CN107206060A - 基于李斯特菌的疫苗与抗ox40或抗gitr抗体的组合 - Google Patents

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Abstract

本文公开了组合物，包括包含减毒活重组李斯特菌菌株的组合物的用途，所述减毒活重组李斯特菌菌株包含融合到异源性抗原的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的融合蛋白，所述异源性抗原包括肿瘤相关抗原，其中所述组合物还包含抗体或其片段或与抗体或其片段共施用。还公开了用于治疗、防御肿瘤和/或诱导对肿瘤的免疫应答的组合疗法，所述组合疗法包括与抗体或其片段相结合使用这些包含减毒活重组李斯特菌菌株的组合物，特别是其中所述治疗、防御和/或诱导免疫应答增加受试者的存活百分比。

Description

基于李斯特菌的疫苗与抗OX40或抗GITR抗体的组合
技术领域
本文公开了组合物，包括包含减毒活重组李斯特菌(Listeria)菌株的组合物的用途，所述减毒活重组李斯特菌菌株包含融合到异源性抗原的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的融合蛋白，所述异源性抗原包括肿瘤相关抗原，其中所述组合物还包含抗体或其片段或与抗体或其片段共施用。还公开了用于治疗、防御肿瘤和/或诱导对肿瘤的免疫应答的组合疗法，所述组合疗法包括与抗体或其片段相结合使用这些包含减毒活重组李斯特菌菌株的组合物，特别是其中所述治疗、防御和/或诱导免疫应答增加受试者的存活百分比。
背景技术
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(Lm)是导致李斯特菌溶血的革兰氏阳性兼性细胞内病原体。一旦侵入宿主细胞，Lm即可通过产生裂解血管膜的成孔蛋白李斯特菌溶血素O(LLO)而逃离吞噬溶酶体，使其进入细胞质，在该处根据肌动蛋白多聚化蛋白(ActA)的迁移性复制并传播到相邻的细胞。在细胞质中，Lm分泌蛋白被蛋白酶降解，并加工为内质网中与MHC I类分子相关的肽。此独特特性使其成为非常有吸引力的癌症疫苗载体，因为肿瘤抗原可通过MHC I类分子呈递，以活化肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
此外，一旦被吞噬，Lm即可在吞噬溶酶体隔室中加工，并且肽在MHC II类上呈递以用于Lm特异性CD4-T细胞应答的激活。或者，Lm可逃离吞噬体并进入胞质溶胶，在胞质溶胶中，肽聚糖被核寡聚域样受体识别以及Lm DNA被DNA传感蛋白AIM2识别将激活炎性级联反应。该炎性应答和抗原向MHC I和MHC II通路的有效递送的组合使Lm成为治疗肿瘤、防御肿瘤和诱导对肿瘤的免疫应答的强大疫苗载体。
然而，肿瘤细胞通常诱导了免疫抑制微环境，这有助于免疫细胞诸如髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)的免疫抑制群体的形成。理解肿瘤的免疫调节的复杂性对于免疫疗法的开发是重要的。各种增强抗肿瘤免疫应答和克服“免疫检查点”的策略正在开发中。此外，组合免疫疗法的施用可提供更有效和持久的应答。
例如，肿瘤介导的免疫抑制的若干机理之一是肿瘤对T细胞共刺激分子的表达。这些分子在接合到其配体之后可抑制外周和肿瘤微环境中的效应淋巴细胞。
目前，仍需要为可消除肿瘤生长和癌症的肿瘤靶向方法提供有效的组合疗法。本发明通过提供基于李斯特菌的疫苗与包括添加抗体或其片段的各种疗法的组合而解决该需求，该组合可增强或促进记忆和效应T细胞的增殖，并激活T细胞或抗原呈递细胞上的共刺激受体。据认为，共刺激除了因施用基于李斯特菌的疫苗而导致的抗原呈递外可能还对产生针对特定肿瘤或癌症的有效抗肿瘤免疫应答至关重要。
靶向免疫调节疗法主要关注于共刺激受体的激活，例如通过使用靶向肿瘤坏死因子受体超家族的成员的激动剂抗体，这些成员包括4-1BB、OX40和GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体相关的)。GITR的调节已展示出在抗肿瘤和疫苗情形中的潜力。激动剂抗体的另一靶标是用于T细胞激活的共刺激信号分子。靶向共刺激信号分子可导致增强T细胞激活并促进更强效的免疫应答。共刺激还可有助于防止抑制性影响受到检查点抑制，并增加抗原特异性T细胞增殖。遗憾的是，使用此类激动剂抗体可导致毒性问题。因此，有必要开发抗肿瘤免疫疗法以确立与所考虑的基于李斯特菌的免疫治疗组合物相结合的任何激动剂抗体的安全有效剂量。
因此，仍然需要对与任何免疫疗法激动剂抗体结合的基于李斯特菌的免疫治疗组合物的施用剂量和计划进行优化。本发明还通过提供基于李斯特菌的疫苗与响应于肿瘤发生的激动剂抗体的组合而解决这一需求。
鉴于某些疾病(包括癌症)的复杂性，存在对治疗这些疾病的组合方法的需求。如在下文的“具体实施方式”中所见，这些组合疗法可改善免疫疗法的总体抗肿瘤功效。
发明内容
在一个方面，本公开涉及一种包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个方面，抗体或其片段是激动剂抗体或其片段。在另一个方面，抗体或其片段结合到抗原或其部分，所述抗原或其部分包括T细胞受体共刺激分子、抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子或TNF受体超家族的成员。
在另一个方面，本公开涉及一种免疫源性组合物，所述组合物包含含有核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个方面，抗体或其片段是激动剂抗体或其片段。在另一个方面，抗体或其片段结合到抗原或其部分，所述抗原或其部分包括T细胞受体共刺激分子、抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子或TNF受体超家族的成员。在另一个相关方面，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子编码截短LLO蛋白。在另一个相关方面，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子编码截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在一个相关方面，本发明涉及一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
在另一个相关方面，本公开涉及引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括使用包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
在另一个相关方面，本公开涉及一种增加受试者中的抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
在另一个相关方面，本公开涉及一种增加受试者中的T细胞应答的方法，所述方法包括使用包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
在另一个相关方面，本公开涉及一种治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
在另一个相关方面，本方面的用于治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法包括使用包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
在另一个相关方面，本发明涉及一种增加受试者存活的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个相关方面，本方面的用于增加受试者存活的方法包括使用包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗TNF受体抗体或其片段的组合物的步骤。
本发明的其他特征和优点将由于以下详细描述的实例和附图而变得显而易见。但是，应当理解，该详细描述和具体实例尽管指出了本发明的优选实施例，但是仅仅通过例证给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对阅读了该详细描述的本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
被视为本发明的主题在说明书的结论部分特别指出并明确要求进行保护。然而，在结合附图阅读时，通过参考以下具体实施方式，可以最好地理解本发明(对组织和操作方法来说皆是如此)及其目的、特征和优点，在附图中：
图1A和1B.Lm-E7和Lm-LLO-E7(ADXS11-001)使用不同的表达系统来表达和分泌E7。通过将基因盒引入单核细胞增多性李斯特菌基因组的orfZ域中来产生Lm-E7(图1A)。hly启动子驱动hly信号序列和LLO的前五个氨基酸(AA)以及随后的HPV-16E7的表达。(图1B)，通过以质粒pGG-55转化prfA-菌株XFL-7来产生Lm-LLO-E7。pGG-55具有驱动LLO-E7非溶血性融合体的表达的hly启动子。pGG-55也含有prfA基因，以选择XFL-7在体内对质粒的保留。
图2.Lm-E7和Lm-LLO-E7分泌E7。使Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)和10403S(泳道6)在Luria-Bertoni液体培养基中于37℃生长过夜。沉淀相等数目的细菌(通过600nm处吸光度OD确定)，并将18ml的每种上清液进行TCA沉淀。通过Western印迹分析E7表达。用抗E7mAb、随后用HRP-偶联的抗小鼠(Amersham)探测该印迹，接着使用ECL检测试剂显影。
图3.LLO-E7融合体的肿瘤免疫抑制功效。显示了肿瘤接种后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米计的肿瘤大小。未暴露的小鼠：空心圆圈；Lm-LLO-E7：实心圆圈；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；和Lm-LLO-NP：实心三角形。
图4.来自Lm-LLO-E7-免疫的小鼠的脾细胞在暴露于TC-1细胞时增殖。将C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或对照rLm菌株免疫和强化。在强化后6天收获脾细胞，并以显示的比率与经照射的TC-1细胞一起铺板。将细胞用3H胸苷脉冲处理并收获。将Cpm定义为(实验cpm)-(无TC-1对照)。
图5A和5B.(图5A)Western印迹证实Lm-ActA-E7分泌E7。泳道1：Lm-LLO-E7；泳道2：Lm-ActA-E7.001；泳道3；Lm-ActA-E7-2.5.3；泳道4：Lm-ActA-E7-2.5.4。(图5B)施用Lm-ActA-E7(矩形)、Lm-E7(椭圆形)、Lm-LLO-E7(X)和未暴露的小鼠(未接种疫苗；实心三角形)的小鼠中的肿瘤大小。
图6A-6C.(图6A)用于制备4种LM疫苗的质粒插入片段的示意图。Lm-LLO-E7插入片段含有所有使用的李斯特菌基因。它含有hly启动子、hly基因(其编码蛋白LLO)的前1.3kb和HPV-16E7基因。hly的该前1.3kb包括信号序列(ss)和PEST区域。Lm-PEST-E7包括hly启动子、信号序列以及PEST和E7序列，但是不包括截短的LLO基因的剩余部分。Lm-ΔPEST-E7不包括PEST区域，但是含有hly启动子、信号序列、E7和截短的LLO的剩余部分。Lm-E7epi仅具有hly启动子、信号序列和E7。(图6B)上部插图：含有PEST区域的李斯特菌构建体诱导肿瘤消退。下部插图：在2个单独实验中肿瘤挑战后第28天时的平均肿瘤大小。(图6C)含有PEST区域的李斯特菌构建体在脾中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。显示了来自3个实验的数据的平均值和SE。
图7A和7B.(图7A)在施用TC-1肿瘤细胞并随后施用Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或无疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中E7特异性的分泌IFN-γ的CD8+T细胞的诱导和浸润肿瘤的数目。(图7B)针对(图7A)描述的小鼠的脾和肿瘤中E7特异性的CD8+细胞的诱导和浸润。
图8A和8B.含有PEST区域的李斯特菌构建体在肿瘤中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。(图8A)来自1个实验的代表性数据。(图8B)来自所有3个实验的数据的平均值和SE。
图9.来自队列1和2的数据，指明在实例6所展示的临床试验中在患者中观察到的疗效。
图10A和10B.(图10A)在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图；(图10B)klk3基因被整合进Lmdd和LmddA染色体。使用klk3特异性引物对来自各构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的714bp的条带，缺乏野生型蛋白的分泌信号序列。
图11A-11D.(图11A)pADV134质粒的图谱。(图11B)使来自LmddA-134培养上清液的蛋白质沉淀，在SDS-PAGE中分离，并且通过Western印迹使用抗E7单克隆抗体来检测LLO-E7蛋白。抗原表达盒由hly启动子、截短的LLO的ORF和人PSA基因(klk3)组成。(图11C)pADV142质粒的图谱。(图11D)Western印迹显示使用抗PSA和抗LLO抗体的LLO-PSA融合蛋白的表达。
图12A和12B.(图12A)在具有和不具有选择压力(D-丙氨酸)的情况下培养时LmddA-LLO-PSA的体外质粒稳定性。首先列出菌株和培养条件，然后列出用于CFU测定的板。(图12B)LmddA-LLO-PSA体内清除和此时间期间的潜在质粒损失的评价。静脉内注射细菌并且在指定时间点从脾脏分离。在BHI和BHI+D-丙氨酸板上测定CFU。
图13A和13B.(图13A)在C57BL/6小鼠中施用108个CFU之后的菌株LmddA-LLO-PSA的体内清除。通过在BHI/str板上铺板来测定CFU数量。此方法的检测限为100个CFU。(图13B)使用10403S、LmddA-LLO-PSA和XFL7菌株进行的J774细胞的细胞感染测定。
图14A-14E.(图14A)在强化剂量之后第6天时，未暴露的小鼠和LmddA-LLO-PSA免疫小鼠的脾细胞中的PSA四聚物特异性细胞。(图14B)使用PSA肽刺激未暴露的小鼠和LmddA-LLO-PSA免疫小鼠的脾细胞中IFN-γ的胞内细胞因子染色5小时。使用基于半胱天冬酶的测定法(图14C)和基于铕的测定法(图14D)，在不同效应子/靶比率下，来自LmddA-LLO-PSA免疫小鼠和未暴露的小鼠的体外刺激效应T细胞对用PSA肽脉冲处理的EL4细胞的特异性裂解。在PSA肽存在下或无肽存在下刺激24小时后获得的未暴露的和经免疫的脾细胞中的IFNγ斑点数(图14E)。
图15A-15C.用LmddA-142免疫引起Tramp-C1-PSA(TPSA)肿瘤消退。小鼠不做处理(n＝8)(图15A)或在第7天、第14天和第21天用LmddA-142(1×108个CFU/小鼠)(n＝8)(图15B)或Lm-LLO-PSA(n＝8)(图15C)腹膜内免疫。测量各个肿瘤的肿瘤大小并且值表示为以毫米为单位的平均直径。各线表示单个小鼠。
图16A和16B.(图16A)未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA(LmddA-142)免疫的小鼠的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的PSA-四聚物+CD8+T细胞的分析。(图16B)未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的CD4+调节性T细胞(定义为CD25+FoxP3+)的分析。
图17A和17B.(图17A)在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图；(图8B)klk3基因被整合进Lmdd和LmddA染色体。使用klk3特异性引物对来自各构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的760bp的条带。
图18A-C.(图18A)Lmdd-143和LmddA-143分泌LLO-PSA蛋白。使来自细菌培养上清液的蛋白质沉淀，在SDS-PAGE中分离并且通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来检测LLO和LLO-PSA蛋白；(图18B)Lmdd-143和LmddA-143产生的LLO保留溶血活性。将绵羊红细胞与细菌培养上清液的连续稀释液一起培育并且通过590nm下的吸光度测量溶血活性；(图18C)Lmdd-143和LmddA-143在巨噬细胞样J774细胞内部生长。将J774细胞与细菌一起培育1小时，随后用庆大霉素处理以杀死胞外细菌。通过对在指示时间点获得的J774裂解物的连续稀释液进行铺板来测量胞内生长。Lm 10403S在这些实验中用作对照。
图19.用Lmdd-143和LmddA-143免疫小鼠诱导PSA特异性免疫应答。将C57BL/6小鼠用1x108个CFU的Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142以1周间隔免疫两次，并且在7天后收获脾脏。在莫能菌素(monensin)存在下用1μM PSA65-74肽刺激脾细胞5小时。针对CD8、CD3、CD62L和胞内IFN-γ对细胞进行染色并且在FACS Calibur细胞计数器中分析。
图20A和20B.图中显示了肿瘤中MDSC和Treg的减少。在Lm疫苗接种(LmddA-PSA和LmddA-E7)后MDSC(图20B)和Treg(图20A)的数量。
图21A-21D.图中显示了抑制测定数据，证实来自TPSA23肿瘤(表达PSA的肿瘤)的单核MDSC在李斯特菌接种后抑制性较差。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性，因为用PSA-抗原特异性T细胞以及用非特异性刺激的T细胞观察到相同的抑制降低。在图21A和21B中，佛波醇-肉豆蔻酸酯-乙酸酯和离子霉素(PMA/I)代表非特异性刺激。在图21C和21D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图21A和21C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图21B和21D显示了合并的分裂周期。
图22A-22D显示了抑制测定数据，证实李斯特菌对脾单核MDSC无影响，且它们仅以抗原特异性方式产生抑制。在图22A和22B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图22C和22D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图22A和22C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图22B和22D显示了合并的分裂周期。
图23A-23D显示了抑制测定数据，证实来自肿瘤的粒细胞MDSC在李斯特菌接种后减弱了抑制T细胞的能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性，因为用PSA-抗原特异性T细胞以及用非特异性刺激的T细胞观察到相同的抑制降低。在图23A和23B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图23C和23D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图23A和23C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图23B和23D显示了合并的分裂百分比。
图24A-24D显示了抑制测定数据，证实李斯特菌对脾粒细胞MDSC无影响，且它们仅以抗原特异性方式产生抑制。在图24A和24B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图24C和24D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图24A和24C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图24B和24D显示了合并的分裂百分比。
图25A-25D显示了抑制测定数据，证实来自肿瘤的Treg仍是抑制性的。在该肿瘤模型中，Treg的抑制能力以非抗原特异性方式轻微下降。在图25A和25B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图25C和25D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无Treg组显示当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示Treg不存在时受刺激的细胞的分裂。图25A和25C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图25B和25D显示了合并的分裂百分比。
图26A-26D显示了抑制测定数据，证实脾Treg仍是抑制性的。在图26A和26B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图26C和26D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无Treg组显示当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示Treg不存在时受刺激的细胞的分裂。图26A和26C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图26B和26D显示了合并的分裂百分比。
图27A-27D显示了抑制测定数据，证实常规的CD4+T细胞对细胞分裂无影响，无论它们是在小鼠的肿瘤还是脾中发现的。在图27A和27B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图27C和27D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD3+CD8+代表％效应(应答)T细胞。无Treg组显示当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示Treg不存在时受刺激的细胞的分裂。图27C-27D显示来自合并的百分比分裂的数据。
图28A-28D显示了抑制测定数据，证实来自4T1肿瘤(表达Her2的肿瘤)的单核MDSC在李斯特菌接种后具有减弱的抑制能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性，因为用Her2/neu抗原特异性T细胞以及用非特异性刺激的T细胞观察到相同的抑制降低。在图28A和28B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图28C和28D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图28A和28C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图28B和28D显示了合并的分裂百分比。
图29A-29D显示了抑制测定数据，证实对脾单核MDSC无李斯特菌特异性影响。在图29A和29B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图29C和29D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图29A和29C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图29B和29D显示了合并的分裂百分比。
图30A-30D显示了抑制测定数据，证实来自4T1肿瘤(表达Her2的肿瘤)的粒细胞MDSC在李斯特菌接种后具有减弱的抑制能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性，因为用Her2/neu抗原特异性T细胞以及用非特异性刺激的T细胞观察到相同的抑制降低。在图30A和30B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图30C和30D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图30A和30C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图30B和30D显示了合并的分裂百分比。
图31A-31D显示了抑制测定数据，证实对脾粒细胞MDSC无李斯特菌特异性影响。在图31A和31B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图31C和31D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD8+代表％效应(应答)T细胞。无MDSC组显示出当它们不受刺激时缺乏应答T细胞的分裂，最后一组(添加了PMA/I或肽)显示不存在MDSC时受刺激的细胞的分裂。图31A和31C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图31B和31D显示了合并的分裂百分比。
图32A-32D显示了抑制测定数据，证实来自4T1肿瘤(表达Her2的肿瘤)的Treg在李斯特菌接种后抑制能力减弱。在图32A和32B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图32C和32D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD8+代表％效应(应答)T细胞。这种减弱为非抗原特异性的，因为用Her2/neu特异性和非特异性应答T细胞都看到Treg抑制能力的变化。图32A和32C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图32B和32D显示了合并的分裂百分比。
图33A-33D显示了抑制测定数据，证实对脾Treg无李斯特菌特异性影响。应答T细胞都能够分裂，无论它们是否是抗原特异性的。在图33A和33B中，PMA/I代表非特异性刺激。在图33C和33D中，术语“肽”代表特异性抗原刺激。百分比(％)CD8+代表％效应(应答)T细胞。图33A和33C显示了每个组的单个细胞分裂周期。图33B和33D显示了合并的分裂百分比。
图34A-34D显示了抑制测定数据，证实粒细胞MDSC的抑制能力是由于tLLO的过表达，且独立于伴侣融合抗原。左侧插图(图34A和34C)显示了每个组的单个细胞分裂周期。右侧插图(图34B和34D)显示了合并的分裂百分比。
图35A-35D显示了抑制测定数据，也证实单核MDSC的抑制能力是由于tLLO的过表达，且独立于伴侣融合抗原。左侧插图(图35A和35C)显示了每个组的单个细胞分裂周期。右侧插图(图35B和35D)显示了合并的分裂百分比。
图36A-36D显示了抑制测定数据，证实在Lm接种后，从脾纯化的粒细胞MDSC保留了它们抑制抗原特异性应答T细胞分裂的能力(图36A和36B)。但是，在非特异性刺激以后，(以PMA/离子霉素)激活的T细胞仍然能够分裂(图36C和36D)。左侧插图显示了每个组的单个细胞分裂周期。右侧插图显示了合并的分裂百分比。
图37A-37D显示了抑制测定数据，证实在Lm接种后，从脾纯化的单核MDSC保留了它们抑制抗原特异性应答T细胞分裂的能力(图37A和37B)。然而，在非特异性激活(以PMA/离子霉素刺激)以后，T细胞仍然能够分裂(图37C和37D)。左侧插图显示了每个组的单个细胞分裂周期。右侧插图显示了合并的分裂百分比。
图38A-38D显示了抑制测定数据，证实不论应答细胞是抗原特异性(图38A和38B)还是非特异性(图38C和38D)激活的，从任意Lm处理组的肿瘤纯化的Treg具有稍微减弱的抑制应答T细胞分裂的能力。左侧插图显示了每个组的单个细胞分裂周期。右侧插图显示了合并的分裂百分比。
图39A-39D显示了抑制测定数据，证实从脾纯化的Treg仍能够抑制抗原特异性(图39A-39B)和非特异性(图39C和39D)活化的应答T细胞的分裂。
图40A-40D显示了抑制测定数据，证实肿瘤Tcon细胞不能抑制T细胞的分裂，无论该应答细胞是抗原特异性(图40A和40B)还是非特异性活化的(图40C和40D)。
图41A-41D显示了抑制测定数据，证实肿瘤Tcon细胞不能抑制T细胞的分裂，无论该应答细胞是抗原特异性(图41A和41B)还是非特异性活化的(图41C和41D)。
图42A-42C.(图42A)接受基于李斯特菌的疫苗(ADXS11-001，其为Lm-LLO-E7)与抗OX40抗体的组合的小鼠的治疗计划的示意图，其中在整个实验中监测肿瘤生长和小鼠存活。(图42B)接受基于李斯特菌的疫苗(ADXS11-001，其为Lm-LLO-E7)与抗GITR抗体的组合的小鼠的治疗计划的示意图，其中在整个实验中监测肿瘤生长和小鼠存活。对于两者(图42A)和(图42B)而言，在第0天，向小鼠注射7×105个TC-1肿瘤细胞以引发肿瘤形成。疫苗接种从第10天开始。对照包括LmddA-LLO和李斯特菌菌株XFL7。(图42A)显示在整个实验周期中每周两次施用抗OX40抗体。(图42B)显示每周两次施用抗GITR抗体，总共三剂。(图42C)指示十二个施用方案，包括无处理(NT)。
图43A-B.在C57BL/6小鼠的腹侧上皮下(s.c.)植入TC-1肿瘤。当肿瘤体积达到约0.06cm3时，以7天为间隔经腹膜内(i.p.)给予两剂基于Lm的E7特异性肿瘤疫苗(1×108个集落形成单位/小鼠)。从疫苗开始每周两次i.p.注射GITR(5mg/Kg体重；总共四剂)和OX40(1mg/Kg体重；在整个实验中)抗体。每周测量肿瘤大小两次。显示了肿瘤生长(图43A)和存活百分比(图43B)。N＝5只/组。结果示为得自一个代表性实验的平均值±SE。实验重复两次。*p≥0.05、**p≥0.01、****p≥0.0001。
图44A-B.在C57BL/6小鼠的腹侧上皮下(s.c.)植入TC-1肿瘤。当肿瘤体积达到约0.06cm3时，以7天为间隔经腹膜内(i.p.)给予两剂基于Lm的E7特异性肿瘤疫苗(1×108个集落形成单位/小鼠)。从疫苗开始每周两次i.p.注射OX40(1mg/Kg体重；在整个实验中)抗体。每周测量肿瘤大小两次。显示了肿瘤生长(图44A)和存活百分比(图44B)。N＝5只/组。结果示为得自一个代表性实验的平均值±SE。实验重复两次。*p≥0.05、**p≥0.01、****p≥0.0001。
图45.抗GITR抗体与基于李斯特菌的疫苗的组合疗法的疫苗施用研究的示意图。
图46A和46B.图46A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性CD4+T细胞的数量。图46B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性Treg(CD4+FoxP3+)细胞的数量。
图47A和47B.图47A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性总非Treg(CD4+FoxP3-)细胞的数量。图47B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性TregFoxP3+of CD4+细胞的百分比。
图48A和48B.图48A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性CD8+T细胞的数量。图48B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性E7特异性CD8+T细胞(抗原特异性)的数量。
图49A和49B.图49A展示条形图，显示了根据不同治疗组的CD8+/Treg细胞的比率。图49B展示条形图，显示了根据不同治疗组的E7+CD8+/Treg细胞的比率。
图50A、50B和50CB.图50A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性髓源性抑制细胞(MDSC)的数量。图50B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性CD8/MDSC的比率。图50C展示条形图，显示了根据不同治疗组的抗原特异性肿瘤浸润性E7-CD8/MDSC的比率。
图51.抗OX40抗体与基于李斯特菌的疫苗的组合疗法的疫苗施用研究的示意图。
图52A和52B.图52A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性CD4+T细胞的数量。图52B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性Treg(CD4+FoxP3+)细胞的数量。
图53A和53B.图53A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性总非Treg(CD4+FoxP3-)细胞的数量。图53B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性TregFoxP3+of CD4+细胞的百分比。
图54A和54B.图54A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性CD8+T细胞的数量。图54B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性E7特异性CD8+T细胞(抗原特异性)的数量。
图55A和55B.图55A展示条形图，显示了根据不同治疗组的CD8+/Treg细胞的比率。图55B展示条形图，显示了根据不同治疗组的E7+CD8+/Treg细胞的比率。
图56A、56B和56C.图56A展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性髓源性抑制细胞(MDSC)的数量。图56B展示条形图，显示了根据不同治疗组的肿瘤浸润性CD8/MDSC的比率。图56C展示条形图，显示了根据不同治疗组的抗原特异性肿瘤浸润性E7-CD8/MDSC的比率。
图57A和57B.ADXS31-164的构建。(图57A)pAdv164的质粒图谱，其具有在组成型李斯特菌p60启动子控制下的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)dal基因，用于补充LmddA菌株的染色体dal-dat缺失。它还含有截短的LLO(1-441)与嵌合人Her2/neu基因的融合体，该融合体通过直接融合3个片段Her2/neu：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)和ICI(aa 679-808)的直接融合而构建。(图57B)通过对用抗LLO抗体印迹的TCA沉淀细胞培养上清液进行的Western印迹分析检测了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表达和分泌。～104KD的差异条带对应于tLLO-ChHer2。检测到内源性LLO为58KD条带。李斯特菌对照缺乏ChHer2表达。
图58A-58C.ADXS31-164的免疫原性(图58A)基于Her2/neu李斯特菌的疫苗在免疫小鼠的脾细胞中引起的细胞毒性T细胞应答使用NT-2细胞作为刺激因子、3T3/neu细胞作为靶标进行测试。Lm-对照基于在各个方面相同但表达不相关抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。(图58B)在体外用丝裂霉素C处理的NT-2细胞刺激24小时以后，通过ELISA测定来自经免疫的FVB/N小鼠的脾细胞分泌进细胞培养基中的IFN-g。(图58C)响应于与来自蛋白的不同区域的肽一起在体外温育，来自用嵌合疫苗免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞的IFN-g分泌。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽组构成阴性对照，如图例中所列出。使用72小时共温育后收集的细胞培养上清液进行ELISA分析，以测定IFN-γ分泌。每个数据点为一式三份数据的平均值+/-标准误差。*P值<0.001。
图59.李斯特菌-ChHER2/neu疫苗的肿瘤预防研究使用每种重组李斯特菌-ChHer2或对照李斯特菌疫苗注射HER2/neu转基因小鼠六次。免疫在6周龄开始，每三周一次延续直到第21周。每周监测肿瘤的外观并以无肿瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每组。
图60.ADXS31-164免疫对脾脏中％Treg的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且使用每种疫苗以一周为间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾脏。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。得自代表性实验的Treg的点图，显示了CD25+/FoxP3+ T细胞的频率，其表示为不同治疗组中总CD3+或CD3+CD4+ T细胞的百分率。
图61A和61B.ADXS31-164免疫对NT-2肿瘤中％肿瘤浸润Treg的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且使用每种疫苗以一周为间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集肿瘤。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。(图61A).来自代表性实验的Treg的点图。(图61B).CD25+/FoxP3+ T细胞的频率，以不同治疗组之间总CD3+或CD3+CD4+ T细胞的百分比(左插图)和肿瘤内CD8/Treg比率(右插图)表示。数据以2个独立实验获得的平均值±SEM表示。
图62A-62C.ADXS31-164疫苗接种可延缓脑中乳腺癌细胞系的生长。Balb/c小鼠使用ADXS31-164或对照李斯特菌疫苗免疫三次。给麻醉小鼠颅内注射EMT6-Luc细胞(5,000个)。(图62A)小鼠的离体成像使用Xenogen X-100CCD照相机在指定的天数进行。(图62B)像素强度以光子数/秒/cm2表面积绘图；这以平均发光度表示。(图62C)EMT6-Luc细胞、4T1-Luc和NT-2细胞系的Her2/neu表达通过使用抗Her2/neu抗体的Western印迹检测。鼠科动物巨噬细胞样细胞系J774.A2细胞用作阴性对照。
图63.显示预先建立的FVB/N Her2/neu,NT-2小鼠肿瘤模型的治疗计划。
将领会的是，为了阐述的简洁和清楚，显示在图中的要素未必是按比率绘制的。例如，为了清楚，一些要素的尺寸可以是相对其他要素而放大的。另外，在认为适合时，附图标记可以在附图之间重复，以指出对应的或类似的要素。
具体实施方式
在以下具体实施方式中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况中，为避免使本公开复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
在一个实施例中，公开了一种包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，并且其中所述组合物还包含抗体或其片段。
在一个实施例中，本文公开的抗体或其片段为激动剂抗体。在另一个实施例中，抗体或其片段为抗TNF受体抗体。在另一个实施例中，抗体或其片段为激动剂抗TNF受体抗体。
在另一个实施例中，本文公开了一种包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述组合物还包含激动剂抗TNF受体抗体或其片段。在又一个实施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不编码融合多肽。
在另一个实施例中，本文公开了一种免疫源性组合物，所述组合物包含：激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在另一个实施例中，本文公开了一种免疫源性组合物，所述组合物包含：激动剂抗TNF受体抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不编码融合多肽。
在一个实施例中，激动剂抗体或其片段结合到包括T细胞受体共刺激分子的异源性抗原或其部分。因此，在另一个实施例中，本文公开了一种免疫源性组合物，所述组合物包含：结合T细胞受体共刺激分子的激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包括截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在再一个实施例中，本文公开了一种免疫源性组合物，所述组合物包含：结合T细胞受体共刺激分子的激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不编码融合多肽。
在另一个实施例中，所公开的激动剂抗体或其片段结合到包括抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的抗原或其部分。因此，在另一个实施例中，本文公开了一种免疫源性组合物，所述组合物包含：结合抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，该免疫源性组合物包含：结合抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不编码融合多肽。
在另一个实施例中，激动剂抗体或其片段结合到包括肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员的抗原或其部分。因此，在另一个实施例中，本文公开了一种免疫源性组合物，所述组合物包含：结合TNF受体超家族的激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，免疫源性组合物包含：结合TNF受体超家族的激动剂抗体或其片段，和包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不编码融合多肽。
在一个实施例中，公开了一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，作为引起增强的抗肿瘤T细胞应答的方法的一部分而施用的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，第一开放阅读框不编码融合多肽。
在另一个实施例中，公开了一种用于抑制受试者中肿瘤介导的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，作为用于抑制肿瘤介导的免疫抑制的方法的一部分而施用的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，第一开放阅读框不编码融合多肽。
在另一个实施例中，公开了一种增加受试者脾脏和肿瘤中的效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，作为用于增加受试者脾脏和肿瘤中的效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法的一部分而施用的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，第一开放阅读框不编码融合多肽。
在另一个实施例中，公开了一种用于增加受试者中的抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，作为用于增加受试者中的T细胞的方法的一部分而施用的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，第一开放阅读框不编码融合多肽。
在另一个实施例中，公开了一种用于增加具有肿瘤或罹患癌症的受试者的存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，作为用于增加具有肿瘤或罹患癌症的受试者的存活时间的方法的一部分而施用的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，第一开放阅读框不编码融合多肽。
在另一个实施例中，公开了一种用于治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，作为用于治疗受试者中的肿瘤或癌症的方法的一部分而施用的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在又一个实施例中，第一开放阅读框不编码融合多肽。
重组李斯特菌菌株
在一个实施例中，本发明的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包括融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在一个实施例中，所述重组李斯特菌菌株是减毒的。
在另一个实施例中，截短李斯特菌O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列不融合到异源性抗原或其片段。
在一个实施例中，截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白包含PEST序列。在另一个实施例中，截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白包含推定的PEST序列。在一个实施例中，截短ActA蛋白包含含有PEST的氨基酸序列。在另一个实施例中，截短actA蛋白包含推定的含PEST的氨基酸序列。
在一个实施例中，PEST氨基酸(AA)序列包括截短LLO序列。在另一个实施例中，该PEST氨基酸序列为KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:1)。在另一个实施例中，抗原与来自李斯特菌的其他LM PEST AA序列的融合也提高抗原的免疫原性。
本发明的方法和组合物的N末端LLO蛋白片段在另一个实施例中包含SEQ ID No:3。在另一个实施例中，该片段包含LLO信号肽。在另一个实施例中，该片段包含SEQ ID No:4。在另一个实施例中，该片段大约由SEQ ID No:4组成。在另一个实施例中，该片段基本上由SEQ ID No:4组成。在另一个实施例中，该片段对应于SEQ ID No:4。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:4同源。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:4的片段同源。用于一些实例的ΔLLO的长度为416个AA(不包括信号序列)，因为包括含有半胱氨酸484的激活域在内的氨基末端的88个残基被截短。本领域的技术人员将会知道，无激活域具体地讲无半胱氨酸484的任何ΔLLO均适用于本发明的方法和组合物。在另一个实施例中，异源性抗原与任何ΔLLO(包括PEST AA序列SEQ ID NO:1)的融合增强抗原的细胞介导的抗肿瘤免疫性。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
技术人员将领会的是，术语“含PEST序列的肽”可涵盖LLO蛋白或其ActA蛋白的PEST序列肽或肽片段。PEST序列肽在本领域是已知的，并在美国专利序列号7,635,479和美国专利公开序列号2014/0186387中有所描述，这两篇专利均据此全文并入本文。
在另一个实施例中，原核生物体的PEST序列可根据诸如Rechsteiner和Roberts(TBS 21:267-271,1996)针对单核细胞增多性李斯特菌所述的方法按照常规方式鉴定。或者，来自其他原核生物体的PEST氨基酸序列也可基于这种方法来鉴定。可预期其中存在PEST氨基酸序列的其他原核生物体包括但不限于其他李斯特菌菌种。例如，单核细胞增多性李斯特菌蛋白ActA包含四个这样的序列。这些序列为KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:7)和RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:8)。来自链球菌菌种(Streptococcussp.)的链球菌溶血素O也包含PEST序列。例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)链球菌溶血素O包含在氨基酸35-51处的PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:9)，并且类马链球菌(Streptococcus equisimilis)链球菌溶血素O包含在氨基酸38-54处的PEST样序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)。另外，据信，PEST序列可嵌入抗原性蛋白内。因此，出于本发明的目的，当关于PEST序列融合时，所谓“融合”是指抗原性蛋白既包含抗原也包含连在抗原一端或嵌入抗原内的PEST氨基酸序列。在其他实施例中，PEST序列或包含PEST的多肽不是融合蛋白的一部分，该多肽也不包含异源性抗原。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子从游离型或质粒载体表达，该游离型或质粒载体具有编码含PEST序列的多肽或含PEST序列的肽的核酸序列。在另一个实施例中，该质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定保持在重组李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，该质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。在另一个实施例中，该片段为功能性片段。在另一个实施例中，该片段为免疫原性片段。
在另一个实施例中，用于构建本发明的疫苗的LLO蛋白具有以下序列：
(GenBank登录号P13128；SEQ ID NO:2；核酸序列在GenBank登录号X15127中列出)。对应于该序列的前蛋白的前25个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切割。因此，在本实施例中，全长的活性LLO蛋白为504个残基长。在另一个实施例中，将以上LLO片段用作并入本发明的疫苗中的LLO片段的来源。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的LLO蛋白的N末端片段具有以下序列：
(SEQ ID NO:3)。
在另一个实施例中，该LLO片段对应于本文所用的LLO蛋白的约AA 20-442。
在另一个实施例中，LLO片段具有以下序列：
(SEQ ID NO:4)。
在另一个实施例中，术语“N末端LLO片段”、“截短LLO”、“ΔLLO”或其语法等同形式在本文可互换使用并指非溶血的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指包含推定的PEST序列的LLO片段。
在另一个实施例中，该LLO片段因活化域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，该LLO片段因包含半胱氨酸484的区域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，LLO因胆固醇结合域(CBD)的缺失或突变而成为非溶血性的，如美国专利No.8,771,702中所述，该专利以引用方式并入本文。
在另一个实施例中，该LLO片段包含野生型LLO蛋白的前441个AA。在另一个实施例中，该LLO片段包含野生型LLO的前420个AA。在另一个实施例中，该LLO片段为野生型LLO蛋白的非溶血形式。
在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。
在另一个实施例中，LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。在另一个实施例中，该LLO片段为本领域已知的任何其他LLO片段。
在另一个实施例中，同源LLO是指与本文公开的LLO序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源LLO是指与本文公开的LLO序列的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的LLO序列的同一性为100％。
在一个实施例中，ActA蛋白包含SEQ ID NO:11:
所示的序列。对应于该序列的前蛋白的前29个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割。在一个实施例中，ActA多肽或肽包含信号序列即上述SEQ ID NO:11的AA1-29。在另一个实施例中，ActA多肽或肽不包含信号序列即上述SEQ ID NO:11的AA 1-29。
在一个实施例中，截短ActA蛋白包含ActA蛋白的N末端片段。在另一个实施例中，截短的ActA蛋白是ActA蛋白的N末端片段。在一个实施例中，截短ActA蛋白包含SEQ ID NO:12:
所示的序列。在另一个实施例中，ActA片段包含SEQ ID NO:12所示的序列。
在另一个实施例中，截短ActA蛋白包含SEQ ID NO:13:所示的序列。
在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，编码截短ActA蛋白的重组核苷酸包含SEQ ID NO:14:
所示的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸具有SEQ ID NO:14所示的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含任何其他的编码ActA蛋白的片段的序列。
在另一个实施例中，“截短ActA”或“ΔActA”是指包含PEST域的ActA片段。在另一个实施例中，该术语是指包含PEST序列的ActA片段。
在另一个实施例中，该PEST序列为源自原核生物体的另一PEST AA序列。在另一个实施例中，PEST序列是本领域已知的任何其他PEST序列。
在另一个实施例中，ActA片段由ActA蛋白的大约前100个AA构成。
在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-338构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-450构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-500构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-550构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-600构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-639构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-100构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-125构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-150构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-175构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-200构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-225构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-250构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-275构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-300构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-325构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-338构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-350构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-375构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-400构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-450构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-500构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-550构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-600构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-604构成。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，ActA片段含有对应于以上AA范围之一的同源ActA蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源ActA蛋白相对于本文所用的ActA蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。
在另一个实施例中，同源ActA是指与本文公开的ActA序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源ActA是指与本文公开的ActA序列的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源ActA是指与本文公开的ActA序列的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源ActA是指与本文公开的ActA序列的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11中的一者的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与本文公开的ActA序列的同一性为100％。
技术人员将领会的是，当提及本文公开的任何核酸序列时，术语“同源性”可以指候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
在一个实施例中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用多种可用软件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。
在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文公开的序列的序列的同一性大于68％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文公开的序列的序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文公开的序列的序列的同一性大于72％。在另一个实施例中，该同一性大于75％。在另一个实施例中，该同一性大于78％。在另一个实施例中，该同一性大于80％。在另一个实施例中，该同一性大于82％。在另一个实施例中，该同一性大于83％。在另一个实施例中，该同一性大于85％。在另一个实施例中，该同一性大于87％。在另一个实施例中，该同一性大于88％。在另一个实施例中，该同一性大于90％。在另一个实施例中，该同一性大于92％。在另一个实施例中，该同一性大于93％。在另一个实施例中，该同一性大于95％。在另一个实施例中，该同一性大于96％。在另一个实施例中，该同一性大于97％。在另一个实施例中，该同一性大于98％。在另一个实施例中，该同一性大于99％。在另一个实施例中，该同一性为100％。
在另一个实施例中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见例如“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985)；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人,1989,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含质粒，所述质粒包含编码抗生素抗性基因的核酸。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌能够逃离吞噬溶酶体。
在一个实施例中，异源性抗原或抗原多肽与LLO同框整合进李斯特菌染色体中。在另一个实施例中，整合的核酸分子与ActA同框整合进actA基因座。在另一个实施例中，编码ActA的染色体核酸被编码抗原的核酸分子替代。
在一个实施例中，异源性抗原是肿瘤相关抗原。在另一个实施例中，肿瘤相关抗原是天然存在的肿瘤相关抗原。在另一个实施例中，肿瘤相关抗原是合成的肿瘤相关抗原。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原是嵌合的肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌包含核酸分子。在另一个实施例中，本文所公开的核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框，该重组多肽包含异源性抗原或其片段。在另一个实施例中，该重组多肽还包含融合到异源性抗原的截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST序列肽。在另一个实施例中，截短LLO蛋白是N末端LLO或其片段。在另一个实施例中，截短ActA蛋白是N末端ActA蛋白或其片段。
在另一个实施例中，本文公开的核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框，所述重组多肽包含截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST序列肽，其中所述截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST序列肽不融合到异源性抗原。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码包含N末端LLO或其片段的截短LLO蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码包含N末端ActA蛋白或其片段的截短ActA蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码基本上由N末端LLO或其片段组成的截短LLO蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码基本上由N末端ActA蛋白或其片段组成的截短ActA蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码由N末端LLO或其片段组成的截短LLO蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码由N末端ActA蛋白或其片段组成的截短ActA蛋白。
在一个实施例中，术语“抗原”、“抗原片段”、“抗原部分”、“异源性蛋白”、“异源性抗原”、“异源性蛋白抗原”、“蛋白抗原”、“抗原”、“抗原性多肽”或其语法等同形式在本文可互换使用并且意指在存在于受试者细胞中的MHC I类和/或II类分子上加工和呈递从而当存在于宿主体内时或在另一个实施例中被宿主检测到时导致产生免疫应答的如本文所述的多肽、肽或重组肽。在一个实施例中，抗原可以是宿主外源的。在另一个实施例中，抗原可以存在于宿主中，但宿主因免疫耐受而不引起对该抗原的免疫应答。
在一个实施例中，本文公开的核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施例中，由该第二开放阅读框编码的代谢酶为丙氨酸消旋酶(Dal)。在另一个实施例中，由该第二开放阅读框编码的代谢酶为D-氨基酸转移酶(Dat)。在另一个实施例中，本文公开的李斯特菌菌株在内源性dal/dat基因中包含突变。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat基因。在另一个实施例中，该dal/dat基因在李斯特菌基因组中缺失。在另一个实施例中，该dal/dat基因在李斯特菌基因组中截短。
在另一个实施例中，所公开的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，所公开的方法和组合物的第一开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，所公开的方法和组合物的第二开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。
“代谢酶”在另一个实施例中是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该酶为营养物的合成所需。
在另一个实施例中，该重组李斯特菌为减毒的营养缺陷型菌株。在另一个实施例中，该重组李斯特菌是如美国专利No.8,114,414中所述的Lm-LLO-E7菌株，该专利以引用方式全文并入本文。
在一个实施例中，该减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施例中，该减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌菌株，该菌株因缺失毒力基因actA而为减毒的并保留了质粒，以通过补充dal基因用于期望的异源性抗原或截短的LLO在体内和体外表达。
在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔactA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPrfA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPlcB。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPlcA。在另一个实施例中，该菌株为任何上文提及的菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施例中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一个实施例中，该菌株从EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施例中，用于本发明的菌株为表达非溶血LLO的李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株为营养缺陷型突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码维生素合成基因的基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码泛酸合酶的基因缺陷的。
在一个实施例中，D-丙氨酸缺陷的李斯特菌AA菌株的生成例如可以按本领域的技术人员熟知的多种方式实现，这些方式包括缺失诱变、插入诱变、以及导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施例中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体。在另一个实施例中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施例中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本文提供的方案生成的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施例中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体进行进一步研究。
在另一个实施例中，除上述D-丙氨酸相关基因之外，本文所公开的涉及代谢酶合成的其他基因可用作李斯特菌诱变的靶标。
在另一个实施例中，代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在另一个实施例中，内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施例中，该代谢酶为氨基酸代谢酶。在另一个实施例中，代谢酶催化用于重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施例中，代谢酶为丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，代谢酶是D-氨基酸转移酶。
在一个实施例中，营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该游离型表达载体包含补充营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施例中，该构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，外源抗原从重组李斯特菌菌株携带的载体表达。在另一个实施例中，游离型表达载体缺乏抗生素抗性标记。在一个实施例中，本文公开的方法和组合物的抗原融合到包含PEST序列的多肽。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是氨基酸(AA)代谢酶缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是D-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是二氨基庚二酸CysK合成中涉及到的基因缺陷的。在另一个实施例中，该基因为维生素-B12非依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个实施例中，该基因为trpA。在另一个实施例中，该基因为trpB。在另一个实施例中，该基因为trpE。在另一个实施例中，该基因为asnB。在另一个实施例中，该基因为gltD。在另一个实施例中，该基因为gltB。在另一个实施例中，该基因为leuA。在另一个实施例中，该基因为argG。在另一个实施例中，该基因为thrC。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是一个或多个上文描述的基因缺陷的。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该基因为氨基酸合成基因。在另一个实施例中，该基因为folP。在另一个实施例中，该基因为二氢尿苷合酶家族蛋白。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为ispF。在另一个实施例中，该基因为磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一个实施例中，该基因为hisF。在另一个实施例中，该基因为hisH。在另一个实施例中，该基因为fliI。在另一个实施例中，该基因为核糖体大亚基假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为双功能GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为cobS。在另一个实施例中，该基因为cobB。在另一个实施例中，该基因为cbiD。在另一个实施例中，该基因为尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶。在另一个实施例中，该基因为cobQ。在另一个实施例中，该基因为uppS。在另一个实施例中，该基因为truB。在另一个实施例中，该基因为dxs。在另一个实施例中，该基因为mvaS。在另一个实施例中，该基因为dapA。在另一个实施例中，该基因为ispG。在另一个实施例中，该基因为folC。在另一个实施例中，该基因为柠檬酸合酶。在另一个实施例中，该基因为argJ。在另一个实施例中，该基因为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基转移酶组分。在另一个实施例中，该基因为menB。在另一个实施例中，该基因为甲基萘醌特异的异分支酸合酶。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶I或II。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一个实施例中，该基因为carB。在另一个实施例中，该基因为carA。在另一个实施例中，该基因为thyA。在另一个实施例中，该基因为mgsA。在另一个实施例中，该基因为aroB。在另一个实施例中，该基因为hepB。在另一个实施例中，该基因为rluB。在另一个实施例中，该基因为ilvB。在另一个实施例中，该基因为ilvN。在另一个实施例中，该基因为alsS。在另一个实施例中，该基因为fabF。在另一个实施例中，该基因为fabH。在另一个实施例中，该基因为假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为pyrG。在另一个实施例中，该基因为truA。在另一个实施例中，该基因为pabB。在另一个实施例中，该基因为atp合酶基因(例如，atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
在另一个实施例中，该基因为phoP。在另一个实施例中，该基因为aroA。在另一个实施例中，该基因为aroC。在另一个实施例中，该基因为aroD。在另一个实施例中，该基因为plcB。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是肽转运蛋白缺陷的。在另一个实施例中，该基因为ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为糖ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为ZIP锌转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为EmrB/QacA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为硫酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为质子依赖性寡肽转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为镁转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甲酸/硝酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为亚精胺/腐胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Na/Pi-协同转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸糖转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为谷氨酰胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为主要协助家族转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钼ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷壁酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钴ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铵转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为氨基酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为细胞分裂ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为锰ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铁化合物ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Bcr/CflA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为上述蛋白之一的亚基。
在一个实施例中，本文公开了核酸分子，该核酸分子用于转化李斯特菌以便获得重组李斯特菌。在另一个实施例中，本文公开的用于转化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施例中，该核酸分子整合进李斯特菌基因组并携带非功能性毒力基因。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌中是突变的。在又一个实施例中，该核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又另一个实施例中，该毒力基因为actA基因、inlA基因和inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。技术人员应当理解，该毒力基因可为本领域已知的任何与重组李斯特菌的毒力相关的基因。
在一个实施例中，李斯特菌菌株包含一个或多个内源性基因中的突变。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是dal突变体、dat突变体、inlA突变体、inlB突变体、inlC突变体、inlJ突变体、prfA突变体、actA突变体、dal/dat突变体、prfA突变体、plcB缺失突变体，或plcA和plcB、或actA和inlB、或dal和dat双突变体，或dal/dat和actA三突变体。在另一个实施例中，本文公开的李斯特菌在这些基因的任一个中或在这些基因的组合中包含突变。在另一个实施例中，本文公开的李斯特菌缺乏这些基因中的每一个。在另一个实施例中，本文公开的李斯特菌缺乏至少一个且最多十个本文公开的任何基因，包括actA、prfA和dal/dat基因。
在另一个实施例中，包含dal和dat突变的李斯特菌菌株通过代谢酶补充，所述代谢酶由在存在于李斯特菌菌株质粒中的核酸序列中的第二开放阅读框编码。在另一个实施例中，包含prfA突变的李斯特菌菌株由包含D133V氨基酸突变的突变体PrfA蛋白补充。在另一个实施例中，突变体D133V PrfA蛋白由在存在于李斯特菌菌株质粒中的核酸序列中的第二开放阅读框编码。
在一个实施例中，减毒活李斯特菌为重组李斯特菌。在另一个实施例中，该重组李斯特菌在基因组内化素C(inlC)基因中包含突变。在另一个实施例中，该重组李斯特菌在基因组actA基因和基因组内化素C基因中包含突变。在一个实施例中，李斯特菌向邻近细胞的迁移通过参与该过程的actA基因和/或inlC基因的缺失而被抑制，由此产生出乎意料的高水平减毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。
在一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体以及任何游离型遗传元件中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是毒力菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，毒力基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，毒力基因从染色体缺失。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株为减毒的。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏actA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏prfA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏inlB基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌同时缺乏actA和inlB基因。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含以下基因中任何单个基因或组合中的失活突变：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。
技术人员将领会的是，术语“突变”及其语法等同形式包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并包括缺失、截短、失活、破坏或易位。这些类型的突变是本领域众所周知的。
在一个实施例中，为了选择包含编码代谢酶或补充本文公开的基因的质粒的营养缺陷型细菌，诸如营养缺陷型李斯特菌，使转化的营养缺陷型细菌在将会选择氨基酸代谢基因或补充基因的表达的培养基上生长。在另一个实施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成缺陷型细菌，并且该营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施例中，如果本发明的质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包含或缺少必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，且可商购获得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。
在另一个实施例中，一旦在适当培养基上选择了包含补充性质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在将确保，该质粒将与该细菌一起复制，从而连续地选择携带该质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大重组李斯特菌菌株的生产。
技术人员将领会的是，在另一个实施例中，其他营养缺陷型菌株和互补系统适合与本公开一起使用。
在一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源性抗原直接互相融合。在另一个实施例中，编码N末端LLO蛋白片段和异源性抗原的基因直接互相融合。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源性抗原通过接头肽可操作地连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源性抗原通过异源性肽连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是异源性抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段单独即以非融合形式表达和使用。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施例中，截短LLO在C末端截短以得到N末端LLO。在另一个实施例中，截短LLO是非溶血LLO。
如本文所公开，粒细胞MDSC的抑制能力存在意外变化，这是由于独立于伴侣融合抗原(参见实例19)的tLLO的过表达所致。
在一个实施例中，N末端ActA蛋白片段和异源性抗原直接互相融合。在另一个实施例中，编码N末端ActA蛋白片段和异源性抗原的基因直接互相融合。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段和异源性抗原通过接头肽可操作地连接。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段和异源性抗原通过异源性肽连接。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段是异源性抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段单独即以非融合形式表达和使用。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施例中，截短ActA在C末端截短的以得到N末端ActA。
在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株表达重组多肽。在另一个实施例中，该重组李斯特菌菌株包含编码重组多肽的质粒。在另一个实施例中，本文公开的重组核酸在本文公开的重组李斯特菌菌株的质粒中。在另一个实施例中，该质粒是不整合进重组李斯特菌菌株染色体中的游离型质粒。在另一个实施例中，该质粒是整合进李斯特菌菌株染色体中的整合型质粒。在另一个实施例中，该质粒为多拷贝质粒。
在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法的重组李斯特菌菌株表达异源抗原性多肽，所述异源抗原性多肽被肿瘤细胞表达。在一个实施例中，肿瘤相关抗原为前列腺特异性抗原(PSA)。在另一个实施例中，肿瘤相关抗原为人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原为美国专利公开No.US2011/014279中描述的Her2/neu嵌合抗原，这些文献全文以引用方式并入本文。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原是血管新生抗原。
在一个实施例中，本文公开的组合物和方法的重组李斯特菌菌株包含编码前列腺特异性抗原(PSA)的第一或第二核酸分子，在一个实施例中，该核酸分子是前列腺肿瘤高度表达的前列腺癌标记物。在一个实施例中，PSA是前列腺上皮细胞分泌的激肽释放酶丝氨酸蛋白酶(KLK3)，在一个实施例中，它被广泛用作前列腺癌的标记物。如本文所用，术语PSA和KLK3可互换使用，均具有相同的含义和特性。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码肿瘤相关抗原的核酸分子。在一个实施例中，肿瘤相关抗原包含KLK3多肽或其片段。在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码KLK3蛋白的核酸分子。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
(SEQ ID No:15；GenBank登录号CAA32915)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQID No:15的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:15的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:15的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:15的片段。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
(SEQ ID No:16)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:16的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:16的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:16的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:16的片段。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:17；GenBank登录号AAA59995.1)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:17的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:17的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:17的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:17的片段。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQ ID No:18；GenBank登录号X14810)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:18的残基401..446、1688..1847、3477..3763、3907..4043和5413..5568编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:18的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:18的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:18的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:18的片段编码。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:19；GenBank登录号NP_001019218)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:19的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:19的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:19的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:19的片段。每种可能性代表了如本文所公开的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQ ID No:20；GenBank登录号NM_001030047)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:20的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:20的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:20的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:20的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:20的片段编码。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:21；GenBank登录号NP_001025221)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:21的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:21的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:21。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:21的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:21的片段。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQ ID No:22)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:22的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:22的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:22的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:22的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:22的片段编码。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，作为KLK3肽的来源的KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:23)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:23的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:23的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:23的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:23的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQ ID No:24)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:24的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:24的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:24的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:24的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:24的片段编码。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:25；GenBank登录号NP_001025219)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的片段。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQ ID No:26；GenBank登录号NM_001030048)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:26的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:26的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:26的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:26的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:26的片段编码。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:27；GenBank登录号NP_001639)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQID No:28；GenBank登录号NM_001648)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的残基42-827编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的片段编码。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:29；GenBank登录号AAX29407.1)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:29。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：(SEQ ID No:30；GenBank登录号BC056665)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的残基47-832编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的片段编码。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:31；GenBank登录号AJ459782)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:32；GenBank登录号AJ512346)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:32的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:32的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:32的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:32。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:32的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID No:33；GenBank登录号AJ459784)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:33。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：(SEQ ID NO:34；GenBank登录号AJ459783)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:34的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:34的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:34的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:34的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：aagtttcccttctccc(SEQ ID No:35；GenBank登录号X07730)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:35的残基67-1088编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:35的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:35的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:35的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:35的片段编码。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
(SEQ ID No:36；GenBank登录号NM_001030050)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:36的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:36的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:36。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:36的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:36的片段。
在另一个实施例中，作为KLK3肽的来源的KLK3蛋白具有以下序列：
(SEQ ID No:37；GenBank登录号NM_001064049)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
(SEQ ID No:38；GenBank登录号NM_001030048)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:38的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:38的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:38的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:38的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由以下GenBank登录号之一所示的序列编码：BC005307、AJ310938、AJ310937、AF335478、AF335477、M27274和M26663。在另一个实施例中，KLK3蛋白由以上GenBank登录号之一所示的序列编码。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由以下GenBank登录号之一所示的序列编码：NM_001030050、NM_001030049、NM_001030048、NM_001030047、NM_001648、AJ459782、AJ512346或AJ459784。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。在一个实施例中，KLK3蛋白由任何本文所述的序列的变型形式编码，其中该序列缺乏MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSR(SEQ ID NO:39)。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有的序列包含以下GenBank登录号之一所示的序列：X13943、X13942、X13940、X13941和X13944。
在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他KLK3蛋白。
在另一个实施例中，KLK3肽是本领域已知的任何其他KLK3肽。在另一个实施例中，KLK3肽是本领域已知的任何其他KLK3肽的片段。每种类型的KLK3肽代表了如本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，“KLK3肽”是指全长KLK3蛋白。在另一个实施例中，该术语是指KLK3蛋白的片段。在另一个实施例中，该术语是指缺乏KLK3信号肽的KLK3蛋白的片段。在另一个实施例中，该术语是指包含除KLK3信号肽之外的整个KLK3序列的KLK3蛋白。在另一个实施例中，“KLK3信号序列”是指天然存在于KLK3蛋白的任何信号序列。在另一个实施例中，本文公开的方法和组合物的KLK3蛋白不含任何信号序列。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，作为用于本文公开的方法和组合物的KLK3肽的来源的激肽释放酶相关肽酶3(KLK3蛋白)是PSA蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是P-30抗原蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是γ-精浆蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是激肽释放酶3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是精液琼脂酶(semenogelase)蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是精囊素蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他类型的KLK3蛋白。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体1KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体2KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体3KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体1KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体2KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体3KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体4KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体5KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体6KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体RP5KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他剪接变体KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他转录变体KLK3蛋白。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白是成熟KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是前KLK3蛋白。在另一个实施例中，前导序列已从本文公开的方法和组合物的成熟KLK3蛋白移除。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，作为本文公开的方法和组合物的KLK3肽的来源的KLK3蛋白是人KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是灵长类KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他物种的KLK3蛋白。在另一个实施例中，上述KLK3蛋白中的一者在本领域中称为“KLK3蛋白”。
在一个实施例中，包含融合到本文公开的PSA蛋白的截短LLO的本文公开的重组多肽由包含
(SEQ ID NO:91)的序列编码。在另一个实施例中，融合蛋白由SEQ ID No:91的同源物编码。在另一个实施例中，融合蛋白由SEQ ID No:91的变体编码。在另一个实施例中，融合蛋白由SEQ ID No:91的异构体编码。在一个实施例中，融合蛋白内的“ctcgag”序列表示用于将肿瘤抗原连接至质粒中的截短LLO的Xho I限制性位点。
在另一个实施例中，包含融合到本文公开的PSA蛋白的截短LLO的本文公开的重组多肽包含以下序列：
(PSA序列标有下划线)(SEQ ID NO:92)。在另一个实施例中，tLLO-PSA融合蛋白是SEQ ID NO:92的同源物。在另一个实施例中，tLLO-PSA融合蛋白是SEQ ID NO:92的变体。在另一个实施例中，tLLO-PSA融合蛋白是SEQ ID NO:92的异构体。在另一个实施例中，tLLO-PSA融合蛋白是SEQ ID NO:92的片段。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码肿瘤相关抗原的核酸分子，其中该抗原包含HPV-E7蛋白。在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码HPV-E7蛋白的核酸分子。
在一个实施例中，整个E7蛋白或其片段融合到LLO蛋白或其截短或肽、ActA蛋白或其截短或肽或含PEST样序列肽，以生成本发明的组合物和方法的重组多肽或肽。所用的E7蛋白(作为整体或作为片段的来源)在另一个实施例中具有序列
(SEQ ID No:40)。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的同源物。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的变体。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的异构体。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的同源物的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的变体的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:40的异构体的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，E7蛋白的序列为：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID No:41)。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ IDNo:41的同源物。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:41的变体。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:41的异构体。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:41的片段。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:41的同源物的片段。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:41的变体的片段。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:41的异构体的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，该E7蛋白具有以下GenBank条目之一所示的序列：M24215、NC_004500、V01116、X62843或M14119。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的同源物。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的变体。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的异构体。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的同源物的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的变体的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的异构体的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，该HPV抗原为HPV 16。在另一个实施例中，该HPV为HPV-18。在另一个实施例中，该HPV选自HPV-16和HPV-18。在另一个实施例中，该HPV为HPV-31。在另一个实施例中，该HPV为HPV-35。在另一个实施例中，该HPV为HPV-39。在另一个实施例中，该HPV为HPV-45。在另一个实施例中，该HPV为HPV-51。在另一个实施例中，该HPV为HPV-52。在另一个实施例中，该HPV为HPV-58。在另一个实施例中，该HPV为高风险HPV型。在另一个实施例中，该HPV为粘膜HPV型。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，HPV E6来自HPV-16。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV-16。在另一个实施例中，HPV-E6来自HPV-18。在另一个实施例中，HPV-E7来自HPV-18。在另一个实施例中，在用于治疗或改善HPV相关疾病、障碍或症状的本发明的组合物和方法中，代替E7抗原或作为其补充，使用HPV E6抗原。在另一个实施例中，代替HPV-18E6和E7或与之组合，使用HPV-16E6和E7。在这样的实施例中，重组李斯特菌可从染色体表达HPV-16E6和E7并从质粒表达HPV-18E6和E7，或反之亦然。在另一个实施例中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原从存在于本文公开的重组李斯特菌中的质粒表达。在另一个实施例中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原从本文公开的重组李斯特菌的染色体表达。在另一个实施例中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原在以上实施例的任何组合中表达，包括其中得自各HPV株的各E6和E7抗原从质粒或染色体表达的实施例。
在另一个实施例中，整个E7蛋白或其片段融合到LLO蛋白、ActA蛋白或含PEST氨基酸序列的肽以生成本文公开的重组多肽。在一个实施例中，所用的E7蛋白(作为整体或作为片段的来源)包含SEQ ID NO:93
(SEQ ID NO:93)所示的序列。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:93的同源物。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:93的变体。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:93的异构体。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:93的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:93的同源物的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQID No:93的变体的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:93的异构体的片段。
在另一个实施例中，融合到E7蛋白的截短LLO的氨基酸序列包含以下氨基酸序列：
(SEQ ID NO:94)所示的序列。在另一个实施例中，tLLO-E7的融合蛋白是SEQ IDNo:94的同源物。在另一个实施例中，融合蛋白是SEQ ID No:94的变体。在另一个实施例中，tLLO-E7融合蛋白是SEQ ID No:94的异构体。在另一个实施例中，tLLO-E7融合蛋白是SEQID No:94的片段。在另一个实施例中，tLLO-E7融合蛋白是SEQ ID No:94的同源物的片段。在另一个实施例中，tLLO-E7融合蛋白是SEQ ID No:94的变体的片段。在另一个实施例中，tLLO-E7融合蛋白是SEQ ID No:94的异构体的片段。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码肿瘤相关抗原的核酸分子，其中肿瘤相关抗原包含Her-2/neu肽。在一个实施例中，肿瘤相关抗原包含Her-2/neu抗原。在一个实施例中，Her-2/neu肽包含嵌合Her-2/neu抗原(cHer-2)。
在一个实施例中，减毒的营养缺陷型李斯特菌菌株基于李斯特菌疫苗载体，该载体由于毒力基因actA的缺失而减毒，并且由于dal基因的互补而维持用于Her2/neu的体内和体外表达的质粒。在一个实施例中，李斯特菌菌株表达和分泌融合到李斯特菌溶血素O(LLO)的前441个氨基酸的嵌合Her2/neu蛋白。在另一个实施例中，李斯特菌是在dal、dat和actA内源性基因中具有突变的dal/dat/actA李斯特菌。在另一个实施例中，突变是突变基因的缺失、截短或失活。在另一个实施例中，李斯特菌菌株发挥强烈的和抗原特异性的抗肿瘤应答，在转基因动物中能够打破对HER2/neu的耐受性。在另一个实施例中，dal/dat/actA菌株是高度减毒的，并且具有比前一代李斯特菌疫苗更高的安全谱，因为它能更迅速地从免疫小鼠的脾脏清除。在另一个实施例中，李斯特菌菌株使转基因动物中的肿瘤发病延缓期比Lm-LLO-ChHer2(该疫苗的抗生素抗性和毒性更强的形式)更长(参见美国公开No.2011/0142791，该文献全文以引用方式并入本文)。在另一个实施例中，李斯特菌菌株使肿瘤内调节性T细胞(Treg)显著减少。在另一个实施例中，LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。在一个实施例中，本发明提供包含融合到Her-2嵌合蛋白或融合到其片段的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽。在一个实施例中，本发明提供由融合到Her-2嵌合蛋白或融合到其片段的LLO蛋白的N末端片段组成的重组多肽。在该实施例中，异源性抗原是Her-2嵌合蛋白或其片段。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的Her-2嵌合蛋白是人Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是小鼠Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是大鼠Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是灵长类Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2蛋白是本领域已知的人或任何其他动物物种的Her-2嵌合蛋白或它们的组合。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，Her-2蛋白是称为“HER-2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白具有Her2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，该抗原示出癌基因的MHC I类表位簇，而在另一个实施例中，嵌合蛋白具有3个H2Dq和至少17个Her2/neu抗原的标绘的人MHC I类表位(片段EC1、EC2和IC1)(图45)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少13个标绘的人MHC I类表位(片段EC2和IC1)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少14个标绘的人MHC I类表位(片段EC1和IC1)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少9个标绘的人MHC I类表位(片段EC1和IC2)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合到非溶血李斯特菌溶血素O(LLO)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合到单核细胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的前441个氨基酸，并且由单核细胞增多性李斯特菌减毒营养缺陷型菌株LmddA表达和分泌。在另一个实施例中，来自本文公开的减毒营养缺陷型菌株(表达嵌合Her2/neu抗原/LLO融合蛋白)的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与体外生长8小时后TCA沉淀细胞培养上清液中Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图45B)。
在一个实施例中，在未暴露的动物(animal)或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(图46A)。而在另一个实施例中，本文公开的减毒营养缺陷型菌株能够通过得自野生型FVB/N小鼠的脾细胞刺激IFN-γ的分泌(图46B)。
在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白由以下SEQ ID NO:95所示的核酸序列编码
(SEQ ID NO:95)。
在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白包含以下序列：
(SEQ ID NO:96)。
在一个实施例中，本文公开的方法和组合物的Her2嵌合蛋白或其片段不包括其信号序列。在另一个实施例中，由于信号序列的高疏水性，信号序列的省去使Her2片段能够在李斯特菌中成功表达。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的Her2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜域(TM)。在一个实施例中，由于TM的高疏水性，TM的省去使Her2片段能够在李斯特菌中成功表达。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，LmddA164包含具有编码融合到cHER2的tLLO的开放阅读框的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:97:
(SEQ ID NO:97)，其中大写字母序列编码cHER2，小写字母序列编码tLLO，并且带下划线的“ctcgag”序列表示用于在质粒中将肿瘤抗原连接到截短LLO的Xho I限制性位点。在另一个实施例中，质粒pAdv168包含SEQ ID NO:97。在一个实施例中，截短LLO-cHER2融合体是SEQ ID NO:97的同源物。在另一个实施例中，截短LLO-cHER2融合体是SEQ ID NO:97的变体。在另一个实施例中，截短LLO-cHER2融合体是SEQ ID NO:97的异构体。
在一个实施例中，包含融合到cHER2的tLLO的重组蛋白的氨基酸序列包含SEQ IDNO:98：
(SEQ ID NO:98)。在一个实施例中，截短LLO-cHER2融合体是SEQ ID NO:98的同源物。在另一个实施例中，截短LLO-cHER2融合体是SEQ ID NO:98的变体。在另一个实施例中，截短LLO-cHER2融合体是SEQ ID NO:98的异构体。
据报道，当基于小片段李斯特菌的疫苗或曲妥单抗(针对位于Her2/neu抗原的胞外域的表位的单克隆抗体)靶向耐药肿瘤时，致癌蛋白Her2/neu中的点突变或氨基酸缺失介导了这些肿瘤细胞的治疗。在一个实施例中，公开了基于嵌合Her2/neu的组合物，该组合物具有Her2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，该抗原示出癌基因的MHC I类表位簇。具有3个H2Dq和至少17个Her2/neu抗原的标绘的人MHC I类表位的该嵌合蛋白融合到单核细胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O蛋白的前441个氨基酸，且由单核细胞增多性李斯特菌减毒菌株LmddA表达和分泌。
在另一个实施例中，所关注的抗原是KLK9多肽。
在另一个实施例中，肿瘤相关抗原是HPV-E7。在另一个实施例中，该抗原为HPV-E6。在另一个实施例中，该抗原为Her-2。在另一个实施例中，该抗原为NY-ESO-1。在另一个实施例中，该抗原为端粒酶。在另一个实施例中，该抗原为SCCE。在另一个实施例中，抗原为WT-1。在另一个实施例中，该抗原为HIV-1Gag。在另一个实施例中，抗原为蛋白酶3。在另一个实施例中，该抗原为酪氨酸酶相关蛋白2。在另一个实施例中，该抗原为PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，该抗原选自E7、E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶、SCCE、WT-1、HIV-1Gag、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，该抗原是肿瘤相关抗原。在另一个实施例中，该抗原是感染性疾病抗原。
在另一个实施例中，该肿瘤相关抗原是血管新生抗原。在另一个实施例中，该血管新生抗原在肿瘤新生血管中的激活周细胞和周细胞二者上表达，在另一个实施例中，它与体内新血管形成相关。在另一个实施例中，该血管新生抗原是HMW-MAA。在另一个实施例中，该血管新生抗原是本领域已知的抗原，并且在WO2010/102140中公开，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，抗原源自真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫或病毒。在另一个实施例中，该抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIV gp120、HIVgag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞体病毒抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相关抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、来自HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35或HPV-45型人乳头瘤病毒的人乳头瘤病毒抗原E1和E2、肿瘤抗原CEA、突变或者其他形式的ras蛋白、突变或者其他形式的p53蛋白、Muc1、间皮素、EGFRVIII或pSA。
在其他实施例中，该抗原与以下疾病之一相关：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脑灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症、包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、例如肾、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物、格雷夫斯病、多内分泌自身免疫病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊椎关节病、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、风疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X-连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、恶性疟原虫环子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。每种抗原代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，本文所公开的异源性抗原为肿瘤相关抗原，其在一个实施例中为以下肿瘤抗原之一：MAGE(黑素瘤相关抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE4、酪氨酸酶；突变体ras蛋白；突变体p53蛋白；p97黑素瘤抗原、与晚期癌症相关的ras肽或p53肽；与宫颈癌相关的HPV 16/18抗原、与乳腺癌相关的KLH抗原、与结肠直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)、与黑素瘤相关的MART1抗原gp100或与前列腺癌相关的PSA抗原。在另一个实施例中，用于本文所公开的组合物和方法的抗原为黑素瘤相关抗原，其在一个实施例中为TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、HSP-70、β-HCG或它们的组合。在另一个实施例中，该肿瘤相关抗原是血管新生抗原。
在一个实施例中，所述抗原为美国专利申请公开US2011/0142791中描述的嵌合Her2抗原，通过引用将该专利全文并入本文。
在另一个实施例中，该异源性抗原是感染性疾病抗原。在一个实施例中，抗原是自体抗原或自身抗原。
在另一个实施例中，该异源性抗原源自真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫或病毒。在另一个实施例中，抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIVgp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞体病毒抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、来自HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35或HPV-45型人乳头瘤病毒的人乳头瘤病毒抗原E1和E2、或它们的组合。
在本文所公开的方法和组合物的另一个实施例中，“核酸”或“核苷酸”指一串至少两个碱基-糖-磷酸的组合。该术语在一个实施例中包括DNA和RNA。在一个实施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的单体单元。在一个实施例中，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(Caudy AA等人Genes&Devel 16:2491-96及其中引用的参考文献)。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些分组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。在另一个实施例中，该术语还包括可包含其他类型的主链但具有相同碱基的人工核酸。在一个实施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主链和核苷酸碱基，并且在一个实施例中能够结合DNA和RNA两种分子。在另一个实施例中，核苷酸是氧杂环丁烷修饰的。在另一个实施例中，核苷酸通过用硫代磷酸键代替一个或多个磷酸二酯键来修饰。在另一个实施例中，人工核酸包含本领域已知的天然核酸的磷酸主链的任何其他变体。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57和Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中有所描述。核酸的制备和使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook和Russell编以及Methods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中有所描述。每种核酸衍生物代表了如本文所公开的独立实施例。
在一个实施例中，术语“寡核苷酸”可与术语“核酸”互换，并且可以指可包括但不限于原核序列、真核mRNA、得自真核mRNA的cDNA、得自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列的分子。该术语还指包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。
在另一个实施例中，本文公开的构建体或核酸分子使用同源重组整合进李斯特菌染色体。用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如在Baloglu S,Boyle SM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing eitherListeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomalL7/L12protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)和Jiang LL,Song HH等人(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在这种情况下，通过hly启动子控制下的E7基因的染色体整合，制备表达E7的重组Lm菌株，并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌，从而产生称作Lm-AZ/E7的重组体。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。每种技术代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun等人(Infection and Immunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在另一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点，但缺点是外源基因在基因组中的插入位置是未知的。
在另一个实施例中，使用噬菌体整合位点将该构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体(Lauer P,Chow MY等人,Construction,characterization,and use of twoListeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.JBacteriol2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’末端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，这种方法产生单拷贝的整合体。在另一个实施例中，本发明还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中可使用必需酶(包括但不限于d-丙氨酸消旋酶)营养缺陷的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为了避免“噬菌体解离步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本发明使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。作为替代，可补充营养缺陷型宿主菌株。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在本文所公开的方法和组合物的一个实施例中，术语“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指核酸分子中的碱基序列，该序列可被重组酶(在一些情况下连同相关蛋白)识别，该重组酶介导位于重组位点侧翼的核酸片段的交换或切除。重组酶及相关蛋白统称为“重组蛋白”，参见例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics&Development)3:699-707；1993)。
“噬菌体表达载体”或“噬粒”指用于在体外或体内在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中组成型或诱导型表达如本文所公开的方法和组合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌体的重组表达系统。噬菌体表达载体通常既可在细菌细胞中繁殖，又可在适合条件下产生噬菌体颗粒。该术语还包括线状或环状表达系统，并涵盖保持游离或者整合进宿主细胞基因组的两种基于噬菌体的表达载体。
在一个实施例中，如本文所用的术语“可操作地连接”意味着将转录和翻译调控核酸相对于任何编码序列以使得引发转录的方式定位。一般来讲，这意味着将启动子和转录引发或起始序列定位在编码区的5'。
在一个实施例中，“开放阅读框”或“ORF”为生物体基因组的一部分，其含有可潜在地编码蛋白的碱基序列。在另一个实施例中，ORF的开始和结束端不等同于mRNA的末端，但它们通常包含在该mRNA内。在一个实施例中，ORF位于基因的开始密码子序列(起始密码子)和结束密码子序列(终止密码子)之间。因此，在一个实施例中，可操作地整合进基因组中与内源多肽一起作为开放阅读框的核酸分子为已整合进基因组中与内源多肽处于相同开放阅读框中的核酸分子。
在一个实施例中，本发明提供包含接头序列的融合多肽。在一个实施例中，“接头序列”是指连接两个异源多肽或其片段或域的氨基酸序列。一般来讲，如本文所用，接头是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接头通常包含在从展示载体移除报告基因后从剩余重组信号翻译的氨基酸，以产生包含由开放阅读框编码的氨基酸序列和展示蛋白的融合蛋白。如本领域技术人员将领会的是，接头可包含另外的氨基酸，诸如甘氨酸和其他小中性氨基酸。
在一个实施例中，“内源性”是指已在参考生物体内发育或起源的或因参考生物体内的成因而产生的某物。在另一个实施例中，内源性是指天然的。
在另一个实施例中，“稳定保持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，周期为15代。在另一个实施例中，周期为20代。在另一个实施例中，周期为25代。在另一个实施例中，周期为30代。在另一个实施例中，周期为40代。在另一个实施例中，周期为50代。在另一个实施例中，周期为60代。在另一个实施例中，周期为80代。在另一个实施例中，周期为100代。在另一个实施例中，周期为150代。在另一个实施例中，周期为200代。在另一个实施例中，周期为300代。在另一个实施例中，周期为500代。在另一个实施例中，该周期为更多代。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外(例如培养物中)稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体内稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外和体内都稳定保持。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含可操作地整合进李斯特菌基因组中与内源性ActA序列一起作为开放阅读框的核酸分子。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达载体，所述载体包含编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含融合到ActA或截短的ActA的抗原。在一个实施例中，抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-233号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，如美国专利No.7,655,238中所述，该专利以引用方式全文并入本文。在另一个实施例中，截短的ActA是ActA-N100或其修饰型式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序缺失，并且包含非保守的QDNKR置换，如美国专利公布No.2014/0186387中所述。
在另一个实施例中，“功能性片段”是免疫原性片段，当给受试者单独或在本文公开的疫苗组合物中施用时引起免疫应答。在另一个实施例中，功能性片段具有生物学活性，如技术人员所了解的并且如本文所进一步公开。
本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株在另一个实施例中是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组格雷李斯特菌(Listeria grayi)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组默里李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是重组威耳逊李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是本领域已知的任何其他李斯特菌属菌种的重组菌株。
在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株已经在动物宿主中传代。在另一个实施例中，该传代让该菌株作为疫苗载体的效能最佳化。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，该传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含编码含抗原重组肽的基因的基因组插入。在另一个实施例中，李斯特菌菌株携带包含编码含抗原重组肽的基因的质粒。在另一个实施例中，该传代如本文所述进行。在另一个实施例中，该传代通过本领域已知的任何其他方法进行。在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株未通过动物宿主传代。
在另一个实施例中，本文公开的重组核酸可操作地连接至驱动编码肽在李斯特菌菌株中表达的启动子/调控序列。可用于驱动基因的组成型表达的启动子/调控序列是本领域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的PhlyA、PActA和p60启动子，链球菌(Streptococcus)bac启动子，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)sgiA启动子以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。
在另一个实施例中，编码本文所公开的肽的核酸的诱导型和组织特异性表达通过将编码该肽的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的调控下实现。可用于此目的的组织特异性或诱导型启动子/调控序列的例子包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子和SV40晚期增强子/启动子。在另一个实施例中，采用响应于诱导剂(诸如金属、糖皮质素等等)而诱导的启动子。因此，将领会的是，本发明包括使用任何已知或未知的并且能够驱动与其可操作地连接的所需蛋白的表达的启动子/调控序列。技术人员将领会的是，术语“异源性”涵盖源自与参考物种不同的物种的核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白。因此，例如，表达异源多肽的李斯特菌菌株在一个实施例中将表达不是该李斯特菌菌株天然的或内源性的多肽，或在另一个实施例中，通常不由该李斯特菌菌株表达的多肽，或在另一个实施例中，来自该李斯特菌菌株之外的来源的多肽。在另一个实施例中，异源性可用于描述源自同一物种内的不同生物体的某物。在另一个实施例中，异源性抗原由李斯特菌的重组菌株表达，并在哺乳动物细胞被该重组菌株感染后加工且呈递到细胞毒性T细胞。在另一个实施例中，由李斯特菌菌种表达的异源性抗原不需要与肿瘤细胞或传染原中对应的未修饰的抗原或蛋白精确匹配，只要其导致可识别在哺乳动物中天然表达的未修饰抗原或蛋白的T细胞应答即可。
技术人员将领会的是，术语“游离型表达载体”涵盖这样的核酸载体，其可以为线性的或环状的，并且其通常为双链的形式且在染色体外，因为其存在于宿主细菌或细胞的细胞质中，而不是整合进细菌或细胞的基因组。在一个实施例中，游离型表达载体包含所关注的基因。在另一个实施例中，游离型载体在细菌细胞质中保持多个拷贝，从而导致所关注的基因的扩增，并在另一个实施例中，在必要时提供病毒反式作用因子。在另一个实施例中，游离型表达载体在本文可被称为质粒。在另一个实施例中，“整合型质粒”包含这样的序列，该序列将该质粒的插入或所携带的所关注基因的插入靶向宿主基因组内。在另一个实施例中，插入的所关注基因不中断，或不受到通常因整合进细胞DNA中而发生的调控约束。在另一个实施例中，存在所插入的异源性基因不导致细胞自身重要区域的重排或中断。在另一个实施例中，在稳定的转染程序中，使用游离型载体通常导致比使用染色体整合质粒更高的转染效率(Belt,P.B.G.M.等人(1991)Efficient cDNA cloning by directphenotypic correction of a mutant human cell line(HPRT2)using an Epstein-Barrvirus-derived cDNA expression vector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等人(1997)Extremely efficient gene transfection into lympho-hematopoieticcell lines by Epstein-Barr virus-based vectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的游离型表达载体可通过用于将DNA分子递送到细胞的多种方法中的任一种递送到体内、离体、体外细胞。载体也可以单独地或以增强向受试者细胞递送的药物组合物的形式递送。
在一个实施例中，术语“融合”是指通过共价键合可操作地连接。在一个实施例中，该术语包括(核酸序列或其开放阅读框的)重组融合。在另一个实施例中，该术语包括化学偶联。
在一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为吸收质粒或其他异源性DNA分子。在另一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为表达质粒的基因或其他异源性DNA分子。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。接合的方法是本领域熟知的，并例如在Nikodinovic J等人(A second generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006年11月；56(3):223-7)和Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。每种方法代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，术语“减毒”是指细菌在动物中的致病能力降低。换句话讲，减毒李斯特菌菌株的病原学特性与野生型李斯特菌相比已降低，虽然减毒李斯特菌能够在培养中生长和维持。例如，使用减毒李斯特菌对Balb/c小鼠的静脉内接种，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50升高至少约10倍，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1,000倍，甚至更优选地至少约10,000倍，最优选地至少约100,000倍。李斯特菌的减毒菌株因此是不杀死施用该菌株的动物的菌株，或是仅当施用的细菌数远高于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌数时才杀死动物的菌株。减毒细菌还应被解释为意指不能够在一般环境中复制的细菌，因为在该环境中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌在提供了所需营养物的受控环境中以受限方式复制。本发明的减毒菌株因此是环境安全的，因为它们不能以不可控制的方式复制。
组合物
在一个实施例中，本发明的组合物是免疫原性组合物。在一个实施例中，本发明的组合物诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质。在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质(Dominiecki等人,Cancer ImmunolImmunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日电子版，以引用方式全文并入本文；Beatty和Paterson,J.Immunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，以引用方式全文并入本文)。在一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD4+ T细胞介导(Beatty和Paterson，2001)。在另一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD8+T细胞介导。在另一个实施例中，因李斯特菌疫苗接种导致的IFN-γ分泌由NK细胞、NKT细胞、Th1 CD4+ T细胞、TC1 CD8+ T细胞或它们的组合介导。
在另一个实施例中，本文公开的组合物的施用诱导一种或多种抗血管新生蛋白或因子的生成。在一个实施例中，该抗血管新生蛋白为IFN-γ。在另一个实施例中，该抗血管新生蛋白为色素上皮衍生因子(PEDF)、血管新生抑制素、内皮抑素、fms样酪氨酸激酶(sFlt)-1或可溶性内皮因子(sEng)。在一个实施例中，本发明的李斯特菌参与抗血管新生因子的释放，由此，在一个实施例中，除了作为用于将抗原引入受试者的载体之外还具有治疗作用。每个李斯特菌菌株及其类型代表了本发明的独立实施例。
本文所公开的方法和组合物所诱导的免疫应答在另一个实施例中为T细胞应答。在另一个实施例中，免疫应答包括T细胞应答。在另一个实施例中，应答为CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，该应答包括CD8+ T细胞应答。每种可能性代表了如本文所公开的独立实施例。
在另一个实施例中，施用本文所公开的组合物增加抗原特异性T细胞的数量。在另一个实施例中，施用组合物激活T细胞上的共刺激受体。在另一个实施例中，施用组合物诱导记忆和/或效应T细胞的增殖。在另一个实施例中，施用组合物增加T细胞的增殖。
如全文所用，术语“组合物”和“免疫原性组合物”可互换使用，均具有相同的含义和特性。在一个实施例中，用于同时或顺序施用各组分的包含重组李斯特菌菌株并且还包含抗体的本文公开的免疫原性组合物也称为“组合疗法”。在另一个实施例中，用于同时或顺序施用各组分的包含重组李斯特菌菌株并且还包含抗体的本文公开的免疫原性组合物也称为“组合疗法”。技术人员应当理解的是，组合疗法也可以包括另外的组分、抗体、疗法等。在一些实施例中，术语“药物组合物”是指适用于药物用途，例如给需要的受试者施用的组合物。
本发明的组合物可用于本发明的方法，以便引发受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答，以便抑制受试者中的肿瘤介导的免疫抑制，或用于提高受试者的脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率，或它们的任何组合。
在另一个实施例中，包含本文公开的李斯特菌菌株的组合物还包含佐剂。在一个实施例中，本发明的组合物还包含佐剂。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物所用的佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施例中，该佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施例中，该佐剂为编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂包含皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂为单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂为SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂包含SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂为含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂包含含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂为免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂为编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为或包含刺糖苷(quillglycoside)。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌有丝分裂原。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌毒素。在另一个实施例中，该佐剂为或包含本领域已知的任何其他佐剂。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本文公开的免疫源性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本文公开的免疫源性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。
在一个实施例中，本文公开的免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个实施例中，所述抗体或其片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体或其任何组合。
在另一个实施例中，本文公开的免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个实施例中，所述抗体或其片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体或其任何组合。
在一些实施例中，术语“抗体”是指完整分子以及它们的功能性片段，在本文也称为“抗原结合片段”，诸如能够与如本文所述的所需靶标特异性相互作用，例如结合到TNF受体超家族成员或T细胞受体共刺激分子或抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的Fab、F(ab’)2和Fv。
在一些实施例中，该抗体片段包括：(1)Fab，即包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，它可通过用木瓜蛋白酶消化全抗体以生成完整轻链和一条重链的一部分来制备；(2)Fab’，即这样的抗体分子的片段：其可通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后还原，以生成完整轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3)(Fab’)2，即这样的抗体的片段：其可通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后不用还原来获得；F(ab’)2是两个Fab’片段通过两个二硫键保持在一起形成的二聚体；(4)Fv，即包含轻链可变区和重链可变区的基因工程片段，所述轻链可变区和重链可变区以两条链表达；或(5)单链抗体(”SCA”)，即包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
这些片段的制备方法是本领域已知的。(参见例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988，该文献以引用方式并入本文)。
在一些实施例中，抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。
在一些实施例中，抗体片段可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶裂解，从而得到以F(ab’)2表示的5S片段来制备。该片段可使用硫醇还原剂，以及任选地使用从二硫键的裂解获得的巯基基团的封端基团进一步裂解，以生成3.5S Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶裂解直接生成两个单价Fab’片段和Fc片段。这些方法例如由Goldenberg在美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献中进行了描述，这些专利的全文据此以引用方式并入。另见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。只要片段结合到由完整抗体识别的抗原，也可使用裂解抗体的其他方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步裂解片段，或其他酶学、化学或基因技术。
Fv片段包含VH和VL链的缔合。该缔合可以是非共价的，如在Inbar等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69:2659-62,1972中所述。或者，可变链可通过分子间二硫键连接，或通过化合物诸如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包含DNA序列的结构基因来制备，该DNA序列编码通过寡核苷酸连接的VH和VL域。该结构基因插入表达载体，随后将该表达载体引入宿主细胞诸如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V域的接头肽的单条多肽链。sFv的制备方法例如在Whitlow和Filpula,Methods,2:97-105,1991；Bird等人,Science 242:423-426,1988；Pack等人,Bio/Technology 11:1271-77,1993；以及Ladner等人的美国专利No.4,946,778中有所描述，这些文献全文据此以引用方式并入。
抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码所关注的抗体的CDR的基因获得。这样的基因例如使用聚合酶链式反应合成产抗体细胞的RNA的可变区来制备。参见例如Larrick和Fry,Methods,2:106-10,1991。
在一些实施例中，如本文所述的抗体或片段可包括抗体的“人源化形式”。在一些实施例中，术语“抗体的人源化形式”是指非人(如鼠科动物)抗体，它是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔子的CDR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体还可包含既不存在于受体抗体也不存在于导入CDR或框架序列中的残基。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。一般来讲，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为导入残基，它们通常取自导入可变域。人源化基本上可按照Winter及其同事的方法[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)]，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的对应序列来进行。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中远小于完整人可变域被非人物种的对应序列替代。在实施过程中，人源化抗体是通常其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
人抗体也可使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库制备[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于人单克隆抗体的制备[Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。相似地，人可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物如小鼠来制备，其中该内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在挑战后，观察人抗体的产生，该抗体在所有方面与人密切相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法例如在美国专利No.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科学出版物中有所描述：Marks等人,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人,NatureBiotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
在一个实施例中，抗体或其功能性片段结合到抗原或其部分，所述抗原或其部分包括T细胞受体共刺激分子、抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子或TNF受体超家族的成员。在另一个实施例中，抗原或其部分包含T细胞受体共刺激分子，包括CD28、ICOS。在另一个实施例中，抗原或其部分包括抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子，包括CD80受体、CD86受体或CD46受体。在另一个实施例中，抗原或其部分包括TNF受体超家族成员，包括糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25。
在一个实施例中，抗体或功能性片段包括T细胞受体共刺激分子结合区、抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子结合区或TNF受体超家族成员结合区。在另一个实施例中，本文公开的抗体是CD28抗体、ICOS抗体或针对此前未命名的共刺激受体的抗体。在另一个实施例中，抗体是CD80受体抗体、CD86受体抗体或CD46受体抗体。在另一个实施例中，抗体是TNF受体超家族成员结合性抗体，其包括糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)抗体、OX40(CD134受体)抗体、4-1BB(CD137受体)抗体或TNFR25抗体。抗体的形式可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体或衍生自非人类动物物种的人源化抗体。抗体可以是完整的或部分的，其中一条或两条抗体链的可变部分是特异性的以充当共刺激受体结合位点的激动剂。
在另一个实施例中，本文公开的抗体为抗OX40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗GITR抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施例中，公开了一种治疗受试者中的癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括以下步骤：获得效应T细胞群，用GITR激动剂处理所述细胞群，所述激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL的活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗抗体。在另一个实施例中，受试者受癌症的折磨。
在另一个实施例中，公开了一种包含重组李斯特菌菌株和GITR激动剂的组合疗法，所述激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL的活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗抗体，其中所述组合疗法用于治疗具有肿瘤或癌症的受试者。
在一个实施例中，本公开提供结合到人CD134的分离的结合分子，包括抗CD134抗体和抗CD134的衍生物。
在另一个实施例中，本公开提供结合到人CD134的结合分子，其中该结合分子不妨碍人CD134(OX40配体(OX40L))，并且其中所述结合分子还不阻碍人CD134表达性效应T细胞上的人OX40L的免疫刺激和/或增殖响应。
在另一个实施例中，本公开提供结合到人CD134的结合分子，其中对OX40L结合到人CD134表达性T细胞上的CD134的效应降低不超过约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％或更低，并且其中所述结合分子增强人CD134表达性效应T细胞上的人OX40L的免疫刺激和/或增殖响应。
在另一个实施例中，本公开提供结合到人CD134的结合分子，其中该结合分子不妨碍人CD134(OX40配体(OX40L))，并且其中所述结合分子增强人CD134表达性效应T细胞上的人OX40L的免疫刺激和/或增殖响应。
在一个实施例中，本文所公开的疾病为癌症或肿瘤。在一个实施例中，由本发明的方法处理的癌症为乳腺癌。在另一个实施例中，该癌症为宫颈癌。在另一个实施例中，该癌症为含Her2的癌症。在另一个实施例中，该癌症为黑素瘤。在另一个实施例中，该癌症为胰腺癌。在另一个实施例中，该癌症为卵巢癌。在另一个实施例中，该癌症为胃癌。在另一个实施例中，该癌症为胰腺的癌性病变。在另一个实施例中，该癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，该癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，其为多形性胶质母细胞瘤。在另一个实施例中，该癌症为结直肠腺癌。在另一个实施例中，该癌症为肺鳞癌。在另一个实施例中，该癌症为胃腺癌。在另一个实施例中，该癌症为卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)。在另一个实施例中，该癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施例中，该癌症为非小细胞肺癌。在另一个实施例中，该癌症为子宫内膜癌。在另一个实施例中，该癌症为膀胱癌。在另一个实施例中，该癌症为头颈癌。在另一个实施例中，该癌症为前列腺癌。在另一个实施例中，该癌症为口咽癌。在另一个实施例中，该癌症为肺癌。在另一个实施例中，该癌症为肛门癌。在另一个实施例中，该癌症为结肠直肠癌。在另一个实施例中，该癌症为食道癌。在另一个实施例中，该癌症为间皮瘤。
在一个实施例中，本文公开的异源性抗原为HPV-E7。在另一个实施例中，该抗原为HPV-E6。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV株16。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV株18。在另一个实施例中，HPV-E6来自HPV株16。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV株18。在另一个实施例中，本发明也涵盖本文公开的异源性抗原的片段。
在另一个实施例中，该抗原为Her-2/ne。在另一个实施例中，该抗原为NY-ESO-1。在另一个实施例中，该抗原为端粒酶(TERT)。在另一个实施例中，该抗原为SCCE。在另一个实施例中，该抗原为CEA。在另一个实施例中，该抗原为LMP-1。在另一个实施例中，该抗原为p53。在另一个实施例中，该抗原为碳酸酐酶IX(CAIX)。在另一个实施例中，该抗原为PSMA。在另一个实施例中，抗原为前列腺干细胞抗原(PSCA)。在另一个实施例中，该抗原为HMW-MAA。在另一个实施例中，抗原为WT-1。在另一个实施例中，该抗原为HIV-1Gag。在另一个实施例中，抗原为蛋白酶3。在另一个实施例中，该抗原为酪氨酸酶相关蛋白2。在另一个实施例中，该抗原为PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，该抗原选自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、HMW-MAA、EGFR-III、存活素、凋亡重复序列包含棒状病毒抑制因子5(BIRC5)、WT-1、HIV-1Gag、CEA、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、Muc1、PSA(前列腺特异性抗原)或它们的组合。
在另一个实施例中，“免疫原性片段”为当向受试者单独施用或在本文公开的疫苗组合物中施用时引起免疫应答的片段。在另一个实施例中，这样的片段包含必要的表位，以引起体液免疫应答和/或适应性免疫应答。
在一个实施例中，本文公开的组合物包含抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，该组合物包含至少一种抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，组合物可包含2种抗体、3种抗体、4种抗体或多于4种抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含Lm菌株和至少一种抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含Lm菌株和2种抗体、3种抗体、4种抗体或多于4种抗体。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含抗体或其功能性片段。存在于相同或不同组合物中的不同抗体不必具有相同的形式，例如一种抗体可以是单克隆抗体，另一种可以是Fab片段。
在一个实施例中，本文公开的组合物包含特异性结合GITR或其部分的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含特异性结合OX40或其部分的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，组合物可包含特异性结合GITR或其部分的抗体和特异性结合OX40的抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和特异性结合GITR的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和特异性结合OX40的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株以及特异性结合GITR或其部分的抗体和特异性结合OX40或其部分的抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合GITR的抗体或其功能性片段，其中该组合物不含本文公开李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合OX40的抗体或其功能性片段，其中该组合物不含本文公开李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合GITR的抗体或其功能性片段和特异性结合GITR的抗体，其中该组合物不含本文公开李斯特菌菌株。存在于相同或不同组合物中的不同抗体不必具有相同的形式，例如一种抗体可以是单克隆抗体，另一种可以是Fab片段。每种可能性代表了本发明的不同实施例。
术语“抗体功能性片段”是指完整抗体的能够特异性结合抗原以导致本发明所预期的生物作用的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型多肽链中的较小者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
技术人员将理解的是，术语“合成抗体”可涵盖使用重组DNA技术生成的抗体，比如由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应被理解为意指这样的抗体：其通过编码抗体的DNA分子的合成而生成，并且该DNA分子表达抗体蛋白或约定该抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列使用本领域可用的和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
在一个实施例中，抗体或其功能性片段包括抗原结合区。在一个实施例中，抗原结合区是抗体或其抗原结合域。在一个实施例中，其抗原结合域是Fab或scFv。
技术人员将领会的是，就抗体而言的术语“结合”或“特异性结合”涵盖抗体或其功能性片段，其识别特异抗原，而基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体可能也结合来自一个或多个物种的该抗原，但是，这种跨物种反应性本身不改变将抗体分类为特异性的。在另一例子中，特异性结合抗原的抗体可能也结合该抗原的不同等位基因形式。但是，这种交叉反应性不改变将抗体分类为特异性的。在一些情况下，可在提及抗体、蛋白或肽与第二化学物相互作用中使用术语“特异性结合”或“特异地结合”，指该相互作用依赖于该化学物上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特异蛋白结构而不是特异氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明的组合物包含重组单核细胞增多性李斯特菌(Lm)菌株。在另一个实施例中，本文公开的组合物包含抗体或其功能性片段，如本文所描述的。
在一个实施例中，免疫原性组合物包含本文公开的抗体或其功能性片段，和本文公开的重组减毒李斯特菌。在另一个实施例中，本文公开的免疫原性组合物的各组分在本文公开的免疫原性组合物的另一组分之前、同时或之后施用。在一个实施例中，即使同时施用时，Lm组合物和抗体或其功能性片段也可以作为两个分开的组合物施用。替代性地，在另一个实施例中，Lm组合物可以包含抗体或其功能性片段。
在另一个实施例中，本文公开的组合物通过本领域技术人员已知的任何方法向受试者施用，例如胃肠外、癌旁、透粘膜、透皮、肌肉内、静脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内施用。
在另一个实施例中，该组合物经口施用，并因此将其被配制为适合经口施用的形式，即，作为固体或液体制备物。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包括硬明胶胶囊。
在另一个实施例中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制剂来施用组合物。适合的液体制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。
在一些实施例中，当抗体或其功能性片段与包含重组Lm菌株的组合物分开施用时，该抗体可以静脉内注射、皮下注射或直接注射进肿瘤或瘤床中。在一个实施例中，将包含抗体的组合物注射进肿瘤手术摘除后留下的空间内，例如在摘除前列腺肿瘤后的前列腺腺体内的空间。
在一个实施例中，术语“免疫原性组合物”可以涵盖本文公开的重组李斯特菌、佐剂、和抗体或其功能性片段或者它们的组合。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本文公开的重组李斯特菌。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或如本文所公开的佐剂。还应理解的是，这些组合物的施用增强免疫应答或增加效应T细胞与调节性T细胞比率或者引起抗肿瘤免疫应答，如本文进一步公开的。
在一个实施例中，本发明提供使用方法，该方法包括施用包含所述李斯特菌菌株并且还包含抗体或其功能性片段的组合物。在另一个实施例中，使用方法包括施用多于一种本文所公开的抗体，该抗体可以存在于相同或不同的组合物中，并且可以存在于与李斯特菌相同的组合物中或单独的组合物中。
在一个实施例中，术语“药物组合物”涵盖治疗有效量的一种或多种活性成分(包括李斯特菌菌株)，和至少一种抗体或其功能性片段，以及药学上可接受的载体或稀释剂。应当理解，术语“治疗有效量”是指为给定病症和施用方案提供治疗效果的量。
技术人员应当理解，术语“施用”涵盖使受试者与本发明的组合物接触。在一个实施例中，施用可在体外即在试管中实现，或在体内即活生物体(例如人)的细胞或组织内实现。在一个实施例中，本发明包括向受试者施用本发明的李斯特菌菌株及其组合物。
如本文所用，术语“约”是数量术语，意指加或减5％，或在另一个实施例中，加或减10％，或在另一个实施例中，加或减15％，或在另一个实施例中，加或减20％。技术人员理解，术语“受试者”可涵盖哺乳动物，包括需要治疗病症或其后遗症或易受其影响的人类成人或儿童、少年或青少年，并且还可包括非人类哺乳动物，诸如狗、猫、猪、乳牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠。还将领会的是，该术语可以涵盖家畜。术语”受试者”不排除在所有方面都正常的个体。
在施用本文公开的免疫原性组合物之后，本文公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致肿瘤部位存在的效应T细胞增加。在另一个实施例中，本文公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致外周存在的效应T细胞增加。效应T细胞的这种扩增导致外周中和肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。技术人员将领会的是，外周淋巴器官包括但不限于脾脏、培氏斑、淋巴结、腺状肿等。在一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周中，而不影响Treg的数量。在另一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周、淋巴器官和肿瘤部位，而不影响这些部位的Treg数量。在另一个实施例中，效应T细胞的比率提高降低Treg的频率，而非这些部位的Treg总数。
组合疗法及其使用方法
在一个实施例中，本公开提供了一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，抗体为激动剂抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗TNF受体抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗OX40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗GITR抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，所述方法包括施用另外的抗体，该抗体可包含在含有所述重组李斯特菌菌株的组合物中或可包含在单独的组合物中。
在另一个实施例中，公开了一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，抗体为激动剂抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗TNF受体抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗OX40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗GITR抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，所述方法包括施用另外的抗体，该抗体可包含在含有所述重组李斯特菌菌株的组合物中或可包含在单独的组合物中。
在一个实施例中，包含本文所述的李斯特菌菌株的任何组合物可用于本文公开的方法。在一个实施例中，包含李斯特菌菌株和抗体或其片段(例如，如本文所述的结合TNF受体超家族成员的抗体，或结合到T细胞受体共刺激分子的抗体，或结合到抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的抗体)的任何组合物均可用在本发明的方法中。在一个实施例中，包含本文所述的抗体或其功能性片段的任何组合物均可用于本文公开的方法。包含李斯特菌菌株的具有和不具有抗体的组合物已在上文详细描述。具有抗体的组合物也已在上文详细描述。在一些实施例中，在本发明的方法中，包含抗体或其片段(例如，结合到TNF受体超家族成员的抗体，或结合到T细胞受体共刺激分子的抗体，或结合到抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的抗体)的组合物可在施用包含李斯特菌菌株的组合物之前、同时或之后施用。
在一个实施例中，本文公开的组合物的重复施用(剂量)可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤消退。在另一个实施例中，重复剂量可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤生长的抑制。评估可通过本领域已知的任何技术确定，包括诊断方法诸如成像技术、血清肿瘤标志物分析、活组织检查、肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。
在一个实施例中，本文公开了用于预防、治疗表达异源性抗原的肿瘤和针对所述肿瘤进行疫苗接种，并且诱导对异源性抗原的次优势表位的免疫应答同时防止肿瘤的逃逸突变的方法和组合物。
在一个实施例中，用于预防、治疗表达异源性抗原的肿瘤和针对所述肿瘤进行疫苗接种的方法和组合物包括使用截短李斯特菌溶血素(tLLO)蛋白。在另一个实施例中，本文公开的方法和组合物包含过表达tLLO的重组李斯特菌。在另一个实施例中，tLLO从李斯特菌内的质粒表达。
在另一个实施例中，本文公开了一种防止或治疗受试者中的肿瘤生长或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫源性组合物的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本文公开了一种防止或治疗受试者中的肿瘤生长或癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫源性组合物的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。
在一个实施例中，术语“治疗”是指治愈疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指防止疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指减少疾病的发生。在另一个实施例中，“治疗”是指改善疾病的症状。在另一个实施例中，“治疗”是指提高患者的无进展存活期或总体存活期。在另一个实施例中，“治疗”是指稳定疾病的进展。在另一个实施例中，“治疗”是指诱导缓解。在另一个实施例中，“治疗”是指减缓疾病的进展。在另一个实施例中，术语“减少”、“阻遏”和“抑制”是指减轻或降低。
在一个实施例中，本文公开了提高受试者脾脏和肿瘤微环境中的效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，该方法包括施用本文公开的免疫原性组合物。在另一个实施例中，提高受试者的脾脏和肿瘤微环境中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率使得受试者中可以实现更明显的抗肿瘤应答。
在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施例中，该调节性T细胞是CD4+FoxP3+T细胞。
在一个实施例中，本发明提供治疗肿瘤、防御肿瘤以及诱导对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施例中，本发明提供一种预防或治疗人受试者中的肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物菌株的步骤，所述重组李斯特菌菌株包含含有LLO蛋白的N末端片段和肿瘤相关抗原的重组多肽，由此重组李斯特菌菌株诱导对肿瘤相关抗原的免疫应答，从而治疗人受试者中的肿瘤或癌症。在另一个实施例中，该免疫应答是T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，本发明提供避免受试者罹患肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本发明提供诱导受试者中的肿瘤消退的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本文公开了降低肿瘤或癌症的发生或复发的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本文公开了抑制受试者中的肿瘤形成的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本文公开了诱导受试者中的癌症缓解的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在一个实施例中，包含编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸分子整合进李斯特菌基因组。在另一个实施例中，核酸在重组李斯特菌疫苗株的质粒中。
在一个实施例中，所述方法包括将重组李斯特菌与另外的疗法共施用的步骤。在另一个实施例中，该另外的疗法是手术、化疗、免疫疗法、放疗、基于抗体的免疫疗法或它们的组合。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之前进行。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之后进行。在另一个实施例中，该另外的疗法是抗体疗法。在另一个实施例中，该重组李斯特菌以增大剂量施用，以提高效应T细胞与调节性T细胞的比率，并产生更强大的抗肿瘤免疫应答。技术人员将领会的是，抗肿瘤免疫应答可通过给患有肿瘤的受试者提供细胞因子进一步增强，该细胞因子包括但不限于IFN-γ、TNF-α以及本领域已知的增强细胞免疫应答的其他细胞因子，这些细胞因子中的一些可见于美国专利No.6,991,785，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，本文所公开的方法还包括将本文所公开的免疫原性组合物与在所述受试者中增强抗肿瘤免疫应答的抗体或其功能性片段共施用的步骤。
在一个实施例中，本文公开的方法还包括将本文公开的免疫原性组合物与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)通路抑制剂共施用的步骤。用于本发明的IDO通路抑制剂包括任何本领域已知的IDO通路抑制剂，其包括但不限于1-甲基色氨酸(1MT)、1-甲基色氨酸(1MT)、Necrostatin-1、吡哆醛异烟腙、依布硒啉、5-甲基吲哚M-3-甲醛、CAY10581、抗IDO抗体或小分子IDO抑制剂。在另一个实施例中，本文公开的组合物和方法还与在前的或随后的化疗或放疗方案联合使用。在另一个实施例中，IDO抑制增强化疗剂的功效。
在另一个实施例中，本文公开了一种增加罹患癌症或具有肿瘤的受试者的存活的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫源性组合物的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在另一个实施例中，本文公开了一种增加罹患癌症或具有肿瘤的受试者中的抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫源性组合物的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本文公开了一种增加罹患癌症或具有肿瘤的受试者中的T细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫源性组合物的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌菌株，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。
在另一个实施例中，本发明的方法还包括用如本文所公开的重组李斯特菌菌株或抗体或其功能性片段强化受试者的步骤。在另一个实施例中，用于强化接种的重组李斯特菌菌株与用于初始的“初免”接种的菌株相同。在另一个实施例中，强化菌株不同于初免菌株。在另一个实施例中，用于强化接种的抗体与用于初始的“初免”接种的抗体结合相同的抗原。在另一个实施例中，强化抗体不同于初免抗体。在另一个实施例中，将相同的剂量用于初免和强化接种。在另一个实施例中，将大剂量用于强化。在另一个实施例中，将小剂量用于强化。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化疫苗接种施用给受试者的步骤。在一个实施例中，强化疫苗接种在单次初免疫苗接种之后。在另一个实施例中，单次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，两次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，三次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期由技术人员通过实验确定。在另一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化菌株在初免菌株后8-10周施用。
在另一个实施例中，本发明的方法还包括用包含本文公开的减毒李斯特菌菌株的免疫原性组合物强化受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用强化剂量的免疫原性组合物的步骤，该组合物包含本文公开的减毒李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化免疫原性组合物施用给受试者的步骤。在一个实施例中，该强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施例中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，三次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施例中，包含本文公开的减毒李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，剂量由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，初免和强化剂量之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化剂量在免疫原性组合物的初免剂量后8-10周施用。
异源性“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体是有效的。Schneider等人,Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人,Strain 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA菌株初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的最有效方式。Shiver J.W.等人,Nature 415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人,Strain 20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人,Strain19:95-102(2000)；Sin,J.I.等人,DNACell Biol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据提示，当以HIV gag DNA对猴进行初免接种后接着以表达HIVgag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIV gag抗原的DNA添加CRL1005泊洛沙姆(12kDa,5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-gag强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.等人Nature415:331-5(2002)。美国专利申请公开US 2002/0165172A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的该免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利No.6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10天或3-7天内施用多核苷酸和多肽。该专利所考虑的抗原包括：肝炎(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎、流感、寄生虫(例如，来自疟原虫(Plasmodium)属)和病原菌(包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体(Chlamydia)、志贺氏菌(Shigella)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、伤寒沙门氏菌(S.typhosa)、幽门螺杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等)抗原等。通过引用将以上所有文献全文并入本文。
在一个实施例中，本发明的处理方案为治疗性的。在另一个实施例中，该方案为预防性的。在另一个实施例中，将本发明的组合物用于保护人们免于诸如乳腺癌的癌症或其他类型的肿瘤的风险，因为家族性遗传或其他情况使得它们易于罹患这些类型的疾病，如技术人员将理解的那样。在另一个实施例中，疫苗在通过手术、常规化疗或放疗摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在此类治疗后，本发明的疫苗的施用使得对疫苗的肿瘤抗原的CTL应答破坏了其余的转移并且延长了癌症的缓解。在另一个实施例中，将本发明的疫苗用于影响之前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。
在一些实施例中，术语“包含”或其语法形式是指包括指定的活性剂，诸如本发明的Lm菌株，以及包括其他活性剂，诸如抗体或其功能性片段，以及制药行业已知的药学上可接受的载体、赋形剂、缓和剂、稳定剂等。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”是指这样的组合物：其唯一的活性成分是指定的活性成分，然而，可包括用于稳定、保存制剂等等但不直接涉及指定的活性成分的治疗效果的其他化合物。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指这样的组分：其通过不同于指定的活性成分的机制发挥治疗效果。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指这样的组分：其发挥治疗效果并且属于与指定的活性成分不同的一类化合物。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指这样的组分：其例如通过不同作用机制的作用而发挥治疗效果并且可以不同于指定的活性成分。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指有助于释放活性成分的组分。在一些实施例中，术语“由...组成”是指这样的组合物：其包含活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂。
如本文所用，除非上下文明确地相反指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数含义。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括它们的混合物。
遍及本申请，本发明的各个实施例可以以范围的形式表示。应理解，以范围形式描述仅是出于方便和简洁，而不应认为是对发明范围的呆板限制。因此，对范围的描述应认为是已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应理解为已具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。这种适用性与范围的广度无关。
每当在本文中指出数值范围时，其旨在包括该指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数和第二指定数“之间的范围”和“从”第一指定数“至”第二指定数的“范围”在本文中可互换使用，旨在包括第一和第二指定数以及它们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知的或易于从已知的方式、手段、技术和工序开发的那些方式、手段、技术和工序。
在以下实例中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本发明。在其他情况中，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
实例
材料和实验方法(实例1-2)
细胞系
C57BL/6同基因TC-1肿瘤经HPV-16E6和E7永生化并以c-Ha-ras癌基因转化。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore,MD)提供的TC-1为高度致瘤的肺上皮细胞，该细胞表达低水平的HPV-16E6和E7，并被c-Ha-ras癌基因转化。让TC-1于37℃及10％CO2下生长在RPMI 1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、50微摩尔(mcM)2-ME、400微克(mcg)/mlG418以及10％国家典型菌种保藏中心-109培养基(National Collection Type Culture-109medium)中。C3为来自C57BL/6小鼠的小鼠胚胎细胞，该细胞经完整HPV 16基因组永生化并经pEJ-ras转化。EL-4/E7为经E7逆转录病毒转导的胸腺瘤EL-4。
单核细胞增多性李斯特菌菌株和繁殖
所用的李斯特菌菌株为Lm-LLO-E7，本文也称为ADXS11-001(在游离型表达系统中的hly-E7融合基因；图1A)、Lm-E7(整合进李斯特菌基因组中的单拷贝E7基因盒)、Lm-LLO-NP(“DP-L2028”；在游离型表达系统中的hly-NP融合基因)和Lm-Gag(“ZY-18”；整合进染色体中的单拷贝HIV-1Gag基因盒)。将E7用引物5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No:51；XhoI位点标有下划线)和5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No:52；SpeI位点标有下划线)通过PCR扩增并连接进pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)。通过XhoI/SpeI消化从pCR2.1切离E7，并将其连接进pGG-55。将hly-E7融合基因和多能转录因子prfA克隆进pAM401，即一种多拷贝穿梭质粒(Wirth R等人,JBacteriol,165:831,1986)，从而生成pGG-55。hly启动子驱动hly基因产物的前441个氨基酸(缺乏溶血性C-端，在下文中被称作“ΔLLO”，并具有SEQ ID No:3所示的序列)的表达，其通过XhoI位点连接至E7基因，从而产生hly-E7融合基因，该基因被转录和分泌成LLO-E7。用为了在体内保留质粒而选择的pGG-55转化prfA阴性李斯特菌菌株XFL-7(由Hao Shen博士提供，University ofPennsylvania)(图1A-B)。使用引物5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ IDNo:53；NheI位点标有下划线)和5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No:54；XhoI位点标有下划线)生成hly启动子和基因片段。将prfA基因用引物5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No:55；XbaI位点标有下划线)和5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No:56；SalI位点标有下划线)进行PCR扩增。通过将含有驱动E7的表达和分泌的hly启动子和信号序列的表达盒引入LM基因组的orfZ域中，产生Lm-E7。将E7用引物5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No:57；BamHI位点标有下划线)和5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No:58；XbaI位点标有下划线)通过PCR扩增。然后将E7连接进pZY-21穿梭载体。用得到的质粒pZY-21-E7转化LM菌株10403S，该质粒包括插入在与LM基因组的orfX、Y、Z域对应的1.6-kb序列的中央的表达盒。该同源域允许E7基因盒通过同源重组插入orfZ域中。针对E7基因盒在orfZ域中的整合，筛选克隆。在含有(Lm-LLO-E7和Lm-LLO-NP)或不含(Lm-E7和ZY-18)氯霉素(20μg/ml)的脑心浸液培养基中培养细菌。在-80℃以等分试样冷冻细菌。通过Western印迹法验证表达(图2)。
Western印迹法
使李斯特菌菌株在Luria-Bertoni培养基中于37℃生长，并在600nm处测得的相同光密度下收获。将上清液TCA沉淀，并重悬于补充了0.1N NaOH的1x样品缓冲液中。将相同量的每种细胞沉淀物或每种经TCA沉淀的上清液上样至4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(NOVEX,San Diego,CA)。将凝胶转移至聚偏二氟乙烯，并用抗-E7单克隆抗体(mAb)(ZymedLaboratories,South San Francisco,CA)探测，然后与HRP-偶联的抗小鼠二抗(AmershamPharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起温育，用Amersham ECL检测试剂显影，并暴露于Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)。
肿瘤生长的测量
每隔一天用卡尺跨最短和最长表面直径测量肿瘤。将这两个测量结果的平均值作为平均肿瘤直径(以毫米计)相对于不同时间点作图。当肿瘤直径达到20mm时，处死小鼠。仅显示存活小鼠在每个时间点的肿瘤测量结果。
李斯特菌重组体对建立的肿瘤生长的影响
6-8周龄C57BL/6小鼠(Charles River)在左胁腹皮下接受2×105个TC-1细胞。肿瘤接种后一周，肿瘤已经达到直径为4-5mm的可触知大小。然后在第7和14天用0.1LD50腹膜内Lm-LLO-E7(107个CFU)、Lm-E7(106个CFU)、Lm-LLO-NP(107个CFU)或Lm-Gag(5×105个CFU)处理8只小鼠的组。
51Cr释放测定
以0.1LD50Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜内免疫6-8周龄C57BL/6小鼠。免疫接种后十天，收获脾。将经照射的TC-1细胞作为饲养细胞，在培养物中建立脾细胞(100:1，脾细胞:TC-1)；在体外刺激5天，然后用在标准51Cr释放测定中，其中使用下述靶标：EL-4、EL-4/E7或经E7H-2b肽(RAHYNIVTF)脉冲处理的EL-4。一式三份地进行的E:T细胞比率为：80:1、40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1。在37℃温育4h以后，将细胞沉淀，并从每个孔取出50μl上清液。以Wallac 1450闪烁计数器(Gaithersburg,MD)测定样品。将特异性裂解百分比确定为[(每分钟的实验计数(cpm)-自发cpm)/(总cpm-自发cpm)]×100。
TC-1特异性增殖
将C57BL/6小鼠用0.1LD50免疫，并在20天后通过腹膜内注射1LD50Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag进行强化。强化后六天，从经免疫的小鼠和未暴露的小鼠收获脾。以2.5×104、1.25×104、6×103或3×103个经照射的TC-1细胞/孔作为E7Ag的来源，或不用TC-1细胞或用10μg/ml Con A，在平底96孔平板中以5×105个/孔在培养物中建立脾细胞。45h后以0.5μCi[3H]胸苷/孔脉冲处理细胞。18h以后，采用Tomtec采集器96(Orange,CT)收获平板，并用Wallac 1450闪烁计数器评估增殖。将以cpm计的变化计算为实验cpm–无Ag cpm。
流式细胞术分析
将C57BL/6小鼠用0.1LD50Lm-LLO-E7或Lm-E7静脉内(i.v.)免疫，并在30天后强化。采用带软件(Becton Dickinson,Mountain View,CA)的流式细胞计对CD8(53-6.7，PE偶联的)、CD62配体(CD62L；MEL-14，APC偶联的)和E7H-2Db四聚体进行三色流式细胞术。将强化后第5天收获的脾细胞在室温(rt)用负载了E7肽(RAHYNIVTF)或对照(HIV-Gag)肽的H-2Db四聚体染色。以1/200稀释度使用四聚体，其由Larry R.Pease博士(MayoClinic,Rochester,MN)以及由NIAID Tetramer Core Facility和NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program提供。分析了四聚体+、CD8+、CD62L低细胞。
B16F0-Ova实验
给24只C57BL/6小鼠接种5×105个B16F0-Ova细胞。在第3、10和17天，将8只小鼠的组用0.1LD50Lm-OVA(106个cfu)、Lm-LLO-OVA(108个cfu)免疫，另八只动物保持不处理。
统计
为了对比肿瘤直径，确定每个组的肿瘤大小的平均值和SD，并通过学生t检验确定统计显著性。p≤0.05视作显著的。
实例1：LLO-抗原融合体诱导抗肿瘤免疫
结果
对比了Lm-E7和Lm-LLO-E7影响TC-1生长的能力。在C57BL/6小鼠的左胁腹上建立皮下肿瘤。七天后，肿瘤已经达到可触知的大小(4-5mm)。在第7和14天，给小鼠接种0.1LD50Lm-E7、Lm-LLO-E7或作为对照的Lm-Gag和Lm-LLO-NP。Lm-LLO-E7诱导75％的建立的TC-1肿瘤的完全消退，而在该组中的其他2只小鼠中控制了肿瘤生长(图3)。相反，使用Lm-E7和Lm-Gag的免疫接种没有诱导肿瘤消退。该实验重复多次，总是得到非常类似的结果。另外，在不同的免疫方案下，Lm-LLO-E7也得到了类似的结果。在另一实验中，单次免疫能够治愈小鼠建立的5mm TC-1肿瘤。
在其他实验中，用另外2个表达E7的肿瘤细胞系得到了类似的结果：C3和EL-4/E7。为了确认以Lm-LLO-E7接种的效力，分别在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7肿瘤细胞重新挑战已经消除了它们的肿瘤的动物。经Lm-LLO-E7免疫的动物保持无肿瘤直到实验终止(就TC-1而言，第124天；就EL-4/E7而言，第54天)。
因此，抗原作为与ΔLLO的融合蛋白的表达会增强所述抗原的免疫原性。
实例2：LM-LLO-E7处理引起TC-1特异性脾细胞增殖
为了用Lm-LLO-E7测量Lm-E7对T细胞的诱导，在经免疫的小鼠中测量了TC-1特异性增殖性应答(抗原特异性免疫活性的度量)。来自经Lm-LLO-E7免疫的小鼠的脾细胞当以20:1、40:1、80:1和160:1的脾细胞:TC-1比率暴露于经照射的TC-1细胞(作为E7的来源)时发生增殖(图4)。反之，来自经Lm-E7和rLm对照免疫的小鼠的脾细胞仅表现出背景水平的增殖。
实例3：ActA-E7和PEST-E7融合体赋予抗肿瘤免疫
材料和方法
Lm-ActA-E7的构建
Lm-ActA-E7是LM的重组菌株，其包含表达与截短形式的actA蛋白融合的E7蛋白的质粒。通过将质粒载体pDD-1引入李斯特菌而生成Lm-actA-E7，所述质粒载体通过修改pDP-2028而构建。pDD-1包含表达310bp hly启动子和hly信号序列(ss)的拷贝的表达盒，该表达盒驱动ActA-E7的表达和分泌；包含四个PEST序列(SEQ ID NO:14)的1170bp actA基因(截短的ActA多肽由分子的前390个AA组成，SEQ ID NO:12)、300bp HPV E7基因、1019bp prfA基因(控制毒力基因的表达)和CAT基因(氯霉素抗性基因)用于选择所转化的细菌克隆(Sewell等人(2004),Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130:92-97)。
使用引物5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I位点标有下划线；SEQID NO:59)和引物5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(Not I位点标有下划线；前18个核苷酸为ActA基因重叠；SEQ ID NO:60)从pGG55(实例1)对hly启动子(pHly)和基因片段进行PCR扩增。使用引物5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'(NotI位点标有下划线；SEQ IDNO:61)和引物5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI位点标有下划线；SEQ ID NO:62)从LM 10403s野生型基因组对actA基因进行PCR扩增。使用引物5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI位点标有下划线；SEQ ID NO:63)和引物5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI位点标有下划线；SEQ ID NO:64)从pGG55(pLLO-E7)对E7基因进行PCR扩增。使用引物5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(XmaI位点标有下划线；SEQ ID NO:65)和引物5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI位点标有下划线；SEQ ID NO:66)从LM 10403s野生型基因组对prfA基因进行PCR扩增。通过PCR生成hly启动子-actA基因融合体(pHly-actA)，并使用上游pHly引物(SEQ ID NO:59)和下游actA引物(SEQ ID NO:62)从纯化的pHly DNA和纯化的actA DNA进行扩增。
通过PCR生成与prfA基因融合的E7基因(E7-prfA)，并使用上游E7引物(SEQ IDNO:63)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:66)从纯化的E7DNA和纯化的prfA DNA进行扩增。
通过PCR产生与E7-prfA融合产物融合的pHly-actA融合产物，并使用上游pHly引物(SEQ ID NO:59)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:66)从纯化的融合pHly-actA DNA基因产物和纯化的融合E7-prfA DNA产物进行扩增，且连接到pCRII(Invitrogen,La Jolla,Calif.)中。用pCRII-ActAE7转化感受态大肠杆菌(TOP10'F,Invitrogen,La Jolla,Calif.)。在裂解和分离后，使用BamHI(预期片段大小770bp和6400bp(或当插入片段逆向插入载体时：2500bp和4100bp))和BstXI(预期片段大小2800bp和3900bp)通过限制性分析筛选质粒，并且还使用上游pHly引物(SEQ ID NO:59)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:66)通过PCR分析进行了筛选。
将pHly-actA-E7-prfA DNA插入片段通过用Xba I和Sal I双重消化而从pCRII切割，并连接进也用Xba I和Sal I消化的pDP-2028。在用表达系统pActAE7转化TOP10'F感受态大肠杆菌(Invitrogen,La Jolla,Calif.)后，使用上游pHly引物(SEQID NO:59)和下游PrfA基因引物(SEQ ID NO:66)通过PCR分析来筛选耐氯霉素克隆。使包含pActAE7的克隆在脑心浸液培养基(具有氯霉素(20mcg(微克)/ml(毫升)，Difco,Detroit,Mich.)中生长，并使用小量提取DNA纯化系统试剂盒(midiprep DNA purification system kit)(Promega,Madison,Wis.)分离pActAE7。如在Ikonomidis等人(1994,J.Exp.Med.180:2209-2218)中所描述的，用表达系统pActAE7转化青霉素处理的李斯特菌的prfA阴性菌株(菌株XFL-7)，并针对体内质粒保留来选择克隆。于37℃在含有氯霉素(20mcg/ml)的脑心浸液中培养克隆。在-80℃在等分试样中冷冻细菌。
抗原表达的免疫印迹验证
为了验证Lm-ActA-E7分泌ActA-E7(约64kD)，使李斯特菌菌株在Luria-Bertoni(LB)培养基中在37℃培养。用三氯乙酸(TCA)从培养物上清液中沉淀蛋白，重悬于含有0.1N氢氧化钠的1x样品缓冲液中。将相等量的每种经TCA沉淀的上清液加样至4％至20％Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX,San Diego,Calif)。将凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，并用1:2500抗-E7单克隆抗体(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif)探测，然后用1:5000辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG(Amersham PharmaciaBiotech,Little Chalfont,England)探测。将印迹用Amersham增强的化学发光检测试剂显影，并暴露于放射自显影胶片(Amersham)(图5A)。
Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi的构建(图6A)
Lm-PEST-E7与Lm-LLO-E7相同，但是它仅含有hly基因的启动子和PEST序列，具体而言，LLO的前50个氨基酸。为了构建Lm-PEST-E7，使用SOE(通过重叠延伸实现的基因剪接)PCR技术，让hly启动子和PEST区域与全长E7基因融合。从质粒pGG-55(其含有LLO的前441个氨基酸)扩增E7基因和hly-PEST基因片段，并通过常规PCR技术剪接到一起。为了建立最终的质粒pVS16.5，将hly-PEST-E7片段和prfA基因亚克隆进质粒pAM401(其包括用于体外选择的氯霉素抗性基因)中，并使用得到的质粒转化XFL-7。
Lm-ΔPEST-E7是与Lm-LLO-E7相同的重组李斯特菌菌株，但是它缺少PEST序列。基本上如针对Lm-PEST-E7所描述的那样进行制备，但是使用设计成从hly-E7融合基因除去含有PEST的区域(bp 333-387)的引物来构建游离型表达系统。Lm-E7epi是分泌不含PEST区域或LLO的E7的重组菌株。用于转化该菌株的质粒含有与E7基因融合的hly启动子和信号序列的基因片段。该构建体不同于原始的Lm-E7，该Lm-E7表达整合进染色体中的单个拷贝的E7基因。除了表达的E7抗原的形式以外，Lm-E7epi是与Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7和Lm-ΔPEST-E7完全同基因的。
结果
为了对比Lm-ActA-E7相对于Lm-LLO-E7诱导的抗肿瘤免疫，将2×105个TC-1肿瘤细胞皮下植入小鼠中，并让其生长至可触知的大小(大约5毫米[mm])。在第7和14天，用1LD50的Lm-ActA-E7(5×108个CFU)(十字叉)、Lm-LLO-E7(108个CFU)(正方形)或Lm-E7(106个CFU)(圆形)腹膜内免疫小鼠。到第26天，在Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7中的所有动物都没有肿瘤且保持如此，而所有未暴露的动物(三角形)和用Lm-E7免疫的动物生长出大肿瘤(图5B)。因而，使用ActA-E7融合体的接种造成肿瘤消退。
另外，针对它们引起表达E7的肿瘤的消退的能力，对比了Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi。40只C57BL/6小鼠的左胁腹上建立皮下TC-1肿瘤。在肿瘤已经达到4-5mm后，将小鼠分成5组，每组8只。每组用4种重组LM疫苗之一处理，1个组保持不处理。Lm-LLO-E7和Lm-PEST-E7分别在5/8和3/8的病例中诱导了建立的肿瘤的消退。在任何时间点在用Lm-PEST-E7或Lm-LLO-E7处理的小鼠的平均肿瘤大小之间没有统计差异。但是，表达不含PEST序列的E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi的疫苗在除了一只以外的所有小鼠中没有造成肿瘤消退(图6B，上方插图)。这代表2个实验，其中在用Lm-LLO-E7或Lm-PEST-E7处理的肿瘤与用Lm-E7epi或Lm-ΔPEST-E7处理的肿瘤之间，观察到在第28天时平均肿瘤大小的统计上显著的差异；P<0.001，学生t检验；图6B，下方插图)。另外，在经含有PEST的疫苗接种的小鼠的脾中，在3个实验中可再现地观察到四聚体阳性脾细胞的增加的百分比(图6C)。因而，使用PEST-E7融合体的接种造成肿瘤消退。
实例4：E7与LLO、ActA或PEST样序列的融合增强E7特异性免疫并产生浸润肿瘤的E7特异性CD8+细胞
材料和实验方法
在12只C57BL/6小鼠(n＝3)的左胁腹皮下植入500mcl(微升)其包含100微升的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2×105个TC-1肿瘤细胞和400微升的(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)。在第7、14和21天腹膜内免疫小鼠，并在第28天收获脾和肿瘤。将肿瘤MATRIGEL从小鼠取出，并在含有2毫升(ml)RP 10培养基的试管中在冰上4℃温育过夜。将肿瘤用镊子切碎，切成2mm块，并与3ml酶混合物(PBS中0.2mg/ml胶原酶P、1mg/ml DNAse-1)一起在37℃温育1小时。将组织悬液穿过尼龙网过滤，并用5％胎牛血清+0.05％的NaN3在PBS中的溶液洗涤，以用于四聚体和IFN-γ染色。
在存在布雷菲德菌素A的情况下以107个细胞/ml将脾细胞和肿瘤细胞与1微摩尔(mcm)E7肽一起温育5小时。将细胞洗涤两次，并在50微升的抗小鼠Fc受体上清液(2.4G2)中4℃温育1小时或过夜。针对表面分子CD8和CD62L将细胞染色，渗透化，使用渗透化试剂盒或(Pharmingen,SanDiego,Calif.)固定，并针对IFN-γ染色。使用双激光流式细胞计FACSCalibur获取500,000个事件，并使用Cellquest软件(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。计算活化的(CD62L低)CD8+ T细胞内的IFN-γ分泌细胞的百分比。
对于四聚体染色，让H-2Db四聚体负载藻红蛋白(PE)偶联的E7肽(RAHYNIVTF,SEQID NO:67)，在室温染色1小时，并用抗别藻蓝蛋白(APC)偶联的MEL-14(CD62L)和FITC偶联的CD8在4℃染色30min。通过对比脾中和肿瘤中的四聚体+CD8+ CD62L低细胞来分析细胞。
结果
为了分析Lm-ActA-E7增强抗原特异性免疫的能力，给小鼠植入TC-1肿瘤细胞，并用Lm-LLO-E7(1×107个CFU)、Lm-E7(1×106个CFU)或Lm-ActA-E7(2×108个CFU)免疫，或者不处理(未暴露的)。来自Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7组的小鼠肿瘤含有比在Lm-E7或未暴露的小鼠中更高百分比的分泌IFN-γ的CD8+细胞(图7A)和四聚体特异性CD8+细胞(图7B)。
在另一个实验中，给荷瘤小鼠施用Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7或Lm-E7epi，并测量肿瘤内的E7特异性淋巴细胞的水平。在第7和14天用0.1LD50的4种疫苗处理小鼠。在第21天收获肿瘤，并用针对CD62L、CD8的抗体和用E7/Db四聚体染色。在接种Lm-LLO-E7和Lm-PEST-E7的小鼠中观察到四聚体阳性的淋巴细胞在肿瘤内增加的百分比(图8A)。该结果在三个实验中是可再现的(图8B)。
因而，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7和Lm-PEST-E7各自有效地诱导浸润肿瘤的CD8+T细胞和肿瘤消退。
实例5：LLO和ActA融合体减小E6/E7转基因小鼠中的原部位(自发)肿瘤
为了确定Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7疫苗对E6/E7转基因小鼠中原部位肿瘤的影响，将6至8周大的小鼠用1×108Lm-LLO-E7或2.5×108Lm-ActA-E7每月一次进行免疫，持续8个月。在最后一次免疫后20天处死小鼠，摘取其甲状腺并称重。该实验重复两次(表1)。
表1.未接种疫苗和接种疫苗的转基因小鼠在8月龄时的甲状腺重量(mg)*。
*使用学生t检验进行的统计分析表明，经Lm-LLO-NP处理的小鼠与未处理的小鼠之间甲状腺重量的差异不显著，但经Lm-LLO-E7与Lm-ActA-E7处理的小鼠之间的差异非常显著(p<0.001)
两个实验的Lm-LLO-E7处理的小鼠与未经处理的小鼠之间以及Lm-LLO-ActA处理的小鼠与未经处理的小鼠之间的甲状腺重量差异显著(分别p<0.001和p<0.05)，而Lm-LLO-NP处理的小鼠(不相关抗原对照)与未经处理的小鼠之间的差异不显著(学生t检验)，显示Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7控制了自发肿瘤生长。因此，本发明的疫苗防止形成新的表达E7的肿瘤。
为了概述以上实例中的发现，LLO抗原和ActA抗原融合体(a)诱导包括肿瘤浸润性抗原特异性T细胞的肿瘤特异性免疫应答；并且对于正常尤其是侵袭性肿瘤能够诱导肿瘤消退和控制肿瘤生长；(b)克服对自身抗原的耐受性；以及(c)防止自发肿瘤生长。如用多种不同的抗原、PEST样序列和肿瘤类型成功实施所证明，这些发现可适用于大量抗原、PEST样序列和肿瘤类型。
实例6：LM-LLO-E7疫苗是安全的并改善宫颈癌患者的临床指标
材料和实验方法
入选标准.试验中的全部患者均诊断为“晚期、进展性或复发性宫颈癌”且入选时的评估指示全部分级为患有IVB疾病。全部患者均表现出对含有选自制念珠菌素、流行性腮腺炎、破伤风或结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)的3种记忆抗原的失能组(anergy panel)具有阳性免疫应答，未怀孕或HIV阳性，在4周内未服用试验药且未接受类固醇。
方案：以3周的间隔以250ml生理盐水中的30分钟静脉内(IV)输注形式向住院病人施用2次疫苗接种。5天后，患者接受单一疗程的IV氨苄西林且出院，额外口服10天氨苄西林。Karnofsky机能状况量表(Karnofsky performance index)为整体活力和生活质量(诸如食欲、完成每日任务的能力、平静睡眠等)的量度，其用于确定总体幸福感。另外，确定以下安全性和一般幸福感指标：碱性磷酸酶；直接胆红素和总胆红素；γ谷氨酰转肽酶(ggt)；胆固醇；心脏收缩、心脏舒张和心率；用于评估疾病进展的美国东部肿瘤协作组(ECOG)准则-Karnofsky类生活质量指标；血容比；血红蛋白；血小板水平；淋巴细胞水平；AST(天冬氨酸转氨酶)；ALT(丙氨酸转氨酶)；以及LDH(乳酸脱氢酶)。在第二次给药之后的3周和3个月对患者进行随访，此时确定患者的实体瘤治疗疗效评价标准(RECIST)评分，进行扫描以测定肿瘤大小，且收集血液样品用于在试验结束时进行免疫分析，其包括评价IFN-γ、IL-4、CD4+和CD8+细胞群。
李斯特菌菌株：LM-LLO-E7的产生在实例1中描述。
结果
在临床试验前，开展了临床前实验以确定LM-LLO-E7的静脉内(i.v.)对比i.p.施用的抗肿瘤功效。在皮下建立了含有1×104个TC-1细胞的肿瘤。在第7和14天，将小鼠用108LM-LLO-E7i.p.或LM-LLO-E7i.v.以108、107、106或105的剂量免疫。在第35天，接受108LM-LLO-E7(通过任一途径)或107LM-LLO-E7i.v.的8只小鼠中的5只，以及接受106LM-LLO-E7的8只小鼠中的4只被治愈。相比之下，i.p.施用的小于107或者在一些情况下甚至108LM-LLO-E7的剂量对于控制肿瘤生长无效。因此，LM-LLO-E7的i.v.施用比i.p.施用更有效。
临床试验
开展了I/II期临床试验以评估LM-LLO-E7疫苗在具有晚期、进展性或复发性宫颈癌的患者中的安全性和疗效。5名患者各自被分配到分别接受1×109或3.3×109个CFU的队列1-2。另外5名患者各自将被分配到分别接受1×1010或3.31×1010个CFU的队列3-4。
安全性数据
第一队列
第一队列中的全部患者在输注开始后1-2小时内均报导出现轻度至中度发热和发冷。一些患者表现出伴有恶心或不伴有恶心的呕吐。1个例外(下文描述)，单次剂量的非类固醇药剂(诸如扑热息痛)足以解决这些症状。观察到轻微、短暂的心血管作用，与发热相符且与发热同时。未报导其他不良作用。
在此宫颈癌的晚期，1年存活率通常为10-15％患者且尚无有效的肿瘤疗法。实际上，患者2为患有极具侵袭性疾病的年轻患者，其在完成试验之后不久去世。
在施用后第2天、第3天和第5天评估定量血液培养物。在此队列中的5名可评估患者中，4名在任何时间均表现出无血清李斯特菌，而1名在第2天具有极少量(35个cfu)的循环李斯特菌，在第3天或第5天具有不可检测的李斯特菌。
对初始疫苗接种起反应的患者5在施用之后48小时具有轻度发热，且用抗炎剂治疗。在1个情景中，发热升至中等严重程度(任何时间均不超过38.4℃)，此后向她给予一个疗程的氨苄西林，发热消退。在抗生素施用期间，她经历轻度风疹，在抗生素施用后结束。血液培养物全部无菌，心血管数据在针对其他患者观测到的范围内，且血清化学值正常，显示此患者不具有李斯特菌疾病。另外，失能组指示对1/3记忆抗原的稳健应答，指示存在功能性免疫(类似于其他患者)。患者5随后证明类似于全部其他患者在接受强化时的应答。
第二队列和总体安全性观测
在两个队列中，在输注后观察到肝功能测试中的轻微和短暂改变。这些改变由监控试验的主治医生确定为不具有临床意义，且预期存在从全身循环快速移除至肝脏和脾脏的短暂细菌感染。一般而言，上文的方法章节中所述的全部安全性指标几乎不或不显示出净变化，指示优异的安全特性。此队列中的副作用特性与初始队列中所见的几乎完全相同，且似乎为与细胞因子和类似因子的后果相关的一系列非剂量依赖性症状，其因引起医源性感染而产生。在任何时间均未观测到血清李斯特菌且任一队列中均未观测到剂量限制性毒性。
疗效-第一队列
在完成试验的第一队列的3名患者中观察到以下疗效指示：(图9)。
入选试验的患者1具有2个各为20mm的肿瘤，其在试验过程中缩小至18和14mm，指示疫苗的治疗功效。另外，入选试验的患者1的Karnofsky机能状况量表为70，其在给药后升至90。在安全性审查小组(Safety Review Panel)会议中，塞尔维亚贝尔格莱德肿瘤学和放射学研究所肿瘤科(Department of Oncology,Institute for Oncology and Radiology,Belgrade,Serbia)主任Radulovic向开展试验的单位的代表展示了结果：作为该单位的顾问工作的独立肿瘤学家MichaelKurman；艾莫利大学(Emory University)的理论妇科肿瘤学家Kevin Ault，其为Merck开展III期Gardasil试验且为Glaxo SmithKline开展Cervarix试验；以及TateThigpen，其为NCI妇科肿瘤学小组(Gynecologic OncologyGroup)创始人和密西西比大学(University of Mississippi)妇科肿瘤学教授。在Radulovic博士的观点中，患者1表现出来自用疫苗治疗的临床益处。
在去世之前，患者2表现出混合应答，肿瘤缩小1/2。
入选的患者3患有副肿瘤疾病(癌症附带现象，其中患者的整体虚弱状态具有继发于癌症的其他后遗症)，包括血小板数升至936×109/ml。在第一剂之后，该计数降至405×109/ml，大致为正常水平。
入选试验的患者4具有2个各为20mm的肿瘤，其在试验过程中缩小至18和14mm，指示疫苗的治疗功效。患者4在第一和第二剂之间表现出1.6Kg的体重增加和约10％的血红蛋白计数增加。
疗效-第二队列和一般观察
在最低剂量队列中，2名患者证实肿瘤缩小。此作用的时间与免疫应答中观察到的相符，因为其遵循免疫应答的时间顺序发展。第二队列中迄今为止评估肿瘤负荷的2名患者中的一名在疫苗接种后的时间点表现出显著的肿瘤负荷降低。在试验开始时，此患者具有13、13和14mm的3个肿瘤。2剂疫苗后，2个肿瘤缩小至9.4和12mm，且第三个不再可检测。
图13B中描绘了2个队列的肿瘤负荷。总体而言，即使在包括初免注射和单次强化的治疗方案中施用的相对低剂量的LM-LLO-E7也在6名已收集数据的患者中获得3个客观反应。
讨论
在此宫颈癌的晚期，1年存活率通常为10-15％患者且尚无有效的肿瘤疗法。没有治疗显示出能有效逆转IVB期宫颈癌。尽管治疗此阶段的宫颈癌有困难，但在2/6名患者中观察到抗肿瘤作用。另外，如上文所述，在完成试验的患者中观察到其他疗效指示。
因此，LM-LLO-E7在人类受试者中是安全的且即使在相对低的剂量下施用时也改善宫颈癌患者的临床指标。当增加强化接种的剂量和数量时；和/或当以较低的剂量或在输注后较晚的时间点施用抗生素时，可能观察到额外的阳性结果。临床前研究已显示单个数量级的剂量增加可引起反应率的显著改变(例如，从0％反应率变为50-100％完全缓解率。额外的强化剂量还极有可能进一步提高所得的免疫应答。此外，观察到的治疗性免疫应答的阳性作用可能随着额外时间的推移而继续，因为免疫系统继续攻击癌症。
实例7：构建减毒李斯特菌菌株-LmddΔactA并且将人klk3基因同框插入Lmdd和Lmdda菌株中的hly基因。
材料和方法
开发了分泌融合到tLLO的PSA的重组Lm(Lm-LLO-PSA)，该重组Lm引起与前列腺癌小鼠模型中的肿瘤消退相关的强效PSA特异性免疫应答，其中tLLO-PSA的表达源自基于pGG55的质粒(表2)，其赋予载体以抗生素抗性。我们最近开发出用于基于pADV142质粒的PSA疫苗的新菌株，其不具有抗生素抗性标记并且称为LmddA-142(表3)。此新菌株与Lm-LLO-PSA相比减毒10倍。另外，LmddA-142比Lm-LLO-PSA略微更具免疫原性并且显著更有效地消退PSA表达肿瘤。
表2.质粒和菌株
质粒pAdv142(6523bp)的序列如下：
(SEQ ID NO:68)。2008年2月20日在Genewiz实验室从大肠杆菌菌株对此质粒进行测序。
通过毒力因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lm dal dat(Lmdd)减毒。构建actA在Lmdaldat(Lmdd)背景下的框内缺失，以避免对下游基因的表达的任何极化效应。Lm daldatΔactA含有在N末端处的前19个氨基酸和C末端的28个氨基酸残基，缺失了ActA的591个氨基酸。
通过扩增对应于actA的上游(657bp-寡核苷酸的Adv 271/272)部分和下游(625bp-寡核苷酸的Adv273/274)部分的染色体区并且通过PCR接合而产生actA缺失突变体。用于此扩增的引物序列在表1中给出。actA的上游和下游DNA区在EcoRI/PstI限制位点克隆到pNEB193中并且来自此质粒，EcoRI/PstI进一步克隆到温敏质粒pKSV7中，从产生ΔactA/pKSV7(pAdv120)。
表1：用于扩增actA的上游和下游的DNA序列的引物序列
使用外部结合至actA缺失区的引物来验证从其染色体位置的基因缺失，所述引物在图10(A和B)中显示为引物3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc，SEQ ID NO:73)和引物4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO:74)。在分离自Lmdd和Lm-ddΔactA的染色体DNA上进行PCR分析。预期在Lmdd染色体DNA中用两组不同的引物对1/2和3/4扩增以后的DNA片段的大小为3.0Kb和3.4Kb。另一方面，对于LmddΔactA，使用引物对1/2和3/4的PCR的预期大小为1.2Kb和1.6Kb。因此，在图10(A和B)中的PCR分析证实actA的1.8kb区在LmddΔactA菌株中缺失。还对PCR产物进行了DNA测序，以证实含有actA的区在菌株Lm-ddΔactA中的缺失。
实例8：构建用于Lm载体的抗原递送的与抗生素无关的游离型表达系统。
用于Lm载体(pAdv142)的抗原递送的与抗生素无关的游离型表达系统为不含抗生素的质粒pTV3的下一代(Verch等人,Infect Immun,2004.72(11):6418-25，以引用方式并入本文中)。用于毒力基因转录激活因子的基因prfA从pTV3缺失，因为李斯特菌菌株Lmdd在染色体中含有prfA基因的拷贝。此外，NheI/PacI限制位点的p60-李斯特菌dal的盒置换为p60-枯草芽孢杆菌dal，从而产生质粒pAdv134(图11A)。李斯特菌和芽孢杆菌dal基因的相似性为～30％，从而实际上消除了质粒与Lmdd染色体中的dal基因的剩余片段之间重组的机会。质粒pAdv134含有抗原表达盒tLLO-E7。将LmddA菌株用pADV134质粒转化并且通过Western印迹确认来自所选克隆的LLO-E7蛋白的表达(图11B)。源自10403S野生型菌株的Lmdd系统缺乏抗生素抗性标记，但具有Lmdd链霉素抗性。
另外，将pAdv134用XhoI/XmaI限制以克隆人PSA klk3，从而产生质粒pAdv142。新质粒pAdv142(图11C，表2)含有在李斯特菌p60启动子控制下的芽孢杆菌dal(B-Dal)。穿梭质粒pAdv142在无外源性D-丙氨酸存在下补充大肠杆菌ala drx MB2159和单核细胞增多性李斯特菌菌株Lmdd的生长。质粒pAdv142中的抗原表达盒由hly启动子和LLO-PSA融合蛋白组成(图11C)。
质粒pAdv142转化至李斯特菌背景菌株LmddactA菌株，从而产生Lm-ddA-LLO-PSA。LLO-PSA融合蛋白经菌株Lm-ddA-LLO-PSA的表达和分泌通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来确认(图11D)。在两次体内传代后，菌株Lm-ddA-LLO-PSA稳定表达和分泌LLO-PSA融合蛋白。
实例9：菌株LmddA-LLO-PSA的体外和体内稳定性
通过在选择性压力存在或不存在下培养LmddA-LLO-PSA李斯特菌菌株八天来检验质粒的体外稳定性。菌株LmddA-LLO-PSA的选择性压力为D-丙氨酸。因此，菌株LmddA-LLO-PSA在脑-心输注(BHI)和BHI+100μg/ml D-丙氨酸中传代。在铺板于选择性(BHI)和非选择性(BHI+D-丙氨酸)培养基上之后测定每天的CFU。预期质粒损失将导致铺板于非选择性培养基(BHI+D-丙氨酸)上之后CFU较高。如图12A中所示，选择性和非选择性培养基中的CFU数量之间不存在差异。这表明当实验终止时，质粒pAdv142稳定至少50代。
通过在C57BL/6小鼠中静脉内注射5×107个CFU LmddA-LLO-PSA来测定质粒体内维持。在24小时和48小时从在PBS中均质化的脾脏分离有活力的细菌。在BHI板和BHI+100g/ml D-丙氨酸上测定各时间点的各样品的CFU。将脾细胞铺板于选择性和非选择性培养基之后，在24小时后回收集落。由于此菌株高度减毒，因此在24小时内体内清除细菌负荷。选择性和非选择性板上未检测到显著CFU差异，指示重组质粒在所有分离的细菌中稳定存在(图12B)。
实例10：菌株LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的体内传代、毒力和清除率
LmddA-142为分泌游离型表达的tLLO-PSA融合蛋白的重组李斯特菌菌株。为了测定安全剂量，将小鼠用多种剂量的LmddA-LLO-PSA免疫并且测定毒性效应。LmddA-LLO-PSA引起最小毒性效应(数据未示出)。结果表明小鼠良好耐受108个CFU LmddA-LLO-PSA剂量。毒力研究指示菌株LmddA-LLO-PSA高度减毒。
测定在C57BL/6小鼠中腹膜内施用安全剂量108个CFU后LmddA-LLO-PSA的体内清除率。第2天后，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的肝脏和脾脏中不存在可检测的集落。因为此菌株高度减毒，所以其在48小时时完全体内清除(图13A)。
为了确定LmddA-LLO-PSA的减毒是否会减弱菌株LmddA-LLO-PSA感染巨噬细胞和胞内生长的能力，进行了感染测定。将诸如J774A.1的小鼠巨噬细胞样细胞系用李斯特菌构建体体外感染并且对胞内生长进行定量。阳性对照菌株野生型李斯特菌菌株10403S胞内生长，并且prfA突变体阴性对照XFL7不能逃离吞噬溶菌体并且因此不会在J774细胞中生长。LmddA-LLO-PSA的胞质内生长比10403S缓慢，因为此菌株失去从细胞扩散至细胞的能力(图13B)。结果指示LmddA-LLO-PSA有能力感染巨噬细胞和胞质内生长。
实例11：菌株-LmddA-LLO-PSA在C57BL/6小鼠中的免疫原性
使用PSA四聚物染色测定C57BL/6小鼠中由构建体LmddA-LLO-PSA引起的PSA特异性免疫应答。小鼠以一周间隔用LmddA-LLO-PSA免疫两次并且在强化后第6天将脾细胞针对PSA四聚物染色。用PSA特异性四聚物对脾细胞的染色显示LmddA-LLO-PSA引起23％的PSA四聚物+CD8+CD62L低细胞(图14A)。使用胞内细胞因子染色检验PSA特异性T细胞在用PSA肽刺激5小时后分泌IFN-γ的功能性能力。LmddA-LLO-PSA组相较于未暴露的小鼠，用PSA肽刺激的CD8+CD62L低IFN-γ分泌细胞的百分比提高200倍(图14B)，指示LmddA-LLO-PSA极具免疫原性并且在脾脏中针对PSA引起高水平的功能活性PSA CD8+ T细胞应答。
为了测定用LmddA-LLO-PSA免疫小鼠后针对PSA产生的细胞毒性T细胞的功能性活性，我们在体外测定中测试了PSA特异性CTL对用H-2Db肽脉冲处理的细胞EL4细胞进行裂解的能力。使用基于FACS的卡斯蛋白酶测定(图14C)和铕释放(图14D)来测量细胞裂解。用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞含有对呈现PSA肽作为靶抗原的细胞具有高细胞溶解活性的CTL。
进行Elispot来测定效应T细胞在用抗原刺激24小时后分泌IFN-γ的能力。使用ELISpot，观察到来自用特异性肽刺激的LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞中的IFN-γ斑点数相较于未暴露的小鼠的脾细胞提高20倍(图14E)。
实例12：用LmddA-142菌株免疫诱导表达PSA的肿瘤的消退和PSA特异性CTL对肿瘤的浸润。
使用工程化以表达PSA的前列腺腺癌细胞系测定构建体LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的治疗功效(Tramp-C1-PSA(TPSA)；Shahabi等人，2008年)。将小鼠皮下植入2×106个TPSA细胞。当肿瘤在肿瘤接种后第6天达到4-6mm可触大小时，小鼠以一周间隔用108个CFU LmddA-142、107个CFU Lm-LLO-PSA(阳性对照)免疫三次或不做处理。未暴露的小鼠逐渐产生肿瘤(图15A)。用LmddA-142免疫的小鼠直至第35天全部无肿瘤并且8只小鼠中有3只逐渐产生肿瘤，其相较于未暴露的小鼠以慢得多的速率生长(图15B)。在第70天，八只小鼠中有五只仍无肿瘤。正如预期，Lm-LLO-PSA接种的小鼠的肿瘤比未暴露的对照小并且肿瘤产生比对照中缓慢(图15C)。因此，构建体LmddA-LLO-PSA可消退TPSA细胞系建立的60％肿瘤并且减缓其他小鼠中的肿瘤生长。仍无肿瘤的治愈小鼠在第68天用TPSA肿瘤再挑战。
用LmddA-142免疫小鼠可控制7天建立的Tramp-C1肿瘤的生长和诱导其消退，相较于未暴露的组中的无结果(图15A)，所述肿瘤经工程化以在超过60％的实验动物中表达PSA(图15B)。使用高度减毒载体(LmddA)和质粒pADV142来构建LmddA-142(表2)。
另外，研究了LmddA-LLO-PSA构建体产生的PSA特异性CD8淋巴细胞浸润肿瘤的能力。将肿瘤和基质胶的混合物皮下植入小鼠，随后以七天间隔用未暴露的或对照(Lm-LLO-E7)李斯特菌或用LmddA-LLO-PSA免疫两次。在第21天切除肿瘤并且分析肿瘤中浸润的CD8+CD62L低PSA四聚物+和CD4+ CD25+FoxP3+调节性T细胞群体。
观察到极低数量的CD8+CD62L低PSA四聚物+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)对未暴露的和Lm-LLO-E7对照免疫小鼠中存在的PSA具有特异性。然而，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠中PSA特异性CD8+CD62L低PSA四聚物+TIL百分比增加10-30倍(图7A)。有趣的是，脾脏中的CD8+CD62L低PSA四聚物+细胞群体比肿瘤中少7.5倍(图16A)。
另外，测定未处理的小鼠和李斯特菌免疫小鼠的肿瘤中CD4+/CD25+/Foxp3+ T调节细胞(Treg)的存在。有趣的是，用李斯特菌免疫导致肿瘤而非脾脏中的CD4+CD25+ FoxP3+T-reg数量显著降低(图16B)。然而，构建体LmddA-LLO-PSA对降低肿瘤中的CD4+ CD25+FoxP3+ T-reg的频率的影响比未暴露的和Lm-LLO-E7免疫组强(图16B)。
因此，LmddA-142疫苗可诱导能够浸润肿瘤部位的PSA特异性CD8+ T细胞(图16A)。有趣的是，用LmddA-142免疫与肿瘤中的调节性T细胞数量减少有关(图16B)，从而可能形成对高效抗肿瘤CTL活性更有利的环境。
实例13：尽管PSA融合，但Lmdd-143和LmddA-143分泌功能性LLO。
Lmdd-143和LmddA-143含有全长人klk3基因，其编码PSA蛋白，该蛋白经同源重组下游插入并且与染色体中的hly基因同框。这些构建体使用pKSV7质粒(Smith和Biochimie.1992；74(7-8)第705-711页)通过同源重组制备，所述质粒为温敏复制子，携带hly-klk3-mpl重组盒。因为第二重组事件之后切除质粒，所以失去用于整合选择的抗生素抗性标记。此外，actA基因在LmddA-143菌株中缺失(图17A)。通过两个构建体中的PCR(图17B)和测序(数据未示出)来验证klk3与hly向染色体中的同框插入。
这些染色体构建体的一个重要方面为LLO-PSA的产生将不会完全消除LLO功能，李斯特菌从单核细胞增多性李斯特菌产生的吞噬体、胞质溶胶侵袭和高效免疫性逃离需要所述LLO功能。对来自Lmdd-143和LmddA-143培养上清液的分泌的蛋白质的Western印迹分析揭示出，对应于LLO-PSA融合蛋白的～81kDa条带和～60kDa条带(其为LLO的预期大小)(图18A)，指示LLO从LLO-PSA融合物裂解或仍作为单个蛋白质由单核细胞增多性李斯特菌产生，而与染色体中的融合基因无关。Lmdd-143和LmddA-143分泌的LLO相较于野生型单核细胞增多性李斯特菌10403S保留50％的溶血活性(图18B)。与这些结果一致，Lmdd-143和LmddA-143能够在巨噬细胞样J774细胞系中胞内复制(图18C)。
实例14：Lmdd-143和LmddA-143均引起针对PSA抗原的细胞介导的免疫应答。
在显示Lmdd-143和LmddA-143能够分泌融合到LLO的PSA之后，研究了这些菌株是否可在体内引起PSA特异性免疫应答的问题。C57Bl/6小鼠不做处理或用Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142免疫两次。通过用PSA65-74肽刺激脾细胞和针对IFN-γ进行胞内染色来测量PSA特异性CD8+ T细胞应答。如图19中示出，染色体和基于质粒的载体诱导的免疫应答类似。
材料与方法(实例15-19)
MDSC和Treg功能
取决于肿瘤模型，将肿瘤植入小鼠的胁腹或生理学部位。7天后，向小鼠接种疫苗，接种首日取决于使用的肿瘤模型。然后在给予疫苗后一周，向小鼠施用强化疫苗。
然后在强化后1周处死小鼠，并收获肿瘤和脾，或者在侵袭性肿瘤型的情况下，在强化后3-4天收获肿瘤和脾。在收获肿瘤之前五天，给非荷瘤小鼠接种疫苗，以用于应答T细胞。采用标准方法学制备脾细胞。
简而言之，制备肿瘤和脾的单细胞悬液。手工地破碎脾，并裂解红血细胞。切碎肿瘤，并与胶原酶/DNA酶一起温育。备选地，将GENTLEMACSTM解离器与肿瘤解离药剂盒一起使用。
采用Miltenyi药剂盒和柱或autoMACs分离器，从肿瘤和脾纯化MDSC或Treg。然后对细胞计数。
制备单细胞悬液，并裂解红血细胞。然后以CFSE标记应答T细胞。
以1×105个T细胞/孔的密度，将应答T细胞(来自所有分裂周期阶段)与MDSC或Treg以2:1比率一起铺板在96孔板中。然后用适当的肽(PSA或CA9)刺激应答T细胞，或者用PMA/离子霉素非特异性地刺激。将细胞在5％CO2下在37℃在暗处温育2天。两天后，将细胞染色进行FACS，并在FACS机器上分析。
T细胞应答的分析
对于通过ELISA进行的细胞因子分析，收获脾细胞，并在有培养基、SEA或conA(作为阳性对照)存在下，以150万个细胞/孔铺板在48孔平板中。温育72小时后，收获上清液，通过ELISA(BD)分析细胞因子水平。对于抗原特异性IFN-γELISpot，收获脾细胞，并在有培养基、特定CTL肽、不相关肽、特定辅助肽或conA(作为阳性对照)存在下，以30万和15万个细胞/孔铺板在IFN-γELISpot平板中。温育20小时后，进行ELISpots(BD)，并通过Immunospot分析仪(C.T.L.)对斑点计数。将每一百万个脾细胞的斑点数绘图。
使用Coulter Counter,Z1对脾细胞计数。使用标准的基于IFN-γ的ELISPOT测定，确定在以gag-CTL、gag-辅助、培养基、不相关抗原和con A(阳性对照)再刺激以后，产生IFN-γ的CD8+T细胞的频率。
简而言之，以5mg/ml使用mAb R40-A2和以最佳稀释度使用多克隆兔抗IFN-γ(由University of Pennsylvania,Philadelphia,PA的Phillip Scott博士友情提供)检测IFN-γ。通过与使用鼠rI++FN-γ(Life Technologies,Gaithersburg,MD)绘制的标准曲线进行对比，计算IFN-γ的水平。使用过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG Ab(IFN-γ)让平板显影。然后在405nm处读取平板。测定法的检测下限为30pg/ml。
实例15：在李斯特菌疫苗处理以后的抑制性细胞功能
在第0天，将肿瘤植入小鼠中。在第7天，给小鼠接种Lmdda-E7或LmddA-PSA。在第14天，收获肿瘤，并测量接种组和未暴露的组的浸润性MDSC和Treg的数目和百分比。据发现，在李斯特菌处理过的小鼠的肿瘤中MDSC和Treg的百分比以及MDSC的绝对数目的减小，而在脾或引流淋巴结(TLDN)中没有观察到该效应(图20)。
将从上述实验中的荷瘤小鼠提取的分离的脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)合并，并针对CD3和CD8染色，以阐明Lm-LLO-E7、Lm–LLO–PSA和Lm-LLO-CA9、Lm-LLO-Her2免疫对MDSC和Treg(脾和肿瘤的MDSC和Treg)在肿瘤中的存在的影响(图21-23)。每个列代表处于特定细胞分裂阶段的T细胞群体的百分比，并且在特定处理组(未暴露的、肽CA9或PSA处理、无MDSC/Treg和无MDSC+PMA/离子霉素)下分成小组(图21-23)。
针对存在的Treg和MDSC的百分比，分析来自荷瘤小鼠的血液。在Lm接种后，在小鼠血液中存在MDSC和Treg二者的下降。
实例16：在李斯特菌疫苗接种后，来自TPSA23肿瘤而不是脾的MDSC具有更低的抑制性。
用非特异性地激活的未暴露的鼠细胞和特异性地激活的细胞(PSA、CA9、PMA/离子霉素)，使用分离自TPSA23肿瘤的单核细胞和粒细胞MDSC，进行抑制测定。结果证实：与来自未暴露的小鼠的肿瘤的MDSC相比，分离自Lm接种组的肿瘤的MDSC具有减小的抑制激活的T细胞分裂的能力。(参见图21&23中的Lm-LLO-PSA和Lm-LLO处理组，在图中右侧的插图代表来自左侧插图的合并的细胞分裂数据)。另外，来自未处理小鼠(其中不存在MDSC，并且其中细胞未被刺激/激活)的T应答细胞保持处于它们的亲代(休眠)状态(图21&23)，而观察到用PMA或离子霉素刺激的T细胞发生复制(图21&23)。另外，据观察，Gr+Ly6G+和GrdimLy6G-MDSC在李斯特菌疫苗处理后抑制性较低。这适用于它们降低的抑制激活的PSA特异性T细胞和非特异性(PMA/离子霉素刺激的)T细胞分裂的能力。
此外，采用分离自TPSA23肿瘤的MDSC以及非特异性地激活的未暴露的鼠细胞进行的抑制测定证实：与来自未暴露的小鼠的肿瘤的MDSC相比，分离自Lm接种组的肿瘤的MDSC具有减小的抑制激活的T细胞分裂的能力
(图21&23)。
另外，当使用脾MDSC时，没有观察到上文刚刚关于图21和27讨论的观察结果。在后者中，来自未暴露的组、李斯特菌处理组(PSA、CA9)和PMA/离子霉素刺激组(阳性对照)的脾细胞/T细胞都表现出相同的复制水平(图22&24)。因此，这些结果表明：李斯特菌介导的对肿瘤中抑制性细胞的抑制以抗原特异性和非特异性方式起作用，而李斯特菌对脾粒细胞MDSC没有影响，因为它们仅以抗原特异性方式产生抑制。
实例17：肿瘤调节性T细胞的减少的抑制
使用在李斯特菌处理后分离自TPSA23肿瘤的Treg，进行抑制测定。据观察，在李斯特菌处理后，来自肿瘤的Treg的抑制能力下降(图25),但是，发现脾Treg仍然是抑制性的(图26)。
作为对照，使用常规CD4+T细胞替代MDSC或Treg，并发现对细胞分裂没有影响(图27)。
实例18：在李斯特菌接种后，来自4T1肿瘤而不是脾的MDSC和TREG具有较低的抑制性。
如上所述的，采用4T1肿瘤进行了相同实验，并且得到了相同的观察结果，即，在李斯特菌接种后MDSC具有较低的抑制性(图28&30)，李斯特菌对脾单核MDSC没有特异性作用(图29&31)，在李斯特菌疫苗接种后来自4T1肿瘤的Treg的抑制能力下降(图32)，以及李斯特菌对脾Treg的抑制能力没有影响(图33)。
最后，据观察，李斯特菌对脾Treg的抑制能力没有影响。
实例19：粒细胞和单核MDSC的抑制能力的变化是由于tLLO的过表达
LLO质粒显示出与含有TAA或不相关抗原的李斯特菌疫苗类似的结果(图34)。这意味着，粒细胞MDSC的抑制能力的变化是由于tLLO的过表达，且独立于伴侣融合抗原。单独的空质粒构建体也会导致MDSC的抑制能力的变化，尽管不是与在质粒上含有截短LLO的任意疫苗刚好相同的水平。3个独立实验的平均值表明：空质粒和其他含有tLLO(含有和不含肿瘤抗原)的质粒之间的抑制差异是显著的。不论是使用抗原特异性还是非特异性刺激的应答T细胞，MDSC抑制能力的下降是相同的。
类似于粒细胞MDSC，3个独立实验的平均值表明：当与其他疫苗构建体相比，在用Lm空质粒接种以后，从肿瘤纯化的单核MDSC观察到的抑制能力的差异是显著的(图35)。
类似于以上观察结果，在Lm接种以后，从脾纯化的粒细胞MDSC保留了它们抑制抗原特异性应答T细胞分裂的能力(图36)。但是，在非特异性刺激以后，(以PMA/离子霉素)激活的T细胞仍然能够分裂。这些结果都没有随单独LLO或空质粒疫苗的使用而改变，表明基于Lm的疫苗不会影响脾粒细胞MDSC(图35)。
类似地，在Lm接种以后，从脾纯化的单核MDSC保留它们的抑制抗原特异性应答T细胞分裂的能力。但是，在非特异性激活(以PMA/离子霉素刺激)以后，T细胞仍然能够分裂。这些结果都没有随单独LLO或空质粒疫苗的使用而改变，表明Lm疫苗不会影响脾单核MDSC(图37)。
不论应答细胞是抗原特异性还是非特异性激活的，从任意Lm处理组的肿瘤纯化的Treg都具有略微降低的抑制应答T细胞分裂的能力。特别是对于非特异性激活的应答T细胞而言，看起来好像含有空质粒的疫苗显示出与在质粒上含有LLO的所有疫苗相同的结果。该实验与其他实验的平均值表明，该差异不是显著的(图38)。
从脾纯化的Treg仍然能够抑制抗原特异性和非特异性激活的应答T细胞的分裂。Lm处理对脾Treg的抑制能力没有影响(图39)。
不论应答细胞是抗原特异性还是非特异性激活的，Tcon细胞都不能抑制T细胞的分裂，这与这些细胞不具有抑制性的事实一致。Lm对这些细胞没有影响，如果从小鼠的肿瘤或脾纯化这些细胞，则不存在差异(图40-41)。
实例20：施用具有抗OX40或抗GITR抗体的基于李斯特菌的组合疫苗增加小鼠存活
材料和方法
动物、细胞系、疫苗和其他试剂
六至八周龄雌性C57BL6小鼠购自Jackson Laboratories并保持在无病原体的条件下。小鼠根据GRUAnimal Care and Use Committee批准的方案按照NIH指导原则管理。通过将人乳头瘤病毒株16(HPV16)早期蛋白6和7(E6和E7)以及活化的ras癌基因共转染到原代C57BL/6小鼠肺上皮细胞而得到的TC-1细胞得自ATCC(Manassas,VA)，并使细胞在补充了10％FBS、青霉素和链霉素(各100U/ml)以及L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640中在37℃和具有5％CO2的条件下生长。如上文实例1中所述并如上文具体实施方式中所公开生成具有或不具有由Advaxis Inc.提供的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E7的李斯特菌疫苗载体(Lm-LLO-E7、LmddA-LLO和XFL7)。
将Lm-LLO-E7、LmddA-LLO和XFL7以1×108个CFU/小鼠的剂量经腹膜内(i.p.)注射。GITR和OX40抗体得自Astra Zeneca/Medimmune并以50μg/小鼠(对于抗OX40Ab)和250μg/小鼠(对于抗GITR Ab)的剂量静脉内注射，如图42A和图42B中所示。
肿瘤植入和处理
如下开展了目的在于分析肿瘤生长和存活的治疗性实验。简而言之，第0天在小鼠的右胁腹皮下(s.c.)每只小鼠植入70,000个TC-1肿瘤细胞。在第10天(肿瘤大小为直径约4-5mm)，将来自适当组(每组10只小鼠)的动物用具有或不具有抗GITR Ab或抗OX40Ab的Lm-LLO-E7、LmddA-LLO和XFL7腹膜内注射，或不接受处理(NT)。(图42C)在整个实验过程中，接受抗OX40Ab的小鼠一周两次用疫苗和抗OX40Ab处理(图42，第10天、第13天、第17天、第20天等)。接受抗GITR Ab的小鼠一周两次用总共3剂处理(图42B，第10天、第13天和第17天)。另一组小鼠保持不处理。
结果
图43A-B显示当施用单独的基于李斯特菌的疫苗ADXS11-001时，经处理的小鼠的存活时间是未经处理或对照处理小鼠的至少两倍，用ADXS11-001处理和施用抗GITR Ab的组合不仅延长该群体的存活时间还提高存活百分比。增加百分比为约40％。ADXS11-001与抗GITR Ab的组合导致在60％的经处理的小鼠中现有肿瘤完全消退(图43A)。有趣的是，抗GITR抗体还显示用Lm ddA-LLO/抗GITR处理的小鼠相较于仅接受LmddA-LLO的小鼠而言存活时间增加(图43B)。
图44A-B显示当施用单独的基于李斯特菌的疫苗ADXS11-001时，经处理的小鼠的存活时间是未经处理或对照处理小鼠的至少两倍，用ADXS11-001处理和施用抗OX40Ab的组合不仅延长该群体的存活时间还提高存活百分比(图44B)。增加百分比为约20％。因此，ADXS11-001与抗OX40Ab的组合导致在40％的经处理的小鼠中现有肿瘤完全消退(图44A)。
这些结果显示使用抗OX40和抗GITR抗体提高了基于李斯特菌的疫苗的治疗潜能。
实例21：使用针对共刺激分子GITR和OX40的激动剂抗体显著增强基于李斯特菌的免疫疗法的抗肿瘤功效
在实例20中提出的结果显示激动剂抗体抗OX40和抗GITR增强基于李斯特菌的疫苗的治疗潜能之后，分析了针对此提高的存活率的免疫应答。
材料和方法
动物、细胞系、疫苗和其他试剂六至八周龄雌性C57BL6小鼠购自JacksonLaboratories并保持在无病原体的条件下。小鼠根据GRUAnimal Care and Use Committee批准的方案按照NIH指导原则管理。通过将人乳头瘤病毒株16(HPV16)早期蛋白6和7(E6和E7)以及活化的ras癌基因共转染到原代C57BL/6小鼠肺上皮细胞而得到的TC-1细胞得自ATCC(Manassas,VA)，并使细胞在补充了10％FBS、青霉素和链霉素(各100U/ml)以及L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640中在37℃和具有5％CO2的条件下生长。如上文实例1中所述并如上文具体实施方式中所公开生成具有或不具有由Advaxis Inc.提供的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E7的李斯特菌疫苗载体(Lm[XFL7]、Lm-LLO[LmddA-LLO]、Lm-LLO-E7[ADXS11-001])。基于李斯特菌的疗法与对照一起显示在表3中。
表3
命名 李斯特菌菌株描述
LM XFL7
Lm-LLO LmddA-LLO
Lm-LLO-E7 ADXS11-001
从第13天开始每7天以1×108个CFU/小鼠的剂量经腹膜内(i.p.)注射Lm、LM-LLO和Lm-LLO-E7(图45和图51A)。GITR和OX40抗体得自Astra Zeneca/Medimmune并静脉内(i.v.)注射,如图45、图51中所示。
肿瘤植入和处理
治疗性实验分析肿瘤生长和免疫应答，并如下进行。简而言之，第0天在小鼠的右胁腹皮下(s.c.)每只小鼠植入70,000个TC-1肿瘤细胞。在第13天(肿瘤大小为直径约4-5mm)，将来自适当组(每组5只小鼠)的动物腹膜内注射具有或不具有抗GITR Ab(图45，表4)或抗OX40Ab(图51，表5)的LM、LM-LLO或Lm-LLO-E7，或不接受处理(NT)。第13天(D13)开始，接受抗OX40Ab的小鼠以3-4天的间隔用疫苗和抗OX40Ab处理，总共四次1mg/kg小鼠体重(mpk)剂量(图51)。第13天(D13)开始，接受抗GITR Ab的小鼠以3-4天的间隔用疫苗和抗GITR Ab处理，总共四次5mg/kg小鼠体重(mpk)剂量(图45)。另一组小鼠保持不用激动剂抗体处理(PBS列，如图42C中所述)。
在小鼠亚组中，每3-4天使用数显卡尺测量肿瘤，并将使用公式V＝(W2×L)/2计算肿瘤体积，其中V是体积，L是长度(较长的直径)，且W是宽度(较短的直径)。在这些实验中，当小鼠濒死、肿瘤溃烂或肿瘤体积达到1.5cm3时，将小鼠处死。
一个存在8个实验组。在第26天(D26)，处死全部动物，采集脾脏和肿瘤且筛选浸润性总CD4、Treg(CD4+FoxP3+)、非Treg(CD4+FOXP3-)、CD8+、CD8+E7+、髓源性抑制细胞(MDSC)、CD8+/Treg、CD8+E7+/Treg、CD8+/MDSC、CD8+E7+/MDSC。
分析外周和肿瘤中的抗原特异性细胞免疫应答(ASIR)、Treg、MDSC。
将ELISPOT用于检测在得自经处理的小鼠和对照小鼠的E7再刺激(10μg/ml)脾细胞培养物中的IFNγ生成，如制造商(BD Biosciences,San Jose,CA)所建议的那样。CTL免疫斑点分析仪(Cellular Technology Ltd.,Shaker Heights,OH)将用于分析斑点。得自不相关肽(hgp 10025–33-KVPRNQDWL-Celtek Bioscience,Nashville,TN)再刺激的脾细胞的斑点数将从E7再刺激的培养物中减去。此外，瘤内ASIR在图48B和54B中示为抗原特异性肿瘤浸润CD8+T细胞(CD8+E7+细胞)的数量。
使用GentleMACS分离器和实体瘤匀化方案处理肿瘤样品，如制造商(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)所建议的那样。使用流式细胞术分析法分析CD45+造血细胞群中肿瘤浸润性CD8+、CD4+Foxp3+(Treg)和CD11b+Gr-1+(MDSC)细胞的数量。使用相同的流式细胞术分析法在荷瘤的经处理小鼠和对照小鼠的脾脏中评价了Treg细胞和MDSC的水平。
统计学分析
所有统计参数均使用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)计算。组之间的统计显著性通过Tukey多重比较事后检验的单因素ANOVA确定(P<0.05被视为统计显著性)。
结果
与GITR激动剂抗体的组合
在组合疗法后，浸润性CD4+T细胞的总数增多。图46A显示施用Lm-LLO-E7与GITR激动剂抗体的组合甚至相较于单独的单一疗法显著增加肿瘤浸润性总CD4+T细胞。重要的是，施用LM-LLO-E7与GITR激动剂抗体的组合对Treg细胞(CD4+Foxp3+)总数不具有显著作用(图46B)。
组合疗法后，非Treg CD4+T细胞的总数增加。图47A显示施用Lm-LLO-E7与GITR激动剂抗体的组合显著增加非Treg(CD4+Foxp3-)CD4+T细胞的总数。有趣的是，施用基于李斯特菌的疫苗本身显著降低了总CD4中的Foxp3细胞的整体百分比，并且在与FITR激动剂抗体的组合中，该降低甚至显著高于单独的PBS或激动剂组(图47B)
组合疗法还导致总CD8+T细胞的增强的肿瘤浸润。观测到施用LM-LLO和LM-LLO-E7与抗GITR激动剂抗体(Ab)的组合显著增加肿瘤浸润性CD8+T细胞。(图48A)有趣的是，观测到LM-LLO-E7与抗GITR Ab一起显著增加肿瘤浸润性抗原特异性CD8+E7+T细胞。(图48B)
组合疗法提高肿瘤中的CD8/Treg比率。据发现，组合GITR Ab组中的瘤内CD8/Treg比率相较于单独的PBS或抗体组显著提高。(图49A)观测到LM-LLO-E7和抗GITR组合组中的E7-CD8/Treg比率未显著提高。(图49B)
通过激动剂GITR抗体诱导MDSC。观察到针对GITR的激动剂Ab相较于PBS组显著诱导MDSC。(图50A)此外，使用抗GITR Ab与LM-LLO-E7的组合显著提高了CD8/MDSC比率。(图50B)有趣的是，抗GITR Ab与LM-LLO-E7的组合显著提高了E7+CD8+/MDSC比率。(图50C)
与OX40激动剂抗体的组合
有趣的是，OX40激动剂Ab本身相较于PBS组显著增加了总CD4+T细胞。基于李斯特菌的LM-LLO-E7与OX40激动剂Ab的组合仅比PBS组但不比单独的单一疗法显著增加肿瘤浸润性总CD4+T细胞。(图52A)与基于李斯特菌的LM-LLO和LM-LLO-E7的组合显著减少OX40Ab诱导的Treg细胞(CD4+Foxp3+)。(图52B)
分析了肿瘤浸润性总非Treg(CD4+FoxP3-)数量和总CD4+T细胞的Treg百分比。基于李斯特菌的E7疫苗与OX40激动剂Ab的组合显著增加了非Treg(CD4+Foxp3-)T细胞的总数。(图53A)基于李斯特菌的疫苗本身显著降低总CD4中Foxp3细胞的整体百分比，并且在与OX40激动剂Ab的组合中，该降低比所有组甚至明显更高。(图53B)
组合疗法后，总CD8+T细胞以及抗原特异性CD8+E7+细胞的数量增加。LM-LLO-E7与抗OX40Ab的组合导致CD8+T细胞总数相较于PBS组显著提高。(图54A)另外，当与抗OX40激动剂Ab的施用组合时，观察到LM-LLO-E7显著增加肿瘤浸润性抗原特异性CD8+E7+ T细胞。(图54B)
组合疗法后，CD8/Treg和E7CD8/Treg的比率提高。据发现，抗OX40激动剂Ab和LM-LLO-E7组合组中相较于所有组，肿瘤中的CD8/Treg比率显著提高。(图55A)据发现，抗OX40激动剂Ab和LM-LLO-E7组合组中相较于所有组，肿瘤中的E7CD8/Treg比率提高。(图55B)
组合疗法后诱导MDSC。观察到激动剂OX40Ab未显著提高MDSC，而与LM-LLO-E7的组合显著降低此免疫抑制性MDSC。(图56A)抗OX40Ab与LM-LLO-E7的组合显著提高了CD8/MDSC比率。(图56B)并且，抗OX40Ab与LM-LLO-E7的组合显著提高了E7+CD8+/MDSC比率。(图56C)
结论：
本文中呈现的结果显示，与基于李斯特菌的E7疫苗组合时，存在抑制共刺激GITR和OX40通路的抗肿瘤和免疫应答。在LM-LLO-E7肿瘤疫苗存在下共刺激GITR或OX40通路表现出提高的抗肿瘤活性和提高的存活率(实例20)。尽管抗GITR或抗OX40与基于肽的E7疫苗的组合显著增加了总CD8以及抗原特异性CD8，但其对Treg或MDSC群无作用。相反发现使用这些激动剂抗体的疗法本身或与基于肽的E7疫苗的组合在TC1肿瘤模型中增加了肿瘤中的免疫抑制细胞。
已知基于李斯特菌的疫苗减少免疫抑制细胞，包括Treg和MDSC。这里观察到在基于李斯特菌的疫苗存在下共刺激GITR或OX40通路提高了CD8T细胞与MDSC群的比率且增加CD8和抗原特异性CD8，从而整体提高与改善的抗肿瘤活性和存活率相关的效应细胞/免疫抑制细胞比率。
材料与方法(实例22-27)
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，DNA测序由Genewiz Inc,SouthPlainfield,NJ进行。流式细胞术试剂购自Becton Dickinson Biosciences(BD,SanDiego,CA)。除非另外指明，否则细胞培养基、补充剂和所有其他试剂均购自Sigma(St.Louise,MO)。由EZbiolabs(Westfield,IN)合成Her2/neu HLA-A2肽。完全RPMI 1640(C-RPMI)培养基包含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素/链霉素、Hepes(25mM)。之前描述了多克隆抗LLO抗体，抗Her2/neu抗体购自Sigma。
小鼠和细胞系
所有动物实验均根据University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批准的方案进行。FVB/N小鼠购自Jackson laboratories(Bar Harbor,ME)。在University of Pennsylvania的动物中心机构安置和饲养FVB/N Her2/neu转基因小鼠，其过表达大鼠Her2/neu肿瘤蛋白。NT-2肿瘤细胞系表达高水平的大鼠Her2/neu蛋白，源自这些小鼠中的自发性乳腺肿瘤，并按之前的描述生长。DHFR-G8(3T3/neu)细胞得自ATCC并且根据ATCC推荐方案生长。EMT6-Luc细胞系由John Ohlfest博士(University ofMinnesota,MN)慷慨赠送，并在完全C-RPMI培养基中生长。生物荧光工作在University ofPennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)的指导下进行。
李斯特菌构建体和抗原表达
Her2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友好提供，并含有克隆进pGEM7Z质粒(Promega,Madison WI)中的全长人Her2/neu(hHer2)基因。将该质粒用作模板，以使用表6所示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和寡聚物，通过PCR扩增hHer-2/neu的三个区段，即EC1、EC2和IC1。
表6：用于克隆人her-2嵌合体的引物
通过SOEing PCR方法，并将每个单独的hHer-2/neu区段作为模板，通过直接融合产生Her-2/neu嵌合构建体。引物显示在表7中。
表7
用于扩增不同片段人Her2区域的引物序列
使用XhoI和SpeI限制性酶从pAdv138切下ChHer2基因，并与Lmdd穿梭载体pAdv134中截短的LLO非溶血片段在同一阅读框内克隆。插入序列LLO和hly启动子通过DNA测序分析确认。将该质粒电穿孔转化至电感受态actA、dal、dat突变单核细胞增多性李斯特菌菌株，在包含链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆。在一些实验中，表达hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的类似李斯特菌菌株用于对比目的。在所有研究中，包括不相关李斯特菌构建体(Lm-对照)，以考虑到李斯特菌对免疫系统的抗原非依赖性效应。Lm对照基于与ADXS31-164(LmddA-ChHer2)相同的李斯特菌平台，但表达不同的抗原，诸如HPV16-E7或NY-ESO-1。测试李斯特菌的融合蛋白的表达和分泌。每个构建体体内传代两次。
细胞毒性分析
以3-5只FVB/N小鼠为一组，使用1×108个集落形成单位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm-对照(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。使NT-2细胞体外生长，通过胰蛋白酶脱壁，并用丝裂霉素C(250μg/ml，溶于无血清C-RPMI培养基)在37℃下处理45分钟。在洗涤5次后，将其与从免疫或未暴露的动物收集的脾细胞以1:5(刺激因子:应答细胞)的比率在37℃和5％CO2下一起温育5天。标准细胞毒性分析使用铕标记的3T3/neu(DHFR-G8)细胞作为靶标根据前述方法进行。在4小时温育后使用分光光度计(Perkin Elmer，Victor2)在590nm下测定从杀死的靶细胞释放的铕。特异性裂解的百分比定义为(实验组的裂解-自发性裂解)/(最大裂解-自发性裂解)。
免疫小鼠的脾细胞分泌的干扰素-γ
以3-5只FVB/N或HLA-A2转基因小鼠为一组，使用1×108个CFU的阴性李斯特菌对照ADXS31-164(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分离FVB/N小鼠的脾细胞，并以5×106个细胞/孔在24孔板中的C-RPMI培养基中在存在丝裂霉素C处理的NT-2细胞的情况下共培养。在1μM HLA-A2特异性肽或1μg/ml重组His-标记的ChHer2蛋白(大肠杆菌中产生并且通过基于镍的亲和色谱系统纯化)存在下，温育来自HLA-A2转基因小鼠的脾细胞。在24或72小时后从上清液获得样品，使用小鼠IFN-γ酶联免疫吸附分析(ELISA)药剂盒根据制造商的推荐方案测试干扰素-γ(IFN-γ)的存在。
Her2转基因动物中的肿瘤研究
六周龄FVB/N大鼠Her2/neu转基因小鼠(9-14只/组)使用5×108个CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm对照免疫6次。每周观察自发性乳腺肿瘤的出现两次，使用电子卡尺测量肿瘤，最多52周。当平均直径大小达到1cm2时切下逃逸的肿瘤，在-20℃下保存于RNAlater中°。为了确定Her2/neu蛋白中的突变对这些肿瘤逃逸的影响，使用基因组DNA分离药剂盒提取基因组DNA并且测序。
ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞的作用
将小鼠皮下(s.c.)植入1×106个NT-2细胞。在第7、14和21天，使用1×108个CFU的ADXS31-164、LmddA-对照对它们进行免疫或保持未暴露的。在第28天提取肿瘤和脾脏并通过FACS分析测试CD3+/CD4+/FoxP3+ Treg的存在。简而言之，通过在C-RPMI培养基中匀化两个载玻片之间的脾脏而分离脾细胞。使用无菌刀片切碎肿瘤，并用包含DNA酶(12U/ml)和溶于PBS的胶原酶(2mg/ml)的缓冲液消化。在室温下搅拌温育60min后，通过猛烈吹打而分离细胞。用RBC裂解缓冲液裂解红细胞，然后用包含10％FBS的完全RPMI-1640培养基洗涤多次。在通过尼龙网过滤后，将肿瘤细胞和脾细胞重悬于FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗体染色，然后进行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)进行流式细胞分析，使用cell quest软件(BD)分析数据。
统计学分析
将对数秩卡方检验用于存活期数据，并将学生t-检验用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地进行。在这些分析中，小于0.05的p-值(以*标记)被视为具有统计学上的显著性。所有统计学分析均使用Prism软件V.4.0a(2006)或SPSS软件V.15.0(2006)进行。除非另有说明，否则对于所有的FVB/N大鼠Her2/neu转基因研究，我们均使用8-14只小鼠/组，对于所有野生型FVB/N研究，我们均使用至少8只小鼠/组。除了在Her2/neu转基因小鼠模型中的长期肿瘤研究以外，所有研究重复至少一次。
实例21：分泌与Her-2片段融合的LLO片段的单核细胞增多性李斯特菌菌株的制备：ADXS31-164的构建
嵌合的Her2/neu基因(ChHer2)的构建如下文所述。简而言之，通过SOEingPCR方法，通过直接融合Her2/neu蛋白的两个胞外片段(氨基酸40-170和氨基酸359-433)和一个胞内片段(氨基酸678-808)，制备ChHer2基因。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人MHC I类表位。从质粒pAdv138(其用于构建Lm-LLO-ChHer2)切离ChHer2基因，并克隆进LmddA穿梭质粒，从而产生质粒pAdv164(图57A)。这两个质粒骨架之间有两个主要差异。1)pAdv138使用氯霉素抗性标记(cat)进行重组细菌的体外选择，而pAdv164具有枯草芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的体外选择和体内质粒保持的代谢互补途径。此疫苗平台被设计和开发成解决FDA对工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的关注。2)与pAdv138不同，pAdv164不具有质粒中的prfA基因拷贝(参见以下序列和图57A)，因为这不是Lmdd菌株的体内互补必需的。LmddA疫苗株还缺乏actA基因(负责李斯特菌的胞内移动和细胞间播散)，因此来源于此骨架的重组疫苗株的毒性比来源于其亲代菌株Lmdd的那些小100倍。基于LmddA的疫苗从免疫小鼠脾脏的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小时内)。体外生长8小时之后经TCA沉淀的细胞培养物上清液中，来自该菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图57B)，因为使用Western印迹分析通过抗LLO抗体检测到～104KD的带。仅表达tLLO的李斯特菌骨架菌株用作阴性对照。
pAdv164序列(7075个碱基对)(参见图57A和57B)：
(SED ID NO:87)
实例22：ADXS31-164的免疫原性与Lm-LLO-ChHER2一样
在标准CTL测定中，将ADXS31-164在产生抗Her2/neu特异性细胞毒性T细胞方面的免疫原性性质与Lm-LLO-ChHer2疫苗的进行比较。两种疫苗引起对由3T3/neu靶细胞表达的Her2/neu抗原强烈的但是相当的细胞毒性T细胞应答。因此，使用仅表达融合到LLO的Her2胞内片段的李斯特菌免疫的小鼠显示出比包含多个MHC I类表位的嵌合体更低的裂解活性。在未暴露的动物或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(图58A)。ADXS31-164也能够刺激得自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图58B)。这在与经丝裂霉素C处理的表达高水平的Her2/neu抗原的NT-2细胞共培养的这些细胞的培养物上清液中检测到(图58C)。
在HLA-A2小鼠中测试了ADXS31-164免疫后人MHC I类表位的适当处理和呈递。将来自经免疫的HLA-A2转基因动物的脾细胞与对应于标绘的HLA-A2限制性表位的肽一起温育72小时，所述HLA-A2限制性表位位于Her2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:88或KIFGSLAFL SEQ ID NO:89)或胞内(RLLQETELV SEQ ID NO:90)域(图58C)。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽作为阴性对照。来自该实验的数据表明：ADXS31-164能够引起针对位于靶抗原的不同域处的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答。
实例23：ADXS31-164在预防自发性乳腺肿瘤的发作中比LM-LLO-ChHER2更有效
对比了ADXS31-164与Lm-LLO-ChHer2在Her2/neu转基因动物中的抗肿瘤效果，该转基因动物在20-25周龄时产生缓慢生长的、自发性乳腺肿瘤。所有使用不相关李斯特菌对照疫苗免疫的动物在21-25周内患上乳腺肿瘤并且在第33周前处死。相比而言，李斯特菌-Her2/neu重组疫苗导致乳腺肿瘤形成的明显延迟。在第45周，超过50％的ADXS31-164疫苗接种的小鼠(9只中的5只)仍无肿瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％。在第52周，8只经ADXS31-164免疫的小鼠中的2只仍保持无肿瘤，而来自其他实验组的所有小鼠均已死于它们的疾病(图59)。这些结果指出：尽管ADXS31-164更加减毒，但是其在Her2/neu转基因动物中预防自发性乳腺肿瘤的发作方面比Lm-LLO-ChHer2更有效。
实例24：经ADXS31-164免疫后HER2/NEU基因的突变
Her2/neu的MHC I类表位中的突变已被认为是造成以小片段疫苗或曲妥珠单抗(赫赛汀，一种靶向Her2/neu的胞外域中的表位的单克隆抗体)免疫后的肿瘤逃逸的原因。为评估该作用，从转基因动物中的逃逸肿瘤提取基因组物质，并对嵌合或对照疫苗免疫的肿瘤中neu基因的对应片段进行测序。在任何接种疫苗的肿瘤样品的Her-2/neu基因中均未观察到突变，这提示替代性逃逸机制(数据未显示)。
实例25：ADXS31-164引起肿瘤内调节性T细胞的明显下降
为阐明ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞频率的影响，将NT-2肿瘤细胞植入小鼠。在三次免疫后分离脾细胞和肿瘤内淋巴细胞并对Treg染色，Treg定义为CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞，但是当单独分析时，FoxP3或CD25标记获得了类似的结果。结果指出：与不相关李斯特菌或未暴露的动物相比，ADXS31-164免疫对脾中Treg的频率没有影响(图60)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫对肿瘤中Treg的存在产生很大的影响(图61A)。然而在未处理肿瘤中所有CD3+ T细胞中平均19.0％是Treg，该频率对于不相关疫苗而言下降至4.2％，并且对于ADXS31-164而言下降至3.4％，肿瘤内Treg的频率下降了5倍(图61B)。任一LmddA疫苗治疗的小鼠中肿瘤内Treg的频率降低不能归因于肿瘤大小的差异。在代表性实验中，ADXS31-164免疫的小鼠的肿瘤显著小于[平均直径(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]未治疗的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相关疫苗治疗的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的肿瘤，而最后两组的比较未显示出肿瘤大小的统计学上的显著差异(p＝0.73)。LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。然而，只有表达靶抗原HER2/neu的疫苗(ADXS31-164)能够减缓肿瘤生长，表明Treg的减少仅在肿瘤中存在抗原特异性应答的情况下具有作用。
实例26：ADXS31-164的外周免疫可延缓脑中转移性乳腺癌细胞系的生长
使用ADXS31-164或不相关Lm-对照疫苗IP免疫小鼠，然后颅内植入5,000个表达荧光素酶和低水平Her2/neu的EMT6-Luc肿瘤细胞(图62A)。在接种后的不同时间通过麻醉小鼠的离体成像监测肿瘤。在肿瘤接种后第8天，检测所有对照动物中的肿瘤，但ADXS31-164中的小鼠均未显示出任何可检测的肿瘤(图62A和62B)。ADXS31-164可明显延缓这些肿瘤的发病，因为在肿瘤接种后第11天阴性对照组中的所有小鼠已死于肿瘤，但ADXS31-164组中的所有小鼠仍然存活，并且仅显示出少量肿瘤生长的迹象。这些结果强烈暗示，ADXS31-164的外周施用得到的免疫应答可能到达中枢神经系统，并且基于LmddA的疫苗可具有治疗CNS肿瘤的潜在用途。
实例27：基于Lm的HER2/neu疫苗、GITR激动剂抗体和检查点抑制剂PD-1Ab的三重组合在Her2/neu阳性BC小鼠模型中的治疗功效和免疫调节作用实验设计：小鼠肿瘤模型：使用了两个小鼠肿瘤模型：大鼠Her-2/FVB/N小鼠模型和FVB/N Her-2/neu转基因小鼠模型。
抗体：抗PD1(RMP-14克隆，大鼠IgG2a)和抗GITR(DTA-1克隆)。两种抗体均一周两次i.p注射。抗PD-1Ab在整个实验期间均以1mg/Kg体重的剂量给予。对于激动剂GITR Ab，以5mg/Kg体重的剂量给予总共4剂。
使用大鼠Her-2/FVB/N小鼠模型的实验：因为大鼠和人类Her-2/neu蛋白高度同源，所以使用大鼠Her-2/FVB/N小鼠模型测试基于Lm的Her-2/neu疫苗与GITR激动剂和抗PD-1Ab的组合的治疗性肿瘤作用。通过在右胁腹注射1×106个表达高水平的大鼠HER2/neu蛋白的NT-2肿瘤细胞在雌性FVB/N小鼠(8-10周大；5只/组)中皮下植入肿瘤。当肿瘤体积达到约0.5cm3时，将小鼠随机分成16组(表8)且用高度减毒的基于Lm的疫苗载体处理(i.p.；通过体内毒性分析法测定为1至5×108个集落形成单位)，这些载体具有或不具有LLO和HER2/neu(Lm、Lm-LLO和ADXS31-164)、抗PD1Ab和激动剂抗GITR Ab。疫苗的初免剂量之后为间隔7天的两次强化。
表8：在用于治疗、免疫应答和肿瘤预防研究的16个组中的小鼠分布。
与疫苗同一天开始施用激动剂GITR Ab，总共4剂。因为PD1在早期活化和T细胞耗尽中发挥作用，所以在疫苗后施用抗PD-1可使正在耗尽的T细胞复兴。因此，在第二次疫苗接种后3天注射抗PD1Ab以确定是否可进一步增强抗原特异性应答。在对照组中，小鼠接受PBS。测量肿瘤生长和存活。使用数显卡尺每周测量肿瘤两次，并使用公式V＝(W2*L)/2计算肿瘤体积，其中V是体积，L是长度(较长的直径)，且W是宽度(较短的直径)。当濒死或肿瘤体积达到1.5cm3时处死小鼠。一般治疗计划显示在图63中。实验重复两次。
使用FVB/N Her-2/neu转基因小鼠模型的实验：使用NT-2细胞系的可移植肿瘤鼠类模型是对Her-2/neu抗原具有极低耐受性的快速生长肿瘤模型。对Her-2/neu抗原的耐受性在降低疫苗的免疫治疗功效中可起到重要作用的更具攻击性肿瘤模型为大鼠Her-2/neu转基因小鼠模型。在此模型中，小鼠在20-25周龄之间产生自发性、缓慢生长的乳房肿瘤。通过使用该小鼠品系，因此我们能够测试基于Lm的Her2/neu疫苗是否能克服对Her-2/neu自身抗原的耐受性。这些小鼠的繁殖对由Advaxis,Inc.友情提供。
如表8中所示将小鼠分成16组。小鼠从第6周开始以3周为间隔总共免疫六剂(1至5×108个集落形成单位)。相较于上文阐述的快速生长模型，疫苗在此模型中可能更具免疫性，因为该模型是预防性模型且自发性肿瘤直至约第20周才开始出现。激动剂GITR Ab与总共6剂疫苗在同一天开始施用且与疫苗的每个剂量一起给予。在最后一次疫苗接种后3-4天开始用抗PD1Ab处理且在整个实验期间继续。一周两次观察小鼠的自发性乳房肿瘤的出现和生长，持续长达52周。通过触诊上部和下部小鼠乳腺体来检测自发肿瘤形成，确定肿瘤直径小至1至2mm。一般治疗计划显示在图5中。
免疫应答和调节研究：另外，在肿瘤、脾脏和肿瘤引流淋巴结(TDLN)中研究对肿瘤生长和存活率起作用的免疫调节的详细机制。对于这些实验，将小鼠分组(4只小鼠/组)且与上文类似地进行处理并在第二次免疫后六天和第三次免疫后一周时处死。采集肿瘤、脾脏、TDLN且执行以下分析：
虽然本文已示出和描述了本发明的某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到许多修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落在本发明的真实精神范围内的所有此类修改和变化。
序列表
<110> 阿德瓦希斯公司
S·卡赫里夫
M·马克里提齐安
<120>基于李斯特菌的疫苗与抗OX40或抗GITR抗体的组合
<130> P-78657-PC
<150> 62/094,472
<151> 2014-12-19
<150> 62/094,349
<151> 2014-12-19
<150> 62/147,463
<151> 2015-04-14
<150> 62/262,896
<151> 2015-12-03
<160> 89
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 1
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys
20 25 30
<210> 2
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GenBank登录号P13128
<400> 2
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 3
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO蛋白的N末端片段
<400> 3
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
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Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 4
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO片段
<400> 4
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
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Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 5
Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 6
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 7
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 8
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 9
Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST序列
<400> 10
Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 11
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ActA蛋白
<400> 11
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly Pro Asn Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu
100 105 110
Asn Ala Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile
115 120 125
Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu
130 135 140
Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val
165 170 175
Ala Lys Glu Ser Val Ala Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser
180 185 190
Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln
195 200 205
Gln Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys
210 215 220
Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys
245 250 255
Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu
260 265 270
Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn
275 280 285
Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro
290 295 300
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
305 310 315 320
Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
325 330 335
Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser
340 345 350
Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn
355 360 365
Ala Ile Asn Arg His Ser Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro
370 375 380
Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu
385 390 395 400
Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu
405 410 415
Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly
420 425 430
Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe
435 440 445
Ala Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Ser Pro Lys Val Ser Lys Ile Ser
450 455 460
Asp Arg Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys Lys Thr Pro Phe Lys Asn
465 470 475 480
Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr
485 490 495
Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu
500 505 510
Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr
515 520 525
Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met
530 535 540
Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu
545 550 555 560
Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser
565 570 575
Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly
580 585 590
Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro
595 600 605
Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
610 615 620
Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
625 630 635
<210> 12
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 12
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 13
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的 ActA蛋白
<400> 13
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly
100
<210> 14
<211> 1170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码截短的ActA蛋白的重组核苷酸
<400> 14
Ala Thr Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly
1 5 10 15
Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys
20 25 30
Cys Ala Ala Thr Thr Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Thr Thr
35 40 45
Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr
50 55 60
Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly
65 70 75 80
Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Gly Thr Cys Thr Ala
85 90 95
Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala
115 120 125
Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Ala Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala
145 150 155 160
Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly
165 170 175
Thr Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr
180 185 190
Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Gly
195 200 205
Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr
210 215 220
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala
225 230 235 240
Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Ala
245 250 255
Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys
260 265 270
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr
275 280 285
Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala
290 295 300
Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala
305 310 315 320
Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Gly
340 345 350
Ala Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Ala Cys Ala
355 360 365
Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Thr
370 375 380
Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly
385 390 395 400
Ala Thr Ala Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Thr
405 410 415
Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala
420 425 430
Gly Cys Cys Ala Thr Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Gly Gly
435 440 445
Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly
450 455 460
Cys Cys Thr Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr
465 470 475 480
Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala
485 490 495
Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Cys
500 505 510
Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Gly Thr Thr Gly Cys Gly
515 520 525
Gly Ala Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly
530 535 540
Ala Cys Thr Thr Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Gly Cys Ala Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Gly
565 570 575
Thr Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr
580 585 590
Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala
595 600 605
Ala Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Ala
610 615 620
Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala
625 630 635 640
Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly
645 650 655
Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Cys
660 665 670
Gly Ala Cys Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly
675 680 685
Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Thr
690 695 700
Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly
705 710 715 720
Thr Thr Ala Ala Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr
725 730 735
Thr Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly
740 745 750
Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr
755 760 765
Thr Cys Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys
770 775 780
Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala
785 790 795 800
Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Thr Thr Gly
805 810 815
Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys
820 825 830
Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Gly Cys
835 840 845
Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Ala Ala
850 855 860
Cys Cys Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Gly Ala Ala Thr
865 870 875 880
Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys
885 890 895
Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala
900 905 910
Cys Thr Thr Gly Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala
915 920 925
Cys Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly
930 935 940
Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr
945 950 955 960
Ala Cys Ala Thr Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys Thr
965 970 975
Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys
980 985 990
Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr
995 1000 1005
Gly Ala Ala Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Thr Cys
1010 1015 1020
Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys
1025 1030 1035
Thr Cys Gly Cys Thr Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Gly Thr
1040 1045 1050
Thr Thr Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Thr
1055 1060 1065
Thr Thr Ala Gly Cys Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Gly Ala
1070 1075 1080
Ala Ala Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Ala Ala Thr Cys Gly Cys
1085 1090 1095
Cys Ala Thr Ala Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys
1100 1105 1110
Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala
1115 1120 1125
Ala Thr Cys Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala
1130 1135 1140
Gly Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Ala
1145 1150 1155
Gly Gly Cys Gly Gly Thr Ala Gly Ala Cys Cys Ala
1160 1165 1170
<210> 15
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 15
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 16
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 16
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His
20 25 30
Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val
35 40 45
Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln
50 55 60
Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val
100 105 110
Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys
115 120 125
Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro
130 135 140
Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys
145 150 155 160
Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly
165 170 175
Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro
180 185 190
Leu Val Cys Tyr Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His
210 215 220
Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
225 230 235
<210> 17
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 17
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His
20 25 30
Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val
35 40 45
Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln
50 55 60
Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val
100 105 110
Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys
115 120 125
Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro
130 135 140
Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys
145 150 155 160
Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly
165 170 175
Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro
180 185 190
Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His
210 215 220
Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
225 230 235
<210> 18
<211> 5873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 18
ggtgtcttag gcacactggt cttggagtgc aaaggatcta ggcacgtgag gctttgtatg 60
aagaatcggg gatcgtaccc accccctgtt tctgtttcat cctgggcatg tctcctctgc 120
ctttgtcccc tagatgaagt ctccatgagc tacaagggcc tggtgcatcc agggtgatct 180
agtaattgca gaacagcaag tgctagctct ccctcccctt ccacagctct gggtgtggga 240
gggggttgtc cagcctccag cagcatgggg agggccttgg tcagcctctg ggtgccagca 300
gggcaggggc ggagtcctgg ggaatgaagg ttttataggg ctcctggggg aggctcccca 360
gccccaagct taccacctgc acccggagag ctgtgtcacc atgtgggtcc cggttgtctt 420
cctcaccctg tccgtgacgt ggattggtga gaggggccat ggttgggggg atgcaggaga 480
gggagccagc cctgactgtc aagctgaggc tctttccccc ccaacccagc accccagccc 540
agacagggag ctgggctctt ttctgtctct cccagcccca cttcaagccc atacccccag 600
tcccctccat attgcaacag tcctcactcc cacaccaggt ccccgctccc tcccacttac 660
cccagaactt tcttcccatt tgcccagcca gctccctgct cccagctgct ttactaaagg 720
ggaagttcct gggcatctcc gtgtttctct ttgtggggct caaaacctcc aaggacctct 780
ctcaatgcca ttggttcctt ggaccgtatc actggtccat ctcctgagcc cctcaatcct 840
atcacagtct actgactttt cccattcagc tgtgagtgtc caaccctatc ccagagacct 900
tgatgcttgg cctcccaatc ttgccctagg atacccagat gccaaccaga cacctccttc 960
tttcctagcc aggctatctg gcctgagaca acaaatgggt ccctcagtct ggcaatggga 1020
ctctgagaac tcctcattcc ctgactctta gccccagact cttcattcag tggcccacat 1080
tttccttagg aaaaacatga gcatccccag ccacaactgc cagctctctg agtccccaaa 1140
tctgcatcct tttcaaaacc taaaaacaaa aagaaaaaca aataaaacaa aaccaactca 1200
gaccagaact gttttctcaa cctgggactt cctaaacttt ccaaaacctt cctcttccag 1260
caactgaacc tcgccataag gcacttatcc ctggttccta gcacccctta tcccctcaga 1320
atccacaact tgtaccaagt ttcccttctc ccagtccaag accccaaatc accacaaagg 1380
acccaatccc cagactcaag atatggtctg ggcgctgtct tgtgtctcct accctgatcc 1440
ctgggttcaa ctctgctccc agagcatgaa gcctctccac cagcaccagc caccaacctg 1500
caaacctagg gaagattgac agaattccca gcctttccca gctccccctg cccatgtccc 1560
aggactccca gccttggttc tctgcccccg tgtcttttca aacccacatc ctaaatccat 1620
ctcctatccg agtcccccag ttccccctgt caaccctgat tcccctgatc tagcaccccc 1680
tctgcaggcg ctgcgcccct catcctgtct cggattgtgg gaggctggga gtgcgagaag 1740
cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca gggcagtctg cggcggtgtt 1800
ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca tcaggaagtg agtaggggcc 1860
tggggtctgg ggagcaggtg tctgtgtccc agaggaataa cagctgggca ttttccccag 1920
gataacctct aaggccagcc ttgggactgg gggagagagg gaaagttctg gttcaggtca 1980
catggggagg cagggttggg gctggaccac cctccccatg gctgcctggg tctccatctg 2040
tgtccctcta tgtctctttg tgtcgctttc attatgtctc ttggtaactg gcttcggttg 2100
tgtctctccg tgtgactatt ttgttctctc tctccctctc ttctctgtct tcagtctcca 2160
tatctccccc tctctctgtc cttctctggt ccctctctag ccagtgtgtc tcaccctgta 2220
tctctctgcc aggctctgtc tctcggtctc tgtctcacct gtgccttctc cctactgaac 2280
acacgcacgg gatgggcctg ggggaccctg agaaaaggaa gggctttggc tgggcgcggt 2340
ggctcacacc tgtaatccca gcactttggg aggccaaggc aggtagatca cctgaggtca 2400
ggagttcgag accagcctgg ccaactggtg aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaaa 2460
ttagccaggc gtggtggcgc atgcctgtag tcccagctac tcaggagctg agggaggaga 2520
attgcattga acctggaggt tgaggttgca gtgagccgag accgtgccac tgcactccag 2580
cctgggtgac agagtgagac tccgcctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2640
aaagaaaaga aaagaaaagg aagtgtttta tccctgatgt gtgtgggtat gagggtatga 2700
gagggcccct ctcactccat tccttctcca ggacatccct ccactcttgg gagacacaga 2760
gaagggctgg ttccagctgg agctgggagg ggcaattgag ggaggaggaa ggagaagggg 2820
gaaggaaaac agggtatggg ggaaaggacc ctggggagcg aagtggagga tacaaccttg 2880
ggcctgcagg caggctacct acccacttgg aaacccacgc caaagccgca tctacagctg 2940
agccactctg aggcctcccc tccccggcgg tccccactca gctccaaagt ctctctccct 3000
tttctctccc acactttatc atcccccgga ttcctctcta cttggttctc attcttcctt 3060
tgacttcctg cttccctttc tcattcatct gtttctcact ttctgcctgg ttttgttctt 3120
ctctctctct ttctctggcc catgtctgtt tctctatgtt tctgtctttt ctttctcatc 3180
ctgtgtattt tcggctcacc ttgtttgtca ctgttctccc ctctgccctt tcattctctc 3240
tgccctttta ccctcttcct tttcccttgg ttctctcagt tctgtatctg cccttcaccc 3300
tctcacactg ctgtttccca actcgttgtc tgtattttgg cctgaactgt gtcttcccaa 3360
ccctgtgttt tctcactgtt tctttttctc ttttggagcc tcctccttgc tcctctgtcc 3420
cttctctctt tccttatcat cctcgctcct cattcctgcg tctgcttcct ccccagcaaa 3480
agcgtgatct tgctgggtcg gcacagcctg tttcatcctg aagacacagg ccaggtattt 3540
caggtcagcc acagcttccc acacccgctc tacgatatga gcctcctgaa gaatcgattc 3600
ctcaggccag gtgatgactc cagccacgac ctcatgctgc tccgcctgtc agagcctgcc 3660
gagctcacgg atgctgtgaa ggtcatggac ctgcccaccc aggagccagc actggggacc 3720
acctgctacg cctcaggctg gggcagcatt gaaccagagg agtgtacgcc tgggccagat 3780
ggtgcagccg ggagcccaga tgcctgggtc tgagggagga ggggacagga ctcctgggtc 3840
tgagggagga gggccaagga accaggtggg gtccagccca caacagtgtt tttgcctggc 3900
ccgtagtctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 3960
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 4020
cagggggcaa aagcacctgc tcggtgagtc atccctactc ccaagatctt gagggaaagg 4080
tgagtgggac cttaattctg ggctggggtc tagaagccaa caaggcgtct gcctcccctg 4140
ctccccagct gtagccatgc cacctccccg tgtctcatct cattccctcc ttccctcttc 4200
tttgactccc tcaaggcaat aggttattct tacagcacaa ctcatctgtt cctgcgttca 4260
gcacacggtt actaggcacc tgctatgcac ccagcactgc cctagagcct gggacatagc 4320
agtgaacaga cagagagcag cccctccctt ctgtagcccc caagccagtg aggggcacag 4380
gcaggaacag ggaccacaac acagaaaagc tggagggtgt caggaggtga tcaggctctc 4440
ggggagggag aaggggtggg gagtgtgact gggaggagac atcctgcaga aggtgggagt 4500
gagcaaacac ctgcgcaggg gaggggaggg cctgcggcac ctgggggagc agagggaaca 4560
gcatctggcc aggcctggga ggaggggcct agagggcgtc aggagcagag aggaggttgc 4620
ctggctggag tgaaggatcg gggcagggtg cgagagggaa caaaggaccc ctcctgcagg 4680
gcctcacctg ggccacagga ggacactgct tttcctctga ggagtcagga actgtggatg 4740
gtgctggaca gaagcaggac agggcctggc tcaggtgtcc agaggctgcg ctggcctcct 4800
atgggatcag actgcaggga gggagggcag cagggatgtg gagggagtga tgatggggct 4860
gacctggggg tggctccagg cattgtcccc acctgggccc ttacccagcc tccctcacag 4920
gctcctggcc ctcagtctct cccctccact ccattctcca cctacccaca gtgggtcatt 4980
ctgatcaccg aactgaccat gccagccctg ccgatggtcc tccatggctc cctagtgccc 5040
tggagaggag gtgtctagtc agagagtagt cctggaaggt ggcctctgtg aggagccacg 5100
gggacagcat cctgcagatg gtcctggccc ttgtcccacc gacctgtcta caaggactgt 5160
cctcgtggac cctcccctct gcacaggagc tggaccctga agtcccttcc taccggccag 5220
gactggagcc cctacccctc tgttggaatc cctgcccacc ttcttctgga agtcggctct 5280
ggagacattt ctctcttctt ccaaagctgg gaactgctat ctgttatctg cctgtccagg 5340
tctgaaagat aggattgccc aggcagaaac tgggactgac ctatctcact ctctccctgc 5400
ttttaccctt agggtgattc tgggggccca cttgtctgta atggtgtgct tcaaggtatc 5460
acgtcatggg gcagtgaacc atgtgccctg cccgaaaggc cttccctgta caccaaggtg 5520
gtgcattacc ggaagtggat caaggacacc atcgtggcca acccctgagc acccctatca 5580
agtccctatt gtagtaaact tggaaccttg gaaatgacca ggccaagact caagcctccc 5640
cagttctact gacctttgtc cttaggtgtg aggtccaggg ttgctaggaa aagaaatcag 5700
cagacacagg tgtagaccag agtgtttctt aaatggtgta attttgtcct ctctgtgtcc 5760
tggggaatac tggccatgcc tggagacata tcactcaatt tctctgagga cacagttagg 5820
atggggtgtc tgtgttattt gtgggataca gagatgaaag aggggtggga tcc 5873
<210> 19
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 19
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Trp Val Ile Leu Ile Thr Glu Leu Thr Met Pro Ala Leu Pro
210 215 220
Met Val Leu His Gly Ser Leu Val Pro Trp Arg Gly Gly Val
225 230 235
<210> 20
<211> 1906
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 20
Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys
20 25 30
Thr Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Gly
65 70 75 80
Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys
85 90 95
Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Thr Thr
130 135 140
Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr
145 150 155 160
Gly Cys Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Gly Thr
165 170 175
Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Gly
180 185 190
Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala
195 200 205
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys Thr Cys
210 215 220
Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala
225 230 235 240
Thr Cys Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Gly Thr
245 250 255
Gly Ala Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Gly Gly
260 265 270
Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys
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Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala
290 295 300
Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys
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Cys Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Cys
325 330 335
Cys Gly Cys Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly
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Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Gly Ala
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Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly
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Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala
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420 425 430
Ala Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr
435 440 445
Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly
450 455 460
Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly
465 470 475 480
Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly
485 490 495
Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly
515 520 525
Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys
530 535 540
Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Thr
545 550 555 560
Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Thr Ala
565 570 575
Thr Thr Thr Cys Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly
580 585 590
Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr
595 600 605
Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr
610 615 620
Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly
625 630 635 640
Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys
645 650 655
Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Thr
660 665 670
Gly Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys
675 680 685
Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Ala
690 695 700
Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys
705 710 715 720
Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Ala Gly Thr
725 730 735
Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr
740 745 750
Gly Thr Cys Thr Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ala
755 760 765
Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys
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Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly
785 790 795 800
Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala
805 810 815
Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr
820 825 830
Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys
835 840 845
Thr Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys
850 855 860
Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr
865 870 875 880
Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys
885 890 895
Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys
900 905 910
Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala
915 920 925
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930 935 940
Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys
945 950 955 960
Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Gly
965 970 975
Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Thr Thr Cys
980 985 990
Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys
995 1000 1005
Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr
1010 1015 1020
Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Gly
1040 1045 1050
Gly Ala Thr Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Ala
1055 1060 1065
Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr
1070 1075 1080
Ala Thr Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys
1085 1090 1095
Thr Gly Cys Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Cys Thr Thr Ala Gly
1100 1105 1110
Gly Gly Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Cys
1115 1120 1125
Cys Cys Ala Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Ala Ala Thr
1130 1135 1140
Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr
1145 1150 1155
Ala Thr Cys Ala Cys Gly Thr Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Cys
1160 1165 1170
Ala Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Cys
1175 1180 1185
Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr
1190 1195 1200
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly
1205 1210 1215
Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly
1220 1225 1230
Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys
1235 1240 1245
Ala Cys Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Cys
1250 1255 1260
Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Thr Ala
1265 1270 1275
Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr
1280 1285 1290
Ala Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys
1295 1300 1305
Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly
1310 1315 1320
Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr
1325 1330 1335
Cys Cys Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Ala
1340 1345 1350
Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr Ala Gly Gly Thr
1355 1360 1365
Gly Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr
1370 1375 1380
Gly Cys Thr Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr
1385 1390 1395
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Gly Thr Gly
1400 1405 1410
Thr Ala Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr
1415 1420 1425
Cys Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Thr
1430 1435 1440
Thr Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly
1445 1450 1455
Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly
1460 1465 1470
Gly Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys
1475 1480 1485
Ala Thr Ala Thr Cys Ala Cys Thr Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys
1490 1495 1500
Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr
1505 1510 1515
Ala Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly
1520 1525 1530
Thr Gly Thr Thr Ala Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr
1535 1540 1545
Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly
1550 1555 1560
Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Ala Cys
1565 1570 1575
Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Gly
1580 1585 1590
Thr Gly Ala Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys
1595 1600 1605
Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala
1610 1615 1620
Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly
1625 1630 1635
Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Ala Cys Cys Ala
1640 1645 1650
Gly Ala Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly
1655 1660 1665
Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys
1670 1675 1680
Ala Thr Ala Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys
1685 1690 1695
Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala
1700 1705 1710
Ala Gly Cys Cys Thr Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr
1715 1720 1725
Gly Thr Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly
1730 1735 1740
Ala Gly Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly
1745 1750 1755
Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly
1760 1765 1770
Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala
1775 1780 1785
Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala
1790 1795 1800
Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly
1805 1810 1815
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Gly Ala
1820 1825 1830
Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Ala Ala Cys
1835 1840 1845
Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala
1850 1855 1860
Thr Thr Thr Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Gly Ala Ala Cys Thr
1865 1870 1875
Cys Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly
1880 1885 1890
Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly
1895 1900 1905
<210> 21
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 21
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys
65
<210> 22
<211> 554
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 22
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct tccgtgacgt ggattggtgc tgcacccctc atcctgtctc ggattgtggg 120
aggctgggag tgcgagaagc attcccaacc ctggcaggtg cttgtggcct ctcgtggcag 180
ggcagtctgc ggcggtgttc tggtgcaccc ccagtgggtc ctcacagctg cccactgcat 240
caggaagtga gtaggggcct ggggtctggg gagcaggtgt ctgtgtccca gaggaataac 300
agctgggcat tttccccagg ataacctcta aggccagcct tgggactggg ggagagaggg 360
aaagttctgg ttcaggtcac atggggaggc agggttgggg ctggaccacc ctccccatgg 420
ctgcctgggt ctccatctgt gttcctctat gtctctttgt gtcgctttca ttatgtctct 480
tggtaactgg cttcggttgt gtctctccgt gtgactattt tgttctctct ctccctctct 540
tctctgtctt cagt 554
<210> 23
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白是KLK3肽的来源
<400> 23
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys
115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215 220
<210> 24
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 24
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300
gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360
agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagcattga accagaggag ttcttgaccc 420
caaagaaact tcagtgtgtg gacctccatg ttatttccaa tgacgtgtgt gcgcaagttc 480
accctcagaa ggtgaccaag ttcatgctgt gtgctggacg ctggacaggg ggcaaaagca 540
cctgctcggg tgattctggg ggcccacttg tctgtaatgg tgtgcttcaa ggtatcacgt 600
catggggcag tgaaccatgt gccctgcccg aaaggccttc cctgtacacc aaggtggtgc 660
attaccggaa gtggatcaag gacaccatcg tggccaaccc ctgagcaccc ctatcaaccc 720
cctattgtag taaacttgga accttggaaa tgaccaggcc aagactcaag cctccccagt 780
tctactgacc tttgtcctta ggtgtgaggt ccagggttgc taggaaaaga aatcagcaga 840
cacaggtgta gaccagagtg tttcttaaat ggtgtaattt tgtcctctct gtgtcctggg 900
gaatactggc catgcctgga gacatatcac tcaatttctc tgaggacaca gataggatgg 960
ggtgtctgtg ttatttgtgg ggtacagaga tgaaagaggg gtgggatcca cactgagaga 1020
gtggagagtg acatgtgctg gacactgtcc atgaagcact gagcagaagc tggaggcaca 1080
acgcaccaga cactcacagc aaggatggag ctgaaaacat aacccactct gtcctggagg 1140
cactgggaag cctagagaag gctgtgagcc aaggagggag ggtcttcctt tggcatggga 1200
tggggatgaa gtaaggagag ggactggacc ccctggaagc tgattcacta tggggggagg 1260
tgtattgaag tcctccagac aaccctcaga tttgatgatt tcctagtaga actcacagaa 1320
ataaagagct gttatactgt g 1341
<210> 25
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 25
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met
85 90 95
Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser
100 105 110
Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu
115 120 125
Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val
130 135 140
His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr
145 150 155 160
Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
165 170 175
Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala
180 185 190
Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys
195 200 205
Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215
<210> 26
<211> 1325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 26
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaagcc aggtgatgac tccagccacg acctcatgct gctccgcctg tcagagcctg 300
ccgagctcac ggatgctgtg aaggtcatgg acctgcccac ccaggagcca gcactgggga 360
ccacctgcta cgcctcaggc tggggcagca ttgaaccaga ggagttcttg accccaaaga 420
aacttcagtg tgtggacctc catgttattt ccaatgacgt gtgtgcgcaa gttcaccctc 480
agaaggtgac caagttcatg ctgtgtgctg gacgctggac agggggcaaa agcacctgct 540
cgggtgattc tgggggccca cttgtctgta atggtgtgct tcaaggtatc acgtcatggg 600
gcagtgaacc atgtgccctg cccgaaaggc cttccctgta caccaaggtg gtgcattacc 660
caaggacacc atcgtggcca acccctgagc acccctatca accccctatt gtagtaaact 720
tggaaccttg gaaatgacca ggccaagact caagcctccc cagttctact gacctttgtc 780
cttaggtgtg aggtccaggg ttgctaggaa aagaaatcag cagacacagg tgtagaccag 840
agtgtttctt aaatggtgta attttgtcct ctctgtgtcc tggggaatac tggccatgcc 900
tggagacata tcactcaatt tctctgagga cacagatagg atggggtgtc tgtgttattt 960
gtggggtaca gagatgaaag aggggtggga tccacactga gagagtggag agtgacatgt 1020
gctggacact gtccatgaag cactgagcag aagctggagg cacaacgcac cagacactca 1080
cagcaaggat ggagctgaaa acataaccca ctctgtcctg gaggcactgg gaagcctaga 1140
gaaggctgtg agccaaggag ggagggtctt cctttggcat gggatgggga tgaagtaagg 1200
agagggactg gaccccctgg aagctgattc actatggggg gaggtgtatt gaagtcctcc 1260
agacaaccct cagatttgat gatttcctag tagaactcac agaaataaag agctgttata 1320
ctgtg 1325
<210> 27
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 27
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 28
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 28
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300
gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360
agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga cctcatgctg ctccgcctgt 420
cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga cctgcccacc caggagccag 480
cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat tgaaccagag gagttcttga 540
ccccaaagaa acttcagtgt gtggacctcc atgttatttc caatgacgtg tgtgcgcaag 600
ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg acgctggaca gggggcaaaa 660
gcacctgctc gggtgattct gggggcccac ttgtctgtaa tggtgtgctt caaggtatca 720
cgtcatgggg cagtgaacca tgtgccctgc ccgaaaggcc ttccctgtac accaaggtgg 780
tgcattaccg gaagtggatc aaggacacca tcgtggccaa cccctgagca cccctatcaa 840
ccccctattg tagtaaactt ggaaccttgg aaatgaccag gccaagactc aagcctcccc 900
agttctactg acctttgtcc ttaggtgtga ggtccagggt tgctaggaaa agaaatcagc 960
agacacaggt gtagaccaga gtgtttctta aatggtgtaa ttttgtcctc tctgtgtcct 1020
ggggaatact ggccatgcct ggagacatat cactcaattt ctctgaggac acagatagga 1080
tggggtgtct gtgttatttg tggggtacag agatgaaaga ggggtgggat ccacactgag 1140
agagtggaga gtgacatgtg ctggacactg tccatgaagc actgagcaga agctggaggc 1200
acaacgcacc agacactcac agcaaggatg gagctgaaaa cataacccac tctgtcctgg 1260
aggcactggg aagcctagag aaggctgtga gccaaggagg gagggtcttc ctttggcatg 1320
ggatggggat gaagtaagga gagggactgg accccctgga agctgattca ctatgggggg 1380
aggtgtattg aagtcctcca gacaaccctc agatttgatg atttcctagt agaactcaca 1440
gaaataaaga gctgttatac tgtg 1464
<210> 29
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 29
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 30
<211> 1495
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 30
gggggagccc caagcttacc acctgcaccc ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt 60
tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat tggtgctgca cccctcatcc tgtctcggat 120
tgtgggaggc tgggagtgcg agaagcattc ccaaccctgg caggtgcttg tggcctctcg 180
tggcagggca gtctgcggcg gtgttctggt gcacccccag tgggtcctca cagctgccca 240
ctgcatcagg aacaaaagcg tgatcttgct gggtcggcac agcctgtttc atcctgaaga 300
cacaggccag gtatttcagg tcagccacag cttcccacac ccgctctacg atatgagcct 360
cctgaagaat cgattcctca ggccaggtga tgactccagc cacgacctca tgctgctccg 420
cctgtcagag cctgccgagc tcacggatgc tgtgaaggtc atggacctgc ccacccagga 480
gccagcactg gggaccacct gctacgcctc aggctggggc agcattgaac cagaggagtt 540
cttgacccca aagaaacttc agtgtgtgga cctccatgtt atttccaatg acgtgtgtgc 600
gcaagttcac cctcagaagg tgaccaagtt catgctgtgt gctggacgct ggacaggggg 660
caaaagcacc tgctcgggtg attctggggg cccacttgtc tgtaatggtg tgcttcaagg 720
tatcacgtca tggggcagtg aaccatgtgc cctgcccgaa aggccttccc tgtacaccaa 780
ggtggtgcat taccggaagt ggatcaagga caccatcgtg gccaacccct gagcacccct 840
atcaactccc tattgtagta aacttggaac cttggaaatg accaggccaa gactcaggcc 900
tccccagttc tactgacctt tgtccttagg tgtgaggtcc agggttgcta ggaaaagaaa 960
tcagcagaca caggtgtaga ccagagtgtt tcttaaatgg tgtaattttg tcctctctgt 1020
gtcctgggga atactggcca tgcctggaga catatcactc aatttctctg aggacacaga 1080
taggatgggg tgtctgtgtt atttgtgggg tacagagatg aaagaggggt gggatccaca 1140
ctgagagagt ggagagtgac atgtgctgga cactgtccat gaagcactga gcagaagctg 1200
gaggcacaac gcaccagaca ctcacagcaa ggatggagct gaaaacataa cccactctgt 1260
cctggaggca ctgggaagcc tagagaaggc tgtgagccaa ggagggaggg tcttcctttg 1320
gcatgggatg gggatgaagt agggagaggg actggacccc ctggaagctg attcactatg 1380
gggggaggtg tattgaagtc ctccagacaa ccctcagatt tgatgatttc ctagtagaac 1440
tcacagaaat aaagagctgt tatactgcga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1495
<210> 31
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 31
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys
115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala
210 215
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 32
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Val Ser His Pro Tyr Ser Gln Asp Leu Glu Gly Lys Gly Glu
210 215 220
Trp Gly Pro
225
<210> 33
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 33
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Glu Arg Gly His Gly Trp Gly Asp Ala Gly Glu Gly Ala Ser Pro Asp
20 25 30
Cys Gln Ala Glu Ala Leu Ser Pro Pro Thr Gln His Pro Ser Pro Asp
35 40 45
Arg Glu Leu Gly Ser Phe Leu Ser Leu Pro Ala Pro Leu Gln Ala His
50 55 60
Thr Pro Ser Pro Ser Ile Leu Gln Gln Ser Ser Leu Pro His Gln Val
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ser His Leu Pro Gln Asn Phe Leu Pro Ile Ala Gln Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Ser Gln Leu Leu Tyr
100
<210> 34
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 34
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 35
<211> 1729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码KLK3蛋白的核苷酸
<400> 35
aagtttccct tctcccagtc caagacccca aatcaccaca aaggacccaa tccccagact 60
caagatatgg tctgggcgct gtcttgtgtc tcctaccctg atccctgggt tcaactctgc 120
tcccagagca tgaagcctct ccaccagcac cagccaccaa cctgcaaacc tagggaagat 180
tgacagaatt cccagccttt cccagctccc cctgcccatg tcccaggact cccagccttg 240
gttctctgcc cccgtgtctt ttcaaaccca catcctaaat ccatctccta tccgagtccc 300
ccagttcctc ctgtcaaccc tgattcccct gatctagcac cccctctgca ggtgctgcac 360
ccctcatcct gtctcggatt gtgggaggct gggagtgcga gaagcattcc caaccctggc 420
aggtgcttgt agcctctcgt ggcagggcag tctgcggcgg tgttctggtg cacccccagt 480
gggtcctcac agctacccac tgcatcagga acaaaagcgt gatcttgctg ggtcggcaca 540
gcctgtttca tcctgaagac acaggccagg tatttcaggt cagccacagc ttcccacacc 600
cgctctacga tatgagcctc ctgaagaatc gattcctcag gccaggtgat gactccagcc 660
acgacctcat gctgctccgc ctgtcagagc ctgccgagct cacggatgct atgaaggtca 720
tggacctgcc cacccaggag ccagcactgg ggaccacctg ctacgcctca ggctggggca 780
gcattgaacc agaggagttc ttgaccccaa agaaacttca gtgtgtggac ctccatgtta 840
tttccaatga cgtgtgtgcg caagttcacc ctcagaaggt gaccaagttc atgctgtgtg 900
ctggacgctg gacagggggc aaaagcacct gctcgggtga ttctgggggc ccacttgtct 960
gtaatggtgt gcttcaaggt atcacgtcat ggggcagtga accatgtgcc ctgcccgaaa 1020
ggccttccct gtacaccaag gtggtgcatt accggaagtg gatcaaggac accatcgtgg 1080
ccaacccctg agcaccccta tcaactccct attgtagtaa acttggaacc ttggaaatga 1140
ccaggccaag actcaggcct ccccagttct actgaccttt gtccttaggt gtgaggtcca 1200
gggttgctag gaaaagaaat cagcagacac aggtgtagac cagagtgttt cttaaatggt 1260
gtaattttgt cctctctgtg tcctggggaa tactggccat gcctggagac atatcactca 1320
atttctctga ggacacagat aggatggggt gtctgtgtta tttgtggggt acagagatga 1380
aagaggggtg ggatccacac tgagagagtg gagagtgaca tgtgctggac actgtccatg 1440
aagcactgag cagaagctgg aggcacaacg caccagacac tcacagcaag gatggagctg 1500
aaaacataac ccactctgtc ctggaggcac tgggaagcct agagaaggct gtgaaccaag 1560
gagggagggt cttcctttgg catgggatgg ggatgaagta aggagaggga ctgaccccct 1620
ggaagctgat tcactatggg gggaggtgta ttgaagtcct ccagacaacc ctcagatttg 1680
atgatttcct agtagaactc acagaaataa agagctgtta tactgtgaa 1729
<210> 36
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 36
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys
65
<210> 37
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白是 KLK3肽的来源
<400> 37
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys
115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215 220
<210> 38
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 38
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met
85 90 95
Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser
100 105 110
Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu
115 120 125
Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val
130 135 140
His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr
145 150 155 160
Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
165 170 175
Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala
180 185 190
Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys
195 200 205
Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白中缺乏的序列
<400> 39
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg
20
<210> 40
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 40
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 41
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 41
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
1 5 10 15
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
20 25 30
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
35 40 45
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
50 55 60
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
65 70 75 80
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
100 105
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
ggctcgagca tggagataca cc 22
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ctccctcgag atcataattt acttcatc 28
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
gactacaagg acgatgaccg acaagtgata acccgggatc taaataaatc cgttt 55
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
gcggatccca tggagataca cctac 25
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
gctctagatt atggtttctg ag 22
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
ggggtctaga cctcctttga ttagtatatt c 31
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
atcttcgcta tctgtcgccg cggcgcgtgc ttcagtttgt tgcgc 45
<210> 52
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
gcgcaacaaa ctgaagcagc ggccgcggcg acagatagcg aagat 45
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
tgtaggtgta tctccatgct cgagagctag gcgatcaatt tc 42
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
ggaattgatc gcctagctct cgagcatgga gatacaccta ca 42
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
aaacggattt atttagatcc cgggttatgg tttctgagaa ca 42
<210> 56
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
tgttctcaga aaccataacc cgggatctaa ataaatccgt tt 42
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
gggggtcgac cagctcttct tggtgaag 28
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藻红蛋白 (PE)偶联的E7肽
<400> 58
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 59
<211> 6523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pAdv142
<400> 59
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagattgt gggaggctgg gagtgcgaga agcattccca accctggcag gtgcttgtgg 2460
cctctcgtgg cagggcagtc tgcggcggtg ttctggtgca cccccagtgg gtcctcacag 2520
ctgcccactg catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg tcggcacagc ctgtttcatc 2580
ctgaagacac aggccaggta tttcaggtca gccacagctt cccacacccg ctctacgata 2640
tgagcctcct gaagaatcga ttcctcaggc caggtgatga ctccagccac gacctcatgc 2700
tgctccgcct gtcagagcct gccgagctca cggatgctgt gaaggtcatg gacctgccca 2760
cccaggagcc agcactgggg accacctgct acgcctcagg ctggggcagc attgaaccag 2820
aggagttctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 2880
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 2940
cagggggcaa aagcacctgc tcgggtgatt ctgggggccc acttgtctgt tatggtgtgc 3000
ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg ccttccctgt 3060
acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc aacccctaac 3120
ccgggccact aactcaacgc tagtagtgga tttaatccca aatgagccaa cagaaccaga 3180
accagaaaca gaacaagtaa cattggagtt agaaatggaa gaagaaaaaa gcaatgattt 3240
cgtgtgaata atgcacgaaa tcattgctta tttttttaaa aagcgatata ctagatataa 3300
cgaaacaacg aactgaataa agaatacaaa aaaagagcca cgaccagtta aagcctgaga 3360
aactttaact gcgagcctta attgattacc accaatcaat taaagaagtc gagacccaaa 3420
atttggtaaa gtatttaatt actttattaa tcagatactt aaatatctgt aaacccatta 3480
tatcgggttt ttgaggggat ttcaagtctt taagaagata ccaggcaatc aattaagaaa 3540
aacttagttg attgcctttt ttgttgtgat tcaactttga tcgtagcttc taactaatta 3600
attttcgtaa gaaaggagaa cagctgaatg aatatccctt ttgttgtaga aactgtgctt 3660
catgacggct tgttaaagta caaatttaaa aatagtaaaa ttcgctcaat cactaccaag 3720
ccaggtaaaa gtaaaggggc tatttttgcg tatcgctcaa aaaaaagcat gattggcgga 3780
cgtggcgttg ttctgacttc cgaagaagcg attcacgaaa atcaagatac atttacgcat 3840
tggacaccaa acgtttatcg ttatggtacg tatgcagacg aaaaccgttc atacactaaa 3900
ggacattctg aaaacaattt aagacaaatc aataccttct ttattgattt tgatattcac 3960
acggaaaaag aaactatttc agcaagcgat attttaacaa cagctattga tttaggtttt 4020
atgcctacgt taattatcaa atctgataaa ggttatcaag catattttgt tttagaaacg 4080
ccagtctatg tgacttcaaa atcagaattt aaatctgtca aagcagccaa aataatctcg 4140
caaaatatcc gagaatattt tggaaagtct ttgccagttg atctaacgtg caatcatttt 4200
gggattgctc gtataccaag aacggacaat gtagaatttt ttgatcccaa ttaccgttat 4260
tctttcaaag aatggcaaga ttggtctttc aaacaaacag ataataaggg ctttactcgt 4320
tcaagtctaa cggttttaag cggtacagaa ggcaaaaaac aagtagatga accctggttt 4380
aatctcttat tgcacgaaac gaaattttca ggagaaaagg gtttagtagg gcgcaatagc 4440
gttatgttta ccctctcttt agcctacttt agttcaggct attcaatcga aacgtgcgaa 4500
tataatatgt ttgagtttaa taatcgatta gatcaaccct tagaagaaaa agaagtaatc 4560
aaaattgtta gaagtgccta ttcagaaaac tatcaagggg ctaataggga atacattacc 4620
attctttgca aagcttgggt atcaagtgat ttaaccagta aagatttatt tgtccgtcaa 4680
gggtggttta aattcaagaa aaaaagaagc gaacgtcaac gtgttcattt gtcagaatgg 4740
aaagaagatt taatggctta tattagcgaa aaaagcgatg tatacaagcc ttatttagcg 4800
acgaccaaaa aagagattag agaagtgcta ggcattcctg aacggacatt agataaattg 4860
ctgaaggtac tgaaggcgaa tcaggaaatt ttctttaaga ttaaaccagg aagaaatggt 4920
ggcattcaac ttgctagtgt taaatcattg ttgctatcga tcattaaatt aaaaaaagaa 4980
gaacgagaaa gctatataaa ggcgctgaca gcttcgttta atttagaacg tacatttatt 5040
caagaaactc taaacaaatt ggcagaacgc cccaaaacgg acccacaact cgatttgttt 5100
agctacgata caggctgaaa ataaaacccg cactatgcca ttacatttat atctatgata 5160
cgtgtttgtt tttctttgct ggctagctta attgcttata tttacctgca ataaaggatt 5220
tcttacttcc attatactcc cattttccaa aaacatacgg ggaacacggg aacttattgt 5280
acaggccacc tcatagttaa tggtttcgag ccttcctgca atctcatcca tggaaatata 5340
ttcatccccc tgccggccta ttaatgtgac ttttgtgccc ggcggatatt cctgatccag 5400
ctccaccata aattggtcca tgcaaattcg gccggcaatt ttcaggcgtt ttcccttcac 5460
aaggatgtcg gtccctttca attttcggag ccagccgtcc gcatagccta caggcaccgt 5520
cccgatccat gtgtcttttt ccgctgtgta ctcggctccg tagctgacgc tctcgccttt 5580
tctgatcagt ttgacatgtg acagtgtcga atgcagggta aatgccggac gcagctgaaa 5640
cggtatctcg tccgacatgt cagcagacgg gcgaaggcca tacatgccga tgccgaatct 5700
gactgcatta aaaaagcctt ttttcagccg gagtccagcg gcgctgttcg cgcagtggac 5760
cattagattc tttaacggca gcggagcaat cagctcttta aagcgctcaa actgcattaa 5820
gaaatagcct ctttcttttt catccgctgt cgcaaaatgg gtaaataccc ctttgcactt 5880
taaacgaggg ttgcggtcaa gaattgccat cacgttctga acttcttcct ctgtttttac 5940
accaagtctg ttcatccccg tatcgacctt cagatgaaaa tgaagagaac cttttttcgt 6000
gtggcgggct gcctcctgaa gccattcaac agaataacct gttaaggtca cgtcatactc 6060
agcagcgatt gccacatact ccgggggaac cgcgccaagc accaatatag gcgccttcaa 6120
tccctttttg cgcagtgaaa tcgcttcatc caaaatggcc acggccaagc atgaagcacc 6180
tgcgtcaaga gcagcctttg ctgtttctgc atcaccatgc ccgtaggcgt ttgctttcac 6240
aactgccatc aagtggacat gttcaccgat atgttttttc atattgctga cattttcctt 6300
tatcgcggac aagtcaattt ccgcccacgt atctctgtaa aaaggttttg tgctcatgga 6360
aaactcctct cttttttcag aaaatcccag tacgtaatta agtatttgag aattaatttt 6420
atattgatta atactaagtt tacccagttt tcacctaaaa aacaaatgat gagataatag 6480
ctccaaaggc taaagaggac tataccaact atttgttaat taa 6523
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv271-actAF1
<400> 60
cggaattcgg atccgcgcca aatcattggt tgattg 36
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv272-actAR1
<400> 61
gcgagtcgac gtcggggtta atcgtaatgc aattggc 37
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv273-actAF2
<400> 62
gcgagtcgac ccatacgacg ttaattcttg caatg 35
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv274-actAR2
<400> 63
gatactgcag ggatccttcc cttctcggta atcagtcac 39
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 3
<400> 64
tgggatggcc aagaaattc 19
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4
<400> 65
ctaccatgtc ttccgttgct tg 22
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合体(F)
<400> 66
tgatctcgag acccacctgg acatgctc 28
<210> 67
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2F（连接）
<400> 67
ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgc 49
<210> 68
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2R（连接）
<400> 68
gcagccagca aactcctgga tattcttcca caaaatcgtg tcctggtag 49
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIF（连接）
<400> 69
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcagca gaagatccgg aagtacacga 50
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIR（连接）
<400> 70
tcgtgtactt ccggatcttc tgctgccctc gggcgcacag ctggtggcag 50
<210> 71
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合体(R)
<400> 71
gtggcccggg tctagattag tctaagaggc agccatagg 39
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC1(F)
<400> 72
ccgcctcgag gccgcgagca cccaagtg 28
<210> 73
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC1(R)
<400> 73
cgcgactagt ttaatcctct gctgtcacct c 31
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC2(F)
<400> 74
ccgcctcgag tacctttcta cggacgtg 28
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her- 2- EC2(R)
<400> 75
cgcgactagt ttactctggc cggttggcag 30
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-Her-2-IC1(F)
<400> 76
ccgcctcgag cagcagaaga tccggaagta c 31
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-IC1(R)
<400> 77
cgcgactagt ttaagcccct tcggagggtg 30
<210> 78
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAdv164序列
<400> 78
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 2460
acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gatatccagg 2520
aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca ctgcagaggc 2580
tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc gtgctagaca 2640
atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga ggcctgcggg 2700
agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc cagcggaacc 2760
cccagctctg ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgca 2820
agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt tgatggggac ccagcctcca 2880
acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga gactctggaa gagatcacag 2940
gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc ttccagaacc 3000
tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc ctgcaagggc 3060
tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga ctggccctca 3120
tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag ctctttcgga 3180
acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt gtgggcgagg 3240
gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcagcagaa gatccggaag tacacgatgc 3300
ggagactgct gcaggaaacg gagctggtgg agccgctgac acctagcgga gcgatgccca 3360
accaggcgca gatgcggatc ctgaaagaga cggagctgag gaaggtgaag gtgcttggat 3420
ctggcgcttt tggcacagtc tacaagggca tctggatccc tgatggggag aatgtgaaaa 3480
ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa acacatcccc caaagccaac aaagaaatct 3540
tagacgaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca 3600
tctgcctgac atccacggtg cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag 3660
actaatctag acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 3720
aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 3780
aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3840
tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3900
taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3960
tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 4020
gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 4080
tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 4140
tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 4200
gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 4260
atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 4320
atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 4380
acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 4440
tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 4500
tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 4560
gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 4620
gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 4680
aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 4740
tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 4800
aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4860
ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4920
gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4980
gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 5040
gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 5100
aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 5160
gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 5220
tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 5280
ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 5340
ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 5400
ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 5460
ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 5520
ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 5580
cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 5640
ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 5700
atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 5760
caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 5820
ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5880
catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5940
ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 6000
ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 6060
tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 6120
gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 6180
acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 6240
gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 6300
cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 6360
aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 6420
ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 6480
ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 6540
accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 6600
cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 6660
aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 6720
gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 6780
gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6840
gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6900
tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6960
agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 7020
atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 7075
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2限制性表位
<400> 79
His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2限制性表位
<400> 80
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2限制性表位
<400> 81
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val
1 5
<210> 82
<211> 2040
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码融合到PSA蛋白的LLO的核苷酸
<400> 82
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gatctcgaga ttgtgggagg ctgggagtgc gagaagcatt cccaaccctg gcaggtgctt 1380
gtggcctctc gtggcagggc agtctgcggc ggtgttctgg tgcaccccca gtgggtcctc 1440
acagctgccc actgcatcag gaacaaaagc gtgatcttgc tgggtcggca cagcctgttt 1500
catcctgaag acacaggcca ggtatttcag gtcagccaca gcttcccaca cccgctctac 1560
gatatgagcc tcctgaagaa tcgattcctc aggccaggtg atgactccag ccacgacctc 1620
atgctgctcc gcctgtcaga gcctgccgag ctcacggatg ctgtgaaggt catggacctg 1680
cccacccagg agccagcact ggggaccacc tgctacgcct caggctgggg cagcattgaa 1740
ccagaggagt tcttgacccc aaagaaactt cagtgtgtgg acctccatgt tatttccaat 1800
gacgtgtgtg cgcaagttca ccctcagaag gtgaccaagt tcatgctgtg tgctggacgc 1860
tggacagggg gcaaaagcac ctgctcgggt gattctgggg gcccacttgt ctgttatggt 1920
gtgcttcaag gtatcacgtc atggggcagt gaaccatgtg ccctgcccga aaggccttcc 1980
ctgtacacca aggtggtgca ttaccggaag tggatcaagg acaccatcgt ggccaacccc 2040
<210> 83
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合到PSA蛋白的LLO
<400> 83
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Leu Glu Ile Val Gly Gly Trp
435 440 445
Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg
450 455 460
Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu
465 470 475 480
Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg
485 490 495
His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser
500 505 510
His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg
515 520 525
Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg
530 535 540
Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu
545 550 555 560
Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp
565 570 575
Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys
580 585 590
Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro
595 600 605
Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly
610 615 620
Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Tyr Gly
625 630 635 640
Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro
645 650 655
Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile
660 665 670
Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
675 680
<210> 84
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 84
His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu
20 25 30
Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg
35 40 45
Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu
50 55 60
Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys
85 90 95
Pro
<210> 85
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合到E7蛋白的截短LLO
<400> 85
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Leu Glu His Gly Asp Thr Pro
435 440 445
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
450 455 460
Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
465 470 475 480
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
485 490 495
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
500 505 510
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
515 520 525
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
530 535 540
<210> 86
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Her-2嵌合蛋白的核酸
<400> 86
gagacccacc tggacatgct ccgccacctc taccagggct gccaggtggt gcagggaaac 60
ctggaactca cctacctgcc caccaatgcc agcctgtcct tcctgcagga tatccaggag 120
gtgcagggct acgtgctcat cgctcacaac caagtgaggc aggtcccact gcagaggctg 180
cggattgtgc gaggcaccca gctctttgag gacaactatg ccctggccgt gctagacaat 240
ggagacccgc tgaacaatac cacccctgtc acaggggcct ccccaggagg cctgcgggag 300
ctgcagcttc gaagcctcac agagatcttg aaaggagggg tcttgatcca gcggaacccc 360
cagctctgct accaggacac gattttgtgg aagaatatcc aggagtttgc tggctgcaag 420
aagatctttg ggagcctggc atttctgccg gagagctttg atggggaccc agcctccaac 480
actgccccgc tccagccaga gcagctccaa gtgtttgaga ctctggaaga gatcacaggt 540
tacctataca tctcagcatg gccggacagc ctgcctgacc tcagcgtctt ccagaacctg 600
caagtaatcc ggggacgaat tctgcacaat ggcgcctact cgctgaccct gcaagggctg 660
ggcatcagct ggctggggct gcgctcactg agggaactgg gcagtggact ggccctcatc 720
caccataaca cccacctctg cttcgtgcac acggtgccct gggaccagct ctttcggaac 780
ccgcaccaag ctctgctcca cactgccaac cggccagagg acgagtgtgt gggcgagggc 840
ctggcctgcc accagctgtg cgcccgaggg cagcagaaga tccggaagta cacgatgcgg 900
agactgctgc aggaaacgga gctggtggag ccgctgacac ctagcggagc gatgcccaac 960
caggcgcaga tgcggatcct gaaagagacg gagctgagga aggtgaaggt gcttggatct 1020
ggcgcttttg gcacagtcta caagggcatc tggatccctg atggggagaa tgtgaaaatt 1080
ccagtggcca tcaaagtgtt gagggaaaac acatccccca aagccaacaa agaaatctta 1140
gacgaagcat acgtgatggc tggtgtgggc tccccatatg tctcccgcct tctgggcatc 1200
tgcctgacat ccacggtgca gctggtgaca cagcttatgc cctatggctg cctcttagac 1260
taa 1263
<210> 87
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2嵌合蛋白
<400> 87
Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val
1 5 10 15
Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His
35 40 45
Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly
50 55 60
Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly
65 70 75 80
Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly
85 90 95
Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly
100 105 110
Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu
115 120 125
Trp Lys Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser
130 135 140
Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr
145 150 155 160
Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu
165 170 175
Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp
180 185 190
Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His
195 200 205
Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu
210 215 220
Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His
225 230 235 240
His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu
245 250 255
Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu
260 265 270
Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg
275 280 285
Gly Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu
290 295 300
Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln
305 310 315 320
Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val
325 330 335
Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro
340 345 350
Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu
355 360 365
Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val
370 375 380
Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys
385 390 395 400
Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys
405 410 415
Leu Leu Asp
<210> 88
<211> 2586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码融合到cHER2的tLLO的开放阅读框
<400> 88
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gatctcgaga cccacctgga catgctccgc cacctctacc agggctgcca ggtggtgcag 1380
ggaaacctgg aactcaccta cctgcccacc aatgccagcc tgtccttcct gcaggatatc 1440
caggaggtgc agggctacgt gctcatcgct cacaaccaag tgaggcaggt cccactgcag 1500
aggctgcgga ttgtgcgagg cacccagctc tttgaggaca actatgccct ggccgtgcta 1560
gacaatggag acccgctgaa caataccacc cctgtcacag gggcctcccc aggaggcctg 1620
cgggagctgc agcttcgaag cctcacagag atcttgaaag gaggggtctt gatccagcgg 1680
aacccccagc tctgctacca ggacacgatt ttgtggaaga atatccagga gtttgctggc 1740
tgcaagaaga tctttgggag cctggcattt ctgccggaga gctttgatgg ggacccagcc 1800
tccaacactg ccccgctcca gccagagcag ctccaagtgt ttgagactct ggaagagatc 1860
acaggttacc tatacatctc agcatggccg gacagcctgc ctgacctcag cgtcttccag 1920
aacctgcaag taatccgggg acgaattctg cacaatggcg cctactcgct gaccctgcaa 1980
gggctgggca tcagctggct ggggctgcgc tcactgaggg aactgggcag tggactggcc 2040
ctcatccacc ataacaccca cctctgcttc gtgcacacgg tgccctggga ccagctcttt 2100
cggaacccgc accaagctct gctccacact gccaaccggc cagaggacga gtgtgtgggc 2160
gagggcctgg cctgccacca gctgtgcgcc cgagggcagc agaagatccg gaagtacacg 2220
atgcggagac tgctgcagga aacggagctg gtggagccgc tgacacctag cggagcgatg 2280
cccaaccagg cgcagatgcg gatcctgaaa gagacggagc tgaggaaggt gaaggtgctt 2340
ggatctggcg cttttggcac agtctacaag ggcatctgga tccctgatgg ggagaatgtg 2400
aaaattccag tggccatcaa agtgttgagg gaaaacacat cccccaaagc caacaaagaa 2460
atcttagacg aagcatacgt gatggctggt gtgggctccc catatgtctc ccgccttctg 2520
ggcatctgcc tgacatccac ggtgcagctg gtgacacagc ttatgcccta tggctgcctc 2580
ttagac 2586
<210> 89
<211> 862
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含融合到cHER2的tLLO的重组蛋白
<400> 89
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Leu Glu Thr His Leu Asp Met
435 440 445
Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu
450 455 460
Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile
465 470 475 480
Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln
485 490 495
Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu
500 505 510
Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn
515 520 525
Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln
530 535 540
Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg
545 550 555 560
Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asn Ile Gln
565 570 575
Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro
580 585 590
Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro
595 600 605
Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu
610 615 620
Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln
625 630 635 640
Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser
645 650 655
Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu
660 665 670
Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu
675 680 685
Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His
690 695 700
Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly
705 710 715 720
Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly Gln Gln Lys Ile
725 730 735
Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu
740 745 750
Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile
755 760 765
Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala
770 775 780
Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val
785 790 795 800
Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys
805 810 815
Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly
820 825 830
Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val
835 840 845
Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp
850 855 860

Claims (57)

1.一种包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述组合物还包含抗体或其功能性片段。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其功能性片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体(SCA)或其任何组合。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其功能性片段结合到所述异源性抗原或其部分，所述异源性抗原或其部分包括T细胞受体共刺激分子、抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子或TNF受体超家族的成员。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述TNF受体超家族的所述成员选自糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)和TNFR25。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子选自CD80受体、CD86受体和CD40受体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中包含第一开放阅读框的所述核酸分子被整合进所述李斯特菌基因组。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中包含第一开放阅读框的所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述质粒不赋予所述重组李斯特菌抗生素抗性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述异源性抗原是肿瘤相关抗原。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原是前列腺特异性抗原(PSA)、人乳头瘤病毒(HPV)抗原或嵌合Her2/neu抗原。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述重组李斯特菌菌株是减毒的。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述减毒李斯特菌包括内源性基因中的突变、缺失、破坏、失活、置换或截短。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述内源性基因包括actA毒力基因、prfA毒力基因、dal基因、inlB基因、dat基因或它们的组合。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的组合物，其中所述内源性基因是prfA基因。
16.根据权利要求13至14中任一项所述的组合物，其中所述内源性基因是dal/dat和actA基因。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中包含第一开放阅读框的所述核酸还包含第二开放阅读框。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第二开放阅读框编码包含D133V突变的PrfA蛋白，并且其中所述PrfA蛋白补充所述prfA基因中的所述突变、缺失、破坏、失活、置换或截短。
19.根据权利要求1至14、16或17中任一项所述的组合物，其中所述第二开放阅读框编码代谢酶并且其中所述代谢酶补充所述dal和dat基因中的所述突变、缺失、破坏、失活、置换或截短。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，还包含佐剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未甲基化的含CpG寡核苷酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述李斯特菌菌株是单核细胞增多性李斯特菌。
24.一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤，并且其中所述施用增强所述受试者中的抗肿瘤T细胞应答。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体或其功能性片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体(SCA)或其任何组合。
26.根据权利要求24至25中任一项所述的方法，其中所述抗体或其功能性片段结合到异源性抗原或其部分，所述异源性抗原或其部分包括T细胞受体共刺激分子、抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子或TNF受体超家族的成员。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述TNF受体超家族的所述成员选自糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)和TNFR25。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子选自CD80受体、CD86受体和CD40受体。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中包含第一开放阅读框的所述核酸分子被整合进所述李斯特菌基因组。
30.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中包含第一开放阅读框的所述核酸分子在所述重组李斯特菌菌株的质粒中。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组李斯特菌菌株中。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述质粒不赋予所述重组李斯特菌抗生素抗性。
33.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述异源性抗原是肿瘤相关抗原。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是前列腺特异性抗原(PSA)、人乳头瘤病毒(HPV)抗原或Her2/neu嵌合抗原。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌菌株是减毒的。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述减毒李斯特菌包括内源性基因中的突变、缺失、破坏、失活、置换或截短。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述内源性基因包括actA毒力基因、prfA毒力基因、dal基因、inlB基因、dat基因或它们的组合。
38.根据权利要求36至37中任一项所述的组合物，其中所述内源性基因是prfA基因。
39.根据权利要求36至37中任一项所述的组合物，其中所述内源性基因是dal/dat和actA基因。
40.根据权利要求24至37中任一项所述的组合物，其中包含第一开放阅读框的所述核酸还包含第二开放阅读框。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述第二开放阅读框编码包含D133V突变的PrfA蛋白，并且其中所述PrfA蛋白补充所述prfA基因中的所述突变、缺失、破坏、失活、置换或截短。
42.根据权利要求24至37或39至40中任一项所述的组合物，其中所述第二开放阅读框编码代谢酶并且其中所述代谢酶补充所述dal和dat基因中的所述突变、缺失、破坏、失活、置换或截短。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
44.根据权利要求24至43中任一项所述的组合物，还包含佐剂。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未甲基化的含CpG寡核苷酸。
46.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述李斯特菌菌株是单核细胞增多性李斯特菌。
47.权利要求24至46中任一项所述的方法，其中包含抗体或其片段的所述组合物在包含所述重组减毒李斯特菌菌株的所述组合物的施用之前、同时或之后施用。
48.根据权利要求24至47中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤T细胞应答包括增加产干扰素-γ(INF-γ)的细胞的水平。
49.根据权利要求24至48中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤T细胞应答包括增加效应T细胞对肿瘤的浸润。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述效应T细胞是CD45+CD8+T细胞或CD4+Fox3P-T细胞。
51.根据权利要求24至50中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤T细胞应答包括脾脏和肿瘤微环境中调节性T细胞(Treg)的频率降低。
52.根据权利要求24至51中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤T细胞应答包括脾脏和肿瘤微环境中髓源性抑制细胞(MDSC)的频率降低。
53.根据权利要求24至52中任一项所述的方法，其中所述方法包括增加所述受试者中的抗原特异性T细胞。
54.根据权利要求24至54中任一项所述的方法，其中所述方法包括治疗受试者中的肿瘤或癌症。
55.根据权利要求24至53中任一项所述的方法，其中所述方法包括增加罹患癌症或肿瘤的受试者的存活时间。
56.根据权利要求55至55中任一项所述的方法，其中所述肿瘤为乳腺肿瘤、头颈肿瘤、宫颈肿瘤、前列腺肿瘤。
57.根据权利要求55至55中任一项所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肛门癌、食道癌、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤或卵巢癌。
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