CN114990061A - 一种诱导扩增中央记忆性t细胞的培养方法 - Google Patents

一种诱导扩增中央记忆性t细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)培养瓶的包被；(2)外周血单个核细胞的准备；(3)T细胞扩增。本发明提出了一种新的T细胞扩增方法，通过培养基中添加烟酰胺扩增获得T细胞，研究不同浓度的NAM对扩增的T细胞中TCM比例、细胞扩增倍数和细胞抗凋亡能力的影响，得到扩增培养基中加入10mM NAM是扩增T细胞的最佳剂量。该方法所获得的T细胞数量多，TCM比例高，抗凋亡能力强，体内增殖能力强，为T细胞的临床治疗应用提供基础。

Description

一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，属于细胞技术领域。
背景技术
近年来，过继性免疫细胞治疗特别是嵌合型抗原受体细胞(Chimeric antigenreceptor Tcell，CAR-T)、T细胞受体嵌合型T细胞(Chimeric T cell receptor T cell，TCR-T)和肿瘤浸润T细胞(Tumor-Infiltrating T Cells，TILs)在肿瘤治疗中疗效显著成为研究的热点。研究发现，过继T细胞在体内的生存和扩增能力与治疗效果高度相关，T细胞在体内的生存和扩增能力又与T细胞的分化程度呈负相关，T细胞分化程度越高其在体内增殖和生存能力越低。
T细胞的分化遵循从幼稚T细胞(Naive T cell，CD3+CD45RA+CCR7+)向干细胞样记忆性T细胞(TSCM，CD3+CD45RA+CCR7+)、中央记忆性T细胞(TCM，CD3+CD45RO+CCR7+)、效应记忆性T细胞(TEM，CD3+CD45RO+CCR7-)和效应T细胞(TE，CD3+CD45RO-CCR7-)的渐进分化过程。在临床实践中，T细胞都需要经过体外大量扩增以满足治疗剂量。
然而，虽然已有多种T细胞体外扩增方法，但这些T细胞扩增方法，往往会导致T细胞终末分化为效应T细胞，回输患者体内后细胞增殖和扩增能力低下，严重影响过继性T细胞治疗的疗效。因此，开发一种能够减少T细胞终末分化的新型快速扩增方法，使T细胞分化为TCM，保持T细胞在体内的生存能力，提高T细胞治疗的效果，具有重要的临床应用意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法。该方法所获得的T细胞数量多，TCM比例高，抗凋亡能力强，体内增殖能力强，为T细胞的临床治疗应用提供基础。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)培养瓶的包被：向培养瓶中加入抗体包被液，于4℃静止过夜，随后弃去抗体包被液，用PBS缓冲液冲洗2～3遍，加入10mL的PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；
(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血，离心分离得到血浆，加等体积生理盐水重悬细胞；用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后用PBS缓冲液冲洗2～3遍，进行细胞计数，备用；
(3)T细胞扩增：
使用T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞，重悬后细胞悬液总体积不超过50mL；将细胞悬液加入步骤(1)包被后的培养瓶中，置于37℃、5％(v/v)CO2静止培养，保持细胞密度为0.5×106～2.5×106cells/mL；培养第7天或细胞体积到达450～550mL后，转入细胞培养袋，继续培养，培养第14天或细胞体积达到2.5L时，收获细胞；
所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓度10ng/mL的IL15和终浓度5-20mM的NAM。
所述抗体包被液为pH值8.0的PBS缓冲液，其中含有5μg/mL抗CD3活化性抗体和5μg/mL抗CD28活化性抗体。
所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓度10ng/mL的IL15和终浓度10mM的NAM。
所述自体血浆是通过以下方法得到的：收集患者自体血浆，于56℃孵育30min，随后4℃静止1小时，使用4000×g离心力离心20min，去除杂质，置于4℃保存，备用。
步骤(3)T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞后，细胞密度为1×106～2.5×106cells/mL。
本发明有益效果：
本发明提出了一种新的T细胞扩增方法。通过培养基中添加烟酰胺(Nicotinamide，NAM)扩增获得T细胞，通过研究不同浓度的NAM对扩增的T细胞中TCM比例、细胞扩增倍数和细胞抗凋亡能力的影响，得到扩增培养基中加入10mM NAM是扩增T细胞的最佳剂量。结果表明：培养基中含10mM NAM时扩增T细胞，不仅不会减少T细胞的总数，而且会增加TCM细胞的比例，扩增的T细胞具有更强的抗凋亡潜力。
通过培养基中添加NAM扩增获得的T细胞，对CD3活化性抗体再刺激反应能力研究表明，T细胞不仅具有更强的抗凋亡能力，还具有更强的增殖和细胞因子表达潜力。
本发明方法将NAM添加到T细胞扩增培养物中，可获得更多中央记忆性T细胞，显著提高T细胞的质量。这种新颖的策略可以有效保持T细胞的“年轻”状态，为T细胞的临床治疗应用提供良好基础。可以预见，当过继输注给患者时，会增强它们的抗肿瘤作用。因此，本发明的研究在未来具有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为对比不同浓度NAM培养基扩增的T细胞流式检测中央记忆性T细胞表面标志CD45RO和CCR7。
其中，NAM(+)0mM为不添加NAM处理组；5、10和20分别为添加5mM、10mM和20mM的NAM处理组。
图2为不同浓度NAM培养基扩增的中央记忆性T细胞占总T细胞的比例统计。
其中，NAM 0mM为不添加NAM处理组；5、10和20分别为添加5mM、10mM和20mM NAM处理组；数据呈现使用Mean±SD，#为P＞0.5、*为P＜0.1、**为P＜0.01。
图3为不同浓度NAM的培养基中T细胞的生长曲线。
其中，NAM 0mM为不添加NAM处理组；5、10和20分别为添加5mM、10mM和20mM NAM处理组，数据呈现使用Mean±SD，***为P＜0.001。
图4为不同浓度NAM培养基中培养的T细胞抗凋亡分子Bcl2和凋亡相关分子Fas基因表达的定量PCR检测结果统计。
其中，NAM 0mM为不添加NAM处理组；5、10和20分别为添加5mM、10mM和20mM NAM处理组，数据呈现使用Mean±SD，#为P＞0.5、**为P＜0.01、***为P＜0.001。
图5为NAM培养的T细胞再次活化后流式检测中央记忆性T细胞表面标志CD45RO和CCR7。
其中，a图为典型的流式散点图，b图为流式结果统计图，NAM(-)为无NAM培养基组，NAM(+)为10mM NAM培养基组，数据呈现使用平均值加减标准差，***为P＜0.001。图6为NAM培养的T细胞增殖统计图。
其中，数据处理以无NAM培养基中培养细胞不使用anti-CD3再刺激的细胞吸光度为1，计算不同处理后细胞增殖倍数，数据呈现使用Mean±SD，***为P＜0.001。
图7为NAM培养的T细胞再刺激后定量PCR检测抗凋亡分子Bcl-2和细胞因子的基因表达。
其中，a图为Bcl-2基因表达统计图，b图为细胞因子基因表达统计图，数据处理以无NAM培养的细胞基因表达为1，计算NAM培养基组基因表达变化倍数，数据呈现使用Mean±SD，***为P＜0.001，NAM(-)为不添加NAM，NAM(+)为添加10mM NAM培养基组。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。如无特别说明，实施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法均为常规方法。
实施例1
一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)培养瓶的包被：向T75培养瓶中加入8mL抗体包被液，于4℃静止过夜，随后弃去抗体包被液，用PBS缓冲液冲洗3遍，加入10mL PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；
其中，抗体包被液为：pH值8.0的PBS缓冲液中，含有5μg/mL抗CD3活化性抗体和5μg/mL抗CD28活化性抗体。
(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血50mL，700×g离心10min分离血浆；使用等体积的生理盐水重悬细胞，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后用PBS缓冲液冲洗2遍，进行细胞计数，备用。
(3)自体血浆的处理：收集患者自体血浆，56℃孵育30min，随后4℃静止1h，使用4000×g离心20min，去除杂质，收集血浆，置于4℃保存，备用。
(4)T细胞扩增：
使用T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞，重悬后细胞悬液调整细胞密度为1×106～2.5×106cells/mL，悬液总体积不超过50mL；
其中，采用的T细胞扩增培养基为GT-T551-H3无血清培养基，含有1％的(v/v)自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓度10ng/mL的IL15和终浓度5-20mM的NAM；
将细胞悬液加入步骤(1)包被后的培养瓶中，置于37℃、5％(v/v)CO2环境静止培养；保持细胞密度0.5×106～2.5×106cells/mL(每2天取样计数一次，若细胞密度不满足，可补加T细胞扩增培养基)；培养第7天或细胞体积到达450～550mL后，转入细胞培养袋，继续培养，培养第14天或培养细胞总体积为2.5L时，收获细胞。
试验例1不同浓度的NAM对扩增的T细胞中TCM比例、细胞扩增倍数和细胞抗凋亡能力的影响
采用实施例1的方法扩增T细胞，研究不同NAM添加量对T细胞扩增效果的影响。通过改变步骤(4)T细胞扩增培养基中NAM的添加量，分别设置不同NAM添加量的组别：不添加NAM的0mM NAM组，添加5mM、10mM和20mM的NAM 5mM NAM组、10mM NAM组和20mM NAM组。
以上各组分别培养14天后收获扩增细胞，进行以下分析：
(1)流式检测扩增细胞中TCM的比例：
收集待测样品，通过500×g离心获得细胞。用PBS洗涤2次后，将收获的细胞分别使用CD3-APC、CD45RO-BV421和CCR7-PE抗体(均来自BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ，美国)在避光条件下室温染色20min。然后，立即使用FACSCanto流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)检测细胞的荧光强度。使用flowjo V10软件分析数据。
结果分析，首先将CD3阳性细胞圈群，标记为T细胞，然后在T细胞群中分析CD45RO+CCR7+阳性的TCM细胞占T细胞群的百分比。如图1所示，与0mM NAM组相比，含有5mM、10mM或20mM NAM处理组中CD45RO+CCR7+的中央记忆性T细胞TCM的比例明显增加。
以0mM NAM处理组中CD3+45RO+CCR7+的TCM比例为1，分别计算5mM、10mM或20mM NAM组中TCM比例相对0mM NAM处理组增加倍数。如图2所示，5mM NAM组、10mM NAM组和20mM NAM组中CD45RO+CCR7+的TCM比例平均增加倍数分别为1.23、1.69和1.95。使用one-way ANOVA法统计发现，5mM NAM处理组中TCM的比例与0mM NAM处理组相比，TCM的比例增加无统计学差异，10mM和20mM的NAM组TCM的比例与0mM NAM培养基组相比增加显著，有统计学差异。
以上结果表明，使用含10mM和20mM的NAM组能显著提高扩增的T细胞中TCM比例，获得更多的TCM细胞。
(2)不同浓度NAM处理组T细胞扩增倍数的研究：
过继性T细胞疗法通常需要至少109到1010的T细胞。为了获得足够临床治疗剂量的T细胞，通常需要将T细胞扩增至少100倍左右。因此，为进一步评价添加NAM扩增获得的T细胞是否能够满足临床实际需求，我们评价了不同浓度的NAM在14天中T细胞扩增倍数，如图3所示。在14天中，0mM、5mM和10mM NAM组T细胞平均扩增倍数分别是147倍、156倍和126倍。one-way ANOVA法统计分析0mM、5mM和10mM NAM组之间T细胞扩增倍数无统计学差异。然而，20mM NAM组T细胞平均仅扩增34倍，统计发现20mM NAM组T细胞扩增倍数显著低于0mM、5mM和10mM NAM组。这些结果表明，使用5mM和10mM的NAM扩增T细胞，可以获得满足临床治疗需求的细胞数量。20mM的NAM显著限制了T细胞的扩增数量。
(3)不同浓度NAM扩增的T细胞抗凋亡能力分析：
T细胞活化过程中，线粒体生物合成和呼吸作用会显著增加，以提供足够的ATP用于细胞生长期间的增殖和分化。线粒体呼吸增加会导致线粒体产生活性氧(ROS)的快速增加，高水平的ROS通过激活诱导的细胞死亡(AICD)或激活的细胞自主死亡(ACAD)来驱动T细胞凋亡。AICD机制主要由Fas/Fas-L通路介导。ACAD机制主要依赖于内在死亡途径，它涉及Bcl-2家族蛋白的促凋亡和抗凋亡成员。NAM先前已被证明可降低ROS水平，并抑制多种类型细胞中ROS诱导的细胞凋亡并上调Bcl-2表达。因此，通过qPCR检测促凋亡(Fas)和抗凋亡(Bcl-2)分子的mRNA表达，能够评价扩增后细胞的抗凋亡能力。
实时定量PCR(RT-qPCR)：收集不同浓度NAM扩增的T细胞，使用RNAiso Plus试剂(Takara，Beijing，China)提取细胞总RNA，使用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara)逆转录获得cDNA。根据试剂说明书，使用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix在QuantStudio5实时PCR系统(Life，Thermo Fisher Scientific Waltham，MA，USA)中扩增分析。靶基因mRNA特异性引物见表1。靶基因表达水平通过2ΔΔCT方法计算，用于对GAPDH表达进行归一化后的相对定量。
表1 RT-qPCR的引物序列
Figure BDA0003722300210000061
如图4所示，使用5mM、10mM和20mM NAM扩增的细胞，细胞中Bcl-2基因表达水平相对于0mM NAM组显著升高(图4a)。同时，在含有10mM或20mM NAM的培养基中培养的T细胞中，Fas基因表达水平显著下降(图4b)。5mM NAM组的细胞中，Fas基因表达水平相对于0mM NAM组在统计学上无显著差异。以上结果表明，在使用10mM或20mM NAM扩增的T细胞具有更强的抗细胞凋亡潜力，可防止由AICD或ACAD引起的细胞凋亡。
因此，加入10mM NAM是扩增T细胞的最佳剂量，既可以产生更多的TCM细胞，还不减少T细胞的扩增总数；此外，扩增的T细胞具有更强的抗凋亡潜力。
试验例2NAM扩增的T细胞对CD3活化性抗体再刺激的反应能力研究
过继性T细胞的肿瘤治疗效果取决于回输T细胞在体内的免疫反应能力、增殖能力和持久性。检测扩增后的T细胞对二次活化刺激的免疫反应能力、增殖能力和抗凋亡能力是评价细胞质量的重要指标。为了进一步评价使用NAM中央记忆性T细胞扩增技术是否能提高细胞在体内的增殖能力、免疫反应能力和抗凋亡能力，我们采用实施例1的方法扩增T细胞，改变步骤(4)T细胞扩增培养基中NAM的添加量，分别设置不添加NAM处理组(NAM(-)组)、添加10mM的NAM处理组(NAM(+)组)。细胞扩增14天后，收集细胞进行以下实验。
(1)流式分析NAM扩增的T细胞，使用CD3活化抗体再刺激后TCM比例
扩增结束后，使用离心法分别收集NAM(+)组和NAM(-)组细胞2×106个，使用2mL培养基(无血清培养基GT551-H3含IL-15 10ng/mL和IL-7 10ng/mL)重悬，分别加入终浓度100ng/mL CD3活化抗体，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养5天，离心法收集细胞，使用PBS洗两遍，使用100μL PBS重悬，分别加入CD3-APC、CD45RO-BV421和CCR7-PE抗体闭光孵育25min，离心弃去抗体，PBS洗两遍，随后进行流式检测。结果分析，首先圈定CD3阳性细胞群为T细胞亚群，然后分析T细胞中CD45RO阳性的记忆性T细胞和CD45RO+CCR7+双阳性中央记忆性T细胞占T细胞的比例。
结果显示，如图5所示，NAM(+)组使用CD3抗体再次刺激活化后，细胞中CD45RO+的记忆T细胞和CD45RO+CCR7+中央记忆细胞TCM的比例显著高于NAM(-)组。
(2)T细胞增殖实验
扩增结束后，收集NAM(+)组和NAM(-)组细胞1×106个，使用1mL培养基(无血清培养基GT551-H3含IL-15 10ng/mL和IL-7 10ng/mL)重悬，分别接种于96孔板中。将NAM(+)组和NAM(-)组分别平均分成2组，每组5个重复孔，分别标记为NAM(-)组、NAM(-)+anti-CD3组、NAM(+)组和NAM(+)+anti-CD3组，按照分组NAM(-)+anti-CD3组和NAM(+)+anti-CD3组加入终浓度100ng/mL anti-CD3活化性抗体，置于37℃、5％CO2细胞培养箱，培养第5天时，每孔加入10μL的CCK-8(Dojindo Molecular Technologies，Gaithersburg，MD)，置于37℃、5％CO2培养1小时。使用酶标仪测定OD450吸光度，数据处理以NAM(-)组吸光度为1，计算其它组细胞增殖倍数。
结果显示，如图6所示，使用NAM(+)组扩增获得的T细胞在接受CD3抗体二次刺激活化后，其细胞增殖能力显著高于NAM(-)组。NAM(+)组在无CD3抗体刺激时，其细胞增殖能力与NAM(-)+anti-CD3组相同。以上结果说明使用NAM扩增T细胞能显著提高T细胞二次活化后的增殖能力。
(3)Bcl-2基因及细胞因子表达分析
扩增结束后，使用离心法分别收集NAM(+)组和NAM(-)组细胞5×106个，使用5mL培养基(无血清培养基GT551-H3含IL-15 10ng/mL和IL-7 10ng/mL)重悬，分别加入终浓度100ng/mL CD3活化抗体，置于37℃、5％CO2培养，培养至第5天。使用离心法收集细胞，使用PBS洗1遍，使用RNAiso Plus试剂提取总RNA，使用PrimeScriptTM RT Master Mix逆转录获得cDNA。根据试剂说明书，使用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix在QuantStudio 5实时PCR系统中扩增分析。靶基因mRNA特异性引物见表1。靶基因表达水平通过2ΔΔCT方法计算，用于对GAPDH表达进行归一化后的相对定量。
结果表明，如图7a所示，使用NAM(+)组在CD3抗体活化后，其抗凋亡分子Bcl-2基因表达水平显著高于NAM(-)组，说明NAM培养获得的T细胞在二次活化后仍具有更强的抗凋亡能力。在细胞因子表达检测中我们发现，NAM(+)组不仅上调具有免疫活化作用的细胞因子IL-17a、IFN-γ和IL-1beta的表达，而且还显著下调免疫抑制作用的IL-10的表达(图7b)。
以上结果表明，使用NAM扩增获得的T细胞不仅具有更强的抗凋亡能力，而且还具有更强的增殖和细胞因子表达潜力。
序列表
<110> 河南省人民医院
<120> 一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法
<130> 细胞技术
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
acctgcacac ctggatccag 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcagagtctt cagagacagc cag 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
agtcaatggg gatgaaccag ac 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cacttctaag ccatgtcctt catc 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tcagatgtag cggataatgg aactc 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
aagtaaaagg agacaatttg gctctg 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ggaagacctc attggtgtca ctg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
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<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
acagatgaag tgctccttcc a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
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<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ccatcttcca ggagcgagat c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
agccttctcc atggtggtga 20

Claims (5)

1.一种诱导扩增中央记忆性T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养瓶的包被：向培养瓶中加入抗体包被液，于4℃静止过夜，随后弃去抗体包被液，用PBS缓冲液冲洗2～3遍，加入10mL的PBS缓冲液，置于4℃保存，备用；
(2)外周血单个核细胞的准备：使用含有肝素钠的采血管采集患者外周血，离心分离得到血浆，加等体积生理盐水重悬细胞；用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，随后用PBS缓冲液冲洗2～3遍，进行细胞计数，备用；
(3)T细胞扩增：
使用T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞，重悬后细胞悬液总体积不超过50mL；将细胞悬液加入步骤(1)包被后的培养瓶中，置于37℃、5％(v/v)CO2静止培养，保持细胞密度为0.5×106～2.5×106cells/mL；培养第7天或细胞体积到达450～550mL后，转入细胞培养袋，继续培养，培养第14天或细胞体积达到2.5L时，收获细胞；
所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓度10ng/mL的IL15和终浓度5-20mM的NAM。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述抗体包被液为pH值8.0的PBS缓冲液，其中含有5μg/mL抗CD3活化性抗体和5μg/mL抗CD28活化性抗体。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述T细胞扩增培养基中，含有1％(v/v)的自体血浆、终浓度10ng/mL的IL7、终浓度10ng/mL的IL15和终浓度10mM的NAM。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述自体血浆是通过以下方法得到的：收集患者自体血浆，于56℃孵育30min，随后4℃静止1小时，使用4000×g离心力离心20min，去除杂质，置于4℃保存，备用。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)T细胞扩增培养基重悬外周血单个核细胞后，细胞密度为1×106～2.5×106cells/mL。
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