CN105861433A - 制备具有高效肿瘤杀伤性cik细胞制剂的方法及制得的cik细胞制剂 - Google Patents
制备具有高效肿瘤杀伤性cik细胞制剂的方法及制得的cik细胞制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105861433A CN105861433A CN201610272170.4A CN201610272170A CN105861433A CN 105861433 A CN105861433 A CN 105861433A CN 201610272170 A CN201610272170 A CN 201610272170A CN 105861433 A CN105861433 A CN 105861433A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- cik
- cell
- cik cell
- lymphocyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 title abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 44
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 13
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 9
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 abstract description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 abstract 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 4
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法及制得的CIK细胞制剂，特别是在体外利用细胞因子高效诱导外周血单个核细胞分化CIK细胞中添加Anti‑CTLA‑4MAb以及Anti‑PD‑1MAb后其肿瘤杀伤活性显著提高。所述提高CIK肿瘤杀伤活性的培养方法包括以下步骤：无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水等体积稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在CIK细胞诱导过程中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN‑γ、IL‑2，培养过程中在适宜的时间点加入Anti‑CTLA‑4MAb以及Anti‑PD‑1MAb，培养13‑16天收获细胞，制备CIK细胞制剂，可以阻断肿瘤细胞的前期CTLA‑4以及后期PD‑1两个免疫抑制途径，从而大大提高了CIK的肿瘤杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，尤其是涉及一种制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法及制得的CIK细胞制剂。
背景技术
CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)又名CD152，是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的CD4+和CD8+T细胞。CTLA-4与其配体B7分子结合后产生抑制性信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA-4的免疫效应可刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。
PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1是近年来发现的负性刺激分子之一，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子大小为55kD，属于CD28型家族，作为抑制分子表达于活化的T细胞和B细胞表面。肿瘤细胞表面表达和分泌细胞程序性死亡配体-1(Programmed Death1 Ligand，PD-L1)，PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，会抑制T、B淋巴细胞的活性，是肿瘤细胞逃避机体免疫的主要原因之一。目前的研究表明PD-L1在多种肿瘤细胞中可呈高表达，其异常表达与患者预后密切相关。
CTLA-4是机体免疫应答过程中T淋巴细胞早期表达的免疫抑制分子，而PD-1是晚期表达的分子，因此两者联合使用可以同时阻断肿瘤免疫的两个通路，从而大大提高CIK细胞的肿瘤杀伤活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法及制得的CIK细胞制剂，通过阻断肿瘤早期的CTLA-4以及晚期的PD-1两种免疫逃逸途径来显著提高CIK细胞的肿瘤杀伤活性。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水等体积稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在CIK细胞诱导过程中，加入CD3 mAb、CD28 mAb、IFN-γ、IL-2，培养过程中加入Anti-CTLA-4MAb以及Anti-PD-1 MAb，培养13-16天收获细胞，制备具有高效肿瘤杀伤活性的CIK细胞制剂。
具体地说，包括以下步骤：
(1)淋巴细胞完全培养基的配置：淋巴细胞基础培养基中含有FBS、IL-2；
(2)采集正常健康人或肿瘤患者外周血，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液将稀释外周血进行单个核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞完全培养基调整浓度至5×105-9×105个/ml，制成PBMC细胞悬液；
(3)将步骤(2)的PBMC细胞悬液转移至预先包被CD3 mAb的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2；
(4)培养第3天，细胞计数，并在培养体系中补加50ml淋巴细胞完全培养基；
(5)培养的第3-4天添加Anti-CTLA-4MAb于培养体系中；
(6)培养第5天，细胞计数，加入100ml淋巴细胞完全培养基；
(7)培养第7天，补加200ml淋巴细胞完全培养基、与步骤(3)中等量CD3 mAb，并添加CD28 mAb；
(8)每隔2天进行细胞计数并补加与培养体系等体积的淋巴细胞完全培养基，在培养的第13-15天加入Anti-PD-1 MAb，孵育培养12-36h后，离心收获CIK细胞。
所述步骤(1)中淋巴细胞完全培养基中FBS的浓度为体积分数2-5％、IL-2的终浓度为300-1000IU/ml。
所述Ficoll淋巴细胞分离液密度为1.077g/ml。
所述步骤(3)及步骤(7)中，CD3 mAb在培养体系中的添加量为5-20ng。
所述步骤(3)中，添加入培养体系中IFN-γ的终浓度为500-1000IU/ml。
所述步骤(5)中，所述培养体系中Anti-CTLA-4MAb添加量为5-30ug。
所述步骤(7)中，CD28 mAb添加量为30-100ng。
所述步骤(8)中Anti-PD-1 MAb添加量为5-30ug。
上述的方法制备的CIK细胞制剂。
本发明的有益效果是：在高效肿瘤杀伤性CIK细胞诱导过程中，加入CD3单克隆抗体(CD3 mAb)、CD28单克隆抗体(CD28 mAb)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)，培养过程中在适宜的时间点加入Anti-CTLA-4MAb以及Anti-PD-1 MAb，培养13-16天收获细胞制备CIK细胞制剂。本发明提供的培养方法可以显著提高CIK的肿瘤杀伤活性。
附图说明
图1为诱导培养第7天细胞生长情况图。
图2为细胞诱导扩增生长曲线。
图3为第16天回收细胞的流式检测结果图。
图4为K562细胞杀伤实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水等体积稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在CIK细胞诱导过程中，加入CD3 mAb、CD28 mAb、IFN-γ、IL-2，培养过程中加入Anti-CTLA-4MAb以及Anti-PD-1 MAb，培养13-16天收获细胞，制备具有高效肿瘤杀伤活性的CIK细胞制剂。
具体地说，包括以下步骤：
(1)淋巴细胞完全培养基的配置：淋巴细胞基础培养基中含有FBS、IL-2；
(2)采集正常健康人或肿瘤患者外周血，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液将稀释外周血进行单个核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞完全培养基调整浓度至5×105-9×105个/ml，制成PBMC细胞悬液；
(3)将步骤(2)的PBMC细胞悬液转移至预先包被CD3 mAb的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2；
(4)培养第3天，细胞计数，并在培养体系中补加50ml淋巴细胞完全培养基；
(5)培养的第3-4天添加Anti-CTLA-4MAb于培养体系中；
(6)培养第5天，细胞计数，加入100ml淋巴细胞完全培养基；
(7)培养第7天，补加200ml淋巴细胞完全培养基、与步骤(3)中等量CD3 mAb，并添加CD28 mAb；
(8)每隔2天进行细胞计数并补加与培养体系等体积的淋巴细胞完全培养基，在培养的第13-15天加入Anti-PD-1 MAb，孵育培养12-36h后，离心收获CIK细胞。
所述步骤(1)中淋巴细胞完全培养基中FBS的浓度为体积分数2-5％、IL-2的终浓度为300-1000IU/ml；
所述Ficoll淋巴细胞分离液密度为1.077g/ml。
所述步骤(3)及步骤(7)中，CD3 mAb在培养体系中的添加量为5-20ng。
所述步骤(3)中，添加入培养体系中IFN-γ的终浓度为500-1000IU/ml。
所述步骤(5)中，所述培养体系中Anti-CTLA-4MAb添加量为5-30ug。
所述步骤(7)中，CD28 mAb添加量为30-100ng。
所述步骤(8)中Anti-PD-1 MAb添加量为5-30ug。
上述的方法制备的CIK细胞制剂。
所述培养第7天开始将细胞培养液转移至培养袋中进行扩大培养。
实施例1
无菌采集外周血100ml，在洁净室进行PBMC的分离和CIK的体外培养。
PBMC分离：
●将外周血与生理盐水等体积混合，室温放置5分钟。
●取200ul用血细胞计数仪计数。
●80ml Ficoll离心分离PBMC。
●离心参数：500g、19度、20分钟。
●取白膜。
●加入生理盐水至总体积100ml，洗涤两次。
●离心参数：300g、19度、5分钟。
●使用移液管或者真空吸液泵移除上清液，不可倾倒。上清液余量在细胞沉淀上0.5-1cm处。
●细胞重悬到10ml淋巴细胞完全培养基中。
●利用细胞计数仪进行细胞计数。
●计算细胞得率。
CIK诱导培养：
●分离的PBMC计数后，按5×105个/ml密度接种。
●将细胞加入CD3 mAb(10ng)包被的T175培养瓶中。
●补充淋巴细胞完全培养基至100ml，加入IFN-γ(500IU/ml)。
●第3天，细胞计数，加入IL-2(500IU/ml)。
●培养的第3天添加5ugAnti-CTLA-4MAb于培养体系中；
●第5天，细胞计数，加入100ml淋巴细胞完全培养基、IL-2(300IU/ml)。
●第7天(图1)，细胞计数，将细胞悬液移入细胞培养袋，加入200ml淋巴细胞完全培养基、CD3 mAb(10ng)、CD28 mAb(30ng)。
●培养的第3天添加5ugAnti-CTLA-4MAb于培养体系中；
●每隔2天补加与原培养体系同等体积的淋巴细胞完全培养基。
●第13天加入5ugAnti-PD-1 MAb，孵育培养36h。
●第16天，细胞计数(共获得4.32*109)绘制生长曲线(图2)，并通过流式检测细胞表面抗原表达情况(图3)。
注：每种因子后面括号内数值表示各因子在培养体系中的终浓度。
CIK细胞对肿瘤细胞(K562细胞系)的体外杀伤率(以样品1为例)
●将两组CIK细胞与靶细胞(Hela细胞)，按5︰1、10︰1、20︰1、30︰1比例加入96孔培养板，同时设靶细胞组、效应细胞组和空白组，每组设3个平行孔，置于37℃，5％CO2，培养箱培养
●12h后，每孔取出100μl上清，再加入20μl 5mg/mL MTT，继续孵育4h，再加入100μl 0.04mol/L HCl酸化异丙醇
●在酶联免疫检测仪上选择570nm波长测各孔OD值，取3个平每孔加入分析纯DMSO 150μl，振荡溶解5min。
●平行孔平均OD值计算结果：
杀伤活性(％)＝1－(实验组OD值一效应组OD值/靶细胞组OD值)×100％。
当效靶比为30︰1时对肿瘤细胞的杀伤率可达到81.37％(图4)。
实施例2
无菌采集外周血100ml，在洁净室进行PBMC的分离和CIK的体外培养。
PBMC分离：
●将外周血与生理盐水等体积混合，室温放置5分钟。
●取200ul用血细胞计数仪计数。
●80ml Ficoll离心分离PBMC。
●离心参数：500g、19度、20分钟。
●取白膜。
●加入生理盐水至总体积100ml，洗涤两次。
●离心参数：300g、19度、5分钟。
●使用移液管或者真空吸液泵移除上清液，不可倾倒。上清液余量在细胞沉淀上0.5-1cm处。
●细胞重悬到10ml淋巴细胞完全培养基中。
●利用细胞计数仪进行细胞计数。
计算细胞得率。
CIK诱导培养：
●分离的PBMC计数后，按7×105个/ml密度接种。
●将细胞加入CD3 mAb(20ng)包被的T175培养瓶中。
●补充淋巴细胞完全培养基至100ml，加入IFN-γ(700IU/ml)。
●第3天，细胞计数，加入IL-2(700IU/ml)。
●培养的第4天添加15ugAnti-CTLA-4MAb于培养体系中；
●第5天，细胞计数，加入100ml淋巴细胞完全培养基。
●第7天，细胞计数，将细胞悬液移入细胞培养袋，加入200ml淋巴细胞完全培养基、CD3 mAb(20ng)、CD28 mAb(70ng)。
●每隔2天补加与原培养体系同等体积的淋巴细胞完全培养基。
●第14天加入15ugAnti-PD-1 MAb，孵育培养24h。
●第16天，细胞计数，收获细胞(共获得4.48*109)。
备注：每种因子后面括号内数值表示各因子在培养体系中的终浓度。
实施例3
无菌采集外周血100ml，在洁净室进行PBMC的分离和CIK的体外培养。
PBMC分离：
●将外周血与生理盐水等体积混合，室温放置5分钟。
●取200ul用血细胞计数仪计数。
●80ml Ficoll离心分离PBMC。
●离心参数：500g、19度、20分钟。
●取白膜。
●加入生理盐水至总体积100ml，洗涤两次。
●离心参数：300g、19度、5分钟。
●使用移液管或者真空吸液泵移除上清液，不可倾倒。上清液余量在细胞沉淀上0.5-1cm处。
●细胞重悬到10ml淋巴细胞完全培养基中。
●利用细胞计数仪进行细胞计数。
计算细胞得率。
CIK诱导培养：
●分离的PBMC计数后，按9×105个/ml密度接种。
●将细胞加入CD3 mAb(5ng)包被的T175培养瓶中。
●补充淋巴细胞完全培养基至100ml，加入FN-γ(1000IU/ml)。
●第3天，细胞计数，加入IL-2(1000IU/ml)。
●培养的第3天添加30ugAnti-CTLA-4MAb于培养体系中；
●第5天，细胞计数，加入100ml淋巴细胞完全培养基。
●第7天，细胞计数，将细胞悬液移入细胞培养袋，加入200ml淋巴细胞完全培养基、CD3 mAb(5ng)、CD28 mAb(100ng)。
●每隔2天补加与原培养体系同等体积的淋巴细胞完全培养基。
●第15天加入30ugAnti-PD-1 MAb。
●孵育培养12h，细胞计数，收获细胞(共获得4.62*109)。
备注：每种因子后面括号内数值表示各因子在培养体系中的终浓度。
本发明在此基础上添加Anti-CTLA-4MAb和Anti-PD-1 MAb，两者联合使用可以同时阻断肿瘤免疫前期的CTLA-4以及后期的PD-1的两个肿瘤免疫通路，从而大大提高CIK细胞的肿瘤杀伤活性。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种制备具有高效肿瘤杀伤活性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水等体积稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在CIK细胞诱导过程中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2，培养过程中加入Anti-CTLA-4MAb以及Anti-PD-1MAb，培养13-16天收获细胞，制备具有高效肿瘤杀伤活性的CIK细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的制备具有高效肿瘤杀伤活性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)淋巴细胞完全培养基的配置：淋巴细胞基础培养基中含有FBS、IL-2；
(2)采集正常健康人或肿瘤患者外周血，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液将稀释外周血进行单个核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞完全培养基调整浓度至5×105-9×105个/ml，制成PBMC细胞悬液；
(3)将步骤(2)的PBMC细胞悬液转移至预先包被CD3mAb的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2；
(4)培养第3天，细胞计数，并在培养体系中补加50ml淋巴细胞完全培养基；
(5)培养的第3-4天添加Anti-CTLA-4MAb于培养体系中；
(6)培养第5天，细胞计数，加入100ml淋巴细胞完全培养基；
(7)培养第7天，补加200ml淋巴细胞完全培养基、与步骤(3)中等量CD3mAb，并添加CD28mAb；
(8)每隔2天进行细胞计数并补加与培养体系等体积的淋巴细胞完全培养基，在培养的第13-15天加入Anti-PD-1MAb，孵育培养12-36h后，离心收获CIK细胞。
3.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中淋巴细胞完全培养基中FBS的浓度为体积分数2-5％、IL-2的终浓度为300-1000IU/ml。
4.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤性的CIK的方法，其特征在于，所述Ficoll淋巴细胞分离液密度为1.077g/ml。
5.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)及步骤(7)中，CD3mAb在培养体系中的添加量为5-20ng。
6.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤活性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，添加入培养体系中IFN-γ的终浓度为500-1000IU/ml。
7.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述培养体系中Anti-CTLA-4MAb添加量为5-30ug。
8.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，CD28mAb添加量为30-100ng。
9.根据权利要求2所述的制备具有高效肿瘤杀伤性CIK细胞制剂的方法，其特征在于，所述步骤(8)中Anti-PD-1MAb添加量为5-30ug。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备的CIK细胞制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610272170.4A CN105861433A (zh) | 2016-04-27 | 2016-04-27 | 制备具有高效肿瘤杀伤性cik细胞制剂的方法及制得的cik细胞制剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610272170.4A CN105861433A (zh) | 2016-04-27 | 2016-04-27 | 制备具有高效肿瘤杀伤性cik细胞制剂的方法及制得的cik细胞制剂 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105861433A true CN105861433A (zh) | 2016-08-17 |
Family
ID=56629326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610272170.4A Pending CN105861433A (zh) | 2016-04-27 | 2016-04-27 | 制备具有高效肿瘤杀伤性cik细胞制剂的方法及制得的cik细胞制剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105861433A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106177931A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-12-07 | 河北利同康生物科技有限公司 | 免疫检测点双阻断ctl高效率杀伤细胞制剂的制备方法 |
| CN106350488A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-01-25 | 大连大学 | 用于治疗肿瘤的pd‑1封闭cik的制备方法 |
| CN106729705A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-31 | 河南省华隆生物技术有限公司 | 一种药物组合物及其应用 |
| CN110452870A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-11-15 | 河南省肿瘤医院 | 一种肿瘤特异性t细胞的分离培养方法及由其获得的产品 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104357394A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-18 | 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞dc-cik的培养方法 |
| CN104371974A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-25 | 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 |
| CN105087487A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-11-25 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 一种高效扩增cik的方法 |
-
2016
- 2016-04-27 CN CN201610272170.4A patent/CN105861433A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104357394A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-18 | 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞dc-cik的培养方法 |
| CN104371974A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-25 | 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 |
| CN105087487A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-11-25 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 一种高效扩增cik的方法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106177931A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-12-07 | 河北利同康生物科技有限公司 | 免疫检测点双阻断ctl高效率杀伤细胞制剂的制备方法 |
| CN106177931B (zh) * | 2016-08-25 | 2018-02-02 | 河北浓孚雨生物科技有限公司 | 免疫检测点双阻断ctl高效率杀伤细胞制剂的制备方法 |
| CN106350488A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-01-25 | 大连大学 | 用于治疗肿瘤的pd‑1封闭cik的制备方法 |
| CN106350488B (zh) * | 2016-09-19 | 2019-09-27 | 大连大学 | 用于治疗肿瘤的pd-1封闭cik的制备方法 |
| CN106729705A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-31 | 河南省华隆生物技术有限公司 | 一种药物组合物及其应用 |
| CN106729705B (zh) * | 2017-01-23 | 2018-04-06 | 河南省华隆生物技术有限公司 | 一种药物组合物及其应用 |
| CN110452870A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-11-15 | 河南省肿瘤医院 | 一种肿瘤特异性t细胞的分离培养方法及由其获得的产品 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104357390B (zh) | 同时扩增cd3+cd56+cik细胞和cd3‑cd56+nk细胞的方法 | |
| CN103756964B (zh) | 一种高效扩增cd3-cd56+的自然杀伤细胞培养系统的方法 | |
| CN105087487B (zh) | 一种高效扩增cik的方法 | |
| CN104357394B (zh) | 一种自体外周血淋巴细胞dc‑cik的培养方法 | |
| CN106399255B (zh) | Pd-1 car-t细胞及其制备方法和应用 | |
| CN101519646B (zh) | 一种cik细胞及其制备方法和细胞制剂 | |
| CN109666639A (zh) | 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法 | |
| CN104371974B (zh) | 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 | |
| CN106544365B (zh) | 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用 | |
| CN106754730A (zh) | 一种高效扩增nk细胞的方法 | |
| CN108893443A (zh) | 一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法 | |
| CN105861433A (zh) | 制备具有高效肿瘤杀伤性cik细胞制剂的方法及制得的cik细胞制剂 | |
| CN108251365B (zh) | 免疫细胞培养基体系 | |
| CN102597223A (zh) | 生产天然杀伤细胞的方法 | |
| CN101506356A (zh) | 用于免疫治疗的活化淋巴细胞的制备方法 | |
| CN105087488A (zh) | 一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用 | |
| CN108588022A (zh) | 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法 | |
| JP2017012010A (ja) | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 | |
| CN105695406A (zh) | 制备具有高效肿瘤杀伤性dc-cik免疫细胞的方法及制得的dc-cik免疫细胞 | |
| CN107502590A (zh) | 一种人类脐带血造血干细胞高效扩增nk细胞的方法 | |
| CN105969727A (zh) | 一种脐血淋巴细胞dc-cik的培养方法 | |
| CN105505871B (zh) | 一种有效扩增cik且提高其特异性杀瘤能力的方法 | |
| CN103396991A (zh) | 一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法 | |
| CN106222141A (zh) | Nk细胞培养液和细胞培养方法 | |
| CN106754704B (zh) | 免疫细胞体外诱导扩增的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160817 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |