CN112553165A

CN112553165A - 以修饰的msc培养nk细胞的方法

Info

Publication number: CN112553165A
Application number: CN202011436729.5A
Authority: CN
Inventors: 段海峰; 薛冰华; 于婷婷; 解晶; 张超; 庞如梦; 刘丽华; 陆颖
Original assignee: Beijing Huizhi Chikang Biotechnology Co ltd; Beijing Shuangyin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Huizhi Chikang Biotechnology Co ltd; Beijing Shuangyin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2021-03-26

Abstract

本申请属于细胞培养技术领域，提供了一种使用修饰的MSC细胞培养NK细胞的方法，所述修饰的MSC细胞表达IL‑18和IL‑12；本申请还提供了固定有上述MSC细胞的细胞培养瓶。本申请的方法能够在不加入细胞因子的情况下，经济、简便、高效和大量的扩增NK细胞，NK表型阳性率达80％以上，且并不影响NK细胞的杀伤活性。

Description

以修饰的MSC培养NK细胞的方法

技术领域

本申请属于细胞生物学领域，具体地，本申请提供了一种以修饰的MSC培养NK细胞的方法，其中修饰的MSC表达IL-18和IL-12。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

目前，NK细胞培养存在两种培养方式：第一种方式是将人白血病肿瘤细胞K562用钴60照射后做成滋养层细胞进行培养方式，该种培养方式的价格相对便宜，但由于在培养过程中选用的滋养层细胞为肿瘤细胞，使用者对此种培养方式实际是心存排斥的。尽管从理论上讲，经过相应处理的肿瘤细胞已经不再具备增殖的可能性，但其潜在风险难以证明可以完全排除。另外，就是伦理方面的问题，将正常细胞与肿瘤细胞共培养，然后将培养后的NK细胞回输体内，确实存在难以克服的伦理障碍。正如上述原因，确实制约了滋养层培养技术的推广。第二种方式是将多种细胞因子混合后的纯因子细胞培养方式，纯因子细胞培养技术以其安全性高而著称，其原因在于所使用的细胞因子，都是体内环境原本就存在的。培养过程相当于模拟体内环境，促进NK细胞的激活及大量增殖，但其缺点是成本过高，且培养效果不稳定，不是所有样本的培养结果都让人满意，总是有某些样本的细胞数量少或者NK表型低。

发明内容

针对以上问题，申请人发展了一种以修饰的MSC培养NK细胞的方法，其中修饰的MSC表达IL-18和IL-12；为了提高活性对IL18进行了突变，IL12两个亚基用GS Linker连接成单链，IL18和IL12用T2A连接；此外还提供了使用前述MSC制备的细胞培养瓶。

一方面，本申请提供了一种修饰的MSC细胞，其特征在于，所述MSC细胞表达IL-18和IL-12。

进一步地，所述IL-18和IL-12的蛋白序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3或其变体。

进一步地，IL12两个亚基用GS Linker连接成单链。

进一步地，所述MSC中IL-18和IL-12的融合基因序列为SEQ ID NO.5。

进一步地，所述MSC为脂肪MSC或脐带MSC。

另一方面，本申请提供了一种细胞培养瓶，其包含前述MSC细胞。

进一步地，所述培养瓶中的MSC细胞被固定形成饲养层。

进一步地，使用无水乙醇进行所述固定。

另一方面，本申请提供了使用上述MSC或培养瓶培养NK细胞的方法。

另一方面，本申请提供了制备前述MSC细胞的方法，包括：构建IL18和IL12载体；制备慢病毒颗粒；感染MSC细胞。

本申请中MSC细胞的构建过程中使用的分子生物学技术为本领域技术人员熟知的常规技术，本领域技术人员可以从诸如《分子克隆》，萨姆布鲁克，科学出版社等著作中获得，也可以查阅相关文献或使用现有的引物设计、蛋白功能预测等工具软件。

本申请中的IL-18和IL-12序列不限于本申请中列出的种类，本领域技术人员可以从Genbank等网站获得各种不如动物白介素序列并常识将其用于本申请的方法，也可以以蛋白领域的现有知识和功能预测方法/软件从上述序列获得变体序列。所述变体序列与亲本序列享有一定的序列同一性，如70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，99％以上，并且具备与亲本序列基本相同的功能。

本申请中的细胞培养瓶不限于瓶形状的容器，其他形状的细胞培养工具，如平板形，杯形，培养罐等也在本申请保护范围之内。

本领域技术人员可以根据适合的来源或者所需的功能获得MSC，MSC来源包括但不限于脂肪，骨髓，脐带等，制备方法如物理处理，悬浮，解离，离心等操作可参阅细胞学相关实验工具书。

本发明的优势在于能够在不加入细胞因子的情况下，经济、简便、高效和大量的扩增NK细胞，NK表型阳性率达80％以上，且并不影响NK细胞的杀伤活性。

附图说明

图1为表达IL18和IL12的质粒图谱；

图2为NK细胞计数，固定和未固定饲养层细胞对比；

图3为流式检测NK细胞表型，实验组1是未固定饲养层细胞，实验组2是固定后饲养层细胞；

图4为NK细胞计数，饲养层细胞刺激培养1次和刺激培养2次对比；

图5为流式检测NK细胞表型，细胞激活不同次数；

图6为NK细胞计数；

图7为流式检测NK细胞表型；

图8为NK细胞对K562的杀伤效率。

具体实施方式

本部分中琼脂糖购自Biowest，DNA电泳marker购自天根生化科技(北京)有限公司，PCR扩增体系购自宝日医生物技术(北京)有限公司，DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶BamHI和EcoRI购自NEB，T4 DNA连接酶购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司，序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司公司进行。

实施例1IL18-IL12融合基因及其重组质粒

(1)IL18mut基因、IL12p35基因和IL12p40基因经由中美泰和生物技术(北京)有限公司全基因合成。第一步构建pCDH-EF1-IL12载体，第二步构建pCDH-EF1-IL18-IL12载体。

(2)pCDH-EF1-IL12p35p40载体构建方法

A.载体：用NotI和SaII双酶切载体pCDH-EF1，3ug，37℃3h，直接纯化回收。备注：该载体应该有已经酶切好的，可以直接用。载体大小约为7100bp。

B.PCR spIL12片段，原始质粒pcDNA3.4-IL12p40，模板100ng

用Ex Taq酶，退火57℃

Primer F：EF1-NotI-Kozak-spIL12-F(320)，Tm＝64℃

Primer R：spIL12-IL12p35-R(322)，Tm＝62℃

胶回收123bp左右片段

C.PCR IL12p35片段，原始质粒pcDNA3.4-IL18-Fc-IL12p35，模板100ng

用Ex Taq酶，退火52℃

Primer F：spIL12-IL12p35-F(321)，Tm＝63℃

Primer R：IL12p35-Linker-R(323)，Tm＝57℃

胶回收648bp左右片段

D.PCR IL12p40片段，原始质粒pcDNA3.4-IL12p40为模板，模板100ng

用Ex Taq酶，退火52℃

Primer F：Linker-IL12p40-F(324)，Tm＝57℃

Primer R：IL12p40-SalI-WPRE-R(325)，Tm＝57℃

胶回收977bp片段

E.用中美泰和2X mix重组连接，载体、spIL12片段、IL12p35片段和IL12p40片段

F.菌落PCR用引物：

Primer F：spIL12-IL12p35-F(321)，Tm＝63℃

Primer R：IL12p35-Linker-R(323)，Tm＝57℃

片段大小：648bp

G.测序引物：EF1通用引物PEF-F(正向测序)和自行设计的pCDH-down(16，反向测序)

H.正确测序后保存菌种，大提质粒。

(3)pCDH-EF1-IL18mut-IL12p35p40载体构建方法

A.载体：用NotI单酶切载体pCDH-EF1-IL12p35p40，3ug，37℃过夜酶切，直接纯化回收。载体大小约为8765bp。

B.PCR IL18片段，原始质粒XJ提供，待定，模板100ng

用Ex Taq酶，退火51℃

Primer F：EF1-NotI-Kozak-IL18-F(326)，Tm＝64℃

Primer R：IL18-T2A-R(328)，Tm＝56℃

胶回收600bp左右片段

C.PCR T2A片段，原始质粒有T2A片段的都可以，模板100ng

用Ex Taq酶，退火52℃

Primer F：IL18-T2A-F(327)，Tm＝59℃

Primer R：T2A-IL12p35p40-R(329)，Tm＝57℃

胶回收106bp左右片段

D.用中美泰和2X mix重组连接，载体、IL18片段和T2A

菌落PCR用引物：(此步也可视情况直接送菌落测序)

F：EF1-NotI-Kozak-IL18-F(326)，Tm＝81℃

R：T2A-IL12p35p40-R(329)，Tm＝70℃

片段大小：706bp

E.测序引物：EF1通用引物PEF-F(正向测序)

F.正确测序后保存菌种，大提质粒，质粒图谱如图1所示。

所用IL-8的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；IL-12的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；融合基因序列为SEQ ID NO.5。

实施例2制备携带IL18-IL12的重组慢病毒

(1)从液氮中取出1支冻存的293T细胞(购自ATCC)迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。培养过程中，待细胞汇合度达90％以上时，进行传代培养，弃去旧培养基，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去PBS溶液，加入2ml0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来；加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬。每个包被过的150mm培养皿细胞接种1.2×10⁷个细胞用于包装慢病毒，37℃、5％CO₂饱和湿度培养，20ml培养基/皿。

其中，293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)来源于Gibco，PBS溶液购自Gibco，Trypsin-EDTA消化液购自Gibco。

(2)转染前2小时，将293T细胞培养基更换为18ml DMEM培养基，向A灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，按照1:2:3的质量比例加入包膜质粒PMD.2G、包装质粒PSPAX和实施例1中制备的重组质粒的混合物，吹打混匀；向B灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，然后加入162μl转染试剂PEI，混合均匀；A管和B管在室温下温育5min；将B管中的液体成滴的加入到A管中，混合均匀，室温孵育10min，以便形成DNA-转染试剂复合物。将DNA-转染试剂复合物转移至预先换液的293T细胞中，混匀，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。换液后分别在24h和48h收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。

其中，DMEM培养基购自Gibco，包膜质粒PMD.2G、包装质粒PSPAX购自Addgene，所述转染试剂PEI购自Polysciences，FBS购自Bioind。

(3)将上述收集的上清液4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，采用孔径为0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的重组慢病毒与5X PEG混匀，4℃放置24小时后，4℃3000rpm离心30min，弃上清，将沉淀重悬至500μl DMEM培养基中。

实施例3制备IL18-IL12修饰的间充质干细胞

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞，按照以下步骤进行：

将正常分娩的人离体脐带放入PBS缓冲液(含有200U/ml青霉素和200U/ml链霉素)中，用注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，再将小块脐带组织用200目滤网过滤，收集滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1～1.5mm的组织块；将组织块直接接种在培养瓶中，放置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，静置1～2小时；待组织块贴壁牢固后，添加含10％胎牛血清的α-MEM培养液，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养，待脐带组织间充质干细胞增生至铺满培养瓶的约80％时，加入0.25％胰蛋白酶(含0.01％EDTA)消化，得到原代细胞。

脐带组织块爬片法分离培养MSC，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆。

复苏预先冻存的P3代间充质干细胞至一个150mm培养皿，20ml无血清培养基37℃、5％CO₂饱和湿度培养。待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用间充质干细胞无血清培养基(购自Bioind)重悬。每个150mm培养皿细胞接种2×10⁶细胞，接种后的第二天吸取细胞的培养基弃掉，更换为无血清的α-MEM培养基，20ml培养基/皿，加入16μl聚凝胺Polybrene(购自Sigma)，按照40MOIs感染复数加入重组IL18-IL12慢病毒(滴度为1×10⁸U/ml)，37℃、5％CO₂饱和湿度培养7h。7小时后弃掉含有病毒的α-MEM培养基(购自Gibco)，更换为无血清培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度继续培养3天。

待细胞长满，收取细胞上清用ELISA检测IL18和IL12因子的表达量。然后细胞用PBS清洗后，用0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用无血清培养基重悬，按照1:6的传代比例进行传代，无血清培养基37℃、5％CO2培养3天，获得稳定表达IL18和IL12的重组间充质干细胞。

实施例3以修饰的MSC培养NK细胞

制备IL18-IL12饲养层

选择培养至P5代细胞，待细胞汇合度达90％以上时，向细胞培养液中加入工作浓度为20ug/ml的丝裂霉素C处理2h，然后用PBS清洗三次，用0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，将细胞按照需求量进行冻存。

制备IL18-IL12饲养层包被的培养瓶

用MSC培养基复苏冻存好的IL18-IL12饲养层细胞到细胞培养瓶中，调整细胞密度为细胞贴壁伸展后达到80％的汇合度，37℃、5％CO2饱和湿度过夜培养。第二天用PBS清洗细胞三次，然后加入无水乙醇处理细胞5分钟。之后弃掉无水乙醇，用PBS清洗细胞三次，最后加入少量PBS至包被好的培养瓶中。包被好的培养瓶放置在4度备用。非固定包被瓶细胞不可用无水乙醇处理，在培养NK细胞的前一天复苏饲养层细胞。

NK细胞扩增

(1)将50ml抗凝外周血移至50ml离心管中，700g离心，吸取上层血浆至另一离心管中，备用。利用血浆体积的0.5倍的生理盐水稀释血浆，获得稀释血液。将稀释血液用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞PBMCs。

(2)验证固定和非固定IL18-IL12饲养层的效果：将分离得到的PBMC置于固定和固定和非固定的包被瓶中进行培养。在培养细胞前，弃去包被瓶中的液体，用PBS清洗细胞三次，然后调整细胞密度为2*10⁶/ml接种于不同的包被瓶中，细胞培养液为VIVO-X15+5％FBS+1000ul IL2，置于37℃，2％CO₂培养箱中培养3天。从第四天开始对细胞计数后，转移至新的包被瓶中进行培养，细胞密度为1*10⁶/ml。之后继续培养，每天进行计数、补液和传代，最终使得细胞密度在0.6×10⁵/ml。在第11天到12天收集细胞，进行检测。如附图2和附图3所示，结果显示和未固定的饲养层细胞培养细胞相比，固定的饲养层细胞培养NK细胞可以培养获得更得的NK细胞，且NK细胞纯度也最好。

(3)验证1次刺激和2次刺激NK细胞的效果：将分离得到的PBMC置于固定的包被瓶中进行培养。在培养细胞前，弃去包被瓶中的液体，用PBS清洗细胞三次，然后调整细胞密度为2*10⁶/ml接种于包被瓶中，细胞培养液为VIVO-X15+5％FBS+1000ul IL2，置于37℃，2％CO₂培养箱中培养3天。第四天对细胞进行计数，然后根据细胞量对培养瓶进行补液，调整细胞密度为1*10⁶/ml。第五天对细胞计数后，转移至新的包被瓶中进行培养，细胞密度为1*10⁶/ml。之后继续培养，每天进行计数、补液和传代，最终使得细胞密度在0.6×10⁵/ml。在第11天到12天收集细胞，进行检测。如附图4和附图5所示，结果显示饲养层细胞刺激培养1次和刺激培养2次无显著区别，培养获得的NK细胞纯度也无显著差异。(4)流程化NK细胞培养：将分离得到的PBMC置于固定的包被瓶中进行培养。在培养细胞前，弃去包被瓶中的液体，用PBS清洗细胞三次，然后调整细胞密度为2*10⁶/ml接种于包被瓶中，细胞培养液为VIVO-X15+5％FBS+1000ul IL2，置于37℃，2％CO2培养箱中培养3天。第四天对细胞进行计数，然后根据细胞量对培养瓶进行补液，调整细胞密度为1*10⁶/ml。第五天对细胞计数后，转移至新的包被瓶中进行培养，细胞密度为1*10⁶/ml。之后继续培养，每天进行计数、补液和传代，最终使得细胞密度在0.6×10⁵/ml。在第11天到12天收集细胞，进行检测。如附图6和附图7所示，利用携带IL18和IL12的MSC细胞作为饲养层细胞培养NK细胞，其获得的NK细胞在数量和纯度上都要远高于传统培养方法培养获得的NK细胞。

(5)对照组细胞细胞就按照标准的细胞因子扩增NK细胞的方法进行。

以K562细胞(人慢性骨髓性白血病细胞系)作为靶细胞，对照组(传统因子培养)和实验组(本专利方法)的NK作为效应细胞，将靶细胞按照密度5000个/ml接种96孔板，每孔100μl，按照1:1，5:1，10:1和20:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，同时加入CCK8(碧云天)试剂，置于5％CO2，37℃培养箱连续培养4h，在450nm波长下读数，计算杀伤效率。结果如图8所示，结果表明，和对照组相比本专利培养得到的NK细胞具有良好的肿瘤杀伤活性。

序列表

<110> 北京双因生物科技有限公司北京汇智驰康生物科技有限公司

<120> 以修饰的MSC培养NK细胞的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 1

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys

20 25 30

Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln

35 40 45

Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp

50 55 60

Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln

65 70 75 80

Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser

85 90 95

Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro

100 105 110

Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg

115 120 125

Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr

130 135 140

Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr

165 170 175

Val Gln Asn Glu Asp

180

<210> 2

<211> 543

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 2

atgccgtctt ctgtctcgtg gggcatcctc ctgctggcag gcctgtgctg cctggtccct 60

gtctccctgg cttactttgg caagcttgaa tctaaattat cagtcataag aaatttgaat 120

gaccaagttc tcttcattga ccaaggaaat cggcctctat ttgaagatat gactgattct 180

gactgtagag ataatgcacc ccggaccata tttattataa gtatgtataa agatagccag 240

cctagaggta tggctgtaac tatctctgtg aagtgtgaga aaatttcaac tctctcctgt 300

gagaacaaaa ttatttcctt taaggaaatg aatcctcctg ataacatcaa ggatacaaaa 360

agtgacatca tattctttca gagaagtgtc ccaggacatg ataataagat gcaatttgaa 420

tcttcatcat acgaaggata ctttctagct tgtgaaaaag agagagacct ttttaaactc 480

attttgaaaa aagaggatga attgggggat agatctataa tgttcactgt tcaaaacgaa 540

gac 543

<210> 3

<211> 540

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 3

Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ala Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro

20 25 30

Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val

35 40 45

Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys

50 55 60

Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser

65 70 75 80

Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys

85 90 95

Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala

100 105 110

Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr

115 120 125

Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys

130 135 140

Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu

145 150 155 160

Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr

165 170 175

Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys

180 185 190

Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr

195 200 205

Ile Asp Arg Val Thr Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys

225 230 235 240

Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu

245 250 255

Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp

260 265 270

Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr

275 280 285

Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys

290 295 300

Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu

305 310 315 320

Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys

325 330 335

Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe

340 345 350

Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val

355 360 365

Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala

370 375 380

Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu

385 390 395 400

Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu

405 410 415

Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr

420 425 430

Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp

435 440 445

Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val

450 455 460

Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr

465 470 475 480

Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu

485 490 495

Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys

500 505 510

Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser

515 520 525

Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

530 535 540

<210> 4

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 4

atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60

gtggccgcta acctccccgt ggccactcca gacccaggaa tgttcccatg ccttcaccac 120

tcccaaaacc tgctgagggc cgtcagcaac atgctccaga aggccagaca aactctagaa 180

ttttaccctt gcacttctga agagattgat catgaagata tcacaaaaga taaaaccagc 240

acagtggagg cctgtttacc attggaatta accaagaatg agagttgcct aaattccaga 300

gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 360

gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 420

atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 480

gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 540

tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 600

gctttcagaa ttcgggcagt gactattgac agagtgacga gctatctgaa tgcttccggt 660

ggtggtggct ccggaggcgg cggctctggt ggcggtggca gcatatggga actgaagaaa 720

gatgtttatg tcgtagaatt ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc 780

acctgtgaca cccctgaaga agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc 840

ttaggctctg gcaaaaccct gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac 900

acctgtcaca aaggaggcga ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa 960

gatggaattt ggtccactga tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt 1020

ctaagatgcg aggccaagaa ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc 1080

agtactgatt tgacattcag tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg 1140

acgtgcggag ctgctacact ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag 1200

tactcagtgg agtgccagga ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt 1260

gaggtcatgg tggatgccgt tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc 1320

atcagggaca tcatcaaacc tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat 1380

tctcggcagg tggaggtcag ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac 1440

ttctccctga cattctgcgt tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga 1500

gtcttcacgg acaagacctc agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg 1560

cgggcccagg accgctacta tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt 1620

<210> 5

<211> 2217

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgccgtctt ctgtctcgtg gggcatcctc ctgctggcag gcctgtgctg cctggtccct 60

gtctccctgg cttactttgg caagcttgaa tctaaattat cagtcataag aaatttgaat 120

gaccaagttc tcttcattga ccaaggaaat cggcctctat ttgaagatat gactgattct 180

gactgtagag ataatgcacc ccggaccata tttattataa gtatgtataa agatagccag 240

cctagaggta tggctgtaac tatctctgtg aagtgtgaga aaatttcaac tctctcctgt 300

gagaacaaaa ttatttcctt taaggaaatg aatcctcctg ataacatcaa ggatacaaaa 360

agtgacatca tattctttca gagaagtgtc ccaggacatg ataataagat gcaatttgaa 420

tcttcatcat acgaaggata ctttctagct tgtgaaaaag agagagacct ttttaaactc 480

attttgaaaa aagaggatga attgggggat agatctataa tgttcactgt tcaaaacgaa 540

gacgagggca gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctatg 600

tgtcaccagc agttggtcat ctcttggttt tccctggttt ttctggcatc tcccctcgtg 660

gccgctaacc tccccgtggc cactccagac ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc 720

caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt 780

tacccttgca cttctgaaga gattgatcat gaagatatca caaaagataa aaccagcaca 840

gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag 900

acctctttca taactaatgg gagttgcctg gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc 960

ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg 1020

aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg cagatctttc tagatcaaaa catgctggca 1080

gttattgatg agctgatgca ggccctgaat ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc 1140

tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct 1200

ttcagaattc gggcagtgac tattgacaga gtgacgagct atctgaatgc ttccggtggt 1260

ggtggctccg gaggcggcgg ctctggtggc ggtggcagca tatgggaact gaagaaagat 1320

gtttatgtcg tagaattgga ttggtatccg gatgcccctg gagaaatggt ggtcctcacc 1380

tgtgacaccc ctgaagaaga tggtatcacc tggaccttgg accagagcag tgaggtctta 1440

ggctctggca aaaccctgac catccaagtc aaagagtttg gagatgctgg ccagtacacc 1500

tgtcacaaag gaggcgaggt tctaagccat tcgctcctgc tgcttcacaa aaaggaagat 1560

ggaatttggt ccactgatat tttaaaggac cagaaagaac ccaaaaataa gacctttcta 1620

agatgcgagg ccaagaatta ttctggacgt ttcacctgct ggtggctgac gacaatcagt 1680

actgatttga cattcagtgt caaaagcagc agaggctctt ctgaccccca aggggtgacg 1740

tgcggagctg ctacactctc tgcagagaga gtcagagggg acaacaagga gtatgagtac 1800

tcagtggagt gccaggagga cagtgcctgc ccagctgctg aggagagtct gcccattgag 1860

gtcatggtgg atgccgttca caagctcaag tatgaaaact acaccagcag cttcttcatc 1920

agggacatca tcaaacctga cccacccaag aacttgcagc tgaagccatt aaagaattct 1980

cggcaggtgg aggtcagctg ggagtaccct gacacctgga gtactccaca ttcctacttc 2040

tccctgacat tctgcgttca ggtccagggc aagagcaaga gagaaaagaa agatagagtc 2100

ttcacggaca agacctcagc cacggtcatc tgccgcaaaa atgccagcat tagcgtgcgg 2160

gcccaggacc gctactatag ctcatcttgg agcgaatggg catctgtgcc ctgcagt 2217

Claims

1.一种修饰的MSC细胞，其特征在于，所述MSC细胞表达IL-18和IL-12。

2.根据权利要求1的MSC细胞，所述IL-18和IL-12的蛋白序列分别为SEQ ID NO.1和SEQID NO.3或其变体。

3.根据权利要求2的MSC细胞，其中IL12两个亚基用GS Linker连接成单链。

4.根据权利要求2或3的MSC细胞，所述MSC中IL-18和IL-12的融合基因序列为SEQ IDNO.5。

5.根据权利要求1-4任一项的MSC细胞，其中所述MSC为脂肪MSC或脐带MSC。

6.一种细胞培养瓶，其包含根据权利要求1-5任一项的MSC细胞。

7.根据权利要求6的细胞培养瓶，所述培养瓶中的MSC细胞被固定形成饲养层。

8.根据权利要求7的细胞培养瓶，其中使用无水乙醇进行所述固定。

9.使用根据权利要求1-4任一项的MSC细胞或者根据权利要求6-8任一项的培养瓶培养NK细胞的方法。

10.制备根据权利要求1-4任一项的MSC细胞的方法，包括：构建IL18和IL12载体；制备慢病毒颗粒；感染MSC细胞。