平后500g室温离心40分钟；
3)用平口巴氏滴管吸取界面细胞，加入到40ml的RPMI-1640培养基中，250离心15分钟，重复该步骤5遍，收集细胞；
4)将经离心洗涤的单个核细胞悬浮于含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并调整细胞数为6.0×106个/ml，按30ml细胞悬液转入一个750ml无菌Falcon培养瓶的比例将所有细胞悬液转入共5个培养瓶中；
5)培养瓶静置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中贴壁培养4小时；
6)取出培养瓶，水平方向轻轻摇晃培养瓶10次后，使非贴壁细胞悬起，弃去含非贴壁细胞的培养基；
7)再次缓缓加入20ml RPMI-1640培养基至培养瓶中，重复步骤6)1次，此时，仍保留在培养瓶中的即为贴壁的DC；
8)往保留有贴壁细胞的培养瓶中每瓶加入40ml含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、100ng/mlrhGM-CSF、25ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，置37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养；
8)培养至第4天，往每个培养瓶中补充30ml新鲜的含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、100ng/ml rhGM-CSF、25ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基，继续培养；
9)培养过程中每天观察细胞的形态3次，在培养的第7天，可见细胞变为毛刺状，并聚集成团；
10)终止培养：在培养的第14天，用20ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使部分半贴壁的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，300g离心15分钟，收取细胞，即得到未致敏的树突状细胞。
5、树突状细胞的抗原致敏
1)将收取的未致敏的树突状细胞用含10％(体积百分比，V/V)胎牛血清、100ng/ml rhGM-CSF、25ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养基配成3.0×106/ml的细胞悬液，加入制备的肿瘤抗原至终浓度100ug/ml，过夜培养24小时，此时可观察到细胞变为毛刺状，具有典型的树突状形态，并聚集成团块状；
2)用20ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使已经过患者肿瘤特异性抗体致敏的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，300g离心15分钟，收取细胞；
3)再加入60ml无菌生理盐水，300g离心15分钟洗涤，连续5次，收集细胞即为患者肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞(APDC)。
6、经肿瘤特异性抗原致敏的树突状细胞的免疫表型测定
方法同实施例1，收集经肿瘤特异性抗原致敏的树突细胞进行免疫表型测定，免疫表型测定结果：CD1a+为72.8％、CD14+为0.87％和HLA-DR+为98.2％。
Claims (2)
1.一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，其特征在于按如下步骤进行：
(1)患者肿瘤抗原的制备：取无菌肿瘤组织，完全浸没于质量百分比浓度为0.05％的醋酸洗必泰溶液中，浸泡20-40分钟后，无菌生理盐水冲洗2-4次后，剪碎，按每克肿瘤组织添加10-15ml的RPMI-1640培养液的比例在肿瘤组织中添加培养液，研磨，过滤单细胞，收集单细胞悬液；
(2)用RPMI-1640培养液调整单细胞悬液浓度为0.5-2.5×107个/ml，细胞悬液经42℃水浴加热1-1.5小时后，60℃水浴继续加热1-1.5小时后，液氮速冻5-15分钟，取出后于室温融化，重复以上步骤4-6次后，300-500g离心15-25分钟，收集上清，上清经无菌滤器过滤除菌后，即得肿瘤抗原，用BCA法测定蛋白质浓度；
(3)在血细胞分离机上采集肿瘤患者单个核细胞血浆悬液50-100ml，悬液中细胞总数为1.0-5.0×109个，将收集到的单个核细胞血浆悬液加入等体积的淋巴细胞分离液中300-500g离心20-40分钟，然后吸取界面层的单个核细胞，加入到RPMI-1640培养基中，150-250g离心5-15分钟，重复离心洗涤2-5遍，收集单个核细胞；
(4)将经离心洗涤的单个核细胞悬浮于含体积百分比10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并调整细胞数为2.0-6.0×106个/ml，将细胞悬液转入无菌培养瓶中，于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中贴壁培养2-4小时后，取出培养瓶，水平方向轻轻摇晃培养瓶5-10次后，弃去含非贴壁细胞的培养液，再次缓缓加入RPMI-1640培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞；
(5)往保留有贴壁细胞的培养瓶中加入含体积百分比10％胎牛血清、30-100ng/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和5-25ng/ml重组人白细胞介素-4的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养，培养至第3-4天，补充新鲜的含体积百分比10％胎牛血清、30-100ng/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和5-25ng/ml重组人白细胞介素-4的RPMI-1640培养基，继续培养，在培养到第7-14天终止培养，用吸管轻轻吹打贴壁细胞，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，收集培养液于离心管中，100-300g离心5-15min，收集细胞，即得到未致敏的DC；
(6)将未致敏的DC重悬于含体积百分比10％胎牛血清、终浓度为30-100ng/ml的rhGM-CSF、终浓度为5-25ng/ml的rhIL-4的RPMI-1640培养基中，调整细胞数为1.0-3.0×106个/ml，加入步骤(1)中制备所得的肿瘤抗原至终浓度20-100ug/ml，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养6-24小时，用吸管吹打培养瓶使特异性抗体致敏的树突状细胞悬起，收集细胞悬液于离心管中，100-300g离心5-15min，收集细胞，然后用无菌生理盐水重悬细胞，100-300g离心5-15min，重复该步骤2-5次，收集细胞，即得到特异性肿瘤抗原致敏的DC。
2.根据权利要求1所述的制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，其特征在于：制备抗原时采用200目网过滤单细胞，采用0.22μ孔径的无菌滤器过滤除菌。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN104693276A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-10 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 一种肿瘤特异性靶标及其制备细胞免疫治疗制剂的应用 |
| CN105316291A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-02-10 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种负载前列腺癌抗原的dc细胞及一种dc细胞肿瘤疫苗 |
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2012
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