CN108588022A - 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法 - Google Patents

体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养CD4+/CD8+TCM细胞的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物组合从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD4+/CD8+TCM细胞的方法。本发明的技术方案获得的T细胞增殖数量多、状态好，比例接近人体自然状态，同时TCM细胞的含量高。

Description

体外培养富集人CD4+和CD8+ TCM细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养富集人CD4+/CD8+ TCM细胞(中枢记忆性T细胞)的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD4+/CD8+ TCM细胞的方法。
背景技术
2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。根据中国医学科学院肿瘤医院、国家癌症中心赫捷院士、全国肿瘤登记中心主任陈万青教授等在《CA:A Cancer Journal for Clinicians》杂志(2015年影响因子144.8)发表的《2015年中国癌症统计数据》：2015年我国肿瘤新发病例为429.2万。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50％，达到每年2160万人。
针对肿瘤，传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性，效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来与之结合并发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞。但分子靶向药物有效性低，某种药物只能对特定突变基因型肿瘤产生作用；肿瘤基因突变产生药物耐受性导致长期的治疗效果下降；存在严重的不良反应；部分肿瘤不能通过靶向药物得到有效治疗。
而免疫疗法恰恰能够解决上述问题。当免疫系统由于自身或肿瘤细胞原因而削弱时，为肿瘤的发生提供有利条件；肿瘤免疫治疗通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤能力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。
2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，肿瘤细胞及免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。
随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。细胞免疫治疗，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。
细胞免疫治疗目前已经广泛开展，从早期的LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)治疗尝试，发展到CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、DC-CIK细胞(自体树突状细胞刺激CIK细胞)治疗等。CIK细胞由IFN-γ(干扰素-γ)、IL-2(白细胞介素-2)及抗-CD3抗体(OKT3)刺激后分化产生，其中在第0天加入1,000U/ml的IFN-γ，24小时后加入50ng/ml OKT3和300U/mlIL-2，中间间隔2天加入含IL-2的新鲜培养基，之后经过2-3周的培养可得到CIK细胞。当前，CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)免疫治疗技术已经成为国际肿瘤治疗研究的热点领域。
肿瘤特异性CTL细胞(细胞毒性T淋巴细胞，即CD8+ T细胞)是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，通过细胞表面的TCR(T细胞抗原受体)识别肿瘤细胞表面呈递的肿瘤抗原和HLA(人类白细胞抗原)分子复合物，激活CTL细胞内一系列反应，通过分泌穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞。近年来科学家们研究了肿瘤突变产生的新表位对机体抗肿瘤作用的影响，有望推动肿瘤特异性T细胞治疗技术的进步和临床应用。现有临床研究表明，肿瘤组织处肿瘤特异性突变，尤其是免疫原性区域抗原的突变，能够产生新的、肿瘤特异性抗原，这些抗原能够激发体内特异性T细胞免疫反应，产生的T细胞表面TCR亲和力较高，从而有效发挥肿瘤细胞杀伤功能。然而肿瘤组织处的免疫耐受环境限制了特异性T细胞的有效激活和功能发挥，需要体外环境下实施人为干预，对突变抗原特异性T细胞进行体外扩增和活化。因此，体外高效T细胞定向增殖培养技术和试剂的开发对于提高以CTL为基础的肿瘤治疗具有重要意义。
中国专利公开第CN106566806A号公开了一种体外培养富集CD8+ T细胞的方法，其中采用终浓度为300U/ml的IL-2，并通过预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板实现了体外培养富集CD8+ T细胞。
CD4+ T细胞即辅助性T细胞(Th细胞)，能分泌多种细胞因子。在过去的研究中，CD8+ T细胞由于可直接杀伤肿瘤细胞而得到了广泛关注，而有关CD4+ T细胞的研究相对较少，但近年来CD4+ T细胞在抗肿瘤免疫中的作用越来越受到重视，目前认为CD4+ T细胞在CTL细胞的启动、记忆性CD8+ T细胞的生成和功能的维持等方面起着重要作用，并可直接杀伤肿瘤细胞，在多种肿瘤中，其抗肿瘤活性在一定程度上可能比CD8+ T细胞更为有效。同时激活CD4+ T细胞和CD8+ T细胞是细胞免疫治疗的理想策略。
新鲜外周血中CD4+/CD8+ T细胞比例为约1：1至约2：1。在T细胞分化过程中，T细胞经历T细胞、效应性T细胞、效应性记忆性T细胞和中枢记忆性T细胞(TCM细胞)的不同时期，其分化增殖的能力各不相同。T细胞分化过程中，其细胞表面标识发生逐渐变化，表现为CD45RA由阳性逐渐变为阴性，而CD62L逐渐由阴性变为阳性，双染色分析表现为：细胞表征为CD45RA+/CD62L+；效应性T细胞表征为CD45RA+/CD62L-；效应性记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L-；中枢记忆性T细胞(TCM细胞)表征为CD45RA-/CD62L+。
TCM细胞发挥反应性记忆，其归巢到次级淋巴器官的T细胞区，几乎没有效应功能，但能稳定地增殖并在抗原刺激下分化为效应细胞。与天然的T细胞相比，TCM对抗原刺激高度敏感，对共刺激信号的依赖减弱，并上调表达了CD40L，可对DC和B细胞有更有效的刺激反馈。在TCR信号传导后，TCM细胞主要产生IL-2，但增殖后，它们分化为效应细胞并产生大量的IFN-γ或IL-4。
因此，在免疫细胞治疗过程中，含有较高含量的TCM细胞对于治疗效果具有重要意义，同时保持CD4+/CD8+ T细胞的比例接近正常人体生理状态将更适用于人体。因此，体外扩增CD4+/CD8+ TCM细胞并保持CD4+/CD8+ T细胞的比例接近正常人体生理状态的培养方法在临床上具有需求。
发明内容
为了解决上述问题，在一个方面，本发明的目的是提供一种培养富集人CD4+/CD8+TCM细胞悬液的方法。
该方法包括以下步骤：
1)从20-25ml人外周血中分离PBMC；
2)对PBMC进行磁性分选，获得CD4+/CD8+ T细胞悬液；
3)将T细胞悬液在细胞培养板中，在37℃、5％CO2和100％湿度条件下，使用含6％人体自身血清的GT-T551细胞培养基培养7-12天，获得目的细胞悬液；
该培养基中添加有终浓度为100-1000U/ml的IL-2、终浓度为20-200U/ml的IL-7；并且该细胞培养板中添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠(购自ThermoFisher公司，11132D)。
优选地，在该方法中，培养基中添加有终浓度为300U/ml的IL-2、终浓度为20U/ml的IL-7。
优选地，在该方法中，T细胞悬液的接种密度为5×105/ml。
优选地，在该方法中，其中步骤1)的处理为：将新鲜采集的外周血用冷却的无菌磷酸盐缓冲液稀释一倍，将稀释后的血样以5：3的比例加入到人外周血淋巴细胞分离液中，在25℃下以700g离心30分钟，吸出中间单个核细胞层至新的无菌离心管中，用等体积磷酸盐缓冲液稀释后，在25℃下以300g离心10分钟；弃掉上清，重复稀释离心一次，加适量氯化钠注射液重悬后，对细胞进行计数，获得分离的PBMC。
优选地，在该方法中，其中添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠是通过下述方法实现的：将与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠与细胞一起加入到细胞培养板中共培养。
优选地，在该方法中，其中分选是通过分选柱实现的。
更优选地，在该方法中，其中分选是通过将分选柱放置在强磁场中实现的。
在另一个方面，本发明的目的是提供一种用于培养富集人CD4+/CD8+ TCM细胞悬液的体系，该体系包含：IL-2；IL-7；CD3/CD28抗体偶联磁珠。
优选地，在该体系中包含：终浓度为100-1000U/ml的IL-2；终浓度为20-200U/ml的IL-7；与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠。
更优选地，在该体系中包含：终浓度为300U/ml的IL-2、终浓度为20U/ml的IL-7；与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠。
本发明的技术方案获得细胞悬液中的T细胞增殖数量多、活力好、CD8+ T细胞与CD4+ T细胞之比接近正常人体生理状态，同时目的细胞悬液中，基于总的细胞数目，TCM细胞的含量接近80％。
具体实施方式
本发明通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料，本发明所使用的抗体均可由商业公司容易地获得。
首先进行T细胞体外扩增培养
实施例1.志愿者外周血淋巴细胞(PBMC)分离：
本发明所用的淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医务人员对志愿者进行采血。本项目选取2例健康志愿者V32和V34，采血时使用含有EDTA-K2抗凝的10ml一次性真空采血管(购自BD公司，367525)，每名志愿者采血约20-25ml，采血后将血样立即颠倒防止凝血。
1)先将新鲜采集的外周血用冷却的磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4，经121℃高压灭菌)稀释一倍，将稀释的血样以5：3的比例加入到预先装有15ml人外周血淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物技术有限公司，LTS1077)的离心管中，需缓慢加入以避免界面混乱；
2)在25℃条件下，将上述含人外周血淋巴细胞分离液和血样的离心管用高速冷冻离心机(购自ThermoFisher公司,75004524)离心，升降速设置为升2、降2，室温、700g离心30分钟；
离心后的样品分四层，其中管底部是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆层，血浆层与分离液层之间是白色云雾状的单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层，将最上层血浆用巴斯德移液管吸出弃掉，之后小心吸出单个核细胞层至新的无菌离心管中，即为粗纯PBMC细胞；
3)用等体积的磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)等体积稀释粗纯PBMC细胞，之后在25℃条件下以300g的离心力离心10分钟；弃掉上清，重复上述步骤一次；加入适量氯化钠注射液重悬细胞后开始计数；获得分离的PBMC细胞备用。
实施例2.T细胞分选
通过免疫磁珠法对上述分离的PBMC细胞中的T淋巴细胞进行分选富集，以获得高纯度的T细胞，用以进行后续培养。
1)首先将实施例1中获得的分离的PBMC细胞按照每1×107细胞与20μl的CD4抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司，130-045-101)、20μl的CD8抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司，130-045-201)和含0.5％胎牛血清(FBS，购自美国Gibco公司品牌澳洲来源，10270-106)和2mM EDTA-Na的80μl磷酸盐缓冲液(PBS-F缓冲液)进行混合，之后置4℃进行孵育15分钟。每107个细胞加1-2ml PBS-F缓冲液，室温300g离心10分钟。
2)用移液枪小心吸除细胞上清液，加500μl PBS-F缓冲液重悬细胞沉淀(一般小于108个细胞加500μl缓冲液重悬)，并通过200目一次性无菌滤网(购自德国美天旎生物技术有限公司,130-101-812)过滤，去除细胞悬液中的杂质，以使得细胞能够顺利通过分选柱(MS分选柱，购自德国美天旎生物技术有限公司,130-042-201)，获得CD4和CD8抗体偶联磁珠结合的PBMC细胞。
3)将MS分选柱放置在强磁场(OctoMACS Separator，购自德国美天旎生物技术有限公司，130-042-108)中，分别用0.5ml PBS-F缓冲液润洗2次，至最后一次润洗的PBS-F缓冲液完全流出分选柱后，获得经处理的MS分选柱备用。
4)将上述步骤2)获得的CD4和CD8抗体偶联磁珠结合的PBMC细胞缓慢加入到步骤3)处理后的MS分选柱，此时结合了CD4抗体偶联磁珠和CD8抗体偶联磁珠的T细胞就会在磁场作用下滞留在MS分选柱中，而未结合磁珠的其它细胞则沿分选柱流出，即为流穿细胞。用500μl的PBS-F缓冲液分三次缓慢加入到分选柱，使分选柱内未结合磁珠的细胞完全洗脱出分选柱，以便获得更高纯度的结合了CD4抗体偶联磁珠和CD8抗体偶联磁珠的T细胞。
5)将含有结合了CD4抗体偶联磁珠和CD8抗体偶联磁珠的T细胞分选柱远离磁场，加入1ml的PBS-F缓冲液，用MS分选柱活塞推出分选柱内与抗体偶联磁珠结合的CD4+/CD8+T细胞，300g离心10分钟，弃掉上清后分别用淋巴细胞、DC细胞培养基(购自TAKARA公司，GT-T551，下同)清洗两次，并以含6％人体自身血清(HS，购自Sigma公司，H3667)和终浓度为300U/ml的IL-2(购自双鹭药业)、终浓度为20U/ml的IL-7(购自PeproTech公司，AF-200-07)的GT-T551培养基(来源同上)重悬计数至浓度为5×105细胞/ml的细胞悬液，获得以CD4+和CD8+ T细胞为主的高纯度T细胞，以备后续刺激处理。
实施例3.T细胞体外刺激扩增
1)将实施例2中步骤5)获得的以CD4+和CD8+ T细胞为主的高纯度T细胞分别进行以下A、B两种方式的处理：
A.置于预包被有CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中，其中培养基中含有终浓度为300U/ml的IL-2和终浓度为20U/ml的IL-7；
B.置于细胞培养板中，添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠(购自ThermoFisher公司，11132D)，其中培养基中含有终浓度为300U/ml的IL-2和终浓度为20U/ml的IL-7；
以便在不同刺激组合形式及培养方式条件下比较T细胞增殖水平及扩增的T细胞亚群和分化水平。具体添加或培养条件如下：
A.置于预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中培养：在制备实施例2的步骤5)中获得的以CD4+和CD8+ T细胞为主的高纯度T细胞的同时，将CD3抗体(克隆号为OKT-3，功能性等级纯化(Functional Grade Purified)，浓度为1mg/ml，购自BioXCell公司，BE0001-2)和CD28抗体(克隆号为CD28.2，功能性等级纯化(Functional Grade Purified)，浓度为1mg/ml，购自BioXCell公司，BE0291)，分别以终浓度2.5μg/ml和0.5μg/ml稀释到一份PBS缓冲液中，并按照2ml/孔(6孔板)或500μl/孔(24孔板)加入后，37℃孵育2小时；每孔加入2mlDPBS(购自Gibco公司，A12856-01)，漂洗1次；每孔再加入1ml GT-T551细胞培养基(来源同上)漂洗1次。弃掉孔内上清溶液，并将实施例2的步骤5)中分选出的以CD4+和CD8+ T细胞为主的高纯度T细胞按照5×105/ml浓度加入到预包被CD3抗体和CD28抗体的孔板中进行培养，其中培养基中含有终浓度为300U/ml的IL-2和终浓度为20U/ml的IL-7；
B.添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠：将实施例2的步骤5)中分选出的以CD4+和CD8+ T细胞为主的高纯度T细胞按照5×105/ml浓度加入到细胞培养板中进行培养，添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠，其中培养基中含有终浓度为300U/ml的IL-2和终浓度为20U/ml的IL-7；
经过上述A、B分别处理的T细胞在37℃、5％CO2和100％湿度条件下培养10天。分别对所培养的T细胞进行计数，每组取不少于5×105个细胞以备后续流式细胞分析检测，对刺激产生的T细胞数量、T细胞亚群和记忆分化特征等进行定性和定量检测。
实施例4.体外刺激扩增后对CD4+/CD8+ T细胞亚群进行分析
按照实施例3所提供的培养方法，在T细胞培养后第10天分别取样进行流式细胞检测，以评价培养后T细胞亚群。
取培养后T细胞5×105个，以300g离心10分钟，弃掉上清后，分别用1ml的PBS缓冲液进行2次洗涤、离心并弃上清液；最后一次离心并弃上清液后用50μl PBS重悬，加入PE-Cy7-anti-CD8抗体(购自BD Biosciences公司，557843)和APC-Cy7-anti-CD4抗体(购自BDBiosciences公司，557871)各1个反应量，室温孵育15分钟，之后分别用1ml的PBS缓冲液进行2次洗涤，300g离心10分钟后，弃上清液。
最后一次离心并弃上清液后用500μl PBS缓冲液进行重悬，加入流式管(购自海门)中在双激光流式细胞分析仪中(购自Beckman Coulter公司，CytoFLEX，下同)检测，所得数据用CytoExpert进行分析。
表1.体外刺激后CD4+/CD8+ T细胞亚群分析结果
(单位为该细胞占所有细胞的百分比)
结果表明，经过A、B处理培养后第10天，预包被CD3/CD28抗体组CD4+ T细胞比例降低，而抗体偶联磁珠处理组CD4+ T细胞比例升高或维持不变，与自然状态接近。
实施例5.体外刺激扩增后T细胞分化特征分析
分别取实施例3中A、B培养后第10天的细胞5×105个，300g离心10分钟，弃上清后分别用1ml的PBS缓冲液进行2次洗涤、离心并弃上清液；最后一次离心并弃上清液后用50μlPBS重悬，加入APC-anti-CD45RA抗体(购自BioLegend公司，304112)和PE-anti-CD62L抗体(购自BioLegend公司，304806)各1个反应量，室温孵育15分钟，之后分别用1ml PBS进行2次洗涤，以1500转/分钟离心5分钟，并弃上清液。
最后一次离心弃上清液后用500μl PBS缓冲液进行重悬，并将其加入流式管(来源同上)中在双激光流式细胞分析仪(来源同上)中检测。
表2.体外刺激后T细胞分化特征分析结果
(单位为该细胞占所有细胞的百分比)
结果分析：
在本实施例中，对实施例3的不同处理并培养至第10天的T细胞分化亚群进行了检测。结果表明，在V32和V34两例健康个体中，TCM细胞亚群比例在T细胞培养至第10天时增加。在V32个体中，A处理培养的TCM细胞在第10天的比例为56.00％，而B处理达到79.89％；B处理相对于A处理TCM细胞的比例提高了20％以上。在V34个体中，A处理培养的TCM细胞在第10天的比例为46.43％，而B处理达到80.81％；B处理相对于A处理TCM细胞的比例提高了近34％。
实施例6.刺激物组合优化
通过实施例4和5可以发现，CD3/CD28抗体偶联磁珠处理、同时添加IL-2和IL-7能够产生更高比例的CD4+ T细胞以及TCM细胞，进一步对刺激条件和刺激物组合进行优化。
参照实施例3，本实施例在T细胞培养孔中分别加入：
A.IL-2(300U/ml)+抗-CD3抗体(2.5μg/ml)+抗-CD28抗体(0.5μg/ml)
B.IL-2(100U/ml)+CD3/CD28抗体偶联磁珠
C.IL-2(300U/ml)+CD3/CD28抗体偶联磁珠
D.IL-2(1000U/ml)+CD3/CD28抗体偶联磁珠
E.IL-2(300U/ml)+IL-7(20U/ml)+CD3/CD28抗体偶联磁珠
F.IL-2(300U/ml)+IL-7(200U/ml)+CD3/CD28抗体偶联磁珠
表3.刺激物组合优化后T细胞分群和分化特征分析结果
(单位为该细胞占所有细胞的百分比)
通过本实施例发现，B、C、D三组处理培养的T细胞在第10天，CD4+/CD8+ T细胞的比例均接近正常人体生理状态，且TCM细胞的比例均较高，均可作为IL-2的使用浓度；其中C组的TCM细胞比例最高，可作为IL-2的最优条件。E、F两组处理培养的T细胞在第10天CD4+/CD8+ T细胞的比例均接近正常人体生理状态，而TCM细胞比例则高于B-D三组；其中E组处理培养的T细胞在第10天具有更高比例的TCM细胞，可为最优组合，用于临床治疗。

Claims (8)

1.一种培养富集人CD4+/CD8+TCM细胞悬液的方法，包括以下步骤：
1)从20-25ml人外周血中分离PBMC；
2)对所述PBMC进行磁性分选，获得CD4+/CD8+T细胞悬液；
3)将所述T细胞悬液在细胞培养板中，在37℃、5％CO2和100％湿度条件下，使用含6％人体自身血清的GT-T551细胞培养基培养7-12天，获得目的细胞悬液；
其特征在于所述培养基中添加有终浓度为100-1000U/ml的IL-2、终浓度为20-200U/ml的IL-7；并且所述细胞培养板中添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠。
2.根据权利要求1所述的方法，所述培养基中添加有终浓度为300U/ml的IL-2、终浓度为20U/ml的IL-7。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞悬液的接种密度为5×105/ml。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤1)的处理为：将新鲜采集的外周血用冷却的无菌磷酸盐缓冲液稀释一倍，将稀释后的血样以5：3的比例加入到人外周血淋巴细胞分离液中，在25℃下以700g离心30分钟，吸出中间单个核细胞层至新的无菌离心管中，用等体积磷酸盐缓冲液稀释后，在25℃下以300g离心10分钟；弃掉上清，重复稀释离心一次，加适量氯化钠注射液重悬后，对细胞进行计数，获得分离的PBMC。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述添加与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠是通过下述方法实现的：将与细胞数量个数比为1：1的CD3/CD28抗体偶联磁珠与细胞一起加入到细胞培养板中共培养。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分选是通过分选柱实现的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述分选是通过将分选柱放置在强磁场中实现的。
8.一种用于培养富集人CD4+/CD8+TCM细胞悬液的体系，其包含：
IL-2；
IL-7；
CD3/CD28抗体偶联磁珠。
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