CN111825756A - 一种脐带间充质干细胞因子在nk细胞体外培养方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞因子在NK细胞体外培养方面的应用。NK细胞是机体主要的天然免疫细胞，无需抗原致敏，不依赖抗体，即可直接识别并清除体内异常细胞，如肿瘤细胞、细菌或病毒等微生物感染细胞，故在机体早期抗肿瘤和抗感染的免疫应答中发挥极为重要的作用。本发明提供了一种hUC‑MSC因子，研究发现，该hUC‑MSC因子用于NK细胞体外培养既可以有效提高其增殖活性，又可以有效提高其杀伤活性，因而可以开发成NK细胞体外培养的增效成分。
Description
技术领域
本发明属于过继性细胞免疫治疗领域，涉及NK细胞的体外培养，具体涉及一种脐带间充质干细胞因子在NK细胞体外培养方面的应用。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是机体主要的天然免疫细胞，无需抗原致敏，不依赖抗体，即可直接识别并清除体内异常细胞，如肿瘤细胞、细菌或病毒等微生物感染细胞，故在机体早期抗肿瘤和抗感染的免疫应答中发挥极为重要的作用。除了可直接杀死肿瘤细胞外，NK细胞活化后还可通过分泌炎性细胞因子和趋化因子，与树突状细胞协同促进效应T细胞募集到肿瘤微环境中发挥抗肿瘤作用，从而有效地诱发后续的特异性抗肿瘤免疫应答。
过继性细胞免疫治疗是将淋巴细胞经体外刺激培养后回输给肿瘤病人，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，进行肿瘤治疗的一种生物治疗方法。近年来，随着医学技术的发展，基于NK细胞的肿瘤过继性细胞免疫治疗应用越来越广泛。
为了提高NK细胞用于过继性细胞免疫治疗的效果，不仅要保证NK细胞的数量，还要保证NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，提供一种脐带间充质干细胞因子在NK细胞体外培养方面的应用，以既提高NK细胞的数量，又提高NK细胞的杀伤力。
技术方案如下：
一种脐带间充质干细胞因子，通过如下方法制备：先将用完全培养基培养的人脐带间充质干细胞经反复冻融获得细胞内容物，再离心、过滤，滤液冷冻干燥即得。
优选地，所述完全培养基为含10％胎牛血清的α-MEM培养基。
优选地，所述完全培养基中还含有rhIGF-1或rhIGF-2。
优选地，所述反复冻融指-80℃冷冻、37℃水浴复苏三个循环。
优选地，所述离心的条件为4℃、3000rpm离心处理20min。
优选地，所述过滤指用0.22μm滤器过滤。
上述脐带间充质干细胞因子用于NK细胞体外培养的用途。
上述脐带间充质干细胞因子用于NK细胞体外培养提高其增殖活性的用途。
上述脐带间充质干细胞因子用于NK细胞体外培养提高其杀伤活性的用途。
有益效果：
NK细胞是机体主要的天然免疫细胞，无需抗原致敏，不依赖抗体，即可直接识别并清除体内异常细胞，如肿瘤细胞、细菌或病毒等微生物感染细胞，故在机体早期抗肿瘤和抗感染的免疫应答中发挥极为重要的作用。本发明提供了一种hUC-MSC因子，研究发现，该hUC-MSC因子用于NK细胞体外培养既可以有效提高其增殖活性，又可以有效提高其杀伤活性，因而可以开发成NK细胞体外培养的增效成分。
附图说明
图1为培养14d的NK细胞的流式鉴定图，从该图中可以看出，CD3-CD56+表型细胞(即NK细胞)的比例达到83.75％，NK细胞培养成功。
图2为各药物组NK细胞增殖率，该结果表明，hUC-MSC因子A、B、C可以显著促进NK细胞的增殖，且与hUC-MSC因子A的促增殖效果相比，hUC-MSC因子B、C对NK细胞的体外促增殖效果更显著优异。
图3为各组NK细胞杀伤活性标志分子CD107a表达水平测定的流式图，从该图中可以看出，hUC-MSC因子A、B、C可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且与hUC-MSC因子A相比，hUC-MSC因子B、C对NK细胞杀伤活性的提高更明显。
图4为各组NK细胞杀伤活性标志分子Granzyme B、Perforin表达水平的Westernblot图，从该图中可以看出，hUC-MSC因子A、B、C可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且与hUC-MSC因子A相比，hUC-MSC因子B、C对NK细胞杀伤活性的提高更明显。
具体实施方式
实施例1：脐带间充质干细胞因子制备
一、试验材料
人脐带间充质干细胞购自赛业(苏州)生物科技有限公司，传代扩增至第二代冻存。
胎牛血清、α-MEM培养基购自Gibco公司。
人胰岛素样生长因子1(rhIGF-1，冻干粉末，细胞培养级别)、人胰岛素样生长因子2(rhIGF-2，冻干粉末，细胞培养级别)购自南京盖斯夫医药科技有限公司。
二、试验方法和结果
1、人脐带间充质干细胞复苏和培养
(1)准备好37℃水浴。
(2)准备好人脐带间质干细胞完全培养基(含10％胎牛血清的α-MEM培养基)，温育到37℃。
(3)在15mL离心管中加入9mL的人脐带间质干细胞完全培养基。
(4)从液氮罐中取出冻存的人脐带间质干细胞，立即放入-80℃冰箱(目的是让进入冻存管的液氮稍加挥发)。
(5)在-80℃放置2-3min后，取出冻存细胞，将冻存管迅速放入37℃温水中，快速晃动使管中内含物尽快融化。仔细观察，待冻存管内含物完全融化后取出。
(6)用70％-75％酒精消毒冻存管口的外壁。
(7)在超净台中打开冻存管，用吸管将细胞冻存悬液移入装有9mL完全培养基的15mL离心管中。在这一过程请尽可能避免产生气泡。
(8)为了减少细胞损失，往冻存管中加入1mL完全培养基，稍微吹打，用吸管将这1mL的细胞悬液吸入离心管中，再用吸管将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。
(9)将细胞悬液经250g离心5min。
(10)尽量去除上清液，向细胞沉淀物加入2mL的完全培养基(已预热到37℃)，轻轻吹打均匀。
(11)将细胞全部接种到1个T25培养瓶中，加入足量的完全培养基。轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布。
(12)放入37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
(13)复苏后的第二天，给复苏的细胞换用新鲜的人脐带间质干细胞完全培养基(已预热到37℃)。
(14)之后，每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80％的汇合度。
(15)当细胞达80％-90％的汇合度，进行消化和传代。
2、分组方法
hUC-MSC因子A组：人脐带间充质干细胞培养过程中使用完全培养基培养；
hUC-MSC因子B组：人脐带间充质干细胞培养过程中使用含有200μg/mL胰岛素样生长因子1(IGF-1)的完全培养基培养；
hUC-MSC因子C组：人脐带间充质干细胞培养过程中使用含有200μg/mL胰岛素样生长因子2(IGF-2)的完全培养基培养。
3、人脐带间充质干细胞因子的制备
hUC-MSC因子A、B、C平行操作，且各平行3份。
hUC-MSC因子A：取复苏后传代3次的人脐带间充质干细胞，用完全培养基重悬制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，培养48h后，离心收集细胞，PBS洗涤3次，用PBS重悬制成5×106个/mL的细胞悬液，冻融3个循环(-80℃冷冻、37℃水浴复苏)，4℃、3000rpm离心处理20min，用0.22μm滤器过滤，滤液冷冻干燥即得。
hUC-MSC因子B：取复苏后传代3次的人脐带间充质干细胞，用含有200μg/mL IGF-1的完全培养基重悬制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，培养48h后，离心收集细胞，PBS洗涤3次，用PBS重悬制成5×106个/mL的细胞悬液，冻融3个循环(-80℃冷冻、37℃水浴复苏)，4℃、3000rpm离心处理20min，用0.22μm滤器过滤，滤液冷冻干燥即得。
hUC-MSC因子C：取复苏后传代3次的人脐带间充质干细胞，用含有200μg/mL IGF-2的完全培养基重悬制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，培养48h后，离心收集细胞，PBS洗涤3次，用PBS重悬制成5×106个/mL的细胞悬液，冻融3个循环(-80℃冷冻、37℃水浴复苏)，4℃、3000rpm离心处理20min，用0.22μm滤器过滤，滤液冷冻干燥即得。
hUC-MSC因子A、B、C于-80℃冻存，备用。
实施例2：hUC-MSC因子对NK细胞增殖活性和杀伤力的影响
一、试验材料
淋巴细胞分离液购自Solarbio。
NK细胞培养基购自CellGro SCGM，胎牛血清购自Gibco。
CD3-PerCP-Cy5.5和CD56-FITC购自BD。
hUC-MSC因子A、B、C按照实施例1方法制备，于-80℃冻存，备用。
二、试验方法
1、NK细胞的培养和鉴定
按常规方法取健康献血者外周抗凝血100mL，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，再用含500U/mL rhIL-2的NK细胞培养基对单个核细胞重悬制成细胞密度为2×105/mL的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，每2～3d半量换液1次，并且在每次换液时调整细胞数量至5×104/mL，培养14d后，收集细胞。
流式鉴定：收集培养14d的细胞，PBS洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入PerCP-Cy5.5标记的CD3和FITC标记的CD56抗体对细胞表面标志物进行检测。
2、NK细胞增殖活力测定
收集培养14d的细胞，PBS洗涤，用含5％胎牛血清的NK细胞培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔5000个细胞，24h后，药物组更换为含有50μg/mL或100μg/mLhUC-MSC因子A、B或C、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，对照组更换为仅含有5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，在37℃、5％CO2条件下培养，继续培养48h后，每孔加入20μL的CCK8溶剂，继续培养4h，用酶标仪于450nm处测定各孔吸光值OD，按照公式计算药物组细胞增殖率(％)：
NK细胞增殖率(％)＝(药物组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100％。
3、NK细胞含量测定
收集培养14d的细胞，PBS洗涤，用含5％胎牛血清的NK细胞培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于24孔板中，24h后，药物组更换为含有100μg/mLhUC-MSC因子A、B或C、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，对照组更换为仅含有5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，在37℃、5％CO2条件下培养，继续培养48h后，PBS洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入PerCP-Cy5.5标记的CD3和FITC标记的CD56抗体，检测CD3-CD56+表型细胞(即NK细胞)的含量。
4、流式细胞法检测NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达水平
收集培养14d的细胞，PBS洗涤，用含5％胎牛血清的NK细胞培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于24孔板中，24h后，药物组更换为含有100μg/mLhUC-MSC因子A、B或C、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，对照组更换为仅含有5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，在37℃、5％CO2条件下培养，继续培养48h后，PBS洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入APC-Anti-CD107a，检测CD107a的表达水平。
5、Western blot法检测NK细胞杀伤活性标志分子Granzyme B、Perforin的表达水平
收集培养14d的细胞，PBS洗涤，用含5％胎牛血清的NK细胞培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于24孔板中，24h后，药物组更换为含有100μg/mLhUC-MSC因子A、B或C、5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，对照组更换为仅含有5％胎牛血清的NK细胞培养基继续培养，在37℃、5％CO2条件下培养，继续培养48h后，PBS洗涤，收集细胞，裂解，测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，将凝胶湿转到PVDF膜，5％脱脂牛奶常温封闭2h，4℃下加入Granzyme B、Perforin、GAPDH一抗孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，显色，拍照分析。
6、统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包处理数据，用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
三、试验结果
1、NK细胞的培养和鉴定
流式鉴定结果显示，培养14d后CD3-CD56+表型细胞的比例达到83.75％，如图1所示。而培养前CD3-CD56+表型细胞的比例仅为6.62％。这表明NK细胞已经被成功培养。
2、NK细胞增殖活力测定结果
各组OD值和药物组NK细胞增殖率结果如表1和图2所示，该结果表明，hUC-MSC因子A、B、C可以显著促进NK细胞的增殖，且与hUC-MSC因子A的促增殖效果相比，hUC-MSC因子B、C对NK细胞的体外促增殖效果更显著优异。
表1各组OD值和药物组NK细胞增殖率
3、NK细胞杀伤活性测定结果(流式细胞法)
各组NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达水平如表2和图3所示，该结果表明，hUC-MSC因子A、B、C可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且与hUC-MSC因子A相比，hUC-MSC因子B、C对NK细胞杀伤活性的提高更明显。
表2各组NK细胞杀伤活性标志分子CD107a的表达水平
4、NK细胞杀伤活性测定结果(Westernblot法)
各组NK细胞杀伤活性标志分子Granzyme B、Perforin的表达水平如图4所示，该结果表明，hUC-MSC因子A、B、C可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且与hUC-MSC因子A相比，hUC-MSC因子B、C对NK细胞杀伤活性的提高更明显。
上述试验说明，本发明提供的hUC-MSC因子用于NK细胞体外培养既可以有效提高其增殖活性，又可以有效提高其杀伤活性，因而可以开发成NK细胞体外培养的增效成分。
以上实施例旨在具体介绍本发明的实质性内容，但不应将本发明的保护范围局限于以上具体的实施例。
Claims (9)
1.一种脐带间充质干细胞因子，其特征在于，通过如下方法制备：先将用完全培养基培养的人脐带间充质干细胞经反复冻融获得细胞内容物，再离心、过滤，滤液冷冻干燥即得。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞因子，其特征在于：所述完全培养基为含10％胎牛血清的α-MEM培养基。
3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞因子，其特征在于：所述完全培养基中还含有rhIGF-1或rhIGF-2。
4.根据权利要求1～3任一所述的脐带间充质干细胞因子，其特征在于：所述反复冻融指-80℃冷冻、37℃水浴复苏三个循环。
5.根据权利要求1～3任一所述的脐带间充质干细胞因子，其特征在于：所述离心的条件为4℃、3000rpm离心处理20min。
6.根据权利要求1～3任一所述的脐带间充质干细胞因子，其特征在于：所述过滤指用0.22μm滤器过滤。
7.权利要求1～6任一所述脐带间充质干细胞因子用于NK细胞体外培养的用途。
8.权利要求1～6任一所述脐带间充质干细胞因子用于NK细胞体外培养提高其增殖活性的用途。
9.权利要求1～6任一所述脐带间充质干细胞因子用于NK细胞体外培养提高其杀伤活性的用途。
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|---|---|---|---|---|
| CN112553165A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-26 | 北京双因生物科技有限公司 | 以修饰的msc培养nk细胞的方法 |
| CN112662626A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-04-16 | 广东壹加再生医学研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法 |
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