CN110494557A - 用于离体扩增和活化自然杀伤细胞的刺激细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来源于永生化/癌细胞的基因工程细胞群，其不表达MHC I类分子但被修饰以表达膜结合IL‑15、膜结合4‑1BBL配体和至少一种其他膜结合分子，例如白细胞介素或抗CD3抗体。所述细胞与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。来自混合细胞培养物与刺激细胞系的共培养的经扩增NK细胞群可用于治疗癌症或感染性疾病的方法。在一个单独的实施方案中，提供了用于制备该工程细胞群的多种核酸。

Description

用于离体扩增和活化自然杀伤细胞的刺激细胞系

相关申请

本申请要求2017年3月27日提交的美国临时申请No.62/477,311的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

许多疾病出现和持续存在的特征在于对异常细胞(包括恶性和病毒感染的细胞)的不足的免疫应答。免疫治疗是使用和操纵患者的免疫系统来治疗多种疾病。

发明概述

免疫治疗呈现了在疾病的治疗中的新的技术进步，其中免疫细胞经改造以表达特异性识别患病或受损细胞并与其反应的某些靶向和/或效应分子。这代表了有希望的进步，至少部分是由于特异性靶向患病或受损细胞的潜力，其与其中影响所有细胞的更传统的方法(例如化疗)相反，并且期望的结果是足够的健康细胞存活以使患者活着。目前正在开发使用将自然杀伤(NK)细胞过继转移给患者的免疫治疗方法。然而，这种治疗需要适合遗传操作和临床应用的大量离体纯NK细胞。本文中公开了用于从混合细胞培养物中离体扩增和活化NK细胞的方法和组合物(及其用途)。

本文中提供了用于扩增和活化NK细胞的多种工程细胞类型、DNA构建体和方法。例如，在多个实施方案中，提供了不表达主要组织相容性复合物(major histocompatibilitycomplex，MHC)I分子的基因工程细胞群，其中所述工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。在多个实施方案中，工程细胞群来源于永生的细胞系。例如，在培养中表现出永生细胞的一种或更多种特征的细胞系。在多个实施方案中，工程细胞群来源于天然永生的细胞系(例如干细胞系)。在多个实施方案中，工程细胞群来源于永生化(例如，癌细胞)系。在一些实施方案中，工程细胞群来源于已通过工程化(例如经基因工程化以改变端粒酶表达)而永生化的细胞。在一些实施方案中，工程细胞群来源于癌细胞。在多个实施方案中，工程细胞群被修饰以表达促进和/或增强NK细胞活化和/或扩增的一种或更多种膜结合因子。例如，在多个实施方案中，工程细胞表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)。在另外一些实施方案中，除了mbIL15或代替mbIL15，工程细胞群被修饰以表达膜结合4-1BB配体(4-1BBL)。在另一些实施方案中，除了或代替mbIL15、4-1BBL和/或其他活化/扩增促进因子，工程细胞群被修饰以表达至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合白细胞介素。

在一些实施方案中，工程细胞群至少包含表达mbIL15的第一多个细胞和表达4-1BBL的第二多个细胞，使得所述群整体表达mbIL15和4-1BBL二者。在另一些实施方案中，工程细胞群包含表达mbIL15和4-1BBL二者的多个细胞。在另一些实施方案中，工程细胞群包含表达mbIL15的一些细胞，表达4-1BBL的一些细胞，以及表达这二者的一些细胞。在一些实施方案中，除了或代替mbIL15和/或4-1BBL，可另外地表达其他配体和/或活化因子。

在多个实施方案中，由工程细胞群表达的mbIL15由包含SEQ ID NO.1的核酸序列编码。在多个实施方案中，由工程细胞群表达的4-1BBL由包含SEQ ID NO.13的核酸序列编码。

根据该实施方案，每个膜结合分子与跨膜结构域偶联。在多个实施方案中，人CD8α的跨膜结构域用于将分子连接至膜。在多个实施方案中，人CD8α的跨膜结构域包含SEQ IDNO.18的序列。根据该实施方案，还使用其他跨膜结构域，例如，可使用已知存在于细胞膜中或跨细胞膜的其他受体或信号传导结构域(任选地截短的)。

在多个实施方案中，工程细胞群来源于选自以下的细胞系：K562细胞、肾母细胞瘤(Wilms tumor)细胞系HFWT、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑素瘤细胞系HMV-II、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130或Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB19或NB69、胚胎癌睾丸细胞系NEC14、宫颈癌细胞系TCO-2和神经母细胞瘤细胞系TNB1。在多个实施方案中，整体群来源于上文(或其他)的两种或更多种细胞系并组合以产生使得能够出人意料地增强免疫细胞(例如NK细胞)的活化/扩增的细胞群。

在多个实施方案中，工程细胞群缺少MHC II分子的表达。在多个实施方案中，工程细胞群来源于K562细胞。

根据该实施方案，如本文中所公开的工程细胞群表达一种或更多种白细胞介素分子。在多个实施方案中，白细胞介素包含IL12A或其片段。在多个实施方案中，IL12A包含SEQID NO.4的序列(或其片段)。在一个实施方案中，白细胞介素包含IL12B或其片段。在一个实施方案中，IL12B包含SEQ ID NO.6的序列(或其片段)。在多个实施方案中，白细胞介素包含IL12A和IL12B或其片段。在这样的一些实施方案中，IL12A和IL12B在多核苷酸中的方向可以是：在二次重复、三次重复或更大重复中为A-B、B-A、A-B-A-B、A-B-B-A、B-A-A-B方向。

在多个实施方案中，工程细胞群还表达膜结合IL18(mbIL18)或其片段。在多个实施方案中，IL18包含SEQ ID NO.8的序列。在另一些实施方案中，工程细胞群还表达膜结合IL21(mbIL21)或其片段。在一个实施方案中，IL21包含SEQ ID NO.10的序列或其片段。

在多个实施方案中，细胞表达膜结合IL22(mbIL22)或其片段。在一个实施方案中，IL22包含SEQ ID NO.12的序列或其片段。如上所讨论，可以以多种组合、重复、三联体等表达各种白细胞介素的组合。在多个实施方案中，多核苷酸中这种重复的表达模式产生了出人意料地增强的NK细胞活化和/或扩增。

在多个实施方案中，工程细胞还可包含膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)、其抗体片段或scFv。在一个实施方案中，mbα-CD3是单克隆抗体。在多个这样的一些实施方案中，mbα-CD3靶向SEQ ID NO.15的CD3ε核酸序列内的表位。在另一些实施方案中，mbα-CD3是scFv。在一个实施方案中，scFv包含SEQ ID NO.17的序列。

如下文更详细讨论的，本文中还提供了用于扩增免疫细胞的方法，所述方法包括将包含免疫细胞的血液样品与本文中公开的任何工程细胞群共培养。在多个实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。

根据多个实施方案，提供了来源于癌细胞的基因工程细胞群，其中工程细胞群被修饰以表达以下的一种、两种或更多种：膜结合白细胞介素-15(mbIL15)、膜结合4-1BB配体(4-1BBL)和至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合白细胞介素，并且其中工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。在多个实施方案中，基因工程细胞群不表达主要组织相容性复合物(MHC)I分子。

在多个实施方案中还提供了不表达主要组织相容性复合物(MHC)I分子的基因工程细胞群，工程细胞群来源于癌细胞，工程细胞群被修饰以表达mbIL15、4-1BBL、刺激免疫细胞活化的膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)，并且其中工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。

在多个实施方案中，工程细胞被修饰以表达包含IL12A或其片段的另外的膜结合白细胞介素。在一个实施方案中，膜结合IL12A包含SEQ ID NO.4的序列。在一个实施方案中，膜结合IL12A具有SEQ ID NO.4的序列。在多个实施方案中，另外的膜结合白细胞介素包含IL12B或其片段。在一个实施方案中，膜结合IL12B包含SEQ ID NO.6的序列。在一个实施方案中，膜结合IL12B具有SEQ ID NO.6的序列。在多个实施方案中，另外的膜结合白细胞介素包含膜结合IL12A和膜结合IL12B或其片段。另外，工程细胞的任何这样的实施方案还可包含膜结合IL18(mbIL18)或其片段的表达。在一个实施方案中，膜结合IL18包含SEQ IDNO.8的序列。在一个实施方案中，膜结合IL18具有SEQ ID NO.8的序列。

在另一些实施方案中，工程细胞表达膜结合IL21(mbIL21)或其片段。在多个实施方案中，膜结合IL21具有SEQ ID NO.10的序列或其片段。无论是与IL21组合还是单独使用，多个实施方案提供了表达膜结合IL22(mbIL22)或其片段的工程细胞。在多个实施方案中，膜结合IL22具有SEQ ID NO.12的序列或其片段。

另外，多个实施方案提供了表达膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)、其抗体片段或单链片段可变(scFv)构建体的工程细胞。在一个实施方案中，mbα-CD3是单克隆抗体。在多个实施方案中，mbα-CD3靶向T细胞受体的CD3部分的核酸序列内的表位。例如，在一个实施方案中，膜结合抗CD3抗体靶向CD3受体的δ、ε或γ亚基中的一种或更多种。在一个实施方案中，工程细胞上表达的膜结合抗体靶向SEQ ID NO.15的CD3受体ε亚基。在多个实施方案中，mbα-CD3是scFv。在一个实施方案中，scFv包含SEQ ID NO.17的序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施方案中，scFv具有SEQ ID NO.17的序列。

另外，在多个实施方案中，提供了刺激细胞(stimulatory cell)，其被改造以表达对IL15具有高亲和力的IL15受体的α亚基，允许其吞噬并在细胞表面上呈递可溶性IL15。根据该实施方案，还可使用任何其他白细胞介素或抗体的组合，以基本上允许刺激细胞的模块化改造，其提供了NK细胞的出人意料地优异的扩增和活化。

在多个实施方案中，工程细胞群来源于包括但不限于以下的细胞系：K562细胞、肾母细胞瘤细胞系HFWT、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑素瘤细胞系HMV-II、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130或Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB19或NB69、胚胎癌睾丸细胞系NEC14、宫颈癌细胞系TCO-2和神经母细胞瘤细胞系TNB1。在多个实施方案中，工程细胞缺少MHC II分子的表达。在多个实施方案中，工程细胞来源于K562细胞。

根据该实施方案，膜结合分子通过与跨膜结构域偶联而被赋予与细胞表面结合的能力。术语“跨膜”应被给予其普通含义，并且应指嵌入细胞膜中的多肽(例如，结构域)的至少一部分。在另一些实施方案中，至少一个膜结合分子可与单个跨膜结构域偶联。另外，在多个实施方案中，多种类型或多个拷贝的膜结合分子可与跨膜结构域偶联。另外，在多个实施方案中，多种类型或多个拷贝的跨膜结构域可与膜结合分子偶联。在多个实施方案中，膜结合分子与人CD8α的跨膜结构域偶联。在多个实施方案中，人CD8α的跨膜结构域包含SEQID NO.18的序列。在多个实施方案中，人CD8α的跨膜结构域具有SEQ ID NO.18的序列。在多个实施方案中，mbIL15由SEQ ID NO.1的核酸编码。在多个实施方案中，mb4-1BBL由SEQ IDNO.13的核酸编码。在多个实施方案中，mbIL15由核酸序列编码，所述核酸序列包含SEQ IDNO.1的序列，基本上由其组成或由其组成。在多个实施方案中，mb4-1BBL由核酸序列编码，所述核酸序列包含SEQ ID NO.13的序列，基本上由其组成或由其组成。

在多个实施方案中，本文中提供的工程细胞群适合于免疫细胞的扩增和/或活化。如本文中所用，细胞的“扩增”被给予其普通含义，并且是指来自初始细胞群的特征细胞类型的数量的提高，其可相同或不同。用于扩增的初始细胞不必与由扩增产生的细胞相同。例如，可通过初始工程细胞群的生长和分化来产生经扩增的细胞。如本文中所用，免疫细胞的“活化”是指免疫细胞响应并在可测量的水平上表现出本领域技术人员已知的相应细胞的免疫功能的能力。测量免疫细胞活性的方法也是本领域技术人员已知的。本文中所用的“免疫细胞”被给予其普通含义，并且包括可测定的免疫系统的任何细胞，包括但不限于B淋巴细胞(也称为B细胞)、T淋巴细胞(也称为T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯细胞、干细胞、树突细胞、外周血单个核细胞、肿瘤浸润(TIL)细胞、经基因修饰的免疫细胞(包括杂交瘤)、经药物修饰的免疫细胞，以及上述细胞类型的衍生物、前体或祖细胞。在多个实施方案中，经扩增和/或活化的免疫细胞是NK细胞。如本文中所用，术语“自然杀伤细胞”(“NK细胞”)被给予其普通含义，并且是指免疫系统的细胞毒性淋巴细胞类型，其提供对病毒感染的细胞的迅速响应和对经转化细胞的响应。通常来说，免疫细胞检测由感染细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的病原体的肽，引发细胞因子释放，引起裂解或凋亡。然而，NK细胞是独特的，因为其具有识别受胁迫细胞(stressed cell)的能力，无论来自病原体的肽是否存在于MHC分子上。在一些方面，NK细胞是哺乳动物NK细胞。“哺乳动物的”或“哺乳动物”的实例包括灵长类动物(例如人)、犬类、猫类、啮齿动物、猪、反刍动物等。具体实例包括人、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、兔、豚鼠、大鼠和小鼠。在一个特定的方面，哺乳动物NK细胞是人NK细胞。

在多个实施方案中，扩增和/或活化包括将包含NK细胞的血液样品(例如外周血样品)与本文中提供的一种工程细胞群共培养。

在多个实施方案中，本文中提供的工程细胞群可通过包括以下的方法制备：用编码mbIL15的第一构建体转导细胞，从而产生第一经转导的细胞群，扩增第一经转导的细胞群，用编码4-1BBL的第二构建体转导第一经转导的细胞群，从而产生第二经转导的细胞群，用编码至少一种能够刺激免疫细胞的另外的分子的第三构建体转导第二经转导的细胞群，从而产生第三经转导的细胞群，以及扩增第三经转导的细胞群。在多个实施方案中，本文中提供的工程细胞群可通过用编码mbIL15的第一构建体、编码4-1BBL的第二构建体和编码至少一种能够刺激免疫细胞的另外的分子的第三构建体同时转导细胞群来制备。在另一些实施方案中，本文中提供的工程细胞群可通过用编码mbIL15、4-1BBL和至少一种能够刺激免疫细胞的另外的分子的单构建体转导细胞群来制备。

另外，在多个实施方案中，工程细胞群可通过包括用编码mbIL15、4-1BB，以及mbIL12A、mbIL12B、mbIL18、mbIL21、mbIL22和mbα-CD3或其片段中的一种或更多种的构建体转导细胞的方法来制备。

还提供了用于产生本文中公开的工程细胞群的多种核酸，其包含来自包含以下的核酸组的至少3种：编码mbIL15的核酸、编码4-1BBL的核酸、编码mbIL12A的核酸、编码mbIL12B的核酸、编码mbIL18的核酸、编码mbIL21的核酸、编码mbIL22的核酸和编码mbα-CD3的核酸。在多个实施方案中，多种核酸任选地配置成单构建体(例如，编码或操作连接)。在多个实施方案中，多种核酸被配置成多于一个构建体的部分。在多个实施方案中，mbIL15由SEQ ID NO.1编码。在多个实施方案中，4-1BBL由SEQ ID NO.13编码。在多个实施方案中，mbIL12A由SEQ ID NO.3编码。在多个实施方案中，mbIL12B由SEQ ID NO.5编码。在多个实施方案中，mbIL18由SEQ ID NO.7编码。在多个实施方案中，mbIL21由SEQ ID NO.9或其片段编码。在多个实施方案中，mbIL22由SEQ ID NO.11或其片段编码。在多个实施方案中，mbα-CD3由SEQ ID NO.16编码。根据该实施方案，多种核酸中的一种或更多种任选地包含标签，例如FLAG标签、HIS标签、GFP或本领域技术人员已知的其他标签和/或标记。

在多个实施方案中，本文中还提供了用于扩增NK细胞的方法，其包括获得包含含有NK细胞和T细胞的混合免疫细胞群的外周血样品，使混合的细胞群与工程细胞群接触，所述工程细胞群表现出降低的MHC I表达并且已被修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)、4-1BB配体(4-1BBL)和至少一种刺激免疫细胞活化的另外的分子，以及将混合细胞群与工程细胞共培养足以扩增混合群的NK细胞的一段时间。在多个实施方案中，所述方法任选地包括将IL2添加至共培养中使用的培养基。在多个实施方案中，所述方法任选地还包括在共培养之前或之后从混合群中除去T细胞。从包含NK细胞和T细胞的混合免疫细胞群中除去和/或分离T细胞的方法是相关领域中公知的。

在一个实施方案中，提供了经修饰细胞系，其包含缺少主要组织相容性复合物I分子的K562髓性白血病细胞，其被遗传修饰以表达膜结合白细胞介素-15、4-1BB配体和膜结合抗CD3。术语“遗传修饰”和“基因工程”应被给予其普通含义，应可互换使用，并且应指使用生物技术来操纵生物体基因组的至少一部分的一个或更多个方面。

在一个实施方案中，提供了经修饰细胞系，其包含缺少主要组织相容性复合物I分子的K562髓性白血病细胞，其被遗传修饰以表达膜结合白细胞介素-15、膜结合4-1BB配体和至少一种另外的膜结合白细胞介素。在多个实施方案中，所述至少一种另外的膜结合白细胞介素是以下一种或更多种：白细胞介素-12、白细胞介素-18以及白细胞介素-12与白细胞介素-18的组合。在多个实施方案中，经修饰的细胞还包含膜结合抗CD3抗体。在多个实施方案中使用这些另外的膜结合信号传导分子的组合。如本文中所用，术语“信号传导分子”应具有其普通含义，并且应包括但不限于白细胞介素、CD3、4-1BB等。

在一个实施方案中，提供了经修饰细胞系，其包含缺少主要组织相容性复合物I分子的K562髓性白血病细胞，其被遗传修饰以表达膜结合白细胞介素-15、4-1BB配体、膜结合抗CD3抗体和至少一种另外的膜结合白细胞介素。

本文中还提供了通过将包含NK细胞和T淋巴细胞的混合细胞培养物与本文中公开的任何经修饰细胞系一起培养而扩增和/或活化的NK细胞群。这样的NK细胞群可用于治疗癌症或感染性疾病，和/或用于制备用于这样的治疗的药物。本文中公开的工程细胞群适用于激活NK细胞，这种活化的NK细胞用于治疗癌症或感染性疾病。

本文中还提供了用于使用经扩增和/或活化的NK细胞治疗疾病的方法。例如，在多个实施方案中，提供了治疗癌症或感染性疾病的方法，其包括向患有癌症(例如肿瘤，无论是实体还是悬浮)或感染性疾病的对象施用包含经扩增的免疫细胞群的组合物，所述免疫细胞通过将免疫细胞与经修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)和4-1BB配体(4-1BBL)并且被修饰以表达至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合白细胞介素的工程细胞群共培养而扩增。在多个实施方案中，共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增，并且其中所述至少一个免疫细胞亚群施用于对象。在多个实施方案中，工程细胞群来源于癌细胞，例如永生化细胞系。在多个实施方案中，所施用的免疫细胞亚群包含NK细胞。

附图简述

以下附图的描述涉及表示本文中公开的发明的一些非限制性实施方案的实验和结果。

图1A-1G表示根据本文中公开的多个实施方案用于扩增免疫细胞的工程细胞的一些非限制性实例。提供了构建体，其中K562细胞(作为实例)表达4-1BB的配体(4-1BBL)和膜结合IL15(mbIL15)以及其他细胞因子，例如膜结合IL12A/12B(mbIL12A/12B；图1A)、膜结合IL18(mbIL18；图1B)、或其组合(图1C)。还提供了构建体，其中细胞(使用K562作为实例)共表达4-1BBL和mbIL15以及细胞因子(例如mbIL12A/12B和/或mbIL18，图1D-1F)和抗体(例如膜结合抗CD3(mbantiCD3，图1G))的组合。

图2A-2F描绘了根据本文中公开的多个实施方案的K562的多种基因表达的流式细胞术测量。图2A描绘了mbIL15的表达，图2B描绘了4-1BBL的表达，图2C描绘了mbIL18的表达，图2D描绘了mbIL12A的表达，图2E描绘了mbIL12B的表达，并且图2F描绘了mb-抗-CD3的表达。

图3A-3B描绘了根据本文中公开的多个实施方案的与通过多种K562构建体的NK细胞扩增相关的数据。图3A描绘了相对于最初接种的外周血单个核细胞的数量，与用多种K562细胞系培养(具有IL-2)7天之后回收的NK细胞的百分比相关的数据。图3B描绘了相对于最初接种的PBMC的数量，与用多种K562细胞系培养7天之后回收的NK细胞的百分比相关的数据(通过配对t检验计算P值)。

图4A-4F描绘了与用多种被遗传修饰的K562细胞刺激的NK细胞的长期扩增和功能相关的数据。图4A描绘了与指定的K562变体共培养时与NK细胞随时间扩增相关的数据。将PBMC与表达mbIL15和4-1BBL的经辐照K562细胞(K562-mb15-41BBL)(图4A)或与还表达mbIL12(+mb12)(图4B)、mbIL18(+mb18)(图4C)、或mbIL12和mbIL18二者(+mb12+mb18)(图4D)的K562-mb15-41BBL细胞共培养。图4E描绘了与在指示的效应物∶靶标(E∶T)比例下经扩增的NK细胞对K562细胞的细胞毒性相关的数据。图4F涉及在指示的E∶T比例下经扩增NK细胞对K562细胞的细胞毒性。显示的是一式三份实验的平均值(±SD)。通过配对t检验计算P值。

发明详述

许多疾病背后异常细胞(包括病毒感染的细胞和恶性细胞)的出现和持续存在是由于针对所述异常细胞的不足的免疫应答。免疫治疗的目标是启动或增强患者免疫系统的应答，例如，增强免疫细胞(例如自然杀伤(NK)细胞)破坏、杀伤或以其他方式抑制受损或患病细胞的能力。被改造以表达特异性鉴别患病或受损细胞并与其反应的某些靶向和/或效应分子的免疫细胞的过继转移是特别有希望的免疫治疗方法。这种方法的一种变化涉及向患者施用被改造以表达嵌合受体的T细胞，以引起目的异常细胞的靶向识别和破坏。然而，该方法的缺点是其可倾向于使用自体细胞(或MHC相容的供体细胞)以防止患者中移植物抗宿主病的诱导。此外，从癌症患者中回收和使用自体T细胞提出了多个潜在的不利问题。然而，根据本文中公开的多个实施方案，NK细胞是有利的，因为可使用自体细胞或供体来源的同种异体细胞。与基于NK细胞的免疫治疗相关的一个挑战是获得足够大且足够纯(例如，不含其他细胞类型)的量的NK细胞用于遗传操作和输注，因为NK细胞代表了免疫细胞群中总细胞的一小部分。

因此，仍然需要NK细胞的更大扩增以用于基于NK细胞的免疫治疗。因此，在多个实施方案中，提供了经扩增和活化的NK细胞群，其源自将本文中公开的经修饰细胞系与起始免疫细胞群共培养。在多个实施方案中，起始免疫细胞群包含NK细胞和T细胞。在多个实施方案中，还提供了在包含NK细胞和T细胞的混合细胞培养物中优先扩增NK细胞的方法，其包括将所述混合细胞培养物与本文中公开的经修饰细胞系共培养。根据该实施方案，优先扩增包括但不限于与其他免疫细胞相比，NK细胞的两倍、三倍、5倍、10倍或更多的扩增。在另一些实施方案中，优先扩增是指NK细胞扩增为另一种免疫细胞类型的扩增至少约10％、约20％、约30％、约50％或更多。在多个实施方案中，还提供了使用本文中公开的任何经修饰细胞系在包含NK细胞和T细胞的混合细胞培养物中扩增NK细胞的方法。

用于免疫细胞扩增的细胞

在多个实施方案中，细胞系用于与待扩增的免疫细胞群共培养。这样的细胞系在本文中称为“刺激细胞”，其也可称为“饲养细胞”。在多个实施方案中，将扩增整个免疫细胞群，而在多个实施方案中，优先扩增所选择的免疫细胞亚群。例如，在多个实施方案中，相对于其他免疫细胞亚群，优先扩增NK细胞。虽然在一些实施方案中，刺激细胞是野生型细胞，但在多个实施方案中，刺激细胞被遗传修饰以使它们特别适合于扩增和/或激活免疫细胞。如下文更详细讨论的，多种细胞系适合于遗传修饰，其可导致刺激NK活化的某些分子的表面表达。某些细胞系特别适合扩增NK细胞，例如不表达对NK细胞具有抑制作用的MHC I分子的那些。在一些实施方案中，细胞不需要完全缺少MHC I表达，但是它们可以以比野生型细胞更低的水平表达MHC I分子。例如，在多个实施方案中，如果野生型细胞以X水平表达MHC，则所用的细胞系可以以下水平表达MHC：小于X的95％，小于X的90％，小于X的85％，小于X的80％，小于X的70％，小于X的50％，小于X的25％，以及所列出的那些之间(并且包括)的任何表达水平。在多个实施方案中，刺激细胞是永生化的，例如癌细胞系。然而，在多个实施方案中，刺激细胞是原代细胞。

缺少或具有降低的MHC I表达的细胞类型包括但不限于K562细胞、某些肾母细胞瘤细胞系(例如肾母细胞瘤细胞系HFWT)、子宫内膜肿瘤细胞(例如，HHUA)、黑素瘤细胞(例如，HMV-II)、肝母细胞瘤细胞(例如，HuH-6)、肺小细胞癌细胞(例如，Lu-130和Lu-134-A)、神经母细胞瘤细胞(例如，NB19和NB69)、胚胎癌睾丸细胞(例如，INEC14)、宫颈癌细胞(TCO-2)、神经母细胞瘤细胞系(例如，TNB1)、721.221 EBV转化的B细胞系等。在多个实施方案中，刺激细胞还具有降低的(或缺少)MHC II表达，并且具有降低的(或缺少)MHC I表达。在一些实施方案中，可使用可最初表达MHC I类分子的其他细胞系，并且对这些细胞进行遗传修饰以降低或敲除MHC I表达。遗传修饰可通过使用基因编辑技术(例如crispr/cas-9系统)、抑制性RNA(例如，siRNA)或其他分子方法来破坏和/或降低细胞表面上MHC I分子的表达来实现。作为补充或替代，可使用阻断与MHC I分子结合或其他相互作用的其他方法(例如，阻断抗体、干扰配体等)。

在多个实施方案中，使用刺激细胞与待扩增/刺激细胞的某些比例。例如，在多个实施方案中，使用约5∶1的刺激细胞：“靶”细胞比例。在多个实施方案中，使用1∶1比例，而在另一些实施方案中，可使用约1∶10、1∶20、1：50、1：100、1∶1,000、1∶10,000、1∶50,000、1∶100,000、100,000∶1、50,000∶1、10,000∶1、1,000∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1，以及所列出的那些之间的任何比例，包括端点。在一些实施方案中，使用细胞类型的组合(例如，K562与一种或更多种另外的细胞类型)，NK细胞的所得活化和/或扩增大于单独使用任何单一细胞类型可实现的活化和/或扩增(例如，由于细胞类型之间的协同作用)。在一些这样的实施方案中，不一定需要在组合使用的每种细胞系中降低和/或不存在MHC I表达。在一些实施方案中，一种细胞类型相对于组合中的其他细胞类型的相对频率可改变，以使所期望免疫细胞群的扩增和活化最大化。例如，如果使用两个细胞群，则相对频率可以是1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶1,000、1∶10,000、1∶50,000、1∶100,000、100,000∶1、50,000∶1、10,000∶1、1,000∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1的比例，以及所列出的那些之间的任何比例，包括端点。

如下文更详细讨论的，某些刺激分子(例如白细胞介素、CD3、4-1BBL等)可在促进免疫细胞扩增和活化的细胞(例如，刺激细胞)上表达，或由其表达。然而，在多个实施方案中，与促进免疫细胞扩增的细胞一起或代替促进免疫细胞扩增的细胞，使用固体支持物。例如，固体支持物是能够使分子附着于表面的表面，包括但不限于金属、玻璃、塑料、聚合物材料、颗粒(例如，珠或微球)和/或脂质(天然的或合成的)。在一些实施方案中，使用可将刺激分子(例如本文中公开的那些)洗脱到培养基中以促进所期望免疫细胞群扩增的组合物。

刺激分子

如上面简要讨论的，某些分子促进免疫细胞的扩增。根据该实施方案，刺激分子可在用于扩增免疫群的刺激细胞的表面上表达，而在一些实施方案中，刺激细胞可被改造以表达一种或更多种刺激分子并将其分泌到培养基中。在另一些实施方案中，使用一种或更多种刺激分子来补充细胞培养基。在一些实施方案中，免疫细胞群相对均匀地扩增(例如，没有特定亚群被优先扩增)。在一些这样的实施方案中，在所有免疫细胞群扩增之后，选择性地分离所期望的亚群(例如，使NK细胞与T细胞分离，或反之亦然)以供进一步使用。在多个实施方案中，某些特定的免疫细胞亚群(例如NK细胞)被优先扩增。

在多个实施方案中，用于改造刺激细胞系以表达膜结合分子的一般构建体使用最终驱动膜结合分子表达的信号肽，编码膜结合分子的核酸序列，任选的接头，以及跨膜结构域。该一般构建体可随实施方案而变化，至少部分基于复杂性、大小或表达给定膜结合分子的能力。

在一些实施方案中，白细胞介素15(IL15)用于促进NK细胞的扩增。在一些实施方案中，IL15是刺激细胞上膜结合的(在本文中称为“mbIL15”)。在一些实施方案中，IL15通过与跨膜分子或整合膜蛋白偶联或缀合而膜结合。在多个实施方案中，使用CD8α的跨膜结构域(SEQ ID NO.18)。在多个实施方案中，野生型(例如，全长)IL15在刺激细胞上表达或由刺激细胞表达。在一些实施方案中，IL15与全长IL15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施方案中，使用IL15的截短形式。在多个实施方案中，mbIL15由SEQ ID NO：1的核酸序列编码。在多个实施方案中，mbIL15由SEQ ID NO：2的氨基酸序列编码。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.1或2的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。

在多个实施方案中，刺激细胞被改造以表达IL15受体的全部或部分。在多个实施方案中，IL15受体的部分是IL15受体的功能部分。例如，在一些实施方案中，刺激细胞被改造以表达IL15受体α亚基。在多个实施方案中，细胞产生或经改造以产生(例如，分泌)可溶性IL15。因此，可溶性IL15可与由刺激细胞表达的其受体结合，并随后被内化(例如，内吞)并呈递给另一细胞。实质上，在一些实施方案中，不是改造刺激细胞以表达工程mbIL15，而是可改造刺激细胞以表达IL15受体α亚基，其可以结合IL15(即使在没有其余IL15受体CD122和CD132亚基的情况下)，并将其呈递在细胞表面，因而以mbIL15的替代方式导致IL15表达。

在一些实施方案中，白细胞介素12A(IL12A)和/或12B(IL12B)用于促进NK细胞的扩增。在一些实施方案中，IL12是刺激细胞上膜结合的(在本文中称为“mbIL12”)。在一些实施方案中，使用IL12A和IL12B的组合(本文中称为“IL12A/12B”，并且当膜结合时，称为“mbIL12A/12B”)。在一些实施方案中，IL15通过与跨膜分子或整合膜蛋白偶联或缀合而膜结合。在多个实施方案中，使用CD8α的跨膜结构域。在多个实施方案中，野生型(例如，全长)IL12A和/或12B在刺激细胞上表达或由刺激细胞表达。在一些实施方案中，IL12A和/或12B分别与全长IL12A或12B具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施方案中，使用IL12A和/或12B的截短形式。在多个实施方案中，mbIL12A由SEQ ID NO：3的核酸序列编码。在多个实施方案中，mbIL12A由SEQ ID NO：4的氨基酸序列编码。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.3或4的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。在多个实施方案中，mbIL12B由SEQ ID NO：5的核酸序列编码。在多个实施方案中，mbIL12B由SEQ ID NO：6的氨基酸序列编码。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.5或6的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。在一些实施方案中，使用IL12A和IL12B的混合物。在多个实施方案中，使用IL12A∶IL12B的特定表达比例，例如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10,000、10,000∶1、1000∶1、100∶1、10∶1以及之间的任何比例，包括端点。在一些实施方案中，表达IL12A和IL12B二者，例如作为融合蛋白。在一些实施方案中，与IL12B的片段联合表达IL12A的片段。在多个实施方案中，刺激细胞上IL12(A和/或B)的表达赋予细胞影响经扩增细胞的表型和功能的能力。换句话说，IL12A和/或B的表达(单独或与本文中公开的其他刺激分子组合)在多个实施方案中导致NK细胞亚群的选择性扩增。在多个实施方案中，该特定亚群可在特定治疗应用中是有利的，其中NK细胞的特定表型特别有效。

在一些实施方案中，白细胞介素18(IL18)用于促进NK细胞的扩增。在一些实施方案中，IL18是刺激细胞上膜结合的(本文中称为“mbIL18”)。在一些实施方案中，IL18通过与跨膜分子或整合膜蛋白偶联或缀合而膜结合。在多个实施方案中，使用CD8α的跨膜结构域。在多个实施方案中，野生型(例如，全长)IL18在刺激细胞上表达或由刺激细胞表达。在一些实施方案中，IL18与全长IL18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施方案中，使用IL18的截短形式。在多个实施方案中，mbIL18由SEQ ID NO：7的核酸序列编码。在多个实施方案中，mbIL18由SEQ ID NO：8的氨基酸序列编码。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.7或8的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。在多个实施方案中，刺激细胞上IL18的表达赋予细胞影响经扩增细胞的表型和功能的能力。换句话说，IL18的表达(单独或与本文中公开的其他刺激分子组合)在多个实施方案中导致NK细胞亚群的选择性扩增。在多个实施方案中，该特定亚群可以在特定治疗应用中是有利的，其中NK细胞的特定表型特别有效。

在一些实施方案中，白细胞介素21(IL21)用于促进NK细胞的扩增。在一些实施方案中，IL21是刺激细胞上膜结合的(本文中称为“mbIL21”)。在一些实施方案中，IL21通过与跨膜分子或整合膜蛋白偶联或缀合而膜结合。在多个实施方案中，使用CD8α的跨膜结构域。在多个实施方案中，野生型(例如，全长)IL21在刺激细胞上表达或由刺激细胞表达。在一些实施方案中，IL21与全长IL21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施方案中，使用IL21的截短形式。在多个实施方案中，用于刺激NK细胞的mbIL21来源于SEQ ID NO：9的核酸序列。如本文中所讨论的，在多个实施方案中，CD8a跨膜结构域用于将SEQ ID NO：9的IL21(或其片段)锚定至刺激细胞的膜。在多个实施方案中，用于刺激NK细胞的mbIL21来源于SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.9或10的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。

在一些实施方案中，白细胞介素22(IL22)用于促进NK细胞的扩增。在一些实施方案中，IL22是刺激细胞上膜结合的(本文中称为“mbIL22”)。在一些实施方案中，IL22通过与跨膜分子或整合膜蛋白偶联或缀合而膜结合。在多个实施方案中，使用CD8α的跨膜结构域。在多个实施方案中，野生型(例如，全长)IL22在刺激细胞上表达或由刺激细胞表达。在一些实施方案中，IL22与全长IL22具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施方案中，使用IL22的截短形式。在多个实施方案中，mbIL22由SEQ ID NO：11的核酸序列编码。在多个实施方案中，mbIL22由SEQ ID NO：12的氨基酸序列编码。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.11或12的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。

在一些实施方案中，4-1BB配体(4-1BBL)用于促进免疫细胞的扩增。4-1BBL具有细胞外结构域，其与T细胞上的受体4-1BB相互作用，从而为T细胞提供用于存活、增殖和分化的共刺激信号。在一些实施方案中，4-1BBL通过与跨膜分子或整合膜蛋白偶联或缀合而膜结合。在多个实施方案中，野生型(例如，全长)4-1BBL在刺激细胞上表达或由刺激细胞表达。在一些实施方案中，4-1BBL与全长4-1BBL具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在一些实施方案中，使用IL18的截短形式。在多个实施方案中，mb4-1BBL由SEQ ID NO：13的核酸序列编码。在多个实施方案中，mb4-1BBL由SEQ IDNO：14的氨基酸序列编码。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.13或14的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。

在一些实施方案中，抗CD3抗体用于促进免疫细胞的扩增。在一些实施方案中，抗CD3抗体是刺激细胞上膜结合的(本文中称为“mbantiCD3”或“mbα-CD3”)。在多个实施方案中，全长抗CD3抗体在刺激细胞上表达。在一些实施方案中，抗CD3抗体包含单链片段可变区(scFv)片段。根据该实施方案，抗体可以是单克隆的或多克隆的。在一些实施方案中，抗CD3抗体包含选自Fab′、F(ab′)2、单结构域抗体(例如，双抗体、纳米抗体)的多种抗原片段和/或融合物。在一些实施方案中，抗体选自莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、特丽珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。在一些实施方案中，抗体与莫罗单抗-CD3、奥昔珠单抗、特丽珠单抗和维西珠单抗中的一种或更多种具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。在多个实施方案中，与T细胞受体的CD3部分的一个或更多个亚基结合的抗体由刺激细胞表达。在多个实施方案中，表达的抗体针对γ、ε或δCD3亚基。在多个实施方案中，由刺激细胞表达的抗体针对来源于SEQ ID NO：15的CD3ε核酸序列的表位。在多个实施方案中，抗CD3抗体是单链片段可变(scFv)。在多个实施方案中，mbantiCD3 scFv由SEQ ID NO：16的核酸序列编码。在一些这样的实施方案中，抗体具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在多个实施方案中，刺激分子可具有从SEQ ID NO.16或17的一个或更多个另外的突变，但是保留了刺激活性，或在一些实施方案中具有增强的刺激活性。

在多个实施方案中，对刺激细胞(例如K562细胞)进行遗传修饰以表达多种刺激分子的组合。根据该实施方案，可使用本文中公开的刺激分子的任何组合。例如，在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL和mbα-CD3在刺激细胞上共表达。在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL和mbIL12A/12B在刺激细胞上共表达。在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL和mbIL18在刺激细胞上共表达。在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL、mbIL18和mbIL12A/12B在刺激细胞上共表达。在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL、mbIL12A/12B和mbantiCD3在刺激细胞上共表达。在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL、mbIL18和mbantiCD3在刺激细胞上共表达。在多个实施方案中，mbIL15、4-1BBL、mbIL12A/12B、mbIL18和mbantiCD3在刺激细胞上共表达。在一些实施方案中，除了上文列出的任何刺激分子或代替上文列出的任何刺激分子，可表达mbIL21和/或mbIL22。在一些实施方案中，这些分子中的每一种通过用单质粒转染在刺激细胞中表达。或者，可在单质粒中编码两种或更多种刺激分子。

根据该实施方案和所讨论的刺激分子，可在与免疫细胞群共培养的过程中的特定时间表达刺激分子。例如，不是组成型表达，一种或更多种标记可在诱导型或其他可调节启动子的控制下。因此，可在期望的时间向共培养物添加触发分子或触发刺激，导致在扩增和活化方案期间的特定点处表达所期望的刺激分子。如本文中所用，术语“诱导型启动子”和“可调节启动子”应被给予其普通含义，并且还应指其转录活性受某些生物或非生物因子的存在调节(例如，刺激或抑制)的启动子。如本文中所用，术语“触发分子”或“触发刺激”应被给予其普通含义，并且应指作用于诱导型或可调节启动子的化学或物理物质或条件，包括但不限于醇、四环素、类固醇、金属和其他化合物，以及高或低培养温度。另外，刺激分子的可调节表达也可用于在培养过程中降低和/或消除特定刺激分子的表达。在NK细胞对信号特别敏感的情况下，这样的实施方案可通过例如在活化和扩增期间的某个时间点提供特定的刺激信号来促进某些免疫细胞亚群(例如NK细胞)的优先扩增。在多个实施方案中，这样的方法可导致NK细胞的出人意料地稳健的活化和扩增。在另一些实施方案中，延长NK细胞增殖的持续时间，最终导致更大的活化NK细胞群用于例如癌症免疫治疗。

在一些实施方案中，本文中还提供了核酸和氨基酸序列，其与由SEQ ID NO.1-17编码的本文中公开的刺激分子的相应核酸或氨基酸序列相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％(及其中的范围)的同源性，并且与相应的SEQ ID No.1-17相比还表现出一种或更多种功能，包括但不限于(i)激活NK细胞，(ii)使NK细胞敏化，(iii)增强的NK细胞增殖，(iv)，增强的NK细胞靶亲和力，(v)上调或以其他方式增强的信号转导，(vi)增强的NK细胞细胞毒性，(vii)T细胞刺激(例如增殖、可用亚群的选择性扩增等)，(viii)特定NK细胞亚群的选择性扩增，以及(ix)其组合。

共培养和免疫细胞扩增的方法

在多个实施方案中，可用多种构建体(每种编码一种或更多种待表达的刺激分子)转导刺激细胞，或者可使用单构建体。在多个实施方案中，首先用与可识别标记(例如荧光标签(例如，绿色荧光蛋白GFP或其他荧光部分)偶联的刺激分子转导刺激细胞。在另一些实施方案中，可使用其他标签。例如，在多个实施方案中，使用FLAG标签(DYKDDDDK，SEQ IDNO.19)。还可获得其他标签序列，例如多组氨酸标签(His标签)(HHHHHH，SEQ ID NO.20)、HA标签或myc标签。在某些实施方案中也可使用标签类型的组合。在转导之后，可查询刺激细胞的标签的存在和表达程度，其与相关刺激分子的表达相关。可选择具有高水平的标签表达(并因此高水平的刺激分子表达)的那些细胞(或单独细胞)并且扩增(如果选择单细胞则克隆扩增)。随后，可进行利用一种或更多种另外的刺激分子的另外的转导，然后进行另外的查询和扩增，直到实现刺激分子组合的期望表达。在一些实施方案中，与每个后续转导相关的标签不同于先前转导的那些，因此可独立地验证每种刺激分子的表达。

在多个实施方案中，将刺激细胞接种到培养容器中并使其达到接近汇合。然后可以以期望的浓度将免疫细胞添加至培养物，在多个实施方案中，为约0.5×10⁶个细胞/cm²至约5×10⁶个细胞/cm²，包括所列出那些之间的任何密度，包括端点。根据实施方案，免疫细胞可在起始样品(例如外周血)、分离的免疫细胞制备物、分离的NK细胞群等中。在多个实施方案中，对血液样品进行预处理以分离某些待扩增的群(例如，NK细胞)。在一些实施方案中，将外周血样品与刺激细胞共培养，并且任选地从经扩增细胞的混合群中分离出经扩增免疫细胞的期望亚群，例如NK细胞。扩增之后，细胞可保持在合适的培养基中，例如RPMI-1640、10％FCS和10IU/mL IL-2中。

如上所述，在多个实施方案中，提供了适于激活和/或扩增免疫细胞群的工程细胞群(本文中也称为刺激细胞)。在多个实施方案中，工程化群来源于癌细胞并且被修饰以表达mbIL15、mb 4-1BBL和至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合分子，因此工程细胞与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群(例如NK细胞)的活化和/或扩增。在多个实施方案中，另外的分子包含一种或更多种白细胞介素(或其片段)，例如IL12A、IL12B、IL18、IL21和/或IL22。在一些实施方案中，另外的分子包含抗体。在多个实施方案中，抗体包含膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)、抗体或scFv或其片段。在多个实施方案中，抗体是单克隆的。在多个实施方案中，抗体与至少一种白细胞介素或其片段共表达。根据该实施方案，一种或更多种膜结合分子与人CD8α的跨膜结构域偶联。本文中还提供了用于扩增NK细胞的方法，其中NK细胞与这样的工程细胞共表达。例如，在多个实施方案中，提供了用于扩增NK细胞的方法，其包括获得包含含有NK细胞和T细胞的混合免疫细胞群的外周血样品，使混合细胞群与这样的工程细胞群接触，并将混合细胞群与工程细胞共培养足以扩增混合群中的NK细胞的一段时间。多个实施方案中，任选地除去T细胞，产生更纯的NK细胞群。

在多个实施方案中，细胞群来源于以下细胞系中的一种或更多种：K562细胞、肾母细胞瘤细胞系HFWT、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑素瘤细胞系HMV-II、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130或Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB19或NB69、胚胎癌睾丸细胞系NEC14、宫颈癌细胞系TCO-2和神经母细胞瘤细胞系TNB1。在多个实施方案中，细胞群缺少MHC I和/或MHC II分子的表达。

在多个实施方案中，还提供了包含多种核酸的试剂盒，其用于产生工程细胞群以扩增免疫细胞，所述试剂盒包含以下至少3种：编码mbIL15的核酸、编码4-1BBL的核酸、编码mbIL12A的核酸、编码mbIL12B的核酸、编码mbIL18的核酸、编码mbIL21的核酸、编码mbIL22的核酸和编码mbα-CD3的核酸。在多个实施方案中，一种或更多种核酸可包含标签，例如GFP、FLAG标签或HIS标签。

本文中还提供了治疗患有癌症或感染性疾病的对象的方法，其包括向对象施用包含本文中所述的基因工程细胞的组合物和/或包含与本文中所述的基因工程细胞共培养的经扩增免疫细胞群的组合物。如本文中所用，在向对象施用治疗的情况下，术语“治疗”应具有其普通含义，并且应指对象从治疗得到的有益效果。在某些实施方案中，通过施用包含本文中所述的基因工程细胞的组合物和/或包含与本文中所述的基因工程细胞共培养的经扩增免疫细胞群的组合物治疗对象实现了一种、二种、三种、四种、或更多种以下效果，包括例如：(i)降低或改善疾病或与其相关的症状的严重程度；(ii)降低与疾病相关的症状的持续时间；(iii)针对疾病或与其相关的症状的进展提供保护；(iv)疾病或与其相关的症状的消退；(v)针对与疾病相关的症状的发生或发作提供保护；(vi)针对与疾病相关的症状的复发提供保护；(vii)降低对象的住院治疗(hospitalization)；(viii)降低住院治疗时长；(ix)提高患有疾病的对象的存活；(x)降低与疾病相关的症状数目；(xi)增强、改善、补充、互补或增大其他治疗的预防或治疗效果。

施用可通过多种途径，包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、肌内、肝内、腹膜内和/或局部递送至受影响的组织。对于给定对象，可基于其体重、疾病类型和状态以及期望的治疗侵袭性容易地确定基因工程细胞和/或与本文中所述的基因工程细胞共培养的经扩增免疫细胞群的剂量，但根据该实施方案，范围为约10⁵个细胞/kg至约10¹²个细胞/kg(例如，10⁵-10⁷、10⁷-10¹⁰、10¹⁰-10¹²和其中的重叠范围)。在一个实施方案中，使用剂量递增方案。在多个实施方案中，施用与本文中所述的基因工程细胞共培养的经扩增的免疫细胞群的范围，例如约1×10⁶个细胞/kg至约1×10⁸个细胞/kg。根据该实施方案，可治疗多种类型的癌症或感染性疾病。本文中提供的多种实施方案包括治疗或预防包括但不限于以下的癌症的非限制性实例：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、淋巴瘤、胃肠癌、阑尾癌、中枢神经系统癌症、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(包括但不限于星形细胞瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤(medulloepithelioma))、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、宫颈癌、结肠癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性疾病(chronic myeloproliferative disorder)、导管癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、肾细胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、胰腺癌、肠癌、淋巴瘤、黑素瘤、眼癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、垂体癌症、子宫癌和阴道癌。

此外，本文中提供的多种实施方案包括治疗或预防感染性疾病的以下非限制性实例，包括但不限于细菌来源的感染，可包括例如来自一个或更多个以下属的细菌的感染：博德特菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)和嗜衣原体属(Chlamydophila)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希菌属(Escherichia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次体属(Rickettsia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森菌属(Yersinia)，及其突变体或组合。在多个实施方案中，提供了治疗病毒感染的方法，例如由以下一种或更多种病毒引起的那些，例如腺病毒、柯萨奇病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、埃博拉病毒、人疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒和水痘-带状疱疹病毒。

在多个实施方案中，经扩增和/或活化的细胞以治疗有效量(例如，足以实现以下的量：治疗癌症，例如通过改善与癌症相关的症状，预防或延迟癌症的发作，还有减轻癌症症状的严重程度或频率，和/或预防、延迟或克服癌症的转移)施用。在治疗特定个体中治疗有效的量将取决于病症(例如，癌症)的症状和严重程度，并且可通过标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径和癌症的严重程度，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可从来自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线外推有效剂量。在多个实施方案中，经扩增的免疫细胞与一种或更多种刺激细胞共施用，而在一些实施方案中，施用刺激细胞(或从刺激细胞产生、分泌或收获的一种或更多种因子)以便激活内源免疫细胞群。

施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、局部、经口和鼻内。其他合适的引入方法还可包括基因治疗、可再充或可生物降解的装置、粒子加速装置(例如，“基因枪”)和缓释聚合物装置。在多个实施方案中，本发明的药物组合物还可作为与其他化合物的组合疗法的一部分来施用。

实施例

以下是在下面公开的实施例中使用的实验方法和材料的一些非限制性描述。

实施例1 K562衍生物的制备，NK细胞的扩增

从来自新加坡国立大学医院血库(National University Hospital Blood Bank，Singapore)的健康成人供体的血小板捐献的丢弃的匿名副产物获得外周血样品。

通过在Lymphoprep密度步骤(Nycomed，Oslo，Norway)上离心分离单核细胞，并在RPMI-1640中洗涤两次。为了从外周血单个核细胞中纯化原代NK细胞，使用来自Miltenyi(Bergisch Gladbach，Germany)的NK细胞分离试剂盒。

如先前所述制备K562-mb15-41BBL细胞系(图1A)(Imai C，Iwamoto S，CampanaD.Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitorysignals and induces specific killing of leukemic cells.Blood.2005；106：376-383；Fujisaki H，Kakuda H，Shimasaki N，et al.Expansion of highly cytotoxic humannatural killer cells for cancer cell therapy.Cancer Res.2009；69(9)：4010-4017)。

通过用包含编码膜结合白细胞介素(IL)-12、IL-18或这二者或者膜结合抗人CD3ScFv的cDNA序列的逆转录病毒载体转导K562-mb15-41BBL细胞来产生其他K562变体。克隆构建体的序列在SEQ ID NO：21(mbIL15)、SEQ ID NO：23(mbIL12A)、SEQ ID NO：24(mbIL12B)、SEQ ID NO：25(mbIL18)和SEQ ID NO：26(mb-抗-CD3 scFv)中提供。使用含有相应cDNA的RD144-假型MSCV逆转录病毒转导K562-mb15-41BBL细胞。将逆转录病毒载体条件培养基添加至RetroNectin(Takara，Otsu，Japan)涂覆的聚丙烯管；在离心并除去上清液后之后，将K562-mb15-41BBL细胞添加至管，并在37℃下放置12小时；在另外连续两天添加新鲜的病毒上清液。然后将细胞维持在含有FBS和抗生素的RPMI-1640中。

使用与别藻蓝蛋白(APC；Miltenyi)或与藻红蛋白(PE；R&D Systems，Minneapolis，MN)缀合的抗IL12a抗体、抗IL12b APC(Biolegend，San Diego，CA)、抗-IL18(MBL；Woburn，MA)然后山羊抗小鼠IgG1 PE(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)，通过流式细胞术分析IL-12a、IL12b和IL18的表面表达。使用与生物素缀合的山羊抗小鼠Fab2抗体然后链霉亲和素APC(均来自Jackson Immunoresearch(WestGrove，PA))检测抗CD3。通过流式细胞术富集表达高水平转基因的亚克隆并将其用于刺激NK细胞扩增。

人NK细胞扩增

为了扩增NK细胞，将PBMC和经遗传修饰的K562细胞共培养。简单地说，在含有10％FBS和40IU/mL人白细胞介素(IL)-2(Novartis，Basel，Switzerland)的SCGM培养基(CellGenix，Freiburg，Germany)中，将外周血单个核细胞(3×10⁶)培养在具有2×10⁶个经辐照(100Gy)的K562经修饰细胞的6孔组织培养板中。每2-3天，添加新鲜的组织培养基和IL-2。共培养7天后，使用Dynabeads CD3(Thermo Fisher)除去残余T细胞，产生含有＞90％CD56+CD3-NK细胞的细胞群。

结果

在产生构建体并用各自的逆转录病毒载体转导K562-mb15-41BBL细胞之后，使用流式细胞术评估K562细胞的多种膜结合分子的表达。图2A-2F描绘了评价结果。如所示，待表达的六种分子中的每一种表明，几乎100％的所得K562细胞系表达所示分子(2A-mbIL15、2B-41BBL、2C-mbIL18、2D-mbIL12A、2E-mbIL12B和2F-mb-抗-CD3)。这些数据表明，所产生的多种构建体成功地转化为K562细胞(或其他类型的刺激细胞)对期望的刺激分子的表达。

确认了期望刺激分子的表达后，评价了多种K562变体扩增NK细胞的能力。如上所讨论，将PBMC与共表达mbIL15和4-1BBL的经辐照K562细胞(K562-mb15-41BBL)共培养。将该K562构建体与另外表达mbIL12(+mb12)、mbIL18(+mb18)或mbIL12和mbIL18二者(+mb12+mb18)的构建体进行比较。相对于最初接种的那些，计算培养7天之后回收的NK细胞(由表达CD56且缺少CD3定义)的数目并显示在图3A中。在所有培养物中，添加IL-240IU/mL(Aldeuskin，Novartis)。显示了来自4个健康供体的细胞的5次实验的结果。水平条对应于中位值。通过添加mbIL12、mbIL18和二者的组合，这些数据表明增强NK细胞扩增的明显趋势。这表明使用根据本文中多个实施方案的构建体实现了补充表达mbIL15-41BBL的K562细胞的刺激性质。

图3B显示了另外的实验，其比较了通过PBMC与K562-mb15-41BBL细胞或与表达mb12和mb18的K562-mb15-41BBL细胞共培养培养7天的NK细胞。该数据来自利用来自8个供体的外周血单个核细胞的12个实验。通过配对t检验计算P值。这些数据表明NK细胞程度显著提高(与起始群相比)。因此，根据本文中公开的多个实施方案的构建体导致NK细胞群的显著扩增。在多个实施方案中，这种扩增特别有利，因为K562细胞表达多种刺激分子导致NK细胞的出人意料的稳健扩增，导致可用于治疗应用的相当大的群。

实施例2-用K562变体刺激的NK细胞的长期扩增和功能

长期扩增

评价了NK细胞继续扩增的能力。将PBMC与表达mbIL15和4-1BBL的经辐照K562细胞(K562-mb15-41BBL)(图4A)或与还表达mbIL12(+mb12)(图4B)、mbIL18(+mb18)(图4C)或mbIL12和mbIL18二者(+mb12+mb18)(图4D)的K562-mb15-41BBL细胞共培养。相对于最初接种的那些，计算每种培养物中不同时间间隔后的NK细胞(由表达CD56且缺少CD3定义)的数目以计算细胞群倍增。为了更新NK细胞的潜在扩增，每2周添加新鲜的基因修饰的K562细胞，K562∶NK比例为5∶1，并且在第一周期间IL-2浓度维持在40IU/mL，并且随后在T细胞耗尽后维持在400IU/mL。箭头表示尽管添加了K562细胞但是NK细胞停止扩增的时间点，表明衰老。

如上文讨论的扩增数据那样，这些数据表明mbIL15-41BBL的表达导致阈扩增水平，而在多个实施方案中，额外刺激分子的表达导致显著的扩增增强。特别地，单独mbIL12的表达看来没有改变NK细胞继续扩增超过使用表达mbIL15-41BBL的细胞所实现的扩增的能力。然而，表达mbIL18和组合mbIL12-mbIL18的K562细胞二者均导致NK细胞扩增的显著更长的持续时间，每种构建体刺激NK细胞扩增近20周(为表达mbIL15-41BBL的K562细胞约3倍高)。这表明，根据本文中公开的多个实施方案，某些刺激分子的表达可出人意料地增强NK细胞的扩增。另外，根据多个实施方案，共表达多种刺激分子可产生协同刺激作用。

细胞毒性测定

除了NK细胞的扩增之外，评价经扩增细胞的细胞毒性以确定刺激细胞的某些工程变体是否赋予经扩增的NK细胞更大程度的细胞毒性。

将靶细胞悬浮于含有10％FBS的RPMI-1640中，用钙黄绿素AM(Sigma)标记，并将其平板接种到96孔平底板(Costar，Corning，NY)中。然后以所指示的多种E∶T比例添加悬浮在含有10％FBS的RPMI-1640中的经扩增NK细胞，并与靶细胞共培养4小时。然后用碘化丙锭对细胞进行染色，并使用Accuri流式细胞仪(BD Bioscience)通过流式细胞术测量细胞毒性，数出活靶细胞的数目(钙黄绿素AM-阳性、碘化丙啶阴性和活细胞的光散射性质)。

图4E描绘了在培养8天和15天之后，在所示效应物∶靶标(E∶T)比例下4小时测定中针对K562细胞的NK细胞细胞毒性的测量数据。在最初的8天时间点，在这两种E∶T比例下，用不同构建体刺激的NK细胞表现出不同的细胞毒性。如所示，用mbIL15-41BBL+mbIL18构建体和mbIL15-41BBL扩增8天的那些NK细胞显示出最大的细胞毒性。有趣的是，在培养中再培养7天的那些组中(总共15天，第二周IL-2为4400IU/mL)，细胞毒性的差异降低，所有组表现出接近100％的细胞毒性作用。

图4F描绘了使用所示的E∶T比例在培养64天(培养9周)之后与NK细胞细胞毒性相关的数据。这些数据表明，即使在培养大量时间后，仍然表现出细胞毒性。在1∶1的E∶T下，使用表达mbIL15-41BBL+mbIL18的K562细胞扩增的NK细胞表现出约30％的细胞毒性，而使用表达mbIL15-41BBL+mbIL12+mbIL18的K562细胞扩增的NK细胞表现出几乎80％的细胞毒性。当靶细胞过量时(E∶T为1∶2)，相应的NK细胞仍然表现出细胞毒性，尽管与1∶1比例相比降低了。相反，当存在的量大于靶细胞(E∶T为2∶1)时，NK细胞表现出更大的细胞毒性。这些数据表明，当长时间培养时，NK细胞的效力可降低(尽管数量提高)。因此，根据一些实施方案，提高的共培养持续时间不仅提高了NK细胞的原始数量，而且还导致每种NK细胞的细胞毒性作用的提高。因此，一些实施方案不仅导致更大的NK细胞数量，而且增强了经扩增NK细胞群的每个成员的效力，从而导致整体更大的临床疗效。根据多个实施方案，使培养的持续时间与效力平衡以在细胞数与所得细胞毒性作用之间达到最佳平衡。

在多个实施方案中，编码4-1BBL的核酸包含如下所示的SEQ ID NO.22的核酸序列，基本上由其组成或由其组成：

考虑可进行上文公开的实施方案的特定特征和方面的各种组合或子组合，并且仍然落入一个或更多个发明内。此外，本文中结合实施方案公开的任何特定特征、方面、方法、性质、特性、品质、属性、要素等的公开内容可用于本文中阐述的所有其他实施方案中。因此，应该理解的是，所公开的实施方案的多种特征和方面可彼此组合或替换，以便形成所公开的发明的变化模式。因此，意图是本文中公开的本发明的范围不应受上述具体公开的实施方案的限制。此外，尽管本发明易于进行多种修改和替换形式，但是其具体实例已在附图中示出并在本文中详细描述。然而，应该理解，本发明不限于所公开的特定形式或方法，但相反，本发明将覆盖落入所描述的多种实施方案和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。本文中公开的任何方法不需要按照所记载的顺序进行。本文中公开的方法包括从业者采取的某些动作；但是，它们也可明确地或暗示地包括这些行为的任何第三方指示。例如，例如“施用经扩增NK细胞群”的动作包括“指导经扩增的NK细胞群的施用”。此外，在根据马库什组(Markush group)描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员本领域将认识到，本公开内容也因此以马库什组的任何个体成员或成员子集的形式描述。

本文中公开的范围还涵盖其任何和所有重叠、子范围及组合。例如“多至”、“至少”、“大于”、“小于”、“之间”等语言包括所记载的数字。在例如“约”或“大约”之类的术语之后的数字包括所记载的数字。例如，“90％”包括“90％”。在一些实施方案中，至少95％同源包括与参考序列96％、97％、98％、99％和100％同源。此外，当序列被公开为“包含”核苷酸或氨基酸序列时，除非另有指明，否则这样的参考还应包括“包含”所记载的序列、“由其组成”或“基本上由其组成”的序列。

没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种，除非相反地指出或者以其他方式从上下文中显而易见。本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此联结的要素中的“一个或两个”。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此联结的要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体标识的要素之外，可任选地存在其他要素。如本本文中说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当在要素列表中使用时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含要素列表的至少一个但任选地多于一个，以及任选地，其他未列出的要素。只有明确表示相反的术语(例如“仅一个”或“恰好一个”)将是指包含若干要素或要素列表中的恰好一个要素。因此，如果一个、多于一个或所有组成员在给定产品或过程中存在、使用或以其他方式相关，则认为在组中的一个或更多个成员之间包括“或”的声明是满足的，除非相反地指明。提供了其中恰好一个组成员在给定产品或过程中存在、使用或以其他方式相关的一些实施方案。提供了其中多于一个或所有组成员在给定产品或过程中存在、使用或以其他方式相关的一些实施方案。可修改任何一个或更多个权利要求以明确地排除任何实施方案、方面、特征、要素或特性，或其任何组合。可修改任何一个或更多个权利要求以排除任何药剂、组合物、量、剂量、施用途径、细胞类型、靶标、细胞标志物、抗原、靶向部分(targeting moiety)或其组合。

序列表

<110> 新加坡国立大学

<120> 用于离体扩增和活化自然杀伤细胞的刺激细胞系

<130> NKT.008WO

<150> 62/477311

<151> 2017-03-27

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 615

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL15的核酸序列

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120

catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180

atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240

catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300

gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360

ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420

ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480

gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 600

accctttact gctaa 615

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> mbIL15的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys

20 25 30

Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr

35 40 45

Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe

50 55 60

Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile

65 70 75 80

His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser

85 90 95

Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu

100 105 110

Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val

115 120 125

Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

130 135 140

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

145 150 155 160

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

165 170 175

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

180 185 190

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

195 200

<210> 3

<211> 867

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL12A的核酸序列

<400> 3

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagaaacc tccccgtggc cactccagac ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc 120

caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt 180

tacccttgca cttctgaaga gattgatcat gaagatatca caaaagataa aaccagcaca 240

gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag 300

acctctttca taactaatgg gagttgcctg gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc 360

ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg 420

aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg cagatctttc tagatcaaaa catgctggca 480

gttattgatg agctgatgca ggccctgaat ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc 540

tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct 600

ttcaggattc gggcagtgac tattgataga gtgatgagct atctgaatgc ttccaagccc 660

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 720

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 780

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 840

ctgtcactgg ttatcaccct ttactaa 867

<210> 4

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> mbIL12A的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly

20 25 30

Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser

35 40 45

Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr

50 55 60

Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr

65 70 75 80

Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser

100 105 110

Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu

115 120 125

Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu

130 135 140

Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala

145 150 155 160

Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val

165 170 175

Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile

180 185 190

Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile

195 200 205

Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro

210 215 220

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

225 230 235 240

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

245 250 255

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

260 265 270

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

275 280 285

<210> 5

<211> 1194

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL12B的核酸序列

<400> 5

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgatatggg aactgaagaa agatgtttat gtcgtagaat tggattggta tccggatgcc 120

cctggagaaa tggtggtcct cacctgtgac acccctgaag aagatggtat cacctggacc 180

ttggaccaga gcagtgaggt cttaggctct ggcaaaaccc tgaccatcca agtcaaagag 240

tttggagatg ctggccagta cacctgtcac aaaggaggcg aggttctaag ccattcgctc 300

ctgctgcttc acaaaaagga agatggaatt tggtccactg atattttaaa ggaccagaaa 360

gaacccaaaa ataagacctt tctaagatgc gaggccaaga attattctgg acgtttcacc 420

tgctggtggc tgacgacaat cagtactgat ttgacattca gtgtcaaaag cagcagaggc 480

tcttctgacc cccaaggggt gacgtgcgga gctgctacac tctctgcaga gagagtcaga 540

ggggacaaca aggagtatga gtactcagtg gagtgccagg aggacagtgc ctgcccagct 600

gctgaggaga gtctgcccat tgaggtcatg gtggatgccg ttcacaagct caagtatgaa 660

aactacacca gcagcttctt catcagggac atcatcaaac ctgacccacc caagaacttg 720

cagctgaagc cattaaagaa ctctcggcag gtggaggtca gctgggagta ccctgacacc 780

tggagtactc cacattccta cttctccctg acattctgcg ttcaggtcca gggcaagagc 840

aagagagaaa agaaagatag agtcttcacg gacaagacct cagccacggt catctgccgc 900

aaaaatgcca gcattagcgt gcgggcccag gaccgctact atagctcatc ttggagcgaa 960

tgggcatctg tgccctgcag taagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 1020

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 1080

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 1140

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctaa 1194

<210> 6

<211> 397

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> mbIL12B的氨基酸序列

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val

20 25 30

Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr

35 40 45

Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu

65 70 75 80

Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu

85 90 95

Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser

100 105 110

Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu

115 120 125

Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu

130 135 140

Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly

145 150 155 160

Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala

165 170 175

Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys

180 185 190

Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu

195 200 205

Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser

210 215 220

Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu

225 230 235 240

Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu

245 250 255

Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe

260 265 270

Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val

275 280 285

Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser

290 295 300

Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu

305 310 315 320

Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

325 330 335

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

340 345 350

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

355 360 365

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

370 375 380

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

385 390 395

<210> 7

<211> 747

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL18的核酸序列

<400> 7

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgtactttg gcaagcttga atctaaatta tcagtcataa gaaatttgaa tgaccaagtt 120

ctcttcattg accaaggaaa tcggcctcta tttgaagata tgactgattc tgactgtaga 180

gataatgcac cccggaccat atttattata agtatgtata aagatagcca gcctagaggt 240

atggctgtaa ctatctctgt gaagtgtgag aaaatttcaa ctctctcctg tgagaacaaa 300

attatttcct ttaaggaaat gaatcctcct gataacatca aggatacaaa aagtgacatc 360

atattctttc agagaagtgt cccaggacat gataataaga tgcaatttga atcttcatca 420

tacgaaggat actttctagc ttgtgaaaaa gagagagacc tttttaaact cattttgaaa 480

aaagaggatg aattggggga tagatctata atgttcactg ttcaaaacga agacaagccc 540

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 600

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 660

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 720

ctgtcactgg ttatcaccct ttactaa 747

<210> 8

<211> 248

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> mbIL18的氨基酸序列

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val

20 25 30

Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg

35 40 45

Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro

50 55 60

Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly

65 70 75 80

Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser

85 90 95

Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn

100 105 110

Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro

115 120 125

Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr

130 135 140

Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys

145 150 155 160

Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn

165 170 175

Glu Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

180 185 190

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

195 200 205

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

210 215 220

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

225 230 235 240

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

245

<210> 9

<211> 706

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL21的核酸序列

<220>

<221> misc_feature

<223> IL21的核酸序列

<400> 9

gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc 60

tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc tcttggggac actggtccac 120

aaatcaagct cccaaggtca agatcgccac atgattagaa tgcgtcaact tatagatatt 180

gttgatcagc tgaaaaatta tgtgaatgac ttggtccctg aatttctgcc agctccagaa 240

gatgtagaga caaactgtga gtggtcagct ttttcctgct ttcagaaggc ccaactaaag 300

tcagcaaata caggaaacaa tgaaaggata atcaatgtat caattaaaaa gctgaagagg 360

aaaccacctt ccacaaatgc agggagaaga cagaaacaca gactaacatg cccttcatgt 420

gattcttatg agaaaaaacc acccaaagaa ttcctagaaa gattcaaatc acttctccaa 480

aaggtatcta ccttaagttt catttgattt tctgctttat ctttacctat ccagatttgc 540

ttcttagtta ctcacggtat actatttcca cagatgattc atcagcatct gtcctctaga 600

acacacggaa gtgaagattc ctgaggatct aacttgcagt tggacactat gttacatact 660

ctaatatagt agtgaaagtc atttctttgt attccaagtg gaggag 706

<210> 10

<211> 155

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> mbIL21的氨基酸序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> IL21的氨基酸序列

<400> 10

Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu

1 5 10 15

Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met

20 25 30

Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp

35 40 45

Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys

50 55 60

Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala

65 70 75 80

Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu

85 90 95

Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg

100 105 110

Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu

115 120 125

Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His

130 135 140

Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser

145 150 155

<210> 11

<211> 1147

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> IL22的核酸序列

<400> 11

cgaccaggtt ctccttcccc agtcaccagt tgctcgagtt agaattgtct gcaatggccg 60

ccctgcagaa atctgtgagc tctttcctta tggggaccct ggccaccagc tgcctccttc 120

tcttggccct cttggtacag ggaggagcag ctgcgcccat cagctcccac tgcaggcttg 180

acaagtccaa cttccagcag ccctatatca ccaaccgcac cttcatgctg gctaaggagg 240

ctagcttggc tgataacaac acagacgttc gtctcattgg ggagaaactg ttccacggag 300

tcagtatgag tgagcgctgc tatctgatga agcaggtgct gaacttcacc cttgaagaag 360

tgctgttccc tcaatctgat aggttccagc cttatatgca ggaggtggtg cccttcctgg 420

ccaggctcag caacaggcta agcacatgtc atattgaagg tgatgacctg catatccaga 480

ggaatgtgca aaagctgaag gacacagtga aaaagcttgg agagagtgga gagatcaaag 540

caattggaga actggatttg ctgtttatgt ctctgagaaa tgcctgcatt tgaccagagc 600

aaagctgaaa aatgaataac taaccccctt tccctgctag aaataacaat tagatgcccc 660

aaagcgattt tttttaacca aaaggaagat gggaagccaa actccatcat gatgggtgga 720

ttccaaatga acccctgcgt tagttacaaa ggaaaccaat gccacttttg tttataagac 780

cagaaggtag actttctaag catagatatt tattgataac atttcattgt aactggtgtt 840

ctatacacag aaaacaattt attttttaaa taattgtctt tttccataaa aaagattact 900

ttccattcct ttaggggaaa aaacccctaa atagcttcat gtttccataa tcagtacttt 960

atatttataa atgtatttat tattattata agactgcatt ttatttatat cattttatta 1020

atatggattt atttatagaa acatcattcg atattgctac ttgagtgtaa ggctaatatt 1080

gatatttatg acaataatta tagagctata acatgtttat ttgacctcaa taaacacttg 1140

gatatcc 1147

<210> 12

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> IL22的氨基酸序列

<400> 12

Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu

1 5 10 15

Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln

35 40 45

Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe

65 70 75 80

His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu

85 90 95

Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln

100 105 110

Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg

115 120 125

Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn

130 135 140

Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu

145 150 155 160

Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn

165 170 175

Ala Cys Ile

<210> 13

<211> 765

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> 4-1BB配体的核酸序列

<400> 13

atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60

gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120

ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180

tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240

cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300

ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360

acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420

tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480

gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540

ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600

ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660

agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720

acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765

<210> 14

<211> 254

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 4-1BB配体的氨基酸序列

<400> 14

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 15

<211> 1534

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> CD3受体ε亚基的核酸序列

<400> 15

tattgtcaga gtcctcttgt ttggccttct aggaaggctg tgggacccag ctttcttcaa 60

ccagtccagg tggaggcctc tgccttgaac gtttccaagt gaggtaaaac ccgcaggccc 120

agaggcctct ctacttcctg tgtggggttc agaaaccctc ctcccctccc agcctcaggt 180

gcctgcttca gaaaatgaag tagtaagtct gctggcctcc gccatcttag taaagtaaca 240

gtcccatgaa acaaagatgc agtcgggcac tcactggaga gttctgggcc tctgcctctt 300

atcagttggc gtttgggggc aagatggtaa tgaagaaatg ggtggtatta cacagacacc 360

atataaagtc tccatctctg gaaccacagt aatattgaca tgccctcagt atcctggatc 420

tgaaatacta tggcaacaca atgataaaaa cataggcggt gatgaggatg ataaaaacat 480

aggcagtgat gaggatcacc tgtcactgaa ggaattttca gaattggagc aaagtggtta 540

ttatgtctgc taccccagag gaagcaaacc agaagatgcg aacttttatc tctacctgag 600

ggcaagagtg tgtgagaact gcatggagat ggatgtgatg tcggtggcca caattgtcat 660

agtggacatc tgcatcactg ggggcttgct gctgctggtt tactactgga gcaagaatag 720

aaaggccaag gccaagcctg tgacacgagg agcgggtgct ggcggcaggc aaaggggaca 780

aaacaaggag aggccaccac ctgttcccaa cccagactat gagcccatcc ggaaaggcca 840

gcgggacctg tattctggcc tgaatcagag acgcatctga ccctctggag aacactgcct 900

cccgctggcc caggtctcct ctccagtccc cctgcgactc cctgtttcct gggctagtct 960

tggaccccac gagagagaat cgttcctcag cctcatggtg aactcgcgcc ctccagcctg 1020

atcccccgct ccctcctccc tgccttctct gctggtaccc agtcctaaaa tattgctgct 1080

tcctcttcct ttgaagcatc atcagtagtc acaccctcac agctggcctg ccctcttgcc 1140

aggatattta tttgtgctat tcactccctt ccctttggat gtaacttctc cgttcagttc 1200

cctccttttc ttgcatgtaa gttgtccccc atcccaaagt attccatcta cttttctatc 1260

gccgtcccct tttgcagccc tctctgggga tggactgggt aaatgttgac agaggccctg 1320

ccccgttcac agatcctggc cctgagccag ccctgtgctc ctccctcccc caacactccc 1380

taccaacccc ctaatcccct actccctcca ccccccctcc actgtaggcc actggatggt 1440

catttgcatc tccgtaaatg tgctctgctc ctcagctgag agagaaaaaa ataaactgta 1500

tttggctgca agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1534

<210> 16

<211> 1017

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mb-抗CD3 scFv的核酸序列

<400> 16

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgcaaattg ttctcaccca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc 120

accatgacct gcagtgccag ctcaagtgta agttacatga actggtacca gcagaagtca 180

ggcacctccc ccaaaagatg gatttatgac acatccaaac tggcttctgg agtccctgct 240

cacttcaggg gcagtgggtc tgggacctct tactctctca caatcagcgg catggaggct 300

gaagatgctg ccacttatta ctgccagcag tggagtagta acccattcac gttcggctcg 360

gggacaaagt tggaaataaa ccggggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 420

ggcggctccg gtggtggtgg atccgaggtc cagctgcagc agtctggggc tgaactggca 480

agacctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacctt tactaggtac 540

acgatgcact gggtaaaaca gaggcctgga cagggtctgg aatggattgg atacattaat 600

cctagccgtg gttatactaa ttacaatcag aagttcaagg acaaggccac attgactaca 660

gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcaa ctgagcagcc tgacatctga ggactctgca 720

gtctattact gtgcaagata ttatgatgat cattactgcc ttgactactg gggccaaggc 780

accactctca cagtctcctc agccaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 960

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactaa 1017

<210> 17

<211> 338

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> mb-抗CD3 scFv的氨基酸序列

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro

50 55 60

Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala

65 70 75 80

His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

100 105 110

Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

145 150 155 160

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr

195 200 205

Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser

210 215 220

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Pro Thr Thr

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

275 280 285

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

290 295 300

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

305 310 315 320

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

325 330 335

Leu Tyr

<210> 18

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD8α跨膜结构域的氨基酸序列

<400> 18

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> FLAG标签的氨基酸序列

<400> 19

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> His标签的氨基酸序列

<400> 20

His His His His His His

1 5

<210> 21

<211> 638

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL15的核酸克隆构建体

<400> 21

gaattcgccc ttccaccatg gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc 60

tgctccacgc cgccaggccg aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag 120

atcttattca atctatgcat attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca 180

gttgcaaagt aacagcaatg aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt 240

ccggagatgc aagtattcat gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacaacagtt 300

tgtcttctaa tgggaatgta acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa 360

aaaatattaa agaatttttg cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt 420

ctaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc 480

tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc 540

tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc 600

tcctgtcact ggttatcacc ctttactgct aactcgag 638

<210> 22

<211> 788

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> 4-1BB配体的核酸克隆构建体

<400> 22

gaattcgccc ttccaccatg gaatacgcct ctgacgcttc actggacccc gaagccccgt 60

ggcctcccgc gccccgcgct cgcgcctgcc gcgtactgcc ttgggccctg gtcgcggggc 120

tgctgctgct gctgctgctc gctgccgcct gcgccgtctt cctcgcctgc ccctgggccg 180

tgtccggggc tcgcgcctcg cccggctccg cggccagccc gagactccgc gagggtcccg 240

agctttcgcc cgacgatccc gccggcctct tggacctgcg gcagggcatg tttgcgcagc 300

tggtggccca aaatgttctg ctgatcgatg ggcccctgag ctggtacagt gacccaggcc 360

tggcaggcgt gtccctgacg gggggcctga gctacaaaga ggacacgaag gagctggtgg 420

tggccaaggc tggagtctac tatgtcttct ttcaactaga gctgcggcgc gtggtggccg 480

gcgagggctc aggctccgtt tcacttgcgc tgcacctgca gccactgcgc tctgctgctg 540

gggccgccgc cctggctttg accgtggacc tgccacccgc ctcctccgag gctcggaact 600

cggccttcgg tttccagggc cgcttgctgc acctgagtgc cggccagcgc ctgggcgtcc 660

atcttcacac tgaggccagg gcacgccatg cctggcagct tacccagggc gccacagtct 720

tgggactctt ccgggtgacc cccgaaatcc cagccggact cccttcaccg aggtcggaat 780

aactcgag 788

<210> 23

<211> 889

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL12A的核酸克隆构建体

<400> 23

gaattcggct tccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60

gctccacgcc gccaggccga gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc 120

atgccttcac cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag 180

acaaactcta gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa 240

agataaaacc agcacagtgg aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg 300

cctaaattcc agagagacct ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac 360

ctcttttatg atggccctgt gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt 420

ggagttcaag accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga 480

tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac 540

tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg 600

catacttctt catgctttca ggattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct 660

gaatgcttcc aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat 720

cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt 780

gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac 840

ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac taactcgag 889

<210> 24

<211> 1216

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL12B的核酸克隆构建体

<400> 24

gaattcggct tccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60

gctccacgcc gccaggccga tatgggaact gaagaaagat gtttatgtcg tagaattgga 120

ttggtatccg gatgcccctg gagaaatggt ggtcctcacc tgtgacaccc ctgaagaaga 180

tggtatcacc tggaccttgg accagagcag tgaggtctta ggctctggca aaaccctgac 240

catccaagtc aaagagtttg gagatgctgg ccagtacacc tgtcacaaag gaggcgaggt 300

tctaagccat tcgctcctgc tgcttcacaa aaaggaagat ggaatttggt ccactgatat 360

tttaaaggac cagaaagaac ccaaaaataa gacctttcta agatgcgagg ccaagaatta 420

ttctggacgt ttcacctgct ggtggctgac gacaatcagt actgatttga cattcagtgt 480

caaaagcagc agaggctctt ctgaccccca aggggtgacg tgcggagctg ctacactctc 540

tgcagagaga gtcagagggg acaacaagga gtatgagtac tcagtggagt gccaggagga 600

cagtgcctgc ccagctgctg aggagagtct gcccattgag gtcatggtgg atgccgttca 660

caagctcaag tatgaaaact acaccagcag cttcttcatc agggacatca tcaaacctga 720

cccacccaag aacttgcagc tgaagccatt aaagaactct cggcaggtgg aggtcagctg 780

ggagtaccct gacacctgga gtactccaca ttcctacttc tccctgacat tctgcgttca 840

ggtccagggc aagagcaaga gagaaaagaa agatagagtc ttcacggaca agacctcagc 900

cacggtcatc tgccgcaaaa atgccagcat tagcgtgcgg gcccaggacc gctactatag 960

ctcatcttgg agcgaatggg catctgtgcc ctgcagtaag cccaccacga cgccagcgcc 1020

gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc 1080

gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat 1140

ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac 1200

cctttactaa ctcgag 1216

<210> 25

<211> 769

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mbIL18的核酸克隆构建体

<400> 25

gaattcggct tccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60

gctccacgcc gccaggccgt actttggcaa gcttgaatct aaattatcag tcataagaaa 120

tttgaatgac caagttctct tcattgacca aggaaatcgg cctctatttg aagatatgac 180

tgattctgac tgtagagata atgcaccccg gaccatattt attataagta tgtataaaga 240

tagccagcct agaggtatgg ctgtaactat ctctgtgaag tgtgagaaaa tttcaactct 300

ctcctgtgag aacaaaatta tttcctttaa ggaaatgaat cctcctgata acatcaagga 360

tacaaaaagt gacatcatat tctttcagag aagtgtccca ggacatgata ataagatgca 420

atttgaatct tcatcatacg aaggatactt tctagcttgt gaaaaagaga gagacctttt 480

taaactcatt ttgaaaaaag aggatgaatt gggggataga tctataatgt tcactgttca 540

aaacgaagac aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat 600

cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt 660

gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac 720

ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac taactcgag 769

<210> 26

<211> 1039

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> mb-抗 CD3 scFv的核酸克隆构建体

<400> 26

gaattcggct tccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct 60

gctccacgcc gccaggccgc aaattgttct cacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc 120

tccaggggag aaggtcacca tgacctgcag tgccagctca agtgtaagtt acatgaactg 180

gtaccagcag aagtcaggca cctcccccaa aagatggatt tatgacacat ccaaactggc 240

ttctggagtc cctgctcact tcaggggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat 300

cagcggcatg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga gtagtaaccc 360

attcacgttc ggctcgggga caaagttgga aataaaccgg ggtggtggtg gttctggtgg 420

tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggtccagc tgcagcagtc 480

tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg tcctgcaagg cttctggcta 540

cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg cctggacagg gtctggaatg 600

gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac aatcagaagt tcaaggacaa 660

ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactga gcagcctgac 720

atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat gatgatcatt actgccttga 780

ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc aagcccacca cgacgccagc 840

gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga 900

ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga 960

tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat 1020

caccctttac taactcgag 1039

Claims (102)

1.基因工程细胞群，其不表达主要组织相容性复合物(MHC)I分子，

其中所述工程细胞群来源于永生化细胞，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合4-1BB配体(4-1BBL)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合白细胞介素，

其中所述工程细胞群不表达主要组织相容性复合物(MHC)I分子，并且

其中所述工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。

2.权利要求1所述的工程细胞群，其中所述mbIL15由包含SEQ ID NO.1的核酸序列编码。

3.权利要求1所述的工程细胞群，其中所述4-1BBL由包含SEQ ID NO.13的核酸序列编码。

4.权利要求1所述的工程细胞群，其中每个膜结合分子与人CD8α的跨膜结构域偶联。

5.权利要求4所述的工程细胞群，其中人CD8α的所述跨膜结构域包含SEQ ID NO.18的序列。

6.权利要求1所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群来源于选自以下的细胞系：K562细胞、肾母细胞瘤细胞系HFWT、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑素瘤细胞系HMV-II、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130或Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB19或NB69、胚胎癌睾丸细胞系NEC14、宫颈癌细胞系TCO-2和神经母细胞瘤细胞系TNB1。

7.权利要求1所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群缺少MHC II分子的表达。

8.权利要求1所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群来源于K562细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12A或其片段。

10.权利要求9所述的工程细胞群，其中所述IL12A包含SEQ ID NO.4的序列。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12B或其片段。

12.权利要求11所述的工程细胞群，其中所述IL12B包含SEQ ID NO.6的序列。

13.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12A和IL12B或其片段。

14.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群还表达膜结合IL18(mbIL18)或其片段。

15.权利要求14所述的工程细胞群，其中所述IL18包含SEQ ID NO.8的序列。

16.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群还表达膜结合IL21(mbIL21)或其片段。

17.权利要求16所述的工程细胞群，其中所述IL21包含SEQ ID NO.10的序列或其片段。

18.权利要求1所述的工程细胞群，其中所述细胞表达膜结合IL22(mbIL22)或其片段。

19.权利要求18所述的工程细胞群，其中所述IL22包含SEQ ID NO.12的序列或其片段。

20.根据权利要求1至8中任一项所述的工程细胞群，其中所述细胞还包含膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)、其抗体片段或scFv。

21.权利要求20所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3是单克隆抗体。

22.权利要求21所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3靶向SEQ ID NO.15的CD3ε核酸序列内的表位。

23.权利要求20所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3是scFv。

24.权利要求23所述的工程细胞群，其中所述scFv包含SEQ ID NO.17的序列。

25.用于扩增免疫细胞的方法，其包括将包含免疫细胞的血液样品与权利要求1至24中任一项所述的工程细胞群共培养。

26.权利要求25所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。

27.基因工程细胞群，其不表达主要组织相容性复合物(MHC)I分子，

其中所述工程细胞群来源于癌细胞，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合4-1BB配体(4-1BBL)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合白细胞介素，并且

其中所述工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。

28.权利要求27所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12A或其片段。

29.权利要求28所述的工程细胞群，其中所述IL12A包含SEQ ID NO.4的序列。

30.权利要求28所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12B或其片段。

31.权利要求30所述的工程细胞群，其中所述IL12B包含SEQ ID NO.6的序列。

32.权利要求27所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12A和IL12B或其片段。

33.根据权利要求27至32中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群还表达膜结合IL18(mbIL18)或其片段。

34.权利要求33所述的工程细胞群，其中所述IL18包含SEQ ID NO.8的序列。

35.根据权利要求27至34中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群表达膜结合IL21(mbIL21)或其片段。

36.权利要求35所述的工程细胞群，其中所述IL21包含SEQ ID NO.10的序列或其片段。

37.根据权利要求27至36中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群表达膜结合IL22(mbIL22)或其片段。

38.权利要求37所述的工程细胞群，其中所述IL22包含SEQ ID NO.12的序列或其片段。

39.根据权利要求27至38中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群还包含膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)、其抗体片段或scFv。

40.权利要求39所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3是单克隆抗体。

41.根据权利要求39或40所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3靶向SEQ ID NO.15的CD3ε核酸序列内的表位。

42.权利要求39所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3是scFv。

43.权利要求42所述的工程细胞群，其中所述scFv包含SEQ ID NO.17的序列。

44.根据权利要求27至43中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群来源于选自以下的细胞系：K562细胞、肾母细胞瘤细胞系HFWT、子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑素瘤细胞系HMV-II、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞系Lu-130或Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB19或NB69、胚胎癌睾丸细胞系NEC14、宫颈癌细胞系TCO-2和神经母细胞瘤细胞系TNB1。

45.根据权利要求27至44中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞缺少MHC II分子的表达。

46.权利要求45所述的工程细胞群，其中所述工程细胞群来源于K562细胞。

47.根据权利要求27至46中任一项所述的工程细胞群，其中每个膜结合分子与人CD8α的跨膜结构域偶联。

48.权利要求47所述的工程细胞群，其中人CD8α的所述跨膜结构域包含SEQ ID NO.18的序列。

49.根据权利要求27至48中任一项所述的工程细胞群，其中所述mbIL15由包含SEQ IDNO.1的核酸序列编码。

50.根据权利要求27至49中任一项所述的工程细胞群，其中所述4-1BBL由包含SEQ IDNO.13的核酸序列编码。

51.基因工程细胞群，其不表达主要组织相容性复合物(MHC)I分子，

其中所述工程细胞群来源于癌细胞，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)，

其中所述工程细胞群被修饰以膜结合表达4-1BB配体(4-1BBL)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达刺激免疫细胞活化的膜结合抗CD3抗体(mbα-CD3)，并且

其中所述工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增。

52.权利要求51所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3是单克隆抗体。

53.根据权利要求51或52所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3靶向SEQ ID NO.15的CD3ε核酸序列内的表位。

54.权利要求51所述的工程细胞群，其中所述mbα-CD3是scFv。

55.权利要求54所述的工程细胞群，其中所述scFv包含SEQ ID NO.17的序列。

56.根据权利要求51至55中任一项所述的工程细胞群，其中所述细胞还表达至少一种膜结合白细胞介素或其片段。

57.权利要求56所述的工程细胞群，其中所述白细胞介素包含IL12A或其片段。

58.权利要求57所述的工程细胞群，其中所述IL12A包含SEQ ID NO.4的序列。

59.根据权利要求56至58中任一项所述的工程细胞群，其中所述至少一种膜结合白细胞介素或其片段包含IL12B或其片段。

60.权利要求59所述的工程细胞群，其中所述IL12B至少一种膜结合白细胞介素或其片段SEQ ID NO.6的序列。

61.根据权利要求56至60中任一项所述的工程细胞群，其中所述至少一种膜结合白细胞介素或其片段包含IL12A和IL12B或其片段。

62.根据权利要求56至67中任一项所述的工程细胞群，其中所述细胞还表达膜结合IL18(mbIL18)或其片段。

63.权利要求62所述的工程细胞群，其中所述IL18包含SEQ ID NO.8的序列。

64.根据权利要求56至63中任一项所述的工程细胞群，其中所述细胞表达膜结合IL21(mbIL21)或其片段。

65.权利要求64所述的工程细胞群，其中所述IL21包含SEQ ID NO.10的序列或其片段。

66.根据权利要求56至65中任一项所述的工程细胞群，其中所述细胞表达膜结合IL22(mbIL22)或其片段。

67.权利要求66所述的工程细胞群，其中所述IL22包含SEQ ID NO.12的序列或其片段。

68.根据权利要求25至67中任一项所述的工程细胞群，其中所述工程细胞适合于免疫细胞的扩增。

69.权利要求68所述的工程细胞群，其中所扩增的免疫细胞是NK细胞。

70.用于扩增NK细胞的方法，其包括将包含NK细胞的样品与权利要求25至69中任一项所述的工程细胞群共培养。

71.用于制备权利要求25至69中任一项所述的工程细胞群的方法，其包括：

用编码mbIL15的第一构建体转导细胞，从而产生第一经转导的细胞群，

扩增所述第一经转导的细胞群，

用编码4-1BBL的第二构建体转导所述第一经转导的细胞群，从而产生第二经转导的细胞群，

用编码至少一种能够刺激免疫细胞的另外的分子的第三构建体转导所述第二经转导的细胞群，从而产生第三经转导的细胞群，以及

扩增所述第三经转导的细胞群。

72.用于制备权利要求25至69中任一项所述工程细胞群的多种核酸，其包含以下至少3种：

编码mbIL15的核酸，

编码4-1BBL的核酸，

编码mbIL12A的核酸，

编码mbIL12B的核酸，

编码mbIL18的核酸，

编码mbIL21的核酸，

编码mbIL22的核酸，以及

编码mbα-CD3的核酸。

73.权利要求72所述的多种核酸，其中所述多种核酸被配置成单构建体。

74.权利要求72所述的多种核酸，其中mbIL15由包含SEQ ID NO.1的核酸序列编码。

75.权利要求72所述的多种核酸，其中4-1BBL由包含SEQ ID NO.13的核酸序列编码。

76.权利要求72所述的多种核酸，其中mbIL12A由包含SEQ ID NO.3的核酸序列编码。

77.权利要求72所述的多种核酸，其中mbIL12B由包含SEQ ID NO.5的核酸序列编码。

78.权利要求72所述的多种核酸，其中mbIL18由包含SEQ ID NO.7的核酸序列编码。

79.权利要求72所述的多种核酸，其中mbIL21由包含SEQ ID NO.9的核酸序列或其片段编码。

80.权利要求72所述的多种核酸，其中mbIL22由包含SEQ ID NO.11的核酸序列或其片段编码。

81.权利要求72所述的多种核酸，其中mbα-CD3由包含SEQ ID NO.16的核酸序列编码。

82.权利要求72所述的多种核酸，其中所述多种核酸中的每一种还包含GFP标签。

83.用于扩增NK细胞的方法，其包括：

a)获得包含含有NK细胞和T细胞的混合免疫细胞群的外周血样品，

b)使混合细胞群与工程细胞群接触，所述工程细胞群表现出降低的MHC I表达并且已被修饰以表达：

i)膜结合白细胞介素-15(mbIL15)，

ii)4-1BB配体(4-1BBL)，以及

iii)至少一种刺激免疫细胞活化的另外的分子，以及

c)将所述混合细胞群与所述工程细胞共培养足以扩增所述混合免疫细胞群中的NK细胞的一段时间，从而扩增NK细胞。

84.权利要求83所述的方法，其任选地还包括在共培养之前或之后从该混合群中除去T细胞。

85.经修饰细胞系，其包含缺少主要组织相容性复合物I分子的K562髓性白血病细胞，其中所述K562髓性白血病细胞被遗传修饰以表达膜结合白细胞介素-15、4-1BB配体和膜结合抗CD3抗体。

86.经修饰细胞系，其包含缺少主要组织相容性复合物I分子的K562髓性白血病细胞，其中所述K562髓性白血病细胞被遗传修饰以表达膜结合白细胞介素-15、膜结合4-1BB配体和至少一种另外的膜结合白细胞介素。

87.权利要求86所述的经修饰细胞系，其中所表达的所述另外的膜结合白细胞介素是白细胞介素-12。

88.权利要求86所述的经修饰细胞系，其中所表达的所述另外的膜结合白细胞介素是白细胞介素-18。

89.权利要求86所述的经修饰细胞系，其中所表达的所述另外的膜结合白细胞介素是白细胞介素-12和白细胞介素-18。

90.根据权利要求86至89中任一项所述的经修饰细胞系，其还包含膜结合抗CD3抗体。

91.根据权利要求86至90中任一项所述的经修饰细胞系，其还包含mbIL12A、mbIL12B、mbIL18、mbIL21、mbIL22和mbα-CD3中的一种或更多种。

92.经修饰细胞系，其包含缺少主要组织相容性复合物I分子的K562髓性白血病细胞，其中所述K562髓性白血病细胞被遗传修饰以表达膜结合白细胞介素-15、膜结合4-1BB配体、膜结合抗CD3抗体和至少一种另外的膜结合白细胞介素。

93.权利要求92所述的经修饰细胞系，其中所表达的所述另外的膜结合白细胞介素是白细胞介素-12。

94.权利要求92所述的经修饰细胞系，其中所表达的所述另外的膜结合白细胞介素是白细胞介素-18。

95.权利要求92所述的经修饰细胞系，其中所表达的所述另外的膜结合白细胞介素是白细胞介素-12和白细胞介素-18。

96.权利要求92所述的经修饰细胞系，其中所述至少一种另外的白细胞介素包含mbIL12A、mbIL12B、mbIL18、mbIL21和mbIL22中的一种或更多种。

97.通过将包含NK细胞和T淋巴细胞的混合细胞培养物与权利要求85至86中任一项所述的经修饰细胞系一起培养而扩增的NK细胞群。

98.权利要求97所述的NK细胞群用于治疗癌症或感染性疾病的用途。

99.根据权利要求25至69中任一项所述的工程细胞群用于扩增免疫细胞群的用途，其中所述免疫细胞群适用于治疗癌症或感染性疾病，并且其中所述免疫细胞群包含NK细胞。

100.治疗癌症或感染性疾病的方法，其包括：

向患有癌症或感染性疾病的对象施用包含经扩增免疫细胞群的组合物，

其中所述免疫细胞已通过将所述免疫细胞与工程细胞群共培养而扩增，

其中所述工程细胞群来源于癌细胞，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合4-1BB配体(4-1BBL)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达至少一种刺激免疫细胞活化的另外的膜结合白细胞介素，

其中所述工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增，以及

其中所述至少一个免疫细胞亚群施用于所述对象。

101.权利要求100所述的方法，其中所施用的细胞亚群包含NK细胞。

102.治疗癌症或感染性疾病的方法，其包括：

向患有癌症或感染性疾病的对象施用包含经扩增免疫细胞群的组合物，

其中所述免疫细胞已通过将所述免疫细胞与工程细胞群共培养而扩增，

其中所述工程细胞群来源于癌细胞，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合白细胞介素-15(mbIL15)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达膜结合4-1BB配体(4-1BBL)，

其中所述工程细胞群被修饰以表达抗CD-3抗体，

其中所述工程细胞群与免疫细胞群的共培养导致至少一个免疫细胞亚群的活化和扩增，以及

其中所述至少一个免疫细胞亚群施用于所述对象。